CN116018158A - 新抗原知情的肿瘤浸润性淋巴细胞癌免疫疗法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)训练和扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体的方法。还提供了用所述TIL治疗群体治疗癌症患者的方法。

Description

新抗原知情的肿瘤浸润性淋巴细胞癌免疫疗法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年4月30日提交的美国临时专利申请第63/018,059号的权益，该申请的内容通过引用整体并入本文。
以电子方式提交的序列表的引用
序列表的正式副本通过EFS-Web以ASCII格式的序列表形式电子提交，文件名为“91482-242PCT_Sequence_Listing.txt”，创建于2021年4月30日，大小为13002字节，与说明书同时提交。本ASCII格式文档中含有的序列表是说明书的一部分，并通过引用整体并入本文。
技术领域
本申请涉及用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)训练和扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体的方法，以及治疗癌症患者的相关方法。
背景技术
免疫疗法是一种癌症疗法的新兴方法，其中T细胞介导的针对肿瘤抗原的反应作用于消除肿瘤细胞。新抗原是由主要组织相容性复合体(MHC)呈递的肽，其具有由体细胞突变形成的新序列，代表了一类尤其有前景的免疫疗法靶点，因为它们只出现在肿瘤上，因此引起最小的脱靶效应。TIL疗法是指一种自体细胞免疫疗法，其中从手术切除的肿瘤标本中分离TIL，在体外扩增，然后重新输注至患者体内，通常在清除淋巴细胞的预处理方案(lymphodepleting conditioning regimen)之后重新输注。虽然TIL疗法已对一系列癌症1,2,3,4取得了一些令人印象深刻的反应，但其成功仍然是偶发的5。
另一方面，原则上有数个理由认为TIL疗法可以是广泛适用的治疗方法。首先，已知大多数肿瘤被新抗原特异性T细胞浸润，尽管有时频率非常低6。其次，已表明扩增和输注包含对单一新抗原具有反应性的CD4或CD8 T细胞的高纯度TIL产物足以介导肿瘤消退7,8。因此，需要生成有效治疗癌症(特别是转移性癌症)的TIL疗法的改进方法。
发明内容
本发明提供了一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体的方法，其包括：(a)从肿瘤细胞中分离第一TIL群体，所述肿瘤细胞从切除自患者的肿瘤中获得；(b)通过对来自患者的肿瘤DNA和/或RNA以及正常DNA和/或RNA的基因组分析，检测肿瘤细胞中的多个患者特异性肿瘤突变；(c)鉴定由体细胞突变产生且显示出与来自第一TIL群体的人白细胞抗原(HLA)蛋白或其片段特异性结合的新抗原；(d)将新抗原与第一TIL群体孵育，以生成富集了识别新抗原的淋巴细胞的第二TIL群体；以及(e)将第二TIL群体扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体。
在某些方面，检测多个患者特异性肿瘤突变包括基因组分析(profiling)与靶标基因组合(panel)的下一代测序。在一方面，基因组分析包括全基因组分析、全外显子组分析、和/或转录组分析。
在其他方面，基因组分析包括通过对来自患者的肿瘤和正常样品进行核酸测序来鉴定表达基因中的多个患者特异性肿瘤突变，并且所述突变存在于患者的癌细胞基因组中，但不存在于来自受试者的正常细胞中。
在另外的其他方面，多个患者特异性肿瘤突变包括点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变、插入、缺失、或其组合；并且多个患者特异性肿瘤突变编码至少一种具有肿瘤特异性新表位的突变多肽，相较于野生型多肽，其以更高的亲和力结合至HLA蛋白或其片段。
在一些方面，所述方法进一步包括鉴定患者的MHC 1类和2类基因型。在一方面，鉴定患者的MHC 1类和2类基因型包括分析来自肿瘤和/或正常组织的全外显子组测序(WES)和/或RNA测序。
在某些方面，鉴定新抗原包括：(i)提供肽构建体文库，其中文库的每种肽构建体包含肽部分和鉴定肽部分的鉴定核酸部分，并且至少一种肽构建体的肽部分能够特异性结合HLA蛋白或其片段；(ii)使HLA蛋白或其片段与肽构建体文库接触；(iii)将包含能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的至少一种肽构建体与包含不能特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的肽构建体分离；(iv)对能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的至少一种肽构建体的鉴定核酸部分的全部或部分进行测序。
在一些方面，肽构建体文库包含通过分析多个患者特异性肿瘤突变而设计的变体肽，所述分析预测每个突变对相应蛋白质的影响，并排除沉默突变和非编码区域中的突变。在一方面，变体肽包含预测影响相应蛋白质的结构的突变。
在其他方面，鉴定新抗原包括(i)使用噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、双顺反子DNA展示、P2A DNA展示、CIS展示、酵母展示、或细菌展示来生成遗传编码的多肽组合文库，其中所述组合文库包含连接至编码多肽的相应核酸分子的多肽；(ii)使组合文库与HLA蛋白或其片段接触；(iii)分离显示出与组合文库的特异性结合的HLA蛋白或其片段；以及(iv)对结合至HLA蛋白或其片段的组合文库的核酸分子的全部或部分进行测序，以鉴定新抗原。
在一方面，多肽组合文库包含通过分析多个患者特异性肿瘤突变而设计的变体肽，所述分析预测每个突变对相应蛋白质的影响，并排除沉默突变和非编码区域中的突变。
在某些方面，新抗原与来自第一TIL群体的HLA蛋白或其片段之间的特异性结合由以下步骤确定：(i)培养用至少一种核酸分子转化的细胞，所述核酸分子包含编码以下的核苷酸序列：MHC II类组分，其包含至少一部分MHC II类α链和至少一部分MHC II类β链，使得MHC II类α链和MHC II类β链形成肽结合槽；以及空间占位物(spaceholder)分子和第一可加工接头，其中所述空间占位物分子通过所述可加工接头连接至MHC II类组分，并且所述空间占位物分子在肽结合槽内结合，从而阻碍任何其他肽在肽结合槽内结合；进行培养步骤以产生MHC II类组分；(ii)回收MHC II类组分；(iii)处理可加工接头，从而从肽结合槽中释放空间占位物分子；(iv)在新抗原存在下孵育MHC II类组分，其中所述孵育促进新抗原结合至肽结合槽；(v)回收已结合新抗原的MHC II类组分。
在一方面，空间占位物分子具有共有序列AAXAAAAAAAXAA(SEQ ID NO：78)。在另一方面，空间占位物分子选自PVSKMRMATPLLMQA(SEQ ID NO：73)；AAMAAAAAAAMAA(SEQ ID NO：74)；AAMAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：75)；AAFAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：76)；和ASMSAASAASMAA(SEQ ID NO：77)。
在一些方面，可加工接头连接至MHC II类组分的MHC II类α链。在其他方面，用结合的新抗原回收MHC II类组分包括用识别MHC II类组分的抗体进行亲和层析。
在某些方面，通过噬菌体展示来确定新抗原与来自第一TIL群体的HLA蛋白或其片段之间的特异性结合，在噬菌体表面表达HLA蛋白或其片段，并将新抗原与噬菌体孵育，以测定特异性结合。
在一方面，所述方法进一步包括计算机分析以确定新抗原与MHC I类蛋白或其片段之间的特异性结合，其中所述计算机分析包括应用计算算法基于新抗原的肽序列来预测与MHC I蛋白的相对结合。
在另一方面，所述方法进一步包括通过细胞分选从第一TIL群体和/或第二TIL群体中去除表达选自PD1、TIM-3、LAG-3、CTLA-4、及其组合的标记物的TIL，以在群体中富集非耗竭TIL。
在又一方面，将新抗原与第一TIL群体孵育进一步包括使第一TIL群体与至少一种细胞因子接触。在一方面，至少一种细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)。
在一些方面，将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括将第二TIL群体注射至患者的淋巴结区域中，注射至患者的胸腺中，和/或通过静脉内施用全身注射至患者体内。
在其他方面，将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括向第二TIL群体的细胞培养基中补充IL-2，任选OKT-3和饲养层细胞。
在另外的其他方面，将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括：(i)通过在包含IL-2和任选OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3至14天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体的数量至少比第二TIL群体多50倍，并且其中在不打开系统的情况下发生转化；并且，任选地，(ii)通过向第三TIL群体的细胞培养基中补充额外的IL-2、任选OKT-3和饲养层细胞来进行第二扩增，以产生第四TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至14天以获得第四TIL群体，其中所述第四TIL群体是TIL治疗群体，其中所述第三扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行，并且其中在不打开系统的情况下发生转化。在一方面，饲养层细胞是抗原呈递细胞(APC)或辐照外周血单个核细胞(PBMC)。
在另一方面，所述方法进一步包括使用源自患者肿瘤细胞的类器官进行免疫浸润测定，以确认与第一TIL群体相比，第二TIL群体的类器官浸润增强。
本发明还提供一种低温冷藏组合物，其包含如本文所公开的TIL治疗群体、包含DMSO的低温保护剂介质、和电解质溶液。
在一些方面，低温冷藏组合物进一步包含一种或多种稳定剂和一种或多种淋巴细胞生长因子。在一方面，一种或多种稳定剂包括人血清白蛋白(HSA)，并且一种或多种淋巴细胞生长因子包括IL-2。
本发明还涉及一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向有需要的患者施用有效量的如本文所公开的TIL治疗群体。
在一些方面，在施用有效量的TIL治疗群体之前，对患者施用非清髓性的清除淋巴细胞方案。在一方面，非清髓性的清除淋巴细胞方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天的步骤。
在其他方面，所述方法进一步包括从施用TIL治疗群体的第二天开始，用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。在一方面，高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟的静脉推注施用600000或720000IU/kg，直至耐受。
在某些方面，所述方法进一步包括使TIL治疗群体与免疫检查点抑制剂接触，或者向患者施用免疫检查点抑制剂。在一方面，检查点抑制剂包括CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-2、4-1BB、或VISTA抑制剂或其组合。在另一方面，检查点抑制剂包括伊匹单抗(ipiliumab)(抗CTLA-4)、派姆单抗(penbrolizumab)(抗PD-L1)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-L1)、阿替利珠单抗(atezolizumab)(抗PD-L1)、德瓦鲁单抗(duralumab)(抗PD-L1)、或其组合。
在一些方面，癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌、和肾细胞癌。在其他方面，癌症选自黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、和三阴性乳腺癌(TNBC)。
在另外的其他方面，TIL治疗群体通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或肿瘤内施用。
附图说明
图1描绘了分离治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的传统方法与所描述的使用基因组工具以富集TIL的改进方法的比较。
图2描绘了本文描述的方法的工作流程的更详细的概述，从收集来自患者的淋巴细胞开始。
图3描绘了图2所示的工作流程的简化时间线，显示了大致的时间要求。
图4描绘了图2所示的工作流程的更详细的时间线，显示了大致的时间要求。
图5描绘了PepSeq作为用于高效合成和分析DNA条形码肽(DNA-barcodedpeptide)的大型文库的平台。所描绘的肽-DNA文库显示了嘌呤霉素(“Puro”)连接物(adaptor)，其促进DNA连接至编码的肽。
图6描绘了分析肿瘤外显子组以鉴定候选新抗原，使用MHC-PepSeq测定来表征候选新抗原，以及评估T细胞对MHC-PepSeq测定中结合至HLA蛋白的新抗原的应答。
图7描绘了PepSeq文库设计，用于分析从肿瘤外显子组分析中鉴定的突变。
图8描绘了MHC-PepSeq测定的实施方案，所述测定用于鉴定结合至MHC II类分子的新抗原。在对照组(“未切割”)中，CLIP肽未从HLA构建体中去除，候选新抗原非特异性结合，而在测试组(“切割”)中，去除CLIP肽打开了HLA构建体的识别位点，以允许候选新抗原特异性结合。
图9描绘了鉴定来自2个人患者(即TG0006和TG00013)的富集肽(即新抗原)。在每个患者ID下显示了通过外显子组分析在每个患者中鉴定的突变数量。在每个图的左上角表明了结合测定中使用的HLA复合物的人白细胞抗原血清型。富集肽显示为较大的数据点。
图10描绘了表明来自人患者TG00013的富集肽(即新抗原)的另外的数据集。富集肽在每个图的上半部分显示为数据点，对应于切割的HLA复合物的对数平均百分比读数更接近0(即更接近于与切割的HLA复合物100％结合)的肽。
图11描绘了富集肽的氨基酸序列，每种肽的相应突变，以及对于人患者TG00013，所述肽特异性结合的HLA复合物的人白细胞抗原血清型。
图12描绘了MHC-PepSeq与计算机预测用于鉴定新抗原的比较。用于计算机分析的IEDB共有序列获自免疫表位数据库和分析资源(IEDB)，IEDB是由国家过敏和传染病研究所(NIAID)维护的公共资源。
图13描绘了由肿瘤细胞悬液生成球状体/类器官。
图14A、14B和14C描绘了浸润测定工作流程。在图14A中，在圆底板中由肿瘤细胞悬液形成类器官后，插入可渗透载体，并允许富集的TIL通过载体迁移以浸润类器官。图14B描绘了具有Z-堆叠(Z-stacking)的类器官的三维图像的产生。图14C描绘了淋巴细胞浸润类器官的定量。
图15描绘了TIL浸润源自患有黑色素瘤的患者TG00013的类器官。
图16描绘了另一个评估TIL浸润源自患者TG00013的类器官的数据集，以及对治疗组之间差异的统计分析。
图17描绘了与来自患者TG00013的一般未受累(“GU”)组织相比，TIL对肿瘤细胞的特异性浸润。
图18描绘了用于NeoTIL分析和CT26结肠癌小鼠的疗法的工作流程的一个实施方案。在另一个实施方案中，受试者(例如小鼠或人)在步骤IV之前经历清除淋巴细胞。
图19描绘了来自CT26结肠癌小鼠的富集肽(即新抗原)。富集肽在图的上半部分显示为数据点，对应于切割的小鼠MHC I类或II类同种抗原的对数平均百分比读数更接近0(即更接近于与切割的小鼠同种抗原100％结合)的肽。
图20描绘了富集肽的氨基酸序列，每种肽的相应突变，以及对于CT26结肠癌小鼠，所述肽特异性结合的小鼠MHC I类或II类同种抗原。
图21描绘了TIL与DMSO、IL-2、肽(即新抗原)、或肽与IL-2共培养第1天和第7天的显微图像。
图22描绘了来自CT26小鼠肿瘤类器官中的免疫浸润测定的显微图像。将以下处理施用于类器官：1)TIL；2)TIL+IL-2；3)TIL+肽(即新抗原)；4)TIL+IL-2+肽(即新抗原)；和5)TIL+DMSO。
图23描绘了对如图22的图像所示的TIL浸润源自CT26小鼠肿瘤的类器官的定量。TIL用Invitrogen CELLTRACKERTM CM-DiI染色，这是一种红色荧光染料，非常适合于监测多代细胞的运动或位置。该染料有助于对TIL浸润类器官进行定量。通过Cytation 5软件进行成像分析。还显示了治疗组之间差异的统计分析，其中显著差异标有星号。
图24描绘了CT26结肠癌小鼠在瘤内(“IT”)施用以下后的平均肿瘤体积：1)TIL；2)TIL+IL-2；3)TIL+肽(新抗原)；4)TIL+IL-2+肽(新抗原)；和5)载体。
图25描绘了CT26结肠癌小鼠在静脉内(“IV”)施用以下后的平均肿瘤体积：1)TIL+IL-2；2)TIL+肽(新抗原)；3)TIL+IL-2+肽(新抗原)；和4)TIL+载体。
图26A至图26E描绘了Neo-TILsTM在黑色素瘤中的疗效。在黑色素瘤患者的肿瘤类器官中测量TIL浸润(图26A、图26B)。图26B描绘了来自肿瘤(黑色)或一般未受累(GU)组织(灰色)的黑色素瘤患者类器官中的免疫浸润测定。通过MesoScale Discovery(MSD)测定，在TIL条件培养基中测量IFNγ(图26C)、TNFα(图26D)、和颗粒酶B(图26E)的水平。
图27A至图27K描绘了Neo-TILsTM在黑色素瘤中的疗效。在黑色素瘤患者的肿瘤类器官中测量TIL浸润(图27A)。qPCR测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图27B)、颗粒酶B(图27C)、和穿孔素(图27D)的相对表达。MSD测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图27E)、TNFα(图27F)、和颗粒酶B(图27G)的水平。qPCR测定还测量耗竭标记物PD-1(图27H)、TIM-3(图27I)、LAG3(图27J)、和TIGIT(图27K)的相对表达。
图28A至图28G描绘了Neo-TILsTM在肺癌中的疗效。在肺癌患者的肿瘤类器官中测量TIL浸润(图28A和图28B)。图26B描绘了来自肿瘤(黑色)或GU组织(灰色)的肺癌患者类器官中的免疫浸润测定。通过MSD测定来测量TIL条件培养基中IFNγ(图28C)、颗粒酶B(图28B)的水平。qPCR测定测量TIL条件培养基中IFNγ(图28E)、颗粒酶B(图28F)、和穿孔素(图28G)的相对表达。
图29A至图29K描绘了Neo-TILsTM在结肠癌中的疗效。在结肠癌患者的肿瘤类器官中测量了TIL浸润(图29A)。qPCR测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图29B)、颗粒酶B(图29C)、和穿孔素(图29D)的相对表达。MSD测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图29E)、TNFα(图29F)、和颗粒酶B(图29G)的水平。qPCR测定还测量耗竭标记物PD-1(图29H)、TIM-3(图29I)、LAG3(图29J)、和TIGIT(图29K)的相对表达。
图30A至图30J描绘了Neo-TILsTM在胰腺癌中的疗效。在胰腺癌患者的肿瘤类器官中测量了TIL浸润(图30A)。qPCR测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图30B)和颗粒酶B(图30C)的相对表达。MSD测定测量TIL和条件培养基中IFNγ(图30D)、TNFα(图30E)、和颗粒酶B(图30F)的水平。qPCR测定还测量耗竭标记物PD-1(图30G)、TIM-3(图30H)、LAG3(图30I)、和TIGIT(图30J)的相对表达。
图31A至图31C描绘了Neo-TILsTM在时间上的疗效估计。相对于常规TIL，对患者肿瘤类器官进行的免疫浸润测定中的Neo-TILsTM疗效在数天后得以维持。48h测定(图31A)、72h测定(图31B)、和120h测定(图31C)。
图32描绘了相对于常规TIL，Neo-TIL如何选择性地识别来自原始患者的肿瘤组织。将未处理的TIL、和IL-2处理的TIL、和来自癌症患者34的训练的Neo-TIL与癌症患者24的类器官一起孵育。分析24h、48h和72h的TIL浸润水平。
图33描绘了肽训练后Neo-TIL的单细胞测序和快速扩增方案(REP)。95％的细胞为CD45阳性，97％为CD3D阳性，98％为CD3E阳性，80％为CD3G阳性。
具体实施方式
如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一”、“一个”和“所述”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。例如，“一”或“一个”表示“至少一个”或“一个或多个”。因此，提及“抗体或其抗原结合片段”是指一种或多种抗体或其抗原结合片段，而提及“所述方法”包括提及本文公开和/或本领域技术人员已知的等效步骤和方法，等等。
本文中的“肿瘤浸润性淋巴细胞”或“TIL”是指最初作为白细胞获得的细胞群体，其已经离开受试者的血流并迁移至肿瘤中。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+T细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和M1巨噬细胞。TIL包括原代TIL和次级TIL。“原代TIL”是如本文概述从患者组织样品中获得的(有时称为“新鲜收获的”)TIL，而“次级TIL”是任何已扩增或增殖的TIL细胞群体。
通常可以通过生物化学(使用细胞表面标记物)或功能(通过TIL浸润肿瘤和影响治疗的能力)来定义TIL。TIL通常可以通过表达一种或多种以下生物标记物来进行分类：CD4、CD8、TCRα/β、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45Ra、CD95、PD-1、和CD25。此外，或者，可以通过TIL在重新引入患者体内时浸润实体瘤的能力来通过功能定义TIL。可以进一步通过效力表征TIL，例如，如果干扰素(IFN)释放大于约50pg/mL，大于约100pg/mL，大于约150pg/mL，或大于约200pg/mL，则可以认为TIL是有功效的。
“新表位”在本领域中被理解为指在暴露于或发生特定事件(例如特定疾病、疾患或病症的发生或进展，例如感染、癌症、癌症分期等)后，在受试者中出现或发生的表位。如本文所用，新表位是其存在和/或水平与暴露于或发生事件相关的表位。在一些实施方案中，新表位是触发针对表达该表位(例如在相关水平上)的细胞的免疫应答的表位。在一些实施方案中，新表位是触发杀死或以其他方式破坏表达该表位(例如在相关水平上)的细胞的免疫应答的抗原。在一些实施方案中，触发新表位的相关事件是或包括细胞中的体细胞突变。在一些实施方案中，新表位在非癌细胞中不以触发和/或支持支持免疫应答(例如足以靶向表达所述新表位的癌细胞的免疫应答)的水平和/或方式而表达。在一些实施方案中，新表位是新抗原。
如本文所用，术语“新抗原特异性肿瘤浸润性淋巴细胞”(也称为Neo-TILTM)是指根据本文所述的方法产生的肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。
术语“靶标”、“靶标分子”和“靶标试剂”在本文中可互换使用，是指与文库孵育以鉴定显示出与靶标特异性结合的肽的蛋白质、毒素、酶、病原体、细胞或生物标记物。
术语“肽”、“多肽”等在本文中可互换使用，是指任何长度的氨基酸聚合形式，化学或生化修饰或衍生化的氨基酸，以及具有修饰肽骨架的多肽。
如本文所用的术语“肽构建体”是指附接至鉴定寡核苷酸上的任意长度的肽。附接可以通过中间接头，并且附接可以是共价的或非共价的。鉴定寡核苷酸可以是被翻译以形成构建体的肽部分的信息，或者它可以是任何其他已知且可以用于通过测序来鉴定附接的肽的序列。“肽构建体集”是指由定制设计的寡核苷酸集生成的肽构建体池。所述集可以含有每个肽构建体物种的少至一个拷贝，但通常含有每种肽构建体的许多拷贝。
如本文所用，术语“结合”是指两个分子之间的吸引力相互作用，其导致稳定的缔合，其中分子彼此非常接近。分子结合可以分为以下种类：非共价、可逆共价和不可逆共价。可以参与分子结合的分子包括蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、和有机小分子如药物化合物。例如，与其他分子形成稳定复合物的蛋白质通常称为受体，而它们的结合配偶体称为配体。核酸也可以与其自身或其他物质形成稳定复合物，例如DNA-蛋白质复合物、DNA-DNA复合物、DNA-RNA复合物。
如本文所用，术语“特异性结合”是指结合物(例如抗体)的特异性，使得它优选结合至靶标(如多肽抗原)。当提及结合配偶体(例如蛋白质、核酸、抗体或其他亲和捕获剂等)时，“特异性结合”可以包括两种或更多种具有高亲和力和/或互补性的结合配偶体的结合反应，以确保在指定的测定条件下选择性杂交。通常，特异性结合将至少是背景信号标准偏差的三倍。因此，在指定的条件下，结合配偶体结合至其特定的靶标分子，并且不与样品中存在的其他分子大量结合。在其他潜在干扰物质的存在下通过结合物或抗体识别特定靶标是这种结合的特征之一。优选地，对靶标具有特异性或特异性结合靶标的结合物、抗体或抗体片段结合至靶标的亲和力高于结合至其他非靶标物质的亲和力。还优选地，对靶标具有特异性或特异性结合靶标的结合物、抗体或抗体片段避免结合至显著百分比的非靶标物质(例如存在于测试样品中的非靶标物质)。在一些实施方案中，本公开的结合物、抗体或抗体片段避免结合大于约90％的非靶标物质，尽管明确考虑和优选更高的百分比。例如，本公开的结合物、抗体或抗体片段避免结合约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、和约99％或更多的非靶标物质。在其他实施方案中，本公开的结合物、抗体或抗体片段避免结合大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、或70％、或大于约75％、或大于约80％、或大于约85％的非靶标物质。
本文所用的术语“捕获剂”和“捕获基团”是指允许通过与靶标分子上的亲和基团或结构域、或者肽构建体的亲和标签结合或键合来捕获靶标分子或肽构建体的任何部分。捕获剂与其亲和标签之间的结合可以是共价键和/或非共价键。捕获剂包括，例如，选择性结合至融合肽上的亲和标签的结合对的成员、通过重组技术或其他机制添加的化学键、酶的辅助因子等。可以使用常规技术使捕获剂与肽构建体结合，所述技术包括杂交、交联(例如使用呋喃香豆素如补骨脂素的共价固定化)、连接、通过化学反应性基团附接、通过翻译后修饰引入等。
“序列测定”、“测序”等包括确定与核酸的核苷酸碱基序列相关的信息。此类信息可能包括核酸的部分序列信息以及全序列信息的鉴定或确定。可以以不同程度的统计可靠性或置信度来确定序列信息。在一方面，该术语包括确定核酸中多个连续核苷酸的身份和排序。“高通量测序”或“下一代测序”包括使用以固有平行方式确定许多(通常为数千至数十亿个)核酸序列的方法来确定序列，即其中不是一次制备一个用于测序的DNA模板，而是在批量过程中制备，并且其中优选平行地读取许多序列，或者可选地使用本身可以平行化的超高通量串行过程。此类方法包括但不限于焦磷酸测序(例如由454Life Sciences,Inc.,Branford,CT商品化的)；连接法测序(例如在SOLiDTM技术中商品化的，LifeTechnologies,Inc.,Carlsbad,CA)；使用修饰核苷酸的合成法测序(如在TruSeqTM和HiSeqTM技术中商品化的，Illumina,Inc.,San Diego,CA；HeliScopeTM技术，HelicosBiosciences Corporation,Cambridge，MA；和PacBio RS，Pacific Biosciences ofCalifornia,Inc.,Menlo Park,CA)、离子检测技术测序(如Ion TorrentTM技术，LifeTechnologies,Carlsbad,CA)；DNA纳米球测序(Complete Genomics,Inc.,Mountain View,CA)；基于纳米孔的测序技术(例如由Oxford Nanopore Technologies,LTD,Oxford,UK开发的)，以及类似的高度平行化测序方法。
术语“外显子组”根据其在本领域中理解的含义使用，是指特定基因组中具有的外显子序列的集。
如本文所用，术语“突变”是指构成基因的DNA序列的永久性变化。在一些实施方案中，突变的大小范围从单个DNA构建单元(DNA碱基)到大型染色体片段不等。在一些实施方案中，突变可以包括错义突变、移码突变、重复、插入、无义突变、缺失和重复扩增。在一些实施方案中，错义突变是一个DNA碱基对的变化，其导致在基因产生的蛋白质中用一个氨基酸替换另一个氨基酸。在一些实施方案中，无义突变也是一个DNA碱基对的变化。然而，改变的DNA序列不是用一个氨基酸替换另一个氨基酸，而是过早地向细胞发出信号以停止构建蛋白质。在一些实施方案中，插入通过添加一段DNA来改变基因中DNA碱基的数量。在一些实施方案中，缺失通过去除一段DNA来改变DNA碱基的数量。在一些实施方案中，小的缺失可以去除基因中的一个或几个碱基对，而较大的缺失可以去除整个基因或数个相邻的基因。在一些实施方案中，重复由被异常复制一次或多次的一段DNA组成。在一些实施方案中，当DNA碱基的添加或缺失改变基因的阅读框时，发生移码突变。阅读框由3个碱基的组组成，每个组编码一个氨基酸。在一些实施方案中，移码突变使这些碱基的分组移位，并改变了氨基酸的编码。在一些实施方案中，插入、缺失和重复都可以是移码突变。在一些实施方案中，重复扩增是另一种类型的突变。在一些实施方案中，核苷酸重复序列是连续重复多次的短DNA序列。例如，三核苷酸重复序列由3个碱基对的序列组成，四核苷酸重复序列由4个碱基对的序列组成。在一些实施方案中，重复扩增是增加短DNA序列重复次数的突变。
如本文所用的“小分子”是指小于5千道尔顿的分子，更通常为小于1千道尔顿。如本文所用的“小分子”包括肽。
“亲和标签”被给予其在本领域中的普通含义。亲和标签是可以容易地附接至靶标生物材料或化学材料的任何生物材料或化学材料。可以通过任何合适的方法将亲和标签附接至靶标生物分子或化学分子。例如，在一些实施方案中，可以使用遗传方法将亲和标签附接至靶标分子。例如，可以将编码亲和标签的核酸序列插入编码生物分子的序列附近；所述序列可以位于核酸内使得亲和标签能够与生物分子一起表达的任何位置，例如在生物分子内、与其相邻或在其附近。在其他实施方案中，还可以在产生(例如表达或合成)靶标生物分子或化学分子之后将亲和标签附接至所述分子。作为一个例子，亲和标签(如生物素)可以化学偶联(例如共价直接地)至靶标蛋白或肽，以促进靶标结合至链霉亲和素。
亲和标签包括，例如，金属结合标签(如组氨酸标签)、GST(在谷胱甘肽/GST结合中)、链霉亲和素(在生物素/链霉亲和素结合中)。其他亲和标签包括Myc/Max对中的Myc或Max，或聚氨基酸(如聚组氨酸)。在本文的不同位置，描述的特定亲和标签与结合相互作用相关。与亲和标签相互作用(即亲和标签结合的)的分子可以是已知的生物结合配偶体或化学结合配偶体，是“识别实体”。将理解的是，在采用亲和标签的任何实施方案中，本发明涉及一系列单独的实施方案，每个均涉及选择本文描述的任何亲和标签。
“识别实体”可以是能够结合至亲和标签的任何化学材料或生物材料。识别实体可以是，例如，小分子如麦芽糖(其结合至MBP、或麦芽糖结合蛋白)、谷胱甘肽、NTA/Ni2+、生物素(其可以结合至链霉亲和素)、或抗体。亲和标签/识别实体的相互作用可以促进靶标分子的附接，例如附接至另一种生物材料或化学材料，或附接至底物(例如硝酸纤维素膜或其他固定化底物)。亲和标签/识别实体的相互作用的例子包括聚组氨酸/NTA/Ni2+、谷胱甘肽S-转移酶/谷胱甘肽、麦芽糖结合蛋白/麦芽糖、链霉亲和素/生物素、生物素/链霉亲和素、抗原(或抗原片段)/抗体(或抗体片段)等。
术语“核糖体展示”是指能够产生mRNA、核糖体和相应靶标蛋白质的三元复合物的反应系统。核糖体展示可以用于筛选用于结合靶标抗原或配体的细胞表面受体、抗体及其片段。产生反应系统的步骤可以包括：1)生成DNA文库并将所述文库转录为RNA文库，2)纯化RNA并在无细胞蛋白质合成系统中体外翻译，3)允许翻译反应的核糖体复合物结合至靶标抗原或配体，4)选择结合的核糖体复合物，以及5)从复合物中分离RNA，并将转录本反转录为cDNA，其中所述cDNA可以被扩增、测序和/或进一步修饰。
如本文所用，术语将试剂“施用”至受试者包括将试剂引入或递送至受试者以执行其预期功能的任何途径。可以通过任何合适的途径进行施用，所述途径包括静脉内、肌肉内、腹膜内、或皮下。施用包括自行施用和由他人施用。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以影响预期应用(包括但不限于疾病治疗)的如本文所述的试剂或试剂组合的量。治疗有效量可以根据以下而变化：预期应用(体外或体内)、或被治疗的受试者和疾病病症(例如受试者的体重、年龄和性别)、疾病病症的严重程度、或施用方式。该术语也适用于将在靶标细胞中诱导特定应答的剂量。具体剂量将根据以下而变化：选择的特定试剂、将遵循的给药方案、试剂是否与其他试剂组合施用、施用时间、施用试剂的组织、以及携带化合物的物理递送系统。
术语“治疗”等是指获得期望的药理作用和/或生理作用。所述作用可以是预防性的(在完全或部分预防疾病或其症状方面)和/或治疗性的(在部分或完全治愈疾病和/或可归因于所述疾病的不良反应方面)。如本文所用的“治疗”涵盖对哺乳动物(特别是人)的疾病的任何治疗，并且包括：(a)防止疾病发生在可能易患所述疾病但尚未被诊断为患有所述疾病的受试者中；(b)抑制疾病，即阻止其发生或进展；(c)缓解疾病，即导致疾病消退和/或缓解一种或多种疾病症状。“治疗”也意味着涵盖即使在没有疾病或病症的情况下递送试剂以提供药理作用。例如，“治疗”涵盖递送可以在没有疾病病症的情况下(例如在疫苗的情况下)引起免疫应答或赋予免疫力的组合物。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是指向其提供或可以向其施用组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防、美容、和/或治疗目的。典型的患者包括动物(例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、非人灵长类动物、和/或人)。在一些实施方案中，患者是人。在一些实施方案中，患者患有或易患一种或多种疾患或病症。在一些实施方案中，患者表现出疾患或病症的一种或多种症状。在一些实施方案中，患者已被诊断为患有一种或多种疾患或病症。在一些实施方案中，疾患或病症是或包括癌症，或存在一个或多个肿瘤。在一些实施方案中，疾患或病症是转移性癌症。
本文描述了用于生产治疗性肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)的方法。TIL疗法是一种自体细胞免疫疗法，其中从手术切除的肿瘤标本中分离TIL，在体外扩增，然后在清除淋巴细胞的预处理方案之后重新输注至患者体内。虽然传统TIL疗法已对一系列癌症取得了一些令人印象深刻的反应，但其成功仍然是偶发的。然而，有理由认为TIL疗法可以是广泛适用的治疗方法。首先，已知大多数肿瘤被新抗原特异性T细胞浸润，尽管有时频率非常低。其次，已表明扩增和输注包含对单一新抗原具有反应性的CD4或CD8 T细胞的高纯度TIL产物足以介导肿瘤消退。
新抗原特异性TIL加工概述
未能持续富集新抗原特异性细胞可能是目前TIL疗法成功有限的原因。例如，强烈的非特异性体外扩增会扭曲T细胞表达(representation)谱，并且通常导致其他特异性细胞竞争胜过期望的靶标T细胞，特别是到肿瘤抗原特异性应答由耗尽或调节表型主导的程度。
本文描述的方法是一种差异化方法(图1和图2)，其中应用新型肽：MHC筛选技术或相关方法以由基因组分析预测个性化免疫原性新抗原，然后这些新抗原用于在TIL制剂中富集效力最强的细胞，所述细胞作为一组在本文中称为新抗原特异性TIL。可以在相对短的时间表内产生这种个性化TIL疗法(见图3和图4)。本文还描述了用于生长肿瘤类器官的方法，其为新抗原特异性TIL的抗肿瘤功效提供了个性化试验台。
在一些实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，其中使用一种或多种以下非互斥策略从TIL中富集新抗原特异性T细胞：
(1)基于表面标记物表达的细胞分选：特别是，已知肿瘤抗原特异性T细胞存在于耗竭的区隔中，其特征在于标记物的高表达(包括PD1、TIM-3、LAG-3、CTLA-49)。此外，可使用肽：MHC多聚体的表面染色来鉴定新抗原特异性细胞。
(2)使用预测的新抗原肽进行抗原特异性扩增：除了“减法”分选之外，还可以通过扩增来富集新抗原特异性细胞。通过在预测的新抗原肽的存在下培养TIL，可以优选扩增期望的特异性的细胞。
在这两组中，传统上限速步是需要从改变肽的体细胞肿瘤变异的通常大型的目录中鉴定靶标新抗原的小型集合。为了解决该限制，部署了一种强大的方法，其中将新型高度多重(highly-multiplexed)肽：MHC II类结合测定(“MHC-PepSeq”)与MHC I类的计算机预测配对。这使得能够快速、高置信度地鉴定候选新抗原肽：MHC，以构建新抗原特异性荧光标记和/或刺激性抗原。可选地，使用噬菌体展示或相关方法来鉴定候选新抗原肽：MHC。
(3)将通过新抗原肽暴露最小程度扩增的TIL注射至淋巴结中以进行加工和扩增：已知离体细胞因子暴露可以改变新抗原库和T细胞动力学。在一方面，将最小程度扩增的TIL直接注射至淋巴结区域中，以保持这些T细胞的“自然”加工和扩增。这种方法是全新的，因为它对TIL使用体内加工。
在T细胞富集后，可以使用单细胞测序(潜在地与肽：MHC多聚体标记联合使用)来鉴定配对的重排TCRα和β基因，其赋予T细胞新抗原特异性。这可以提供T细胞富集效率的另外度量，并且还可以实现平行基因转移方法，其中将患者特异性新抗原反应性赋予通用供体细胞，以提供规避内源性应答的耗竭表型的潜力。
肿瘤突变和/或新表位的检测
可以从切除肿瘤的基质中获得自体TIL。为此，由患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。可以以任何合适的方式获得单细胞悬液，例如机械方式(使用例如gentleMACSTM解离剂，Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.来解聚肿瘤)和/或酶促方式(例如胶原酶或DNA酶)。
如本文所述，可以使用各种已知技术中的任一种来筛选癌症以检测突变和/或新表位(例如检测新抗原特性，和/或新表位性质、水平和/或频率)。在一些实施方案中，在核酸水平(例如在DNA或RNA中)检测特定突变或新表位、或其表达。本领域技术人员将认识到，可以在包含来自癌细胞的DNA或RNA的样品中检测突变或新表位、或其表达。此外，本领域技术人员将理解的是，包含来自癌细胞的DNA或RNA的样品可以包括但不限于循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞游离DNA(cfDNA)、细胞、组织或器官。在一些实施方案中，在蛋白质水平检测突变或新表位、或其表达(例如在包含来自癌细胞的多肽的样品中，所述样品可以是或包含多肽复合物或其他高阶结构，包括但不限于细胞、组织或器官)。
在一些具体实施方案中，检测涉及核酸测序。在一些实施方案中，检测涉及全外显子组测序。在一些实施方案中，检测涉及免疫测定。在一些实施方案中，检测涉及使用微阵列。在一些实施方案中，检测涉及大规模平行外显子组测序。在一些实施方案中，检测涉及基因组测序。在一些实施方案中，检测涉及RNA测序。在一些实施方案中，检测涉及标准DNA或RNA测序。在一些实施方案中，检测涉及质谱。
在一些实施方案中，检测涉及下一代测序(DNA和/或RNA)。在一些实施方案中，检测涉及基因组测序、基因组重测序、靶向测序组合、转录组分析(RNA-Seq)、DNA-蛋白质相互作用(ChIP-测序)、和/或表观基因组表征。在一些实施方案中，可以利用患者基因组的重测序，例如用于检测基因组变异。
在一些实施方案中，检测涉及使用诸如ELISA、蛋白质印迹、免疫测定、质谱、微阵列分析等技术。
在一些实施方案中，检测涉及下一代测序(DNA和/或RNA)。在一些实施方案中，检测涉及靶标基因组合的下一代测序(例如
Figure BDA0004030634470000141
肿瘤/正常外显子组RNA检测
Figure BDA0004030634470000142
MSK-IMPACT、或
Figure BDA0004030634470000143
)。在一些实施方案中，检测涉及基因组分析。
在一些实施方案中，检测涉及使用
Figure BDA0004030634470000144
测试的基因组分析。
Figure BDA0004030634470000145
测试是一种全面的外显子组和转录组分析测定，其既为护理癌症患者提供信息，又能够实现未来对该疾病的研究。通过杂交捕获和临床深度测序分析了多于19000个基因，以鉴定体细胞点突变、小的和大的插入和缺失、以及结构重排。还进行了微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB)的测量，以为免疫疗法的应用提供信息。为了确保鉴定的变异为体细胞起源，对种系和肿瘤外显子组均进行了测序并比较。还对整个转录组进行测序，使得能够由患者RNA检测基因融合和选择性剪接事件。
Figure BDA0004030634470000146
适用于实体癌和血液癌。
在一些实施方案中，检测涉及使用可操作癌症靶标的集成突变分析(MSK-IMPACT)进行基因组分析(参见Cheng D T,Mitchell T N,Zehir A等人，Memorial SloanKettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets(MSK-IMPACT):A Hybridization Capture-Based Next-Generation Sequencing ClinicalAssay for Solid Tumor Molecular Oncology.J Mol Diagn.2015；17(3):251-264；和Ross D S,Zehir A,Cheng D T等人，Next-Generation Assessment of Human EpidermalGrowth Factor Receptor 2(ERBB2)Amplification Status:Clinical Validation inthe Context of a Hybrid Capture-Based,Comprehensive Solid Tumor GenomicProfiling Assay.J Mol Diagn.2017；19(2):244-254)。MSK-IMPACT是一种全面的分子分析测定，其涉及多个癌基因和肿瘤抑制基因的所有外显子和选定内含子的杂交捕获和深度测序，以允许检测点突变、小的和大的插入或缺失、以及重排。MSK-IMPACT还捕获散布在基因组中的基因间和内含子单核苷酸多态性(例如平铺(tiling)探针)，其有助于准确评估全基因组拷贝数。在一些实施方案中，探针可以靶向兆碱基。
在一些实施方案中，检测涉及使用
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CDXTM(“FlCDx”)测定进行基因组分析。FlCDx测定是基于体外诊断设备的下一代测序，其用于检测324个基因中的替换、插入和缺失改变(插入缺失(indel))、和拷贝数改变(CNA)、和选定的基因重排、以及基因组签名(包括微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB))，使用从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)肿瘤组织标本中分离的DNA进行检测。美国食品药品监督管理局(FDA)批准FlCDx用于数种肿瘤适应症，包括NSCLC、黑色素瘤、乳腺癌、结直肠癌、和卵巢癌。
FlCDx测定采用从常规FFPE活检或手术切除标本中单次提取DNA的方法，50-1000ng DNA将进行全基因组鸟枪文库构建和基于杂交捕获来自309个癌症相关基因的所有编码外显子、一个启动子区域、一个非编码(ncRNA)区域、和来自34个常见重排基因的选定内含子区域(其中21个还包括编码外显子)。该测定总计检测总计324个基因中的改变。使用
Figure BDA0004030634470000152
HiSeq 4000平台，对混合捕获选定的文库进行高均匀深度测序(靶标>500×中位覆盖率，>99％的外显子覆盖率>100×)。然后使用定制的分析管道处理序列数据，所述分析管道设计为检测所有类别的基因组改变，包括碱基替换、插入缺失、拷贝数改变(扩增和纯合基因缺失)和选定的基因组重排(例如基因融合)。此外，还报告基因组签名，包括微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB)。
在一些实施方案中，检测可以涉及对来自至少100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000或更多个基因(例如癌基因和/或肿瘤抑制基因)的外显子和/或内含子序列进行测序。例如，文献报告表明，MSK-IMPACT已用于实现468个癌基因和肿瘤抑制基因的所有外显子和选定内含子的深度测序。
可选地或额外地，在一些实施方案中，检测可以涉及对基因间和/或内含子单核苷酸多态性进行测序。例如，文献报告表明，MSK-IMPACT已用于实现>1000个基因间和内含子单核苷酸多态性的深度测序。
在一些实施方案中，检测涉及对剪接变体进行测序。癌细胞能够通过发展机制来适应和进化，以逃逸它们的微环境的控制。因此，选择性剪接提供的多样性和可塑性为癌细胞提供了产生适合于肿瘤生长和/或扩散的蛋白质亚型的机会(David C J和Manley J L.,Genes Dev.2010；24(21):2343-2364)。全基因组方法已揭示了在肿瘤发生过程中会发生大规模的选择性剪接(Venable J P等人,Nat Struct Mol Biol.2009；16(6):670-676)，并且已证明选择性剪接模式的基因组画像可用于肿瘤分类中(Venable J P.,Bioessays.2006；28(4):378-386；Skotheim R I等人,Int J Biochem Cell Biol.2007；39(7-8):1432-1449；Omenn G S等人,Dis Markers.2010；28(4):241-251)。
已注意到报告了不同癌症中的异常剪接事件和选择性剪接转录本比例的改变(Rajan P等人,Nat Rev Urol.2009；6(8):454-460)。这些事件导致在正常细胞对应物中未观察到的新转录本。已报道了肿瘤生物学的几乎所有领域都受到选择性剪接的影响，包括代谢、细胞凋亡、细胞周期控制、侵袭、转移和血管生成(Venables J P.,Bioessays.2006；28(4):378-386；Ghigna C等人,Curr Genomics.2008；9(8):556-570)。
选择性剪接变体的最早例子之一是Bcl-x，其具有相反凋亡效应。可以选择性剪接Bcl-x前mRNA以产生两种剪接变体：抗凋亡Bc1-xL(长形式)和促凋亡Bc1-xS(短形式)(Boise L H等人,Cell.1993；74(4):597-608)。可以在许多癌症类型(包括人淋巴瘤、乳腺癌、和人肝细胞癌)中发现高Bc1-xL/Bc1-xS比率，其促进肿瘤细胞存活(Minn A J等人,JBiol Chem.1996；271(11):6306-6312.44-46；Olopade O I等人,Cancer J Sci Am.1997；3(4):230-237；Takehara T等人,Hepatology.2001；34(1):55-61)。在癌细胞中经历选择性剪接的细胞凋亡相关基因的另一个例子是Fas受体基因。
Fas受体在许多细胞类型的细胞表面表达，细胞毒性T细胞产生的Fas配体激活Fas受体，从而启动死亡信号级联反应，导致表达Fas受体的细胞凋亡(Bouillet P等人,NatRev Immunol.2009；9(7):514-519)。至少有3个Fas的短mRNA变体缺少编码的跨膜结构域，所得翻译的蛋白变体可能由癌细胞分泌并作为Fas配体的诱饵受体，从而允许癌细胞逃逸细胞凋亡(Cheng J等人,Science.1994；263(5154):1759-1762；Cascino I等人,Journalof Immunology.1995；154(6):2706-2713)。
H-Ras癌基因的选择性剪接发生在先前未知的剪接外显子(称为IDX)上，由H-Ras基因的内含子突变引起(Cohen J B等人,Cell.1989；58(3):461-472)。IDX剪接位点的这种突变导致H-Ras mRNA变体，其更加耐受无义介导的mRNA降解(NMD)过程，因此在癌症中过表达(Barbier J等人,Mol Cell Biol.2007；27(20):7315-7333)。选择性剪接还在促进癌症侵袭和转移行为方面发挥作用。CD44是最早具有与转移特异性相关的剪接变体的基因之一，其中含有外显子4-7(v4-7)和6-7(v6-7)的变体被显示在转移性胰腺癌细胞系中表达，但不在相应的亲本肿瘤中表达(Gunthert U等人,Cell.1991；65(1):13-24)。
突变调用(Mutational Calling)软件工具
在某些方面，使用了Pegasus人研究管道。将序列与HG19人基因组或HG38人基因组比对。在一方面，使用三个独立的突变调用者Seurat、Mutect、和Strelka来调用体细胞突变。选择在多个调用者中看到的所有突变，用于生成肽。这背后的理由是每个调用者具有自己的优势和劣势。通过拉取由多个调用者调用的突变，会降低鉴定出假阳性的风险。遵循DNA和RNA工作流程的最佳实践。可选地，使用未改变的CLIA认证的体细胞调用以生成肽，所述肽作为候选新抗原用于进一步分析。
在一些实施方案中，可以利用单个或多个突变调用者以调用基因组变异。对于由测序肿瘤和正常组织组成的样品，可以使用的调用者是：Strelka、Strelka2、VarDict、VarScan2、qSNP、Shimmer、RADIA、SOAPsnv、SomaticSniper、FaSD-somatic、Samtools、JointSNVMix、Virmid、SNVSniffer、Seurat、CaVEMan、MuTect、MuTect2、LoFreq、EBCall、deepSNV、LoLoPicker、MuSE、MutationSeq、SomaticSeq、SnooPer、FreeBayes、HapMuC、SPLINTER、Pisces、DeepSNVMiner、smCounter、DeepVariant、Cake、Tnscope、DNAscope、NeoMutate、Maftools、scABA、Sanivar、Sarek、BATCAVE、SomaticNet、CoVaCS、RegTools、xAtlas、R2D2、SiNPle、Bambino、和exactSNP。对于仅由肿瘤组成的样品，可以利用的测序调用者是：Platypus、LumosVar、LumosVar2、SNVMix2、SNVer、OutLyzer、ISOWN、SomVarIUS、SiNVICT、FreeBayes、SNPiR、eSNV-dectect、RNAIndel、VaDir、和Clairvoyante。
在某些实施方案中，可以利用识别剪接变体的单个或多个突变调用者以调用基因组变异。对于由测序肿瘤和正常组织组成的样品，可以使用的调用者是：RegTools、ASGAL、MATS(rMATS)、SUPPA(SUPPA2)、Leafcutter、MAJIQ、JunctionSeq、findAS、Cufflinks/Cuffdiff、IsoformSwitchAnalyzeR、ALEXA-seq、MISO、SplicingCompass、Flux Capacitor、JuncBASE、SpliceR、FineSplice、ARH-seq、Spladder、DEXSeq、edgeR、Limma、DiffSplice、dSpliceType、SpliceDetector、HISAT2、STAR、Subread、Subjunct、PennDiff、DSGseq、AltAnalyze、Splicing Express、SpliceTrap、PSGInfer、FDM、IsoEM2、MADS+、Spanki、SpliceMap、CASPER、AVISPA、PASA、SpliceSeq、MATT、Aspli、IPSA、SANJUAN、VAST-Tools、SpliceV、Asprofile、DESeq2、Yanagi、ABLas、IRIS、和AS-Quant。
HLA分型
在一些实施方案中，可以使用来自肿瘤和/或正常组织的全外显子组测序(WES)和/或RNA测序以鉴定个体患者的MHC 1类和2类基因型。
可以利用单个或多个HLA调用者来鉴定HLA类型。对于DNA测序，可以利用的HLA调用者是：BWAkit、PHLAT、OptiType、HLAMiner、HISAT、HISAT2、xHLA、HLA-Vbseq、GATK HLACaller、PolySolver、HLAReporter、Athlates、HLAseq、HLAssign、SOAP-HLA、STC-SEq、HapLogic、Gyper、HLATyphon、HLA-LA、HLA-PRG、MHC-PRG、Prohlatype、GraphTyper、ALPHLARD、Omixon、SNP2HLA、HLAscan、NeoEpitopePred、和Assign。对于RNA测序，可以利用的HLA调用者是：BWAkit、seq2HLA、PHLAT、HLAProfiler、OptiType、HLAMiner、HLAForest、arcasHLA、HISAT、HISAT2、HLAseq、HLAssign、STC-Seq、HLATyphon、ALPHLARD、Omixon、和HLAscan。
在一些实施方案中，可以使用Polysolver(多态性基因座解析器)分析全外显子组测序数据以进行HLA分型(Shukla等人，2015)。Polysolver是一种用于推断三个主要MHC I类(HLA-A、HLA-B、HLA-C)基因的等位基因的算法。例如，可以使用Polysolver从全外显子组测序数据推断患者的HLA I类等位基因。在其他变化形式中，在没有全外显子组测序数据的情况下，可以通过另一种HLA分型算法从转录组测序数据推断患者的HLA I类等位基因。
在一个实施方案中，在计算机中使用在计算设备上运行的一种或多种技术(如OptiType)进行HLA分型。参见Szolek等人,OptiType:precision HLA typing from next-generation sequencing data,Bioinformatics.2014年12月1日；30(23)，其整体并入本文并用于所有目的。也可以使用各种其他计算机技术。参见Major等人,HLA typing from1000genomes whole genome and whole exome Ilumina data,PLoS One.2013年11月6日；8(11):e78410；Wittig等人,Development of a high-resolution NGS-based HLA-typingand analysis pipeline,Nucl.Acids Res.(2015)。
由肿瘤突变生成肽
在一些实施方案中，如上面标题为“肿瘤突变和/或新表位的检测”一节所述获得突变数据。可以使用单个或多个工具(包括但不限于Varcode、customProDB、和pyGeno)将突变调用转换为突变蛋白序列。这些工具将生成用于下游体外和计算机HLA结合测定的肽序列。此外，在一些实施方案中，肽将经过测试以验证每种肽对人蛋白质组是独特的。可以将肽与来自NCBI的数个不同蛋白质数据库比对，所述数据库包括：非冗余蛋白质序列(Non-redundant protein sequences)、参考蛋白质(Reference proteins)、模式生物(modelorganisms)、UniProtKB/Swiss-Prot、专利蛋白质序列(Patented protein sequences)、蛋白质数据库蛋白质(Protein Data Bank proteins)、宏基因组蛋白质(Metagenomicproteins)、和转录组鸟枪组装蛋白质(Transcriptome Shotgun Assembly proteins)。使用上面列出的数据库，可以利用rBlast运行蛋白质BLAST，以鉴定对人蛋白质组具有100％同一性的蛋白质。
在某些方面，在python中利用Varcode软件以预测基因组变异数据的影响。Varcode从突变和/或新表位生成期望的肽大小的野生型和突变蛋白序列。在某些方面，期望的肽大小为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个氨基酸。在一方面，期望的肽大小为15个氨基酸。
Varcode依赖Pyensembl，它是Ensembl参考基因组数据的python接入点，以生成肽。在一些实施方案中，Varcode预测每个突变对蛋白质的影响。排除了沉默突变和基因组非编码区域中的突变。然后使用Varcode在整个肽序列中生成突变。用计算机方法和/或生化测定进一步分析这些含有Varcode生成的突变的变体肽(即候选新抗原)，以鉴定与来自患者的TIL结合的肽。
新抗原分析
在以上表明的策略(1)和(2)中，传统上限速步是需要从改变肽的体细胞肿瘤变异的通常大型目录中鉴定靶标新抗原的小型集合。最近开发的用于研究肽结合的筛选技术可以解决这种限制。
在一些实施方案中，将新型高度多重肽：靶标蛋白测定与计算机预测配对以鉴定新抗原。例如，将高度多重肽：MHC II类结合测定与MHC I类的计算机预测配对。这使得能够快速、高置信度地鉴定候选新抗原肽：MHC，用于构建新抗原特异性荧光标记和/或刺激性抗原。这些高度多重肽：靶标蛋白结合测定的例子如描述于美国专利号9,958,454；美国专利号10,288,608；美国专利申请公布号2016/0025726；和国际专利申请号PCT/US2021/013774中。
可选地，使用噬菌体展示或相关方法来鉴定候选新抗原肽：MHC。
在其他实施方案中，遗传编码有意义的多肽以促进鉴定新抗原。遗传编码的多肽文库的一个例子是mRNA展示文库。另一个例子是可复制遗传展示包(rgdp)文库，如噬菌体展示文库。在一个实施方案中，将有意义的多肽遗传编码为噬菌体展示文库。在这些实施方案中，核酸可以由噬菌体基因组组成。在这些实施方案中，多肽可以由噬菌体外壳组成。
在一些实施方案中，可以使用本发明以产生遗传编码的多肽组合文库，通过将许多核酸翻译为相应多肽并将所述分子支架的分子连接至所述多肽而生成所述文库。可以通过噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示、细菌展示或mRNA展示来生成遗传编码的多肽组合文库。
高度多重肽：靶标蛋白结合测定
在一些方面，鉴定新抗原包括：提供肽构建体文库，其中文库的每种肽构建体包含肽部分和鉴定肽部分的鉴定核酸部分，并且至少一种肽构建体的肽部分能够特异性结合HLA蛋白或其片段；使HLA蛋白或其片段与肽构建体文库接触；将包含能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的至少一种肽构建体与包含不能特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的肽构建体分离；对能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的至少一种肽构建体的鉴定核酸部分的全部或部分进行测序。在一些方面，每种肽构建体的鉴定核酸部分包含编码肽构建体的肽部分的多核苷酸序列或其互补物。在具体实施中，PepSeq平台用于鉴定候选新抗原。
PepSeq是一种可以快速生成大量潜在新抗原作为分离TIL的候选结合剂的技术。PepSeq是一种生成肽文库(长度为10-50个氨基酸)的方法，每种肽缀合至独特的DNA标签，在结合实验之后可以使用所述DNA标签监测肽丰度。重要地，肽序列可以用于具有多达100000种独特的可编程肽的大型多重结合测定。可以使用任何分子靶标的结合测定以筛选大量不同的PepSeq文库。可以将生物结构(例如分离的TIL群体)与不同的肽混合，从未结合的肽中分离，然后查询那些“粘附(stick)”的肽。具体的文库可以是基于靶标的先前知识(例如来自外显子组测序和分析)智能设计的文库。PepSeq平台更详细地描述于美国专利号9,958,454；美国专利号10,288,608；以及美国专利申请公布号2016/0025726中，其内容通过引用并入本文。
在具体实施中，可以进一步修饰被鉴定为结合至HLA蛋白或其片段的肽构建体，以增强与HLA蛋白或其片段的结合。正是将与HLA蛋白的结合增强的肽用于培养TIL，以产生新抗原特异性TIL。因此，在一些方面，鉴定新抗原进一步包括基于被鉴定为结合至HLA蛋白或其片段的肽构建体(随后称为“第一肽”)生成肽构建体文库，并鉴定第一肽与HLA蛋白或其片段结合的阈值z评分。肽构建体文库包含：包含第一肽的肽构建体，和包含变体肽的多种肽构建体。所述方法进一步包括使HLA蛋白或其片段与肽文库接触，并鉴定与第一肽相比，与HLA蛋白或其片段的结合增强的至少一种变体肽。z评分高于第一肽的已鉴定阈值z评分表明结合增强。通过首先确定肽构建体文库中每种肽构建体的相对丰度水平，然后基于相对丰度水平的相似性将分组肽构建体分组至箱(bin)中，来计算肽的z评分，其中每个箱包含至少300种肽构建体。还根据肽构建体文库中阴性对照肽构建体的相对丰度水平的平均值，对每种肽构建体的相对丰度水平进行归一化。使用箱中每种肽构建体的归一化相对丰度水平来确定每个箱的平均值和标准偏差。根据肽的箱的平均值和标准偏差来计算肽的z评分。在一些方面，确定箱中归一化相对丰度水平的平均值和标准偏差排除了相对丰度水平为异常值的肽构建体。在一些方面，当肽构建体的归一化相对丰度水平在其箱的95％最高密度区间之外时，肽构建体的相对丰度水平为异常值。在某些实施中，将每个箱中5％的肽构建体排除在确定箱中归一化相对丰度水平的平均值和标准偏差之外。
在一些实施方案中，鉴定新抗原进一步包括生成第二肽构建体文库，使HLA蛋白或其片段与第二肽构建体文库接触，以及从第二肽构建体文库中鉴定至少一种变体肽，与第二肽相比，所述变体肽与HLA蛋白或其片段的结合增加。第二肽构建体文库基于第二肽，与第一肽相比，所述第二肽被鉴定为与HLA蛋白或其片段的结合增加，例如通过z评分高于第一肽的阈值z评分进行鉴定。因此，第二肽构建体文库包含：包含第二肽的肽构建体，和包含变体肽的多种第二肽构建体。与第二肽相比，与HLA蛋白或其片段的结合增加的来自第二肽构建体文库的至少一种变体肽的z评分高于第二肽的z评分。
在一些方面，通过完全单残基诱变、滑窗诱变、或丙氨酸扫描或甘氨酸扫描诱变，来产生多个肽构建体的变体肽。在某些实施中，多个变体肽包括通过完全单残基诱变、滑窗诱变、和丙氨酸扫描诱变产生的变体肽的至少一个集合。该方法寻找改进的结合靶标的更多细节见于国际专利申请号PCT/US2021/013774。
噬菌体展示
多年来开发了不同的噬菌体展示系统，利用不同的噬菌体载体(M13丝状噬菌体、λ、T4和T7噬菌体)和各种噬菌体外壳蛋白进行共价融合。进行噬菌体展示的技术和方法可以见于WO 2009/098450中。噬菌体展示例如描述于：Ladner等人，美国专利号5,223,409；Smith(1985)Science 228:1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO92/09690；WO 90/02809；de Haard等人(1999)J.Biol.Chem 274:18218-30；Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4:1-20；Hoogenboom等人(2000)Immunol Today 2:371-8；Fuchs等人(1991)Bio/Technology 9:1370-1372；Hay等人(1992)Hum Antibod Hybridomas 3:81-85；Huse等人(1989)Science246:1275-1281；Griffiths等人(1993)EMBO J 12:725-734；Hawkins等人(1992)J MolBiol226:889-896；Clackson等人(1991)Nature 352:624-628；Gram等人(1992)Proc NatlAcad Sci USA 89:3576-3580；Garrard等人(1991)Bio/Technology 9:1373-1377；Rebar等人(1996)Methods Enzymol.267:129-49；Hoogenboom等人(1991)Nuc Acid Res19:4133-4137；和Barbas等人(1991)PNAS 88:7978-7982。
核糖体展示
在某些方面，本文描述的方法包括使用核糖体展示来鉴定新抗原。核糖体展示可以用于对有意义的蛋白质(例如候选新抗原)进行体外蛋白质合成。核糖体展示也可以用于进行体外蛋白质进化以产生具有期望的特性的蛋白质，例如结合至特定靶标分子的Fab片段。核糖体展示是一种可用于生成文库的众所周知的技术。这种完全体外的方法允许多样性为1016个成员的文库。该过程产生与其RNA起源相关的翻译蛋白质，这些蛋白质可以作为复合物用于选择具有期望的特性(例如结合至固定化的靶标分子)的蛋白质。然后，可以将显示期望的特性(例如高结合亲和力)的RNA-蛋白质复合物逆转录为cDNA，并通过PCR扩增序列。该过程还提供了迭代或蛋白质表达的重复周期。此外，可以在随后的循环中将核酸突变有效地引入选择的核酸文库，导致持续的DNA多样化，从而导致蛋白质进化。最终结果是可以用于产生有意义的蛋白质的核酸序列(例如特异性结合至TIL的新抗原)。
在本文提供的方法中，在核糖体的表面上展示有意义的蛋白质，从中翻译有意义的蛋白质。简要地，在体外翻译系统中将RNA分子文库翻译至RNA分子的3'末端，使得核糖体不会脱落。这是通过在RNA模板中不掺入功能性终止密码子来实现的。通常，释放因子识别终止密码子，所述释放因子触发新生多肽从核糖体中分离。在核糖体展示中，肽从核糖体中出现，但不会脱离复合物。这例如允许新生多肽与另一种多肽结合以形成功能性二聚体。在一些情况下，在氧化环境中有另外的折叠步骤(对于形成二硫键很重要)。
折叠的有意义的蛋白质、核糖体和RNA的整个复合物在数天内稳定，然后可以筛选期望的特性，如通过翻译的有意义的蛋白质特异性结合至结合对配体。可以将编码选择的有意义的蛋白质的RNA逆转录为单链cDNA，其可以转化为双链DNA并通过PCR扩增，以提供选择的蛋白质(例如新抗原)的编码序列。可以在核糖体展示复合物中结合的mRNA上进行逆转录反应，或者可以从核糖体展示复合物中分离mRNA，然后用于逆转录步骤中。用于破坏/解离核糖体复合物的合适方法是本领域已知的，包括EDTA处理和/或苯酚提取。
一般地，用于核糖体展示的核酸(DNA)构建体含有启动子(T7、SP6或T3)、翻译起始信号(如Shine-Dalgarno(原核)或Kozak(真核)序列)、起始密码子、和有意义的蛋白质的编码序列(例如VH或VL链结构域)。可以包括编码一个或多个检测标签的一个或多个核酸序列，以提供产生进一步包含一个或多个检测标签(例如组氨酸标签)的蛋白质。为了能够展示完整的新生蛋白质并使其折叠成其活性构象，可以在C末端添加长度为至少23-30个氨基酸的间隔子结构域，以允许蛋白质完全退出核糖体。间隔子可以为设计用于RT-PCR回收DNA序列的引物提供已知序列。
为了从DNA中去除终止密码子，可以在PCR构建过程中使用缺乏终止密码子的3'引物。为了基于细菌的展示系统设计的构建体可以在DNA的5'和3'末端掺入含有茎环结构的序列，以稳定mRNA，防止无细菌细胞系统中被RNA酶活性降解。
本文描述的方法中使用的mRNA翻译系统可以是任何合适的可用系统。可以使用原核或真核翻译系统，例如大肠杆菌裂解物粗品(商业上可获自例如Promega Corp.,Madison,Wis.；Agilent Technologies,Santa Clara,Calif.；GE HealthcareBiosciences,Pittsburgh,Pa.；Life Technologies,Carlsbad,Calif.)、重组核糖体系统(如PURE，参见例如Shimizu等人,Nat.Biotechnol.,19:751-755(2001))，或如下所述的无细胞蛋白质合成系统。
PURE系统可以包含约32种单独纯化的组分，用于体外蛋白质生物合成(例如起始、延伸和终止)。在一些实施方案中，组分包括起始因子(例如IF1、IF2、IF3)、延伸因子(例如EF-G、EF-Tu、EF-Ts)、释放因子(例如RF1、RF3)、终止因子(例如RRF)、20种氨酰基-tRNA合成酶、甲硫酰基-tRNA转化酶、T7RNA聚合酶、核糖体、46种tRNA、NTP、磷酸肌酸、10-甲酰基-5,6,7,8-四氢叶酸、20种氨基酸、肌酸激酶、肌激酶、核苷二磷酸激酶和焦磷酸酶。
已使用核糖体展示以成功生成对其靶标具有高亲和力的抗体片段。核糖体展示的详细描述见于例如Hanes,J.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:14130-14135(1998)；Schaffitzel等人,J.Immunological Methods,231:119-135(1999)；He等人,J.Immunological Methods,231,105-117(1999)；Roberts R W,Current Opinion inChemical Biology,3:268-273(1999)。
二、用于体外选择的其他展示方法
其他体外文库展示方法可以用于本文描述的方法中，例如但不限于mRNA展示、双顺反子展示、P2A展示、和CIS展示(顺式活性展示)。
mRNA展示
在mRNA展示中，RNA文库的每个成员都通过与嘌呤霉素(一种可以模仿tRNA的氨酰基末端的抗生素)的稳定共价键直接附接至它编码的有意义的蛋白质(参见例如Robert RW和Szostak J W,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94:12297-12302(1997))。嘌呤霉素是一种氨基核苷类抗生素，在原核生物或真核生物中均有活性，源自白黑链霉菌(Streptomycesalboniger)。在核糖体中发生翻译的过程中，过早的链终止会抑制蛋白质合成。分子的一部分作为酪氨酰基-tRNA的3'末端的类似物，其中其结构的一部分模拟腺苷分子，另一部分模拟酪氨酸分子。它进入A位点并转移至生长链，导致形成嘌呤酰化的(puromycylated)新生链和过早的链释放。3'位置含有酰胺键而不是tRNA的正常酯键，使得分子更耐水解并停止沿核糖体推进。
蛋白质合成的其他嘌呤霉素类似物抑制剂包括O-去甲基嘌呤霉素、O-炔丙基嘌呤霉素、9-{3′-脱氧-3′-[(4-甲基-L-苯基丙氨酰基)氨基]-β-D-呋喃核糖基}-6-(N,N′-二甲氨基)嘌呤[L-(4-甲基)-苯基-PANS]和6-二甲氨基-9-[3-(对叠氮基-L-β-苯基丙氨酰氨基)-3-脱氧-β-呋喃核糖基]嘌呤。
RNA文库的成员可以通过接头(例如但不限于多核苷酸或化学接头(例如聚乙二醇))连接至嘌呤霉素(Fukuda等人,Nucleic Acid Research,34(19):e127(2006))。在一些实施方案中，包含RNA的多核苷酸接头在3'末端连接至嘌呤霉素。在其他实施方案中，PEG接头连接至嘌呤霉素。
当连接至RNA分子的3'末端的嘌呤霉素进入核糖体时，由于核糖体中的肽基转移酶活性，它与新生蛋白质(由RNA分子编码)建立共价键。转而在蛋白质和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸部分之间形成稳定的酰胺键。
如本文所述，RNA-嘌呤霉素融合物的RNA文库可以进行体外翻译以生成RNA-嘌呤霉素-蛋白质复合物(例如RNA-嘌呤霉素-新抗原复合物)。在一些实施方案中，RNA-嘌呤霉素融合物包含编码候选新抗原的RNA分子，所述候选新抗原通过来自患者的肿瘤细胞和野生型细胞的外显子组分析进行鉴定。
可以在mRNA展示的蛋白质文库上进行亲和力选择，以筛选具有期望的特性(如特异性结合至结合对配体)的蛋白质。可以在溶液中或在固体载体上进行mRNA展示。可以通过本领域已知的标准方法(如亲和层析法)来纯化选择的mRNA展示的有意义的蛋白质。可以对mRNA进行克隆、PCR扩增和/或测序，以确定选择的有意义的蛋白质的编码序列。在一个实施方案中，选择的mRNA展示文库含有结合至TIL的新抗原群体。
在一些方面，核酸成员文库的成员连接至嘌呤霉素，其中每个成员编码预期有意义的蛋白质，其具有不同于其他核酸成员编码的其他蛋白质的一级氨基酸序列。mRNA展示系统可以含有不同复合物的群体或混合物，使得每个复合物具有不同的连接至嘌呤霉素的mRNA、核糖体、和预期有意义的蛋白质。
双顺反子DNA展示
双顺反子DNA展示可以用于体外选择有意义的蛋白质(参见例如Sumida等人,Nucleic Acid Research,37(22):e147(2009))。该方法基于将翻译的有意义的蛋白质体外复合至它们的编码DNA，使用所述编码DNA以确定有意义的蛋白质的序列。通常地，生成含有多个ORF的DNA模板，所述ORF可以连接至其编码的蛋白质。此外，偶联的转录/翻译反应被区隔在油包水乳液(例如胶束)中。
在一些情况下，当使用多个ORF时，它们可以通过核糖体结合侧分隔。在一些实施方案中，将有意义的蛋白质的编码序列融合至链霉亲和素的编码序列。在一些实施方案中，DNA模板通过接头进行生物素化。接头可以是可切割的。
在体外转录/翻译过程中，蛋白质可以在胶束中表达。在一个非限制性说明性实施方案中，DNA模板含有候选新抗原的编码序列，并且候选新抗原在胶束中表达。在实施方案中，形成候选新抗原，并通过键(如链霉亲和素-生物素连接)使其与编码候选新抗原的DNA结合。DNA展示的有意义的蛋白质(如候选新抗原)可以从乳液中回收并通过亲和力选择进行筛选。可以通过诸如UV照射的方法从复合物中切割出选择的DNA展示的有意义的蛋白质的DNA模板，然后进行PCR扩增、克隆和/或测序。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括生成核酸成员文库，每个成员编码预期有意义的蛋白质(即候选新抗原)，其具有不同于其他核酸成员编码的其他蛋白质的一级氨基酸。在一些实施方案中，文库包含DNA成员，并且所述方法包括将文库转录为RNA，并在无细胞蛋白质合成系统中翻译所述RNA，以在油包水乳液中生成双顺反子DNA展示系统。在一些实施方案中，双顺反子DNA展示系统含有被选择用于特异性结合至结合对配体的有意义的蛋白质群体。在一个实施方案中，双顺反子DNA展示系统含有候选新抗原群体，其中每个候选新抗原与编码候选新抗原的DNA分子结合。
P2A DNA展示
在利用核酸内切酶P2A的顺式活性的P2A DNA展示中，P2A和有意义的蛋白质的融合蛋白结合至表达了所述融合蛋白的同一DNA分子(参见例如Reiersen等人,NucleicAcids Research,33(1):e10)。DNA模板可以含有编码有意义的蛋白质的编码序列，其遗传融合至P2A的编码序列、启动子、和复制起点。可以通过本领域已知的标准方法获得P2A的编码序列并构建与有意义的蛋白质的遗传融合物。
在一些实施方案中，使用P2A DNA展示以选择有意义的蛋白质。可以通过生成融合蛋白文库(其中文库的每个成员包含P2A和有意义的蛋白质之间的融合蛋白)并且基于期望的特性(例如特异性结合至结合对配体)选择有意义的蛋白质，来选择有意义的蛋白质。可以由核酸成员文库构建该文库，所述核酸成员文库中每个成员包含编码不同有意义的蛋白质的DNA模板(即每种有意义的蛋白质具有不同于核酸文库其他成员编码的其他蛋白质的一级氨基酸序列)，所述模板遗传融合至P2A的编码序列。
在一些实施方案中，可以通过亲和力选择策略来筛选P2A DNA展示文库，例如在溶液中或在固体载体上筛选。可以通过例如亲和层析法来纯化选择的有意义的蛋白质，并且可以对复合DNA进行PCR扩增、克隆和/或测序。
CIS展示
与P2A DNA展示类似，CIS展示涉及一种基于DNA的方法，将体外转录/翻译的蛋白质直接连接至编码它们的DNA分子(参见例如Odegrip等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,101(9):2806-2810)。该方法使用RepA(一种DNA复制引发蛋白)，如果DNA分子具有CIS元件，则RepA非共价结合至表达了它的DNA分子。除了RepA之外，还可以产生DNA分子以编码有意义的蛋白质(例如候选新抗原)。
在一些实施方案中，使用CIS展示以选择有意义的蛋白质。可以通过生成融合蛋白的DNA文库(其中每个成员包含RepA和有意义的蛋白质之间的融合蛋白)并且基于期望的特性(例如特异性结合至结合对配体)选择有意义的蛋白质，来选择有意义的蛋白质。可以由DNA文库构建该文库，其中所述DNA文库的每个成员包含编码不同有意义的蛋白质的DNA模板(即每种有意义的蛋白质具有不同于核酸文库其他成员编码的其他蛋白质的一级氨基酸序列)，所述模板遗传融合至RepA的编码序列。
在一些实施方案中，DNA文库的成员含有有意义的蛋白质的编码序列、RepA的编码序列、CIS元件、复制起点和启动子，其中有意义的蛋白质的编码序列遗传融合至RepA的编码序列。CIS元件可以遗传连接至RepA编码序列。
在一些实施方案中，文库含有RepA和有意义的蛋白质之间的融合蛋白，以及编码所述融合蛋白的DNA分子。
可以通过亲和力选择策略来筛选RepA DNA展示的文库，例如在溶液中或在固体载体上筛选。可以通过例如亲和层析法来纯化选择的有意义的蛋白质，并且可以对复合DNA进行PCR扩增、克隆和/或测序。
无细胞蛋白质合成(CFPS)
为了表达本文所述的有意义的生物活性蛋白质(即新抗原)，可以使用无细胞蛋白质合成系统。已开发了在体外合成反应期间支持从纯化的mRNA转录本或从由DNA转录的mRNA体外合成蛋白质的细胞提取物。
在包含细菌提取物和/或限定的试剂的反应混合物中进行多肽的CFPS。反应混合物包含至少：ATP或能量来源；用于生产大分子的模板，例如DNA、mRNA等；氨基酸，和多肽合成所需的辅助因子、酶和其他试剂，例如核糖体、tRNA、聚合酶、转录因子、氨酰基合成酶、延伸因子、起始因子等。在本发明的一个实施方案中，能量来源是稳态能量来源。还可以包含由高能磷酸键催化ATP再生的酶，例如乙酸激酶、肌酸激酶等。此类酶可以存在于用于翻译的提取物中，或者可以添加至反应混合物。此类合成反应体系是本领域众所周知的，并且已描述于文献中。
用于无细胞蛋白质合成的模板可以是mRNA或DNA。模板可以包含任何特定有意义的基因的序列，并且可以编码全长多肽或其任意长度的片段。用作蛋白质合成模板的核酸任选地源自天然来源，或者它们可以是合成的或重组的。例如，DNA可以是重组DNA，例如质粒、病毒等。
如本文所用的术语“反应混合物”是指能够催化由核酸模板合成多肽的反应混合物。反应混合物包含来自细菌细胞的提取物，例如大肠杆菌(E.coli)S30提取物。S30提取物是本领域众所周知的，并且描述于例如Lesley,S.A.等人(1991),J.Biol.Chem.266,2632-8中。可以在有氧或厌氧条件下进行合成。
在一些实施方案中，将细菌提取物干燥。可以将干燥的细菌提取物以原始固体的110％复溶于milli-Q水(例如反渗透水)中，通过测量起始材料的固体百分比来确定。在一个实施方案中，将精确称量的干燥提取物等分试样(代表10mL提取物的原始固体的110％)添加至玻璃烧杯中的10mL Milli-Q水中，所述玻璃烧杯在磁力搅拌器上并带有搅拌棒。搅拌所得混合物直至粉末溶解。除非立即使用，否则溶解后，将材料转移至15mL Falcon管中并储存于-80℃。
提取物在反应混合物中的体积百分比将变化，其中提取物通常至少为总体积的约10％；更通常至少约20％；在一些情况下，当提供至少约50％时，可以提供额外的益处；或至少约60％；通常不超过总体积的约75％。
一般系统包含编码有意义的蛋白质的核酸模板。核酸模板是编码mRNA的RNA分子(例如mRNA)或核酸(例如RNA、DNA)，并且是任何形式(例如线状、环状、超螺旋、单链、双链等)。核酸模板指导产生期望的蛋白质。
为了保持模板，可以选择用于产生提取物的细胞以减少、大量减少或消除有害酶的活性，或选择具有修饰活性的酶的所述细胞。具有修饰的核酸酶或磷酸酶活性(例如具有至少一种突变磷酸酶或核酸酶基因或其组合)的细菌细胞可以用于合成细胞提取物以提高合成效率。例如，用于制造用于CFPS的S30提取物的大肠杆菌菌株可以是RNA酶E或RNA酶A缺陷的(例如通过突变)。
在通用CFPS反应中，编码有意义的蛋白质的基因在转录缓冲液中表达，从而产生mRNA，所述mRNA在CFPS提取物和翻译缓冲液中被翻译成有意义的蛋白质。可以单独添加转录缓冲液、无细胞提取物和翻译缓冲液，或者可以在添加前将这些溶液中的两种或更多种组合，或同时添加。
为了在体外合成有意义的蛋白质，CFPS提取物在一些时候包含编码有意义的蛋白质的mRNA分子。在一些CFPS系统中，mRNA从天然来源纯化后外源添加，或使用RNA聚合酶(如RNA聚合酶II、SP6 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶、T7 RNA聚合酶、RNA聚合酶III和/或源自噬菌体的RNA聚合酶)由克隆的DNA体外合成制备。在其他系统中，mRNA由模板DNA在体外产生；转录和翻译都发生在这种类型的CFPS反应中。在一些实施方案中，转录和翻译系统是偶联的，或者包含互补的转录和翻译系统，其在同一反应中进行RNA和蛋白质两者的合成。在此类体外转录和翻译系统中，CFPS提取物含有在单个系统中转录(产生mRNA)和翻译(合成蛋白质)两者所需的所有组分(外源性或内源性)。
无细胞蛋白质合成反应混合物包含以下组分：模板核酸，如DNA，其包含有意义的基因，所述基因可操作地连接至至少一个启动子和任选一个或多个其他调控序列(例如含有有意义的基因的克隆载体或表达载体)或PCR片段；RNA聚合酶，其识别有意义的基因可操作连接的启动子和任选一种或多种转录因子，所述转录因子指向模板核酸可操作连接的任选调控序列；核糖核苷酸三磷酸(rNTP)；任选地，其他转录因子及其辅助因子；核糖体；转运RNA(tRNA)；其他或任选的翻译因子(例如翻译起始、延伸和终止因子)及其辅助因子；一种或多种能量来源(例如ATP、GTP)；任选地，一种或多种能量再生组分(例如PEP/丙酮酸激酶、AP/乙酸激酶或磷酸肌酸/肌酸激酶)；任选地，提高产率和/或效率的因子(例如核酸酶、核酸酶抑制剂、蛋白质稳定剂、伴侣)及其辅助因子；以及任选地，增溶剂。反应混合物进一步包含蛋白质合成具体所需的氨基酸和其他材料，包括盐(例如乙酸、谷氨酸或硫酸的钾盐、镁盐、铵盐和锰盐)、聚合化合物(例如聚乙二醇、葡聚糖、二乙基氨基乙基葡聚糖、季氨基乙基葡聚糖和氨乙基葡聚糖等)、环AMP、蛋白质或核酸降解酶的抑制剂、蛋白质合成的抑制剂或调节剂、氧化/还原调节剂(例如DTT、抗坏血酸、谷胱甘肽、和/或其氧化物)、非变性表面活性剂(例如Triton X-100)、缓冲组分、精胺、亚精胺、腐胺等。CFPS反应的组分在美国专利号7,338,789和7,351,563、和美国申请公布号2010/0184135中更详细地讨论，其公开内容通过引用以其整体并入并用于所有目的。
根据提取物中存在的特定酶，例如可以选择许多已知的核酸酶、聚合酶或磷酸酶抑制剂中的一种或多种，并且有利地用于提高合成效率。
蛋白质和核酸合成通常需要能量来源。启动转录以产生mRNA需要能量(例如，当使用DNA模板用于启动翻译时，使用例如GTP形式的高能磷酸盐)。核糖体的一个密码子(三个核苷酸；一个氨基酸)的每个后续步骤都需要将另一个GTP水解为GDP。通常还需要ATP。对于将在蛋白质合成过程中聚合的氨基酸，必须首先将其激活。因此，蛋白质和/或核酸合成的进行需要来自高能磷酸键的大量能量。
能量来源是可以被酶加工以提供能量以实现期望的化学反应的化学底物。通常使用允许通过切割高能磷酸键(例如见于核苷三磷酸(例如ATP)中的那些高能磷酸键)释放能量用于合成的能量来源。可转换为高能磷酸键的任何来源都尤其合适。通常可以认为ATP、GTP、和其他三磷酸盐是支持蛋白质合成的等效能量来源。
为了提供能量用于合成反应，系统可以包含添加的能量来源，如葡萄糖、丙酮酸、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、氨甲酰磷酸、乙酰磷酸、磷酸肌酸、磷酸丙酮酸、甘油醛-3-磷酸、3-磷酸甘油酸和葡萄糖-6-磷酸，其可以生成或再生高能三磷酸化合物，如ATP、GTP、其他NTP等。
当合成系统中最初不存在足够的能量时，优选补充另外的能量来源。在体外合成反应过程中也可以添加或补充能量来源。
在一些实施方案中，使用PANOx-SP系统进行无细胞蛋白质合成反应，所述系统包含NTP、大肠杆菌tRNA、氨基酸、乙酸Mg2+、谷氨酸Mg2+、乙酸K+、谷氨酸K+、亚叶酸、Tris pH8.2、DTT、丙酮酸激酶、T7 RNA聚合酶、二硫异构酶、磷酸烯醇丙酮酸(PEP)、NAD、CoA、草酸Na+、腐胺、亚精胺、和S30提取物。
在一些情况下，无细胞合成反应不需要添加通常的二次能源，而是使用氧化磷酸化和蛋白质合成的共激活。在一些情况下，在诸如Cytomim(细胞质模拟物)系统的反应中进行CFPS。Cytomim系统定义为在没有聚乙二醇的情况下进行并具有优化的镁浓度的反应条件。该系统不会积累磷酸盐，已知磷酸盐会抑制蛋白质合成。
可以使用特异性抑制活性氧化磷酸化途径中的步骤的抑制剂(如电子传递链抑制剂)来测试所述途径的存在。氧化磷酸化途径抑制剂的例子包括：毒素类，如氰化物、一氧化碳、叠氮化物、羰基氰化间氯苯腙(CCCP)、和2,4-二硝基苯酚；抗生素类，如寡霉素；杀虫剂类，如鱼藤酮；和琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂，如丙二酸和草酰乙酸。
在一些实施方案中，使用Cytomim系统进行无细胞蛋白质合成反应，所述系统包含NTP、大肠杆菌tRNA、氨基酸、乙酸Mg2+、谷氨酸Mg2+、乙酸K+、谷氨酸K+、亚叶酸、Tris pH 8.2、DTT、丙酮酸激酶、T7 RNA聚合酶、二硫异构酶、丙酮酸钠、NAD、CoA、草酸Na+、腐胺、亚精胺、和S30提取物。在一些实施方案中，Cytomim系统的能量底物是丙酮酸、谷氨酸、和/或葡萄糖。在系统的一些实施方案中，将核苷三磷酸(NTP)替换为核苷单磷酸(NMP)。
可以用碘乙酰胺处理细胞提取物，以灭活可以还原二硫键并损害适当的蛋白质折叠的酶。在一些实施方案中，细胞提取物包含外源性蛋白质伴侣。可以通过用于制造无细胞提取物的细菌菌株表达蛋白质伴侣，或者可以将蛋白质伴侣添加至细胞提取物。外源性蛋白质伴侣的非限制性例子包括二硫键异构酶(PDI)(例如但不限于大肠杆菌DsbC)和肽基脯氨酰基顺反异构酶(PPIase)(例如但不限于FkpA)。在一些实施方案中，提取物包含PDI和PPIase两者，例如DsbC和FkpA两者。也可以将谷胱甘肽二硫化物(GSSG)和/或谷胱甘肽(GSH)添加至提取物，其比例使得能够促进适当的蛋白质折叠并防止形成异常的蛋白质二硫化物。
在一些实施方案中，CFPS反应包括反转的膜囊泡以进行氧化磷酸化。可以在制备细胞提取物过程的高压均质步骤中形成这些囊泡，如本文所述，并保留在用于反应混合物中的提取物中。
制备细胞提取物的方法例如描述于Zawada,J.“Preparation and Testing ofE.coli S30 In Vitro Transcription Translation Extracts”,Douthwaite,J.A.和Jackson,R.H.(编辑),Ribosomal display and Related Technologies:Methods andProtocols,Methods in Molecular Biology,vol.805,pp.31-41(Humana Press,2012)；Jewett等人,Molecular Systems Biology:4,1-10(2008)；Shin J.和Norieaux V.,J.Biol.Eng.,4:8(2010)中。简要地，培养和收获细菌培养物；将其悬浮于合适的缓冲液(例如S30缓冲液)中，并匀浆以裂解细胞。
可以在用于CFPS反应之前将无细胞提取物解冻至室温。当合成具有二硫键的蛋白质时，可以将提取物与50μM碘乙酰胺一起孵育30分钟。在一些实施方案中，CFPS反应包含约30％(v/v)碘乙酰胺处理的提取物，其具有约8mM谷氨酸镁、约10mM谷氨酸铵、约130mM谷氨酸钾、约35mM丙酮酸钠、约1.2mM AMP、各自约0.86mM的GMP、UMP和CMP、约2mM氨基酸(酪氨酸约1mM)、约4mM草酸钠、约0.5mM腐胺、约1.5mM亚精胺、约16.7mM磷酸钾、约100mM T7 RNA聚合酶、约2-10μg/mL质粒DNA模板、约1-10μM大肠杆菌DsbC、和总浓度约2mM的氧化(GSSG)谷胱甘肽。任选地，无细胞提取物可以包含1mM还原GSH。
生成裂解物
本文描述的方法和系统可以使用细胞裂解物对有意义的靶标蛋白质进行体外翻译。为方便起见，用作裂解物来源的生物体可以称为来源生物体或宿主细胞。宿主细胞可以是细菌、酵母、哺乳动物或植物细胞，或能够合成蛋白质的任何其他类型的细胞。裂解物包含能够翻译编码期望的蛋白质的信使核糖核酸(mRNA)的组分，并且任选地包含能够转录编码期望的蛋白质的DNA的组分。此类组分包括，例如：DNA指导的RNA聚合酶(RNA聚合酶)、启动编码期望的蛋白质的DNA转录所需的任何转录激活因子、转运核糖核酸(tRNA)、氨酰基-tRNA合成酶、70S核糖体、N10-甲酰基四氢叶酸、甲酰甲硫氨酸-tRNAfMet合成酶、肽基转移酶、起始因子(如IF-1、IF-2和IF-3)、延伸因子(如EF-Tu、EF-Ts和EF-G)、释放因子(如RF-1、RF-2和RF-3)等。
实施方案使用裂解物所源自的细菌细胞。本发明的方法可以使用源自任何细菌菌株的细菌裂解物。可以如下获得细菌裂解物。在许多生长培养基中的任一种中，在本领域众所周知并且由实践者容易地优化以用于具体细菌的生长的生长条件下，使选择的细菌生长至对数期。例如，用于合成的天然环境利用源自细菌细胞的细胞裂解物，所述细菌细胞在含有葡萄糖和磷酸盐的培养基中生长，其中所述葡萄糖存在的浓度为至少约0.25％(重量/体积)，更通常至少约1％；并且通常不超过约4％，更通常不超过约2％。这种培养基的一个例子是2YTPG培养基，然而本领域技术人员将理解的是，许多培养基可以适应此目的，因为有许多公布的培养基适合细菌(如大肠杆菌)的生长，使用定义和未定义的营养来源。可以通过将细胞沉淀悬浮于合适的细胞悬浮缓冲液中来裂解已过夜收获的细胞，并通过超声处理、在弗氏压碎器(French press)中连续流动高压均质化来破碎悬浮细胞、或本领域已知的任何其他可用于有效细胞裂解的方法来破碎悬浮细胞。然后将细胞裂解物离心或过滤以去除大的DNA片段和细胞碎片。
用于制造细胞裂解物的细菌菌株一般具有降低的核酸酶和/或磷酸酶活性，以提高无细胞合成效率。例如，用于制造无细胞提取物的细菌菌株可以具有编码核酸酶RNA酶E和RNA酶A的基因中的突变。菌株还可以具有稳定细胞合成反应的组分的突变，如诸如tnaA、speA、sdaA或gshA的基因中的缺失，这些基因在无细胞合成反应中分别防止氨基酸色氨酸、精氨酸、丝氨酸和半胱氨酸的降解。此外，菌株可以具有稳定无细胞合成的蛋白质产物的突变，如蛋白酶ompT或lonP中的敲除。
没有终止密码子的DNA表达盒
在一些实施方案中，核糖体展示反应系统中使用的核酸模板包含DNA表达盒，其能够表达编码有意义的蛋白质的RNA，其中所述RNA缺乏可操作的终止密码子。为了从表达盒中的蛋白质编码区去除终止密码子，可以使用缺少终止密码子的PCR引物来扩增有意义的蛋白质的编码区，使得从翻译起点至编码C-末端氨基酸的序列的整个编码区被扩增。
用新抗原文库进行MHC结合测定
主要组织相容性复合体(MHC)是编码称为MHC蛋白的糖蛋白的基因集合。MHC蛋白在体内的主要功能是以能够被TCR识别的形式呈递抗原。MHC蛋白以抗原肽的形式结合至抗原，以形成MHC-肽复合物。
MHC蛋白在人中也称为人白细胞抗原(HLA)，在小鼠中也称为H-2区，其分为两类：I类和II类MHC蛋白。这些蛋白质由一簇高度多态性基因组成。具体地，人HLA-A、HLA-B和HLA-C称为I类MHC分子，而人HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR称为II类MHC分子。HLA基因座包括HLA-DP、HLA-DN、HLA-DM、HLA-DO、HLA-DQ、HLA-DR、HLA-A、HLA-B和HLA-C。这些基因座各自含有人群中的不同等位基因。由这些等位基因变异编码的不同亚型旨在在本发明的保护范围内。
MHC II类蛋白是异二聚体整合膜蛋白，其包含非共价连接的一条α链和一条β链。α链具有两个细胞外结构域(α1和α2)、跨膜(TM)结构域和细胞质(CYT)结构域。β链含有两个细胞外结构域(β1和β2)、TM和CYT结构域。MHC I类蛋白是整合膜蛋白，其包含糖蛋白重链，所述重链具有三个细胞外结构域(即α1、α2和α3)、TM和CYT结构域。重链与称为β2-微球蛋白(β2m)的可溶性亚基非共价结合。
在一些实施方案中，本发明的结合测定(例如MHC-PepSeq测定)采用使用通过可加工接头连接至MHC II类组分(例如β链)的空间占位物分子。本发明的空间占位物分子可以是能够结合至MHC蛋白的肽结合槽的任何肽，其结合方式阻碍任何其他肽在肽结合槽中结合。优选地，空间占位物分子以中等亲和力在肽结合槽内结合，更优选以低亲和力结合，在大约中性的pH下结合。在一个实施方案中，空间占位物分子的长度为约5个至约40个氨基酸残基，更优选约6个至约30个氨基酸残基，8个至约20个氨基酸残基，甚至更优选约12个至15个氨基酸残基。在进一步的实施方案中，空间占位物分子为约13个氨基酸残基。合适的空间占位物分子的例子包括但不限于(以单字母氨基酸代码表示)：PVSKMRMATPLLMQA(SEQ IDNO：73)，也称为CLIP；AAMAAAAAAAMAA(SEQ ID NO：74)；AAMAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：75)；AAFAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：76)；ASMSAASAASMAA(SEQ ID NO：77)，及其功能等同物。在一个实施方案中，空间占位物分子将具有共有序列AAXAAAAAAAXAA(SEQ ID NO：78)，其中X是任何氨基酸。将空间占位物分子保持在MHC II类分子的结合槽内的能力防止形成“空的(empty)”分子。由于这些“空的”分子聚集的趋势，形成“空的”MHC II类分子一直是主要的限制因素，使得难以分离功能性MHC II类组分。
本发明的空间占位物分子可以通过接头共价连接至MHC分子，所述接头具有含有能够切割蛋白质的酶的靶位点的氨基酸序列。此类接头在本文中称为“可加工接头”。本发明的可加工接头的例子包括含有酶(如胶原酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、激肽释放酶、凝血酶、和纤溶酶原激活物)的靶位点的接头。本发明优选的可加工接头包括具有凝血酶切割位点的接头。
也可以使用各种方法设计可用于本发明的合适接头。例如，可以使用MHC蛋白的X射线晶体学数据来设计适当长度和电荷的接头，使得接头不会干扰空间占位物分子结合至MHC II类组分的肽结合槽。此类方法包括在本发明中。
本发明的接头的长度优选足够短(即尺寸足够小)，使得接头不会实质上抑制空间占位物分子与MHC II类组分之间的结合。本发明的接头的长度范围可以为约1个氨基酸残基至约40个氨基酸残基，更优选约5个氨基酸残基至约30个氨基酸残基，甚至更优选约8个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。
接头的切割促进空间占位物分子的释放，从而释放肽结合槽。然后将MHC II类组分与候选新抗原文库(例如由肿瘤和野生型细胞的外显子组分析设计的肽PepSeq文库)孵育，以促进抗原肽分子结合至MHC II类组分。在允许结合的足够时间(其可以由本领域技术人员容易地确定)之后，回收已结合至抗原肽分子的MHC II类组分。
在某些实施方案中，使用不同的抗原肽分子，重复切割接头并与抗原肽分子孵育的步骤。重复这些步骤的优点是允许形成识别数种抗原表位的许多MHC II类组分。此外，可以使用由MHC II类基因的不同等位基因形式构建的MHC II类分子来进行这些步骤。因此，该测定的这种特征允许生成对许多不同的MHC等位基因型具有特异性的数种MHC II类组分。
可选地，本发明的结合测定(例如MHC-PepSeq测定)采用噬菌体展示系统(参见例如Hammer J等人,Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-bindingpeptides,Cell(1993)74(1):197-203)。用噬菌体展示表达MHC II组分。然后将表达MHC II组分的噬菌体与候选新抗原文库(例如由肿瘤和野生型细胞的外显子组分析设计的肽PepSeq文库)孵育，以促进抗原肽分子结合至MHC II类组分。在允许结合的足够时间(其可以由本领域技术人员容易地确定)之后，回收已结合至抗原肽分子的MHC II类组分。
在某些方面，使用计算机分析确定新抗原与MHC I类蛋白或其片段之间的特异性结合。计算机分析包括根据新抗原的肽序列，应用计算算法来预测与MHC I蛋白的相对结合。诸如netMHCpan的工具用于预测肽/新抗原与MHC蛋白的结合(参见Jurtz等人,NetMHCpan-4.0:Improved Peptide-MHC Class I Interaction PredictionsIntegrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data,J Immunol(2017)199(9):3360-3368)。该分析的输入是肽序列和有意义的MHC等位基因，输出是预测的结合亲和力。
TIL与新抗原的孵育
在某些方面，将在MHC结合测定或计算机中显示出与MHC I类分子或MHC II类分子结合的新抗原合并以形成肽混合物，并且将该肽混合物与由患者肿瘤分离的TIL孵育。在与肽混合物孵育后，生成肽特异性富集的TIL群体(见图2)。
在一些方面，将TIL与肽混合物孵育约6小时、12小时、18小时、24小时、48小时、或72小时。在其他方面，将TIL与肽混合物孵育约1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、或更长时间。在其他方面，将TIL与肽混合物孵育的时间在1天和10天之间(例如在1天和10天之间、在1天和9天之间、在1天和8天之间、在1天和7天之间、在1天和6天之间、在1天和5天之间等)。
在一方面，在6孔组织处理的板中，在约2.5μg/mL肽混合物的存在下，在补充有HEPES、L-谷氨酰胺、人血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、和2-巯基乙醇的RPMI 1640中培养约2.5×106个TIL 8天，然后进行REP(快速扩增)。
新抗原特异性TIL的扩增
在某些方面，产生新抗原特异性TIL是2步的过程。在REP前(快速扩增)阶段，TIL在标准实验室培养基(如RPMI)中生长，并用试剂(如辐照饲养层细胞和抗CD3抗体)处理TIL，以达到期望的效果。在REP阶段，将TIL扩增至足够大的培养量，用于治疗患者。
在一些实施方案中，产生新抗原特异性TIL是快速扩增阶段，其中TIL在补充有HEPES、L-谷氨酰胺、人血清、丙酮酸钠、非必需氨基酸、2-巯基乙醇、IL-2(或其他细胞因子)、和抗CD3抗体的标准实验室培养基(如RPMI 1640)中生长，并与辐照饲养层细胞培养，以达到期望的效果。
可以通过本领域已知的任何方法完成肿瘤浸润性淋巴细胞(如T细胞)的扩增。例如，使用非特异性T细胞受体刺激，在饲养层淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)、IL-7、IL-15、IL-21、或其组合的存在下，可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可以包括约30ng/ml的OKT3，小鼠单克隆抗CD3抗体(可获自Ortho-
Figure BDA0004030634470000331
Raritan,N.J.或MiltenyiBiotec,Bergisch Gladbach,德国)。可选地，可以在T细胞生长因子的存在下(如约200-400Ill/ml，如300IU/ml IL-2或IL-15，优选IL-2)，通过用一种或多种抗原(包括其抗原部分，如表位或癌症的细胞，其可以任选地从载体表达，如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如约0.3μM MART-1:26-35(27L)或gp100:209-217(210M))体外刺激外周血单个核细胞(PBMC)来快速扩增T细胞。通过用相同癌症抗原脉冲(pulse)表达HLA-A2的抗原呈递细胞的再刺激来迅速扩增体外诱导的T细胞。可选地，例如，可以用辐照的自体淋巴细胞或辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激T细胞。
可选地或另外，可以在饲养层细胞(例如辐照的同种异体饲养层细胞、辐照的自体饲养层细胞、和/或人工抗原呈递细胞(例如用编码CD3和/或CD8的核酸转导的K562白血病细胞)和白细胞介素-2(IL-2)或白细胞介素-15(IL-15)(优选IL-2)的存在下，使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增TIL。在该方法的实施方案中，使用约1×109个至约4×109个同种异体饲养层细胞和/或自体饲养层细胞，优选约2×109个至约3×109个同种异体饲养层细胞和/或自体饲养层细胞，来扩增TIL的数量。非特异性T细胞受体刺激可以包括，例如，约30ng/ml的OKT3，小鼠单克隆抗CD3抗体(可获自Ortho-Mcneil,Raritan,N.J.或MiltenyiBiotech,Auburn,Calif.)。可选地，例如，可以在T细胞生长因子的存在下(如300IU/ml IL-2或IL-15，优选IL-2)，通过用癌症的抗原(一种或多种，包括其抗原部分，如表位或细胞；其可以任选地从载体表达，如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gp100:209-217(210M))体外刺激TIL来快速扩增TIL。其他合适的抗原可以包括，例如，NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2、和VEGFR2、或其抗原部分。此外，可以使用本文描述的方法鉴定的新抗原。通过用相同癌症抗原脉冲表达HLA-A2的抗原呈递细胞的再刺激来迅速扩增体外诱导的TIL。可选地，例如，可以用例如辐照的自体淋巴细胞或辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激TIL。
可以通过本领域已知的任何方法来测试扩增的TIL的特异性肿瘤反应性，例如通过在与肿瘤细胞共培养后测量细胞因子释放(例如干扰素-γ)来测试。在一些实施方案中，将促进自体T细胞生长和激活的T细胞生长因子与自体T细胞同时施用于哺乳动物，或者在自体T细胞之后施用于哺乳动物。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞的生长和激活的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的例子包括白细胞介素(IL)-2、IL-7、IL-15、IL-12和IL-21，它们可以单独使用或以各种组合使用，如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL-2。
TIL的基因组编辑
通过(a)兆核酸酶，(b)锌指核酸酶(ZFN)，(c)转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)，(d)mega-TALEN或(e)CRISPR-Cas系统，完成将识别新抗原的TCR的基因序列引入通用供体T细胞。本领域众所周知使用这些工程化核酸酶中每一种的技术。
在一些实施方案中，修饰TIL以抑制一个或多个基因的表达。在一些实施方案中，通过基因组编辑进一步修饰TIL。已描述了用于靶向切割基因组DNA的各种方法和组合物。此类靶向切割事件可以用于，例如，诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失、8,110,379、8,409,861、8,586,526、美国专利公布20030232410、20050208489、20050026157、20050064474、20060063231、201000218264、20120017290、20110265198、20130137104、20130122591、20130177983和20130177960，其公开内容通过引用以其整体并入。
这些方法通常涉及使用工程化切割系统来在靶标DNA序列中诱导双链断裂(DSB)或切口，使得通过由错误产生(error born)的过程(如非同源末端连接(NHEJ))修复断裂或使用修复模板(同源定向修复或HDR)修复可以导致基因敲除或插入有意义的序列(靶向整合)。可以通过使用特定的核酸酶(如工程化的锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN))来实现切割，或者使用CRISPR/Cas系统以及工程化的crRNA/示踪RNA(“单向导RNA”)来指导特异性切割。
在一些实施方案中，修饰TIL以破坏或减少内源性T细胞受体基因的表达(参见例如WO 2014/153470)。在一些实施方案中，修饰工程化免疫细胞以导致破坏或抑制PD1、PDL-1或CTLA-4(参见例如美国专利公开20140120622)或本领域已知的其他免疫抑制因子(Wu等人(2015)Oncoimmunology 4(7):el016700,Mahoney等人(2015)Nature Reviews DrugDiscovery 14,561-584)。
用于患者特异性新抗原反应性的平行基因转移的通用供体细胞可以源自任何T细胞的来源。在一方面，由脐带血T细胞生成通用供体T细胞。使用脐带血T细胞对本发明是有利的，因为它们在移植受体中具有幼稚的表型、巨大的增殖潜力和强大的体内活性。因此，可以从获得脐带血样品开始产生通用供体细胞。脐带血样品可以是任何类型的样品。例如，脐带血样品可以是新鲜脐带血或冷冻脐带血。脐带血样品可以源自一个个体。脐带血样品可以源自多个个体，例如合并的脐带血样品。
可以通过从样品中分离表达CD62L的细胞来从脐带血样品中获得脐带血T细胞。可以使用任何适当的方法来从样品中分离表达CD62L的细胞。例如，可以基于结合抗CD62L抗体的能力来从样品中分离表达CD62L的细胞。
可以使用荧光激活细胞分选(FACS)或磁激活细胞分选(MACS)来从样品中分离表达CD62L的细胞。在MACS中，磁珠与抗CD62L抗体缀合。因此，表达CD62L的细胞与抗CD62L抗体结合，使得细胞被磁珠标记。因此，可以使用磁性来从样品中分离被标记的细胞。
可以手动进行分离步骤。可选地，可以在设计用于自动分离细胞的系统中进行分离步骤。在一方面，系统配置为自动化产生脐带T细胞。系统可以是CliniMacs系统或Miltenyi Prodigy系统。其他自动细胞分离系统是本领域已知的。
TIL的施用
根据本文提供的方法施用TIL可以以将细胞施用于受试者的任何合适的方式进行，包括但不限于注射、输液、植入或移植。在一些实施方案中，将TIL皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌肉内、鞘内、通过静脉内或淋巴内注射、或腹膜内施用于患者。在一些实施方案中，将TIL施用至由切除肿瘤组织形成的腔中(例如腔内递送)，或在切除之前直接施用至肿瘤中(例如肿瘤内递送)。在一个实施方案中，TIL通过静脉内注射施用。
在实施方案中，本发明包括一种用TIL群体治疗癌症的方法，其中在输注根据本发明的TIL之前，用非清髓性化疗对患者进行预治疗。在一些实施方案中，可以提供TIL群体，其中在输注根据本发明的TIL之前，用非清髓性化疗对患者进行预治疗。
在实施方案中，非清髓性化疗是环磷酰胺60mg/kg/d持续2天(TIL输注前第27天和第26天)和氟达拉滨25mg/m2/d持续5天(TIL输注前第27天至第23天)。在实施方案中，在非清髓性化疗和根据本发明的TIL输注(第0天)之后，患者每8小时以720000IU/kg接受静脉输注IL-2至生理耐受。
实验结果表明，通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争元素(“细胞因子下沉(cytokine sink)”)，在过继转移肿瘤特异性T淋巴细胞之前清除淋巴细胞在增强治疗效果方面发挥关键作用。因此，本发明的一些实施方案在引入本发明的TIL之前对患者采用清除淋巴细胞步骤(有时也称为“免疫抑制预处理”)。
治疗癌症的方法
通过公开的组合物和方法治疗的癌症可以是可以对其产生TIL的任何实体瘤。癌症也可以是转移性和/或复发性的。癌症的非限制性例子包括：急性淋巴细胞癌、急性髓系白血病、腺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳腺癌、肛门癌、肛管癌或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈癌、胆囊癌或胸膜癌、鼻癌、鼻腔癌或中耳癌、外阴癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓系癌、宫颈癌、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、腹膜癌、网膜癌和系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、软组织癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌、尿道膀胱癌和消化道癌(例如食道癌、胃癌、胰腺癌、胃癌、小肠癌、胃肠类癌肿瘤、口腔癌、结直肠癌、和肝胆癌)。
三阴性乳腺癌(TNBC)占所有乳腺癌的约15％，是高度侵袭性肿瘤类型，其缺乏雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、和ERBB2(HER2)基因扩增。TNBC对激素治疗(如他莫昔芬)或芳香酶抑制剂或靶向HER2受体的疗法(如赫赛汀(曲妥珠单抗))无应答。因为可用于TNBC的靶点有限，所以目前对寻找新靶点从而有可以治疗该类型乳腺癌的个性化药物有强烈的意义。因此，在一些实施方案中，癌症是三阴性乳腺癌(TNBC)。
组合癌症疗法
公开的组合物和方法可以与其他癌症免疫疗法组合使用。有两种不同类型的免疫疗法：被动免疫疗法使用免疫系统的组分来使靶向细胞毒性活性针对癌细胞，而不必在患者中启动免疫应答，而主动免疫疗法则积极触发内源性免疫应答。被动策略包括使用B细胞应答特定抗原而产生的单克隆抗体(mAb)。1970年代杂交瘤技术的发展和肿瘤特异性抗原的鉴定允许药物开发mAb，所述mAb可以特异性靶向肿瘤细胞以使其被免疫系统破坏。到目前为止，mAb一直是免疫疗法的最成功案例；2012年最畅销的前三抗癌药物是mAb。其中有利妥昔单抗(美罗华，Genentech)，其结合至B细胞恶性肿瘤(如非霍奇金淋巴瘤(NHL))表面高度表达的CD20蛋白。利妥昔单抗被FDA批准与化疗组合用于治疗NHL和慢性淋巴细胞白血病(CLL)。另一个重要的mAb是曲妥珠单抗(赫赛汀，Genentech)，其通过靶向HER2的表达，彻底变革了HER2(人表皮生长因子受体2)阳性乳腺癌的治疗。
已开发了治疗性癌症疫苗以积极驱动抗肿瘤免疫应答。与预防性用于治疗传染病的预防性疫苗不同，治疗性疫苗被设计为通过刺激针对特定肿瘤相关抗原的免疫应答来治疗已确定的癌症。基于IMPACT(免疫疗法前列腺腺癌治疗)试验的结果，其中与安慰剂相比，sipuleucel-T使OS改善了4.1个月，并使死亡风险降低了22％，2010年，sipuleucel-T(Provenge，Dendreon Corporation)被FDA批准用于治疗转移性、去势抵抗性前列腺癌。主动免疫疗法的优点在于，它们具有通过参与先天免疫应答和适应性免疫应答两者来提供持久的抗癌活性的潜力。虽然通常认为mAb是被动免疫疗法，但越来越多的证据表明，它们也通过“疫苗接种样”作用来诱导适应性免疫反应。
生成最佳的“杀伤”CD8 T细胞应答还需要T细胞受体激活和共刺激，这可以通过连接肿瘤坏死因子受体家族成员(包括OX40(CD134)和4-1BB(CD137))来提供。OX40特别有意义，因为用激活(激动剂)抗OX40 mAb治疗会增强T细胞分化和细胞溶解功能，导致增强针对多种肿瘤的抗肿瘤免疫力。
许多抗癌药物可用于与本发明的方法和组合物组合。以下是抗癌(抗肿瘤)药物的非详尽清单，所述药物可以与辐照联合或不联合使用：阿西维辛(Acivicin)、阿柔比星(Aclarubicin)、盐酸阿考达唑(Acodazole Hydrochloride)、阿克罗宁(AcrQnine)、阿多来新(Adozelesin)、阿地白介素(Aldesleukin)、六甲蜜胺(Altretamine)、安波霉素(Ambomycin)、醋酸阿美坦醌(Ametantrone Acetate)、氨鲁米特(Aminoglutethimide)、安吖啶(Amsacrine)、阿那曲唑(Anastrozole)、安曲霉素(Anthramycin)、天冬酰胺酶(Asparaginase)、曲林菌素(Asperlin)、阿扎胞苷(Azacitidine)、阿扎替派(Azetepa)、含氮霉素(Azotomycin)、巴马司他(Batimastat)、苯佐替派(Benzodepa)、比卡鲁胺(Bicalutamide)、盐酸比生群(Bisantrene Hydrochloride)、二甲磺酸双奈法德(Bisnafide Dimesylate)、比折来新(Bizelesin)、硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)、布喹那钠(Brequinar Sodium)、溴匹立明(Bropirimine)、白消安(Busulfan)、放线菌素C(Cactinomycin)、卡鲁睾酮(Calusterone)、卡醋胺(Caracemide)、卡贝替姆(Carbetimer)、卡铂(Carboplatin)、卡莫司汀(Carmustine)、盐酸卡柔比星(Carubicin Hydrochloride)、卡折来新(Carzelesin)、西地芬戈(Cedefingol)、苯丁酸氮芥(Chlorambucil)、西罗霉素(Cirolemycin)、顺铂(Cisplatin)、克拉屈滨(Cladribine)、甲磺酸克立那托(CrisnatolMesylate)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、阿糖胞苷(Cytarabine)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素D(Dactinomycin)、盐酸柔红霉素(DaunorubicinHydrochloride)、地西他滨(Decitabine)、右奥马铂(Dexormaplatin)、地扎胍宁(Dezaguanine)、甲磺酸地扎胍宁、亚胺醌(Diaziquone)、多西他赛(Docetaxel)、阿霉素(Doxorubicin)、盐酸阿霉素、屈洛昔芬(Droloxifene)、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸屈他雄酮(Dromostanolone Propionate)、偶氮霉素(Duazomycin)、依达曲沙(Edatrexate)、盐酸依氟鸟氨酸(Eflomithine Hydrochloride)、依沙芦星(Elsamitrucin)、恩洛铂(Enloplatin)、恩普氨酯(Enpromate)、依匹哌啶(Epipropidine)、盐酸表柔比星(Epirubicin Hydrochloride)、厄布洛唑(Erbulozole)、盐酸依索比星(EsorubicinHydrochloride)、雌莫司汀(Estramustine)、雌莫司汀磷酸钠、依他硝唑(Etanidazole)、乙碘油I 131(Ethiodized Oil I 131)、依托泊苷(Etoposide)、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺(Etoprine)、盐酸法倔唑(Fadrozole Hydrochloride)、法扎拉滨(Fazarabine)、维甲酰酚胺(Fenretinide)、氟尿苷(Floxuridine)、磷酸氟达拉滨(Fludarabine Phosphate)、氟尿嘧啶(Fluorouracil)、氟西他滨(Flurocitabine)、磷喹酮(Fosquidone)、福司曲星钠(Fostriecin Sodium)、吉西他滨(Gemcitabine)、盐酸吉西他滨、金Au 198、羟基脲(Hydroxyurea)、盐酸伊达比星(Idarubicin Hydrochloride)、异环磷酰胺(Ifosfamide)、伊莫福新(Ilmofosine)、异丙铂(Iproplatin)、盐酸伊立替康(IrinotecanHydrochloride)、醋酸兰瑞肽(Lanreotide Acetate)、来曲唑(Letrozole)、醋酸亮丙瑞林(Leuprolide Acetate)、盐酸利阿唑(Liarozole Hydrochloride)、洛美曲索钠(Lometrexol Sodium)、洛莫司汀(Lomustine)、盐酸洛索蒽醌(LosoxantroneHydrochloride)、马索罗酚(Masoprocol)、美登素(Maytansine)、盐酸氮芥(Mechlorethamine Hydrochloride)、醋酸甲地孕酮(Megestrol Acetate)、醋酸美仑孕酮(Melengestrol Acetate)、美法仑(Melphalan)、美诺立尔(Menogaril)、巯嘌呤(Mercaptopurine)、甲氨蝶呤(Methotrexate)、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶(Metoprine)、美妥替哌(Meturedepa)、米丁度胺(Mitindomide)、米托卡星(Mitocarcin)、丝裂红素(Mitocromin)、丝裂吉菌素(Mitogillin)、丝裂马菌素(Mitomalcin)、丝裂霉素(Mitomycin)、丝裂帕菌素(Mitosper)、米托坦(Mitotane)、盐酸米托蒽醌(MitoxantroneHydrochloride)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、诺考达唑(Nocodazole)、诺拉霉素(Nogalamycin)、奥马铂(Ormaplatin)、奥昔舒仑(Oxisuran)、紫杉醇(Paclitaxel)、培门冬酶(Pegaspargase)、培利霉素(Peliomycin)、奈莫司汀(Pentamustine)、硫酸培洛霉素(Peplomycin Sulfate)、培磷酰胺(Perfosfamide)、哌泊溴烷(Pipobroman)、哌泊舒凡(Piposulfan)、盐酸吡罗蒽醌(Piroxantrone Hydrochloride)、光辉霉素(Plicamycin)、普洛美坦(Plomestane)、卟吩姆钠(Porfimer Sodium)、泊非霉素(Porfiromycin)、泼尼莫司汀(Prednimustine)、盐酸丙卡巴肼(Procarbazine Hydrochloride)、嘌呤霉素(Puromycin)、盐酸嘌呤霉素、吡唑霉素(Pyrazofurin)、利波腺苷(Riboprine)、吡鲁米特(Rogletimide)、沙芬戈(Safmgol)、盐酸沙芬戈、司莫司汀(Semustine)、辛曲秦(Simtrazene)、磷乙酰天冬氨酸钠(Sparfosate Sodium)、稀疏霉素(Sparsomycin)、盐酸锗螺胺(Spirogermanium Hydrochloride)、螺莫司汀(Spiromustine)、螺铂(Spiroplatin)、链黑霉素(Streptonigrin)、链脲佐菌素(Streptozocin)、氯化锶Sr 89、磺氯苯脲(Sulofenur)、他利霉素(Talisomycin)、紫杉烷(Taxane)、紫杉化合物(Taxoid)、替可加兰钠(Tecogalan Sodium)、替加氟(Tegafur)、盐酸替洛蒽醌(TeloxantroneHydrochloride)、替莫泊芬(Temoporfin)、替尼泊苷(Teniposide)、替罗昔隆(Teroxirone)、睾内酯(Testolactone)、硫咪嘌呤(Thiamiprine)、硫鸟嘌呤(Thioguanine)、噻替派(Thiotepa)、噻唑呋林(Tiazofurin)、替拉扎明(Tirapazamine)、盐酸拓扑替康(Topotecan Hydrochloride)、柠檬酸托瑞米芬(Toremifene Citrate)、醋酸曲托龙(Trestolone Acetate)、磷酸曲西立滨(Triciribine Phosphate)、三甲曲沙(Trimetrexate)、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林(Triptorelin)、盐酸妥布氯唑(Tubulozole Hydrochloride)、尿嘧啶氮芥(Uracil Mustard)、乌瑞替哌(Uredepa)、伐普肽(Vapreotide)、维替泊芬(Verteporfin)、硫酸长春花碱(Vinblastine Sulfate)、硫酸长春新碱(Vincristine Sulfate)、长春地辛(Vindesine)、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定(Vinepidine Sulfate)、硫酸长春甘酯(Vinglycinate Sulfate)、硫酸长春素(Vinleurosine Sulfate)、酒石酸长春瑞滨(Vinorelbine Tartrate)、硫酸长春罗定(Vinrosidine Sulfate)、硫酸长春利定(Vinzolidine Sulfate)、伏氯唑(Vorozole)、折尼铂(Zeniplatin)、净司他丁(Zinostatin)、盐酸佐柔比星(Zorubicin Hydrochloride)。
公开的组合物和方法可以与一种或多种免疫检查点抑制剂组合使用。免疫检查点抑制剂是指在检查点信号途径中抑制蛋白质的化合物。检查点信号途径中的蛋白质包括，例如，CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、TIGIT、Lair1、CD244、HAVCR2、CD200、CD200R1、CD200R2、CD200R4、LILRB4、PILRA、ICOSL、4-1BB或VISTA。免疫检查点抑制剂是本领域已知的。
例如，免疫检查点抑制剂可以是小分子。小分子可以是例如：核酸、肽、多肽、拟肽、碳水化合物、脂质或其他有机或无机分子。
可选地，免疫检查点抑制剂是抗体或其片段。例如，抗体或其片段对检查点信号通路中的蛋白质(如CD27、CD28、CD40、CD 122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM-3、TIGIT、Lair1、CD244、HAVCR2、CD200、CD200R1、CD200R2、CD200R4、LILRB4、PILRA、ICOSL、4-1BB或VISTA)具有特异性。
示例性抗免疫检查点抗体包括例如伊匹单抗(抗CTLA-4)、派姆单抗(抗PD-L1)、纳武单抗(抗PD-L1)、阿替利珠单抗(抗PD-L1)、和德瓦鲁单抗(抗PD-L1)。
通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应被解释为限制性的。本申请全文中引用的所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容以及附图，通过引用整体并入本文并用于所有目的。
实施例
实施例1.新抗原知情TIL疗法概述
TIL(肿瘤浸润性淋巴细胞)疗法是一种自体细胞免疫疗法，其中从手术切除的肿瘤标本中分离TIL，在体外扩增，然后在清除淋巴细胞的预处理方案之后重新输注至患者体内。虽然TIL疗法已对一系列癌症取得了一些令人印象深刻的反应，但其成功仍然是偶发的。另一方面，原则上有理由认为TIL疗法可以是广泛适用的治疗方法。首先，已知大多数肿瘤被新抗原特异性T细胞浸润，尽管有时频率非常低。其次，已表明扩增和输注包含对单一新抗原具有反应性的CD4或CD8 T细胞的高纯度TIL产物足以介导肿瘤消退。
发明人已开发了一种差异化的NeoTIL方法(图1和图2)，其中应用新型肽：MHC筛选技术(即“PepSeq”)或相关方法(例如核糖体展示)以由基因组分析预测个性化免疫原性新抗原，然后这些新抗原用于在TIL制剂中富集效力最强的细胞。可以在相对短的时间表内产生个性化NeoTIL疗法(见图3和图4)。
PepSeq平台提供了一种用于高效合成和分析DNA条形码肽的大型文库的方法(见图5)。作为NeoTIL方法的一部分，发明人还开发了使肿瘤类器官生长的方法，其为细胞产物的抗肿瘤功效提供了个性化的试验台。
这种方法的大多数程序是相互关联的。发明人已获得IRB批准，并且已招募了一系列实体瘤患者到该领域的临床试验中，其包括与DNA/RNA测序和类器官分离生长和测试相关的创造性方法的元素，如下文进一步详述。
实施例2.一种用于从人肿瘤中鉴定和扩增新抗原特异性TIL的方法
以下方法使得能够从人肿瘤中鉴定和分离新抗原特异性TIL。将来自患有各种恶性肿瘤的人患者的新鲜切除的肿瘤标本各自分成2个样品。第一样品将用于提取DNA和RNA，使得能够进行全外显子组测序和RNAseq。与种系样品(例如血液或颊拭子)一起，这将使得能够鉴定体细胞变异并对相关蛋白质的表达进行量化。
在分析测序数据之后，将使用肿瘤基因组信息来设计覆盖候选突变及其野生型对应物的重叠(overlapping)肽文库。例如，将使用PepSeq平台或噬菌体展示平台以高度平行的方式合成这些肽的DNA编码文库，并与一组通常表达的人MHC II类蛋白质平行测定。平行地，将应用MHC I类结合的计算机模型来鉴定候选新抗原的第二子集。所得数据将使得能够确定推定的I类或II类限制性新抗原的优先子集，以供下游关注。
第二肿瘤样品将使用标准方法解离成单细胞。使用通过PepSeq或噬菌体展示平台和/或计算机预测方法鉴定的候选新抗原，将寻求用于从该样品中富集新抗原反应性T细胞的两种平行方法。在第一方法中，将通过在细胞因子的存在下将解离的肿瘤样品与代表入围(即优先)新抗原序列的肽进行培养，来完成新抗原反应性T细胞的选择性扩增。在替选方法中，将使用对应于入围序列的荧光标记肽：MHC探针(并且可能与细胞耗竭标记物组合)，通过荧光激活细胞分选来分离新抗原反应性T细胞。在每种情况下，将使用体外激活测定来测量细胞产物针对自体肿瘤细胞的活性，可能包括使用源自体外的肿瘤类器官。
实施例3.一种用于从人肿瘤中鉴定和扩增新抗原特异性TIL的替选方法
将来自患有各种恶性肿瘤的人患者的新鲜切除的肿瘤标本分成2个样品。第一样品用于提取DNA和RNA，使得能够进行全外显子组测序和RNAseq。与种系样品(血液或颊拭子)一起，这使得能够鉴定体细胞变异并对相关蛋白质的表达进行量化。
在分析测序数据之后，使用肿瘤基因组信息来设计覆盖候选突变及其野生型对应物的重叠肽文库。使用PepSeq平台以高度平行的方式合成这些肽的DNA编码文库，并与患者特异性的MHC II类(DR、DP、和DQ)平行测定。该过程使得能够通过选择性和亲和力快速、高置信度地鉴定候选新抗原肽：MHC。作为结果，从改变肽的体细胞肿瘤变异的通常大型的目录中选择了靶标新抗原的小型集合。
使用标准方法将第二肿瘤样品解离成单细胞，并加工以分离TIL和肿瘤细胞。为了解决非特异性体外T细胞扩增的限制，在通过PepSeq鉴定的候选新抗原肽的存在下对TIL进行传代培养。这种方法使得能够优选扩增具有期望的特异性的细胞。
这种方法确保生成新抗原肽特异性富集的TIL群体，可以在对源自患者的肿瘤类器官进行的免疫浸润测定中测试所述群体。在T细胞富集后，可以使用单细胞测序来鉴定配对的重排TCRα和β基因，其赋予T细胞新抗原特异性。这可以提供T细胞富集效率的另外度量，并且还可以实现平行基因转移方法，其中将患者特异性新抗原反应性赋予通用供体细胞，以提供规避内源性应答的耗竭表型的潜力。
需要明确的是，一般在通过与肽(即新抗原)的混合物孵育而富集之后使用整个淋巴细胞群体。
为了测试该方法的效率，对源自患者的肿瘤类器官进行免疫浸润测定。简要地，在超低亲和力(ULA)板中培养从原始标本中分离的肿瘤细胞以形成3D结构(类器官)。已知类器官概括了来源组织的表型特征，包括抗原潜力。在将新抗原肽特异性TIL与源自同一患者的肿瘤类器官共培养后，通过z-堆叠成像对类器官中的TIL浸润水平进行量化。
可以在细胞因子的存在下体外扩增新抗原肽特异性TIL，然后重新输注至患者体内，通常在清除淋巴细胞的预处理方案之后重新输注。
实施例4.从人患者和小鼠收集TIL
在临床试验中招募了数个人患者，以测试NeoTIL疗法的疗效。患者已被诊断为患有肺癌、结直肠癌、黑色素瘤、乳腺癌、和结肠癌。此外，结肠癌的BALB/c小鼠模型用于收集TIL。
从每个人患者和小鼠收集肿瘤活检。确定每个人患者的分离肿瘤细胞(TC)、外周血单个核细胞(PBMC)、和TIL的数量(见表1)。此外，鉴定了每个人患者和结肠癌的BALB/c小鼠模型的MHC等位基因和突变数量(见表2)。
表1.从人患者取出的肿瘤活检中收集TIL。
Figure BDA0004030634470000411
Figure BDA0004030634470000421
表2.鉴定每个人患者和结肠癌的BALB/c小鼠模型的MHC等位基因和突变。
Figure BDA0004030634470000422
实施例5.外显子组测序、肽文库设计、以及与人样品的结合测定
使用肿瘤外显子组和来自正常细胞外显子组的全外显子组测序来设计PepSeq文库，如图6和图7所概述。PepSeq文库中的肽在序列上重叠，并含有野生型残基(“W”)和突变残基(“M”)(见图7)。
使用Day等人,J Clin Invest.2003；112(6):831-842中概述的方法，对人患者TG00006和TG00013进行结合测定，如图8所示。结合测定鉴定了对存在于每个患者中的特定人白细胞抗原血清型具有高亲和力的肽(参见图9所示每个图左上角的较大数据点)。使用肽文库结合测定对人患者TG00013进行的另外分析示于图10中。
用PepSeq肽构建体分离了编码对HLA复合物具有高亲和力的肽的核酸。对人患者TG00013，对这些核酸进行测序，相应的氨基酸序列示于图11中。
可以使用MHC-PepSeq结果与计算机预测的比较，来鉴定和确认新抗原和/或新表位，如图12所示。
实施例6.人样品的浸润测定
在圆底超低亲和力(ULA)板中由肿瘤细胞悬液形成类器官，插入可渗透载体，并允许富集的TIL通过载体(即transwell插入物)迁移以浸润类器官，如图图13和图14A所示。用Z-堆叠生成类器官的三维图像，并对类器官中的淋巴细胞浸润进行定量，如图14B和图14C所示。
富集的TIL用Invitrogen CELLTRACKERTM CM-DiI染色，这是一种红色荧光染料，非常适合于监测多代细胞的运动或位置以促进对类器官中的TIL浸润进行定量。将以下处理施用于类器官：1)TIL；2)TIL+IL-2；3)TIL+IL-2+肽(即新抗原)；和4)TIL+肽(即新抗原)。在施用后6小时、12小时、24小时、48小时、和120小时，对类器官中的TIL浸润进行定量。
随着TIL暴露于IL-2和/或肽(即新抗原)，TIL对类器官的浸润显著增加，最大浸润一般发生在暴露于IL-2和肽两者的TIL中(见图15和图16)。
发明人比较了肿瘤中与从同一患者获得的正常组织中的新抗原肽特异性TIL浸润。重要地，用IL-2处理的TIL积极浸润肿瘤和正常组织，而新抗原肽特异性TIL无法识别正常组织，证实了NeoTIL方法保证了肿瘤选择性(见图17)。
实施例7.CT26结肠癌小鼠的NeoTIL分析和疗法
用NeoTIL分析和治疗CT26结肠癌小鼠的工作流程概述于图18中。如实施例5所述，用CT26结肠癌小鼠进行外显子组测序、肽文库设计、和结合测定。
结合测定鉴定了对存在于CT26结肠癌小鼠中的特定小鼠MHC I类或II类同种抗原具有高亲和力的肽(参见图19所示图上部的数据点)。
用PepSeq肽构建体分离了编码对小鼠MHC I类或II类同种抗原具有高亲和力的肽的核酸。对这些核酸进行测序，相应的氨基酸序列示于图20中。
实施例8.CT26结肠癌小鼠浸润测定和肿瘤生长测定
如实施例6所述，用源自CT26结肠癌小鼠肿瘤细胞的类器官进行浸润测定。与DMSO(即肽载体)、IL-2、肽(即新抗原)、或肽与IL-2共培养的TIL在第1天和第7天的显微图像示于图21中。
在该小鼠模型中，在不同条件下(即，不处理的TIL、TIL+IL-2、TIL+肽、TIL+IL-2+肽)将TIL与肿瘤类器官共培养表明，TIL与组合的肽和IL-2孵育导致肿瘤类器官中最高且具有统计学显著性的浸润水平(P<0.0001)(见图22和图23)。
在肿瘤内(“IT”)施用或静脉内(“IV”)施用不同的TIL处理后，测量了CT26结肠癌小鼠的肿瘤体积。没有向小鼠使用清除淋巴细胞或IL-2(除了存在于某些扩增的TIL群体中的IL-2)。对于IT施用，处理包括1)TIL；2)TIL+IL-2；3)TIL+肽(即新抗原)；4)TIL+IL-2+肽(即新抗原)；5)载体。对于静脉施用，处理包括1)TIL+IL-2；2)TIL+肽(即新抗原)；3)TIL+IL-2+肽(即新抗原)；4)TIL+载体。
这些用CT26结肠癌小鼠模型进行的体内研究表明，即使没有清除淋巴细胞预处理，新抗原肽特异性TIL也促进肿瘤体积减少大约50％(见图24和图25)。
实施例9.使用PepSeq鉴定用于训练TIL的新抗原
使用PepSeq鉴定作为推定的II类MHC结合物的肽。将原始读取序列与PepSeq文库的核苷酸编码参考序列比对，以生成每个MHC样品的原始读取计数和每种肽的读数的矩阵。通过取对每种肽对每个MHC II样品的归一化结合信号相对于其配对阴性对照(未切割的MHC)的比率，来计算PepSeq结合评分比。将常数调整的比率阈值应用于结合评分，以选择用于包含在TIL+肽细胞培养实验中的肽。
计算机预测用于选择与I类MHC具有结合潜力的肽。使用公开可用的工具对PepSeq文库中平铺的独特9mer进行计算机预测。选择相对于肽的随机集合具有最小预测MHC结合百分位数排位(较低的排位对应于较强的结合)的肽，用于包含在TIL+肽细胞培养中。对每个患者的I类MHC等位基因(多至六个等位基因)生成预测。
对每个患者使用描述的方法选择I类和II类MHC覆盖的自定义肽池，其中大约一半由最佳II类结合肽组成，一半由最佳I类结合肽组成，最终池中总共有大约24个肽。实验因素可能会使池的组成向I类或II类略有偏移。
实施例10.Neo-TIL在黑色素瘤、肺癌、结肠癌、和胰腺癌中的疗效
使用标准方法将肿瘤样品解离成单细胞，并加工以分离TIL。在由PepSeq鉴定的候选新抗原肽的存在下对TIL进行传代培养。这种方法使得能够优选扩增具有期望的特异性的细胞。通过在淋巴细胞和IL-2的存在下施用小鼠单克隆抗CD3抗体OKT3，使用非特异性T细胞受体刺激来快速扩增TIL。
在圆底超低亲和力(ULA)板中由肿瘤细胞悬液形成类器官，插入可渗透载体，并允许富集的TIL通过载体(transwell插入物)迁移以浸润类器官。富集的TIL用InvitrogenVybrantTM CM-Dil染色，这是一种红色荧光染料，非常适合于监测多代细胞的运动或位置以促进对类器官中的TIL浸润进行定量。用Z-堆叠生成类器官的三维图像，并对类器官中的淋巴细胞浸润进行定量(图26A、图26B、图27A、图28A、图28B、图29A、图30A、图31A-图31C和图32)。
将以下处理施用于类器官：1)未处理的TIL；2)TIL+IL-2(即常规TIL)；和3)TIL+肽(即Neo-TIL)。在施用后24小时对类器官中的TIL浸润进行定量。
相对于未处理的TIL，用暴露于肽的TIL(即Neo-TIL)显著增加了黑色素瘤患者的肿瘤类器官中的TIL浸润(见图26A、图27A)。重要地，常规TIL积极浸润肿瘤和正常组织，而新抗原肽特异性TIL(即Neo-TIL)无法识别正常组织，证实了Neo-TIL方法保证了肿瘤选择性(见图26B)。
相对于未处理的TIL，用暴露于肽的TIL(即Neo-TIL)显著增加了肺癌患者的肿瘤类器官中的TIL浸润(见图28A)。此外，常规TIL积极浸润肿瘤和正常组织，而新抗原肽特异性TIL(即Neo-TIL)选择性识别肿瘤组织(见图28B)。
此外，相对于未处理的TIL，用暴露于肽的TIL(即Neo-TIL)显著增加了结肠癌患者的肿瘤类器官和胰腺癌患者的肿瘤类器官中的TIL浸润(见图29A和图30A)。
在免疫浸润评估的时间过程中，相对于常规TIL，在数天后仍保持Neo-TIL浸润(图31A-图31C)。除了保持浸润能力之外，在三天的时间过程中，Neo-TIL选择性识别来自原始患者的肿瘤组织，而常规TIL识别来自其他患者的肿瘤组织，突出显示了Neo-TIL方法保证了肿瘤选择性(见图32)。在对Neo-TIL进行分类时，95％的细胞为CD45阳性，97％为CD3D阳性，98％为CD3E阳性，80％为CD3G阳性(图33)。
为了测量细胞因子释放，在使用前洗涤TIL以去除快速扩增方案中已使用的IL-2。在洗涤之后，将TIL与自体或HLA不相合的肿瘤细胞以1:1的比例培养过夜。收集每种共培养物的上清液，并通过Meso-Scale Discovery(MSD)测定来测量IFNγ、TNFα、和颗粒酶B的水平。通过qPCR测量IFNγ、穿孔素、颗粒酶B、PD-1、TIM-3、LAG-3、TIGIT的基因表达。
相对于常规TIL和未处理TIL，Neo-TIL显示出IFNγ、TNFα、颗粒酶B、和穿孔素的水平显著增加，由此说明Neo-TIL在黑色素瘤中显示出增强的激活和细胞毒性特性(见图26C-图26E和图27B-图27G)。此外，在快速扩增之后，Neo-TIL表现出较低水平的耗竭标记物PD-1、TIM-3、LAG-3、和TIGIT(见图27H-图27K)。类似地，Neo-TIL在肺癌(见图28C-图28G)、结肠癌(见图29B-图29K)、和胰腺癌(见图30B-图30J)中表现出增强的激活和细胞毒性特性，以及降低的耗竭标记物表达。
实施例11.附加材料和方法
将原代人肿瘤组织解离成单细胞悬液用于随后的TIL分离
在肿瘤切除术之前，患者进入临床方案并签署了由机构审查委员会批准的知情同意书。
解离肿瘤并分别使用Milteny Biotech的肿瘤解离试剂盒(#130-095-929)和人CD45(TIL)微珠(#130-118-780)分离CD45+TIL。简要地，从肿瘤样品中去除脂肪、纤维区域和坏死区域。然后将肿瘤切成2-4mm的小碎块。将组织碎块转移至含有酶混合物的gentleMACS C管中(如制造商的方案中提及的，使用的酶量取决于肿瘤的大小)。使用gentleMACS解离器选择适当的gentleMACSTM程序来解离组织。得到肿瘤单细胞悬液后，将细胞与CD45微珠孵育，并根据制造商的方案通过正向选择来分离CD45+细胞。认为CD45+细胞是肿瘤浸润性淋巴细胞或TIL，并使用85％人血清和15％ DMSO将其冷冻直至进一步使用。
与肽培养的TIL
在解冻并洗涤细胞之后，在24孔平底TC处理板中，在每孔2mL完全RPMI+10％ AB血清的存在下，在37℃培养250万个TIL(如果TIL数量较少，则每种条件下可以使用100万个细胞)。完全RPMI培养基含有：用20mM HEPES和L-谷氨酰胺改良的RPMI-1640培养基(不含碳酸氢钠，液体，无菌过滤，适用于细胞培养)(Sigma，R7638-500ml)、10％人AB血清、10000单位青霉素/ml，10000μg链霉素/ml、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、1×非必需氨基酸、5μM 2-巯基乙醇。然后在2ml完全TIL培养基中含有TIL的每孔中加入0.625μl的每种肽(肽储存浓度为在DMSO中4mg/ml)。次日，从每孔取出1mL上清液，然后在每孔中替换为新鲜的含有IL-2(100U/ml)的培养基(在IL-2孔中)或仅TIL培养基(在肽孔中)。每3天后，如果观察到大量生长则将传代细胞，或将一半的培养基更换为新鲜培养基。在第8天，通过移液器吹吸10次取出细胞，然后用1ml的2mM EDTA-dPBS溶液洗涤孔。最后，将细胞洗涤并溶解于TIL培养基中，并使用血细胞计数器计数。
快速扩增方案
在饲养淋巴细胞和白细胞介素-2(IL-2)的存在下，可以使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可以使用约30ng/ml的OKT3(一种小鼠单克隆抗CD3抗体)诱导。简要地，通过以1500rpm离心5分钟洗涤TIL(与肽培养)，重悬于TIL CM中，计数，并按示于下表3中的比例将活细胞添加至其他组分中：
表3
组分 T75培养瓶
活TIL <![CDATA[5×10<sup>5</sup>]]>
饲养PBMC <![CDATA[10×10<sup>6</sup>]]>
OKT3 30ng/ml
重组人IL-2 6000IU/ml
TIL CM 15ml
AIM-V CM 15ml
在开始REP后的第5天(第5天)，从每个培养瓶中吸出一半的培养基(细胞保留在培养瓶底部)。将培养基替换为含有6000IU/ml IL-2的TIL CM/AIM-V50/50。然后每2/3天将培养基更换为含有6000IU/ml IL-2的TIL CM/AIM-V 50/50。继续培养2周。2周后，计数细胞并用85％人血清(含15％ DMSO)冷冻培养基冷冻。
TIL疗效研究
类器官的生成：在96孔超低吸附球体微孔板(Corning；货号4591)中，在40μL含有1.5％生长因子减量基质胶的适当培养基(Corning；货号354230)中，以每孔5000个细胞接种肿瘤细胞。然后在室温以2000rpm离心板2min。在5％ CO2加湿培养箱中培养细胞至少72h，以生成用于免疫浸润测定的球体。
TIL浸润和成像：在快速扩增之后，计数适当数量的TIL(通常将2×105个TIL添加至每个类器官)，并在室温以1500rpm离心10min。然后将沉淀溶解于2ml OptiMem培养基中。在该细胞悬液中，添加2μM分子探针Vybrant CM-Dil(Thermo Fischer，货号C7000)的溶液，将其在37℃避光孵育45min，然后在4℃另外孵育15min。在孵育之后，将细胞用PBS洗涤两次，并重悬于所需量的TIL完全培养基中。接着，在含有肿瘤类器官的每孔中添加160μL的TIL培养基。然后将5μm HTS Transwell 96孔可渗透载体接收板(Corning，货号3387)置于超低吸附球体微孔板上，以允许TIL浸润至类器官中。然后以2×105个细胞/孔或以1:5的肿瘤类器官：TIL的比例，将分子探针Vybrant CM-Dil染色的TIL接种至插入物中。在24h之后，去除插入物，并通过3D Z-堆叠成像来分析类器官微孔板，并使用Cytation 5软件进行形态分析以对TIL浸润进行量化。
细胞因子释放测定：在使用前洗涤1×105个TIL以去除IL-2，然后与自体或HLA不相合的肿瘤细胞(如果有)以1:1的比例培养过夜。然后根据制造商的说明，通过MSD板测定来自每个共培养物的上清液中的IFN-γ、颗粒酶B、IL-4、TNF-a。
参考文献
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<160> 54
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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<220>
<223> 新抗原
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<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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<212> PRT
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<220>
<223> 新抗原
<400> 7
Ser Gly Gly Pro Gly Ser Glu Lys Ser Leu Leu Leu Ser Lys Trp
1               5                   10                  15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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<220>
<223> 新抗原
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 12
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<212> PRT
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<220>
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<223> 新抗原
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<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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Asp Thr Ile Ser Arg Ala Val Phe Pro Leu Ala Phe Leu Ile Phe
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 16
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<212> PRT
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<220>
<223> 新抗原
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<212> PRT
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<223> 新抗原
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Gly Ile Arg Lys Ala Lys Lys Arg Asn Tyr Ala Phe Leu Trp Asp
1               5                   10                  15
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<212> PRT
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<223> 新抗原
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Pro His Leu Lys Asp Trp Gln Ile Phe His Gln Ala Leu Leu Arg
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<220>
<223> 新抗原
<400> 20
Gly Leu Gly Lys His Gly Phe Ile Met Glu Met Asn Ala Phe Gly
1               5                   10                  15
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 新抗原
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Asn His Ala Phe Lys Cys Lys His Cys Gly Lys Pro Phe Gly Thr
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<223> 新抗原
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Leu Asp Lys His Trp His Leu Glu Cys Phe Lys Cys Lys Thr Cys
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<223> 新抗原
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Pro Cys Val Phe Leu Val Asn Cys Leu Pro Phe Cys Arg Thr His
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<223> 新抗原
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 新抗原
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Lys Ala Glu Ile Leu Ser Ser Leu Gly Ala Leu Tyr Tyr Asn Thr
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<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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Pro His Gly Tyr Glu Ile Lys Phe Ile Phe Gly Ile Pro Leu Asp
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<223> 新抗原
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Ile Arg Glu Asn Phe Leu Phe Leu Asp Val Phe Phe Glu Ala Leu
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<223> 新抗原
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Gln His Asp Lys Glu Gln Lys Met Ile Gly Ser Val Ser Gln Ser
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<210> 29
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<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 29
Gln Glu Asn Thr Cys Asn Ile Thr Ile Glu Gly Leu Asp Ala Glu
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<220>
<223> 新抗原
<400> 30
Val Glu Asp Pro Val Tyr Gln Val Ile Ser Glu Thr Ser Arg Asp
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<220>
<223> 新抗原
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<223> 新抗原
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Thr Lys Phe Ile Leu Val Glu Phe Pro Gly Ser Leu Ser Met Arg
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<220>
<223> 新抗原
<400> 33
Ile Leu Leu Glu Asn Thr Asp Leu Ser Ala Leu Trp Tyr Leu Tyr
1               5                   10                  15
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<223> 新抗原
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<213> 人工序列
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<223> 新抗原
<400> 35
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<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 36
Asp Cys Phe Ser Thr Asn Lys Leu Leu Thr Tyr Glu Ala Leu Gly
1               5                   10                  15
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<223> 新抗原
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<223> 新抗原
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 39
Ala Arg Ala Leu Ile Leu Leu Pro Thr Arg Glu Leu Ala Leu Gln
1               5                   10                  15
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<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
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<223> 新抗原
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<223> 新抗原
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<220>
<223> 新抗原
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Leu Arg Cys Met Gly Asn Asn Gly Ile Cys Arg Ala Ser Cys Lys
1               5                   10                  15
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<212> PRT
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<220>
<223> 新抗原
<400> 44
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Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ser Gly His Met Asp Arg Gln Arg Arg
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Ala Leu Phe Asp Gly Asp Ser His Leu Ser Thr Glu Asn Pro Ala
1               5                   10                  15
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 47
Pro Ser Pro Thr Val Leu Arg Ala His Ala Glu Met Ala Leu Asp
1               5                   10                  15
<210> 48
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 新抗原
<400> 48
Asp Met Leu Ser Gln Thr Asn Cys Phe Val Ser Leu Trp Leu Pro
1               5                   10                  15
<210> 49
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<400> 49
Pro Val Ser Lys Met Arg Met Ala Thr Pro Leu Leu Met Gln Ala
1               5                   10                  15
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<400> 50
Ala Ala Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Met Ala Ala
1               5                   10
<210> 51
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<400> 51
Ala Ala Met Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10
<210> 52
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<400> 52
Ala Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1               5                   10
<210> 53
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<400> 53
Ala Ser Met Ser Ala Ala Ser Ala Ala Ser Met Ala Ala
1               5                   10
<210> 54
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 空间占位物
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 54
Ala Ala Xaa Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Xaa Ala Ala
1               5                   10

Claims (42)

1.一种用于将肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体的方法，其包括：
(a)从肿瘤细胞中分离第一TIL群体，所述肿瘤细胞从切除自患者的肿瘤中获得；
(b)通过对来自患者的肿瘤DNA和/或RNA以及正常DNA和/或RNA的基因组分析，检测肿瘤细胞中的多个患者特异性肿瘤突变；
(c)鉴定由体细胞突变产生且显示出与来自第一TIL群体的人白细胞抗原(HLA)蛋白或其片段特异性结合的新抗原；
(d)将新抗原与第一TIL群体孵育，以生成富集了识别新抗原的淋巴细胞的第二TIL群体；以及
(e)将第二TIL群体扩增为用于过继细胞免疫疗法的TIL治疗群体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中检测多个患者特异性肿瘤突变包括基因组分析与靶标基因组合的下一代测序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述基因组分析包括全基因组分析、全外显子组分析、和/或转录组分析。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述基因组分析包括通过对来自患者的肿瘤和正常样品进行核酸测序来鉴定表达基因中的多个患者特异性肿瘤突变，并且所述突变存在于患者的癌细胞基因组中，但不存在于来自受试者的正常细胞中。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中
所述多个患者特异性肿瘤突变包括点突变、剪接位点突变、移码突变、通读突变、基因融合突变、插入、缺失、或其组合；并且
所述多个患者特异性肿瘤突变编码至少一种具有肿瘤特异性新表位的突变多肽，相较于野生型多肽，其以更高的亲和力结合至HLA蛋白或其片段。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其进一步包括鉴定患者的MHC1类和2类基因型。
7.根据权利要求6所述的方法，其中鉴定患者的MHC 1类和2类基因型包括分析来自肿瘤和/或正常组织的全外显子组测序(WES)和/或RNA测序。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中鉴定新抗原包括：
(i)提供肽构建体文库，其中
文库的每种肽构建体包含肽部分和鉴定肽部分的鉴定核酸部分，并且
至少一种肽构建体的肽部分能够特异性结合HLA蛋白或其片段；
(ii)使HLA蛋白或其片段与肽构建体文库接触；
(iii)将包含能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的至少一种肽构建体与包含不能特异性结合至HLA蛋白或其片段的肽部分的肽构建体分离；
(iv)对能够特异性结合至HLA蛋白或其片段的至少一种肽构建体的鉴定核酸部分的全部或部分进行测序。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肽构建体文库包含通过分析多个患者特异性肿瘤突变而设计的变体肽，所述分析预测每个突变对相应蛋白质的影响，并排除沉默突变和非编码区域中的突变。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述变体肽包含预测影响相应蛋白质的结构的突变。
11.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中鉴定新抗原包括：
(i)使用噬菌体展示、核糖体展示、mRNA展示、双顺反子DNA展示、P2A DNA展示、CIS展示、酵母展示、或细菌展示来生成遗传编码的多肽组合文库，其中所述组合文库包含连接至编码多肽的相应核酸分子的多肽；
(ii)使组合文库与HLA蛋白或其片段接触；
(iii)分离显示出与组合文库特异性结合的HLA蛋白或其片段；以及
(iv)对结合至HLA蛋白或其片段的组合文库的核酸分子的全部或部分进行测序，以鉴定新抗原。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多肽组合文库包含通过分析多个患者特异性肿瘤突变而设计的变体肽，所述分析预测每个突变对相应蛋白质的影响，并排除沉默突变和非编码区域中的突变。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述变体肽包含预测影响相应蛋白质的结构的突变。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中新抗原与来自第一TIL群体的HLA蛋白或其片段之间的特异性结合由以下步骤确定：
(i)培养用至少一种核酸分子转化的细胞，所述核酸分子包含编码以下的核苷酸序列：
MHC II类组分，其包含至少一部分MHC II类α链和至少一部分MHC II类β链，使得MHCII类α链和MHC II类β链形成肽结合槽；以及
空间占位物分子和第一可加工接头，其中所述空间占位物分子通过所述可加工接头连接至MHC II类组分，并且所述空间占位物分子在肽结合槽内结合，从而阻碍任何其他肽在肽结合槽内结合；进行培养步骤以产生MHC II类组分；
(ii)回收MHC II类组分；
(iii)处理可加工接头，从而从肽结合槽中释放空间占位物分子；
(iv)在新抗原存在下孵育MHC II类组分，其中所述孵育促进新抗原结合至肽结合槽；
(v)回收已结合新抗原的MHC II类组分。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述空间占位物分子具有共有序列AAXAAAAAAAXAA(SEQ ID NO：78)。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述空间占位物分子选自PVSKMRMATPLLMQA(SEQID NO：73)；AAMAAAAAAAMAA(SEQ ID NO：74)；AAMAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：75)；AAFAAAAAAAAAA(SEQ ID NO：76)；和ASMSAASAASMAA(SEQ ID NO：77)。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法，其中所述可加工接头连接至MHC II类组分的MHC II类α链。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法，其中用结合的新抗原回收MHC II类组分包括用识别MHC II类组分的抗体进行亲和层析。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中通过噬菌体展示来确定新抗原与来自第一TIL群体的HLA蛋白或其片段之间的特异性结合，在噬菌体表面表达HLA蛋白或其片段，并将新抗原与噬菌体孵育，以测定特异性结合。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其进一步包括计算机分析以确定新抗原与MHC I类蛋白或其片段之间的特异性结合，其中所述计算机分析包括应用计算算法基于新抗原的肽序列来预测与MHC I蛋白的相对结合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其进一步包括通过细胞分选从第一TIL群体和/或第二TIL群体中去除表达选自PD1、TIM-3、LAG-3、CTLA-4、及其组合的标记物的TIL，以在群体中富集非耗竭TIL。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中将新抗原与第一TIL群体孵育进一步包括使第一TIL群体与至少一种细胞因子接触。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述至少一种细胞因子包括白细胞介素-2(IL-2)。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括将第二TIL群体注射至患者的淋巴结区域中，注射至患者的胸腺中，和/或通过静脉内施用全身注射至患者。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括向第二TIL群体的细胞培养基中补充IL-2，任选OKT-3和饲养层细胞。
26.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中将第二TIL群体扩增为TIL治疗群体包括：
(i)通过在包含IL-2和任选OKT-3的细胞培养基中培养第二TIL群体来进行第一扩增，以产生第三TIL群体，其中所述第一扩增在提供第一透气表面积的封闭容器中进行，其中所述第一扩增进行约3至14天以获得第三TIL群体，其中所述第三TIL群体的数量至少比第二TIL群体多50倍，并且其中在不打开系统的情况下发生转化；并且，任选地，
(ii)通过向第三TIL群体的细胞培养基中补充额外的IL-2、任选OKT-3和饲养层细胞来进行第二扩增，以产生第四TIL群体，其中所述第二扩增进行约7至14天以获得第四TIL群体，其中所述第四TIL群体是TIL治疗群体，其中所述第三扩增在提供第二透气表面积的封闭容器中进行，并且其中在不打开系统的情况下发生转化。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述饲养层细胞是抗原呈递细胞(APC)或辐照外周血单个核细胞(PBMC)。
28.根据权利要求1至27中任一项所述的方法，其进一步包括使用源自患者肿瘤细胞的类器官进行免疫浸润测定，以确认与第一TIL群体相比，第二TIL群体的类器官浸润增强。
29.一种低温冷藏组合物，其包含权利要求1至28中任一项所述的TIL治疗群体、包含DMSO的低温保护剂介质、和电解质溶液。
30.根据权利要求29所述的低温冷藏组合物，其进一步包含一种或多种稳定剂和一种或多种淋巴细胞生长因子。
31.根据权利要求30所述的低温冷藏组合物，其中所述一种或多种稳定剂包括人血清白蛋白(HSA)，并且所述一种或多种淋巴细胞生长因子包括IL-2。
32.一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1至28中任一项所述的TIL治疗群体施用于有需要的患者。
33.根据权利要求32所述的方法，其中在施用有效量的TIL治疗群体之前，对患者施用非清髓性的清除淋巴细胞方案。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述非清髓性的清除淋巴细胞方案包括以60mg/m2/天的剂量施用环磷酰胺两天，然后以25mg/m2/天的剂量施用氟达拉滨五天的步骤。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的方法，其进一步包括从施用TIL治疗群体的第二天开始，用高剂量IL-2方案治疗患者的步骤。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述高剂量IL-2方案包括每八小时以15分钟的静脉推注施用600000或720000IU/kg，直至耐受。
37.根据权利要求32至36中任一项所述的方法，其进一步包括使TIL治疗群体与免疫检查点抑制剂接触，或者向患者施用免疫检查点抑制剂。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR、ICOS、A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-2、4-1BB、或VISTA抑制剂或其组合。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述检查点抑制剂包括伊匹单抗(抗CTLA-4)、派姆单抗(抗PD-L1)、纳武单抗(抗PD-L1)、阿替利珠单抗(抗PD-L1)、德瓦鲁单抗(抗PD-L1)、或其组合。
40.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺癌、膀胱癌、乳腺癌、人乳头瘤病毒引起的癌症、头颈癌(包括头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))、肾癌、和肾细胞癌。
41.根据权利要求32至39中任一项所述的方法，其中所述癌症选自黑色素瘤、HNSCC、宫颈癌、NSCLC、和三阴性乳腺癌(TNBC)。
42.根据权利要求32至41中任一项所述的方法，其中所述TIL治疗群体通过静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、或肿瘤内施用。
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