KR20110134386A

KR20110134386A - 단일 세포의 세포독성을 평가하기 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20110134386A
Application number: KR1020117018895A
Authority: KR
Inventors: 존 크리스토퍼 러브; 나빈 바라다라잔; 보리스 율크; 브루스 워커
Original assignee: 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지; 더 제너럴 하스피털 코포레이션 두잉 비즈니스 애즈 매사츄세츠 제너럴 하스피털
Priority date: 2009-01-21
Filing date: 2009-07-13
Publication date: 2011-12-14
Also published as: CN104745669A; RU2011134898A; JP2012515548A; CA2689681A1; US20120149592A1; CA2689681C; EP2389446A1; US9244071B2; AU2009338127A1; EP2389446B1; SG172889A1; JP2015144617A; IL213938A0; WO2010085275A1; SG10201401643PA; CN102388145A; RU2532228C2; EP2389446A4; AU2009338127B2; JP6017620B2

Abstract

본 발명은 마이크로어레이의 다수의 단일 세포를 프로파일링하는 고속 처리 스크리닝 방법을 이용하여 표적 세포와 효과기 세포 쌍 사이의 상호작용을 분석하는 방법을 제공한다.

Description

단일 세포의 세포독성을 평가하기 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR ASSESSING CYTOTOXICITY OF SINGLE CELLS}

본 발명은 마이크로어레이에서 다수의 단일 세포의 프로파일링을 위해 고속 처리 스크리닝 방법을 이용하여 표적 및 효과기 세포 쌍의 상호작용을 분석하는 방법을 제공한다.

25년 이상 동안 인간과 인간 면역결핍 바이러스 1형(HIV-1)의 상호작용에 대한 연구에도 불구하고, HIV/AIDS는 여전히 전세계인의 건강에 대한 가장 일반적인 위협 요인 중 하나이다. 현재 견해로는, 향후 20년 동안 이 질병은 전세계에서 암과 심혈관 질환에 이에 세번째로 높은 사망 원인이 될 것이라고 한다. 이 질병을 조절하기 위한 자연 기전을 유발하거나 감염을 예방하는 백신은 아직 개발되지 않았다. 기존의 분석 도구는 바이러스에 대한 효과적인 방어 면역을 제공하는 면역계 세포와 관련된 중요한 특성을 규명하는데 결코 적당하지 않다. 유세포 분석 및 면역흡착 분석(ELISpot, ELISA) 등의 기법으로 세포군을 평가할 수 있지만, 희귀 사건에 대한 감도가 불량하다. 세포독성 및 증식과 같은 다른 중요한 기능은 현재 대량으로만 측정할 수 있다. 이와 함께, 이러한 제약들로 인하여, 방어 관련성을 결정하기 위해 충분히 명확하게 HIV에 대한 인간 면역 반응을 평가하는 것이, 불가능하지 않더라도, 곤란하다. 따라서, HIV와 같은 바이러스에 대한 방어 면역을 분석하기 위한 새로운 전략에 대한 요구가 절박하다.

본 발명은 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 효과기 CD8+ 세포 및 표적 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰이 단일 효과기 세포를 가지는 단계; CD8+ 세포에 의해 표적 세포가 용해되는 조건 하에서 현탁액을 배양하는 단계; 효과기 세포에 의한 표적 세포의 용해를 검출하는 단계; 및 CD4+ HIV 감염된 세포를 용해시킬 수 있는 CD8+ 세포를 동정하는 단계에 의해, 피험체의 CD4+ HIV-감염된 세포를 용해할 수 있는 CD8+ 세포를 동정하는 방법을 제공한다. 경우에 따라서, 표적 세포를 용해시키는 효과기 세포를 회수한다. 바람직하게는, 표적 세포를 용해시키는 회수한 효과기 세포를 배양한다. 일 측면에서, 효과기 세포 및 표적 세포를, 마이크로웰에 세포를 놓기 전에 혼합한다. 대안적으로, 효과기 세포 및 표적 세포를, 마이크로웰에 세포를 놓은 후에 혼합한다. 표지된 세포의 형광 변화를 모니터링하여 용해를 검출한다. 대안적으로, 표적 세포의 세포내 칼슘 수준 변화를 모니터링하여 용해를 검출한다. 칼슘 민감성 형광 염료로 칼슘을 검출한다. 바람직하게는, 칼슘 민감성 형광 염료는 Fura 2AM(Invitrogen)이다.

일 측면에서, 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시킨 다음 제제를 검출하는데, 이 때 기판은 효과기 세포의 산물을 특이적으로 검출하는 하나 이상의 제제로 전처리되어 있다. 상기 제제는 항체, 사이토킨, 또는 가용성 용해 매개인자(soluble mediator of lysis)이다. 바람직하게는, 사이토킨은 TNF-α 또는 IFN-γ이다. 경우에 따라서, 가용성 용해 매개인자는 그랜자임 B(GzB) 또는 퍼포린이다. 본 발명의 방법은 경우에 따라 CD69로 효과기 세포를 표지하는 것을 추가로 포함한다.

본 발명은 또한, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 B 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV로 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되고, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 세포를 포함하는 단계; 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판이 하나 이상의 B 세포 검출제로 전처리되어 있는 단계; 및 상기 검출제를 검출하여 항체 반응을 특성규명하는 단계에 의해, 피험체의 항체 반응을 특성규명하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, B 세포 검출제는 gp120의 에피토프에 특이적인 항체이다.

일 측면에서, 본 발명의 방법은 마이크로웰 어레이를 제2 기판과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 기판은 하나 이상의 제1 B 세포 검출제로 전처리되어 있다. 경우에 따라서, 제1의 B 세포 검출제는 HIV gp120에 대한 항체이다. 바람직하게는, 항체는 HIV gp120의 C-말단에 대한 것이다. 일 측면에서, 마이크로웰 어레이의 B 세포가 생산하는 항체의 이소타입을 측정한다. HIV와 반응성인 항체를 발현하는 B 세포를 경우에 따라 단리한다. 또 다른 측면에서, 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부를 단리하여 증폭시킨다. B 세포를 경우에 따라 세포에서 항체의 생산을 자극하는 제제에 노출시킨다. 바람직하게는, 제제는 CD40L 또는 항-BCR 항체이다. 또다른 측면에서, B 세포를 CD40L 및 항-BCR 항체에 노출시킨다.

또한, 본 발명은 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 B 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV에 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되며, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 세포를 가지는 단계; 상기 마이크로웰 어레이를 제1 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판은 하나 이상의 마이크로웰의 B 세포가 생산하는 항체로 전처리되어 있는 것인 단계; 상기 기판을 제1의 표지된 HIV 비리온 및 제2의 표지된 HIV 비리온과 접촉시키는 단계; 및 제1의 표지된 비리온 및 제2의 표지된 비리온이 마이크로웰의 동일한 세포에 의해 생산되는 항체에 결합하는지 여부를 결정하는 단계에 의해, 복수의 HIV 단리물에 대한 B 세포의 교차반응성을 특성규명하는 방법을 제공한다. 경우에 따라서, 표지된 제1 비리온과 표지된 제2 비리온에 특이적으로 결합하는 항체 생산 B 세포를 회수한다. 일 측면에서, 회수된 B 세포를 배양한다. 바람직하게는, 하나 이상의 비리온을 표지한다. 대안적으로, 제1 비리온 및 제2 비리온을 다르게 표지한다. 즉, 상이한 검출가능한 마커로 표지한다.

또한, 본 발명은 CTL(CD8⁺), NK 세포(CD16⁺), NK T 세포(CD1d⁺,Vα24⁺), 또는 γδ T 세포(Vγ9⁺,Vδ2⁺)로 이루어진 군에서 선택된 효과기 세포군을 제공하는 단계로서, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓인 피험체로부터 효과기 세포를 얻고, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 효과기 세포를 가지며, 효과기 세포군은 동족의 표적 세포군과 함께 로딩되는 단계; 효과기 세포를 가시화하는 단계; 효과기 세포의 세포독성을 평가하는 단계; 마이크로웰 어레이를 제1 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판이 IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α 및 IFN-γ 중 하나 이상을 특이적으로 검출하는 제제로 전처리된 것인 단계; 및 마이크로웰의 효과기 세포가 하나 이상의 제제에 결합하는지 여부를 측정하는 단계에 의해, 피험체의 HIV 감염에 반응성인 효과기 세포에 대한 기능성 프로파일을 형성하는 방법을 제공한다. 일측면에서, 세포독성은 칼세인 AM의 방출을 검출하여 평가한다. 경우에 따라, 하나 이상의 특이적 표면 마커 단백질에 대해 세포를 표지한다. 바람직하게는, 표면 마커 단백질은 CD62L, CXCR3, CCR4, 또는 CCR7이다. 또 다른 측면에서, 하나 이상의 마이크로웰로부터 효과기 세포를 회수한다. 경우에 따라서, 회수된 세포를 배양하여 회수된 세포의 클론 증폭물을 얻는다. 경우에 따라, 회수된 세포의 하나 이상의 유전자 발현을 특성규명한다. 회수된 세포는 바람직하게는 CD8⁺ 세포독성 T 세포(CTL), 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 또는 γδT 세포이다. 또 다른 측면에서, 피험체는 급성기 감염 피험체, 고활성 항레트로바이러스 요법(HAART) 피험체 또는 엘리트 콘트럴러(elite controller)이다.

본 발명은 또한, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 NK 세포 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV로 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되고, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 그 위에 놓여진 단일 세포를 가지는 단계; 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판은 하나 이상의 NK 세포 검출제로 전처리되는 단계; 및 상기 검출제를 검출하여 NK 세포를 검출하고 선천 면역 반응을 평가하는 단계에 의해, HIV 감염 피험체의 선천 면역 반응을 평가하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, NKp46-Cy3, CD107a-Alexa647, 및/또는 CD69-Alexa488를 사용하여 NK 세포를 검출한다. NK 세포 검출제는 NK 세포를 검출한다. 경우에 따라 세포를 성형가능한 슬래브 상에 놓기 전에 공동배양한다. 바람직하게는, 세포를 IL-12 및 IL-18과 함께 공동배양한다.

또한, 본 발명은 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 NK 세포 및 표적 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 효과기 세포를 가지는 것인 단계; NK 세포가 표적 세포를 용해시키는 조건 하에 상기 현탁액을 배양하는 단계; 효과기 세포에 의한 표적 세포의 용해를 검출하는 단계; 및 효과기 세포를 동정하여 NK 세포군에서의 클론 다양성을 평가하는 단계에 의해, NK 세포군의 클론 다양성을 평가하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, 표적 세포를 용해하는 NK 세포를 회수하고, 경우에 따라 배양한다. 또 다른 측면에서, 표적 세포를 용해하는 NK 세포를 회수한다. 경우에 따라서, NK 세포 및 표적 세포를, 마이크로웰에 세포를 놓기 전에 혼합한다. 대안적으로, NK 세포 및 표적 세포를, 마이크로웰에 세포를 놓은 후에 혼합한다. 일 측면에서, 표적 세포의 용해는, 표지된 세포의 형광 변화를 모니터링하여 결정한다. 또 다른 측면에서, 표적 세포를 용해하는 NK 세포를 단리하고, NK 세포 상의 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR) 유전자를 검출한다. 경우에 따라서, 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키며, 이 때 기판은 NK 세포의 산물을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 제제로 전처리되며, 이 후 제제를 검출한다. 상기 제제는 항체, 사이토킨, 또는 가용성 용해 매개인자이다. 바람직하게는, 사이토킨은 TNF-α 또는 IFN-γ이다.

또한, 본 발명은 증식된 HIV-감염 CD4+ 세포 T 세포, 활성화 NK 세포, 및 B 세포와 표적 세포를 포함하는 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 현탁액을 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓고, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰이 단일 T 세포를 가지는 단계; B 세포에 의해 생산되는 항체가 T 세포의 표면에 결합하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계; B 세포, NK 세포, 및 용해된 T 세포를 포함하는 웰을 확인하고 B 세포 또는 NK 세포를 동정하는 단계에 의해, NK 및 B 세포군의 다양성을 평가하는 방법을 제공한다. 일 측면에서, NK 세포를 IL-2로 활성화시킨다. 또 다른 측면에서, B 세포를 CD40L 또는 항-BCR로 활성화시킨다. 또 다른 측면에서, B 세포를 CD40L 및 항-BCR 항체로 활성화시킨다. NK 세포를 IL-2로 활성화시킨다. B 세포를 항-BCR 항체의 CD40L로 활성화시킨다. 경우에 따라서, B 세포 또는 NK 세포를 웰로부터 회수하고; B 세포의 하나 이상의 성질을 특성규명한다. 또 다른 측면에서, B 세포의 항체 유전자를 특성규명한다. B 세포의 항체를 코딩하는 VDJ 영역의 유전자를 경우에 따라 분석한다. 마이크로웰 어레이를, 경우에 따라 B 세포가 생산한 항체가 기판에 부착되도록 하는 조건 하에 기판과 접촉시킨다. 또 다른 측면에서, 기판을 HIV 감염 세포로부터의 용해물과 접촉시키고, 항-IgG3 항체 또는 HIV 용해물에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 포함하는 웰을 확인한다. 바람직하게는, 항-IgG3 항체 또는 HIV 용해물에 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 포함하는 웰을 확인한다.

본 발명의 기타 특징 및 장점은 하기 바람직한 실시양태들의 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다. 달리 정의된 바 없다면, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자들이 공통적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 가진다. 본원에 개시된 것과 유사하거다 대등한 방법 및 재료를 본 발명의 실시 또는 시험에 이용할 수 있지만, 적당한 방법 및 재료가 이하에 개시되어 있다. 본원에서 언급한 모든 공개문헌, 특허출원, 특허 및 다른 참조문헌은 그 전문이 참고로 포함된다. 상충되는 경우에는, 정의를 포함하는 본 명세서에 따른다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.

본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 분석안의 예시도이다. 형광 표지된 표적(칼세인으로 염색, 녹색) 및 효과기(α-CD8 APC로 염색, 핑크) 세포를 ~30 ㎛ 마이크로웰 어레이에 로딩하고 형광 현미경으로 영상화한다. 그 다음, 마이크로웰 어레이를, 포획 항체로 사전작용화한 유리 슬라이드로 피복하고, 2∼6 시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 항온처리하였다. 항온처리 후에, 특이적 형광 항체를 이용하여 유리 슬라이드 상에서 분비된 사이토킨을 검출하고, 특정 효과기에 의해 용해된 표적을 형광성 손실로 영상화한다(웰 1). 표적 세포만을 포함하는 마이크로웰(웰 2) 및 표적을 용해할 수 없는 효과기를 포함하는 마이크로웰(웰 3)에서는 표적의 형광성의 변화가 거의 없어야 한다.
도 2는 항온처리 전 및 후(0 시간 및 4 시간)에 표지된 표적과 효과기의 대표적인 형광 영상 시리즈이다. (A) 칼세인 염색되고(녹색), 펩티드 로딩된(KK10) 표적(3개의 개별 세포가 관찰될 수 있음); (B) α-CD8-APC로 표지된 효과기(핑크); (C) 효과기(핑크) 및 비로딩(첨가된 KK10 펩티드 없음) 표적(녹색)의 동시항온배양; (D) 효과기(핑크) 및 KK10 펩티드가 로딩된 표적(녹색)의 동시항온배양. 표적-용해는 효과기가 펩티드 로딩된 표적을 인식할 때만 일어난다(D에 도시됨).
도 3은 GFP 발현 NL4-3 바이러스로 감염된 CD4 T-세포의 형광 영상 패널이다. 녹색 세포는 감염을 표시한다.
도 4는 칼세인 AM 표지된 HIV 펩티드가 로딩된 B-세포와 HIV 특이적 CD8+ T-세포 클론의 동시배양을 도시하는 형광 영상 시리즈이다. CTL 매개 용해는 형광 신호 손실에 의해 표시된다.
도 5는 APC 표지된 CTL(적색) 및 칼세인 AM 표지된 B-세포(녹색)의 동시배양을 도시하는 형광 영상 패널이다. 칼세인 AM 형광 소광은 CTL 매개의 사멸을 나타낸다.
도 6은 마이크로웰의 어레이를 이용하여 개발된 단일 세포 측정 과정을 도시한 개략도이다. 직렬 또는 병렬로 측정을 결부시킨다. 각 영상에 도시된 사각형은 50 ㎛이다.
도 7은 gp120의 CD4 결합 영역을 인식하는 세포를 확인하기 위한 포획 분석의 개략적인 예시도이다. B 세포의 한 어레이를 사용하여 (a) 고정된 gp120의 표면과, 이어서 (b) 가용성 CD4로 차단한 후에, 고정된 gp120의 제2 표면에 프린팅한다.
도 8은 복수의 HIV 균주에 결합하는 B 세포로부터의 인간 항체를 동정하기 위한 실험적 설계를 개략적으로 예시한 것이다. 포획된 항체의 각 클러스터(착색)는 상응하는 마이크로웰의 어레이에 유지되는 세포에 대응되는 마이크로웰 어레이의 한 성분을 나타낸다.
도 9는 단일 세포 데이터로부터의 기능적 프로파일의 구축을 도시한다. 세포군을 분류하고, 그 세포독성 능력, 사이토킨 프로파일 및 표면 마커를 측정한다. 그러한 맵은 서브세트의 빈도가 감염 과정에서 어떻게 변화하는지를 나타낸다. CD4+ T 세포에 대한 유사한 프로파일은 계의 상태에 대한 기준점을 제공한다.
도 10은 마이크로웰로부터 선택된 각 B 림프구의 축퇴 RT-PCR의 결과를 예시하는 겔을 도시한다. B 세포를 혈액 샘플(자기 분류에 의한 PBMC의 음성 선별)로부터 정제하고 마이크로웰로 로딩한다. 12개의 마이크로웰의 세포를 무작위로 선별하고, 용해 완충액에 놓고, 중쇄 및 경쇄에 대한 축퇴성 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR로 증폭시켰다. 7종의 단백질 서열을 회수하였으며, 겔 아래에 도시되어 있다.

면역계를 회피하는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)가 이용하는 기전의 완전한 이해가 효과적인 백신 및 치료법을 고안하는데 필수적이다. 미치료 개체의 질병 진행은 바이러스 복제의 지속성 및 CD4+ T 세포의 상실에 의해 나타난다(Kahn JO, Walker BD (1998) Acute human immunodeficiency virus type I infection. N. Engl. J. Med. 339, 33; Hecht FM et al. (2002) Use of laboratory tests and clinical symptoms for identification of primary HIV infection. AIDS 16, 1119). 바이러스 특이적 CTL은 지속 감염을 조절하는데 중요한 역할을 하며, HIV-1 특이적 CD8+ T 세포의 초기 출현은 바이러스 양을 감소시키는 것으로 나타났다(Altfeld M et al. (2006) HLA Alleles Associated with delayed progression to AIDS contribute strongly to the initial CD8+ T cell response against HIV-1 PLoS. Med. 3(10), 1851). 그러나, 바이러스 복제 감소는 대부분의 개체에서 일시적이다(진행자). LTNP(엘리트 콘트럴러)로 명명되는 매우 소수의 개체의 부분집단이 지속적인 기간 동안 낮은 바이러스 역가를 유지하며, 이들 개체에서 동정된 바이러스 특이적 CD8+ T 세포는 진행자로부터 분리된 동일한 세포와 비교하여 더 높은 증식력을 가지는 것으로 확인되었다(Migueles SA et al. (2002) HIV-specific CD8+ T cell proliferation is coupled to perforin expression and is maintained in nonprogessors Nat. Immun. 3(11), 1061).　

본원에 개시된 발명 이전에, 병원체와 인간 면역계 사이의 상호작용의 연구에 대한 고유한 2가지 과제가 있었다: 1) 대부분의 임상 샘플에서 이용가능한 세포의 수가 흔히 제한적이라는 점; 및 2) 병원체 특이적 B 세포 또는 T 세포와 같은 특별한 클론이 희귀하다는 점. 또한 기존의 분석 도구는 동일한 각 세포에 복수의 특성(계통, 기능, 유전자형)을 동시에 배정하기에 충분하지 않다. 예를 들어, 유세포 분석법은 표면 발현된 표현형 마커에 대해 단일 세포군을 평가하는데 사용되는 일반적 기법이지만, 특정 기능적 표현형을 나타내는 사이토킨 프로파일의 분석은 세포의 고정 및 투과를 필요로 한다. 생존력 상실은 세포독성과 같은 추가의 기능적 특성을 직접 평가할 수 없다는 것을 의미하며, 유전자 분석은 또한 종종 방해를 받는다. 따라서, 본원에 개시된 발명 이전에는, 특정 감염제에 반응하는 선천 및 적응 면역계로부터의 세포 서브세트에서 미세한 이종성을 분명하게 분리할 수는 없었다. 면역계 상태의 포괄적인 정보(snapshot)을 얻는 것도 어려웠다. 그러한 프로파일로 인해, 건강한 반응에 대한 진단 지시자와 특정 병원체에 대한 방어를 부여하는 기전의 확인이 개선된다. 따라서, 본 발명은 계통, 기능 및 유전자형을 측정하여 다수의 각 세포와 관련시켜 인간 면역계와 해당 병원체, 특히 HIV의 상호작용에 대한 연구를 향상시키는 새로운 기법을 제공한다(Fauci, A.S., Johnston, M.I., Dieffenbach, C.W., Burton, D.R., Hammer, S.M., Hoxie, J.A., Martin, M., Overbaugh, J., Watkins, D.I., Mahmoud, A. & Greene, W.C. Perspective - HIV vaccine research: The way forward. Science 321, 530-532 (2008)).

본 발명은 인간 면역결핍 바이러스에 의한 감염을 포함하는 감염에 대한 피험체의 면역 반응을 특성규명하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. PCT/US2006/036282호(WO/2007/035633호에 공개된 바와 같음) 및 USSN 61/057,371호에 개시된 방법을 포함하는 당업계에 공지된 방법으로 마이크로어레이 및 슬래브를 구성할 수 있다. 이들 출원의 내용은 그 전문이 참고로 포함된다. 본원에 개시된 바와 같이, "성형가능한 슬래브"는 기판과 접촉하여 배치된 경우, 적어도 한 치수에서, 구부러지거나, 움직이거나, 또는 비틀어질 수 있는 장치를 의미하는 것이다. 예를 들어, 특정 구성에서 성형가능한 슬래브는 재료, 예컨대 엘라스토머 재료를 포함하여, 성형가능한 슬래브가 기판과 접촉하여 배치될 때 성형가능한 슬래브와 기판 사이에 실질적으로 유체 기밀성 시일이 형성되어 성형가능한 슬래브로부터 임의의 유체가 흘러나오거나 새는 것을 지연 또는 방지할 수 있다.

HIV 억제에 있어서 항바이러스 세포독성 T-림프구(CTL) 기능

세포독성 CD8+ T-세포(CTL)는 급성 바이러스 감염의 제거 및 지속성 바이러스 저장소의 조절에 중추적인 역할을 한다. SIV 감염된 머카크에서 CD8+ 림프구 결핍은 바이러스혈증의 급격하고 현저한 증가를 유발한다. 그럼에도 불구하고, 만성 HIV-1 감염은, 바이러스 제거 또는 조절의 부재 하에 HIV-특이적 CD8+ T 세포의 많은 양과 관련이 있다. 이들 데이타는, CD8+ T 세포의 수가 아니라 기능이 바이러스 복제를 효과적으로 조절하는데 중요하다는 것을 시사하는 것이다. 지금까지, HIV-특이적 CD8+ T-세포 활성의 효능은, 펩티드-HLA 클래스 I 복합체 사량체로 세포를 표지하여 HIV-특이적 CD8+ T 세포의 빈도를 평가하거나, 또는 항원 자극시 이들 T 세포가 IFN-γ를 분비하는 능력에 의해 측정하였다. 그러나, 최근 연구 결과는, CD8+ T 세포에 의한 IFN-γ의 빈도 및 분비가 만성 HIV-1 감염의 바이러스혈증의 조절과 관계가 없다는 것을 보여준다.

HIV 복제를 억제하는 CTL의 능력은, HIV-감염 CD4+ T-세포 및 자가의 대량 CD8+ T-세포를 동시배양하여 측정한다. 이들 실험은 HIV를 억제하는 개체의 능력에 대한 이질적인 결과를 보여준다. 최근 결과는, 생체외 CD8+ T 세포 반응이 시험관 내에서 HIV-1 복제를 억제하는 이들 세포의 능력과 관련이 없다는 것을 제안하고 있다. 그 보다는, CD8+ T 세포가 바이러스에 대한 조절을 증가시킬 수 있는 바이러스에 대항하는 충분한 양으로 증식할 수 있지만, 이들 세포의 표현형, 기능적 속성 및 유전자 전자 프로파일(성숙/소진)은 알려지지 않고 있다.

질병 진행 조절에 있어서 바이러스-특이적 CD8⁺ T 세포의 중요성은 분명해보이지만, 이의 특성 및 단리는 과제로 남아있다. 각각 장점과 단점을 가지는 각종 방법을 이용하여 CTL을 분리하였다. 제한적 희석 분석법은 항원 특이적 클론을 분리하는데 이용될 수 있지만, 조직 배양물에서 이들 클론을 배가시키는 능력에 좌우된다. ELISPOT 분석법은 단일 사이토킨을 분비하는 활성화된 CTL의 능력을 측정할 수 있지만, 용해능에 대한 어떤 정보도 제공하지 않는다. 또한, 저 밀도의 펩티드 로딩된 MHC(pMHC)를 나타내는 항원 제시 세포(APC)가 사이토킨의 동시 분비 없이 세포독성 기능을 유발할 수 있다는 것이 이미 입증되었다(Valitutti S et al. (1996) Different responses are elicited in cytotoxic T lymphocytes by different levels of T cell receptor occupancy. J. Exp. Med. 183, 1917). 이러한 제약은 바이러스 감염이 클래스 I MHC를 하향조절하기 때문에 HIV 특이적 CTL을 단리하고자 하는데 특히 중요하다(Mangasarian A et al. (1999) Nef-Induced CD4 and Major Histocompatibility Complex Class I (MHC-I) Down-Regulation Are Governed by Distinct Determinants: N-Terminal Alpha Helix and Proline Repeat of Nef Selectively Regulate MHC-I Trafficking J. Virol. 73(3), 1964). 펩티드 로딩되고 형광 표지된 HLA 클래스 I 사량체 염색을 유세포 분석과 결부시켜 항원-특이적 CTL을 단리하였지만, 이도 역시 용해능에 대한 정보를 제공하지 못하였다. 또한, 사량체 염색을 이용하여 단리한 CTL이 바이러스 감염 세포를 항상 인식하는 것은 아니라는 것이 확인되었다(Appay V et al. (2000) HIV-specific CD8+ T cells produce antiviral cytokines but are impaired in cytolytic function. J. Exp. Med. 192(1), 63). 카스파제 기질을 이용한 유세포 용해 분석이 보고된 바 있지만, 효과기 세포에 대해 다수를 스크리닝하는데는 적합하지 않다(Liu L et al. (2002) Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates Nat. Med. 8, 185). 따라서, 본원에 개시된 발명 이전에, 추가의 기능적 특성규명 및 유전자 분석을 위한 클론주를 확립하기 위해서 생세포를 회수할 수 있으면서도 분비되는 사이토킨 및 세포독성 분자를 측정하고 감염된 표적 1차 단일 세포를 용해시키는 단일 CTL의 능력을 측정하는 단일 고속 처리 기법은 없었다.

감염된 CD4+ T 세포를 인식하여 용해시킬 수 있는 CD8+ T 세포의 고빈도 유지는 바이러스 복제를 억제하는 환자의 능력과 직접 관련이 있다. 단일 세포 수준에서 비-세포용해 CTL에 대한 세포용해 CTL의 고유 표현형, 기능 및 유전자 발현 프로파일을 규명하면 유효한 HIV 백신의 생성에 필요한 항바이러스 CD8⁺ T 세포 면역의 관련성을 정할 수 있다. 본 발명은 유효 항바이러스 CD8⁺ T 세포 매개 면역의 면역학적 및 유전자 관련성을 결정하는 표현형 및 유전자 분석과 결부시킨 단일 세포 CTL 사멸 분석을 제공한다. 단일 세포 수준에서의 이들 특성 규명은 바이러스 복제를 강력하게 조절할 수 있는 CD8⁺ T 세포의 증식을 유도하도록 고안된 백신접종을 통해 유발되는 원형적인 반응을 제공한다.

HIV-감염인에서의 항체 다양성

HIV의 표면에서 발현되는 1차 수용체는 gp120이다. 이는 감염에 필수적이며, 특정 T 세포의 표면에 제시된 수용체인 CD4에 결합한다. HIV 백신에 대한 여러 접근법들은 gp120에 대해 NAb 반응을 형성하여 감염을 차단하려는 것이었으나, 대개는 균주마다 수용체의 변이성과 숙주 내에서 변이하려는 성향으로 인하여, 지금까지는 전부 실패하였다. 그러나, 바이러스의 여러 변이체를 광범위하게 중화시키는, 자연적으로 NAb를 형성하는 감염인의 예가 있다. 혈청의 고유 항체는 그 양이 제한적이고, 정제가 어려우며, 상응하는 유전자 없이 재조합으로 형성할 수 없기 때문에 통상적인 기법으로 이들 항체의 다양성을 평가하기가 어렵다. 도전과제는 B 세포로부터 제조되는 B 세포의 클론주에 bNAb를 대응시키는 것이다. 지금까지, NAb를 코딩하는 유전자를 확인하는 가장 성공적인 방법은 HIV+ 개체로부터 유래한 다수의 순환성 B 세포로부터 재조합으로 생성한 항체 라이브러리를 패닝하는 것이다(Koefoed, K., Farnaes, L., Wang, M., Svejgaard, A., Burton, D.R. & Ditzel, H.J. Molecular characterization of the circulating anti-HIV-1 gp120-specific B cell repertoire using antibody phage display libraries generated from pre-selected HIV-1 gp120 binding PBLs. J Immunol Methods 297, 187-201 (2005)). 그러나, 이들 방법은 그 과정이 중쇄 및 경쇄의 고유한 클론 조합을 뒤섞기 때문에, 개체의 천연 레퍼토리를 알기 어렵게 한다. 하기 실시예에 개시된 바와 같이, 2가지 문제가 검토될 것이다: (1) 개체의 bNAb 생산 B 세포 중에서의 클론 다양성; 및 (2) 다양한 1차 단리물에 결합하는 bNAb의 특성.

HIV에 대한 세포 면역 반응

HIV 백신에 대한 희망은 소위 '엘리트 콘트럴러"라고 하는 자연적으로 질병 진행을 주목할 만하게 조절하는 사람들과, 백신접종에 의해 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)로부터 방어된 비인간 영장류에 있지만, 이들 사례에서 방어와 관련된 중요한 인자는 분명하지 않다(Saez-Cirion, A., Pancino, G., Sinet, M., Venet, A., Lambotte, O. & Gr, A.E.H.C.S. HIV controllers: how do they tame the virus? Trends Immunol 28, 532-540 (2007); Deeks, S.G. & Walker, B.D. Human immunodeficiency virus controllers: Mechanisms of durable virus control in the absence of antiretroviral therapy. Immunity 27, 406-416 (2007); Koff, W.C., Johnson, P.R., Watkins, D.I., Burton, D.R., Lifson, J.D., Hasenkrug, K.J., McDermott, A.B., Schultz, A., Zamb, T.J., Boyle, R. & Desrosiers, R.C. HIV vaccine design: insights from live attenuated SIV vaccines. Nat Immunol 7, 19-23 (2006)). 적응 면역 반응이 많은 관심을 받아왔지만, 선천 면역에 대한 최근 연구는 적응성 반응을 구체화하는데 있어서 선천 면역계의 중요성을 강조하고 있다(Pulendran, B. & Ahmed, R. Translating innate immunity into immunological memory: Implications for vaccine development. Cell 124, 849-863 (2006)). 효과적으로 면역 세포가 감염 세포를 제거하는 방식을 모니터링하는 기존 분석법은 기능적 양상의 이종성을 특성화하는데 충분하지 않다(Fauci, A.S., Johnston, M.I., Dieffenbach, C.W., Burton, D.R., Hammer, S.M., Hoxie, J.A., Martin, M., Overbaugh, J., Watkins, D.I., Mahmoud, A. & Greene, W.C. Perspective - HIV vaccine research: The way forward. Science 321, 530-532 (2008); Walker, B.D. & Burton, D.R. Toward an AIDS vaccine. Science 320, 760-764 (2008)). 본 발명은 상이한 계통의 각 세포에 대해 복수의 면역 기능을 특성화하고 관련지어 상이한 그룹의 환자, 예컨대 급성 감염, 만성 진행자, 고활성 항레트로아비러스 요법(HAART) 환자 및 엘리트 콘트럴러으로부터의 효과기 세포 서브세트를 분석하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 바와 같이, 정량적 세포 분석은 바이러스 복제를 제어하는데 필요한 기능이 특정하게 조합된 세포를 강조한다.

선천 면역 반응은 바이러스 감염에 대한 또 다른 방어 부문을 제공한다. NK 세포는 이 반응의 중심 성분이다(Alter, G., Teigen, N., Ahern, R., Streeck, H., Meier, A., Rosenberg, E.S. & Altfeld, M. Evolution of innate and adaptive effector cell functions during acute HIV-1 infection. J Infect Dis 195, 1452-1460 (2007)). 이들 세포는 사이토킨, 예컨대 IFNγ, MIP-1β, TNF-α, 및 GM-CSF의 방출을 통한 적응 면역 반응을 또한 유도하는 세포독성 효과기 세포이다. HIV-1 감염에 있어서, 유력 유행병학 데이타는 특정 NK 세포 수용체(살해 면역글로불린 수용체-3DS1(KIR3DS1) 및 KIR3DL1의 일부 대립유전자) 및 이의 추정 리간드(80번 위치에서 이소류신을 가지는 HLA-B 대립유전자) 둘다를 보유한 개체가 이들 대립유전자 중 하나만을 가지거나 또는 둘다 가지지 않는 개체보다 AIDS로 더욱 서서히 진행된다는 것을 입증하였다(Martin, M.P., Qi, Y., Gao, X.J., Yamada, E., Martin, J.N., Pereyra, F., Colombo, S., Brown, E.E., Shupert, W.L., Phair, J., Goedert, J.J., Buchbinder, S., Kirk, G.D., Telenti, A., Connors, M., O'Brien, S.J., Walker, B.D., Parham, P., Deeks, S.G., McVicar, D.W. & Carrington, M. Innate partnership of HLA-B and KIR3DL1 subtypes against HIV-1. Nat Genet 39, 733-740 (2007)). 유사하게, NK 세포 활성 상승 및 대량 NK 세포에서의 KIR3DS1 전사체 발현 증가는 반복 노출에도 불구하고 감염으로부터의 방어와 상관 관계가 있었다(Alter, G., Martin, M.P., Teigen, N., Carr, W.H., Suscovich, T.J., Schneidewind, A., Streeck, H., Waring, M., Meier, A., Brander, C., Lifson, J.D., Allen, T.M., Carrington, M. & Altfeld, M. Differential natural killer cell-mediated inhibition of HIV-1 replication based on distinct KIR/HLA subtypes. The Journal of experimental medicine 204, 3027-3036 (2007); Long, B.R., Ndhlovu, L.C., Oksenberg, J.R., Lanier, L.L., Hecht, F.M., Nixon, D.F. & Barbour, J.D. Conferral of enhanced natural killer cell function by KIR3DS1 in early human immunodeficiency virus type 1 infection. J Virol 82, 4785-4792 (2008)). 이들 데이터는 특정 NK 세포군이 감염의 예방 및 조절 둘다에 보호적 역할을 한다는 것을 제시하지만, 이들 세포의 정확한 표현형은 아직 규명되지 않았다.

HIV 감염 세포를 제거하기 위해 NK 세포가 이용하는 하나의 기전은 세포-대-세포 접촉시의 직접적인 세포용해이다. NK 세포의 표면에서 발현되는 KIR의 일부 형태는 표적 세포의 표면에서 발현되는 HLA 클래스 I에 결찰될 때 세포용해 기능을 억제하는 세포에 억제 신호를 제공한다(Moretta, A., Bottino, C., Mingari, M.C., Biassoni, R. & Moretta, L. What is a natural killer cell? Nat Immunol 3, 6-8 (2002)). 이들 상호작용의 부재 하에, NK 세포는 표적 세포를 활성화 및 용해시킨다. HIV-감염 세포는 HLA-A 및 -B 대립유전자의 발현을 종종 하향조절하며, 이는 활성화된 NK 세포에 의한 세포용해에 대해 더욱 민감성이 되게 한다(Fogli, M., Mavilio, D., Brunetta, E., Varchetta, S., Ata, K., Roby, G., Kovacs, C., Follmann, D., Pende, D., Ward, J., Barker, E., Marcenaro, E., Moretta, A. & Fauci, A.S. Lysis of endogenously infected CD4⁺ T cell blasts by rIL-2 activated autologous natrual killer from HIV-infected viremic individuals. Plos Pathogens 4, 1-13 (2008)). CD16(Fcγ 수용체 III)을 발현하는 NK 세포의 서브세트가 HIV 감염 세포를 파괴하는 제2의 기전은 ADCC이다(Cooper, M.A., Fehniger, T.A. & Caligiuri, M.A. The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol 22, 633-640 (2001)). 이들 수용체는 감염된 세포의 표면 상의 표적에 결합된 항체의 Fc 영역에 결합하여, NK 세포에 의한 용해를 활성화시킨다. 이 방어 기전은 B 세포가 매개하는 체액 면역 반응과 NK 세포의 선천 반응 사이의 관련성이 필요하다. 이 반응은 HIV 감염의 진행 지연을 위해, 그리고 일부 사례에서는 머카크의 SIV로부터 그리고 정맥내 약물 사용자의 HIV-1로부터의 방어를 위해 잠재적으로 중요하다(Stratov, I., Chung, A. & Kent, S.J. Robust NK cell-mediated human immunodeficiency virus (HIV)-specific antibody-dependent responses in HIV-infected subjects. J Virol 82, 5450-5459 (2008)). 그러나, 본원에 개시된 발명 이전에는, ADCC를 측정하는 정량적 분석법이 없어서 이러한 기전의 조사에 제약이 있었다.

본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 추가로 예시된다.

실시예 1. 단일 세포의 세포용해 활성을 평가하기 위한 고속 처리 분석의 개발

피크리터 마이크로웰(마이크로어레이당 ~2 x 10⁵, 각 웰은 ~30 ㎛ 직경)에 단일 세포를 로딩하여 다수의 1차 세포를 기능적으로 특성규명하기 위한 고속 처리 분석에 관한 연구 결과가 이전에 개시된 바 있다(Bradshaw EM et al. (2008) Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129(1), 10; Love JC et al. (2006) A microengraving method for rapid selection of single cell producing antigen-specific antibodies. Nat. Biotech. 24(6), 703). 로딩된 마이크로웰을, 적절한 시약으로 사전 작용화시킨 유리 슬라이드(예를 들어, 폴리리신 슬라이드 상에 코팅된 항-IL-2 포획 항체)와 물리적 접촉을 유지하고, 분비 사이토킨을 포획하기 위해서 2 시간 동안 항온처리하였다. 그 다음 슬라이드를 적절한 검출 항체로 처리 및 태그화하여 이를 분비한 세포에 맵핑할 수 있는 슬라이드 상의 형광 스폿을 나타내었다. 이어서, 클론 증식에 대한 자동식 미세조작기를 이용하여 세포를 회수할 수 있다.

본 발명은 세포 간의 상호작용을 연구하기 위한 마이크로웰의 어레이의 적용예를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 활성화 마커/분비된 가용성 매개인자를 동시에 프로파일링하면서 단일 CTL에 의한 감염된 표적 세포의 사멸을 모니터링하는 능력을 제공한다. 이 분석 시스템의 또 다른 장점은 결과가 얻어지는 속도(또는 분석이 완료되는 속도)이다. 예를 들어, 24 시간 미만, 12 시간 미만, 또는 10 시간 미만 내에 결과가 얻어진다(또는 분석이 완료된다). 예를 들어, 4 시간 미만 내에 결과가 얻어진다(또는 분석이 완료된다).

마이크로어레이 스탬프의 제작

포토리소그래피 및 복제 몰딩을 이용하여 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 마이크로웰 어레이를 제적하였다. 웰의 깊이 및 크기는 바람직하게는 100 ㎛ 미만, 예컨대 50 ㎛ 미만이다. 전문가의 지시대로 웰의 깊이 및 크기를 ~30 ㎛로 설정한다. O₂ 플라즈마 처리를 이용하여 마이크로어레이를 멸균하고 친수성이 되게 한다. 플라즈마 처리된 어레이를 PBS-BSA에 침지하여 후속 사용을 위해 친수성 성질을 유지한다.

세포 스톡

HIV-감염된 CD4 세포 및 자가 CD8 세포 둘다를 하기 개시된 방법에 사용한다. 또한 진행자, LTNP 및 HIV 음성 개체로부터의 PBMC도 포함시켜 하기 개시된 방법에 이용한다. 또한, HLA-B27 제한된 HIV gag 펩티드(KK10)를 특이적으로 인식하는 단리된 CTL 클론을 양성 대조군으로 이용하여 분석 유효성을 확립하고 실험 조건을 개량한다.

분석법 개발

표적 특이적 CTL의 단리를 위한 확실한 프로토콜을 고안하기 위해서, 앞서 언급한 KK10-특이적 클론(효과기)을 효과기로서 사용하고, HLA B27-발현, EBV-형질전환된 B 세포를 표적으로 사용한다. 분석의 개관을 나타내는 개략도가 도 1에 도시되어 있다. 펩티드 로딩된 B 세포(표적)는 세포내 에스터라제 및 리파제에 대한 비특이적 형광 기질인 칼세인 AM(Invitrogen, Carlsabad, CA)을 사용하여 염색한다. 온전한 비손상 세포는, 도 2A에 도시된 바와 같이 사멸 분석 동안(4h) 효과기 세포의 부재 하에 형광으로 존재한다.

장기간의 항온처리시 광표백/형광단 분해로 인해 표적 형광의 감소가 또한 가능하기 때문에, Sytox Red(Invitrogen, Carlsabad, CA)를 사용하여 표적을 표지한다. Sytox 계열의 막 투과성 염료는 핵산이 삽입되면 높은 형광 강도 증가(>500 배)를 나타내며, 따라서 손상막을 가지는 용해된 세포에 대한 특이적 마커로서 사용할 수 있다. Sytox 및 칼세인 염료는 오르소고날 방식으로 세포를 표지하기 때문에, 이들을 사용하여 형광 현미경의 독립 채널에서 형광 증가/감소를 추적하여 표적 용해의 동력학을 동시에 모니터링할 수 있다.

효과기를 형광 항-CD8 항체(APC/Alexa647/Pacific Blue)로 표지한다. 분석 조건(4 시간, 37℃)에서 최대 재현가능한 신호 및 최소 광표백/분해를 나타내는 염료를 이용한다. α-CD8-APC로 표지한 효과기가 도 2B에 도시되어 있다.

이전의 보고서(Bradshaw EM et al. (2008) Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129(1), 10; Love JC et al. (2006) A microengraving method for rapid selection of single cell producing antigen-specific antibodies. Nat. Biotech. 24(6), 703) 및 예비 실험(도 2A 및 2B)으로, 세포를 마이크로웰에 캡슐화한 경우 세포가 아폽토시스를 진행하지 않는다는 것을 확인하였다. 소정의 비율의 표적과 효과기를 마이크로웰 어레이에 로딩하는 최적의 방법을 그 다음에 결정하였다. 효과기 및 표적의 로딩 또는 순차 로딩 전에 매체 중에서 표적 및 효과기를 사전 혼합하는 2가지 상이한 방법을 평가하였다. 먼저 효과기를 로딩한 다음 표적을 로딩하는 순차 로딩이 마이크로웰에서 효과기:표적 비율 조작을 더욱 양호하게 제어하기 때문에, 표준 방법으로 채용하였다. 분석 실현가능성을 조사하기 위해서, 비로딩된 표적(펩티드가 결합되지 않은 표적, 음성 대조군) 및 KK10 로딩된 표적(양성 대조군)을 효과기와 함께 항온처리하였다. 효과기 상의 T 세포 수용체(TCR)는 표적 상의 pMHC만을 인식할 수 있기 때문에, 펩티드의 부재 하에서는 용해가 관찰되지 않았다(도 2C). 표적을 KK10 펩티드로 사전로딩하고 효과기와 함께 항온처리한 경우, 녹색 형광 손실로 입증되는 바와 같이, 표적 용해가 관찰되었다(도 2D). 도 2에 도시된 데이터는 하나의 단일 마이크로웰로부터의 대표적인 데이터이다. 단일 표적을 단일 효과기와 함께 항온처리한 마이크로웰의 빈도를 추정하고 표적을 특이적으로 용해하는 효과기 서브세트의 빈도를 결정하기 위해서, 형성된 형광 영상(2개의 상이한 채널) 및 위상차 영상(투과광, 제3 채널)의 자동 분석이 필수적이다. 상기 개시된 바와 같은 표적 및 효과기 클론을 사용하는 대조군 포함 실험에 있어서는 소수의 세포(~10²)의 수동 검사가 분석 유효성을 확인하는데 충분하지만, 일반적인 스크리닝의 경우에는 다수의 생성 데이타를 추출 및 분석하는 알고리즘이 필요하다.

저 빈도 세포의 확인

CTL의 일반적인 스크리닝 분석을 성공적으로 실시하기 위한 중요한 요건은 저 빈도 양성을 검출 및 단리하는 능력이다. 이를 위해서, HLA-B27 KK10(칼세인 블루로 표지됨)에 대한 효과기를 무관한 에피토프(비표지)에 대한 효과기와 상이한 비율(1/5,000∼1/25,000)로 사전혼합하고, α-CD8-APC로 세포 혼합물을 표지하고 마이크로웰 어레이에서 KK10 로딩된 표적(칼세인 그린으로 표지됨)과 함께 항온처리하였다. KK10 특이적 효과기에 의한 표적의 녹색 형광 소실에 의해 마이크로웰에서 저 빈도 효과기 양성이 확인되며, 이를 맵핑하는 능력은 현미경의 블루 채널에서 얻은 형광 영상을 통해 KK10 특이적 효과기의 위치를 확인하여 독립적으로 입증할 수 있다.

항바이러스 CTL 활성의 표현형 규명

마이크로웰-어레이 플랫폼을 채용하여 효과적인 CTL-매개 사멸의 생물학을 자세히 분석한다. HIV-감염된 표적 세포(T)와 효과기 세포(E)를 2개의 상이한 형광 리포터 염료로 표지하고 각종 E:T 비율로 혼합한 다음, 평균적으로 단일 효과기가 각 웰로 놓이는 방식으로 마이크로웰의 어레이에 로딩시킨다. 세포를 4 시간 동안 공동배양한 다음, 경시적으로 표적 세포 형광 손실을 검출하여 세포용해를 측정한다. 궁극적으로, 사멸을 매개하는 세포를 확인하고, 자동화된 미세조작기를 사용하여 이들 세포를 회수하여 RNA 추출 완충액으로 직접 전달한다. 병행하여, 비교를 위해 중간 살해제 및 비살해제를 또한 회수한다. 실험 서브세트에서, 살해제와 비살해제를 취하여 단일 세포 클로닝을 위해 사용하여 클론 수준에서 이들 세포에 대한 심층 지식을 얻는다. 이 분석은 더욱 상세한 방식으로 CTL의 특성을 규명할 수 있지만, 비-조작된 T 세포에서 분석 실행하여 방어적 CD8+ T 세포 반응에 대한 생체외 관련성에 대해 명백한 아이디어를 얻을 수 있다. 이들 분석을 다양하게 실험적으로 변형시켜 "방어적" 대비 "비방어적" HLA 대립유전자와 콘트럴러 대비 진행자 또는 환자로부터의 효과기 CTL의 표현형 사이의 차이를 정의할 수 있다.

단일 세포의 세포용해능을 평가하기 위한 마이크로웰 기반 분석의 확립

또한, 본 발명은 높은 재현성으로 상이한 세팅에서 세포 매개의 사멸을 확인할 수 있다. 생물학적 고안, 시약, 동력학, 세포 조제, 표적 세포 선택 및 데이타 분석을 포함하는, 상기 마이크로웰 플레이트와 관련한 여러가지 상세한 설명이 정의된다. 표적으로서 펩티드 펄스형 B 세포와 효과기로서 세포용해 T 세포 클론을 이용하여 분석을 정한다. 예비 실험에서, HIV gag 펩티드(KK10)로 HLA B27-발현 B 세포를 펄싱한 다음, 칼세인 AM으로 표지하였다. 표적 세포를, B27-KK10 에피토프(E:T = 1:1)를 인식하는 CTL 클론과 함께 공동배양하고, 4 시간 항온처리한 후에, 표적 세포로부터 형광 손실에 의해 용해를 검출하였다(도 4). 효과기와 표적 세포 둘다를 부각시키기 위한 일정 범위의 염료를 사용하여 상이한 표지화 방법을 평가하고, 웰당 E:T의 비율을 조정하여 세포용해 활성의 가시화를 개선한다. 또 다른 예비적 실험에서, 효과기 세포를 항-CD8-APC로 표지하고 B 세포를 칼세인 AM으로 표지하였다. 도 5는 공동배양 4 시간 동안 표적 세포의 점진적 손실을 예시한다. 효과기 세포(적색)는 표적 세포(녹색)와 분명하게 구분된다.

해당 세포를 확인하기 위한 소프트웨어 알고리즘 개발

개발된 프로토콜이 정교하여 실험당 10⁵-10⁶ 세포의 일반적인 스크리닝을 실시할 수 있다. 하나의 어레이로부터 형성된 데이터는 24*72*3 영상(~5 Gb 데이터)을 포함한다. 소수의 세포(10²-10³)의 수동 검사에 의해 분석이 최적화되지만, 이 방법에 의한 일반적인 스크리닝의 경우에는 다수의 생성된 데이터를 추출 및 분석하기 위한 알고리즘이 바람직하다. 소프트웨어 방법을 개발하여 바이오인포메틱스를 검토할 수 있다. 각 어레이로 축적되는 다량의 데이터를 처리 및 저장하기 위한 영상 분석을 위해 맞춤 패키지를 개발하였다. 이 소프트웨어는 사멸이 일어나는 웰을 인식하여 마이크로조작기에 이들 웰을 배치한다.

실시예 2. 표적 세포를 용해하는 능력을 통해 HIV-감염된 CD4 ⁺ T 세포에 대해 특이적인 CTL의 확인 및 단리와 이들 CTL의 분비된 매개인자의 검출

저 빈도 세포의 확인을 위한 최적의 조건이 확립되면, 마이크로웰 분석을 이용하여 HIV-감염된 자가 CD4+ T 세포를 용해시킬 수 있는 CTL을 확인한다. 초기 전략은 GFP 발현 재조합 바이러스로 감염된 CD4⁺ T 세포를 이용하여 우선적 사멸을 특이적으로 가시화한다. GFP 형광에서의 유세포 분류로 동질의 바이러스 감염된 CD4+ 표적 개체군이 확보된다. 최근 연구에서는, 감염도, 복제능 및 GFP 신호 강도에 대해, 결과가 유망한 GFP+NL4-3-유래의 HIV 변이체를 평가하였다. CD4 T-세포는 GFP 발현 균주로 감염된 경우 특징적인 녹색 형광 신호를 나타낸다(도 3). 세포 분류에 의한 감염된 CD4 세포의 정제로 균질한 표적군이 보장된다.

표적 특이적 용해 CTL의 분비된 매개인자 검출

분비된 사이토킨의 복합적 검출을 위해 마이크로인그레이빙 기법을 개발하였다(Bradshaw EM et al. (2008) Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: cytokines and antigen-reactive antibodies. Clin. Immunol. 129(1), 10). 도 1에 예시된 바와 같이, 사이토킨에 대한 포획 항체로 사전 작용화한 유리 슬라이드를 마이크로웰 어레이와 접촉시켜 배치한다. 항온처리 후에, 슬라이드를 세척하고 형광단 접합된 검출 항체를 이용하여 검출한다. 스폿을 마이크로웰 어레이의 각 웰에 맵핑하여 마이크로웰 내에 포함된 세포를 확인 및 채취한다. CTL 매개 사멸에 있어서, TNF-α, IFN-γ와 가용성 용해 매개인자인 그랜자임 B(GzB) 및 퍼포린의 분비가 검출될 것이다. GzB 및 퍼포린의 검출은, 이들 분비가 면역학적 시냅스(IS)로 편중되기 때문에(Faroudi et al. (2003) Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T lymphocyte/target cell interaction: manifestation of a dual activation threshold. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 14145), 그리고 분비된 양이 통상적으로 적기 때문에 문제가 될 수 있다. 분비된 인자의 양이 분석을 이용하여 검출하기에는 너무 적은 경우에는, 세포내 칼슘 수준을 추적하여 CTL 활성화를 모니터링한다. pMHC 복합체에 의한 TCR 촉발은 T 세포에서의 시토졸 칼슘 이온 농도의 용량 의존적 증가를 유도한다(Kim H et al. (2006) Live lymphocytes arrays for biosensing Adv. Funct. Mater. 16, 1313). 막 투과성 칼슘 민감성 형광 염료, 예컨대 Fura 2AM(Invitrogen)은 세포내 칼슘 수준과 이에 따른 T 세포 활성화의 편리한 정보원으로서 기능할 수 있다. 이들 선택사항이 둘다 실행가능하지 않다면, 효과기 세포를 활성화 마커 CD69에 대해 표지한다.

용해능, 분비된 인자 및 활성화 상태를 통한 CTL의 특성규명 후에, 클론주를 확립하고 유전자 정보를 제공하기 위해 미세조작기를 사용하여 세포를 회수한다. 사이토킨 프린팅 과정에서의 세포 손실이 문제인 경우에는, 단지 인력과 반대로, 피브로넥틴/항-CD44(B/T 세포 표면 마커)를 사용한 마이크로웰 분석으로 세포를 포획 및 유지하는 대안법을 조사한다.

실시예 3. 가용성 매개인자의 분비능과 용해 실시능에 의해 측정되는 질병 진행자와 장기간의 비진행자(LTNP) 간의 CTL의 차이

이 연구의 목적은 표적을 용해하는 능력과 사이토킨을 분비하는 능력 둘다에 의해, HIV-감염된 CD4+ T 세포에 대한 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 정량화 및 비교하는 것이다. 이 연구는 마이크로어레이에서 다수의 단일 세포를 프로파일링하기 위해 최근에 개발된 고속 처리 스크리닝 방법에 기초하며, 표적 및 효과기 세포의 쌍 사이의 상호작용을 분석하는데 적용된다.

CTL 차이의 비교 및 정량

본 발명은 진행자, LTNP, HAART에서의 감염 개체, 및 만성적 감염 개체의 거대군에서 각 표적 특이적 CTL 사이의 차이를 정량하는 능력을 제공한다. 예를 들어, LTNP와 진행자의 HIV 특이적 CTL의 퍼포린 발현 및 증식의 유의적인 차이가 나타났지만, CTL 군에서 분석을 실시하였으며 이들 세포의 용해 특성에 대해 직접적인 정보는 입수하지 못하였다(Migueles SA et al. (2002) HIV-specific CD8+ T cell proliferation is coupled to perforin expression and is maintained in non-progressors Nat. Immun. 3(11), 1061). 제기되는 중요한 문제는 TCR 연결에 의한 활성화를 진행하지만, 사이토킨 또는 세포독성제의, 분비성 반응에 장애가 있는 CTL의 서브세트가 있는지 여부다. 고속 처리 분석은 이들 및 다른 CTL 서브세트를 확인하고 유전자 조작 및 클론주의 후속 확립을 위한 세포의 회수를 돕는다.

이로 인해 단일 세포 수준에서 HIV 감염된 세포를 용해할 수 있는 CTL을 확인 및 회수하기 위한 확실하고 정량적인 분석이 된다. 이 방법은 사멸을 정량할 뿐 아니라, 미세조작에 의한 후속 회수시 효과적인 항바이러스 CTL 작용의 면역학적 및 유전학적 관련성에 대해 상세히 이해할 수 있게 한다. 이 방법은 CTL 생물학의 여러가지 특성을 포괄적으로 정의하고 급성 감염된 환자, HAART 치료 환자, 엘리트 콘트럴러 및 만성 감염 환자의 거대 환자군을 신속하게 평가하여 이들 그룹 간의 CTL의 차이를 평가할 수 있게 한다. 또한, 이 분석은 세포용해 세포(즉, 자연 살해 세포, 대식세포 등)를 포함하는 각종 세포 서브세트에 의한 사멸 연구로 용이하게 확장된다.

실시예 4. HIV 감염인에서의 항체 다양성의 평가

동시에 다수의 1차 개별 림프구의 복수의 특성을 평가하기 위한 미세제작된 시스템을 사용하는 일련의 새로운 방법이 본원에 제시되어 있다. 이들 방법으로 항원 반응성 항체 분비 세포를 확인하고(Love, J.C., Ronan, J.L., Grotenbreg, G.M., van der Veen, A.G. & Ploegh, H.L. A microengraving method for rapid selection of single cell producing antigen-specific antibodies. Nat Biotechnol 24, 703-707 (2006); Ronan, J.L., Story, C.M., Papa, E. & Love, J.C. Optimization of the surfaces used to capture antibodies from single hybridomas reduces the time required for microengraving. J. Immunol. Methods (in press); Story, C.M., Papa, E., Hu, C.-C.A., Ronan, J.L., Herlihy, K., Ploegh, H.L. & Love, J.C. Profiling antibody responses by multiparametric analysis of single B cell. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 17902-17907 (2008)), 분비된 사이토킨을 프로파일링하고(Bradshaw, E.M., Kent, S.C., Tripuraneni, V., Orban, T., Ploegh, H.L., Hafler, D.A. & Love, J.C. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: antigen-reactive antibodies and cytokines. Clin Immunol 129, 10-18 (2008)), mRNA 전사체를 증폭하고, 세포독성 기능을 - 단일 세포 분리를 이용하여 - 평가하였다(도 6). 이들 기법에 사용되는 공통 요소는 중합체 칩(칩당 ~10⁵-10⁶웰)의 표면으로 몰딩되는 나노리터 이하의 마이크로웰의 고밀도 어레이이다. 웰당 ~1 세포의 밀도로 현탁액으로부터 세포를 놓는다(예, 1, 2, 3, 4, 또는 5 세포/웰, 바람직하게는 웰당 1 세포). 세포의 어레이는 분비된 분자(항체 또는 사이토킨)의 단백질 마이크로어레이를 프린팅하기 위한 스탬프로서, 그리고 규명된 단일 세포 분석(유전자 발현, 세포독성 또는 증식)을 위한 용기의 세트로서 작용할 수 있다. 유전자 발현 평가를 제외하고는, 분석 후에 세포는 생존해있다: 표면 발현된 마커를 영상화하여 면역표현형을 정하고, 클론 증식 또는 유전자 분석을 위한 미세조작으로 관심 세포를 회수한다. 이들 분석의 순차 적용으로 기능, 면역표현형 및 유전자형을 동일한 단일 세포 세트에 관련시킨다. 이와 함께, 이들 측정값은 단일 세포 분리 외에, 기능(ELISA, ELISpot, 증식), 표현형(FACS, 면역형광), 및 유전자형(RT-PCR)에 대한 개체군 기반 분석으로 얻어진 것과 유사 데이터를 산출한다.

개체에서의 bNAb 생산 B 세포 간의 클론 다양성

마이크로인그레이빙은 단일 세포로부터의 항체의 마이크로어레이를 프린팅하여 gp120-반응성 순환 B 세포의 빈도, 이들 항체의 이소타입의 분포 및 중화력을 정량화하기 위해 개발된 기법이다. 스크리닝 분석은 유리 슬라이드 표면 상에 gp120(D73-324)의 c-말단에 특이적인 항체를 먼저 고정한 다음, 재조합 gp120(Progenics)을 부착시켜 gp120-반응성 항체를 부각시키도록 구성되어 있다. 혈청 중 bNAb의 역가가 높은 HIV+ 개체로부터의 B 세포를 CD40L/항-BCR로 자극하여 항체 생성을 유도한다. 세포를 마이크로웰의 어레이에 놓고 gp120-코팅된 슬라이드 상에 항체의 2개의 복제 마이크로어레이를 프린팅하는데 사용한다. 제2 어레이를 프린팅하기 전에, 가용성 CD4 또는 b12(기지의 중화력을 가지는 모노클로날 항체)를 세포로부터 항체를 포획하는데 사용되는 기판에 첨가한다. 제1 마이크로어레이 상의 gp120에 결합하지만, 제2 어레이에서 CD40 차단된 gp120에는 결합하지 않는 항체는 HIV를 중화시킬 가능성이 높다(도 7). 제시된 이소타입의 다양성을 등급화하기 위해서, 마이크로어레이를 형광의 이소타입 특이적 2차 항체(IgG1, IgG3, IgG4, IgA, IgM)의 혼합물로 표지한다. 마이크로어레이 상의 관심 항체를 상응하는 마이크로웰에 맵핑하고, 자동화된 미세조작(Aviso CellCelector)으로 세포를 회수한다. 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자의 가변 영역을 증폭시키고 단세포 RT-PCR로 서열결정한다(Wang, X.W. & Stollar, B.D. Human immunoglobulin variable region gene analysis by single cell RT-PCR. J　Immunol Methods 244, 217-225 (2000)). 서열 비교는 우성의 생식세포 유전자 및 체세포 돌연변이를 통해 밀접하게 관련된 클론과 연결시킨다. 항체를 재조합 발현하고 표준 분석법(Monogram Biosciences)으로 그 중화능을 입증한다.

다양한 1차 분리물에 결합하는 bNAb의 특성

NAb를 형성하도록 고안되는 백신을 위한 한가지 과제는, 면역원이 다른 바이러스 변이체와 광범위하게 교차 반응하는 항체를 유발해야 한다는 것이다. 다양한 1차 분리물을 중화시키는 항체의 특이성을 이해하면 새로운 면역원 디자인이 도출될 수 있으며, 이는 HIV 연구를 위해 현재 중요한 것 중 하나이다(Fauci, A.S., Johnston, M.I., Dieffenbach, C.W., Burton, D.R., Hammer, S.M., Hoxie, J.A., Martin, M., Overbaugh, J., Watkins, D.I., Mahmoud, A. & Greene, W.C. Perspective - HIV vaccine research: The way forward. Science 321, 530-532 (2008)). 스크리닝 분석은 마이크로인그레이빙에 의해 각 B 세포로부터 분비된 항체를 포획한 다음, 상이한 HIV 분리물을 갖는 어레이를 패닝하도록 재구성되며 - 각각은 구별되는 친지성 형광 염료로 염색된다(도 8). 관심 세포를 회수하고, 이의 항체를 재조합 발현시켜 에피토프 특이성 및 중화력에 대해 특성규명한다.

소정의 B 세포의 빈도는 순환시 낮을 수 있다. 현재 검출 한계(0.01∼0.001%)는 FACS(0.1%)에 대해 전형적인 값을 넘을 수 있지만(Bradshaw, E.M., Kent, S.C., Tripuraneni, V., Orban, T., Ploegh, H.L., Hafler, D.A. & Love, J.C. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: antigen-reactive antibodies and cytokines. Clin Immunol 129, 10-18 (2008)), gp120 코팅된 자기 비드를 사용하여 gp120 반응성 B 세포를 농축시키는 것이 필요할 수 있다. 스크리닝 분석에 대한 2가지 별법은 i) 삼량체 특이적 항체를 확인하기 위해 삼량체 gp120을 발현하는 바이러스 유사 입자 또는 세포주의 사용, 및 ii) 2G12와 같은 다른 bNAb와의 경쟁 분석을 포함한다. 여기에 제안된 방법은 단순 분석 세트로 순환 B 세포로부터 직접 유래한 다양한 1차 분리물에 결합하는 항체를 형성하는 디자인된 면역원의 능력을 모니터링할 수 있게 한다.

효과기 세포의 반응을 평가하는 가장 일반적인 분석법은 ELISpot에 의한 인터페론-γ(IFN-γ)의 검출이지만, 이 단일 파라미터 측정은 바이러스혈증의 조절과 관련이 없다(Walker, B.D. & Burton, D.R. Toward an AIDS vaccine. Science 320, 760-764 (2008)). 다른 작용적 반응, 예컨대 증식, 광범위한 사이토킨 프로파일, 점막으로의 소집에 대한 마커 및 세포용해 활성의 측정이 또한 필요하다. (Fauci, A.S., Johnston, M.I., Dieffenbach, C.W., Burton, D.R., Hammer, S.M., Hoxie, J.A., Martin, M., Overbaugh, J., Watkins, D.I., Mahmoud, A. & Greene, W.C. Perspective - HIV vaccine research: The way forward. Science 321, 530-532 (2008)). 다중파라미터 작용성 프로파일을, 마이크로툴을 사용하여 HIV 감염된 세포에 반응하는 상이한 서브세트의 효과기 세포(CD8⁺ 세포독성 T 세포(CTL), 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, γδ T 세포)에 대해 정한다. PBMC는 FACS에 의해 CTL(CD8⁺), NK 세포(CD16⁺), NK T 세포(CD1d⁺,Vα24⁺), 및 γδ T 세포 (Vγ9⁺, Vδ2⁺)로 분류된다. 각 효과기 서브세트를 표적 세포 - HIV 유래의 펩티드의 중첩 풀이 로딩되고 칼세인 AM으로 염색된 HLA-매칭, EBV-형질전환된 B 세포 - 를 가지는 마이크로웰에 공동로딩한다. 이중 로딩 웰을 측정하기 위해서 생세포 현미경에서 공동로딩 어레이를 영상화한다. 항온처리 후에, 어레이를 재영상화하여 세포독성을 평가한다(칼세인 AM의 방출에 의해 표시됨)(도 6c, 우측 아래). 웰에 잔존하는 세포에 의해 방출되는 사이토킨은 마이크로인그레이빙을 사용하여 프로파일링한다(IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α 및 IFN-γ). 이 초기 패널은 Th1 및 Th2 사이토킨뿐 아니라 조절성 사이토킨을 분석당 약 10∼15 사이토킨으로 측정한다. 또한, 이 세포를, 귀소 패턴을 나타내는 3개의 특이적 표면 마커(예, CD62L, CXCR3, CCR4, CCR7)에 대해 표지하고 현미경으로 영상화한다. 클론 증식 또는 유전자 배양 프로파일링을 위한 미세조작으로 실험에서 얻은 해당 세포를 추출한다. 5명의 개체에 대해서 급성 감염기 동안 3∼5회 시점에서 실험을 반복한다. 비교를 위해서 HAART 환자 및 엘리트 콘트럴러로 측정을 확대한다. 이들 데이터는 감염 과정에서 세포군의 다기능적 반응의 변화를 나타내며, 유효 세포독성과 관련된 표현 형질을 확정한다.

급성 감염 환자 및 HAART 환자와 비교하여 엘리트 콘트럴러에서의 HIV에 대한 면역반응의 전신 수준 프로파일

광범위한 클래스의 세포 서브세트(예, CD4⁺ T 세포) 사이의 작은 기능적 및 표현형 차이를 모니터링하기 위한 도구의 부재와 함께 면역계의 복잡성으로 인해 대부분의 인간 질병의 연구가 나머지 네트워크로부터 분리된 하나의 세포군의 특성화로 제한된다. 복잡한 생물학적 네트워크의 전신 수준의 정량 분석 및 예측 모델링이 가능하지만, 면역계의 미묘한 세부사항을 분리하기 위한 충분한 다변량 데이터가 필요하다. 엘리트 콘트럴러, 급성 감염 환자 및 HAART 환자로부터의 효과기 세포 서브세트에 대한 기능적 프로파일을 개시하는 단일 세포 데이터로부터 상태 기반 맵을 구축한다(도 4). 계층적 클러스터링 및 주성분 분석과 같은 통계학적 분석을 이용하여 각 클래스로부터 유래한 개체군 사이의 변화를 조사하였다. 수집된 데이터를 이 프로젝트의 제1 부분에서 사용하여 이들 프로파일을 구축한다. 이 방법은 통합적 게놈 분석에 사용되는 것과 유사하지만, 그 대신 상세한 단일 세포 데이터를 이용하여 생성되는 프로파일을 규정한다(Bradshaw, E.M., Kent, S.C., Tripuraneni, V., Orban, T., Ploegh, H.L., Hafler, D.A. & Love, J.C. Concurrent detection of secreted products from human lymphocytes by microengraving: antigen-reactive antibodies and cytokines. Clin Immunol 129, 10-18 (2008)).

본원에 개시된 방법들의 하나의 장점은 소수의 세포(10³-10⁵)를 분석에 사용할 수 있다는 것이다. 표적 세포를 로딩하기 위한 모아진 펩티드의 사용은 측정된 기능적 프로파일을 편중시킨다. 대안적 방법으로서, 자가 HIV-감염된 CD4⁺ T 세포의 사용을 이들 분석에서 조사하고; 이의 프로파일이 세포용해 세포와 뒤엉키는 것을 방지하기 위해서 먼저 이들 세포의 사이토킨 프로파일을 평가할 필요가 있다. 비-세포용해 인간 T 세포를 클로닝하기 위한 현재의 효율은 ~75-90%이다. 이 효율은, 일부 세포용해 세포가 계획된 세포사를 진행함에 따라 감소될 수 있지만, 세포를 증식시켜 각 클론에서 추가의 분석을 실시할 수 있다. 선천 면역계의 세포 및 효과기 기억 세포에 대한 효과적인 항바이러스 반응에 관련된 미세한 기능적 차이를 규명하면 백신 또는 다른 중재를 평가하기 위한 표준 기준을 확립할 수 있다.

실시예 5. HIV 감염의 급성기 동안 NK 세포의 기능적 양상과 표현형 마커 사이의 관련성

상기 개시된 분석을 단일 세포에 의해 분비되는 사이토킨의 복합 검출에 적용하여 급성 HIV 감염 환자 및 장기간의 비진행자 둘다로부터의 NK 세포에 대한 세부적인 표현형, 기능성 및 유전자 프로파일을 형성한다. 상기 요약한 바와 같이, 이 방법은 숙주의 면역 반응에 대한 세포 기여를 해결하는데는 전형적이지 않지만, 유세포 분석 및 ELISpot와 같은 기존 툴에 의한 평가가 곤란할 수 있는 희귀 세포의 특성을 확인할 수 있다. NK 세포의 별개의 서브세트가 상이한 감염 단계에서 존재하고, 그 기능적 양상(또는 기능 상실)으로 급성 감염기 후에 이들 세포의 효과 감소를 통찰할 수 있다.

이 연구에 필요한 세포는 HIV⁺ 환자로부터의 순환 NK 세포이다. 급성 감염 환자 및 장기간의 비진행자/엘리트 콘트럴러로부터의 장기적 샘플을 이용한다.

인간에서 보고되는 2가지 중요한 종류의 NK 세포 서브세트가 있다(Cooper, M.A., Fehniger, T.A. & Caligiuri, M.A. The biology of human natrual killer-cell subsets. Trends Immunol 22, 633-640 (2001)). 세포독성 NK 세포(NKp46^posCD3^negCD56^posCD16^pos/neg)는 다량의 IFN-γ, TNF-α, MIP-1β, GM-CSF를 분비한다. 대조적으로, 면역조절 NK 세포(NKp46^posCD3^negCD56^pos/negCD16^pos)는 다량의 IL-10 및 IL-17을 생산한다. 건강한 개체는 일반적으로 다수의 세포독성 NK 세포와 낮은 수준의 면역조절성 NK 세포를 보유한다. 그러나, 점막 감염의 억제 및 임신 동안 면역조절성 NK 세포군이 증식한다. HIV-1 감염 동안 2개의 NK 세포군 사이의 균형이 변화하는지, 그리고 NK 세포의 특정 클론이 복수의 T-헬퍼 반응과 관련된 사이토킨 패턴을 생성할 수 있는지는 불확실하다.

상기 개시한 마이크로인그레이빙 방법을 이용하여 단일 분석에서 5종의 사이토킨을 검출한다(IFN-γ, TNF-α MIP-1β IL-10 및 IL-17). 이 분석을 최적화하기 위해서, 음성 선별(Stem Cell Technologies)에 의해 건강한 대조군의 말초혈로부터 NK 세포를 추출한다. 이들 NK 세포를 2개의 분획으로 분리하고, 각각 IL-12 및 IL-18(모든 NK 세포 기능에 대한 유효 자극)과 공동배양하거나 또는 비자극시킨다. 4 시간 동안 자극한 후에, NK 세포를 마이크로웰의 어레이(~10⁵ 30 ㎛ 직경)에 놓는다. 피크 NK 세포 기능을 측정하기 위한 최적의 항온처리 시간을 평가하기 위한 동력학 연구를 실시한다. 유리 상에 사이토킨을 포획한 후에, 웰의 세포를 NK 세포 활성화의 기본형 마커(Hoescht 33324(핵), NKp46-Cy3, CD107a-Alexa647, 및 CD69-Alexa488)에 대해 염색하고, 맞춤 제작의 고속 영상화 스테이션에서 영상화한다. 각 세포로부터 검출된 사이토킨 프로파일을 이들 데이터와 연관시키고, 공통 세포 서브세트(세포당 8개의 파라미터)를 확인하기 위해 주성분 분석으로 클러스터링한다. NK 세포를 10명의 급성 감염 HIV 환자와 10명의 장기간의 비진행자로부터 단리한다. 이 분석을 반복하여 상호 비교한 이들 그룹과 대조군 세트에서 세포 서브세트가 어떻게 변화하는지를 평가한다. 마지막으로, 장기간 동안 급성 감염 환자로부터 얻은 세포 세브세트에서 차이를 조사하여 서브세트가 질병 진행에 따라서 어떻게 변화하는지를 평가한다.

실시예 6. 세포독성 NK 세포 사이의 클론 다양성 평가

단일 항원 특이적 수용체를 발현하는 T 및 B 세포와 달리, NK 세포는 무작위 조합으로 다수의 상이한 수용체를 발현한다. 개별 NK 세포 클론에서의 수용체의 조합으로 바이러스 감염 또는 악성 세포를 구별하여 인식할 수 있다. NK 세포 수용체의 발현 및 NK 세포 서브세트의 분포 둘다는 HIV 감염을 급격히 변화시킨다. 급성 HIV-1 감염 개체는 NK 세포의 유의적인 증가를 나타낸다: 순환 말초혈 단핵구 세포(PBMC)의 최대 50%는 감염된 후 첫 몇주 동안 NK 세포이다. 비교하면, 진행성 감염은 아네르기 CD56^neg NK 세포의 축적에 의해 나타난다. 각종 수용체가 클론적으로 다른 이유 그리고 이것이 항바이러스 조절을 위해 NK 세포 기능과 어떻게 관련되었는지는, 특히 현저한 세포용해능을 발휘하는 이들 클론에서는, 잘 알려져 있지 않다.

급성 감염기로부터 시작하여, HIV-1 감염의 상이한 단계에서 개별 세포용해 NK 세포에 의해 발현되는 살해 세포 면역글로불린 유사 수용체(KIR)의 프로파일을 결정한다. 마이크로웰의 어레이를 사용한 분석을 이용하여 세포용해 기능을 측정한다. 개별 세포독성 NK 세포를, RT-qPCR에 의한 수용체 레퍼토리의 후속 정량화를 위해 미세조작으로 회수한다. 단일 세포 세포용해 분석에 있어서, CD56-Alexa 647 또는 시토졸 염색제(CellTracker red)로 표지된 NK 세포에, 칼세인 AM으로 표지된 MHC-결핍 표적 세포(K562 또는 221)를 공동로딩한다. (표적 세포로부터의 칼세인 손실에 의해 나타나는) 용해를 평가하기 위해 주기적으로 영상화하면서 5∼6 시간 동안 이들 어레이를 항온처리한다. 활성화 확보를 위해서 NK 세포 표면 상에 CD107a가 도달된다.

CTL과 표적 B 세포주를 사용한 이러한 유형의 분석에 대한 예비 결과가 도 5에 도시되어 있다. 이 분석에서 표적으로서의 자가의 HIV-감염된 CD4⁺ T 세포를 대안적으로 이용한다. 어레이 내에 각 용해 세포를 함유하는 웰의 위치를 기록한 후에, 자동 미세조작(Aviso CellCelector)으로 세포를 회수하고, 이 세포를 재조합 IL-2를 사용한 96웰 플레이트에서 클론적으로 증식시킨다. 증식 후에, 12 KIR에 대한 특이적 프라이머 패널을 사용하여 RT-qPCR에 의해 각 클론 상의 NK 세포 수용체 레퍼토리를 정량한다.

증식 없이 세포의 직접 단일 세포 분석을, 올리고-dt 프라이머와 네스티드-프라이머에 대한 매립된 증폭 결합 서열을 포함하는 SuperScript-3 RT-PCR mastermix(Invitrogen)에 세포를 배치한 다음 써머사이클링시켜 실시한다. 12 KIR 프라이머 세트를 이용하여 cDNA에서 qPCR을 실시한다. 단리된 NK 세포로부터 유래한 KIR 레퍼토리의 다양성을 10명의 건강한 대조군, 10명의 급성 HIV+ 감염 개체, 10 명의 HIV+ 자발적 비진행자(2000 카피/ml 이하의 바이러스양), 및 10명의 HIV+ 만성 미치료 진행자(> 10,000 카피/ml의 바이러스양)에서 정한다.

실시예 7. 감염 진행에 따른 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC) 변화를 나타내는 NK 세포능의 결정

지금까지 HIV에 대한 대부분의 후보 백신은 바이러스에 대한 광범위한 중화 항체를 유도하고자 하는 것이었다(Barouch, D.H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature 455, 613-619 (2008)). 방어를 매개하는 항체 반응을 이용하는 대안의 전략은 ADCC이다. 급성 감염 환자로부터의 혈청 전달 연구는 NK 세포의 활성화가 일어남을 제시하지만, NK 세포에 의해 매개되는 ADCC를 효과적으로 유도하는 항체를 형성하는 B 세포 클론을 확인하는데 유용한 분석법은 지금까지는 없다. 하기 개시된 바와 같은 그러한 클론으로부터의 재조합 항체의 형성은 백신접종을 위한 면역원의 합리적인 고안에 대한 새로운 연구에 도움이 된다(Walker, B.D. & Burton, D.R. Toward an AIDS vaccine. Science 320, 760-764 (2008)).

3가지 세포군이 급성 감염 환자 및 장기간의 비진행자로부터 분리된다. - CD56^lowCD16⁺ NK 세포, CD4⁺ T 세포, 및 CD20⁺ B 세포. CD4⁺ T 세포는, 피토헤마토글루티닌(PHA) 및 IL-2과 함께 배양하여 증식시키고, HIV로 외생적으로 감염시킨다. NK 세포는 IL-2로 활성화시키고, B 세포는 CD40L 및 항-BCR로 활성화시킨다. B 세포(CellTracker 적색으로 표지됨)를 HIV 감염된 T 세포(칼세인 AM로 표지됨)와 함께 마이크로웰의 어레이에 공동로딩한다. 유리 슬라이드에 대해 어레이를 1 시간 동안 밀봉한다. 분리된 반응기에서 이 시간 동안, B 세포는 감염된 T 세포의 표면에 결합할 수 있는 항체를 생산한다. 그 다음, 이 어레이를 유리로부터 분리하여 세척한다.

활성화된 NK 세포(Celltracker 청색으로 표지)를 웰에 첨가하고 4∼6 시간 동안 항온처리한다. 이 어레이를 항온처리 전후에 영상화하여 1) B 세포, 2) NK 세포 및 3) 항온처리 후에 용해된 T 세포를 포함하는 웰을 기록한다. 이들 웰로부터 세포를 회수하고 항체를 코딩하는 유전자의 VDJ 영역에 대한 축퇴성 프라이머 세트를 사용하여 RT-PCR을 실시한다. 어레이 상의 내부 대조군은 B 세포도 NK 세포도 무작위로 포함하지 않는 웰이다. NK 세포 및 T 세포를 포함하는 어레이만을 기록한다. 회수된 항체의 재조합 발현은 감염된 세포 상에 결합된 에피토프의 맵핑과, 생산적인 ADCC에 연관된 B 세포에서 형성되는 클론 다양성의 평가를 가능하게 한다.

대안법은 분석을 두 부분으로 나누는 것이다. 먼저, B 세포의 농축군을 마이크로인그레이빙 기법을 사용하여 생성하고 이를 이용하여 항체의 마이크로어레이를 형성한다. 이들 어레이를 항-IgG3 및 HIV-감염된 세포로부터의 용해물로 염색한다. 이중 양성 웰로 맵핑되는 B 세포를 유전자 분석을 위해 회수한다. 이들 세포로부터의 재조합 항체를 감염된 세포에 적용하고, 상기 개시된 바와 같은 세포용해 분석으로 NK 세포와 혼합한다.

본원에 개시된 방법은 인간의 임상 샘플로부터 직접 채취한 세포에서 직접 숙주-병원체 상호작용의 특성규명을 가능하게 하며, 발견, 평가 및 모니터링을 위한 정량적 면역학적 프로파일링을 이용하여 감염성 질병에 대한 면역요법 및 백신 개발을 증진시킨다. 방법은, HIV 이외에, 고의의 억제성 중재 또는 HIV의 결과로서, 면역저하인에서의 선도적 감염의 원인인 병원체를 포함하는, 다른 감염성 질환으로 확대할 수 있다. 이들은, 예컨대 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae) 및 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)를 포함한다.

추가의 구체예들은 특허청구범위 내에 있다.

Claims

피험체에서 CD4+ HIV-감염된 세포를 용해할 수 있는 CD8+ 세포를 동정하는 방법으로서,
마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 표적 세포 및 효과기 CD8+ 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 효과기 세포를 가지는 것인 단계;
상기 CD8+ 세포에 의해 상기 표적 세포가 용해되는 조건 하에서 상기 현택액을 배양하는 단계;
상기 효과기 세포에 의한 상기 표적 세포의 용해를 검출하는 단계; 및
CD4+ HIV-감염된 세포를 용해할 수 있는 CD8+ 세포를 동정하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 세포를 용해하는 효과기 세포를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 표적 세포를 용해한 효과기 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 효과기 세포 및 표적 세포를, 상기 마이크로웰에 세포를 놓기 전에 혼합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 효과기 세포 및 표적 세포를, 상기 마이크로웰에 세포를 놓은 후에 혼합하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 표지된 세포의 형광 변화를 모티터링하여 용해를 검출하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 세포의 세포내 칼슘 농도 변화를 모니터링하여 용해를 검출하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 칼슘은 칼슘 민감성 형광 염료로 검출하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 염료는 푸라(Fura) 2AM(인비트로젠(Invitrogen))인 방법.
제1항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판은 상기 효과기 세포의 산물을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 제제로 전처리되는 것인 단계; 및
상기 제제를 검출하는 단계
를 더 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 제제는 항체, 사이토킨, 또는 가용성 용해 매개인자인 방법.
제10항에 있어서, 상기 제제는 사이토킨인 방법.
제12항에 있어서, 상기 사이토킨은 TNF-α 또는 IFN-γ인 방법.
제8항에 있어서, 상기 제제는 가용성 용해 매개인자인 방법.
제14항에 있어서, 상기 가용성 용해 매개인자는 그랜자임 B(GzB) 또는 퍼포린인 방법.
제1항에 있어서, 효과기 세포를 CD69로 표지하는 단계를 더 포함하는 방법.
피험체에서의 항체 반응을 특성규명하는 방법으로서,
마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 B 세포의 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV에 의해 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되고, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 세포를 가지는 것인 단계;
상기 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판은 하나 이상의 B 세포 검출제로 전처리되는 것인 단계; 및
상기 제제를 검출하여, 이로써 상기 항체 반응을 특성규명하는 단계
를 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 B 세포 검출제는 gp120의 에피토프에 특이적인 항체인 방법.
제17항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이를 제2 기판과 접촉시키는 단계를 더 포함하고, 이 기판이 하나 이상의 제1의 B 세포 검출제로 전처리되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 제1의 B 세포 검출제는 HIV gp120에 대한 항체인 방법.
제20항에 있어서, 상기 항체는 HIV gp120의 C-말단에 대한 것인 방법.
제17항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이의 상기 B 세포에 의해 생산되는 항체의 이소타입을 결정하는 단계를 더 포함하는 방법.
제17항에 있어서, HIV와 반응성인 항체를 발현하는 B 세포를 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 항체의 경쇄 및 중쇄 가변부를 증폭 및 단리하는 단계를 더 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 B 세포는, 상기 세포의 항체 생산을 자극하는 제제에 노출되는 것인 방법.
제25항에 있어서, 상기 제제는 CD40L 또는 항-BCR 항체인 방법.
제25항에 있어서, 상기 B 세포는 CD40L 및 항-BCR 항체에 노출되는 것인 방법.
B 세포의 복수의 HIV 단리물에 대한 교차 반응성을 특성규명하는 방법으로서,
마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 B 세포 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV에 의해 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되고, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 세포를 가지는 것인 단계;
상기 마이크로웰 어레이를 제1 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판은 상기 하나 이상의 마이크로웰의 상기 B 세포에 의해 생산되는 항체로 전처리되는 것인 단계;
상기 기판을 제1의 표지된 HIV 비리온 및 제2의 표지된 HIV 비리온과 접촉시키는 단계; 및
상기 제1의 표지된 비리온과 제2의 표지된 비리온이 상기 마이크로웰에서 동일한 세포가 생산하는 항체에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 제1의 표지된 비리온과 제2의 표지된 비리온에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 B 세포를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 회수된 B 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 비리온 중 하나 이상이 표지된 것인 방법.
제21항에 있어서, 상기 제1 비리온 및 제2 비리온이 다르게 표지된 것인 방법.
피험체에서 HIV 감염에 반응성인 효과기 세포에 대한 기능적 프로파일을 형성하는 방법으로서,
CTL(CD8⁺), NK 세포(CD16⁺), NK T 세포(CD1d⁺,Vα24⁺), 또는 γδ T 세포(Vγ9⁺,Vδ2⁺)로 이루어진 군에서 선택된 효과기 세포군을 제공하는 단계로서, 상기 효과기 세포는 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터 얻고, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 효과기 세포를 가지며, 상기 효과기 세포군은 동족의 표적 세포군과 함께 로딩되는 것인 단계;
상기 효과기 세포를 가시화하는 단계;
상기 효과기 세포의 세포독성을 평가하는 단계;
상기 마이크로웰 어레이와 제1 기판을 접촉시키는 단계로서, 상기 기판이 IL-2, IL-4, IL-10, TNF-α, 및 IFN-γ 중 하나 이상을 특이적으로 검출하는 제제로 전처리되는 것인 단계; 및
상기 마이크로웰의 상기 효과기 세포가 상기 하나 이상의 제제에 결합하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 칼세인 AM의 방출을 검출하여 세포독성을 평가하는 것인 방법.
제33항에 있어서, 하나 이상의 특이적 표면 마커 단백질에 대해 세포를 표지하는 단계를 더 포함하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 표면 마커 단백질은 CD62L, CXCR3, CCR4, 또는 CCR7인 방법.
제33항에 있어서, 하나 이상의 마이크로웰로부터 효과기 세포를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 회수된 세포를 배양하여 상기 회수된 세포의 클론 증폭물을 얻는 단계를 더 포함하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 회수된 세포에서 하나 이상의 유전자의 발현을 특성규명하는 단계를 더 포함하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 세포는 CD8⁺ 세포독성 T 세포(CTL), 자연 살해(NK) 세포, NK T 세포, 또는 γδ T 세포인 방법.
제33항에 있어서, 상기 피험체는 급성 감염기, 고활성 항레트로바이러스 요법(HAART) 피험체 또는 엘리트 콘트럴러(elite controller)인 방법.
HIV 감염 피험체에서 선천 면역 반응을 평가하는 방법으로서,
마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 NK 세포 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 피험체는 HIV에 의해 감염되거나 또는 감염된 것으로 의심되고, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰에는 단일 세포가 놓여지는 것인 단계;
상기 마이크로웰 어레이를 기판과 접촉시키는 단계로서, 상기 기판이 하나 이상의 NK 세포 검출제로 전처리되는 것인 단계; 및
상기 제제를 검출하여, 상기 선천 면역 반응을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 NK 세포는, NKp46-Cy3, CD107a-Alexa647, 및/또는 CD69-Alexa488을 사용하여 검출하는 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 세포는, 성형가능한 슬래브 상에 놓기 전에 공동배양하는 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 세포는 IL-12 및 IL-18과 함께 공동배양하는 것인 방법.
제45항에 있어서, 상기 NK 세포 검출제는 NK 세포를 검출하는 것인 방법.
NK 세포군에서의 클론 다양성을 평가하는 방법으로서,
마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 포함하는 성형가능한 슬래브 상에 놓여진 피험체로부터의 표적 세포 및 NK 세포 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 효과기 세포를 가지는 것인 단계;
상기 NK 세포에 의해 상기 표적 세포가 용해되는 조건 하에서 상기 현탁액을 배양하는 단계;
상기 효과기 세포에 의한 상기 표적 세포의 용해를 검출하는 단계; 및
상기 효과기 세포를 동정하여, 상기 NK 세포군에서의 클론 다양성을 평가하는 단계를 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 표적 세포를 용해하는 효과기 세포를 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제48항에 있어서, 상기 회수된 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 표적 세포를 용해한 NK 세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 NK 세포 및 표적 세포를, 상기 마이크로웰로 세포를 놓기 전에 혼합하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 NK 세포 및 표적 세포를, 상기 마이크로웰로 세포를 놓은 후에 혼합하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 표지된 세포의 형광 변화를 모니터링하여 표적 세포 용해를 측정하는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 마이크로웰 어레이와 기판을 접촉시키는 단계로서, 상기 기판이 상기 NK 세포 산물을 특이적으로 검출할 수 있는 하나 이상의 제제로 전처리되는 것인 단계; 및
상기 제제를 검출하는 단계
를 더 포함하는 방법.
제55항에 있어서, 상기 제제는 항체, 사이토킨, 또는 가용성 용해 매개인자인 방법.
제55항에 있어서, 상기 사이토킨은 TNF-α 또는 IFN-γ인 방법.
NK 및 B 세포군에서의 다양성을 평가하는 방법으로서,
증식된 HIV 감염된 CD4+ 세포 T 세포, 활성화된 NK 세포와 B 세포 및 표적 세포를 포함하는 세포 현탁액을 제공하는 단계로서, 상기 세포 현탁액을, 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰을 함유하는 성형가능한 슬래브 상에 놓고, 상기 마이크로웰 어레이의 하나 이상의 마이크로웰은 단일 T 세포를 가지는 것인 단계;
B 세포에 의해 생산된 항체가 T 세포의 표면에 결합하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계;
B 세포, NK 세포 및 용해된 T 세포를 함유하는 웰을 동정하는 단계; 및
B 세포 또는 NK 세포를 동정하는 단계
를 제공하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 NK 세포는 IL-2에 의해 활성화되는 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 B 세포는 CD40L 또는 항-BCR에 의해 활성화되는 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 B 세포는 CD40L 및 항-BCR 항체에 의해 활성화되는 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 NK 세포는 IL-2에 의해 활성화되는 것인 방법.
제57항에 있어서, 상기 B 세포는 항-BCR 항체의 CD40L에 의해 활성화되는 것인 방법.
제57항에 있어서,
상기 웰로부터 B 세포 또는 NK 세포를 회수하는 단계; 및
상기 B 세포의 하나 이상의 성질을 특성규명하는 단계
를 더 포함하는 방법.
제63항에 있어서, 상기 B 세포의 항체 유전자를 특성규명하는 단계를 포함하는 방법.
제64항에 있어서, 상기 B 세포에서 항체 코딩 유전자의 VDJ 영역을 분석하는 단계를 포함하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 B 세포에 의해 생산되는 항체가 기판에 부착되는 조건 하에서 상기 마이크로웰 어레이와 기판을 접촉시키는 단계를 포함하는 방법.
제57항에 있어서, 상기 기판을 HIV 감염 세포로부터의 용해물과 접촉시키는 단계, 및
상기 HIV 용해물 또는 항-IgG3 항체에 결합하는 항체 생산 B 세포를 포함하는 웰을 동정하는 단계
를 포함하는 방법.
제67항에 있어서, 상기 HIV 용해물 또는 항-IgG3 항체에 결합하는 항체 생산 B 세포를 포함하는 웰을 동정하는 단계를 포함하는 방법.