CN114616467A - 筛选原代人类细胞中的同源t细胞和表位反应性的高通量方法 - Google Patents

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Abstract

描述了一种自体同源的原代免疫细胞的测定法，其中可在没有HLA单倍型特异性试剂的情况下同时针对感兴趣的个别抗原，例如T细胞表位，对个体自身的血细胞进行功能性筛选。使用寡核苷酸标记的散列跟踪系统，随后通过单细胞测序进行去卷积，将抗原反应性与个别T细胞相关联。

Description

筛选原代人类细胞中的同源T细胞和表位反应性的高通量 方法
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2019年10月3日提交的美国临时专利申请序列号62/910,379的优先权，其公开内容以引用的方式整体并入本文中。
对经由EFS WEB以文本文件提交的序列表的引用
文件10669_ST25.txt中编写的序列表为5千字节，创建于2020年10月2日，特此以引用的方式并入。
背景技术
随着对人类疾病中抗原特异性T细胞活性的兴趣日益受到关注，需要能够将表位特异性TCR序列与HLA的环境中呈递的同源表位相关联。然而，鉴定哪些表位会导致生产性T细胞激活以及响应T细胞的TCR序列在历史上一直是并将继续是一项技术上具有挑战性的任务。
用于评估抗原特异性T细胞结合和反应性的传统方法包括多聚体染色和功能性T细胞测定，其中T细胞重新暴露于要通过细胞因子或细胞溶解反应(例如，ELISPOT、细胞杀伤测定)检测的表位。虽然这些方法很有用，但它们可能需要昂贵的个别HLA单倍型特异性试剂(多聚体)和大量血液来高通量评估潜在的反应性。此外，很少有HLA II类(CD4+T细胞)多聚体存在，因此大多数基于多聚体的研究都集中在HLA I类(CD8+T细胞)反应性上。
因此，尤其需要一种能够提供将TCR的同源TCRα和β多肽与TCR识别的表位相关联的信息的高通量方法。
发明内容
本文描述了一种免疫细胞测定法，其可用于自体同源和原代免疫细胞，其中可同时测定针对多个感兴趣的T细胞表位的CD8+T细胞和/或CD4+T细胞反应。使用散列标签寡核苷酸(HTO)跟踪系统将抗原反应性与个别T细胞相关联，随后可通过单细胞测序对其进行去卷积以提供单细胞水平信息，例如：(a)表位特异性，(b)单细胞配对α/β链TCR序列，(c)内源性单细胞RNA转录组信息，(d)细胞表面蛋白表达(例如，使用CITE-seq抗体)，(e)多聚体染色(如果包括多聚体)，以及它们的任何组合。因此，本文提供了免疫细胞测定方法、用于所述方法的组合物和试剂盒，以及它们例如用于制备TCR治疗剂的用途。
在一个实施方案中，本文所述的方法包括例如基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含其它细胞，例如自体同源的抗原呈递细胞(APC)的组合物中分选激活T细胞，其中所述激活T细胞用HTO缀合的分子标记。
在一些实施方案中，本文所述的方法(例如，用于鉴定能够激活T细胞的抗原，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列)包括
(I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中T细胞能够识别在表面结合的MHC的环境中呈递的肽；(b)独特抗原；(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其可用于特异性鉴定(和/或特异性鉴定)独特抗原，其中独特HTO与用独特HTO标记T细胞的分子缀合，以及任选地，(d)支持T细胞的激活的培养基，以及
(II)对(I)中分选的激活T细胞进行单细胞测序分析以鉴定与用独特HTO标记激活T细胞的分子缀合的独特HTO，其中鉴定独特HTO鉴定能够将激活T细胞激活的抗原，并且任选地其中单细胞测序分析还鉴定(i)由激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或(ii)由激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
本文所述的一些方法还包括在分选步骤之前建立多个生物样品，例如独特生物样品，使得分选的组合物包含多个独特生物样品。一些方法实施方案包括在分选之前通过将包含从受试者分离的T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞集合平均分布到个别样品中来建立多个生物样品的步骤，其中每个生物样品任选地包含支持T细胞和/或APC活力、激活和/或活性的培养基和细胞因子。
一些方法实施方案包括在分选之前通过向多个生物样品中的每一个递送独特抗原和/或可用于特异性鉴定(和/或特异性鉴定)独特抗原的独特HTO来建立多个独特生物样品的步骤，其中独特HTO与用独特HTO标记T细胞的分子缀合，其中所述多个生物样品中的每一个包括包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，其中在递送独特抗原和/或与用独特HTO标记T细胞的分子缀合的独特HTO后，多个生物样品中的每一个变成独特生物样品，所述独特生物样品包含：(a)包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合；(b)独特抗原；(c)特异性鉴定独特抗原并与用HTO标记T细胞的分子缀合的独特HTO，以及任选地(d)支持T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基。任选地，可在本文中所述的方法中分选之前汇集多个独特生物样品，使得在(I)中分选的组合物包含多个独特生物样品。本文中的一些方法实施方案包括在分选步骤之前建立多个生物样品和建立(例如，从多个生物样品)多个独特生物样品，以及任选地汇集多个独特生物样品以建立可根据本文所述的方法分选的组合物的两个步骤。
在本文所述的一些方法中，分选包括基于AIM的表达对激活T细胞进行荧光激活细胞分选，例如，其中荧光激活细胞分选是基于用特异性结合AIM的荧光标记抗体检测表达AIM的T细胞。这类方法还可包括将独特生物样品(或包含一个或多个独特生物样品的组合物)与特异性结合AIM的荧光标记配体(例如，荧光标记抗体)一起孵育。
在一些实施方案中，本文所述的方法还包括对通过单细胞测序分析的激活T细胞进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之前进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析与单细胞测序分析同时进行。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之后进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，在单细胞测序分析之前、与单细胞测序分析同时和/或在单细胞测序分析之后进行功能和/或表型分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含流式细胞术分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含CITE-seq分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含多聚体分析。在一些实施方案中，功能和/或表型分析包含流式细胞术分析、CITE-seq分析和多聚体分析的任何组合。在一些实施方案中，进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或RNA表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。
在一些实施方案中，本文所述的方法包括鉴定特异性结合抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列，优选地其中TCRα链序列和/或TCRβ链序列分别是TCRα链可变区序列(Vα/Jα序列)和/或TCRβ链可变区序列(Vβ/Jβ序列)。在一些实施方案中，方法包括鉴定特异性结合抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述方法还包括利用TCRα链序列和/或TCRβ链序列来制造治疗剂，例如人类治疗剂。或者，所述方法还可包括鉴定TCRδ/TCRγ序列，例如TCRδ/TCRγ可变区序列。
本文还描述了可用于本文所述的方法中的组合物。在一些实施方案中，组合物包含独特生物样品，所述独特生物样品包含：(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中T细胞能够识别在表面结合的MHC的环境中呈递的肽；(b)抗原；(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其特异性鉴定抗原，其中HTO与用HTO标记T细胞的分子缀合；以及任选地(d)支持T细胞的激活的培养基。在一些实施方案中，组合物包含超过一个生物样品，例如第一和第二生物样品，其中第一生物样品包含：(a)第一T细胞和第一表面结合的MHC，其中第一T细胞能够识别在第一表面结合的MHC的环境中呈递的肽；(b)第一抗原；以及(c)第一HTO，其可用于特异性鉴定，并且优选地特异性鉴定第一抗原，其中第一HTO与用第一HTO标记第一T细胞的第一分子缀合，其中第二生物样品包含(a)第二T细胞和第二表面结合的MHC，其中第二T细胞能够识别在第二表面结合的MHC的环境中呈递的肽；(b)第二抗原；以及(c)特异性鉴定第二抗原的第二HTO，其中第二HTO与用第二HTO标记第二T细胞的第二分子缀合，其中(i)第一T细胞和第二T细胞是从同一个受试者分离，(ii)第一抗原与第二抗原不相同，(iii)用第一HTO标记第一T细胞的第一分子与用第二HTO标记第二T细胞的第二分子相同，并且第一HTO与第二HTO不相同，以及任选地其中第一和第二生物样品中的任一个或两个还包含支持第一T细胞和第二T细胞的激活的培养基。
本文还描述了试剂盒。在一些实施方案中，本文所述的试剂盒包含多种独特抗原和多种独特散列标签寡核苷酸(HTO)，所述多种独特HTO中的每一种可用于特异性鉴定，并且优选地每一种特异性鉴定多种独特抗原中的仅一种。在一些试剂盒实施方案中，多种独特HTO中的每一种与相同的分子缀合，使得试剂盒包含多种独特HTO缀合的分子。在如本文所述的一些试剂盒实施方案中，多种独特抗原中的每一种包含来自单一蛋白质的独特且重叠的肽序列，例如致病性抗原、肿瘤相关抗原或移植抗原。
在本文中的一些实施方案中，表面结合的MHC是细胞膜结合的MHC，例如表面结合的MHC在细胞，例如抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。在一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，APC是单核细胞来源的树突状细胞。在一些组合物、方法、试剂盒或用途实施方案中，APC是树突状细胞。在一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，APC是单核细胞。在一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，APC是巨噬细胞。在一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，APC是B细胞。在一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，表面结合的MHC在细胞群体，例如APC群体的表面上表达，例如，其中APC群体包含单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和它们的任何组合。在一些实施方案中，T细胞和APC是自体同源的。在一些实施方案中，T细胞和APC各自从人类供体分离。在一些实施方案中，外周血单核细胞(例如，从人类供体分离)提供T细胞和表面结合的MHC(例如，在APC表面上表达的MHC。
本文所述的方法、组合物、试剂盒和用途可以有利地用低容量样品，例如低容量人类样品进行。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的从受试者，例如人类受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少两个个别生物样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少三个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少五个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少二十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少三十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少五十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的T细胞和抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的从受试者，例如人类受试者分离的APC和T细胞，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中，每一个包含APC:T细胞比率为约1:1、约1:5或约1:10的APC和T细胞(例如，DC和T细胞)，例如，其中每个样品包含至少约5×103个、5×104个或5×105个DC和约5×103个、1×104个、2.5×104个、5×104个、1×106个、2.5×105个、5×105个、1×106个、2.5×106个或5×106个T细胞，例如细胞集合可来源于约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。
在如本文所述的方法中使用或作为如本文所述的组合物或试剂盒的部分的抗原可(I)为选自由以下组成的组的抗原：(i)细菌抗原或其部分，(ii)病毒抗原或其部分，(iii)过敏原或其部分，(iv)肿瘤相关抗原或其部分，以及(v)它们的组合；和/或(II)包含(i)氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，(iii)溶解产，以及(iv)它们的组合。
本文所述的方法、组合物、试剂盒和用途各自包含与分子缀合的散列标签寡核苷酸(HTO)，所述分子可用于用HTO标记细胞(例如，T细胞)。在一些实施方案中，用于用HTO标记细胞的分子可包含配体，例如抗体。在一些实施方案中，HTO缀合的配体，例如HTO缀合的抗体，结合细胞表面分子。在一些实施方案中，细胞表面分子被大多数细胞普遍表达。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含β2微球蛋白。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含CD298。在一些实施方案中，细胞表面分子可由T细胞选择性地表达。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含选自由以下组成的组的T细胞表面分子：CD2、CD3、CD4、CD8和它们的任何组合。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含CD2。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含CD3。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含CD4。在一些实施方案中，细胞表面分子是或包含CD8。在一些实施方案中，用于用HTO标记细胞的分子可包含脂质，例如所述脂质优选地自身并入细胞膜，例如分裂细胞的细胞膜中。在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含HTO缀合的脂质，例如脂质修饰的寡核苷酸。在一些实施方案中，用于用HTO标记细胞的分子是或包含胆固醇。在一些实施方案中，本文所述的HTO缀合的分子包含HTO缀合的胆固醇，例如胆固醇修饰的寡核苷酸。
本文所述的方法包括基于激活诱导标志物(AIM)的表达分选激活T细胞。因此，本文所述的一些方法、组合物、试剂盒和用途实施方案包含可用于这类分选步骤的剂。在一些实施方案中，所述剂包含特异性结合AIM的荧光标记配体，例如特异性结合AIM的荧光标记抗体。在本文中的一些方法、组合物或试剂盒实施方案中，AIM是或包含在T细胞激活后由T细胞上调的任何标志物。在本文中的一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含选自由以下组成的组的AIM：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT和它们的任何组合。在本文中的一些方法、组合物、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD137/4-1BB。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD107。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含IFNγ。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含PD-1。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD40L。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含OX40。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD25。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD69。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CD28。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含HLA-DR。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含CX3CR1。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含TIM3。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含LAG3。在本文中的一些方法、组合、试剂盒或用途实施方案中，AIM是或包含TIGIT。
如本文所述的方法可包括对通过单细胞测序分析的激活T细胞进行功能和/或表型分析。因此，在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物、套组或用途可包含额外试剂，例如抗体和/或MHC多聚体，它们中的一种或两种可用于流式细胞术分析和/或CITE-seq分析。
本文所述的一些方法、组合、试剂盒和用途实施方案包含支持存在的T细胞(以及任选地其它细胞，例如抗原呈递细胞，例如树突状细胞)的活力、激活和/或活性的培养基。在一些实施方案中，培养基包含一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，培养基包含IL-2。在一些实施方案中，培养基包含IL-4。在一些实施方案中，培养基包含IL-7。在一些实施方案中，培养基包含IL-15。在一些实施方案中，培养基包含IL-21。在一些实施方案中，培养基包含GM-CSF。在一些实施方案中，培养基包含FLT3L。在一些实施方案中，培养基包含IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、GM-CSF和FLT3L的任何组合。在一些实施方案中，培养基包含选自由以下组成的组的细胞因子：IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4和它们的任何组合。
本文还描述了如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒用于分析T细胞介导的患者对疫苗的免疫反应的用途。在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒可用于分析T细胞介导的患者对免疫疗法的免疫反应。在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒可用于分析患者在患者的免疫疗法期间的T细胞介导的免疫反应。在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒可用于分析患者对自身抗原的T细胞反应。在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒可用于分析患者对移植抗原的T细胞反应。在一些实施方案中，如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒可用于鉴定激活T细胞的一个或多个TCR可变区序列(例如，TCRα链的CDR3序列和/或TCRβ链的CDR3序列)。在一些实施方案中，如此鉴定的一个或多个TCR可变区序列可用于产生人类治疗剂，例如包含使用如本文所述的方法、组合物和/或试剂盒鉴定的一个或多个TCR可变区序列的T细胞。
附图说明
图1提供了本发明的非限制性示例性实施方案的图示(未按比例)。简单地说，将各自包含细胞(例如，全外周血单核细胞、自体同源的抗原呈递细胞和T细胞等)、独特抗原和鉴定独特抗原的独特HTO的独特生物样品汇集。使独特生物样品池富集激活T细胞，然后可以分析激活T细胞的功能和表型特征。该方法的详细步骤在下文中描述。
图2A提供了用DMSO、CMV pp65或MART 1抗原引发后T细胞:树突状细胞共培养物的荧光激活细胞分选(FACS)斑点印迹：(a)在用相同的抗原预扩增后和再刺激前，和(b)在用相同的抗原进行24小时再刺激后。通过流式细胞术使用荧光标记的单克隆抗体(CD8和CD137/4-1BB)或dextramer多聚体评估通过CD137/4-1BB或多聚体染色测量的CD8的细胞表面表达和功能激活。图2B提供了从四个不同的供体(x轴)分离的CD8+T细胞的百分比(y轴)，所述细胞与DMSO或CMV pp65一起孵育并结合于阴性多聚体或pp65标记的多聚体(上图)或抗4-1BB抗体(下图)。*阴性多聚体＝具有无关肽的多聚体；FMO＝荧光减一的对照
图3A显示了在用DMSO(基线)或MART1(ELAGIGILTV：SEQ ID NO:15)合成短肽(MART-1再暴露)进行10天预扩增和24小时再刺激后来自健康HLA-A*0201+人类供体(HD3和HD27；x轴)的全外周血单核细胞(PBMC)群体内功能性CD8+T细胞的百分比(y轴)。使用多聚体对基线群体进行染色，并且使用抗CD137/4-1BB抗体对再刺激的群体进行染色。*FMO＝荧光减一的对照；阴性多聚体＝具有无关肽的多聚体。图3B提供了小提琴图，显示来自供体HD27并通过CD137/4-1BB或多聚体染色鉴定(x轴)的所有MART1特异性TCR克隆呈T细胞百分比的克隆频率(上图；y轴)和呈T细胞的数目的克隆大小(下图；y轴)。嵌入在小提琴图中的是箱线图，显示中位数、上四分位数和下四分位数以及四分位数间距(上四分位数与下四分位数之间的距离)。
图4A-B提供了源自独特生物样品的数据，所述独特生物样品包含用hCMV pp65肽预扩增和再刺激并与以下独特抗原之一孵育的T细胞：EBV YVL-9、hCMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1或M型流感病毒。图4A显示了来自ELISPOT测定法的数据，其中通过测量这些生物样品的IFNγ产生(SFC/2×106；y轴)来计算肽特异性T细胞的数目。SPC＝斑点形成菌落。图4B显示了来自用抗CD137/4-1BB(y轴)和抗CD8(x轴)抗体染色的这些生物样品的流式细胞术分析的点图。与DMSO孵育的CD137/4-1BB+CD8+细胞的百分比为0.25％，EBV YVL-9肽为1.27％，CMV pp65肽为约26.2％，EBV LMP2A肽为约3.21％，EBV BMLF1肽为约9.67％，或流感病毒肽为约5.2％。
图5提供了本发明的非限制性实施方案的非限制性图示(未按比例)，其中将包含PBMC、独特抗原多肽(例如，如图4中所述)和独特散列标签寡核苷酸缀合的抗CD2抗体(HTO；1-6)的独特生物样品汇集，使之富集那些表达CD137/4-1BB和CD8的细胞，并通过单细胞测序(5’scSEQ)分析进行分析。尽管例如对于用DMSO、EBV YVL-9、hCMV pp65、EBV LMP2A、EBVBMLF1或M型流感病毒刺激的独特生物样品每一个，显示了6个散列孔，但DMSO群体最终不会提供许多CD8+CD137/4-1BB+T细胞用于单细胞测序分析。
图6A显示了与从独特生物样品中富集的个别CD137/4-1BB+CD8+T细胞相关的散列标签寡核苷酸(HTO-1、HTO-2、HTO-3、HTO-4、HTO-5)(y轴)的水平(标度为0至2.5)，所述独特生物样品各用独特抗原(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1或M型流感；y轴)刺激。还显示了测序超过一种HTO(双重)或未测序HTO(无HTO)的那些CD137/4-1BB+CD8+T细胞。图6B提供了如果每种独特抗原(例如EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EB V BMLF1或M型流感中的每一种)同等地扩增其相关的独特生物样品，则图6A将看上去如何的示意性(未按比例)实例。图6C显示了对于每个CD137/4-1BB+CD8+T细胞群体，来自图6A的分选池的散列细胞的数目(y轴)，所述细胞是关于针对EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、M型流感的反应性鉴定的并且分别对应于HTO-1、HTO-2、HTO-3、HTO-4和HTO-5。还显示了测序超过一种HTO(双重)或未测序HTO(无HTO)的CD137/4-1BB+CD8+T细胞的数目。图6D的上图提供的图显示了在用装载各种肽(x轴)的dextramer染色后用HTO 40(与HTO-5一样，鉴定M型流感抗原)、HTO 47(与HTO-4一样，鉴定EBV BMLF1抗原)或HTO-48(与HTO-2一样，鉴定CMV pp65抗原)散列的富集CD137/4-1BB+T细胞的归一化dextramer表达(计数；y轴)。图6D的下图提供了用HTO-40、HTO-47和HTO-48进行散列标记并针对CD137/4-1BB表达富集的T细胞克隆的克隆大小(x轴)和在上图中描述的实验中鉴定的那些克隆的克隆大小。独特克隆的总数目，例如总克隆，用TC表示。显示与散列抗原对应的dextramer的高表达的克隆数目，例如重叠克隆，用OC表示。
图7A显示了从个别CD137/4-1BB+CD8+T细胞的RNA转录组分析中解析的七个独特簇(簇0-6)，这些T细胞从各用独特抗原(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1或M型流感；y轴)刺激的独特生物样品中富集。每个点代表单个细胞。图7B提供了TCR克隆性图，显示了与针对EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1或M型流感的同源反应性对应的个别T细胞，以及每种反应性的相对TCR克隆大小。每个点代表单个细胞。
图8A提供了个别CD137/4-1BB+T细胞的表型和功能性T细胞标志物(CD3、CD4、CD8a、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD274-PDL1、CD279-PD1、CD127、CD25、CD27、CD28、CD137/4-1BB、CD69、CD278/ICOS、CD197/CCR7)的相对蛋白质表达水平，这些T细胞从各用独特抗原(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1或M型流感；y轴)刺激的独特生物样品中富集，其中个别细胞由一个点表示，并根据图7中描绘的RNA转录组分析进行聚类。图8B中显示了每个细胞的这些相同表型和功能性T细胞标志物的对应RNAseq转录产物表达水平，每个细胞由一个点表示。
图9A显示了基于个别CD137/4-1BB+T细胞的HTO鉴定(1-5)的5个独特簇，这些T细胞从用通过HTO-1、HTO-2、HTO-3、HTO-4或HTO-5鉴定的独特HPV抗原刺激的独特生物样品中富集。每个簇都通过数字和灰度等级来鉴定。簇“M”是那些用多种HTO鉴定的个别细胞。每个点代表个别细胞。图9B复制了图9A的聚类图并显示了代表在整个HTO簇中未共享的TCR克隆，例如，表达对通过HTO鉴定的独特抗原具有特异性的TCR的细胞。相同克隆的细胞由相同的灰度着色表示。图9C复制了图9A-B的聚类图，显示个别细胞的CD137/4-1BB、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3的相对RNA表达水平。还显示了这些细胞的CD137/4-1BB蛋白质表达水平(CITE-Seq)。
具体实施方式
寡核苷酸(寡核苷酸)标记的抗体被开发为绕过传统流式细胞术分析的一种方法。参见例如WO2018144813，以引用的方式整体并入本文中。这类寡核苷酸标记的抗体可用作结合活细胞表面上的蛋白质以帮助单细胞RNA测序(scRNA SEQ)实验的单细胞跟踪的工具。Stoeckius(2017)bioRxiv(也印在(2018)Genome Biology 19:224中)中描述的一种方法使用寡核苷酸标记的抗体，该抗体具有在所有靶细胞上表达的单一蛋白质特异性；以及独特寡核苷酸标签(也称为散列标签寡核苷酸或HTO)，每个样品具有独特序列，以跟踪最终汇集用于测序文库制备的个别样品。在这种方法中，每个细胞都可以用独特寡核苷酸序列进行标记，该序列可以鉴定细胞来自的样品。该寡核苷酸序列被检测出并包括在测序文库中，因此可以从得到的测序信息中确定样品的身份。传统上，散列抗体用于将多个样品汇集(例如，将样品多路复用)到一个单细胞测序(scSEQ)文库制备中，以归一化数据并提高效率。
先前已经描述了HTO在功能测定法中的使用，例如用于表征特定T细胞反应，其中HTO与主要组织相容性复合体(MHC)的多聚体缀合，参见例如Bentzen等人(2016)NatureBiotechnology34:1037-45。MHC由抗原呈递细胞(APC)表达并将肽呈递给识别肽的T细胞。教条上，CD8+T细胞与MHC I配对，而CD4+T细胞与MHC II配对。此外，MHC的极端多态性使得了解哪些等位基因被T细胞识别为自身很重要，因此任何反应都可以说是由肽本身的呈递引起的，而不是外来MHC的呈递。因此，为了能够有效地刺激抗原特异性T细胞并表征肽特异性T细胞反应，肽必须在与相应T细胞在类别和单倍型上匹配的MHC中呈递。
以前，肽特异性T细胞反应是通过功能测定法表征的，所述测定法例如增殖测定法、基于铬的细胞毒性测定法、Ca2+通量测定法以及更常见地，细胞因子检测测定法，例如ELISPOT和细胞内细胞因子流式细胞术染色。Klinger等人(2015)PLoS One DOI:10.1371/journ al.pone.0141561描述了这类测定的多路复用。然而，这些功能测定法的局限性在于它们既不能描述抗原特异性，也不能表征单细胞水平的反应。流式细胞术MHC四聚体染色克服了其中一些限制。通过流式细胞术MHC四聚体染色，可以使用荧光团缀合的负载有感兴趣的肽的MHC多聚体来评估特定T细胞反应。通过对那些与荧光MHC多聚体，有时是其它抗体结合的细胞进行分选，鉴定出特异性结合负载有感兴趣的肽的MHC多聚体并可能被其激活的T细胞。从荧光标记的MHC多聚体到HTO缀合的MHC多聚体的转变消除了可用于表征激活T细胞的少量荧光标签的限制因素。此外，与散列抗体类似，散列MHC多聚体可用于跟踪最终汇集用于序列分析的个别样品，从而检测HTO序列并将其包括在测序文库中，并鉴定与正在分析的T细胞结合的MHC/肽组合。然而，与上述Stoeckius(2017)bioRxiv(也印在(2018)GenomeBiology 19:224中)中描述的方法不同，使用HTO缀合的MHC多聚体提供的不仅仅是样品的跟踪，因为这样的使用还提供了功能分析，例如鉴定能够结合特定T细胞的MHC/肽组合。
本文描述了用于在单细胞水平上跟踪抗原特异性T细胞反应的功能测定法，但该功能测定法不需要(尽管它也不禁止)使用MHC多聚体。通常，本文所述的方法使用散列分子来跟踪来自个别测定孔的激活T细胞。只有在来自所有孔的细胞分别用一种或多种寡核苷酸标记的分子，例如可以掺入细胞膜中的分子(例如，一种或多种寡核苷酸标记的脂质)和/或结合一种或多种普遍存在的细胞表面标志物的分子(例如，一种或多种寡核苷酸标记的抗原结合蛋白)独特标记后，才将不同的独特培养物汇集。由于细胞带有散列标签，因此可以确定它们的来源和同源抗原，无需将样品分开。在汇集后，对激活诱导标志物(AIM)进行流式细胞术分析的功能测定法可用于将那些已激活的细胞与池中未激活的那些细胞分开。
图1中说明性地描绘了本文所述的方法的非限制性示例性图示。如该非限制性实例中所示，在步骤(1)中，独特抗原，例如独特T细胞表位(例如，“1”、“2”、“3”)，可以是蛋白质、肽、RNA、细胞、细胞溶解产物等和/或单个刺激物或刺激物池，将其添加到包含多个生物样品之一的各个孔中，其中多个生物样品中的每一个包含T细胞和被T细胞识别的MHC，例如其中所述多个样品中的每一个包含自体同源的外周血单核细胞(PBMC)。将生物样品与独特抗原一起培养足够使激活T细胞上调激活诱导标志物的时间(例如，6-72小时)。在一些非限制性示例性实施方案中，例如在激活T细胞的再刺激过程中，激活T细胞上调AIM仅需要生物样品与抗原进行过夜培养(例如，约18-24小时)。在一些非限制性实施方案中，生物样品可以首先用抗原引发例如约一或两周，例如约7-14天，以允许反应性T细胞预扩增，然后进行过夜再刺激培养。再刺激后，在步骤(2)中，将每一个单独的孔与独特散列标签寡核苷酸(HTO)一起孵育，所述HTO与并入细胞膜中和/或特异性结合由无论激活状态如何的T细胞表达的细胞表面标志物(例如β2微球蛋白、CD2、CD298、CD3、CD4和/或CD8等)的分子(例如脂质、抗体等)缀合，其中每种独特HTO(例如，“1”、“2”、“3”)鉴定每一个单独的孔中的独特抗原。在步骤(3)中，所有独特生物样品被多路复用，例如汇集，并且在汇集之后，在步骤(4)中，包含独特生物样品池的组合物与可用于检测由激活T细胞表达的激活诱导标志物(例如CD137/4-1BB)的剂和所需的其它单细胞测序和流式细胞术试剂(例如包括但不限于CITE-seq抗体、荧光标记抗体和寡核苷酸标记的多聚体)一起孵育。尽管图1中描绘的非限制性实施方案示出了在汇集之后添加这些额外的试剂，但在其它非限制性实施方案中，可以在汇集之前添加这些额外的试剂。在步骤(5)中，在功能上通过AIM荧光激活细胞分选(FACS)对用可用于检测激活诱导标志物的剂，例如特异性结合激活诱导标志物和另一种T细胞标志物的荧光标记抗体标记的细胞(例如CD137/4-1BB+CD3+T细胞)进行富集。在步骤(6)中，然后分析每个富集细胞的转录组，例如，将分选的细胞的群体封装到10X Genomics单细胞胶珠乳液(Gel Bead-In Emulsions，GEMS)中以将细胞分成单细胞，并对每个细胞进行RNA测序。在图1所示的非限制性实施方案中，产生用于HTO、转录组(5’mRNA)、TCR-seq、CITE-seq和/或寡核苷酸-多聚体的5’测序文库，用于在步骤(6)中进行高通量单细胞测序。在步骤(7)中，在生物信息学上对个别HTO簇进行多路分解，以阐明个别细胞暴露于哪些抗原。
所描述的功能测定法提供了许多好处。例如，本文所述的方法例如通过使用自体同源T细胞和MHC可以完全个性化。此外，它允许同时询问许多反应性，即使要测试的生物样品是有限的。同源抗原/T细胞反应性可以针对单细胞或在汇集细胞水平上进行鉴定。使用非MHC特异性试剂允许在患者样品中灵活应用该方法，并且能够以非MHC限制方式捕获信息，例如可以同时捕获CD4+和CD8+T细胞信息，并且使用功能表型(例如，激活诱导标志物)有助于仅鉴定和评估激活T细胞。此外，本文所述的方法与以快速且具有成本效益的方式评估激活T细胞的表型和转录组的后续方法兼容，可以为个性化疗法的开发和/或决策提供信息。以这种方式，可以评估对疗法(疫苗、免疫疗法等)的免疫反应，例如T细胞对疫苗编码的抗原、病毒抗原和/或肿瘤抗原的反应性。类似地，还可以测定自身免疫反应性，例如T细胞对自身抗原的反应性的免疫监测。本文所述的方法可用于TCR发现和治疗剂开发，例如在许多感兴趣的抗原中筛选感兴趣的TCR，和/或用于TCR:表位结合发现和算法生成。例如，由本文所述的方法提供的表位:TCR序列数据的编译可以帮助发现关于TCR序列和/或与特定HLA-肽结合相关的结构特征的单倍型特异性规则。
因此，本文描述了包括以下一个或多个步骤的方法：
将包含T细胞和MHC的生物样品散列，例如，将生物样品与独特抗原(例如，T细胞表位)和独特条形码(例如，散列标签寡核苷酸)一起孵育以形成独特生物样品，
汇集多个独特生物样品，
基于功能测定法(例如，AIM分选，例如使用针对激活诱导标志物的荧光标记抗体，例如CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3和/或TIGIT)富集激活T细胞，
对激活细胞(例如，在单细胞基础上)进行测序方法和任选的其它众所周知的方法(例如，CITE-seq分析、流式细胞术分析和/或多聚体染色)，以鉴定(a)激活T细胞的独特条形码，由此鉴定将T细胞激活的抗原，和任选地(b)可用于鉴定例如激活T细胞的TCRα和β序列的其它序列，例如用于治疗剂开发。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一(a/an)”和“所述”包括复数提及物。因此，例如，对“一种方法”的提及包括一种或多种方法，和/或本文所述类型的和/或在阅读本公开后对于本领域技术人员将变得显而易见的步骤。
术语“约”或“大约”包括在有意义的值范围内。术语“约”或“大约”所涵盖的允许变化取决于研究中的特定系统，并且本领域普通技术人员容易理解这一点。
T细胞结合抗原呈递细胞表面上与主要组织相容性复合体(MHC)相关的小抗原决定簇上的表位。T细胞通过T细胞表面上的T细胞受体(TCR)复合物结合这些表位。T细胞受体是由两种类型的链构成的异二聚体结构：一条α(α)和β(β)链，或一条γ(γ)和δ(δ)链。α链由位于人类14号染色体(还涵盖整个δ基因座)上的α基因座内的核酸序列编码，而β链由位于人类7号染色体上的β基因座内的核酸序列编码。大多数T细胞具有αβTCR；而少数T细胞具有γδTCR。尽管本文通常提及α和β链，但本文所述的方法、组合物和试剂盒可类似地应用于γδTCR链。
T细胞受体α和β多肽(以及类似的γ和δ多肽)经由二硫键相互连接。构成TCR的两种多肽中的每一种都含有一个包含恒定区和可变区的细胞外结构域、一个跨膜结构域和一个胞质尾(跨膜结构域和胞质尾也是恒定区的一部分)。TCR的可变区决定了它的抗原特异性，并且与免疫球蛋白类似，包含3个互补决定区(CDR)，例如CDR1、CDR2和CDR3。同样与免疫球蛋白基因相似的是，T细胞受体可变基因座(例如，TCRα和TCRβ基因座)含有许多未重排的V(D)J区段(可变(V)区段、连接(J)区段和在TCRβ和δ中多样性(D)区段)。在胸腺T细胞发育过程中，TCRα可变基因座发生重排，使得产生的TCRα可变结构域由VJ区段的特定组合(Vα/Jα序列)编码；并且TCRβ可变基因座发生重排，使得产生的TCRβ可变结构域由VDJ区段的特定组合(Vβ/Dβ/Jβ序列)编码。TCRα和β可变结构域，特别是CDR1、CDR2和CDR3，更特别是CDR3，提供了TCR结合MHC的特异性。
术语“主要组织相容性复合体”和“MHC”涵盖术语“人类白细胞抗原”或“HLA”(后两个通常保留用于人类MHC)、天然存在的MHC、MHC的个别链(例如MHC I类α(重)链、β2微球蛋白、MHC II类α链和MHC II类β链)、这类MHC链的个别亚基(例如，MHC I类α链的α1、α2和/或α3亚基、MHC II类α链的α1-α2亚基、MHC II类β链的β1-β2亚基)以及其部分(例如肽结合部分，例如肽结合槽)、突变体和各种衍生物(包括融合蛋白)，其中这类部分、突变体和衍生物保留了展示抗原肽以供T细胞受体(TCR)，例如抗原特异性TCR识别的能力。MHC I包含由重α链的α1和α2结构域形成的肽结合槽，它可以储存大约8-10个氨基酸的肽。尽管两类MHC都结合肽内约9个氨基酸(例如，5至17个氨基酸)的核心，但MHC II类肽结合槽(MHC II类α多肽的α1结构域与MHC II类β多肽的β1结构域结合)的开放性质允许更宽范围的肽长度。结合MHC II类的肽的长度通常在13至17个氨基酸之间变化，但更短或更长的长度并不少见。因此，肽可能会在MHC II类肽结合槽内移动，从而在任何给定时间改变哪个9聚体直接位于槽内。
术语“抗原”涵盖当被引入免疫活性宿主时被宿主的免疫系统识别并引发宿主的免疫反应的任何作用物(例如，蛋白质、肽、多糖、糖蛋白、糖脂质、核苷酸、它们的部分或它们的组合)。T细胞受体(TCR)识别在主要组织相容性复合体(MHC)的环境中呈递的肽，作为免疫突触的一部分。肽-MHC(pMHC)复合物被TCR识别，其中肽(抗原决定簇)和TCR独特型提供了相互作用的特异性。因此，术语“抗原”涵盖在MHC的环境中呈递的肽，例如肽-MHC复合物，例如pMHC复合物。MHC上展示的肽也可以称为“表位”或“抗原决定簇”。术语“肽”、“抗原决定簇”、“表位”等不仅涵盖由抗原呈递细胞(APC)天然呈递的那些，而且可以是任何所需的肽，只要它在适当地呈递给T细胞时被T细胞识别即可。例如，具有人工制备的氨基酸序列的肽也可以用作表位。
TCR与同源pMHC的结合通常是短暂的，不过这种相互作用可以通过“亲合力效应”来稳定，这种效应是通过例如使用多聚体，例如四聚体、dextramer等将多个pMHC并入单个骨架(例如表面)上提供的。已经使用了各种pMHC多聚化平台，其中许多是可购得的。参见例如Wooldridge等人(2009)Immunol.126:147-64。为了提供这种亲合力效应，在一些实施方案中，本文中的MHC优选地是表面结合的，以便可以获得适当密度的MHC。
在本文公开的非限制性实施方案中，MHC可以结合的非限制性示例性表面包括
a.细胞膜，例如，其中MHC在抗原呈递细胞(例如，专职抗原呈递细胞，例如树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和B细胞)、脂质体表面、病毒载体包膜等上表达，
b.珠粒，
c.细胞培养皿，例如多孔板的孔，以及
d.多聚体，例如四聚体、dextramer等。
抗原可以包含合成肽、蛋白质、mRNA、病毒、病毒载体、DNA、活细胞、细胞溶解产物等。在一些非限制性实施方案中，抗原是肿瘤相关抗原，包括其肽部分。在这样的实施方案中，肿瘤相关抗原可以选自由以下组成的组：ALK、BAGE蛋白、BIRC5(生存素(survivin))、BIRC7、CA9、CALR、CCR5、CD19、CD20(MS4A1)、CD22、CD27、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD52、CD56、CD79、CDK4、CEACAM3、CEACAM5、CLEC12A、EGFR、EGFR变体III、ERBB2(HER2)、ERBB3、ERBB4、EPCAM、EPHA2、EPHA3、FCRL5、FLT3、FOLR1、GAGE蛋白、GD2、GD3、GPNMB、GM3、GPR112、IL3RA、KIT、KRAS、LGR5、EBV来源的LMP2、L1CAM、MAGE蛋白、MLANA、MSLN、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC16、MUM1、ANKRD30A、NY-ESO1(CTAG1B)、OX40、PAP、PAX3、PAX5、PLAC1、PRLR、PMEL、PRAME、PSMA(FOLH1)、RAGE蛋白、RET、RGS5、ROR1、SART1、SART3、SLAMF7、SLC39A6(LIV1)、STEAP1、STEAP2、TERT、TMPRSS2、汤普森诺抗原(Thompson-nouvelle antigen)、TNFRSF17、TYR、UPK3A、VTCN1、WT1。
在另一个实施方案中，抗原可能与传染病有关。在这样的实施方案中，例如，在添加传染原或源自其的表位下，生物样品可以变成独特生物样品。在一个这样的实施方案中，传染病相关抗原可以是病毒抗原并且病毒抗原选自由以下组成的组：HIV、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、疱疹病毒(例如HSV-1、HSV-2、CMV、HAV-6、VZV、爱泼斯坦巴尔病毒(EpsteinBarr virus))、腺病毒、流感病毒、黄病毒、埃可病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(例如，SARS-CoV-2)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV、登革热病毒(dengue virus)、乳头瘤病毒、软疣病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病病毒、JC病毒、埃博拉病毒(ebola virus)和虫媒病毒性脑炎病毒抗原。在另一个这样的实施方案中，传染病相关抗原可以是细菌抗原并且细菌抗原选自由以下组成的组：衣原体(chlamydia)、立克次体(rickettsia)、分枝杆菌(mycobacteria)、葡萄球菌(staphylococci)、链球菌(streptococci)、肺炎球菌(pneumococci)、脑膜炎球菌(meningococci)、淋球菌(gonococci)、克雷伯氏菌(klebsiella)、变形杆菌(proteus)、沙雷氏菌(serratia)、假单胞菌(pseudomonas)、军团菌(legionella)、白喉(diphtheria)、沙门氏菌(salmonella)、杆菌(bacilli)、霍乱(cholera)、破伤风(tetanus)、肉毒杆菌中毒(botulism)、炭疽(anthrax)、鼠疫、钩端螺旋体(leptospira)和莱姆病(Lyme disease)细菌抗原。
如本文所述的方法中使用的术语“生物样品”是指一种培养物，其包含生物活性细胞、生物活性细胞的激活剂和任选地支持细胞活力和/或生物活化，例如细胞活性的培养基。生物活性细胞可以是同质细胞群体，例如特定类型的分离细胞(例如，T细胞)，或不同细胞类型的混合物(例如，外周血单核细胞(PBMC)、抗原呈递细胞(APC)和T细胞的共培养物、树突状细胞(DC)和T细胞的共培养物等)，它们可以从受试者(例如人或哺乳动物或其它物种受试者)分离或包含从所述受试者分离的生物流体或组织。作为非限制性实例，生物流体或组织可包括血清、血浆、全血、外周血、唾液、尿液、阴道或宫颈分泌物、羊水、胎盘液、脑脊液、浆液或粘膜分泌物(例如，口腔、阴道或直肠)。还有其它样品包括血液来源或活检来源的生物样品或组织，例如包含肿瘤浸润淋巴细胞(例如，肿瘤)、硬结等的组织。
本文公开的一些非限制性生物样品包含T细胞和呈递抗原(例如，T细胞表位)的表面结合的MHC，例如生物活性细胞是T细胞并且激活剂是呈递抗原(例如，T细胞表位)的表面结合的MHC。本文公开的一些非限制性生物样品包含T细胞、呈递抗原(例如，T细胞表位)的表面结合的MHC，以及一种或多种支持T细胞的活力、激活和/或活性的细胞因子，例如生物活性细胞是T细胞，激活剂是呈递抗原(例如，T细胞表位)的表面结合的MHC，并且培养基包含一种或多种支持T细胞的活力、激活和/或活性的细胞因子。在一些实施方案中，支持T细胞的活力、激活和/或活性的细胞因子包含选自由IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21和它们的组合组成的组的白细胞介素。本文公开的一些非限制性生物样品包含T细胞和呈递抗原的表面结合的MHC，其中MHC在抗原呈递细胞如体细胞的表面上表达，抗原呈递细胞可以任选地是专职抗原呈递细胞，选自由单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和B细胞组成的组。这些包含T细胞和呈递抗原的表面结合的MHC(其中MHC在抗原呈递细胞的表面上表达)的非限制性生物样品可以任选地进一步包含支持T细胞的活力、激活和/或活性的细胞因子(例如IL-2、IL-4、IL-7、IL-15和/或IL-21)和/或支持抗原呈递细胞的活力、激活和/或活性的细胞因子(例如，GM-CSF、FLT3L和/或IL-4)。可用于支持T细胞和/或抗原呈递细胞的活力、激活和/或活性的额外细胞因子或细胞因子组合(以及其支持T细胞和/或抗原呈递细胞的活力、激活和/或活性的量)是本领域众所周知的。在一些实施方案中，在支持细胞活力的培养基中包括激活APC的其它因子，例如IFNα、LPS、聚-IC、TNF、IL-1β、IL-6、PGE2等。
生物样品通常获自或源自特定来源、受试者或患者。
“个体”或“受试者”或“动物”是指人类、兽医动物(例如猫、狗、牛、马、羊、猪等)和疾病的实验动物模型(例如小鼠、大鼠)。在一个实施方案中，受试者是人。
在本文的非限制性实施方案中，生物样品包含源自受试者的外周血单核细胞(PBMC)。本文所述的生物样品可包含新分离的PBMC、曾冷冻保存的新鲜解冻的PBMC，或曾被引发，例如在抗原存在下培养约一周以扩大记忆反应性和增加测定信号的PBMC。
通常，如本文所述的生物样品(例如，独特生物样品)包含足以支持T细胞响应抗原发生激活的数目的T细胞和表面结合的MHC，例如至少1×105个、5×105个、1×106个或更多全外周血单核细胞。散列与多路复用的组合有利地提供了在低血容量样品，例如低容量人血样品上执行本文所述的方法，因为1mL全(人)血可以包含5×105至3×106任何数目的外周血单核细胞(PBMC)和/或可用于分离5×103至5×105任何数目的APC(例如，树突状细胞)和5×103至5×106任何数目的T细胞。作为非限制性实例，源自从受试者分离的10mL全血的细胞集合可以包含5×106至3×107任何数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中，例如至少20个生物样品，每个生物样品包含约1×105至1×106个PBMC和/或1×105至5×105个DC和1×105至5×106个T细胞等，然后可以将它们汇集(在各自添加独特抗原和/或独特HTO后)并根据本文所述的方法进行测定。因此，在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的外周血单核细胞(PBMC)，使得细胞集合可以均匀地分布到多个生物样品中。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少两个个别生物样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少三个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少五个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少二十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少三十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的PBMC，使得细胞集合可以均匀地分布到至少五十个个别样品中，每一个包含至少约1×105个PBMC、至少约5×105个PBMC或至少约1×106个PBMC，例如细胞集合可来源于约1mL、约3mL、约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的T细胞和抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的T细胞和抗原呈递细胞(APC)(例如，树突状细胞(DC))，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中。在一些实施方案中，细胞集合包含足够数目的从受试者，例如人类受试者分离的APC和T细胞，使得细胞集合可以均匀地分布到多个个别生物样品中，每一个包含APC:T细胞比率为约1:1、约1:5或约1:10的APC和T细胞(例如，DC和T细胞)，例如其中每个样品包含至少约5×103个、5×104个或5×105个DC和约5×103个、1×104个、2.5×104个、5×104个、1×106个、2.5×105个、5×105个、1×106个、2.5×106个或5×106个T细胞，例如细胞集合可来源于约5mL、约10mL、约15mL、约20mL或约50mL从受试者，例如人类受试者分离的全血。
从受试者分离的生物样品可以进一步用盐水、缓冲液或生理学上可接受的稀释剂稀释。或者，来自受试者的生物样品可以通过常规方式浓缩。从受试者分离的生物样品还可以分成两个或更多个等分试样以形成“多个生物样品”，其中多个生物样品中的每一个包含大约相同数目的生物活性细胞(例如，T细胞)和大约相同量的支持试剂。因此，除非另有说明，否则如本文所用的“多个生物样品”是指多个不同的生物活性细胞群体，其中每个生物活性细胞群体从同一个受试者分离，包含大约相同数目的生物活性细胞，并保持在类似的培养条件下，例如具有支持生物活性细胞的活力、激活和/或活性的支持试剂。
在本发明的一些实施方案中，通过与抗原孵育约一周(例如，约7-10天)，离体引发生物样品，例如预扩增，然后在体外用抗原再刺激约一至三天(例如6-72小时，例如18-24小时)并且随后对独特生物样品进行散列、富集和/或分析。在本发明的一些实施方案中，在用抗原进行体外再刺激和随后对生物样品进行散列、富集和/或分析独特生物样品之前，不离体引发生物样品。对于那些在体内可能已经遇到抗原的生物样品，通常不需要离体引发。包含T细胞的生物样品的引发和再刺激方案，包括相同的时间选择(例如引发7-10天，以及再刺激6-72小时，例如18-24小时)是本领域中众所周知的。
在一些非限制性实施方案中，多个生物样品中的每一个通过与其自身的独特刺激物或独特刺激物组合(例如，抗原或抗原池(例如，T细胞表位))和/或其自身的独特条形码，例如用于散列标记和任选多路复用的(散列标签寡核苷酸)一起孵育而变成独特生物样品。
如本文所用的“散列标记”、“散列”、“标记”等包含使独特生物样品的生物活性细胞与缀合至独特条形码，例如独特散列标签寡核苷酸(HTO)的分子接触，其中独特条形码鉴定独特生物样品的独特特征，例如独特抗原(例如，独特T细胞表位)或缺乏独特抗原，并且其中分子并入生物活性细胞的细胞膜中和/或与生物活性细胞表达的细胞表面标志物特异性结合，无论生物活性细胞的激活状态如何。在一些实施方案中，HTO-分子可以并入任何细胞，例如任何分裂细胞中，和/或结合由大多数或所有细胞表达的细胞表面标志物(例如，β2微球蛋白、CD298)。在一些实施方案中，选择的细胞标志物由无论激活状态如何的T细胞表达(例如CD2、CD3、CD4和/或CD8等)。在一些实施方案中，在以两种或更多种不同的方式用HTO标记细胞的两种或更多种分子(例如，一种分子可以将其自身并入细胞膜中而另一种结合标志物，两种或更多种分子可以结合两种或更多种不同的标志物)各与HTO缀合并且各用于散列标记方法中以标记相同的独特生物样品的情况下，两种或更多种分子可以包含相同的条形码。在一些实施方案中，用于散列标记独特生物样品的两种或更多种标志物可以是相同或不同的标志物。在一些实施方案中，第一独特生物标志物可以用与第一独特条形码如第一HTO缀合的第一分子标记，第二独特生物样品用与第二独特条形码如第二HTO缀合的第二分子标记，并且第三生物样品用与第三条形码如第三条形码缀合的第三分子标记，其中第一分子、第二分子和第三分子中的每一个是相同的，例如，每一个都将自身并入细胞膜中或特异性结合相同的标志物，但是其中第一分子、第二分子和第三分子中的每一个都包含独特条形码，该条形码足够不同以致于可以区分第一分子、第二分子和第三分子每一个。在洗去未结合的分子后，可以汇集独特散列的独特生物样品并任选地与额外的试剂孵育，以对抗原特异性的激活T细胞群体进行进一步的功能和表型分析(例如，流式细胞术分析和/或荧光细胞激活分选、单细胞序列分析等)，因为散列标记允许以后检测、跟踪和/或定量源自同一样品的每个样品和靶标。
一些非限制性实施方案可以进一步增强本文所述的方法的灵敏度和/或稳健性。例如，在一些非限制性实施方案中，每个scSEQ样品汇集20个潜在反应性的寡核苷酸散列的测定样品通常引起足够的富集。在一些实施方案中，可以采用组合散列方法来增加测定的灵敏度。例如，以两种或更多种不同的方式用各自的HTO各自标记细胞的两种或更多种分子(例如，一种分子可以将其自身并入细胞膜中而另一种结合标志物，两种或更多种分子可以结合两种或更多种不同的标志物等(例如，β2微球蛋白和CD2))各与相同的条形码，例如包含相同序列的HTO缀合，并且各用于散列标记方法中以标记相同的独特生物样品。
“散列标签寡核苷酸”、“HTO”等的产生和使用，包括散列标签寡核苷酸例如与分子(例如抗体或其它大分子，例如脂质)的缀合，是众所周知的，所述分子任选地并且在一些非限制性实施方案中优选结合激活诱导标志物。参见例如WO2018144813；Stoeckius等人(2018)Genome Biol.19:224；van Buggenum JAGL等人，每篇参考文献均以引用的方式整体并入本文中。通常，HTO包含独特条形码，例如包含独特序列的核酸，该独特序列可根据标准聚合酶链式反应方案，例如对细胞转录组进行测序的单细胞RNA测序方案测定(参见例如Stoeckius等人(2017)Nat.Method 9:2579-10)，在本文所述的实施方案中，该独特序列鉴定激活生物样品，例如使生物样品表达激活诱导标志物的刺激物或刺激物组合。缀合化学，例如iEDDA点击化学，可用于将散列标签寡核苷酸与分子(例如结合细胞表面标志物，例如组成型表达的细胞表面标志物的配体)缀合，例如共价连接。在一些实施方案中，细胞表面标志物由大多数或所有细胞表达，包括T细胞(例如，β2微球蛋白、CD298)。在一些实施方案中，选择由无论激活状态如何的T细胞表达的细胞标志物(例如CD2、CD3、CD4和/或CD8等)。尽管本文描述了寡核苷酸标记的抗体，但可以使用抗体之外的其它的寡核苷酸标记的跟踪分子，例如寡核苷酸标记的并入细胞膜的脂质和细胞穿透性核酸，特别是用于基于单细胞测序分析的进一步功能和/或表型表征。
在这些组合物和方法中使用的散列标签寡核苷酸(HTO)可以缀合可用于标记细胞的任何天然存在的或合成的生物或化学分子，例如并入细胞膜中的脂质和/或与单个已鉴定的标志物特异性结合的配体。结合可以是共价的或非共价的，即缀合或通过考虑到配体和其相应靶标的性质的任何已知方式。术语“第一HTO缀合的分子”和“额外HTO缀合的分子”或“第二HTO缀合的分子”等是指以不同方式标记细胞的HTO缀合的分子，例如，一种分子可以将自身并入细胞膜中而第二分子结合标志物，两种或更多种分子可以结合不同的靶标或靶标的不同部分。例如，多个“第一HTO缀合的分子”并入细胞膜中或在同一位点与相同标志物结合。多个额外HTO缀合的分子与不同于第一HTO缀合的分子且不同于任何额外HTO缀合的分子的标志物结合。HTO缀合的分子(例如，第一HTO缀合的分子和额外HTO缀合的分子，例如第二、第三、第四和第五HTO缀合的分子等)可以独立地选自肽、蛋白质、抗体或抗体片段(例如，抗体的抗原结合部分)、抗体模拟物、亲和体(affibody)、核糖或脱氧核糖核酸序列、适体、脂质、胆固醇、多糖、凝集素或由多个相同或不同分子形成的嵌合分子。HTO缀合的分子的其它非限制性实例包括包含Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、单链Fv(scFv)、双链抗体(Dab)、合成抗体、纳米抗体、BiTE、SMIP、DARPin、DNL、双运载蛋白(Duocalin)、粘附蛋白(adnectin)、fynomer、Kunitz结构域Albu-dab、DART、DVD-IG、Covx体、肽体、scFv-Ig、SVD-Ig、dAb-Ig、杵臼结构(Knob-in-Hole)、三功能抗体(triomAb)等或它们的组合的那些。在一些实施方案中，与HTO缀合的分子是重组的或天然存在的蛋白质。在某些实施方案中，与HTO缀合的分子是单克隆或多克隆抗体或它们的片段。在一个实施方案中，HTO缀合的分子本身也可以用一种或多种可检测标志物直接标记，例如可以根据众所周知的方法通过独立于测量或检测条形码如HTO的方法的方法测量的荧光团。
在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含自身并入细胞膜中的脂质。在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含自身并入细胞膜中的胆固醇。在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含脂质和胆固醇修饰的寡核苷酸(LMO和CMO)。参见例如McGinnis等人(2019)NatureMethods 16:619-26，以引用的方式整体并入。
用于抗原特异性激活T细胞群体的进一步的功能和表型分析的测定法是本领域众所周知的，并且包括但不限于使用荧光标记的结合蛋白(例如，抗体)或MHC多聚体的荧光细胞激活分选和/或流式细胞术分析、单细胞RNA测序(scRNA-seq)和/或通过测序对转录组和表位进行细胞索引(CITE-seq)分析等。“流式细胞术”涵盖如下方法，所述方法包括将细胞或颗粒悬浮在流体中并将悬浮液注入流式细胞仪中，该流式细胞仪将样品集中，以在理想情况下一次使一个细胞通过激光束，其中散射的光是细胞和其成分所特有的。用荧光标记进行标记的细胞吸收激光并以可用于区分细胞的波长带发射。在一个优选的实施方案中，在散列和汇集之后，使独特生物样品富集激活T细胞，例如针对那些表达激活诱导标志物的细胞进行分选。在一个实施方案中，在细胞的任何进一步的功能和表型分析之前或同时，例如在任何额外的流式细胞术分析和/或单细胞序列分析(其可能包括在分选之前或之后添加到生物样品中的任何CITE-seq试剂的CITE-seq分析)之前或同时，使用针对激活诱导标志物的荧光标记抗体和荧光激活细胞分选(FACS)使细胞富集激活T细胞，例如分选。“CITE-seq”涵盖如下方法，其中使用寡核苷酸标记的分子(例如寡核苷酸标记的抗体)来测量样品的蛋白质表达水平，例如在如Stoeckius等人(20017)Nat.Methods14:865-868(以引用的方式整体并入本文中)中描述的单细胞测序方法期间。在一些非限制性实施方案中，细胞的进一步的功能和表型分析包括用荧光标记抗体进行流式细胞术分析，所述抗体检测细胞表面标志物(例如额外的激活标志物)或细胞内蛋白质(例如细胞内细胞因子)的蛋白质表达水平。在一些非限制性实施方案中，细胞的进一步的功能和表型分析包括每个激活细胞的单细胞RNA测序。用于单细胞RNA测序的非限制性示例性平台包括但不限于基于平板的方法或微流体/纳米孔方法，例如基于液滴的微流体方法，例如但不限于Dr op-seq(Macosko等人(2015)Cell 161:1202-14)、InDrop(Kein等人(2015)Cell161:1187-1201)、10X Genomics(Zhen等人(2017)Nat.Commun.8:1-12)和
Figure BDA0003583078660000311
单细胞测序解决方案。由于mRNA表达水平可能与细胞中的蛋白质表达水平没有很好的相关性，因此在一些非限制性实施方案中，单细胞RNA测序与CITE-Se q分析相结合，使用例如寡核苷酸标记的抗体、MHC多聚体等进行(参见例如WO2018144813，以引用的方式整体并入本文中)。
“激活诱导标志物”(AIM)是一种在T细胞激活后表达或表达上调的标志物。众所周知的T细胞激活诱导标志物包括但不限于CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT等。在一些实施方案中，T细胞激活标志物，例如激活诱导标志物，包含CD40L。CD40L也可以称为CD154。在一些实施方案中，T细胞激活标志物，例如激活诱导标志物，包含CD137。CD137在本文中也称为4-1BB。因此，CD137/4-1BB是指本领域已知为CD137、4-1BB等的分子，并且短语“CD137”、“4-1BB”和“CD137/4-1BB”可以互换使用。CD137/4-1BB是一种短暂T细胞激活标志物，它在抗原特异性TCR结合后迅速上调，并在细胞上保持表达约72小时。在本文所述的方法中，暴露于抗原后20-36小时似乎是CD137/4-1BB表达的功能富集和检测的最佳时间点。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含CD107。CD107也可以称为CD107a或LAMP1。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含干扰素γ(IFNγ)，其也可称为γ干扰素、IFNG、IFG等。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含PD-1，也可称为程序性细胞死亡1、CD279和HPD-1。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含TNF受体超家族成员4，其也可称为OX40和/或CD134。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含白细胞介素-2受体α，其也可称为IL-2R、IL-2Rα和/或CD25。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含CD69，其也可称为白细胞表面抗原Leu-23和/或MLR3。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含CD28，其也可称为Tp44和/或T细胞特异性表面糖蛋白。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含主要组织相容性复合体II类DR，其也可称为HLA-DR。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含CXC基序趋化因子受体(CX3CR1)，其也可称为IL-8受体、IL-8Rα和/或CDw128a。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含TIM3，其也可称为甲型肝炎病毒细胞受体2、T细胞膜蛋白3和/或CD366。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含淋巴细胞活化基因3(LAG3)，其也可称为CD223。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)，其也可称为含V-Set和免疫球蛋白结构域蛋白9(VSIG9)和/或含V-Set和/或跨膜结构域3(VSTM3)。
术语“免疫球蛋白”、“抗体(antibody)”、“抗体(antibodies)”、“结合蛋白”等是指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab')片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、内抗体、微抗体、双链抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对抗原特异性TCR的抗Id抗体)，和任何上述抗体的表位结合片段。术语“抗体”还指共价双链抗体，例如美国专利申请公布20070004909(以引用的方式整体并入本文)中公开的那些，以及Ig-DARTS，例如美国专利申请公布20090060910(以引用的方式整体并入本文)中公开的那些。
如本文所用，术语“可检测标记”意指能够提供可检测的信号的试剂、部分或化合物，这取决于所采用的测定格式。标记可以仅与分子相关和/或与独特条形码(例如独特HTO)或其功能部分相关。或者，可以对HTO缀合的分子的每个组分使用不同的标记。这类标记能够单独或与其它组合物或化合物一起提供可检测的信号。在一个实施方案中，标记是相互作用的以产生可检测的信号。在一个具体的实施方案中，标记是可视觉检测的，例如比色检测。多种酶系统可在测定中显示比色信号，例如葡萄糖氧化酶(其使用葡萄糖作为底物)释放过氧化物作为产物，在过氧化物酶和氢供体(如四甲基联苯胺(TMB))存在下会产生氧化的TMB，看上去为蓝色。其它实例包括辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)，以及己糖激酶与6-磷酸葡萄糖脱氢酶结合，与ATP、葡萄糖和NAD+反应，除其它产物外，产生NADH，检测到NADH在340nm波长下吸光度增加。可用于所述方法和分子的其它标记系统可通过其它方式检测，例如嵌入染料的有色乳胶微粒(Bangs Laboratories,Indiana)可用于代替酶以在适用的测定中提供指示标记分子存在的视觉信号。还有其它标记包括荧光化合物、荧光团、放射性化合物或元素。在一个实施方案中，荧光可检测荧光染料，例如异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、别藻蓝蛋白(APC)、柯里膦-0(coriphosphine-0，CPO)或串联染料、PE-花青苷-5或-7(PC5或PC7)、PE-德州红(Texas Red)(ECD)、PE-花青苷-5.5、罗丹明、PerCP和Alexa染料。可以使用这些标记的组合，例如德州红和罗丹明、FITC+PE、FITC+PECy5和PE+PECy7等，取决于测定方法。适用于标记分子和/或聚合物分子的任何组分的标记的选择和/或产生在本说明书提供的本领域技术范围内。
术语“特异性结合”、“以特异性方式结合”等指示参与特异性结合的分子(1)在生理条件下能够稳定结合，例如缔合，例如形成分子间非共价键，并且(2)在生理条件下不能与指定结合对之外的其它分子稳定结合。
术语“蛋白质”涵盖所有种类的天然存在的和合成的蛋白质，包括所有长度的蛋白质片段、融合蛋白和改性蛋白质，包括但不限于糖蛋白，以及所有其它类型的改性蛋白质(例如，由磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、棕榈酰化、糖基化、氧化、甲酰化、酰胺化、聚谷氨酰化、ADP-核糖基化、聚乙二醇化、生物素化等产生的蛋白质)。
除非另有说明，否则术语“寡核苷酸”、“核酸”和“核苷酸”涵盖DNA、RNA、修饰碱基或这些碱基的组合。在一些实施方案中，散列标签寡核苷酸包含DNA。在一些实施方案中，散列标签寡核苷酸包含3至100个、3至50个、3至30个、5至30个、10至20个、5至20个或5至15个核苷酸。在一些实施方案中，散列标签寡核苷酸包含至少3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、80个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或多达100个核苷酸的序列。在一些实施方案中，散列标签寡核苷酸包含多聚A序列，其可包含十个或更多个(例如，10-40个、10-30个或10-20个)连续腺苷核苷酸、腺苷核苷酸的衍生物或变体。
术语“自体同源”是指从同一来源分离的生物组分，并且包括那些不是从同一来源分离但具有的物理(例如，氨基酸序列)和功能特征就好像这些生物组分是从同一来源分离的一样的生物组分。相反，“异源”是指来自不同来源的作用物或实体。
根据本文的公开内容，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有充分的解释。参见Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版.Cold Spring Harbor,NY:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989(本文中“Sambrook等人,1989”)；DNA Cloning:APractical Approach,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编辑1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins编辑(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney编辑(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRLPress,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；Ausubel,F.M.等人(编辑).Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley&Sons公司,1994，这些出版物中的每一个以引用的方式整体并入本文中。这些技术包括定点诱变，参见例如Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492(1985)；美国专利No.5,071,743；Fukuoka等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.263:357-360(1999)；Kim和Maas,BioTech.28:196-198(2000)；Parikh和Guengerich,BioTech.24:4 28-431(1998)；Ray和Nickoloff,BioTech.13:342-346(1992)；Wang等人,BioTech.19:556-559(1995)；Wang和Malcolm,BioTech.26:680-682(1999)；Xu和Gong,BioTech.26:639-641(1999)；美国专利No.5,789,166和5,932,419；Hogrefe,Strategies l4.3:74-75(2001)；美国专利No.5,702,931、5,780,270和6,242,222；Angag和Schutz,Biotech.30:486-488(2001)；Wang和Wilkinson,Biotech.29:976-978(2000)；Kang等人,Biotech.20:44-46(1996)；Ogel和McPherson,Protein Engineer.5:467-468(1992)；Kirsch和Joly,Nucl.Acids.Res.26:1848-1850(1998)；Rhem和Hancock,J.Bacteriol.178:3346-3,349(1996)；Boles和Miogsa,Curr.Genet.28:197-198(1995)；Barrenttino等人,Nuc.Acids.Res.22:541-542(1993)；Tessier和Thomas,Meths.Molec.Biol.57:229-237；以及Pons等人,Meth.Molec.Biol.67:209-218；这些出版物中的每一个以引用的方式整体并入本文中。
方法和组合物
本文所述的组合物和方法可用于(a)检测从受试者，例如人类受试者分离的生物样品，例如细胞的功能激活的不存在或存在，和/或(b)鉴定刺激物和任选地独特同源TCR序列。
在一个实施方案中，本文所述的用于鉴定能够激活T细胞的抗原，例如T细胞表位，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列，例如T细胞表位的方法包括：
(I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)独特抗原，
(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其可用于特异性鉴定，优选地特异性鉴定所述独特抗原，其中所述独特HTO与用独特HTO标记T细胞的分子缀合，和任选地，
(d)支持T细胞的激活的培养基，
(II)对(I)中分选的激活T细胞进行单细胞测序分析以鉴定与用独特HTO标记激活T细胞的分子缀合的独特HTO，其中鉴定独特HTO鉴定能够将激活T细胞激活的抗原，并且任选地其中所述单细胞测序分析还鉴定以下一种或多种：
(i)由激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或
(ii)由激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
在一些实施方案中，如本文所述的方法包括
(I)从包含独特生物样品池的组合物中分选一种或多种激活T细胞，并且
(II)对(I)中分选的激活T细胞进行单细胞测序分析以鉴定使激活T细胞起反应的抗原。
在一些实施方案中，(I)中分选的每个独特生物样品包括：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在表面结合的MHC的环境中呈递的肽，其中每个独特生物样品的每个T细胞是从同一个受试者分离并且其中每个独特生物样品的每个MHC具有相同的单倍型(任选地，其中每个独特生物样品的每个MHC来源于相同的样品，结合于相同的表面(例如，抗原呈递细胞的细胞膜)等等)，
(b)独特抗原，例如T细胞表位，
(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其中所述独特散列标签寡核苷酸与用HTO标记T细胞的分子缀合，其中独特HTO包含特异性鉴定(b)的独特抗原，例如T细胞表位的独特核苷酸序列，和任选地，
(d)支持T细胞的激活的培养基，
使得(II)中的单细胞测序分析鉴定与实体缀合的独特HTO，其中鉴定独特HTO的独特核苷酸序列鉴定能够将激活T细胞激活的抗原，例如T细胞表位。在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含自身并入细胞膜中的脂质。在一些实施方案中，HTO缀合的分子包含特异性结合于T细胞表达的细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，T细胞表达的细胞表面标志物被许多细胞普遍表达，例如细胞表面标志物可以是β2微球蛋白。在一些实施方案中，细胞表面标志物可以被所有T细胞选择性地表达，无论激活状态如何。在一些实施方案中，细胞标志物选自由以下组成的组：β2微球蛋白、CD298、CD2、CD3CD4、CD8和它们的组合。在一些实施方案中，单细胞测序分析还鉴定由激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或由激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
在一些实施方案中，所述方法还包括形成独特生物样品池。形成独特生物样品池可包括例如通过以下来建立多个生物样品：将从受试者分离并包含至少T细胞和优选地MHC(例如，外周血单核细胞(PBMC)、T细胞和APC等)的生物样品平均分布到个别样品中，将生物样品维持在支持T细胞的活力、激活和/或活性的条件下(例如，其中每个生物样品包含支持PBMC，例如T细胞和APC的活力和活性的培养基和细胞因子)。如本文所述，在本文中所述的方法中使用的T细胞和MHC可来源于任何来源。在一些实施方案中，MHC在抗原呈递细胞上表达，例如生物样品包含在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达的T细胞和MHC。在一些实施方案中，T细胞和APC是自体同源的。APC的非限制性和示例性来源包括全外周血单核细胞(PBMC)、单核细胞来源的树突状细胞(DC)、B细胞、巨噬细胞、正常组织或肿瘤细胞、APC细胞系等。T细胞可使用APC与T细胞的共培养物来刺激。在一些实施方案中，全PBMC提供APC和T细胞。
在这些和其它实施方案中的一些实施方案中，所述方法还包括通过以下来建立独特生物样品：将(i)独特抗原，例如独特T细胞表位递送至生物样品中，所述生物样品从受试者分离并且至少包含T细胞和优选地还包含MHC和/或(ii)与用HTO标记T细胞的分子缀合的独特HTO。在一些实施方案中，独特生物样品用独特抗原引发约7-10天，然后同时用抗原再刺激，在再刺激之后，用独特HTO对样品进行散列。在一些实施方案中，在同时用抗原再刺激并用独特HTO散列之前，独特生物样品未离体引发(例如，样品在体内引发)。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激至少6小时。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激至少16小时。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激至少约18-24小时。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激约48小时。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激约72小时。在一些实施方案中，样品在被散列之前被再刺激不超过96小时。在一些实施方案中，所述方法还包括汇集独特生物样品，从而建立包含独特生物样品的组合物。
在一些实施方案中，分选一种或多种激活T细胞包括激活诱导标志物(AIM)测定法。在一些实施方案中，AIM测定法包括对与特异性结合激活诱导标志物的荧光标记配体结合的激活T细胞进行荧光激活细胞分选。因此，在一些实施方案中，本文所述的方法包括在从包含独特生物样品池的组合物中分选激活T细胞之前，将独特生物样品与特异性结合激活诱导标志物的荧光标记配体一起孵育。孵育步骤可以与任何散列步骤同时进行和/或在汇集独特生物样品之后进行。
在一些实施方案中，荧光标记配体是荧光标记抗体和/或激活诱导标志物选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3和/或TIGIT和它们的组合。在一些实施方案中，激活诱导标志物包含CD137/4-1BB。
在一些实施方案中，所述方法包括对激活T细胞进行进一步的功能和/或表型分析。在一些实施方案中，进一步的功能和/或表型分析包括流式细胞术分析、CITE-seq分析、多聚体分析或它们的组合。在一些实施方案中，进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。
本文还描述了具有生物活性的散列样品，例如其中细胞表现出可检测的功能。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含生物样品，所述生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)抗原，例如T细胞表位，
(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其中所述HTO与用HTO标记T细胞的分子缀合，并且其中HTO包含特异性鉴定(b)的抗原，例如T细胞表位的核苷酸序列，和任选地
(d)支持T细胞的激活的培养基。
在一些实施方案中，用HTO标记T细胞的分子是脂质。在一些实施方案中，用HTO标记T细胞的分子是结合细胞标志物的抗体。
本文还描述了可用于本文所述的方法中的组合物。在一些实施方案中，在本文所述的组合物包含生物样品，所述生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)抗原，
(c)特异性鉴定所述抗原的散列标签寡核苷酸(HTO)，其中所述HTO与用HTO标记T细胞的分子缀合，
以及任选地
(d)支持T细胞的激活的培养基。
在一些实施方案中，组合物包含独特生物样品(例如，至少2个)池，例如组合物包含第一和第二生物样品(并且在一些实施方案中，额外的生物样品)，其中第一和第二生物样品中的每一个生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)抗原，例如T细胞表位，
(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其中所述HTO与用HTO标记T细胞的分子缀合，并且其中HTO包含可用于特异性鉴定，并且优选地特异性鉴定(b)的抗原的核苷酸序列，以及任选地
(d)支持T细胞的激活的培养基。
在一些实施方案中，第二生物样品包含
(a)第二T细胞和第二表面结合的MHC，其中所述第二T细胞能够识别在第二表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)第二抗原，例如第二T细胞表位，
(c)第二HTO，其中所述散列标签寡核苷酸与用HTO标记T细胞的第二分子缀合，并且其中第二HTO包含特异性鉴定(b)的第二抗原，例如第二T细胞表位的第二序列，和任选地
(d)支持第二T细胞的激活的第二培养基，
其中(i)第一样品的T细胞和第二T细胞是从同一个受试者分离，并且第一样品的MHC和第二MHC结合于相同的表面，并且优选地具有相同的单倍型(例如，从相同的来源分离)；(ii)第一样品的抗原(例如第一T细胞表位)和第二抗原(例如第二T细胞表位)不相同；(iii)第一分子和第二分子相同，并且第一HTO的第一核苷酸序列和第二HTO的第二核苷酸序列不相同。
在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少2个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少3个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少4个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少5个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少6个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少7个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少8个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少9个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少10个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少11个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少12个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少13个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少14个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少15个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少17个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少18个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少19个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少20个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少30个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少50个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少80个独特生物样品。在一些实施方案中，如本文所述的组合物包含至少100个独特生物样品。
在本文所述的一些组合物实施方案中，MHC在抗原呈递细胞(APC)如树突状细胞的表面上表达。在一些实施方案中，T细胞和APC是自体同源的，T细胞和APC各自从人类供体分离，和/或APC是树突状细胞。
在本文所述的一些组合物实施方案中，抗原，例如T细胞表位，选自由以下组成的组：(i)细菌抗原或其部分，(ii)病毒抗原或其部分，(iii)过敏原或其部分，(iv)肿瘤相关抗原或其部分，以及(v)它们的组合。在本文所述的一些组合物实施方案中，抗原，例如T细胞表位，包含(i)氨基酸序列，(ii)核苷酸序列，(iii)细胞溶解产物，和(iv)它们的组合。
在本文所述的一些组合物实施方案中，HTO与作为抗体的分子和/或结合选自由以下组成的组的细胞表面标志物的分子缀合：β2微球蛋白、CD298、CD2、CD3、CD4和/或CD8。
在一些实施方案中，培养基包含支持T细胞和/或APC的活力的细胞因子，任选地其中细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、GM-CSF、IL-4、FLT3L和它们的组合。在一些实施方案中，代替或支持T细胞和/或APC的活力的细胞因子或除此之外，培养基包含抗CD28和/或抗CD3抗体。
在一些实施方案中，生物样品包含从受试者分离的外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，PBMC是新分离的PBMC。在其它实施方案中，PBMC是曾冷冻保存的新鲜解冻的PBMC。在一些实施方案中，生物样品包含树突状细胞和T细胞，例如自体同源的树突状细胞和T细胞的共培养物。
在一些实施方案中，本文所述的组合物还包含特异性结合T细胞激活标志物的荧光标记抗体，任选地其中T细胞激活标志物选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3和/或TIGIT和它们的组合。在一些实施方案中，如本文所述的组合物还包含可用于流式细胞术分析或CITE-seq分析和/或MHC多聚体(例如，荧光标记的多聚体和/或寡核苷酸标记的多聚体)中的另外的抗体。
试剂盒
本文提供的方法和组合物可用于免疫反应的高通量评估。由于不管MHC单倍型如何，本文提供的方法都可用于患者样品，所以本文还提供了用于分析这类T细胞反应的现成试剂盒。
在一些实施方案中，试剂盒包含多种独特抗原，例如多种独特T细胞表位，和多种独特HTO缀合的分子，其中所述多种独特HTO缀合的分子中的每一种包含独特HTO，所述独特HTO包含独特HTO序列和相同的分子，并且其中所述多个独特HTO序列中的每一个被分配给多种独特抗原中的仅一种(例如，多种独特T细胞表位中的一种)，使得独特HTO序列可鉴定分配给它的独特抗原(例如，T细胞表位)。在一些实施方案中，多种抗原中的每一种源自相同的来源，例如多种抗原包含来自单一抗原的一组重叠肽，例如帮助表位定位。在一些实施方案中，单一抗原可以是致病性抗原，例如细菌或病毒抗原。在非限制性实施方案中，这类试剂盒包含多种源自致病性抗原的抗原(例如，T细胞表位)，其可用于疫苗开发或监测患者对已建立的疫苗的免疫反应。在一些实施方案中，单一抗原可以是肿瘤相关抗原。在非限制性实施方案中，这类试剂盒包含多种源自肿瘤相关抗原的抗原(例如，T细胞表位)，其可用于免疫疗法开发，例如用于鉴定与T细胞介导的针对肿瘤细胞的细胞毒性相关的TCR可变(例如，CDR3)序列。在一些实施方案中，单一抗原可以是自身抗原。在非限制性实施方案中，这类试剂盒包含多种源自自身抗原的抗原(例如，T细胞表位)，其可用于监测患者的自身免疫反应。在一些实施方案中，单一抗原可以是移植抗原。在非限制性实施方案中，这类试剂盒包含多种源自移植抗原的抗原(例如，T细胞表位)，其可用于鉴定不太可能被受试者排斥和/或建立移植物抗宿主病的供体器官。一些试剂盒实施方案还可包括另外的组分，例如阴性和/或阳性对照抗原、缓冲液、小瓶、使用说明书、多孔培养板等。
这类试剂盒可用于对例如针对以下的T细胞反应进行高通量分析：(1)潜在或正在进行的疗法，如疫苗、免疫疗法等；(2)在自身免疫性病症或移植排斥期间；(3)用于开发基于TCR的疗法；和/或(4)用于确定TCR:表位结合算法。因此，本文还提供了使用本文所述的高通量筛选方法、组合物和/或试剂盒评估免疫反应和/或鉴定与参与免疫反应的激活T细胞相关的TCR序列(例如，TCR可变序列，例如TCRα和/或β可变序列，例如TCRα和/或βCDR1、CDR2和/或CDR3序列)的方法。
用途
本文提供的方法和组合物可用于评估免疫反应。因此，本文还描述了使用高通量筛选方法、相关组合物和/或相关试剂盒来研究在T细胞激活、免疫耐受等背景下的免疫反应的方法。
自分离的时间，至任何预刺激或再刺激培养物，至细胞分选的时间，本文所述的方法似乎不影响样品(例如，外周血单核细胞(PMBC)、吸出物)中不同细胞部分的相对分数，尤其是抗原特异性T细胞群体的分数。因此，提供了使用本文所述的高通量筛选方法、组合物和/或试剂盒来评估样品中抗原特异性T细胞的相对群体大小的方法。
还提供了使用本文所述的高通量筛选方法、组合物和/或试剂盒来测试候选疫苗的方法。在一个实施方案中，本文提供了一种评估疫苗是否会在受试者中激活免疫反应(例如，T细胞增殖、细胞因子释放等)并导致效应子以及记忆T细胞(例如，中枢和效应记忆T细胞)产生和/或鉴定激活的免疫学免疫反应的分子表型的方法。
本发明还提供了使用本文所述的高通量筛选方法、相关组合物和/或试剂盒进行过继性T细胞疗法的方法。因此，本文提供了治疗或改善受试者(例如，哺乳动物受试者，例如人类受试者)的疾病或疾患(例如，癌症)的方法。在一些实施方案中，疾病或疾患是癌症。在其它实施方案中，疾病或疾患由病毒或细菌引起。
在一些实施方案中，本文所述的过继性T细胞疗法包括使用本文所述的高通量筛选方法、组合物和/或试剂盒鉴定编码TCRα和/或β可变结构域的核酸序列，例如抗原特异性T细胞和同源抗原的TCRα和/或β可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列(或在其它实施方案中，编码TCRδ和/或γ可变结构域的核酸序列)。在一些实施方案中，所鉴定的编码TCRα和/或β可变结构域的核酸序列，例如TCRα和/或β可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列(或在其它实施方案中，编码TCRδ和/或γ可变结构域的核酸序列)用于产生人类治疗剂。
在一个实施方案中，人类治疗剂是携带感兴趣的核酸序列(例如，用感兴趣的核酸转染或转导或以其它方式引入)的T细胞(例如人T细胞，例如源自人类受试者的T细胞)以便T细胞表达对感兴趣的抗原具有亲和力的TCR。在一方面，采用治疗剂的受试者需要针对特定疾病或疾患的疗法，并且抗原与疾病或疾患相关。在一方面，T细胞是细胞毒性T细胞，抗原是肿瘤相关抗原，并且疾病或疾患是癌症。一方面，T细胞源自受试者。因此，在鉴定核酸和同源抗原后，本文所述的过继性T细胞治疗方法还可包括将通过本文所述的方法鉴定的T细胞受体的核酸序列或其一部分(例如，TCR可变结构域的核酸序列)克隆到表达载体(例如，逆转录病毒载体)中，将该载体引入到源自受试者的T细胞中，使得T细胞表达抗原特异性T细胞受体，并将T细胞注入到受试者中。
在本文所述的过继性T细胞疗法的其它实施方案中，编码TCRα和/或β可变结构域的核酸序列，例如抗原特异性T细胞的TCRα和/或β可变结构域的CDR1、CDR2和/或CDR3的序列(或在其它实施方案中，编码TCRδ和/或γ可变结构域的核酸序列)用于产生人类T细胞受体治疗剂。在一个实施方案中，治疗性受体是可溶性T细胞受体。已经进行了许多努力来产生可溶性T细胞受体或TCR可变区以供治疗剂使用。可溶性T细胞受体的产生取决于获得重排的TCR可变区。一种方法是设计包含TCRα和TCRβ的单链TCR，并且类似于scFv免疫球蛋白格式，经由接头将它们融合在一起(参见例如国际申请No.WO 2011/044186)。如果与scFv类似，所得的scTv将提供热稳定和可溶形式的TCRα/β结合蛋白。替代方法包括设计具有TCRβ恒定结构域的可溶性TCR(参见例如Chung等人,(1994)Functiona l three-domainsingle-chain T-cell receptors,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91:12654-58)；以及将非天然二硫键工程化到TCR恒定结构域之间的界面中(在Boulter和Jakobsen(2005)Stable,soluble,high-affi nity,engineered T cell receptors:novel antibody-likeproteins for sp ecific targeting of peptide antigens,Clinical andExperimental Immu nology 142:454-60中进行了综述；又见美国专利No.7,569,664)。已经描述了其它格式的可溶性T细胞受体。本文所述的方法可用于确定以高亲和力结合感兴趣的抗原的T细胞受体的序列，并随后基于该序列设计可溶性T细胞受体。
包含根据本文所述的高通量方法、组合物和/或试剂盒鉴定的序列的可溶性T细胞受体可用于阻断感兴趣的蛋白质，例如病毒、细菌或肿瘤相关蛋白的功能。或者，可溶性T细胞受体可以与能够杀死受感染或癌细胞的部分，例如细胞毒性分子(例如，化学治疗剂)、毒素、放射性核素、前药、抗体等融合。可溶性T细胞受体还可以与免疫调节分子，例如细胞因子、趋化因子等融合。可溶性T细胞受体还可以与免疫抑制分子，例如抑制T细胞杀死其它含有被T细胞识别的抗原的细胞的分子融合。这种与免疫抑制分子融合的可溶性T细胞受体可用于例如阻断自身免疫。Ravetch和Lanier(2000)Immune Inhibitory Receptors,Science290:84-89中综述了可以与可溶性T细胞受体融合的各种示例性免疫抑制分子，该文献以引用的方式并入本文中。
下面提供了非限制性和示例性实施方案。
实施方案1.一种用于鉴定识别感兴趣的表位的TCR的T细胞受体(TCR)α和/或β链序列的方法，所述方法包括从T细胞池中分选用寡核苷酸缀合的抗体标记的T细胞群体，其中所述寡核苷酸标签包含与独特表位、抗原或抗原池相关的序列。
实施方案2.实施方案1的方法，所述方法包括在分选之后确定所述寡核苷酸标签的序列的步骤，从而确定激活用所述寡核苷酸缀合的抗体标记的所述T细胞的所述表位、抗原或抗原池。
实施方案3.实施方案1或实施方案2的方法，所述方法在所述分选步骤之前包括一个或多个以下步骤：
例如在多孔培养板中从外周血单核细胞(PBMC)样品中建立多种培养物，其中每种培养物包含支持抗原呈递细胞(APC)和T细胞功能和生长的培养基和细胞因子，
向所述多种培养物中的每一种递送感兴趣的独特抗原或抗原池，从而建立独特培养物，例如将感兴趣的单个抗原(或抗原池)添加到所述多种培养物中的一种，例如所述培养板中的一个孔中，其中每种培养物(孔)包含独特抗原或抗原池，
向独特培养物添加与所述独特培养物相关的独特寡核苷酸标签，以及
任选地添加其它表面染色抗体和多聚体，所述表面染色抗体和多聚体也可包含低聚物标签，例如CITE-seq和寡核苷酸-dextramer试剂，以及
汇集所述培养物。
实施方案4.实施方案1-3中任一项的方法，所述方法包括
例如在多孔培养板中从外周血单核细胞(PBMC)样品中建立多种培养物，其中每种培养物包含支持抗原呈递细胞(APC)和T细胞功能和生长的培养基和细胞因子，
向所述多种培养物中的每一种递送感兴趣的独特抗原或抗原池，从而建立独特培养物，例如将感兴趣的单个抗原(或抗原池)添加到所述多种培养物中的一种，例如所述培养板的一个孔中，其中每种培养物(孔)包含独特抗原或抗原池，
向独特培养物添加足以标记每个孔中存在的所有细胞的量的结合T细胞激活标志物的抗体和用与所述独特培养物相关的独特寡核苷酸标签标记的分子，以及
任选地添加其它表面染色抗体和多聚体，所述表面染色抗体和多聚体还可包含低聚物标签，例如CITE-seq和寡核苷酸-dextramer试剂，
汇集所述培养物；
分选用结合T细胞激活标志物的所述抗体标记并用独特寡核苷酸标签标记的那些T细胞，以及
从步骤(5)中分选的所述T细胞确定核酸序列，包括所述独特寡核苷酸标签的所述核酸序列。
实施方案5.实施方案1-4中任一项的方法，其中所述T细胞激活标志物包含CD137/4-1BB。
实施方案6.一种用于鉴定能够激活T细胞的抗原，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列的方法，所述方法包括：
(I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)独特抗原，
(c)可用于和/或用于特异性鉴定所述独特抗原的独特散列标签寡核苷酸(HTO)，例如特异性鉴定所述独特抗原的独特HTO，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记所述T细胞的分子缀合，和任选地，
(d)支持所述T细胞的激活的培养基，
(II)对(I)中分选的所述激活T细胞进行单细胞测序分析以鉴定与用所述独特HTO标记所述激活T细胞的所述分子缀合的所述独特HTO，其中鉴定所述独特HTO鉴定能够将所述激活T细胞激活的所述抗原，并且任选地其中所述单细胞测序分析还鉴定以下一种或多种：
(i)由所述激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或
(ii)由所述激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
实施方案7.实施方案6的方法，所述方法包括在分选之前进行以下步骤中的一个或两个：
通过将包含从受试者分离的T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞集合平均分布到个别样品中来建立多个生物样品，其中每个生物样品任选地包含支持T细胞和/或APC活力、激活和/或活性的培养基和细胞因子，以及
通过向多个生物样品中的每一个递送独特抗原和/或可用于和/或用于特异性鉴定所述独特抗原的独特HTO，例如特异性鉴定所述独特抗原的独特HTO来建立多个独特生物样品，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合，以及任选地将所述多个独特生物样品组合，使得在(I)中分选的所述组合物包含多个独特生物样品
其中所述多个生物样品中的每一个包括包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合和任选地支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基，并且
其中在递送所述独特抗原和/或与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合的所述独特HTO后，所述多个生物样品中的每一个变成独特生物样品，所述独特生物样品包含
(a)包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，
(b)独特抗原，
(c)特异性鉴定所述独特抗原并与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合的独特HTO，和任选地
(d)支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基。
实施方案8.实施方案7的方法，其中所述APC包含单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞或它们的组合。
实施方案9.实施方案6-8中任一项的方法，其中分选包括基于激活诱导标志物(AIM)的表达对激活T细胞进行荧光激活细胞分选。
实施方案10.实施方案9的方法，其中所述AIM选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT和它们的任何组合。
实施方案11.实施方案9或实施方案10的方法，其中荧光激活细胞分选是基于用针对所述AIM的荧光标记抗体检测。
实施方案12.实施方案6-11中任一项的方法，所述方法包括对II中分析的所述激活T细胞进行进一步的功能和/或表型分析，任选地其中所述进一步的功能和/或表型分析选自由以下组成的组：流式细胞术分析、CITE-seq分析、多聚体分析和它们的组合。
实施方案13.实施方案12的方法，其中所述进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或RNA表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。
实施方案14.实施方案6-13中任一项的方法，其中外周血单核细胞提供所述T细胞和表面结合的MHC。
实施方案15.实施方案6-14中任一项的方法，其中用所述独特HTO标记所述T细胞的所述分子包含结合细胞表面分子的抗体。
实施方案16.实施方案6-15中任一项的方法，其中所述AIM是或包含CD137/4-1BB。
实施方案17.实施方案6-16中任一项的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列分别是TCRα链可变区序列和/或TCRβ链可变区序列。
实施方案18.实施方案6-17中任一项的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述方法还包括利用所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列制造治疗剂。
实施方案19.一种组合物，所述组合物包含生物样品，所述生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)抗原，
(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其特异性鉴定所述抗原，其中所述HTO与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合，
以及任选地
(d)支持所述T细胞的激活的培养基。
实施方案20.实施方案19的组合物，其中
(a)所述MHC在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，任选地其中：
所述T细胞和APC是自体同源的，
所述T细胞和所述APC各自从人类供体分离，和/或
所述APC选自由以下组成的组：单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和它们的组合，
(b)所述抗原
(I)选自由以下组成的组：
(i)细菌抗原或其部分，
(ii)病毒抗原或其部分，
(iii)过敏原或其部分，
(iv)肿瘤相关抗原或其部分，以及
(v)它们的组合，和/或
(II)包含
(i)氨基酸序列，
(ii)核苷酸序列，
(iii)溶解产物，以及
(iv)它们的组合，
(c)所述HTO缀合的分子包含
(I)结合细胞表面分子的抗体，或
(II)脂质，和/或
(d)所述培养基包含支持所述T细胞和/或APC的活力的细胞因子。
实施方案21.实施方案20的组合物，其中
所述抗体结合选自由以下组成的组的细胞表面标志物：β2微球蛋白、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8和它们的任何组合，或
所述脂质并入细胞膜中。
实施方案22.实施方案20或实施方案21的组合物，其中支持所述T细胞和/或所述APC的活力的所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4和它们的任何组合。
实施方案23.实施方案20-22中任一项的组合物，所述组合物还包含第二生物样品，其中所述第二生物样品包含：
(a)第二T细胞和第二表面结合的MHC，其中所述第二T细胞能够识别在所述第二表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)第二抗原，
(c)特异性鉴定所述第二抗原的第二HTO，其中所述HTO与用所述第二HTO标记所述第二T细胞的第二分子缀合，
以及任选地
(d)支持所述第二T细胞的激活的培养基，
其中
(i)所述T细胞和第二T细胞是从同一个受试者分离，
(ii)所述抗原和所述第二抗原不相同，
(iii)用所述HTO标记所述T细胞的所述分子和用所述第二HTO标记所述第二T细胞的所述第二分子相同，并且所述HTO和所述第二HTO不相同。
实施方案24.实施方案19-23中任一项的组合物，其中所述组合物还包含允许基于激活诱导标志物(AIM)的表达分选激活T细胞的剂。
实施方案25.实施方案24的组合物，其中所述允许基于AIM的表达分选激活T细胞的剂是特异性结合所述AIM的荧光标记抗体。
实施方案26.实施方案24或实施方案25的组合物，其中所述AIM选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3和/或TIGIT。
实施方案27.实施方案19-26中任一项的组合物，其中所述组合物包含可用于所述组合物的流式细胞术分析或CITE-seq分析的抗体和/或MHC多聚体。
实施方案28.一种试剂盒，所述试剂盒包含
多种独特抗原，和
多种独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其中每一种特异性鉴定所述多种独特抗原中的仅一种。
实施方案29.实施方案28的试剂盒，其中所述试剂盒还包含允许基于激活诱导标志物(AIM)的表达分选激活T细胞的剂，任选地其中所述允许基于AIM的表达分选激活T细胞的剂是特异性结合所述AIM的荧光标记抗体。
实施方案30.实施方案28或29的试剂盒，其中所述多种独特HTO中的每一种与相同的分子缀合，使得所述试剂盒包含多种独特HTO缀合的分子。
实施方案31.实施方案28-30中任一项的试剂盒，其中所述多种独特抗原中的每一种包含来自单一蛋白质的独特且重叠的肽序列。
实施方案32.实施方案31的试剂盒，其中所述单一蛋白质选自由以下组成的组：致病性抗原、肿瘤相关抗原或移植抗原。
实施方案33.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于分析T细胞介导的患者对疫苗的免疫反应。
实施方案34.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于分析T细胞介导的患者对免疫疗法的免疫反应。
实施方案35.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于分析患者在所述患者的免疫疗法期间的T细胞介导的免疫反应。
实施方案36.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于分析患者对自身抗原的T细胞反应。
实施方案37.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于分析患者对移植抗原的T细胞反应。
实施方案38.实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒的用途，用于鉴定激活T细胞的一个或多个TCR可变区序列。
实施方案39.实施方案38的用途，其中所述一个或多个TCR可变区序列包含TCRα链的CDR3序列和/或TCRβ链的CDR3序列。
实施方案40.在实施方案38或39中鉴定的一个或多个TCR可变区序列用于制造人类治疗剂的用途。
实施方案41.实施方案40的用途，其中所述人类治疗剂包括包含使用实施方案1-18中任一项的方法、实施方案19-27中任一项的组合物或实施方案28-32中任一项的试剂盒鉴定的一个或多个TCR可变区序列的T细胞。
虽然已参考许多实施方案特定地展示和描述了本发明，但本领域技术人员应了解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下在形式和细节上对本文所公开的各个实施方案作出改变，并且本文所公开的各个实施方案不意图充当对权利要求书的范围的限制。
实施例
图1中示出了本文所述的方法的非限制性实施方案。本文的实施例提供的数据说明散列方法可与功能测定法，例如激活诱导标志物(AIM)细胞富集和单细胞转录组测序结合使用以筛选同源T细胞和抗原反应性，例如T细胞表位反应性，并且这类方法在原代人类细胞中特别有用。
在描述这些方法的更具体和示例性应用之前，这里提供了一般方法。
一般材料和方法
人外周血单核细胞(PBMC)：购买冷冻保存的PBMC(Precision for MedicineFrederick,Maryland)或从人类受试者的新鲜血液中分离，使用Ficoll-Paque Plus(GEHealthcare Life Sciences，45-001,749)试剂按照制造商的说明书通过密度梯度离心分离并在冷冻培养基(90％人血清(Millipore Sigma)、10％组织培养级DMSO(MilliporeSigma，2438)中冷冻保存以供以后分析。
肽：肽是在Genscript(Piscataway,NJ)定制合成的。冻干的肽在DMSO中以10-50mg/mL复原为储备溶液，然后在适当的测定培养基中进一步稀释至10μg/mL以供使用。按照制造商的说明书CEF对照肽池(Anaspec，AS-61036-003)以10ug/mL使用并使用细胞刺激混合物(ThermoFisher，00-4970-93)。
原代细胞培养物：将冷冻保存的PBMC解冻并在具有5％人血清AB(MilliporeSigma，H3667)和1％青霉素-链霉素(ThermoFisher Scientific，15140163)的CellGenixGMP DC无血清培养基(CellGenix，20801-0500)中孵育。培养物补充有树突状细胞和T细胞支持性细胞因子：T细胞培养基(CellGenix树突状细胞培养基，目录号20801-0500+5％人血清AB(Sigma，目录号H3667))+1％青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(ThermoFisher，目录号10378-016)、5ng/ml T细胞支持性细胞因子IL-7和IL-15(分别是CellGenix，目录号1410-050和1413-050)以及10U/ml IL-2(Peprotech，目录号200-0)。
寡核苷酸标记的散列抗体的产生：使用已公布的方法将对所有人类T细胞上的细胞表面靶标具有高度特异性的单克隆抗体(CD2、RPA-2.10；Biolegend目录号300202)定制缀合到带有多聚A尾的各种独特15碱基寡核苷酸序列。参见例如Stoeckius 2017,bioRxiv,同上。
直接离体IFNγ/颗粒酶B ELISPOT：双重人IFNγ/颗粒酶BFluoroSpot测定试剂盒购自ImmunoSpot(Cleveland,OH)，并按照制造商的方案使用。简单地说，将PBMC解冻并在200uL中在FluoroSpot板中以200,000个细胞/孔在肽刺激下孵育48小时。使用制造商的自动化软件在ImmunoSpot分析仪上读出ELISPOT反应性。
抗体和通过流式细胞术对T细胞进行表型表征：荧光标记抗体购自商业供应商。为了对表面蛋白进行流式细胞仪表型表征，收获、洗涤细胞并再悬浮于含有感兴趣的抗体的流式细胞术BD BSA染色缓冲液(BD Biosciences，#554657)中。将细胞在4℃下孵育30分钟，然后洗涤两次，然后在A3 Symphony细胞仪(BD Biosciences)上进行流式细胞术采集。使用FlowJo分析软件(FlowJo,Ashland,OR)分析流式细胞术数据。门是基于荧光减一(FMO)对照设置的。
抗原特异性T细胞反应性测定：通过Ficoll-Paque Plus梯度分离法分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC于T细胞培养基(CellGenix GMP DC培养基，目录号20801-0500+5％人血清AB(Sigma，目录号H3667))+1％青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺(ThermoFisher，目录号10378-016)、1000U/mL树突状细胞支持性因子GM-CSF和500U/mL IL-4(分别是CellGenix，#1412-050和CellGenix，#1403-050)、5ng/ml T细胞支持性细胞因子IL-7和IL-15(分别是CellGenix，#1410-050和1413-050)以及10U/ml IL-2(Peprotech，目录号200-0)中接种至培养板中，例如等分。将个别的抗原，例如感兴趣的肽以10ug/ml(Genscript)添加到分析孔中，以形成独特生物样品。
在肽刺激后24小时收获过夜培养物并准备用于分选和单细胞测序。对于10天的预扩增培养，在初始肽添加后的一周内，每两天向细胞馈入新鲜培养基和细胞因子。然后，将个别的感兴趣的肽添加到T细胞扩增培养物中进行过夜再刺激，以上调激活诱导标志物(例如CD137/4-1BB)的表达，并使得能够基于抗原特异性AIM进行功能性T细胞分选。肽再刺激后，制备细胞用于流式细胞术表征或进一步处理以使得能够进行散列、汇集和单细胞测序。
进行功能性T细胞测定后的细胞散列：在功能性刺激后，将来自个别测定孔的细胞收集到96孔测定块中，洗涤并再悬浮于含有感兴趣的散列试剂的流式细胞术BD BSA染色缓冲液(BD Biosciences，#554657)中。用一种或两种散列标签寡核苷酸(HTO)抗体对细胞进行染色，每种为1μg/106个细胞。将细胞在4℃下孵育30分钟，洗涤两次，然后汇集。如果分析中包括寡核苷酸标记的dextramer，则按照下面的寡核苷酸标记的dextramer染色方案，在进行CITE-seq和流式细胞术抗体染色之前，用dextramer对样品进行染色。
CITE-seq抗体染色和荧光抗体染色：在散列染色程序之后，将汇集和散列的样品再悬浮于含有各自处于最佳浓度下的CITE-seq抗体以及荧光标记的流式细胞术抗体的BDBSA染色缓冲液中。将细胞在4℃下孵育30分钟，洗涤两次，然后分选以进行单细胞测序。
寡核苷酸标记的dextramer染色和FACS分选：将冷冻保存的健康供体PBMC在37℃水浴中短暂解冻。使用磁珠(Miltenyi Biotec)富集CD8+T细胞。通过离心洗涤细胞，然后在37℃下用含有全能核酸酶(benzonase)(Millipore，70664)和50nM达沙替尼(Dasatinib)(Axon Medchem，1392)的PBS(Gibco，14190-250)处理45分钟。将细胞转移至96孔测定块(Corning，3960)，离心并吸出上清液。在室温下以1ul/100ul反应避光添加适当的定制Immudex dCODE-PE dextramer池(Copenhagen,Denmark)，历时30分钟。接下来，添加荧光染料标记的表面标志物，并将细胞在4℃中再培养30分钟。洗涤后，立即分选细胞。在染色缓冲液(BD，554657)中进行流式细胞术抗体染色和洗涤。FACS的表面标志物包括以下标志物和荧光物：活/死-DAPI原位添加在分选仪上(Sigma，10236276001)、CD3 BUV737(BDBiosciences，612750)、CD4 BV510(BD Biosciences，563919)、CD8BUV805(BDBiosciences，612889)、CCR7 AF647(BioLegend 353218)和CD45RO BV605(BioLegend304238)。
CD137/4-1BB+T细胞FACS分选：再刺激后二十四小时，收集细胞并使用Astrios细胞分选仪(Beckman Coulter)使用以下表面抗体用FACS荧光标记抗体染色：CD3(BDBiosciences，目录号612750)和CD137/4-1BB(Biolegend，目录号309828)。前向散点图、侧向散点图和荧光通道的门设置为选择活细胞，同时排除碎片和双峰。使用100μm喷嘴对单个CD3+CD137/4-1BB+细胞进行分选以进行进一步处理。
Chromium单细胞分区和文库制备：然后将分选的细胞加载到Chromium单细胞5'芯片(10x Genomics，1000287)上，并通过Chromium控制器进行处理以产生GEM(胶珠乳液)。按照制造商的方案使用Chromium单细胞5'文库和胶珠试剂盒(10x Genomics，1000265)制备了RNA-Seq文库。
生物信息学方法
对转录组、TCR(VDJ)、散列、CITE-seq和dextramer文库进行测序，并使用10XCellRanger分析管道处理原始测序数据。CellRanger分析生成特征条形码UMI计数矩阵和TCR(VDJ)氨基酸序列。这些功能包括基因表达、散列抗体、CITE-seq抗体和dextramer捕获。使用特征条形码矩阵作为输入，R包Seurat v3.1.4(Butler等人2018)用于下游分析。对基因UMI计数进行标准对数归一化，然后鉴定1000个最可变基因，并对数据进行缩放和居中。接下来进行主成分分析(Principal Component Analysis，PCA)，并且计算50个PC并存储。然后使用Seurat的基于图形的聚类方法进行聚类。基于20维PCA空间中的欧氏距离(Euclidean distance)计算k-最近邻(KNN)图，然后以各种分辨率进行聚类。在每个分辨率下，鉴定顶部标志基因，并用于建立跨不同簇的基因表达热图。通过目视检查，确定了最佳聚类分辨率。以线粒体基因作为顶部基因标志物，从下游分析中去除属于死细胞簇的所有细胞。去除检测到的基因数目小于或等于500个并且线粒体基因表达分数大于或等于0.25的细胞。由于该测定的主要目标之一是鉴定由TCR-抗原相互作用驱动的T细胞针对各种抗原的反应性，因此任何具有单个TCR链或非生产链或多于一个α或β链的细胞也被去除了。还去除了任何检测到大量基因和/或检测到大量UMI的异常细胞。对于剩余的细胞，然后处理来自其它特征(CITE-seq、散列、dextramer)的数据。与那些特征相对应的计数矩阵的数据使用中心对数比变换进行归一化，然后进行缩放。使用MultiSeqDemux算法(McGinnis等人(2019)Nature Methods 16:619-26；默认参数)使用散列数据对细胞进行多路分解。根据散列方案未分配散列标签的任何细胞在多路复用后被去除。对于每个细胞，获得了定义细胞独特功能克隆型的配对TCR氨基酸序列。多路分解后，计算与散列标记测定孔相关的所有细胞中每个T细胞克隆的克隆型大小。任何大小>20的克隆型都被认为对散列标记孔中的特定抗原具有潜在的反应性。
实施例1：将CD137/4-1BB鉴定为与多聚体染色相当的能够在功能上鉴定抗原特异性T细胞群体的激活诱导标志物(AIM)
材料和方法
通常，在本实施例中描述的方法中，来自健康HLA-A*0201+人类供体的T细胞按照本文描述的方法在同源合成肽存在下进行预扩增，然后用荧光标记抗体和dextramer多聚体进行染色，用于流式细胞术分析，以鉴定抗原特异性T细胞群体。
结果
在图2A中，树突状细胞(DC)源自来自健康人类供体的全外周血单核细胞(PBMC)。简单地说，通过使用抗CD14磁珠(Miltenyi)进行磁选从PBMC中分离出CD14+单核细胞。CD14+细胞在补充有IL-4和GM-CSF的CellGenix CellGro DC培养基中培养5天。在第五天，用对HLA-A*0201具有特异性的CMV pp65(NLVPMVATV；SEQ ID NO:16)或MART1(ELAGIGILTV；SEQID NO:15)合成短肽对DC脉冲2小时。然后，将IFNα添加到细胞中以激活它们。在第7天，将自体同源T细胞添加到培养物中，并将培养基更换为补充有5％人血清加支持性细胞因子(IL7、IL-15、IL-2)的CellGenix CellGro培养基。将这些自体同源DC和T细胞培养10天以扩增相关的预先存在的抗原特异性T细胞群体。在培养中预扩增10天后，用相关肽或DMSO阴性对照再刺激T细胞24小时。使用荧光标记的单克隆抗体和dextramer多聚体通过流式细胞术表征(A3 Symphony分析仪，BD)评估感兴趣的细胞表面靶标。
图2A的流式细胞术点图证明，在刺激之前，培养物中的CD137/4-1BB+CD8+T细胞分数较低(x轴，左图)，但多聚体对感兴趣的CD8+T细胞群体进行了强烈染色：25.5％CMV pp65CD8+T细胞，7.79％MART1+T细胞(x轴，中图)。换句话说，这一特定实施例中使用的细胞培养条件使预先存在的记忆T细胞扩增，但没有诱导从头T细胞扩增。然而，在用同源肽再刺激24小时后，CD8+T细胞上CD137/4-1BB表达上调，并且CD137/4-1BB+群体的总大小(x轴)与多聚体+群体相似(右图)。
在图2B中，使用与本实施例中所述相同的细胞培养和染色方法，将从4个HLA-A*0201+健康供体(HD1、HD2、HD3和HD27)分离的细胞在DMSO或CMV pp65合成肽存在下培养10天。通过流式细胞术评估了10天扩增后CMVpp65多聚体+CD8+T细胞相对于阴性对照多聚体的分数(图2B，上图)。还通过流式细胞术评估了相对于DMSO对照，在用CMV pp65合成肽再刺激24小时后CD8+T细胞上CD137/4-1BB的表达(图2B，下图)。CMV血清阳性的四名健康供体中的三名具有可测量的CMV pp65+CD8+T细胞(HD1、HD2、HD27)，而CMV血清阴性供体(HD3)没有可检测到的CMV pp65+T细胞。(图2B)。一般来说，多聚体+CD8+和CD137/4-1BB+CD8+T细胞的群体大小是一致的。(图2B)。
在图3A-3B中，将来自健康HLA-A*0201+人类供体(HD3和HD27)的全外周血单核细胞(PBMC)在包含支持性细胞因子(GM-CSF、IL-4、IL7、IL-15、IL-2)和DMSO或MART1(ELAGIGILTV；SEQ ID NO:15)合成短肽或的培养基中培养10天以分别提供基线群体(DMSO)或扩增相关的预先存在的MART1特异性T细胞。在培养中预扩增10天后，用DMSO阴性对照或MART1肽再刺激T细胞24小时。通过荧光激活细胞分选(FACS)对来自健康供体27(HD27)的MART1多聚体+CD8+T细胞和CD137/4-1BB CD8+T细胞进行分选并封装在10X Genomics单细胞分区器中，用于5’RNA和TCR单细胞测序文库制备，然后进行高通量下一代测序。仅评估产生完整的配对的α和βTCR信息的细胞。评估多聚体+和CD137/4-1BB+样品中的重叠。
在再刺激之前，两个供体都有可检测到的MART1+CD8+T细胞(图3A，上图)。在用同源肽再刺激24小时后，两个供体(HD3和HD27)在其细胞表面上调CD137/4-1BB(图3A，下图)。然而，一个供体(HD27)的CD137/4-1BB+T细胞明显高于多聚体+CD8+T细胞(图3A)。为了测试这种差异，通过评估多聚体+和CD137/4-1BB+样品中的重叠，进一步评估通过多聚体和CD137/4-1BB染色鉴定的功能性T细胞克隆。多聚体+和CD137/4-1BB+CD8+T细胞群体之间共享的TCR序列存在显著的重叠。(图3B)。总体而言，CD137/4-1BB+部分比MART1多聚体+群体含有更多的克隆群体。在CD137/4-1BB+CD8+T细胞群体中检测到大部分克隆扩增的MART1多聚体+TCR，并且在两个富集群体中也可检测到许多较低丰度的TCR。然而，CD137/4-1BB+群体捕获了在多聚体+群体中未检测到的TCR。此外，来自MART1多聚体+群体的许多低丰度TCR序列在CD137/4-1BB+群体中以较大的克隆大小存在。
图2A-B和3A-B中显示的数据证明，在抗原特异性激活后，人T细胞上激活诱导标志物CD137/4-1BB上调，并且根据本文所述的方法培养的多聚体+与CD137/4-1BB+CD8+T细胞之间，单细胞配对的α/β链T细胞受体(TCR)序列中存在显著的重叠。因此，CD137/4-1BB可用于功能测定法，例如，作为抗原特异性T细胞的功能富集激活诱导标志物(AIM)。此外，使用CD137/4-1BB作为功能标志物与传统多聚体染色一样有效，并提供类似的功能测定结果。
实施例2：使用散列标签寡核苷酸和激活T细胞的CD137/4-1BB富集来表征原代人类细胞中的同源T细胞和表位反应性
为了进一步验证散列、AIM分选和/或单细胞测序分析作为评估和表征同源抗原和TCR反应性的可行方法，包含PBMC和独特病毒肽的独特生物样品用缀合抗CD2抗体的散列标签寡核苷酸进行散列并汇集。通过CD137/4-1BB染色鉴定功能激活，并将CD137/4-1BB在功能测定法中的使用与ELISPOT和dextramer染色的常规功能测定进行比较。
材料和方法
ELISPOT：将来自已知对CMV、EBV和流感呈血清阳性的健康HLA-A*0201+人类供体的PBMC在DMSO或个别HLA-A*0201+限制性病毒肽刺激(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、甲型流感)下以2×105个细胞/孔的浓度涂铺在双IFNγ/颗粒酶B FluoroSpot测定板(ImmunoSpot,Cleveland,OH)中，持续48小时。孵育后，使用制造商的说明书和自动化软件在ImmunoSpot分析仪上发展和读取ELISPOT反应性。
用于散列和AIM富集的PBMC培养：将来自健康HLA-A*0201+人类供体的全外周血单核细胞(PBMC)在培养基、支持性细胞因子(GM-CSF、IL-4、IL7、IL-15、IL-2)和个别HLA-A*0201+限制性病毒肽(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、甲型流感)中培养10天，以扩增相关的预先存在的抗原特异性T细胞群体。在培养中预扩增10天后，用相关肽或DMSO阴性对照再刺激T细胞24小时。使用荧光标记的单克隆抗体通过流式细胞术表征(A3Symphony分析仪，BD)评估感兴趣的细胞表面靶标。通过流式细胞术评估CD137/4-1BB+CD8+T细胞在病毒肽刺激下的相对分数(CD8+CD137/4-1BB+T细胞分数作为超过门的总CD8+T细胞的百分比提供)。
散列、AIM富集和单细胞测序：将用独特散列标签寡核苷酸标记的单克隆人抗CD2抗体添加到本实验中描述的PBMC生物样品的每个测定孔中，以对来自给定孔的T细胞用同一孔受到的刺激进行独特条形码标记。然后，将所有测定孔样品汇集并用荧光标记的表面抗体染色以进行FACS分选，并用CITE-seq抗体染色以进行scSEQ表型分析。对CD137/4-1BB+CD8+T细胞群体进行分选和多路分解，例如通过单细胞测序(10X Genomics 5'RNA和TCR)进行分析。使用LogNormalize方法对表达进行归一化，该方法通过总表达对每个细胞的基因表达进行归一化。在数学上，归一化表达式等于log1p(UMI.计数*换算系数/(总UMI计数))，其中换算系数＝10,000，并且log1p是log
寡核苷酸标记的dextramer激活和染色使用Miltenyi CD8+T细胞阴性富集(Miltenyi)来富集CD8+T细胞。然后将细胞与全能核酸酶(Millipore)和达沙替尼(Axon)一起孵育45分钟，然后在室温下用寡核苷酸标记的dextramer池染色30分钟。然后再将细胞用荧光标记的CD3(BD Biosciences，目录号612750)、CD4(BD Biosciences，目录号563919、CD8(BD Biosciences，目录号612889)、CCR7(Biolegend，目录号353218)和CD45RO(Biolegend，目录号304238)和CITE-seq抗体在冰上染色30分钟。利用Astrios细胞分选仪(Beckman Coulter)，在前向散点图、侧向散点图和荧光通道上设置荧光激活细胞分选(FACS)门控以选择活细胞，同时排除碎片和双峰。使用100μm喷嘴对单个CD3+CD8+dextramer+细胞进行分选以进行进一步处理。
RNA测序聚类对从AIM富集分选的CD137/4-1BB+T细胞评估RNA转录产物表达。使用Seurat的基于图形的聚类方法使用k-最近邻(KNN)图进行聚类，并基于20维PCA空间中的欧氏距离计算，然后以各种分辨率进行聚类。
结果
如图4A和4B所示，生物样品中抗原特异性细胞的百分比通过散列和AIM富集来确定(图4B)，并且它与使用常规ELISPOT功能测定法所确定的百分比相关(图4A)。因此，似乎本文所述的预扩增和再刺激方案维持抗原特异性T细胞群体的相对分数。
图6中显示了本文提供的方法的验证。对通过本文公开的方法富集和分析的抗原特异性细胞的单细胞序列分析提供了进一步的验证，其非限制性实施方案在图5中示出。如图6A-C所示，单细胞序列分析将大多数细胞分配给个别HTO(80％)，而约8％的细胞被归类为“双重”，而约12％的细胞被确定为“无HTO”。对应于每种HTO的细胞的相对数目，因此每种反应性(EBV YVL-9、CMV pp65、EBV LMP2A、EBV BMLF1、M型流感)反映了正交功能测定法中确定的细胞的相对数目，这些功能测定法包括图4A中所示的ELISPOT测定法和图4B中所示的流式细胞术分析法。图6B中显示了在每种刺激进行不切实际的同等扩增下通过每种散列标签鉴定的细胞的相对数目。
平行的基于寡核苷酸标记的汇集的dextramer的实验证实了散列的CD137/4-1BB+T细胞对CMV pp65、EBV BMLF1或M型流感克隆的反应性。图6D显示了HTO-40、HTO-47和HTO-48散列的CD137/41BB扩展的TCR显示出对通过散列标签鉴定的抗原，即M型流感(HTO-40)、EBV-BMLF1(HTO-47)和pp65-CMV(HTO-48)的反应性。这通过在对应于这些抗原的散列标记孔中存在克隆大小>＝20的T细胞克隆观察到。独特克隆的数目用总克隆(TC)表示。平行的基于寡核苷酸标记的汇集的dextramer的实验证实了这些扩增的克隆的反应性。与dextramer实验中克隆大小>＝10的克隆相同的CD137/4-1BB扩增克隆的数目用OC表示。这些重叠克隆(OC)显示对应于散列抗原的dextramer高表达和对应于无关抗原的dextramer低表达。
在scSEQ数据的多路分解中提供了进一步的验证。基于个别细胞的基因表达模式和水平，从RNA转录组分析中解析出七个独特簇。(图7A)。值得注意的是，通过scSEQ数据的多路分解发现的每种抗原特异性T细胞的群体大小比较(图7B)与功能流式细胞术测定法发现的抗原特异性T细胞的群体大小一致(图4B)。数据显示独特的抗原特异性T细胞可通过scSEQ数据的HTO多路分解鉴定，并且每个抗原特异性T细胞群体的相对群体大小在多路分解后保持不变。此外，CITE-seq试剂与本文所述的散列、AIM分选和单细胞序列分析方法兼容。使用这类CITE-seq试剂可能会增加关键信息层，从而改进细胞亚群鉴定和表型分析。作为非限制性实例，CITE-seq数据给出了每个细胞的表面上蛋白质丰度的测量值，而RNA-seq数据给出了每个细胞中转录产物丰度的测量值。蛋白质丰度和RNA-seq表达可能不相关，因此两种测量提供了互补信息。这一点通过在图8A所示的CD4 CITE-seq数据和图8B所示的CD4 RNA-seq数据的比较而突显。
实施例3：抗原特异性T细胞的功能和表型分析
本文描述了散列、AIM分选、单细胞测序和CITE-seq抗体染色用于直接在PBMC上进行的抗原特异性T细胞的功能和表型分析，例如无需7-10天的预扩增。
材料和方法
5’人TCRα/β与细胞表面抗体染色：细胞分区、文库制备和测序
将悬浮在含0.04％BSA的PBS中的单细胞加载到Chromium单细胞仪器(10XGenomics)上。使用Chromium单细胞5’文库、胶珠和多路复用试剂盒(10X Genomics)，在添加抗体衍生的标签引物下制备RNAseq、V(D)J和抗体衍生的标签文库。扩增后，将cDNA分成小(<300bp)和大(>300bp)片段部分。RNAseq和V(D)J文库由>300bp的部分制备；细胞表面抗体衍生的文库由<300bp的部分制备。为了使V(D)J文库等分试样富集TCRα/β，将cDNA分成两个20ng等分试样，并使用引物扩增两轮。
具体而言，对于第一轮扩增，使用的引物是，用于短R1的MP147(ACACTCTTTCCCTACACGACGC；SEQ ID NO:17)，用于人TRAC的MP120(GCAGACAGACTTGTCACTGGA；SEQ ID NO:18)，以及用于人TRBC的MP121(CTCTGCTTCTGATGGCTCAAACA；SEQ ID NO:19)。对于第二轮扩增，使用MP147、MP128(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGTCAGGGTTCTGGATA；SEQ ID NO:20)巢式R2加人TRAC以及MP129(GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCAGGGTCAGGGTTCTGGATA；SEQ ID NO:21)巢式R2加人TRBC，扩增第一轮的20ng等分试样。V(D)J文库由各25ng hTRAC和hTRBC扩增的cDNA制备。在Illumina NextSeq500上对RNAseq和抗体衍生的标签文库进行双末端测序(读取1 26bpUMI和细胞条形码，8bp i7样品索引，和读取2 55bp转录产物读取)和V(D)J文库(读取1 150bp、8bp i7样品索引和读取2 150bp读取。
结果
将从供体分离的PBMC与五种独特HPV肽中的一种一起孵育。使用基于CD137/4-1BB的AIM分选和单细胞序列分析，基于HTO序列对抗原特异性T细胞进行聚类(图9A)。鉴定出代表在HTO样品中未共享的TCR克隆(高于阳性信号阈值)的细胞，并获得这些克隆的TCR序列(参见例如图9B)。图9B提供了示例性说明，其中每个独特细胞克隆由不同的灰度颜色表示，其中克隆的每个细胞由相同的灰度颜色表示。下表1中提供了每种散列标签的散列标签限制性克隆的数目，即仅与一个HTO相关联的克隆数目，以及每个克隆中的细胞数目。
表1
散列标签 独特克隆数目 细胞数目
HTO-1 168 233
HTO-2 176 209
HTO-3 416 1128
HTO-4 188 225
HTO-5 179 342
如表1所示，通过HTO-3鉴定的细胞显示出最大数目的表达对同源抗原具有特异性的TCR的TCR克隆，其次是聚类到HTO-5的细胞。通过氨基酸序列鉴定克隆，并且下表2中提供了一些HTO-3限制性TCR的TCRα和β对的示例性CDR3序列。
表2
Figure BDA0003583078660000701
单细胞测序分析表明，那些散列限制性T细胞克隆，即在HTO样品中未共享的T细胞克隆，更高程度地表达与功能性T细胞反应相关的标志物。(图9C；又见图9B)。
本文展示了一种独特的方法，该方法可快速鉴定特异性结合抗原的T细胞受体的独特氨基酸序列，并提供表达抗原特异性T细胞受体序列的细胞的表型特征。通过这种高通量方法，可以快速鉴定和产生新颖且可能个性化的治疗剂。
等效方案
本领域技术人员将认识到或仅使用常规实验就能够确定本文所述的本发明的特定实施方案的许多等效方案。这类等效方案意图涵盖于以下权利要求书中。
在本申请中引用的所有非专利文献、专利申请和专利的全部内容以引用的方式整体并入本文中。
序列表
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迪林·拉奎尔(Deering, Raquel)
哈尼·克安库(Dhanik, Ankur)
普尔普·史蒂芬(Pourpe, Stephane)
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<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Cys Ala Ser Ser Val Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
Cys Ala Gly Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 4
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Cys Ala Ser Ser Ile Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 5
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
Cys Val Val Trp Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 6
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 6
Cys Ala Ser Ser Ile Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Cys Ala Gly Gly Gly Ser Ser Asn Thr Gly Lys Leu Ile Phe
1 5 10
<210> 8
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
Cys Ala Ser Ser Ile Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
Cys Ala Met Arg Gly Ser Pro Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Thr
1 5 10 15
Phe
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 10
Cys Ala Ser Ser Glu Tyr Ser Asn Gln Pro Gln His Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
Cys Ala Tyr Met Thr Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Gly Lys Leu Ile
1 5 10 15
Phe
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 12
Cys Ala Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Gly Thr Phe
1 5 10
<210> 13
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
Cys Ala Gly Ala Leu Gly Gly Gly Ser Gln Gly Asn Leu Ile Phe
1 5 10 15
<210> 14
<211> 13
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
Cys Ala Ser Ser Val Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Glu Leu Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5 10
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val
1 5
<210> 17
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于短R1的MP147
<400> 17
Ala Cys Ala Cys Thr Cys Thr Thr Thr Cys Cys Cys Thr Ala Cys Ala
1 5 10 15
Cys Gly Ala Cys Gly Cys
20
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于人TRAC的MP120
<400> 18
Gly Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Thr Thr Gly Thr Cys Ala
1 5 10 15
Cys Thr Gly Gly Ala
20
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 用于人TRBC的MP121
<400> 19
ctctgcttct gatggctcaa aca 23
<210> 20
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MP128巢式R2加人TRAC
<400> 20
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaggg tcagggttct ggata 55
<210> 21
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> MP129巢式R2加人TRBC
<400> 21
gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg atctgcaggg tcagggttct ggata 55

Claims (36)

1.一种用于鉴定能够激活T细胞的抗原，以及任选地特异性结合所述抗原的TCR的T细胞受体(TCR)α链序列和/或TCRβ链序列的方法，所述方法包括：
(I)基于激活诱导标志物(AIM)的表达从包含独特生物样品的组合物中分选激活T细胞，所述独特生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)独特抗原，
(c)独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其用于特异性鉴定所述独特抗原，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记所述T细胞的分子缀合，以及任选地，
(d)支持所述T细胞的激活的培养基，以及
(II)对(I)中分选的所述激活T细胞进行单细胞测序分析，以鉴定与用所述独特HTO标记所述激活T细胞的所述分子缀合的所述独特HTO，其中鉴定所述独特HTO鉴定能够激活所述激活T细胞的所述抗原，并且任选地其中所述单细胞测序分析还鉴定以下一种或多种：
(i)由所述激活T细胞表达的一种或多种基因，和/或
(ii)由所述激活T细胞表达的TCR的TCRα和/或β链序列。
2.如权利要求1所述的方法，所述方法包括在分选之前进行以下步骤中的一个或两个：
通过将包含从受试者分离的T细胞和抗原呈递细胞(APC)的细胞集合平均分布到个别样品中来建立多个生物样品，其中每个生物样品任选地包含支持T细胞和/或APC活力、激活和/或活性的培养基和细胞因子，以及
通过向多个生物样品中的每一个递送独特抗原和/或用于特异性鉴定所述独特抗原的独特HTO来建立多个独特生物样品，其中所述独特HTO与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合，
其中所述多个生物样品中的每一个包括包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，和任选地支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基，并且
其中在递送所述独特抗原和/或与用所述独特HTO标记T细胞的分子缀合的所述独特HTO后，所述多个生物样品中的每一个变成独特生物样品，所述独特生物样品包含：
(a)包含从受试者分离的T细胞和APC的细胞集合，
(b)独特抗原，
(c)独特HTO，其特异性鉴定所述独特抗原并与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合，以及任选地
(d)支持所述T细胞和APC的活力、活性和/或激活的培养基，
使得(I)中分选的所述组合物包含多个独特生物样品。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述APC包含单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞或它们的组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中分选包括基于所述激活诱导标志物(AIM)的表达对激活T细胞进行荧光激活细胞分选。
5.如权利要求4所述的方法，其中所述AIM选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3、TIGIT和它们的任何组合。
6.如权利要求4或权利要求5所述的方法，其中荧光激活细胞分选是基于用所述AIM的荧光标记抗体检测。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法包括对II中分析的所述激活T细胞进行进一步的功能和/或表型分析，任选地其中所述进一步的功能和/或表型分析选自由以下组成的组：流式细胞术分析、CITE-seq分析、多聚体分析和它们的组合。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述进一步的功能和/或表型分析测量以下一种或多种的蛋白质和/或RNA表达水平：CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD45RA、CD62L、HLA-DR、CD137/4-1BB、CD69、CD278、CD274、CD279、CD127、CD197、IFNγ、GZMH、GNLY、CD38、CCL3和LAG3。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中外周血单核细胞提供所述T细胞和表面结合的MHC。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中用所述独特HTO标记所述T细胞的所述分子包含结合细胞表面分子的抗体。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述AIM是或包含CD137/4-1BB。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列分别是TCRα链可变区序列和/或TCRβ链可变区序列。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括鉴定特异性结合所述抗原的TCR的TCRα链序列和/或TCRβ链序列并且所述方法还包括利用所述TCRα链序列和/或TCRβ链序列制造治疗剂。
14.一种组合物，所述组合物包含生物样品，所述生物样品包含：
(a)T细胞和表面结合的主要组织相容性复合体(MHC)，其中所述T细胞能够识别在所述表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)抗原，
(c)散列标签寡核苷酸(HTO)，其特异性鉴定所述抗原，其中所述HTO与用所述HTO标记所述T细胞的分子缀合，
以及任选地
(d)支持所述T细胞的激活的培养基。
15.如权利要求14所述的组合物，其中
(a)所述MHC在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达，任选地其中：
所述T细胞和所述APC是自体同源的，
所述T细胞和所述APC各自从人类供体分离，和/或
所述APC选自由以下组成的组：单核细胞来源的树突状细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞和它们的组合，
(b)所述抗原
(I)选自由以下组成的组：
(i)细菌抗原或其部分，
(ii)病毒抗原或其部分，
(iii)过敏原或其部分，
(iv)肿瘤相关抗原或其部分，以及
(v)它们的组合，和/或
(II)包含
(i)氨基酸序列，
(ii)核苷酸序列，
(iii)溶解产物，以及
(iv)它们的组合，
(c)所述HTO缀合的分子包含结合细胞表面分子的抗体或脂质，和/或
(d)所述培养基包含支持所述T细胞和/或APC的活力的细胞因子。
16.如权利要求15所述的组合物，其中
所述抗体结合选自由以下组成的组的细胞表面标志物：β2微球蛋白、CD298、CD2、CD3、CD4、CD8和它们的任何组合，或
所述脂质并入细胞膜中。
17.如权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中支持所述T细胞和/或所述APC的活力的所述细胞因子选自由以下组成的组：IL-2、IL-7、IL-15、GM-CSF、IL-4和它们的任何组合。
18.如权利要求15-17中任一项所述的组合物，所述组合物还包含第二生物样品，其中所述第二生物样品包含：
(a)第二T细胞和第二表面结合的MHC，其中所述第二T细胞能够识别在所述第二表面结合的MHC的环境中呈递的肽，
(b)第二抗原，
(c)特异性鉴定所述第二抗原的第二HTO，其中所述HTO与用所述第二HTO标记所述第二T细胞的第二分子缀合，
以及任选地
(d)支持所述第二T细胞的激活的培养基，
其中
(i)所述T细胞和所述第二T细胞是从同一个受试者分离，
(ii)所述抗原和所述第二抗原不相同，
(iii)用所述HTO标记所述T细胞的所述分子与用所述第二HTO标记所述第二T细胞的所述第二分子相同，并且所述HTO和所述第二HTO不相同。
19.如权利要求14-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含允许基于激活诱导标志物(AIM)的表达分选激活T细胞的剂。
20.如权利要求19所述的组合物，其中所述允许基于AIM的表达分选激活T细胞的剂是特异性结合所述AIM的荧光标记抗体。
21.如权利要求19或权利要求20所述的组合物，其中所述AIM选自由以下组成的组：CD137/4-1BB、CD107、IFNγ、PD-1、CD40L、OX40、CD25、CD69、CD28、HLA-DR、CX3CR1、TIM3、LAG3和/或TIGIT。
22.如权利要求14-21中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含可用于所述组合物的流式细胞术分析或CITE-seq分析的抗体和/或MHC多聚体。
23.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
多种独特抗原，和
多种独特散列标签寡核苷酸(HTO)，其中每一种特异性鉴定所述多种独特抗原中的仅一种。
24.如权利要求23所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包含允许基于激活诱导标志物(AIM)的表达分选激活T细胞的剂，任选地其中所述允许基于AIM的表达分选激活T细胞的剂是特异性结合所述AIM的荧光标记抗体。
25.如权利要求23或权利要求24所述的试剂盒，其中所述多种独特HTO中的每一种与相同的分子缀合，使得所述试剂盒包含多种独特HTO缀合的分子。
26.如权利要求23-25中任一项的试剂盒，其中所述多种独特抗原中的每一种包含来自单一蛋白质的独特且重叠的肽序列。
27.如权利要求26所述的试剂盒，其中所述单一蛋白质选自由以下组成的组：致病性抗原、肿瘤相关抗原或移植抗原。
28.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于分析T细胞介导的患者对疫苗的免疫反应。
29.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于分析T细胞介导的患者对免疫疗法的免疫反应。
30.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于分析患者在所述患者的免疫疗法期间的T细胞介导的免疫反应。
31.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于分析患者对自身抗原的T细胞反应。
32.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于分析患者对移植抗原的T细胞反应。
33.如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒的用途，用于鉴定激活T细胞的一个或多个TCR可变区序列。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述一个或多个TCR可变区序列包含TCRα链的CDR3序列和/或TCRβ链的CDR3序列。
35.权利要求33或权利要求34中鉴定的所述一个或多个TCR可变区序列在制造人类治疗剂中的用途。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述人类治疗剂包含T细胞，所述T细胞包含使用如权利要求1-13中任一项所述的方法、如权利要求14-22中任一项所述的组合物或如权利要求23-27中任一项所述的试剂盒鉴定的所述一个或多个TCR可变区序列。
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