ES2218598T3 - Anticuerpo especifico del prpsc natural. - Google Patents

Abstract

LOS PRIONES SON PATOGENOS INFECCIOSOS QUE PRODUCEN ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL EN EL HOMBRE Y LOS ANIMALES. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNOS METODOS PARA OBTENER ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A LA ISOFORMA DE LA PROTEINA DEL PRION PRP SC PRODUCIDA DE FORMA NATURAL EN EL SCRAPIE, Y A METODOS DE USO DE ESTOS ANTICUERPOS PARA DETECTAR PRP SC EN MUESTRAS.

Description

Anticuerpo específico del Prp^{Sc} natural.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a los métodos para obtener anticuerpos y a los análisis para utilizar tales anticuerpos. Más específicamente, la invención se refiere a los métodos para obtener anticuerpos que se unen específicamente a las formas de origen natural de Prp^{Sc}.

Antecedentes de la invención

Los priones son agentes patógenos infecciosos que causan las encefalopatías espongiformes del sistema nervioso central en humanos y animales. Los priones son distintos de las bacterias, los virus y los viroides. La hipótesis predominante en la actualidad es que no son necesarios componentes de ácido nucleico para la infectividad de la proteína priónica. Adicionalmente, un prión que infecta una especie de animal (v.g., un humano) no infectará otra (v.g., un ratón).

La etapa principal en el estudio de los priones y las enfermedades que ocasionan fue el descubrimiento y la purificación de una proteína denominada proteína priónica ("PrP") [Bolton y col., Science 218:1309-11 (1.982); Prusiner, y col., Biochemistry 21:6942-50 (1.982); McKinley, y col., Cell 35:57-62 (1.983)]. Los genes que codifican las proteínas priónicas completas han sido desde entonces clonados, secuenciados y expresados en animales transgénicos. La PrP^{C} está codificada por un gen del huésped de una sola copia [Basler, y col., Cell 46:417-28 (1.986)] y se encuentra normalmente en la superficie externa de las neuronas. Las enfermedades priónicas están acompañadas por la conversión de PrP^{C} en una forma modificada denominada PrP^{Sc}. Sin embargo, la función biológica o fisiológica real de la PrP^{C} no se conoce.

La isoforma del scrapie de la proteína priónica (PrP^{Sc}) es necesaria tanto para la transmisión como para la patogénesis de las enfermedades neurodegenerativas transmisibles de animales y humanos. Ver Prusiner, S.B., "Molecular biology of prion disease", Science 252:1515-1522 (1.991). Las enfermedades priónicas más comunes de los animales son el scrapie de las ovejas y cabras y la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) del ganado vacuno [Wilesmith, J. y Wells, Microbiol. Immunol. 172:21-38 (1.991)]. Han sido identificadas cuatro enfermedades priónicas de humanos: (1) kuru, (2) Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD), (3) Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheeinker (GSS), y (4) insomnio familiar fatal (FFI) [Gajdusek, D.C., Science 197:943-960 (1.977); Medori y col., N. Engl. J. Med. 326:444-449 (1.992)]. La presentación de las enfermedades priónicas humanas como dolencias genéticas e infecciosas, esporádicas planteó inicialmente un enigma que ha sido explicado por el origen genético celular de la PrP.

La mayoría de los casos de CJD son esporádicos, pero aproximadamente el 10-15% son heredados como alteraciones dominantes autosómicas que están causadas por mutaciones en el gen PrP humano (Hsiao y col., Neurology 40:1820-1827 (1.990); Goldfarb y col., Science 258:806-808 (1.992); Kitamoto y col., Proc. R. Soc. Lond. (en imprenta) (1.994)]. La CJD yatrógena ha sido causada por la hormona del crecimiento humana derivada de pituitarias cadavéricas así como injertos de la duramadre [Brown y col., Lancet 340:24-27 (1.992)]. A pesar de los numerosos intentos de ligar la CJD con una fuente infecciosa tal como el consumo de carne de oveja infectada con scrapie, ninguna ha sido identificada hasta la fecha [Harries-Jones y col., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 51: 1113-1119 (1.988)] excepto en los casos de enfermedad inducida yatrogénamente. Por otra parte, se cree que el kuru, que durante muchas décadas ha devastado el Fore y las tribus vecinas de las tierras altas de Nueva Guinea, ha sido extendido por infección durante el canibalismo ritual [Alpers, M.P., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System Vol. 1, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (Nueva York: Academic Press), págs. 66-90 (1.979)].

La transmisión inicial de la CJD a primates experimentales tiene una rica historia que comienza con el reconocimiento de William Hadlow de la similitud entre el kuru y el scrapie. En 1.959, Hadlow sugirió que los extractos preparados a partir de pacientes que morían de kuru fueran inoculados en primates no humanos y que los animales fueran observados en cuanto a la enfermedad que se había pronosticado que se produciría tras un período de incubación prolongado [Hadlow, W.J. Lancet 2:289-290 (1.959)]. Siete años más tarde, Gajdusek, Gibbs y Alpers demostraron que la transmisibilidad del kuru a chimpancés tras períodos de incubación que oscilaban entre 18 y 21 meses [Gajdusek y col., Nature 209:794-796 (1.966)]. La similitud de la neuropatología del kuru con las de la CJD [Klatzo y col., Lab. Invest. 8:799-847 (1.959)] sugirió la necesidad de experimentos similares con chimpancés y se informó sobre transmisiones de la enfermedad en 1.968 [Gibbs, Jr. y col., Science 161:388-389 (1.968)]. A lo largo de los últimos 25 años, aproximadamente 300 casos de CJD, kuru y GSS han sido transmitidos a una variedad de simios y monos.

El gasto, la escasez y a menudo la inhumanidad observada de tales experimentos han restringido este trabajo y por tanto limitado la acumulación de conocimiento. Si bien se ha dicho que la mayor parte de los datos de transmisión fiables emana de estudios en los que se utilizan primates no humanos, algunos casos de enfermedad priónica humana han sido transmitidos a roedores pero aparentemente con menos regularidad [Gibbs, Jr. y col., Slow Transmissible Diseases of the Nervous System, Vol. 2, S.B. Prusiner y W.J. Hadlow, eds. (Nueva York: Academic Press), págs. 87-110 (1.979); Tateishi, y col., Prion Diseases of Humans and Animals, Prusiner, y col., eds. (Londres: Ellis Horwood), págs. 129-134 (1.992)].

La infrecuente transmisión de enfermedades priónicas humanas a roedores ha sido citada como ejemplo de la "barrera de especie" descrita primero por Pattison en sus estudios de paso del agente del scrapie entre ovejas y roedores [Pattison, I.H., NINDB Monograph 2. D.C. Gajdusek, C.J. Gibbs Jr. y M.P. Alpers, eds. (Washington, D.C.: U.S. Government Printing), págs. 249-257 (1.965)]. En aquellas investigaciones, el paso inicial de priones de una especie a otra estaba asociado con un tiempo de incubación prolongado desarrollándose la dolencia sólo en unos pocos animales. El paso posterior en la misma especie estaba caracterizado porque todos los animales se ponían enfermos tras tiempos de incubación enormemente reducidos.

Se demostró que la base molecular para la barrera de especie entre el hámster Sirio (SHa) y el ratón reside en la secuencia del gen PrP utilizando ratones transgénicos (Tg) [Scott, y col., Cell 59:847-857 (1.989)]. SHaPrP difiere de MoPrP en 16 posiciones de los 254 restos aminoácido [Basler, y col., Cell 46:417-428 (1.986); Locht, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1.986)]. Los ratones Tg(SHaPrP) que expresaban SHaPrP tenían tiempos de incubación abreviados cuando se inoculaban con priones de SHa. Cuando se realizaban estudios similares con ratones que expresaban los transgenes PrP humano, o bovino, la barrera de especie no era abrogada, es decir, el porcentaje de animales que se infectaban era inaceptablemente bajo y los tiempos de incubación eran inaceptablemente largos. Así, no ha sido posible, por ejemplo en el caso de los priones humanos, el uso de animales transgénicos (tales como ratones que contienen un gen PrP de otra especie) para someter a ensayo de manera fiable una muestra para determinar si esa muestra está infectada con priones. La gravedad del riesgo para la salud resultante de la carencia de semejante ensayo se ejemplifica más abajo.

Más de 45 adultos jóvenes tratados previamente con HGH derivada de pituitarias humanas han desarrollado CJD [Koch, y col., N. Engl. J. Med. 313:731-733 (1.985); Brown, y col., Lancet 340:24-27 (1.992); Fradkin, y col., JAMA 265:880-884 (1.991); Buchanan, y col., Br. Med. J. 302:824-828 (1.991)]. Afortunadamente, ahora se utiliza HGH recombinante, aunque ha aumentado la aparentemente remota posibilidad de que la expresión de wtPrP^{C} estimulada por HGH pueda inducir enfermedades priónicas [Lasmezas, y col., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1163-1169 (1.993)]. Que la HGH preparada a partir de pituitarias estaba contaminada con priones está apoyado por la transmisión de la enfermedad priónica a un mono 66 meses después de la inoculación con un lote de HGH sospechoso [Gibbs, Jr., y col., N. Engl. J. Med. 328:358-359 (1.993)]. Los largos tiempos de incubación asociados con enfermedades priónicas no revelarán el grado completo de CJD yatrógena durante décadas en miles de personas tratadas con HGH en todo el mundo. La CJD yatrógena también parece haberse desarrollado en cuatro mujeres estériles tratadas con hormona gonadotropina derivada de pituitaria humana contaminada [Healy, y col., Br. J. Med. 307:517-518 (1.993); Cochius, y col., Aust. N.Z. J. Med. 20:592-593 (1.990); Cochius, y col., J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 55:1094-1095 (1.992)] así como al menos 11 pacientes que recibieron injertos de duramadre [Nisbet, y col., J. Am. Med. Assoc. 261:1118 (1.989); Thadani, y col., J. Neurosurg. 69:766-769 (1.988); Willison, y col., J. Neurosurg. Psychiatric 54:940 (1.991); Brown, y col., Lancet 340: 24-27 (1.992)]. Estos casos de CJD yatrógena subrayan la necesidad de rastrear fármacos que puedan estar posiblemente contaminados con priones.

Recientemente, dos doctores en Francia fueron acusados del homicidio involuntario de un niño que había sido tratado con hormonas del crecimiento extraídas de cadáveres. El niño desarrolló la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. (Ver New Scientist, 31 de Julio de 1.993, página 4). Según el Institute Pasteur, desde 1.989 ha habido informes de 24 casos de CJD en gente joven que había sido tratada con hormona del crecimiento humana entre 1.983 y mediados de 1.985. Quince de estos niños han fallecido. Ahora parece como si cientos de niños en Francia hubieran sido tratados con hormona del crecimiento extraída de cadáveres con el riesgo de desarrollar CJD (ver New Scientist, 20 de Noviembre de 1.993, página 10). Los intentos previos de crear anticuerpos monoclonales para PrP han sido infructuosos (ver Barry y Prusiner, J. of Infectious Diseases Vol. 154, Núm. 3, páginas 518-521 (1.986). Por tanto existe la necesidad de un análisis para detectar compuestos que produzcan la enfermedad. Específicamente, existe la necesidad de un análisis de coste eficaz, conveniente para someter a ensayo materiales de muestra en cuanto a la presencia de priones que causen la CJD. La presente invención ofrece semejante análisis.

Compendio de la invención

Los anticuerpos de la invención se unirán específicamente a una proteína priónica nativa (es decir, PrP^{Sc} nativa) in situ con un alto grado de afinidad de unión. Los anticuerpos pueden ser colocados sobre un sustrato y utilizados para analizar una muestra para determinar si la muestra contiene una forma patógena de una proteína priónica. Los anticuerpos se caracterizan por uno o más de los siguientes rasgos (1) la capacidad de neutralizar los priones infecciosos, (2) se unirán a proteínas priónicas (PrP^{Sc}) in situ es decir, se unirán a formas de origen natural de una proteína priónica en un cultivo celular o in vivo y sin la necesidad de tratar (v.g. desnaturalizar) la proteína priónica, y (3) se unirán a un elevado porcentaje a la forma PrP^{Sc} (es decir, la forma de la enfermedad) de la proteína priónica en una composición v.g., se unirán al 50% o más de las formas PrP^{Sc} de las proteínas priónicas. Los anticuerpos preferidos se caracterizan adicionalmente por una capacidad (4) para unirse a una proteína priónica sólo de una especie de mamífero específica v.g., unirse a proteínas priónicas humanas y no a proteínas priónicas de otros mamíferos.

Un objeto importante es proporcionar anticuerpos que se unan a proteínas priónicas nativas (PrP^{Sc}).

Otro objeto es proporcionar anticuerpos que se unan específicamente a epítopos de proteínas priónicas (PrP^{Sc}) de una especie específica de animal y no a las proteínas priónicas (PrP^{Sc}) de otras especies de animales.

Otro objeto es proporcionar anticuerpos monoclonales que se unan específicamente a proteínas priónicas (PrP^{Sc}) asociadas con enfermedades, (v.g., PrP^{Sc} humana) cuyos anticuerpos no se unen a proteínas PrP desnaturalizadas no asociadas con enfermedades (v.g., PrP^{c} humana).

Otro objeto más es proporcionar la metodología específica para permitir que otros generen una amplia gama de anticuerpos específicos caracterizados por su capacidad para unirse a uno o más tipos de proteínas priónicas de una o más especies de animales.

Otro objeto de la invención es proporcionar un análisis para la detección de formas PrP^{Sc} de proteínas PrP.

Otro objeto de la invención es proporcionar un análisis que pueda diferenciar específicamente la proteína priónica (PrP^{Sc}) asociada con una enfermedad a partir de PrP^{Sc} no asociada con la enfermedad.

Otro objeto es detectar priones que se unan específicamente a PrP^{Sc} nativas de una especie específica tal como un humano, una vaca, una oveja, un cerdo, un perro, un gato o un pollo.

Una ventaja de la invención es que proporciona un análisis eficaz de coste provechoso, rápido para detectar la presencia de PrP^{Sc} nativa en una muestra.

Una ventaja específica es que el análisis puede ser utilizado como criba para la presencia de priones (es decir, PrP^{Sc}) en productos tales como fármacos (derivados de fuentes naturales), alimentos, cosméticos o cualquier material que pudiera contener tales priones y de se modo proporcionar garantías adicionales en cuanto a la seguridad de tales productos.

Otra ventaja es que los anticuerpos pueden ser utilizados con una proteasa que desnaturaliza PrP^{c} proporcionando de ese modo un método de diferenciación entre las formas (PrP^{Sc}) infecciosas y (PrP^{Sc}) no infecciosas de los priones.

Otra ventaja de la invención es que los anticuerpos de la invención se caracterizan por su capacidad para neutralizar la infectividad de los priones de origen natural v.g., neutralizar PrP^{Sc}.

Otra ventaja es que los anticuerpos de la invención se unirán a las proteínas priónicas (PrP^{Sc}) in situ, es decir, se unirán a priones de origen natural (PrP^{Sc}) en su estado natural en un cultivo celular o in vivo sin requerir que las proteínas priónicas sean tratadas, aisladas o desnaturalizadas particularmente.

Otra ventaja es que las proteínas priónicas de la invención se unirán a un porcentaje relativamente elevado de la forma infecciosa de la proteína priónica (v.g., PrP^{Sc}) por ejemplo se unirán al 50% o más de la forma PrP^{Sc} de las proteínas priónicas en una composición.

Un rasgo importante de la invención es que la metodología hace posible crear una amplia variedad de anticuerpos para proteínas priónicas diferentes con las mismas características o características diseñadas individualmente cuyas características pueden hacer el anticuerpo particularmente adecuado para usos tales como (1) neutralización de priones para purificar un producto, (2) extracción de proteínas priónicas y (3) terapias.

Una característica de la invención es que utiliza genotecas de presentación en fagos en la creación de los anticuerpos.

Otra característica de la invención es que los fagos están diseñados genéticamente para expresar una proteína de unión específica de un anticuerpo sobre su superficie.

Estos y otros objetos, ventajas, y características de la invención se harán evidentes para aquellas personas expertas en la técnica tras la lectura de los detalles del gen quimérico, el método de análisis, y el ratón transgénico que se describirán más cuidadosamente más abajo.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una vista esquemática de una porción de proteínas PrP que muestra las diferencias entre una proteína PrP humana de tipo salvaje, normal y una proteína PrP de ratón de tipo salvaje, normal;

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón junto con las diferencias específicas entre la PrP de ratón y la PrP humana;

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón y muestra específicamente las diferencias entre PrP de ratón y PrP bovina;

La Figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón y muestra específicamente las diferencias entre la PrP de ratón y la PrP bovina;

La Figura 5 es un diagrama de barras de la dilución en suero vs. densidad óptica a 405 nm para el ratón (D7282) para el suero frente a PrP de ratón 27-30 desnaturalizada;

La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de regiones variables de la cadena pesada (A) y de la cadena ligera (B) seleccionadas generadas mediante inmunopurificación de una genoteca de IgG1 de ratón D7282 frente a varillas de MoPrP 2730 desnaturalizadas;

La Figura 7 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas para algunos de los clones de fagos obtenidos en una inmunopurificación frente a PrP;

Las Figuras 8A-8H muestran fotos de histotransferencias 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F, 8G y 8H que muestran la tinción de SHaPrP 27-30, y SHaPrP 27-30 desnaturalizada;

La Figura 9 es un gráfico que muestra la reactividad ELISA de Fabs purificados frente a la proteína priónica SHa 27-30;

La Figura 10 es un gráfico de la reactividad ELISA de Fabs purificados frente a la proteína priónica SHa 27-30 desnaturalizada;

La Figura 11 es una foto que muestra la amino-precipitación de SHaPrP 27-30 con Fabs recombinantes de la invención; y

La Figura 12 es una foto que muestra la amino-precipitación de SHaPrP 27-30 con Fabs purificados de la invención.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Antes de producir y utilizar los anticuerpos, análisis y métodos de la presente invención tal como se describen y revelan, se debe entender que esta invención no está limitada a anticuerpos, análisis o métodos concretos, ya que estos pueden, por supuesto, variar. Asimismo se debe entender que la terminología utilizada aquí tiene la finalidad de describir sólo realizaciones concretas, y no se pretende que sea limitante, puesto que el alcance de la presente invención estará limitado sólo por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se especifique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado comúnmente comprendido por un experto normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Aunque se pueden utilizar cualquiera de los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación se describen los métodos y materiales preferidos. Todas las publicaciones de la presente se incorporan como referencia para revelar y describir los métodos y/o materiales en conexión con los cuales se citan las publicaciones.

Los términos "proteína PrP", "PrP" y similares se utilizan intercambiablemente aquí y deben representar tanto la forma de la partícula infecciosa PrP^{Sc} conocida por causar enfermedades (encefalopatías espongiformes) en humanos y animales como la forma no infecciosa PrP^{c} que, en las condiciones apropiadas se convierte en la forma PrP^{Sc} infecciosa.

Los términos "prión", "proteína priónica" y "proteína PrP^{Sc}" y similares utilizados intercambiablemente aquí hacen referencia a la forma PrP^{Sc} infecciosa de una proteína PrP y es una contracción de las palabras "proteína" e "infección" y las partículas están comprendidas en gran parte si no exclusivamente por moléculas de PrP^{Sc} codificadas por un gen PrP. Los priones son distintos de las bacterias, los virus y los viroides. Entre los priones conocidos se incluyen aquellos que infectan animales para causar el scrapie, una enfermedad degenerativa, transmisible del sistema nervioso de ovejas y cabras así como las encefalopatías espongiformes bovinas (BSE) o enfermedad de las vacas locas y las encefalopatías espongiformes felinas de los gatos. Las cuatro enfermedades priónicas que se sabe que afectan a los humanos son (1) el kuru, (2) la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, (3) la Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker (GSS), y (4) el insomnio familiar fatal (FFI). Según se utiliza aquí en el prión se incluyen todas las formas de priones que causan todas o cualquiera de estas enfermedades u otras en cualquiera de los animales utilizados - y en particular en humanos y en animales de granja domésticos.

El término "gen PrP" se utiliza aquí para describir material genético que expresa las proteínas mostradas en las Figuras 2-4 y los polimorfismos y las mutaciones tales como los enumerados aquí en el subencabezamiento "Mutaciones y Polimorfismos Patógenos". El término "gen PrP" hace referencia generalmente a cualquier gen de cualquier especie que codifique cualquier forma de proteína priónica. Algunas secuencias de PrP conocidas comúnmente las describen Gabriel y col., en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1.992) que se incorpora aquí como referencia para revelar y describir tales secuencias. El gen PrP puede ser de cualquier especie animal incluyendo el "huésped" y los animales de "ensayo" descritos aquí y cualquiera de los polimorfismos y mutaciones del mismo, reconociéndose que en los términos se incluyen otros genes PrP semejantes que todavía no han sido descubiertos. La proteína expresada por semejante gen puede suponer o bien una forma PrP^{c} (no enfermedad) o bien PrP^{Sc} (enfermedad).

Los términos "preparación priónica normalizada", "preparación priónica", "preparación" y similares se utilizan intercambiablemente aquí para describir una composición que contiene priones (PrP^{Sc}) cuya composición es obtenida a partir de tejido cerebral de mamíferos que contiene sustancialmente el mismo material genético por lo que se refiere a los priones, v.g., tejido cerebral de un grupo de mamíferos que manifiestan signos de enfermedad priónica cuyos mamíferos (1) incluyen un transgen como se ha descrito aquí; (2) tienen un gen de una proteína priónica endógena suprimido; (3) tienen un elevado número de copias de genes de la proteína priónica de una especie diversa genéticamente; o (4) son híbridos con un gen de una proteína priónica endógena suprimido y un gen de una proteína priónica de una especie diversa genéticamente. Los mamíferos de los cuales se obtienen las preparaciones priónicas normalizadas manifiestan signos clínicos de disfunción del CNS como resultado de inoculación con priones y/o debido al desarrollo de la enfermedad por a su naturaleza genéticamente modificada, v.g., elevado número de copias de los genes de la proteína priónica.

El término "gen PrP artificial" se utiliza aquí para abarcar el término "gen PrP quimérico" así como otros genes construidos por recombinación que cuando se incluyan en el genoma de un animal huésped (v.g. un ratón) harán al mamífero susceptible de infección por priones que naturalmente sólo infectan un mamífero de ensayo genéticamente diverso, v.g., humano, bovino u ovino. En general, en un gen artificial se incluirá la secuencia del codón del gen PrP del mamífero que está siendo genéticamente alterado con uno o más codones (pero no todos, y generalmente menos de 40) de la secuencia natural que está siendo remplazada por un codón diferente - preferiblemente un codón correspondiente de un mamífero diverso genéticamente (tal como un humano). El mamífero alterado genéticamente que está siendo utilizado para analizar priones en las muestras que sólo infectan al mamífero diverso genéticamente. Los ejemplos de los genes artificiales son los genes PrP de ratón que codifican las secuencia mostrada en las Figuras 2, 3 y 4 con uno o más codones de reposición diferentes seleccionados entre los codones mostrados en estas Figuras para humanos, vacas y ovejas que remplazan los codones de ratón en la misma posición relativa, con la condición de que no todos los codones de ratón son remplazados con diferentes codones humanos, de vaca u oveja. En los genes PrP artificiales se pueden incluir no sólo codones de animales diversos genéticamente sino que también se pueden incluir codones y secuencias de codones no asociados con ningún gen PrP nativo pero que, cuando se insertan en un animal hacen al animal susceptible de infección con priones que normalmente infectarían sólo una animal diverso genéticamente.

Los términos "gen quimérico", "gen PrP quimérico", "gen de proteína priónica quimérica" y similares se utilizan intercambiablemente aquí para representar un gen construido artificialmente que contiene los codones de un animal huésped tal como un ratón con uno o más de los codones que están siendo remplazados por los correspondientes codones de un animal de ensayo diverso genéticamente tal como un humano, una vaca o una oveja. En un ejemplo específico el gen quimérico está constituido por la secuencia de inicio y terminación (es decir, los codones N- y C-terminales) de un gen PrP de un mamífero de una especie huésped (v.g. un ratón) y asimismo contiene una secuencia de nucleótidos de una porción correspondiente de un gen PrP de un mamífero de ensayo de una segunda especie (v.g. un humano). Un gen quimérico hará, cuando se inserte en el genoma de un mamífero de la especie huésped, al mamífero susceptible de infección con priones que normalmente infectan sólo mamíferos de la segunda especie. El gen quimérico preferido descrito aquí es MHu2M que contiene la secuencia de inicio y terminación de un gen PrP de ratón y una región de la secuencia no terminal que es remplazada por una secuencia humana correspondiente que difiere del gen PrP de ratón de manera tal que la proteína expresada de ese modo difiere en nueve restos.

Se pretende que el término "material genético relacionado con priones" abarque cualquier material genético que afecte a la capacidad de un animal para ser infectado por priones. Así, el término abarca cualquier "gen PrP", "gen PrP artificial", gen "PrP quimérico" o "gen PrP suprimido" cuyos términos se definen aquí así como la modificación de los mismos que afecten a la capacidad de un animal para ser infectado por priones. Las preparaciones priónicas normalizadas son producidas utilizando animales que tienen todos sustancialmente el mismo material genético relacionado con priones de manera que todos los animales se infectarán con el mismo tipo de priones y manifestarán signos de infección en aproximadamente el mismo tiempo.

Los términos "animal huésped" y "mamífero huésped" se utilizan para describir animales que tienen sus genomas manipulados genéticamente y manipulados artificialmente con el fin de incluir material genético que no se encuentre presente de manera natural en el animal. Por ejemplo, entre los animales huésped se incluyen ratones, hámsteres y ratas que tienen su gen PrP suprimido es decir se ha vuelto no operativo. El huésped es inoculado con proteínas priónicas para generar anticuerpos. Las células que producen los anticuerpos son una fuente de material genético para elaborar una genoteca de fagos. Otros animales huésped pueden tener un gen (PrP) natural o uno que esté alterado por la inserción de un gen artificial o por la inserción de un gen PrP nativo de un animal de ensayo diverso genéticamente.

Los términos "animal de ensayo" y "mamífero de ensayo" se utilizan para describir el animal que es diverso genéticamente del animal huésped en términos de diferencias entre el gen PrP del animal huésped y el gen PrP del animal de ensayo. El animal de ensayo puede ser cualquier animal para el cual se desea realizar un ensayo de análisis para determinar si una muestra dada contiene priones con los cuales el animal de ensayo sería susceptible generalmente de infección. Por ejemplo, el animal de ensayo puede ser un humano, una vaca, un oveja, un cerdo, un caballo, un gato, un perro o un pollo, y se puede desear determinar si una muestra concreta incluye priones que normalmente sólo infectarían al animal de ensayo.

Los términos "animal diverso genéticamente" y "mamífero diverso genéticamente" se utilizan para describir un animal que incluye una secuencia del codón de PrP nativo del animal huésped que difiere del animal de ensayo diverso genéticamente en 17 o más codones, preferiblemente 20 o más codones, y muy preferiblemente 28-40 codones. Así, un gen PrP de ratón es genéticamente diverso con respecto al gen PrP de un humano, una vaca o una oveja, pero no es genéticamente diverso con respecto al gen PrP de un hámster.

Los términos "gen de la proteína PrP escindido", "gen PrP desorganizado", y similares se utilizan intercambiablemente aquí para representar un gen PrP endógeno que ha sido alterado (v.g., añadido y/o eliminado nucleótidos) con el fin de volver no operativo el gen. Los ejemplos de genes PrP no funcionales y los métodos para elaborarlos los describen Büeler, H., y col. en "Normal development of mice lacking the neuronal cell-surface PrP protein" Nature 356, 577-582 (1.992) y Weisman (WO 93/10227). La metodología para suprimir un gen la ilustra Capecchi, en Cell 51:503-512 (1.987) la cual se incorpora aquí como referencia en su totalidad. Preferiblemente ambos alelos de los genes son desorganizados.

Los términos "animal híbrido", "animal híbrido transgénico" y similares se utilizan intercambiablemente aquí para representar un animal obtenido a partir de la cría cruzada de un primer animal que tiene un gen de la proteína priónica endógena suprimido con un segundo animal que incluye o bien (1) un gen quimérico o un gen PrP artificial o bien (2) un gen PrP de un animal diverso genéticamente. Por ejemplo se obtiene un ratón híbrido mediante cría cruzada de un ratón con un gen de ratón suprimido con un ratón que contiene (1) genes PrP humanos (que pueden estar presentes en un número elevado de copias) o (2) genes quiméricos. En el término híbrido se incluye cualquier descendiente de un híbrido incluyendo un descendiente engendrado por endogamia de dos híbridos siempre que el descendiente resultante sea susceptible de infección por priones que infectan normalmente sólo una especie diversa genéticamente. Se pueden inocular priones en un animal híbrido y servir como fuente de células para la creación de hibridomas para elaborar los anticuerpos monoclonales de la invención.

Los términos "susceptible de infección" y "susceptible de infección por priones" y similares se utilizan intercambiablemente aquí para describir un animal de ensayo transgénico o híbrido que desarrolla una enfermedad si es inoculado con priones que normalmente sólo infectarían un animal de ensayo genéticamente diverso. Los términos se utilizan para describir un animal transgénico o híbrido tal como un ratón transgénico Tg(MHu2M) que, sin el gen PrP quimérico, no sería infectado por un prión humano pero con el gen quimérico es susceptible de infección por priones humanos.

Por "anticuerpo" se quiere significar una proteína inmunoglobulina que es susceptible de unirse a un antígeno. Se pretende que anticuerpo según se utiliza aquí incluya el anticuerpo completo así como cualquiera de los fragmentos de anticuerpo (v.g., F(ab')_{2}, Fab', Fab, Fv) susceptible de unirse al epítopo, antígeno o fragmento antigénico de interés.

Los anticuerpos de la invención son inmunorreactivos o inmunoespecíficos y por lo tanto se unen específicamente y selectivamente a la proteína PrP^{Sc} natural o nativa. Se prefieren los anticuerpos que son inmunorreactivos e inmunoespecíficos para PrP^{Sc} natural o nativa. Los anticuerpos para PrP^{Sc} son preferiblemente inmunoespecíficos - es decir, sustancialmente no presentan reactividad cruzada con los materiales relacionados. Aunque el término "anticuerpo" abarca todos los tipos de anticuerpos (v.g., monoclonal) los anticuerpos de la invención son producidos preferiblemente utilizando la metodología de presentación en fagos descrita aquí.

Por "anticuerpo purificado" se quiere significar uno que esté suficientemente libre de otras proteínas, carbohidratos, y lípidos con los cuales está naturalmente asociado. Semejante anticuerpo "se une preferiblemente" a una proteína PrP^{Sc} nativa (o un fragmento antigénico de la misma), es decir, no reconoce sustancialmente y se une a otras moléculas antigénicamente no relacionadas. Un anticuerpo purificado de la invención es preferiblemente inmunorreactivo con e inmunoespecífico para una proteína PrP^{Sc} de una especie específica y más preferiblemente inmunoespécifica para PrP^{Sc} humana nativa.

Por "fragmento antigénico" de una proteína PrP se quiere significar una porción de semejante proteína que es capaz de unirse a un anticuerpo de la invención.

Por "se une específicamente" se quiere significar una elevada avidez y/o una elevada afinidad de unión de un anticuerpo a un polipéptido específico es decir, epítopo de una proteína PrP^{Sc}. La unión de un anticuerpo a su epítopo en este polipéptido específico es preferiblemente más fuerte que la unión del mismo anticuerpo a cualquier otro epítopo, concretamente aquellos que pueden estar presentes en moléculas asociadas con, o en la misma muestra que, el polipéptido específico de interés v.g., se une más fuertemente a PrP^{Sc} que los fragmentos desnaturalizados de PrP^{Sc} de manera que ajustando las condiciones de unión el anticuerpo se une casi exclusivamente a PrP^{Sc} y no a los fragmentos desnaturalizados de PrP^{Sc}. Los anticuerpos que se unen específicamente a un polipéptido de interés pueden ser capaces de unirse a otros polipéptidos a un nivel débil, todavía detectable (v.g., 10% o menos de la unión mostrada al polipéptido de interés). Semejante unión débil, o unión de fondo, es fácilmente discernible de la unión de anticuerpos específica al compuesto o polipéptido de interés, v.g. mediante el uso de controles apropiados. En general, se dice que los anticuerpos de la invención que se unen a PrP^{Sc} nativa in situ con una afinidad de unión de 10^{7} litros/mol o más, preferiblemente 10^{8} litros/mol se unen específicamente a PrP^{Sc}. En general, un anticuerpo con una afinidad de unión de 10^{6} litros/mol o menos no es útil ya que no se unirá a un antígeno a un nivel detectable utilizando la metodología convencional utilizada en la actualidad.

Por "anticuerpo marcado detectablemente", "anti-PrP marcado detectablemente" o "fragmento anti-PrP marcado detectablemente" se quiere significar un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo que conserva la especificidad de unión), que tiene una marca detectable anclada. La marca detectable está anclada normalmente mediante conjugación química, pero cuando la marca es un polipéptido, podría estar anclado alternativamente mediante mecanismos de ingeniería genética. Los métodos para la producción de proteínas marcadas detectablemente son bien conocidos en la técnica. Las marcas detectables pueden ser seleccionadas entre una variedad de marcas conocidas en la técnica, pero normalmente son radioisótopos, fluoróforos, marcas paramagnéticas, enzimas (v.g., peroxidasa de rábano picante), u otros radicales o compuestos que o bien emiten una señal detectable (v.g., radiactividad, fluorescencia, color) o bien emiten una señal detectable tras la exposición de la marca a su sustrato. Diversos pares marca detectable/sustrato (v.g., peroxidasa de rábano picante/diaminobenzidina, avidina/estreptavidina, luciferasa/luciferina)), métodos para anticuerpos marcadores, y métodos para utilizar los anticuerpos marcados son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, eds. (Antibodies: A Laboratory Manual (1.968) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)).

Los términos "tratamiento", "tratar" y similares se utilizan aquí para representar generalmente la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de prevenir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de una cura parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. Según se utiliza "tratamiento" abarca cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, concretamente un humano, e incluye:

(a) evitar que la enfermedad se produzca en un sujeto que pueda estar predispuesto a la enfermedad pero todavía no se haya diagnosticado que la tiene;

(b) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o

(c) aliviar la enfermedad, es decir, causar la regresión de la enfermedad. La invención está dirigida a tratar pacientes con priones infecciosos y está particularmente dirigida a tratar humanos infectados con PrP^{Sc}, que produce una enfermedad del sistema nervioso central tal como la encefalopatía espongiforme bovina; la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob; el insomnio familiar fatal o la Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker.

Entre las abreviaturas utilizadas aquí se incluyen:

CNS para el sistema nervioso central;

BSE para la encefalopatía espongiforme bovina;

CJD para la Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob;

FFI para el insomnio familiar fatal;

GSS para la Enfermedad de Gerstmann-Strassler-Scheinker;

Hu para humano;

HuPrP para una proteína priónica humana;

Mo para ratón;

MoPrP para una proteína priónica de ratón;

SHa para un hámster Sirio;

PrPSHa para una proteína priónica de hámster Sirio;

Tg para transgénico;

Tg(SHaPrP) para ratón transgénico conteniendo el gen PrP de hámster Sirio;

Tg(HuPrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP humano completo;

Tg(ShePrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP de oveja completo;

Tg(BocPrP) para ratones transgénicos conteniendo el gen PrP bovino completo;

PrP^{Sc} para la isoforma del scrapie de la proteína priónica;

PrP^{c} para la isoforma normal comúnmente contenida en la célula de la proteína priónica;

MoPrP^{Sc} para la isoforma del scrapie de la proteína priónica de ratón;

MHu2M para un gen de ratón/humano quimérico donde una región del gen PrP de ratón es remplazada por la correspondiente secuencia humana que difiere de PrP de ratón en 9 codones;

Ratones Tg(MHu2M) son ratones transgénicos de la invención que incluyen el gen MHu2M quimérico;

MHu2MPrP^{Sc} para la isoforma del scrapie del gen PrP humano/ratón quimérico;

PrP^{CJD} para la isoforma CJD de un gen PrP;

Prnp^{0/0} para la ablación de ambos alelos de un gen de la proteína priónica endógena, v.g., el gen MoPrP;

Tg(SHaPrP^{+/0})81/Prnp^{0/0} para una línea concreta (81) de ratones transgénicos que expresan SHaPrP, +/0 indica heterozigoto;

Tg(HuPrP)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de la proteína priónica humana (HuPrP) con un ratón con ambos alelos del gen de la proteína priónica endógena desorganizados;

Tg(MHu2M)/Prnp^{0/0} para un ratón híbrido obtenido cruzando un ratón con un gen de la proteína priónica quimérico (MHu2M) con un ratón con ambos alelos de la proteína priónica endógena desorganizados.

FVB para una cepa endogámica normalizada de ratones utilizada a menudo en la producción de ratones transgénicos puesto que los huevos de ratones FVB son relativamente grandes y toleran la microinyección de ADN exógeno relativamente bien.

Aspecto general de la invención

El núcleo de la invención es un anticuerpo que se une específicamente a una proteína PrP^{Sc} no desnaturalizada nativa in situ con una afinidad de 10^{7} litros/mol o más, preferiblemente 10^{8} litros/mol o más de una única especie (v.g., humano) y más preferiblemente se une sólo a PrP^{Sc} humana y no a fragmentos desnaturalizados de PrP^{c} humana). El anticuerpo se puede unir a todas las proteínas codificadas por diferentes mutaciones y/o polimorfismos del gen de la proteína PrP. Alternativamente, se proporciona una batería de anticuerpos (2 o más anticuerpos diferentes) donde cada anticuerpo de la batería se une específicamente a la proteína codificada por una mutación o polimorfismo diferente del gen PrP. El anticuerpo se puede unir a una superficie de soporte y utilizar para analizar en una muestra in vitro la presencia de un tipo concreto de PrP^{Sc} humana. El anticuerpo también se puede unir a una marca detectable e inyectar en un animal para analizar in vivo la presencia de un tipo concreto de PrP^{Sc} nativa.

Aunque existen procedimientos conocidos para producir anticuerpos a partir de cualquier antígeno dado, la práctica ha demostrado que es particularmente difícil producir anticuerpos que se unen a ciertas proteínas v.g., PrP^{Sc}. La dificultad en la obtención de anticuerpos para PrP^{Sc} se refiere, en parte, a sus especiales y desconocidas cualidades. Siguiendo los procedimientos descritos aquí se han obtenido anticuerpos que se unen a PrP^{Sc} nativa in situ y otros pueden seguir los procedimientos descritos aquí para obtener otros anticuerpos para PrP^{Sc} y para otras proteínas para las cuales es difícil generar anticuerpos.

Para producir los anticuerpos de la invención es preferible empezar inoculando un mamífero huésped con proteínas priónicas es decir, PrP^{Sc} infecciosas. El mamífero huésped puede ser cualquier mamífero y es preferiblemente un mamífero huésped del tipo definido aquí tal como un ratón, rata, cobaya hámster y es muy preferiblemente un ratón. El animal huésped es inoculado con proteínas priónicas que son endógenas para una especie diferente que es preferiblemente una especie diversa genéticamente. Por ejemplo un ratón es inoculado con proteínas priónicas humanas. Preferiblemente, el mamífero huésped es inoculado con proteínas priónicas infecciosas de un mamífero diverso genéticamente. Por ejemplo un ratón es inoculado con PrP^{Sc} humana. Utilizando un mamífero huésped normal de esta manera es posible lograr la generación de algunos anticuerpos. No obstante, cuando un animal huésped incluye un gen de una proteína priónica y es inoculado con priones de una especie diversa genéticamente, sólo se generarán, si es que lo hacen, los anticuerpos para los epítopos que difieren de los epítopos de la proteína priónica del animal huésped y los epítopos de la especie diversa genéticamente. Esto limita sustancialmente la cantidad de anticuerpos que podrían ser generados y disminuye la capacidad de encontrar un anticuerpo que se una selectivamente a una forma infecciosa de una proteína priónica y no se una a fragmentos desnaturalizados de una forma no infecciosa. Así, a menos que se esté intentando generar anticuerpos que difieran entre proteínas priónicas de diferentes especies es preferible empezar el procedimiento de producción de anticuerpos utilizando un mamífero que tenga un gen de una proteína priónica suprimido es decir, un gen PrP nulo abreviado como Prnp^{0/0}. Por consiguiente, la invención se describe generalmente en relación con el uso de tales mamíferos "nulos" y se describe específicamente en relación con "ratones nulos".

Los anticuerpos son elaborado produciendo primero un animal huésped (v.g., un ratón) que tiene su gen PrP endógeno suprimido, es decir, el gen PrP se ha vuelto no operativo. Un ratón con un gen PrP suprimido es referido como un "ratón nulo". Un ratón nulo puede ser creado insertando un segmento de ADN en un gen PrP de ratón normal y/o separando una porción del gen para proporcionar un gen PrP desorganizado. El gen desorganizado es inyectado en un embrión de ratón y por medio de la recombinación homóloga remplaza el gen PrP endógeno.

El ratón nulo es inyectado con priones con el fin de estimular la formación de anticuerpos. Adicionalmente, se utilizan generalmente inyecciones de coadyuvantes y priones para maximizar la generación de anticuerpos. Después se sacrifica el ratón y la médula ósea y el bazo se separan. Las células se someten a lisis, el ARN se extrae y se somete a transcripción inversa a ADNc. Las cadenas pesada y ligera del anticuerpo (o partes de las mismas) se amplifican después mediante PCR. La genoteca de ADNc amplificado puede ser utilizada tal cual o tras la manipulación para crear una gama de variantes y de ese modo incrementar el tamaño de la genoteca.

Después se construye una genoteca de presentación en fagos de IgG insertando el ADNc amplificado que codifica la cadena pesada de IgG y el ADNc amplificado que codifica una cadena ligera en un vector de presentación del fago (v.g., un vector pComb3) de manera que el vector contenga un inserto de ADNc que codifica un fragmento de la cadena pesada en un primer casete de expresión del vector, y un inserto de ADNc que codifica un fragmento de la cadena ligera en un segundo casete de expresión del vector.

Los vectores ligados son empaquetados después por el fago M13 filamentoso utilizando métodos bien conocidos en la técnica. La genoteca empaquetada es utilizada después para infectar un cultivo de E. coli, con el fin de aumentar el número de partículas de fago. Tras la lisis bacteriana, las partículas de fago se aíslan y se utilizan en un procedimiento de inmunopurificación.

La genoteca creada es inmunopurificada frente a una composición que contiene priones. Después se aíslan los fragmentos de anticuerpo que se unen selectivamente a PrP^{Sc}, v.g., PrP^{Sc} humana.

Específicos de una proteína PrP

El componente principal de los priones infecciosos purificados, denominado PrP 27-30, es el núcleo resistente a la proteinasa K de una proteína nativa más grande PrP^{Sc} que es la forma causante de la enfermedad de la proteína celular ubicua PrP^{c}. La PrP^{Sc} se encuentra solamente en células infectadas con scrapie mientras PrP^{c} está presente tanto en células infectadas como no infectadas que implican PrP^{Sc} como componente principal, sino único, de las partículas priónicas infecciosas. Puesto que tanto PrP^{c} como PrP^{Sc} están codificadas por el mismo gen de copia individual, se ha dirigido un gran esfuerzo hacia el desenmarañamiento del mecanismo por el cual PrP^{Sc} deriva de PrP^{c}. Ha sido central para este objetivo la caracterización de las diferencias físicas y químicas entre estas dos moléculas. Entre las propiedades que distinguen PrP^{Sc} de PrP^{c} se incluyen la escasa solubilidad (Meyer, y col. 1.986 PNAS), antigenicidad escasa (Kascack, J. Virol 1987; Serban D. 1.990) resistencia a la proteasa (Oesch, y col. 1985 Cell) y polimerización de PrP 27-30 en productos agregados en forma de varillas que son muy similares, a nivel ultraestructural e histoquímico, a las placas amiloides de PrP observadas en cerebros enfermos de scrapie (Prusiner, y col Cell 1983). Utilizando la proteinasa K es posible desnaturalizar PrP^{c} pero no PrP^{Sc}. Hasta la fecha, los intentos de identificar cualquiera de las modificaciones químicas post-traduccionales en PrP^{c} que conducen a su conversión en PrP^{Sc} han sido infructuosos (Stahl, y col 1.993 Biochemistry). Por consiguiente, se ha propuesto que PrP^{c} y PrP^{Sc} son de hecho isómeros conformacionales de la misma molécula.

La descripción conformacional de PrP utilizando los mecanismos convencionales ha sido impedida por los problemas de solubilidad y la dificultad de producir cantidades suficientes de proteína pura. Sin embargo, PrP^{c} y PrP^{Sc} son conformacionalmente distintas. Los cálculos teóricos basados en las secuencias de aminoácidos de PrP de diversas especies han pronosticado cuatro supuestas unidades helicoidales en la molécula. Los datos espectroscópicos experimentales indicarían que en PrP^{c} estas regiones adoptan ordenamientos helicoidales \alpha, virtualmente sin lámina \beta (Pan, y col PNAS 1.993). En espectacular contraste, en el mismo estudio se encontró que PrP^{Sc} y PrP 27-30 poseen un contenido en lámina \beta significativo, que es típico de las proteínas amiloides. Por otra parte, los estudios con péptidos sintéticos ampliados, correspondientes a los restos aminoácido de PrP 90-145, han demostrado que estas moléculas truncadas pueden ser convertidas en estructuras \alpha-helicoidales o en lámina \beta alterando sus condiciones en solución. La transición de PrP^{c} a PrP^{Sc} requiere la adopción de la estructura en lámina \beta por las regiones que eran previamente \alpha-helicoidales.

En general, la infección por scrapie fracasa al producir una respuesta inmune, con organismos huésped que son tolerantes a PrP^{Sc} de la misma especie. Sin embargo se han originado anticuerpos anti-PrP policlonales en conejos tras la inmunización con grandes cantidades de SHaPrP 27-30 (Bendheim, y col PNAS 1.985, Bode, y col. J. Gen. Virol. 1.985). De un modo similar, se ha producido un puñado de anticuerpos anti-PrP monoclonales en ratones (Kascack, y col. J. Virol. 1.987, Barry, y col., J. Infect. Dis. 1.986). Estos anticuerpos son capaces de reconocer la PrP^{C} nativa y la PrP^{Sc} desnaturalizada tanto de SHa como humana igualmente bien, pero no se unen a MoPrP. De modo poco sorprendente, los epítopos de estos anticuerpos fueron mapeados para las regiones de la secuencia que contenían diferencias de aminoácidos entre SHa- y MoPrP (Rogers, y col. J. Immunol. 1.993).

No está completamente claro por qué los anticuerpos del tipo descrito en las publicaciones citadas antes se unirán a PrP^{c} pero no a PrP^{Sc}. Sin estar ligado a ninguna teoría concreta se sugiere que esto puede tener lugar debido a que los epítopos que están expuestos cuando la proteína está en conformación PrP^{c} no están expuestos o están parcialmente escondidos en la configuración PrP^{Sc}- donde la proteína es relativamente insoluble y está plegada de forma más compacta entre sí. Se indica que hacer constar que un anticuerpo se une a PrP^{c} pero no a PrP^{Sc} no es correcto en términos absolutos (pero correcto en los términos aceptados comúnmente) debido a que se puede producir cierta unión mínima a PrP^{Sc}. Para los fines de la invención una indicación de que no se produce unión significa que la constante de equilibrio o afinidad K_{a} es de 10^{6} litros/mol o menos. Adicionalmente, se reconocerá que existe unión cuando la K_{a} sea de 10^{7} litros/mol o mayor, preferiblemente 10^{8} litros/mol o mayor. La afinidad de unión de 10^{7} litros/mol o más puede ser debida a (1) un anticuerpo monoclonal individual (es decir, gran número de una clase de anticuerpos) (2) una pluralidad de anticuerpos monoclonales diferentes (v.g., gran número de cada uno de los cinco diferentes anticuerpos monoclonales) o (3) gran número de anticuerpos policlonales. Asimismo es posible utilizar combinaciones de (1) - (3).

Los anticuerpos preferidos unirán un 50% o más de la PrP^{Sc} de la muestra. No obstante, esto se puede lograr utilizando numerosos anticuerpos diferentes como para los puntos (1) - (3) anteriores. Se ha encontrado que un número creciente de anticuerpos diferentes es más eficaz al unirse a un porcentaje mayor de la PrP^{Sc} de la muestra en comparación con el uso de un único anticuerpo. Por ejemplo, el uso de seis copias de un anticuerpo individual "Q" podría unir un 40% de la PrP^{Sc} de la muestra. Se podrían obtener resultados similares con seis copias de anticuerpo "R" y "S". Sin embargo, utilizando dos copias de cada uno de "Q", "R" y "S" los seis anticuerpos unirán más del 50% de la PrP^{Sc} de la muestra. Así, se puede obtener un efecto sinérgico combinando combinaciones de dos o más anticuerpos que se unen a PrP^{Sc} es decir, combinando dos o más anticuerpos que tienen una afinidad de unión K_{a} para PrP^{Sc} de 10^{7} litros/mol o más. De ese modo, la combinación de D4, R2, 6D2, D14, R1 y R10 y/o anticuerpos relacionados puede proporcionar resultados sinérgicos.

Fuerzas de unión anticuerpo/antígeno

Las fuerzas que mantienen un antígeno y un anticuerpo juntos no son en esencia diferentes de las interacciones no específicas que se producen entre dos proteínas no relacionadas cualesquiera es decir, otras macromoléculas tales como seralbúmina humana y transferrina humana. Estas fuerzas intermoleculares pueden ser clasificadas en cuatro áreas generales que son (1) electrostáticas; (2) enlaces de hidrógeno; (3) hidrófobas; y (4) de Van der Waals. Las fuerzas electrostáticas se deben a la atracción entre grupos iónicos cargados de forma opuesta en dos cadenas laterales de la proteína. La fuerza de atracción (F) es inversamente proporcional al cuadrado de la distancia (d) entre las cargas. Las fuerzas de los enlaces de hidrógeno son proporcionadas por la formación de puentes de hidrógeno reversibles entre grupos hidrófilos tales como -OH, -NH_{2} y -COOH. Estas fuerzas dependen en gran parte del íntimo posicionamiento de las dos moléculas que portan estos grupos. Las fuerzas hidrófobas funcionan de la misma manera que las gotitas de aceite en agua se fusionan para formar una única gota grande. Por consiguiente, los grupos hidrófobos, no polares tales como las cadenas laterales de valina, leucina y fenilalanina tienden a asociarse en un entorno acuoso. Por último, las de Van der Waals son fuerzas creadas entre moléculas que dependen de la interacción entre las nubes de electrones externas.

Se puede obtener información adicional referente a cada uno de los tipos diferentes de fuerzas de "Essential Immunology" editado por I.M. Roitti (6ª Edición) Blackwell Scientific Publications, 1.988. Con respecto a la presente invención, los anticuerpos útiles manifiestan todas estas fuerzas. Obteniendo una acumulación de estas fuerzas en cantidades mayores es posible obtener un anticuerpo que tenga un elevado grado de afinidad o fuerza de unión a la proteína PrP y en particular un anticuerpo que tenga un elevado grado de fuerza de unión a PrP^{Sc} in situ.

Medición de la fuerza de unión anticuerpo/antígeno

Se puede medir la afinidad de unión entre un anticuerpo y un antígeno cuya medida es una acumulación de la medida de todas las fuerzas descritas antes. Los procedimientos normalizados para llevar a cabo tal medida existen y se pueden aplicar directamente para medir la afinidad de los anticuerpos de la invención hacia las proteínas PrP incluyendo la PrP^{Sc} nativa in situ.

Un método normalizado para medir la afinidad de unión anticuerpo/antígeno es a través del uso de un saco de diálisis que es un recipiente constituido por un material que es permeable al antígeno pero impermeable al anticuerpo. Los antígenos que se unen completamente o parcialmente a los anticuerpos se colocan dentro del saco de diálisis en un disolvente tal como agua. Después el saco se coloca en un recipiente más grande que no contiene anticuerpos o antígeno pero contiene sólo el disolvente, v.g. el agua. Puesto que sólo el antígeno puede difundir a través de la membrana de diálisis la concentración del antígeno en el saco de diálisis y la concentración del antígeno en el recipiente externo más grande intentarán alcanzar un equilibrio. Tras colocar el saco de diálisis en un recipiente más grande y permitir que pase el tiempo para alcanzar el equilibrio es posible medir la concentración del antígeno dentro del saco de diálisis y dentro del recipiente circundante y determinar después las diferencias de concentración. Esto hace posible calcular la cantidad de antígeno que permanece unida al anticuerpo en el saco de diálisis y la cantidad que se desasocia del anticuerpo y difunde al recipiente circundante. Renovando constantemente el disolvente (v.g. el agua) del recipiente circundante con el fin de eliminar cualquier antígeno que esté difundido allí es posible desasociar totalmente el anticuerpo del antígeno dentro del saco de diálisis. Si el disolvente circundante no es renovado el sistema alcanzará el equilibrio y es posible calcular la constante de equilibrio (K) de la reacción es decir, la asociación y la desasociación entre el anticuerpo y el antígeno. La constante de equilibrio (K) se calcula como una cantidad igual a la concentración de anticuerpo unido al antígeno dentro del saco de diálisis dividida por la concentración de los sitios de combinación del anticuerpo libres veces la concentración de antígeno libre. El valor de la constante de equilibrio "K" se mide generalmente en términos de litros por mol. El valor de K es una medida de la diferencia de energía libre (delta g) entre el antígeno u el anticuerpo en estado libre en comparación con la forma complejada del antígeno u el anticuerpo. Cuando se utiliza la metodología de presentación en fagos descrita más abajo los anticuerpos obtenidos tienen una afinidad o valor K de 10^{7} litros/mol o más.

Avidez del anticuerpo

Como se ha indicado antes el término "afinidad" describe la unión de un anticuerpo a un determinante antigénico individual. Sin embargo, en las circunstancias más prácticas inquieta la interacción de un anticuerpo con un antígeno multivalente. El término "avidez" se utiliza para expresar esta unión. Los factores que contribuyen a la avidez son complejos y entre ellos se incluyen la heterogeneidad de los anticuerpos en un suero dado que están dirigidos a cada determinante del antígeno y la heterogeneidad de los determinantes en si mismos. La multivalencia de la mayoría de los antígenos conduce a un interesante efecto "bonus" en el cual la unión de dos moléculas antigénicas por anticuerpo es siempre mayor, normalmente muchas veces mayor, que la suma aritmética de las conexiones del anticuerpo individuales. Así, se puede entender que la avidez medida entre un antisuero y un antígeno multivalente será algo mayor que la afinidad entre un anticuerpo y un determinante antigénico individual.

Ratones PrP nulos para elaborar anticuerpos

La presente invención supera los problemas de tolerancia y genera más eficazmente paneles de anticuerpos monoclonales capaces de reconocer diversos epítopos en Mo y otras PrP utilizando en parte ratones con ambos alelos del gen PrP (Prnp) suprimidos (Prnp^{0/0}) (Bueler, y col. 1.992). Estos ratones deficientes en PrP (o ratones nulos), son indistinguibles de los ratones normales en su desarrollo y comportamiento. Estos ratones nulos son resistentes al scrapie tras la inoculación cerebral de MpPrP^{Sc} infecciosas (Bueler, y col. 1.993 Cell; Prusiner, y col, PNAS 1.993). Además los ratones Prnp^{0/0} desarrollarán títulos en suero de IgG frente a PrP Mo-, SHa y humana tras la inmunización con cantidades relativamente pequeñas de SHaPrP 27-30 purificada en coadyuvante (Prusiner, y col, PNAS 1.993). Tras conceder tiempo suficiente para generar anticuerpos los ratones Prnp^{0/0} inmunizados fueron sacrificados para la producción de hibridoma de la manera convencional. Las fusiones derivadas de estos ratones secretaban anticuerpo específico para PrP. Sin embargo, estos hibridomas no secretarían anticuerpos específicos para PrP durante más de unas horas. En vista del éxito algo limitado se tomó un enfoque diferente.

Presentación en fagos

La tecnología de la genoteca de anticuerpos combinatoria, es decir, la selección basada en antígenos de genotecas de anticuerpos expresados en la superficie del fago filamentoso M13, ofrece un nuevo enfoque para la generación de anticuerpos monoclonales y posee numerosas ventajas en relación con las metodologías del hibridoma que son particularmente pertinentes para el problema de los priones (Huse, y col, 1.989; Barbas, y col, 1.991; Clackson, y col, 1.991; Burton y Barbas, 1.994). En la presente invención se utiliza semejante tecnología para proporcionar anticuerpos monoclonales específicos de PrP de genotecas de anticuerpos de fagos preparadas a partir de ratones Prnp^{0/0} inmunizados con MoPrP. La invención proporciona los primeros anticuerpos monoclonales que reconocen MoPrP in situ y muestra la aplicación de genotecas combinatorias para anticuerpos específicos a partir de ratones nulos. Las metodologías generales implicadas en la creación de grandes genotecas combinatorias utilizando la tecnología de presentación en fagoa se describen y revelan en la Patente de los Estados Unidos 5.223.409 expedida el 29 de Junio de 1.993 cuya patente se incorpora aquí como referencia para revelar y describir la metodología de la presentación en fagos.

Animales nulos

La invención se describe aquí en gran parte con respecto a ratones nulos es decir, ratones FVB con ambos alelos del gen PrP suprimidos. No obstante, se pueden utilizar otros animales huésped y los animales huésped preferidos son ratones y hámsteres, siendo los más preferidos los ratones ya que existe un conocimiento considerable de la producción de animales transgénicos. Entre los posibles animales huésped se incluyen aquellos pertenecientes a un género seleccionado entre Mus (v.g. ratones), Rattus (v.g. ratas), Oryctolagus (v.g. conejos), y Mesocricetus (v.g. hámsteres) y Cavia (v.g., cobayas). En general se pueden utilizar mamíferos con un peso corporal adulto totalmente desarrollado normal de menos de 1 kg que sean fáciles de criar y mantener.

Gen PrP

El material genético que constituye el gen PrP es conocido para numerosas especies de animales diferentes (ver Gabriel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1.992)). Adicionalmente, existe una considerable homología entre los genes PrP de diferentes mamíferos. Por ejemplo, ver la secuencia de aminoácidos de PrP de ratón en comparación con la de PrP humana, vaca y oveja de las Figuras 2, 3 y 4 donde sólo se muestran las diferencias. Aunque existe una considerable homología genética con respecto a los genes PrP, las diferencias son significativas en algunos casos. Más específicamente, debido a pequeñas diferencias en la proteína codificada por el gen PrP de diferentes mamíferos, un prión que infecte un mamífero (v.g. un humano) no infectará normalmente un mamífero diferente (v.g. un ratón). Debido a esta "barrera de especie", generalmente no es posible utilizar animales normales (esto es, animales que no hayan tenido su material genético relacionado con proteínas PrP manipuladas) tales como ratones para determinar si una muestra concreta contiene priones que normalmente infectarían una especie diferente de animal tal como un humano. La presente invención resuelve este problema proporcionando anticuerpos que se unen a proteínas PrP^{Sc} nativas de cualquier especie de animal para las cuales se diseña el anticuerpo.

Mutaciones y polimorfismos patógenos

Existe un número conocido de mutaciones patógenas en el gen PrP humano. Adicionalmente, se conocen polimorfismos en los genes PrP humanos, de oveja y bovinos. La siguiente es una lista de tales mutaciones y polimorfismos:

\newpage

Mutaciones	Polimorfismo	Polimorfismo	Polimorfismo
patógenas	Humano	Oveja	Bovino
humanas	s	s	ms
inserto de 2	Codón 129	Codón 171	5 ó 6 octa-
octarrepeticiones	Met/Val	Arg/Glu	repeticiones
inserto de 4	Codón 129	Codón 171	5 ó 6 octa-
octarrepeticiones	Met/Val	Arg/Glu	repeticiones
inserto de 5
octarrepeticiones
inserto de 6
octarrepeticiones
inserto de 7
octarrepeticiones
inserto de 8
octarrepeticiones
inserto de 95
octarrepeticiones
Codón 102
Pro-Leu
Codón 105
Pro-Leu
Codón 117
Ala-Val
Codón 145
Terminación
Codón 178
Asp-Asn
Codón 180
Val-Ile
Codón 198
Phe-Ser
Codón 200
Glu-Lys
Codón 210
Val-Ile
Codón 217
Asn-Arg
Codón 232
Met-Ala

La secuencia de ADN de los genes PrP de humano, oveja y vaca han sido determinadas, permitiendo, en cada caso, la predicción de la secuencia de aminoácidos completa de sus respectivas proteínas PrP. La secuencia de aminoácidos normal que existe en la vasta mayoría de los individuos es referida como secuencia PrP de tipo salvaje. Esta secuencia de tipo salvaje está sujeta a ciertas variaciones polimórficas características. En el caso de la PrP humana, existen dos aminoácidos polimórficos en los restos 129 (Met/Val) y 219 (Glu/Lys). La PrP de oveja tiene dos polimorfismos de aminoácidos en los restos 171 y 136, mientras la PrP bovina tiene cinco o seis repeticiones de una secuencia unidad de ocho aminoácidos en la región amino terminal de la proteína priónica madura. Si bien ninguno de estos polimorfismos son por si mismos patógenos, parecen influir en las enfermedades priónicas. Diferentes de estas variaciones normales de las proteínas PrP de tipo salvaje, se han identificado ciertas mutaciones del gen PrP humano que alteran o bien los restos aminoácido específicos de PrP o bien el número de octarrepeticiones que han sido identificadas que segregan las enfermedades priónicas humanas heredadas.

Con el fin de proporcionar más significado al diagrama anterior que muestra las mutaciones y polimorfismos, se puede hacer referencia a las secuencias de PrP publicadas. Por ejemplo, se describen y se publican un gen PrP de pollo, bovino, de oveja, de rata y de ratón en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9097-9101 (1.992) de Gabriel y col. La secuencia para el hámster Sirio se publica en Cell 46:417-428 (1.986) de Basler y col. El gen PrP de oveja se publica en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2476-2480 (1.990) de Goldmann y col. La secuencia del gen PrP para bovinos se publica en J. Gen. Virol. 72:201-204 (1.991) de Goldmann y col. La secuencia del gen PrP de pollo se publica en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7664-7668 (1.991) de Harris y col. La secuencia del gen PrP para visón se publica en J. Gen. Virol. 73:2757-2761 (1.992) de Kretzschmar y col. La secuencia del gen PrP humano se publica en DNA 5:315-324 (1.986) de Kretzschmar y col. La secuencia del gen PrP de ratón se publica en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:6372-6376 (1.986) de Locht y col. La secuencia del gen PrP de oveja se publica en Genes Dev. 8:959-969 (1.994) de Westaway. Todas estas publicaciones se incorporan aquí como referencia para revelar y describir el gen PrP y las secuencias de aminoácidos de PrP.

"Cepas" de priones humanos

Los estudios en roedores han demostrado que las cepas de priones producen diferentes patrones de acumulación de PrP^{Sc} [Hecker y col., Genes & Development 6:1213-1228 (1.992); DeArmond y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6449-6453 (1.993)]; que han sido cambiados espectacularmente por la secuencia de PrP^{Sc} [Carlson y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA en imprenta (1.994)]. La base molecular de la diversidad de los priones ha sido atribuida durante muchos años a un ácido nucleico específico del scrapie [Bruce y col., J. Gen. Virol. 68:79-89 (1.987)] pero no se ha encontrado ninguno [Meyer y col., J. Gen. Virol. 72:37-49 (1.991); Kellings y col., J. Gen. Virol. 73:1025-1029 (1.992)]. Entre otras hipótesis para explicar las cepas de priones se incluyen las variaciones en las cadenas de azúcar conectadas a Asn de PrP [Hecker y col., Genes & Development 6:1213-1228 (1.992)] y múltiples confórmeros de PrP^{Sc} [Prusiner, S.B., Science 252:1515-1522 (1.991)]. Los patrones de PrP^{Sc} en ratones Tg(MHu2M) eran notablemente similares para los tres inóculos de humanos que morían por CJD.

Los patrones de la acumulación de PrP^{Sc} en los cerebros de ratones Tg(MHu2M) inoculados eran notablemente diferentes para los priones RML y los priones Hu. Sin embargo, los inóculos de prión RML que contenían MoPrP^{Sc} estimulaban la formación de más MoPrP^{Sc} mientras los inóculos de prión Hu que contenían HuPrP^{CJD} desencadenaban la producción de MHu2MPrP^{Sc}. La distribución de cambios neuropatológicos caracterizados por la vacuolación neuronal y la gliosis astrocítica es similar para los patrones de acumulación de PrP^{Sc} en los cerebros de ratones Tg(MHu2M) inoculados con priones RML o priones Hu.

Preparación de priones normalizada

Se pueden producir preparaciones de priones normalizadas con el fin de someter a ensayo los análisis de la invención y de ese modo mejorar la fiabilidad del análisis. Aunque la preparación puede ser obtenida a partir de cualquier animal se obtiene preferiblemente a partir de un animal huésped que tienen material cerebral que contiene priones de un animal de ensayo. Por ejemplo, un ratón transgénico que contiene un gen de una proteína priónica humana puede producir priones humanos y el cerebro de semejante ratón puede ser utilizado para crear una preparación de priones humanos normalizada. Adicionalmente, ya que la preparación es para un "patrón", ésta se obtiene preferiblemente a partir de una batería (v.g., 100; 1.000, o más animales) de animales sustancialmente idénticos. Por ejemplo, 100 ratones que contienen todos un número de copias de los genes PrP humanos muy elevado (todos los polimorfismos y mutaciones) desarrollarían espontáneamente la enfermedad y el tejido cerebral de cada uno podría ser combinado para elaborar una preparación priónica normalizada útil.

Las preparaciones priónicas normalizadas pueden ser producidas utilizando cualquier mamífero huésped modificado del tipo descrito antes. Por ejemplo, las preparaciones priónicas normalizadas podían ser producidas utilizando ratones, ratas, hámsteres, o cobayas que están modificados genéticamente de manera que sean susceptibles de infección con priones cuyos priones sólo infectarían generalmente especies diversas tales como un humano, una vaca, una oveja o un caballo y cuyos mamíferos huésped modificados desarrollarán signos clínicos de disfunción del CNS en un período de tiempo de 350 días o menos tras la inoculación con priones. El mamífero huésped más preferido es un ratón en parte porque son poco costosos para su uso y porque se ha obtenido mayor cantidad de experiencia con respecto a la producción de ratones transgénicos que con respecto a la producción de otros tipos de animales huésped. Los detalles referentes a la elaboración de preparaciones priónicas normalizadas se describen en la solicitud de Patente de los Estados Unidos titulada "Method of Detecting Prions in a Sample and Transgénic Animal Used For Same" presentada el 31 de Agosto de 1.995, Núm. de Serie 08/521.992 y solicitud de Patente de los Estados Unidos titulada "Detecting Prions In A Sample And Prion Preparation And Transgenic Animal Used For Same" Extracto del Apoderado Núm. 06510/056001, presentada el 30 de Julio de 1.996 ambas las cuales se incorporan aquí como referencia.

Una vez que se elige un tipo de huésped, tal como un ratón, la siguiente etapa es elegir el tipo de manipulación genética apropiada que se va a utilizar para producir una formulación priónica normalizada. Por ejemplo, los ratones pueden ser ratones que estén modificados genéticamente por la inserción de un gen quimérico de la invención. En este grupo los ratones podrían estar modificados incluyendo elevados números de copias del gen quimérico y/o por la inclusión de múltiples promotores con el fin de incrementar el nivel de expresión del gen quimérico. Alternativamente, se podrían utilizar ratones híbridos de la invención en los que los ratones que tienen el gen PrP endógeno suprimido están cruzados con ratones que tienen un gen PrP humano insertado en su genoma. Existen, por supuesto, diversas subcategorías de tales ratones híbridos. Por ejemplo, el gen PrP humano puede ser insertado en un elevado número de copias y/o utilizado con múltiples promotores para intensificar la expresión. En otra alternativa más los ratones podrían ser producidos insertando múltiples genes PrP diferentes en el genoma con el fin de crear ratones que sean susceptibles de infección con una variedad de priones diferentes, es decir, que generalmente infectan dos o más tipos de animales de ensayo. Por ejemplo, se podría crear un ratón que incluyera un gen quimérico incluyendo parte de la secuencia de humano, un gen quimérico separado que incluyera parte de la secuencia de vaca y otro gen quimérico más que incluyera parte de la secuencia de oveja. Si los tres tipos diferentes de genes quiméricos fueran insertados en el genoma del ratón el ratón sería susceptible de infección con priones que generalmente sólo infectan humanos, vacas y ovejas.

Tras elegir el mamífero apropiado (v.g., un ratón) y el modo de modificación genética apropiado (v.g., insertando un gen PrP quimérico) la siguiente etapa es producir un gran número de tales mamíferos que sean sustancialmente idénticos en términos de material genético referente a los priones. Más específicamente, cada uno de los ratones producidos incluirá un gen quimérico idéntico presente en el genoma sustancialmente en el mismo número de copias. Los ratones deben ser suficientemente idénticos genéticamente en términos de material genético referente a los priones para que el 95% o más de los ratones desarrollen signos clínicos de disfunción del CNS en 350 días o menos tras la inoculación y todos los ratones desarrollen tal disfunción del CNS en aproximadamente el mismo tiempo v.g., \pm 30 días unos de otros.

Una vez que un grupo grande v.g., 50 o más, más preferiblemente 100 o más, aún más preferiblemente 500 o más de tales ratones son producidos. La siguiente etapa es inocular los ratones con priones que generalmente sólo infectan un mamífero genéticamente diverso v.g., priones de un humano, oveja, vaca o caballo. Las cantidades dadas para los diferentes grupos de mamíferos se pueden variar. Tras la inoculación de los mamíferos con los priones los mamíferos son observados hasta que los mamíferos manifiestan síntomas de infección por priones v.g. signos clínicos de disfunción del CNS. Tras manifestar los síntomas de la infección por priones se extrae el cerebro o al menos una porción del tejido cerebral de los mamíferos. El tejido cerebral extraído es homogeneizado lo que proporciona la preparación priónica normalizada.

Como alternativa para inocular el grupo de ratones transgénicos con priones de un animal diverso genéticamente es posible producir ratones que desarrollen espontáneamente enfermedades relacionadas con priones. Esto se puede realizar, por ejemplo, incluyendo números extremadamente elevados de copias de un gen PrP humano en un genoma de ratón. Cuando el número de copias se eleva, por ejemplo, a 100 o más copias, el ratón desarrollará espontáneamente signos clínicos de disfunción del CNS y tendrá, en su tejido cerebral, priones que son capaces de infectar humanos. Los cerebros de estos animales o las porciones del tejido cerebral de estos animales pueden ser extraídos y homogeneizados para producir una preparación priónica normalizada.

Las preparaciones priónicas normalizadas pueden ser utilizadas directamente o pueden ser diluidas y tituladas de una manera tal que proporcionen una variedad de controles positivos diferentes. Más específicamente, se pueden utilizar diversas cantidades conocidas de tal preparación normalizada para inocular un primer grupo de ratones de control transgénicos. Un segundo grupo de ratones sustancialmente idénticos es inoculado con un material que se va a someter a ensayo es decir, un material que puede contener priones. Un tercer grupo de ratones sustancialmente idénticos no es inyectado con ningún material. Después se observan los tres grupos. El tercer grupo, por supuesto, no debe ponerse enfermo ya que a los ratones no se les inyecta ningún material. Si tales ratones se ponen enfermos el análisis no es exacto debido probablemente al resultado de producción de ratones que desarrollan espontáneamente la enfermedad. Si el primer grupo, al que se ha inyectado una preparación normalizada, no se pone enfermo el análisis también es inexacto debido probablemente a que los ratones no han sido creados correctamente de manera que se ponen enfermos cuando son inoculados con priones que generalmente sólo infectan un mamífero diverso genéticamente. Sin embargo, si el primero grupo enferma y el tercer grupo no enferma se puede suponer que el análisis es exacto. Así, si el segundo grupo no enferma el material de ensayo no contiene priones y si el segundo grupo enferma el material de ensayo contiene priones.

Utilizando las preparaciones priónicas normalizadas de la invención es posible crear composiciones extremadamente diluidas que contengan priones. Por ejemplo, se puede detectar una composición que contiene una parte por millón o menos o incluso una parte por millardo o menos. Semejante composición puede ser utilizada para someter a ensayo la sensibilidad de los anticuerpos, análisis y métodos de la invención en la detección de la presencia de priones.

Las preparaciones priónicas son deseables ya que incluirán una cantidad constante de priones y son extraídas de un fondo isogénico. Por consiguiente, los productos contaminados de las preparaciones serán constantes y controlables. Las preparaciones priónicas normalizadas serán útiles al llevar a cabo bioanálisis con el fin de determinar la presencia, si la hubiera, de priones en diversos productos farmacéuticos, sangre completa, fracciones de sangre, alimentos, cosméticos, órganos y en particular cualquier material que derive de un animal (vivo o muerto) tal como órganos, sangre y productos de la misma derivados de humanos vivos o muertos. Así, las preparaciones priónicas normalizadas serán valiosas en la validación de los protocolos de purificación en los que las preparaciones son pinchadas y las reducciones del título son medidas para un proceso concreto.

Aplicaciones útiles

Como se ha indicado antes y se describe adicionalmente más abajo en ejemplos detallados es posible utilizar la metodología de la invención para crear una amplia gama de anticuerpos diferentes, es decir, anticuerpos que tengan diferentes rasgos específicos. Por ejemplo, se pueden crear anticuerpos que se unan sólo a una proteína priónica de origen natural de una única especie y no se una a una proteína priónica de origen natural de otra especie. Adicionalmente, el anticuerpo puede ser diseñado de manera que se una sólo a una forma infecciosa de una proteína priónica (v.g., PrP^{Sc}) y no se una a una forma no infecciosa (v.g., PrP^{c}). Después se pueden utilizar un único anticuerpo o una batería de anticuerpos diferentes para crear un dispositivo de análisis. Semejante dispositivo de análisis puede ser preparado utilizando la tecnología convencional conocida por los expertos en la técnica. El anticuerpo puede ser purificado y aislado utilizando mecanismos conocidos y unido a la superficie de un soporte utilizando procedimientos conocidos. La superficie resultante que tiene un anticuerpo unido a ella puede ser utilizada para analizar una muestra in vitro para determinar si la muestra contiene uno o más tipos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos que se unen sólo a la PrP^{Sc} humana pueden ser anclados a la superficie de un material y la muestra puede ser desnaturalizada vía proteinasa K. La muestra desnaturalizada se pone en contacto con los anticuerpos unidos a la superficie del material. Si no se produce unión se puede deducir que la muestra no contiene PrP^{Sc} humana.

Los anticuerpos de la invención también se caracterizan por su capacidad para neutralizar priones. Específicamente, cuando se deja que los anticuerpos de la invención se unan a los priones se elimina la infectividad del prión. Por consiguiente, las composiciones de anticuerpos de la invención pueden ser añadidas a cualquier producto dado con el fin de neutralizar cualquier proteína infecciosa del producto. De ese modo, si se elabora un producto a partir de una fuente natural que podría contener proteínas priónicas infecciosas los anticuerpos de la invención podrían ser añadidos como precaución eliminando de ese modo cualquier infección potencial resultante de proteínas priónicas infecciosas.

Los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados en relación con la tecnología de la cromatografía de inmunoafinidad. Más específicamente, los anticuerpos pueden ser colocados sobre la superficie de un material en una columna de cromatografía. Después de eso, se puede hacer pasar por la columna una composición que se vaya a purificar. Si la muestra que se va a purificar incluye cualquier proteína priónica que se una a los anticuerpos esas proteínas priónicas (PrP^{Sc}) serán eliminadas de la muestra y de ese modo purificadas.

Por último, los anticuerpos de la invención pueden ser utilizados para tratar un mamífero. Los anticuerpos pueden ser administrados profilácticamente o pueden ser administrados a un individuo ya infectado con proteínas priónicas infecciosas habiéndose determinado semejante infección mediante el uso del análisis descrito antes. La cantidad exacta de anticuerpo que se vaya a administrar variará dependiendo de numerosos factores tales como la edad, el sexo, el peso y el estado del paciente. Los expertos en la técnica pueden determinar la cantidad precisa administrando anticuerpos en pequeñas cantidades y determinando el efecto y ajustando después la dosis. Se sugiere que la dosificación puede variar de 0,01 mg/kg a aproximadamente 300 mg/kg, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg, más preferiblemente de aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg en una o más administraciones diarias de la dosis, durante uno o varios días. Se prefiere la administración del anticuerpo durante 2 a 5 o más días consecutivos con el fin de evitar "el rebote" de la infectividad priónica existente.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se muestran a fin de proporcionar a los expertos en la técnica una descripción y una revelación completas de cómo elaborar y utilizar los genes quiméricos, los ratones transgénicos y los análisis de la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los autores de la presente invención consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g. cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderal, la temperatura es en grados Centígrados, y la presión es la atmosférica o esta próxima a ella.

Construcción de genotecas de anticuerpos presentados en fagos que expresan anticuerpos (Fabs)

La construcción de genotecas de presentación en fagos para la expresión de anticuerpos, concretamente la porción Fab de los anticuerpos, es bien conocida en la técnica. Preferiblemente, las genotecas de anticuerpos de presentación en fagos que expresan anticuerpos son preparadas según los métodos descritos en la Patente de los Estados Unidos 5.223.409, presentada el 29 de Junio de 1.993 y la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 07/945.515, presentada el 16 de Septiembre de 1.992, incorporadas aquí como referencia. Los procedimientos de la metodología general pueden ser adaptados utilizando la presente descripción para producir los anticuerpos de la presente invención.

Aislamiento de ARN que codifica anticuerpos específicos de priones

En general, las genotecas de anticuerpos anti-PrP de presentación en fagos se preparan aislando primero una reserva de ARN que contiene el ARN que codifica los anticuerpos anti-PrP. Para lograr esto, se inmuniza un animal (v.g., un ratón, rata, o hámster) con un prión de interés. No obstante, los animales normales no producen anticuerpos para priones a niveles detectables o satisfactoriamente elevados. Este problema se evita inmunizando animales en los que el gen (PrP) ha sido suprimido en ambos alelos. Tales ratones se denominan Prnp^{0/0} y los métodos para elaborar tales ratones los describen Büeler, Nature (1.992) y la Publicación de Weismann WO 93/10227, publicada el 27 de Mayo de 1.993. La inoculación de animales "nulos" con priones da como resultado la producción de títulos en suero de IgG contra el prión (Prusiner y col. PNAS 1.993). En una realización preferida, el animal seleccionado para la inmunización es un ratón Prnp^{0/0} descrito por Büeler y Weismann.

Generalmente, la cantidad de prión necesaria para lograr una respuesta de anticuerpos en suero en un animal "nulo" es de aproximadamente 0,01 mg/kg a aproximadamente 500 mg/kg.

La proteína priónica se administra generalmente al animal mediante inyección, preferiblemente intraperitoneal o inyección intravenosa, más preferiblemente mediante inyección intraperitoneal. Los animales son inyectados una vez, con al menos 1 a 4 inyecciones de refuerzo posteriores, preferiblemente al menos 3 inyecciones de refuerzo. Tras la inmunización, la reactividad de los antisueros de los animales con el prión puede ser sometida a ensayo utilizando análisis inmunológicos normalizados, tales como ELISA o transferencia Western, según los métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Harlow y Lane, 1.988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Los animales que tienen antisueros de unión a priones pueden ser reforzados con una inyección adicional de prión.

Los niveles de anticuerpos en suero pronostican secreción de anticuerpos, y por lo tanto de niveles de ARNm específico en linfocitos, concretamente en las células del plasma. La detección de anticuerpos en suero, concretamente niveles relativamente altos de anticuerpos en suero, se corresponde por tanto con un elevado nivel de linfocitos tales como células del plasma productoras de ARNm que codifica aquellos anticuerpos del suero. Así, las células del plasma aisladas de ratones inmunizados con proteína priónica contendrán una elevada proporción de linfocitos (v.g., células del plasma) que producen anticuerpos específicos de priones, concretamente cuando las células del plasma son aisladas de los ratones en un corto período de tiempo después de la inyección de refuerzo final (v.g., aproximadamente 2 a 5 días, preferiblemente 3 días). La inmunización de los ratones y las posteriores inyecciones de refuerzo sirven así para incrementar el porcentaje total de células del plasma productoras de anticuerpos anti-PrP presentes en la población total de las células del plasma del ratón. Por otra parte, debido a que los anticuerpos anti-PrP están siendo producidos en los niveles pico del suero o cerca de ellos, las células del plasma productoras de anticuerpos anti-PrP están produciendo anticuerpos anti-PrP, y de ese modo ARNm que codifica estos anticuerpos en los niveles del pico o cerca de ellos.

La correlación anterior entre los niveles en suero de anticuerpos específicos del antígeno, el número de linfocitos que producen esos anticuerpos específicos del antígeno, y la cantidad de ARNm total que codifica los anticuerpos específicos del antígeno proporciona un medio para aislar una reserva de ARNm que está enriquecida en ARNm que codifica los anticuerpos específicos del antígeno de interés. Los linfocitos, incluyendo las células del plasma son aislados del bazo y/o la médula ósea de animales inmunizados con priones según métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Huse y col. Science 1.989). Preferiblemente los linfocitos son aislados aproximadamente de 2 a 5 días, preferiblemente aproximadamente 3 días después del refuerzo de inmunización final. El ARN total es extraído después de estas células. Los métodos para el aislamiento de células de mamífero son bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., 1.989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).

Producción de ADNc que codifica anticuerpos a partir de ARNm de linfocitos

El ADNc es producido a partir de ARN aislado utilizando la transcriptasa inversa según los métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra), y el ADNc que codifica las cadenas pesadas o las cadenas ligeras del anticuerpo es amplificado utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los cebadores 3' utilizados para amplificar los ADNc que codifican la cadena pesada o la cadena ligera se basan en secuencias de nucleótidos conocidas comunes a los anticuerpos con cadena pesada o con cadena ligera de una subclase de anticuerpos específica. Por ejemplo, un grupo de cebadores basados en la región constante del gen que codifica la cadena pesada de IgG1 puede ser utilizado para amplificar cadenas pesadas de la subclase IgG1, mientras otro grupo de cebadores basados en la porción constante del gen que codifica la cadena ligera de IgG1 se utiliza para amplificar las cadenas ligeras de la subclase IgG1. Los cebadores 5' son secuencias consenso basadas en el examen de un gran número de secuencias variables en la base de datos. De esta manera, el ADN que codifica todos los anticuerpos de una clase o subclase de anticuerpos específicos son amplificados prescindiendo de la especificidad de antígeno de los anticuerpos codificados por el ADN amplificado. El gen completo que codifica la cadena pesada o la cadena ligera puede ser amplificado. Alternativamente, sólo una porción del gen que codifica la cadena pesada o ligera puede ser amplificada, con la condición de que el producto de la amplificación por PCR codifique un producto génico de la cadena pesada o ligera que se pueda asociar con su correspondiente cadena pesada o ligera y funcionar en la unión al antígeno es decir, se una selectivamente a una proteína priónica. Preferiblemente, el producto presentado en fagos es un fragmento de anticuerpo Fab o Fv.

El ADNc que codifica el anticuerpo seleccionado para la amplificación puede codificar cualquier isotipo y preferiblemente codifica una subclase de IgG. Entre las subclases de IgG de rataón ejemplares se incluyen IgG1, IgG2a, IgG2b, e IgG3. La selección del ADNc que codifica la subclase de anticuerpo específica para la amplificación variará según una variedad de factores, incluyendo, por ejemplo, la respuesta de los anticuerpos del suero del animal al antígeno. Preferiblemente, el ADNc que codifica la subclase de anticuerpos seleccionada para la amplificación mediante PCR es aquella subclase de anticuerpos para la cual el animal producía el título más elevado de anticuerpos. Por ejemplo, si los títulos de IgG1 en suero son superiores a los de cualquier otra subclase de IgG detectada en la respuestas de anticuerpos del suero, el ADNc que codifica la IgG1 es amplificado a partir de la reserva de ADNc.

Preferiblemente, se amplifican las cadenas pesada y ligera del ADNc de las células del plasma para producir dos reservas de ADNc amplificadas separadas: 1) una reserva de ADNc que contiene los amplímeros producto del ADNc de la cadena pesada, donde la cadena pesada es de una subclase de anticuerpo específica; y 2) una reserva de ADNc que contiene los amplímeros producto del ADNc de la cadena ligera, donde la cadena ligera es de una subclase de anticuerpos específica.

Anticuerpos de animales transgénicos

Además de obtener material genético que codifica anticuerpos infectando un animal con un antígeno y extrayendo después de eso las células (y su ADN) responsables de la producción de anticuerpos es posible obtener el material genético produciendo un animal transgénico o utilizando la tecnología anteriormente descrita y la tecnología de los animales transgénicos con el fin de producir anticuerpos ratón/humano quiméricos o totalmente humanos. La tecnología para producir inmunoglobulinas quiméricas o totalmente foráneas implicar obtener, a partir de células de animales transgénicos que han tenido insertado en su línea germinal, un material genético que codifica toda o parte de la inmunoglobulina que se une al antígeno deseado. Se pueden producir anticuerpos totalmente humanos a partir de ratones transgénicos que han tenido insertado en su genoma material genético que codifica anticuerpos humanos. La tecnología para producir tales anticuerpos a partir de animales transgénicos se describe en la Publicación PCT Núm. WO 90/04036, publicado el 19 de Abril de 1.990. Adicionalmente, ver Goodhartd, y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 84, páginas 4229-4233, Junio de 1.987 y Bucchine y col. Nature, Vol. 326, páginas 409-411, 26 de Marzo de 1.987, todas las cuales describen y revelan métodos para producir anticuerpos a partir de animales transgénicos.

Vectores para su uso con las genotecas de anticuerpos de presentación en fagos

Los ADNc que codifican la cadena pesada y los ADNc que codifican la cadena ligera son insertados cada uno en casetes de expresión separados de un vector apropiado. Preferiblemente el vector contiene una secuencia de nucleótidos que codifica y es capaz de expresar un polipéptido de fusión que contiene, en la dirección del extremo amino al carboxi, 1) un dominio de la señal de secreción procariótica, 2) un sitio de inserción para el ADN que codifica un polipéptido heterólogo (v.g., un ADNc que codifica o bien la cadena pesada o bien la ligera), y en el casete de expresión para el ADNc de la cadena pesada 3) un dominio ancla a la membrana del fago filamentoso.

En el vector se incluyen secuencias de control de la expresión del ADN procariótico o de mamífero para expresar el polipéptido de fusión, preferiblemente secuencias de control procariótico. Las secuencias de control de la expresión del ADN pueden incluir cualquier señal de expresión para expresar un producto génico estructural, y pueden incluir elementos 5' o 3' conectados operativamente al casete de expresión para la expresión del polipéptido heterólogo. La secuencia de control 5' define un promotor para iniciar la transcripción, y un sitio de unión al ribosoma conectado operativamente al extremo 5' de la secuencia traducible aguas arriba. En el vector se incluye adicionalmente un origen de replicación para el mantenimiento y la replicación en una célula procariótica, preferiblemente una célula gram negativa tal como E. coli. En el vector también se pueden incluir genes cuya expresión confiere una ventaja selectiva, tal como la resistencia a fármacos, a una célula procariótica o eucariótica transformada con el vector.

El ancla a la membrana del fago filamentoso es preferiblemente un dominio de la proteína de la envuelta cpIII o cpVIII capaz de asociarse con la matriz de una partícula del fago filamentoso, incorporando de ese modo el polipéptido de fusión sobre la superficie del fago. La señal de secreción es un dominio del péptido líder de una proteína que dirige la proteína a la membrana periplasmática de las bacterias gram negativas. Tales secuencias líder para las bacterias gram negativas (tales como E. coli) son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo, Oliver, In Neidhard, F.C. (ed.), Escherichia coli and Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1:56-69, 1.987).

Anclas a la membrana del fago filamentoso para su uso en el vector de presentación del fago

Las anclas a la membrana preferidas para el vector son obtenibles a partir de los fagos filamentosos M13, f1, fd, y fagos filamentosos equivalentes. Los dominios ancla a la membrana preferidos se encuentran en las proteínas de la envuelta codificadas por el gen III y el gen VIII. El dominio ancla a la membrana de una proteína de la envuelta de un fago filamentoso es una porción de la región carboxi terminal de la proteína de la envuelta e incluye una región de restos aminoácido hidrófobos para abarcar una membrana de bicapa lipídica, y una región de restos aminoácido cargados que se encuentra normalmente en la cara citoplásmica de la membrana y se extiende más allá de la membrana. En el fago f1, la región que abarca la membrana de las proteínas de la envuelta del gen VIII comprende los 11 restos carboxi terminales desde el 41 al 52 (Ohkawa y col., J. Biol. Chem., 256:9951-9958, 1.981). Un ancla a la membrana ejemplar constaría de los restos 26 a 41 de cpVIII. Así, la secuencia de restos aminoácido de un dominio ancla a la membrana preferido deriva de la proteína de la envuelta del gen VIII del fago filamentoso M13 (también denominado cpVIII o CP 8). La proteína de la envuelta del gen VIII está presente en un fago filamentoso maduro sobre la mayoría de la partícula del fago típicamente con aproximadamente 2.500 a 3.000 copias de la proteína de la envuelta.

La secuencia de restos aminoácido de otro dominio ancla a la membrana preferido deriva de la proteína de la envuelta del gen III del fago filamentoso M13 (también denominada cpIII). La proteína de la envuelta del gen III está presente en un fago filamentoso maduro en un extremo de la partícula del fago típicamente con aproximadamente 4 a 6 copias de la proteína de la envuelta. Las descripciones detalladas de la estructura de las partículas de fagos filamentosos, sus proteínas de la envuelta, y el ensamblaje de las partículas se encuentran en las revisiones de Rachel y col., (Microbiol. Rev., 50:401-427, 1.986) y Model y col. (En: The Bacteriophages: Vol. 2, R. Calendar, ed. Plenum Publishing Co., págs. 375-456, 1.988).

Preferiblemente, el ADN que codifica el ancla a la membrana del fago filamentoso es insertado 3' del inserto de ADNc del vector de la genoteca de manera que el ADN que codifica el ancla a la membrana del fago pueda ser fácilmente separado cortando y el vector relegado sin desorganizar el resto de los casetes de expresión del vector. La separación del ADN que codifica el ancla a la membrana del fago del vector, y la expresión de este vector en una célula huésped apropiada, da como resultado la producción de fragmentos de anticuerpo solubles (Fab). Los fragmentos Fab solubles conservan la antigenicidad del Fab unido al fago, y por tanto pueden ser utilizados en análisis y terapias de la manera que se utilizan los anticuerpos completos (no fragmentados).

El vector para su uso con la presente invención debe ser capaz de expresar un receptor heterodimérico (tal como un anticuerpo o Fab de anticuerpo). Esto es, el vector debe ser capaz de contener y expresar independientemente dos insertos de ADNc separados (v.g., el ADNc de la cadena pesada y el ADNc de la cadena ligera). Cada casete de expresión puede incluir los elementos descritos antes, excepto que el ADN que codifica el ancla a la membrana del fago filamentoso esté presente sólo en el casete de expresión para el ADNc de la cadena pesada. Así, cuando el anticuerpo o Fab es expresado sobre la superficie del fago, sólo el polipéptido de la cadena pesada está anclado a la superficie del fago. La cadena ligera no está directamente unida a la superficie del fago, sino que está indirectamente unida al fago vía su asociación con la porción libre del polipéptido de la cadena pesada (es decir, la porción de cadena pesada que no está unida a la superficie del fago).

Preferiblemente, el vector contiene una secuencia de nucleótidos que permite la ligadura direccional, es decir, un poliligador. El poliligador es una región del vector de expresión de ADN que conecta operativamente la secuencia de ADN traducible aguas arriba y aguas abajo para la replicación y el transporte, y proporciona un sitio o medio para la ligadura direccional de una secuencia de ADN en el vector. Típicamente, un poliligador direccional es una secuencia de nucleótidos que define dos o más secuencias de reconocimiento para endonucleasas de restricción, o sitios de restricción. Tras la escisión con una enzima de restricción, los dos sitios rinden extremos cohesivos en los cuales se puede ligar una secuencia de ADN traducible al vector de expresión de ADN. Preferiblemente, los dos extremos cohesivos no son complementarios y de ese modo permiten la inserción direccional del ADNc en el casete. Los poliligadores pueden proporcionar uno o múltiples sitios de clonación direccionales, y pueden ser traducidos o no durante la expresión del ADNc insertado.

Preferiblemente, el vector de expresión es susceptible de manipulación en forma de una partícula del fago filamentoso. Semejantes vectores de expresión de ADN contienen adicionalmente una secuencia de nucleótidos que define un origen de replicación del fago filamentoso de manera que el vector, tras la presentación del complemento genético apropiado, puede replicar como un fago filamentoso en forma replicativa de hebra sencilla, y puede ser empaquetado en partículas del fago filamentoso. Esta característica proporciona la capacidad de que el vector de expresión de ADN sea empaquetado en partículas de fago para el posterior aislamiento de partículas de fago individuales(v.g., mediante infección y replicación en colonias bacterianas aisladas).

Un origen de replicación de un fago filamentoso es una región del genoma del fago que define sitios para el inicio de la replicación, la terminación de la replicación, y el empaquetamiento de la forma replicativa producida por las replicaciones (ver, por ejemplo, Rasched y col., Microbiol. Rev., 50:401-427, 1.986; Horiuchi, J. Mol. Biol., 188:215-223, 1.986). Un origen de replicación de un fago filamentoso preferido para su uso en la presente invención es un origen de replicación del fago M13, f1, o fd (Short y col., Nucl. Acids Res., 16:7583-7600, 1.988). Los vectores de expresión de ADN preferidos son los vectores de expresión pCOMB8, pCKAB8, pCOMB2-8, pCOMB3, pCKAB3, pCOMB2-3, pCOMB2-3' y pCOMB3H.

El vector pCOMB3H es una forma modificada de pCOMB3 en la que (i) las cadenas pesada y ligera son expresadas a partir de un único promotor Lac en oposición a los promotores individuales y (ii) las cadenas pesada y ligera tienen dos secuencias líder diferentes (pg1B y ompA) en oposición a la misma secuencia líder (pHB). Referencia para pComb, Wang, y col. (1.995) J. Mol. Biol., En Imprenta. Los principios de pComb3H son básicamente los mismos que para pComb3.

Producción de la genoteca de anticuerpos de presentación en fagos

Una vez que los ADNc de la cadena pesada y la cadena ligera son clonados en el vector de expresión, la genoteca completa es empaquetada utilizando un fago filamentoso apropiado. Los fagos son utilizados después para infectar un cultivo bacteriano susceptible a los fagos (tal como una cepa de E. coli), se deja que los fagos repliquen y lisen las células, y el producto lisado se aísla de los deshechos bacterianos. El producto lisado de los fagos contiene el fago filamentoso que expresa en su superficie las cadenas pesada y ligera clonadas aisladas del animal inmunizado. En general, las cadenas pesada y ligera están presentes sobre la superficie del fago en forma de fragmentos de anticuerpos Fab, estando anclada la cadena pesada de Fab a la superficie del fago por medio de la porción ancla a la membrana del fago filamentoso del polipéptido de fusión. La cadena ligera está asociada con la cadena pesada con el fin de formar un sitio de unión al antígeno. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se describen en la Patente de los Estados Unidos 4.816.567, expedida el 28 de Marzo de 1.989 por Cabilly, y col. que se incorpora aquí como referencia para describir y revelar tales procedimientos. Adicionalmente, ver Bobrzecka, y col. Immunology Letters, 2, páginas 151-155 (1.980) y Konieczny, y col. Haematologia 14 (1), páginas 85-91 (1.981) también incorporadas aquí como referencia.

Selección de Fabs específicos del antígeno priónico a partir de la genoteca de anticuerpos de presentación en fagos

Los fagos que expresan un anticuerpo o Fab que se une específicamente a un antígeno priónico pueden ser aislados utilizando cualquiera de una variedad de protocolos para la identificación y aislamiento de anticuerpos monoclonales y/o policlonales. Entre tales métodos se incluyen, la purificación por inmunoafinidad (v.g., unión del fago a una columna que tiene un antígeno unido) y métodos de inmunopurificación de anticuerpos (v.g., ciclos repetidos de unión del fago a antígenos unidos a un soporte sólido para la selección de fagos de elevada afinidad de unión al antígeno). Preferiblemente, el fago se selecciona mediante inmunopurificación utilizando mecanismos que son bien conocidos en la técnica.

Tras la identificación y el aislamiento de fagos que expresan anticuerpos anti-PrP, se pueden utilizar los fagos para infectar un cultivo bacteriano, e identificar los productos aislados de fagos individuales. Cada producto aislado de fagos separado puede ser rastreado de nuevo utilizando uno o más de los métodos descritos antes. Con el fin de confirmar adicionalmente la afinidad del fago por el antígeno, y/o para determinar las afinidades relativas del fago por el antígeno, el ADN que codifica los anticuerpos o Fabs puede ser aislado del fago, y las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesada y ligera contenidas en el vector determinadas utilizando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col.).

Aislamiento de Fabs solubles a partir del fago seleccionado de la genoteca de anticuerpos de presentación en fagos

Se pueden producir anticuerpos o Fabs solubles a partir de una presentación modificada del mismo vector dicistrónico separando por corte el ADN que codifica el ancla a la membrana del fago filamentoso que está asociada con el casete de expresión para la cadena pesada del anticuerpo. Preferiblemente, el ADN que codifica el ancla a la membrana está flanqueado por sitios de restricción convenientes que permiten la separación por corte de la secuencia del ancla a la membrana sin desorganizar el resto del casete de expresión de la cadena pesada o desorganización de cualquier otra porción del vector de expresión. El vector modificado sin la secuencia del ancla a la membrana permite después la producción de una cadena pesada soluble así como de una cadena ligera soluble tras el empaquetamiento y la infección de células bacterianas con el vector modificado.

Alternativamente, cuando el vector de expresión contiene las secuencias de expresión de mamíferos apropiadas se puede utilizar el vector modificado para transformar una célula eucariotica (v.g., una célula de mamífero o levadura, preferiblemente una célula de mamífero (v.g., células de ovario de hámster Chino (CHO)) para la expresión del Fab. Cuando el vector modificado no proporciona expresión eucariótica, preferiblemente el vector permite la separación por corte de ambos casetes de expresión de las cadenas pesada y ligera en forma de fragmentos de ADN sencillo para subclonar en un vector apropiado. Numerosos vectores para la expresión de proteínas en células procarioticas y/o eucarióticas son asequibles comercialmente y/o bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra).

Análisis comercial

Los siguientes Ejemplos 14-18 y específicamente el Ejemplo 17 muestran el aislamiento de un anticuerpo que se une específicamente a PrP^{Sc} sin desnaturalización alguna. Una muestra que contiene proteínas PrP (es decir, PrP^{c} y PrP^{Sc}) puede ser sometida a desnaturalización mediante el uso de la digestión con proteasa K (PK). El uso de la misma digerirá PrP^{c} pero no PrP^{Sc}. Así, tras llevar a cabo la digestión, la muestra se pone en contacto con el anticuerpo (v.g., R2) como para el Ejemplo 17 en condiciones de unión adecuadas. Preferiblemente, el anticuerpo está unido a un sustrato y puede ser situado de manera que la muestra se pueda poner en contacto fácilmente con el material sustrato que tiene el anticuerpo unido sobre él. Si el material se une a los anticuerpos del sustrato se confirma la presencia de PrP^{Sc} infecciosa.

En las realizaciones comerciales de la invención puede ser deseable utilizar los anticuerpos de la invención en un análisis de tipo sándwich. Más concretamente, el anticuerpo de la invención puede estar unido a una superficie del soporte sustrato. La muestra que se va a someter a ensayo se pone en contacto con la superficie del soporte en condiciones que permitan la unión. Después de eso, los sitios que no han reaccionado se bloquean y la superficie se pone en contacto con un anticuerpo generalizado que se unirá a cualquier proteína de allí. El anticuerpo generalizado se conecta a una marca detectable. Se deja que el anticuerpo generalizado con la marca detectable se una a cualquier PrP^{Sc} unida a los anticuerpos de la superficie del soporte. Si se produce la unión se puede hacer que la marca se vuelva detectable por ejemplo generando un color por medio del cual se indique la presencia de la marca lo que indica indirectamente la presencia de PrP^{Sc} en la muestra. El análisis puede detectar los priones (PrP^{Sc}) presentes en una cantidad de 1 parte por millón o menos, incluso una parte por millardo o menos. La PrP^{Sc} puede estar presente en una fuente seleccionada del grupo formado por (a) una formulación farmacéutica que contiene un componente terapéuticamente activo extraído de una fuente animal, (b) un componente extraído de una fuente animal, (c) un órgano, tejido, fluido corporal o células extraídas de una fuente humana, (d) una formulación seleccionada del grupo formado por formulaciones inyectables, orales, cremas, supositorios, y de liberación intrapulmonar, (e) un cosmético, y (f) un compuesto farmacéuticamente activo extraído de un cultivo celular de mamífero. Tales materiales fuente también pueden ser tratados para separar o neutralizar la proteína PrP^{Sc} añadiendo un anticuerpo de la invención. La invención también incluye un método de tratamiento, que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une selectivamente a la proteína PrP^{Sc} cuyo anticuerpo se caracteriza por su capacidad para neutralizar la infectividad de la proteína PrP^{Sc}.

Procedimiento generalizado

Los anticuerpos de la invención podían ser obtenidos mediante una variedad de mecanismos. Sin embargo, el procedimiento general implica sintetizar una genoteca de proteínas (es decir, anticuerpos o porciones de los mismos) sobre la superficie de fagos. La genoteca se pone después en contacto con una composición que incluye proteínas PrP y en particular es una composición de origen natural que incluye PrP^{Sc}. Los fagos que se unen a la proteína PrP son aislados después y el anticuerpo o porción del mismo que se une a la proteína PrP es aislado. Es deseable determinar la secuencia del material genético que codifica el anticuerpo o la porción del mismo. Adicionalmente, la secuencia puede ser amplificada e insertada, por si misma, o con otro material genético en un vector apropiado o línea celular para la producción de otros anticuerpos. Por ejemplo, una secuencia que codifica una región variable que se une a PrP^{Sc} puede ser fusionada con una secuencia que codifica una región constante humana de un anticuerpo que produce un constructo constante/variable. Este constructo puede ser amplificado e insertado en un vector adecuado que puede ser insertado en una línea celular adecuada para la producción de anticuerpos humanizados. Los procedimientos como este se describen en la Patente de los Estados Unidos 4.816.567, expedida el 28 de Marzo de 1.989 por Cabilly, y col. que se incorpora aquí como referencia para describir y revelar tales procedimientos. Adicionalmente, ver Bobrzecka, y col. Immunology Letters, 2, páginas 151-155 (1.980) y Konieczny, y col. Haematologia 14 (1), páginas 85-91 (1.981) también incorporadas aquí como referencia.

Cuando el material genético que codifica un anticuerpo o porción del mismo que se une a una proteína PrP es aislado es posible utilizar ese material genético para producir otros anticuerpos o porciones de los mismos que tengan una mayor afinidad para la unión a las proteínas PrP. Esto se realiza mediante la tecnología de la mutagénesis dirigida al sitio o mediante mutagénesis al azar y selección. Específicamente, los codones individuales o grupos de codones de la secuencia son separados o remplazados por codones que codifiquen diferentes aminoácidos. Se pueden generar, amplificar y utilizar grandes números de secuencias diferentes para expresar variaciones del anticuerpo o porciones del mismo sobre la superficie de fagos adicionales. Estos fagos pueden ser utilizados después para someter a ensayo la afinidad de unión del anticuerpo hacia las proteínas PrP.

La genoteca de fagos puede ser creada en una variedad de modos diferentes. Según un procedimiento se inmuniza un animal huésped tal como un ratón o rata con proteína PrP y preferiblemente se inmuniza con PrP^{Sc}. La inmunización se puede llevar a cabo junto con un coadyuvante para la formación de cantidades y tipos de anticuerpos mayores. Tras dejar pasar un tiempo suficiente para la generación de los anticuerpos, las células responsables de la producción de anticuerpos se extraen del animal huésped inoculado. El ARN es aislado de las células extraídas y sometido a transcripción inversa con el fin de producir una genoteca de ADNc. El ADNc extraído es amplificado mediante el uso de cebadores e insertado en un vector de presentación del fago apropiado. El vector permite la expresión de anticuerpos o porciones de los mismos sobre la superficie del fago. Asimismo es posible someter el ADNc a mutagénesis dirigida al sitio antes de la inserción en el vector de presentación. Específicamente, los codones son separados o remplazados por codones que expresan diferentes aminoácidos con el fin de crear una genoteca mayor (es decir, una genoteca de muchas variantes) que después es expresada sobre la superficie del fago. Después de eso, como se ha descrito antes, el fago se pone en contacto con la muestra y se aíslan los fagos que se unen a la proteína PrP.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos se exponen con el fin de proporcionar a los expertos en la técnica una descripción y una revelación completas de cómo elaborar y utilizar los anticuerpos anti-PrP recombinantes y los análisis de la presente invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los autores de la presente invención consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (v.g. cantidades, temperatura, etc.) pero se deben tener en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderal, la temperatura es en grados Centígrados, y la presión es la atmosférica o esta próxima a ella.

Ejemplo 1 Purificación de MoPrP 27-30

Se prepararon varillas de MoPrP 27-30 purificada a partir de los cerebros de ratones CD-1 clínicamente enfermos inoculados con priones RML (producto aislado de scrapie de Chandler (Chandler R.L. 1.961 Lancet, 1378-1379)). Las varillas de prión fueron recuperadas de fracciones con un gradiente de sacarosa como se ha descrito previamente (Prusiner, McKinley 1.983 Cell). Brevemente, las fracciones que contenían las varillas de priones, que sedimentan en sacarosa al 48-60% (peso/volumen), fueron diluidas 2:1 en agua destilada y centrifugadas a 100.000 x g durante 6 horas a 4ºC. El sedimento fue resuspendido en agua, centrifugado de nuevo, y las varillas fueron resuspendidas a 1 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato libre de Ca/Mg (PBS) conteniendo Sarcosyl al 0,2%. La PrP 27-30 era la proteína principal como se determinó mediante SDS-PAGE y análisis mediante tinción con plata. La cuantificación de la proteína se realizó mediante unión al colorante de ácido bicincónico, con una cantidad conocida de serabúmina bovina como patrón de concentración de proteína.

Ejemplo 2 Inmunización de ratones Prnp^{0/0}

Se inmunizaron ratones Prnp^{0/0}, en los cuales ambos alelos del gen PrP (Prnp) estaban suprimidos, con las varillas de MoPrP 27-30 purificada, que fueron aisladas como se describe en el Ejemplo 1. Los ratones Prnp^{0/0} y los métodos para elaborar esta cepa son bien conocidos en la técnica (Büeler, y col. 1.992). Los ratones Prnp^{0/0}, que eran indistinguibles de los ratones normales en su desarrollo y comportamiento, son resistentes al scrapie tras la inoculación intracerebral de MpPrP^{Sc} infecciosa (Büeler, y col. 1.993 Cell; Prusiner y col. PNAS 1.993), y desarrollarán títulos en suero de IgG frente a Mo-, SHa, y PrP humana tras la inmunización con cantidades relativamente pequeñas de SHaPrP 27-30 purificada en coadyuvante (Prusiner y col. PNAS 1.993).

Tres (3) ratones Prnp^{0/0} de seis semanas de edad fueron inmunizados mediante inyección intraperitoneal de 100 \mug de varillas de MoPrP 27-30 totalmente emulsionadas en coadyuvante completo de Freund. Con posterioridad los ratones fueron reforzados 2 veces a intervalos de 2 semanas con coadyuvante incompleto de Freund conteniendo en el primer caso 100 \mug, después 50 \mug de varillas. Cuatro días después del segundo refuerzo se analizó la reactividad del suero de cada ratón frente a las proteínas priónicas como se describe más abajo en el Ejemplo 3. Aquellos ratones que tenían antisueros reactivos anti-PrP recibieron una tercera inyección de refuerzo de 50 \mug de varillas de prión en coadyuvante incompleto de Freund 14 días después del segundo refuerzo.

Ejemplo 3 Reactividad en suero de ratones Prnp^{0/0} inmunizados con MoPrP 27-30

Un indicador de pronóstico primario del éxito en el aislamiento de un anticuerpo específico a partir de genotecas combinatorias es la reactividad del anticuerpo con el antígeno o los antígenos que se van a estudiar (Burton y Barbas, Adv. Immunol. 1.994). Los niveles de anticuerpo en suero son un pronóstico de la secreción de anticuerpos y por lo tanto son un pronóstico de los niveles de ARNm específico en las células del plasma. Es este último factor el que dicta en último lugar la composición de la genoteca de ADNc que codifica el anticuerpo.

Cuatro días después del segundo refuerzo, los ratones Prnp^{0/0} inmunizados con MoPrP 27-30 como se ha descrito en el Ejemplo 2 fueron desangrados por la cola, y los antisueros almacenados a -20ºC durante el posterior análisis inmunológico. La reactividad del suero del ratón inmunizado (subclases de anticuerpos IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3) fue medida frente Mo- y SHaPrP 27-30 desnaturalizada y no desnaturalizada en ELISA. Los pocillos de ELISA fueron cubiertos durante la noche a 4ºC con 50 \mul de varillas de PrP a 40 \mug/ml en bicarbonato de sodio 100 mM, pH 8,6. Cuando se utilizaban varillas de PrP desnaturalizadas como antígeno en el ELISA, se añadían 50 \mul de isotiocianato de guanidinio 6 M al pocillo durante 15 minutos a la temperatura ambiente, después de lo cual los pocillos fueron lavados 6 veces con PBS libre de Ca/Mg. Todos los pocillos fueron bloqueados con PBS libre de Ca/Mg conteniendo BSA al 3%. Los antisueros fueron sometidos a dilución seriada en PBS, e incubados con los pocillos durante una hora a 37ºC. El exceso de antisuero fue eliminado lavando 10 veces con PBS-Tween 20 al 10,05% y el antisuero unido fue detectado utilizando anticuerpo anti-ratón de cabra marcado que se une específicamente a los anticuerpos murinos IgG1, IgG2a, IgG2b o IgG3.

Los 3 ratones producían anticuerpos IgG anti-PrP. La reactividad del suero de uno de los ratones, denominado D7282, se ilustra en la Figura 5 como ejemplar de las respuestas de anticuerpos de los ratones inmunizados. Los títulos en suero más altos frente a los antígenos Mo- y SHaPrP eran de las subclases IgG1 e IgG2b. En contraste, los títulos anti-PrP de IgG2a e IgG3 estaban próximos a los niveles de fondo de reactividad observados para todas las subclases de IgG en el suero de ratones Prnp^{0/0} no inmunizados. Los títulos de anticuerpo eran mayores frente a las varillas desnaturalizadas que a las varillas no desnaturalizadas. La reactividad en suero similar frente a las varillas de Mo- y SHa desnaturalizadas es probablemente reflejo de la elevada homología en la secuencia de aminoácidos entre las dos proteínas. No obstante, aunque había una considerable reactividad en suero frente a las varillas de Mo- no desnaturalizadas (aproximadamente 40-50% del nivel de la de MoPrP 27-30 desnaturalizada), la reactividad con las varillas de SHa no desnaturalizadas estaba al nivel del fondo.

Ejemplo 4 Aislamiento de ARNm que codifica anticuerpos anti-PrP y construcción de genotecas de presentación en fagos de anticuerpos

Tres días después de la inyección de refuerzo final, el ratón D7282 fue sacrificado y el ARN fue preparado a partir de la médula ósea y del bazo. El ARN total de bazo de ratón fue preparado según métodos bien conocidos en la técnica (Huse y col. Science 1.989). El ARN fue preparado a partir de tejidos de médula ósea separando primero la tibia y la fíbula de ambas patas traseras del ratón. Los huesos fueron cortados después cerca de cada extremo, y sus contenidos enjuagados mediante inyección de isotiocianato de guanidinio en la cavidad ósea utilizando una aguja del calibre 27. La preparación de ARN continuó después como se describe para el bazo de ratón.

Las preparaciones de ARN fueron reunidas después, y el ADNc fue generado a partir del ARNm utilizando la transcriptasa inversa según métodos bien conocidos en la técnica. Se construyeron dos genotecas de ADNc independientemente a partir del ARNm del ratón D7282: 1) una genoteca de IgG1; y 2) una genoteca de IgG2b. Para cada una de estas genotecas, los ADNc que codifican las cadenas pesadas y los ADNc que codifican las cadenas ligeras fueron amplificados por separado mediante PCR a partir de fracciones separadas del ADNc reunido. Los cebadores oligonucleotídicos 5' y 3' empleados para la amplificación por PCR de los fragmentos de ADN que codificaban las cadenas ligera (\kappa) y pesada (\alpha1 o \alpha2b) de la subclase IgG1 fueron las utilizadas por Huse, y col. (Science 1.989) y los cebadores de la cadena pesada adicional fueron los presentados en la Tabla 1 y los polímeros de la cadena pesada fueron los presentados en la Tabla 1. Los cebadores fueron utilizados para la amplificación de los ADNc que codificaban los fragmentos de la cadena pesada.

TABLA 1 Cebadores de la cadena pesada

\hskip0,5cm

Cebadores

\hskip4,3cm

Secuencia de Nucleótidos

1

Cebadores utilizados para la amplificación de fragmentos de la cadena pesada del anticuerpo

\hskip0,5cm

Cebadores 5'

2

\newpage

\hskip0,5cm

Cebadores 3'

3

\hskip0,5cm

Cebadores 3'

4

La PCR se realizó utilizando un Perkin Elmer 9600 con 35 ciclos de amplificación; desnaturalización a 94ºC durante 30 segundos, hibridación a 52ºC durante 60 segundos y extensión a 72ºC durante 60 segundos.

Los ADNc amplificados resultantes que codifican las cadenas pesadas de las subclases IgG1 e IgG2b y las cadenas ligeras fueron clonados en el vector pComb3. La preparación de genotecas de anticuerpos Fab presentados sobre la superficie de un fago filamentoso utilizando el vector pComb3 ha sido descrita (Williamson y col. PNAS, 1.993; Barbas y col. PNAS 1.991). Brevemente, la genoteca de presentación en fagos de IgG1 e IgG2b se construye insertando el ADNc amplificado que codifica la cadena pesada de IgG1 o IgG2b y el ADNc amplificado que codifica la cadena ligera en el vector pComb3H de manera que cada vector contiene un inserto de ADNc que codifica un fragmento de la cadena pesada en un casete de expresión del vector, y un inserto de ADNc que codifica un fragmento de la cadena ligera en el otro casete de expresión. La genoteca de IgG1 resultante contenía aproximadamente 9 x 10^{6} clones individuales, mientras la genoteca de IgG2b resultante contenía aproximadamente 7 x 10^{6} clones individuales.

Los vectores ligados fueron empaquetados después mediante el fago filamentoso M13 utilizando métodos bien conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Sambrook y col., supra). La genoteca empaquetada es utilizada después para infectar un cultivo de E. coli, con el fin de ampliar el número de partículas de fago. Tras la lisis de las células bacterianas, las partículas de fago son aisladas y utilizadas en el procedimiento de inmunopurificación siguiente. Las alícuotas de la genoteca del fago son almacenadas para su futura amplificación y uso. Las alícuotas separadas de las genotecas de los fagos son aisladas y almacenadas para su futura amplificación y uso.

Ejemplo 5 Rastreo de la genoteca de anticuerpos presentados en fagos en cuanto a la unión a PrP

Los fagos de unión al antígeno fueron seleccionados en cuanto a la unión a las varillas de MoPrP 27-30 desnaturalizadas frente al antígeno PrP unido a pocillos de ELISA a través de un procedimiento de inmunopurificación descrito por (Purton, y col. PNAS 1.991, Barbas Lerner Methods in Enzymol 1.991). Brevemente, los pocillos de ELISA fueron revestidos durante la noche a 4ºC con 50 \mul devarillas de MoPrP 27-30 a 40 \mug/ml en bicarbonato de sodio 100 mM pH 8,6. Las varillas de PrP fueron desnaturalizadas después mediante incubación con 50 \mul de isotiocianato de guanidinio 6 M durante 15 minutos a la temperatura ambiente, después de lo cual los pocillos fueron lavados 6 veces con PBS libre de Ca/Mg. Los pocillos fueron bloqueados después con PBS libre de Ca/Mg conteniendo BSA al
3%.

Se aplicaron alícuotas de fago con anticuerpo para separar los pocillos de ELISA revestidos con PrP. Se añadieron un total de aproximadamente 1 x 10^{10} fagos con anticuerpo por pocillo en el experimento de inmunopurificación.

Los fagos fueron incubados con el antígeno MoPrP unido al pocillo durante 2 horas a 37ºC. Los fagos no unidos fueron separados lavando 10 veces con PBS - TWEEN 20 al 0,5%.Los fagos unidos fueron separados después de los pocillos mediante elución con ácido, reunidos, re-amplificados y sometidos a un segundo ciclo de inmunopurificación.

La genoteca de IgG1 fue seleccionada por medio de 5 ciclos de inmunopurificación. Desde el primer al quinto ciclo se midió una amplificación de 40 veces de fagos con anticuerpos, como se determina mediante el número de fagos eluidos de los pocillos de ELISA revestidos con PrP.

Ejemplo 6 Producción de Fab soluble a partir de fagos productores de anticuerpos seleccionados

Los Fabs solubles fueron producidos a partir de clones de fagos eluidos del cuarto y el quinto ciclos de inmunopurificación. El ADN de los clones de fagos seleccionados fue aislado, y la proteína de la envuelta III del fago (ancla a la membrana del fago filamentoso) fue separada del vector pComb3H utilizando las enzimas de restricción apropiadas. El ADN fue autoligado para rendir un vector susceptible de expresar el Fab soluble (el procedimiento de producción de Fabs solubles es detallado por (Barbas y col. PNAS 1.991)). Los vectores fueron utilizados después por separado para transformar bacterias para la expresión de los Fabs, y los transformantes aislados fueron seleccionados.

La expresión de Fab fue inducida en un cultivo bacteriano durante la noche utilizando isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido. Las bacterias fueron centrifugadas, y el sedimento bacteriano resultante fue o bien sometido a sonicación o bien congelado y descongelado tres veces para liberar Fab del espacio periplásmico bacteriano. Los sobrenadantes del Fab bacteriano fueron sometidos a ensayo después en cuanto a la reactividad frente a PrP en un ELISA.

Ejemplo 7 Análisis ELISA de la unión de Fabs anti-PrP a antígenos PrP

La unión de los Fabs solubles producidos en el Ejemplo 6 a antígenos PrP desnaturalizados y no desnaturalizados así como a péptidos PrP sintéticos fue determinada utilizando el análisis ELISA descrito en el Ejemplo 3. Los péptidos PrP sintéticos fueron producidos utilizando los protocolos de síntesis peptídica convencionales bien conocidos en la técnica.

De los clones de Fab tomados del cuarto ciclo del inmunopurificación frente a las varillas de MoPrP desnaturalizadas, menos del 5% eran reactivas con PrP desnaturalizada, mientras aproximadamente el 50% de los clones tomados del quinto ciclo de la misma inmunopurificación reconocían los antígenos PrP. En el ELISA todos los clones reactivos de este inmunopurificación eran capaces de unirse específicamente a varillas de Mo y SHa desnaturalizadas, pero no a varillas no desnaturalizadas de cualquier especie. Además, todos los Fabs anti-PrP fracasaban al reconocer los péptidos sintéticos que abarcaban los restos 90-145 de MO y SHa PrP, sugiriendo que los anticuerpos se unen entre los restos 146 y 231 de la proteína priónica.

Ejemplo 8 Análisis de la unión del anticuerpo seleccionado (Fab) a tejido de cerebro de roedor infectado con priones y no infectado

La reactividad de los anticuerpos identificados por inmunopurificación de la genoteca de anticuerpos de presentación en fagos fue sometida a ensayo mediante SDS/PAGE del tejido de cerebro de roedor infectado con priones y análisis de transferencia Western utilizando los Fabs seleccionados. Se utilizó proteína de tejido cerebral de ratones infectados con priones y no infectados como antígeno frente al cual se sometía a ensayo la inmunorreactividad. El antígeno fue preparado desorganizando tejido cerebral de roedor en PBS libre de Ca/Mg mediante el paso 5 veces a través de una aguja del calibre 20, seguido del paso 10 veces a través de una aguja del calibre 22. El producto homogeneizado al 10% (peso/vol) fue centrifugado después a 1.600 x g durante 5 minutos a 4ºC. Las alícuotas de la proteína sobrenadante fueron diluidas a una concentración final de 1 mg/ml en PBS libre de Ca/Mg conteniendo Sarcosyl al 0,2%. Esta dilución fue mezclada con un volumen igual de 2 x tampón de muestra SDS/PAGE no reductor y hervida durante 5 minutos, antes de SDS/PAGE (Laemmli, U.K. (1.970) Nature (Londres) 227, 680-685). Se realizó una inmunotransferencia como se ha descrito previamente (Pan y col. PNAS 1.993) con antisuero IgG de ratón primario (Pierce) diluido 1:1.000.

Ejemplo 9 Secuenciación del ácido nucleico

Las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos de los dominios variables de las cadenas ligera y pesada del anticuerpo fueron determinadas para varios de los clones específicos de PrP. La secuenciación del ácido nucleico se realizó con un secuenciador de ADN automátizado modelo 373A (Applied Biosystems) utilizando un estuche de secuenciación por ciclos terminador de didesoxinucleótidos Taq (Applied Biosystems). Los cebadores para la elucidación de la secuencia de la cadena ligera del anticuerpo fueron los cebadores MoSeqKb [5'-CAC GAC TGA GGC ACC TCC-3'] y OmpSeq [5'-AAG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G-3'] que hibridaban a la hebra (-) y para la cadena pesada MOIgGGzSeq [5'-ATA GCC CTT GAC CAG GCA TCC CAG GGT CAC-3'] que se unían a la hebra (+) y PelSeq [5'-ACC TAT TGC CTA CGG CAG CCG-3'] que se une a la hebra (-).

Las secuencias de aminoácidos deducidas para algunos de los clones de fagos obtenidos en una inmunopurificación frente a PrP desnaturalizada se proporcionan en las Figuras 6 y 7. La Figura 6 muestra las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena pesada (A) y la cadena ligera (B) seleccionadas generadas mediante inmunopurificación una genoteca de IgG1 de ratón D7282 frente a varillas de MoPrP 27-30 desnaturalizada. Las secuencias son muy similares pero contienen numerosas heterogeneidades que son probablemente el resultado de mutaciones somáticas tras la exposición repetida del ratón al antígeno PrP. Todas las secuencias de la cadena pesada examinadas en estos clones contenían secuencias muy similares. En particular, la región determinante de la complementariedad de la cadena pesada 3 (HCDR3) era idéntica a nivel de nucleótidos en todos los clones de Fab examinados. Se observaron pequeñas diferencias en CDR1, CDR2, marco (FR) 3 y FR4 de la cadena pesada. Estas diferencias son demasiado numerosas para ser atribuibles a errores de la PCR o de la secuenciación y se han acumulado probablemente durante los ciclos de mutación somática a medida que el ratón era reforzado repetidamente con antígeno. Las secuencias de la cadena ligera también eran muy similares, pero con una heterogeneidad localizada en todo el dominio variable, de nuevo resultante probablemente de mutaciones somáticas.

Ejemplo 10 Selección de anticuerpos anti-prión tras el enmascaramiento de los epítopos con anticuerpos existentes

La inmunopurificación de la genoteca de IgG1 frente a PrP desnaturalizada producía una serie de anticuerpos relacionados, presumiblemente variantes somáticas de un clon dirigido a un único epítopo (Ejemplo 9). Para el acceso de los anticuerpos a otros epítopos, se añadió un anticuerpo prototipo de la serie anterior a PrP desnaturalizada en pocillos ELISA antes de la inmunopurificación de la manera normal. El anticuerpo enmascarador fue utilizado en todas las etapas de inmunopurificación posteriores. Utilizando este procedimiento, se derivaron anticuerpos de secuencia diferente que reaccionaban con la PrP desnaturalizada en el ELISA. Estos anticuerpos están dirigidos probablemente a diferentes epítopos de PrP. El procedimiento de enmascaramiento se llevó a cabo como describen Ditzel, y col. (1.995) J. Immunol. El enmascaramiento también se podía llevar a cabo con moléculas distintas de los anticuerpos que interaccionaban con PrP.

Ejemplo 11 Selección de partículas de fago que expresan los anticuerpos anti-PrP específicos para PrP^{Sc}

Una genoteca de anticuerpos de presentación en fagos similar a la descrita en los Ejemplos anteriores se somete a experimentos de inmunopurificación para identificar los clones de fagos que se unen a PrP^{Sc}, pero no a PrP^{c}. El antígeno PrP^{Sc} y el antígeno PrP^{c} se unían a pocillos separados de una placa de microtitulación como se ha descrito antes para el análisis ELISA. La genoteca de anticuerpos de presentación en fagos es inmunopurificada primero sobre los pocillos de ELISA con PrP^{c}. Los fagos no unidos son recuperados de los pocillos y reunidos. Los fagos que se unen al antígeno PrP^{c} son separados de los pocillos y o bien descartados o bien reunidos para análisis posteriores. Los fagos no unidos reunidos son añadidos de nuevo después a pocillos de ELISA con PrP^{c}, basándose de nuevo la selección en la carencia de unión a PrP^{c}. Tras varias selecciones repetidas sobre el antígeno PrP^{c}, los fagos son reunidos y inmunopurificados en pocillos de ELISA conteniendo el antígeno PrP^{Sc}. La inmunopurificación se repite varios ciclos, siendo el fago que se une al antígeno PrP^{Sc} el fago que es seleccionado para ciclos adicionales de inmunopurificación. Al cabo de 5 ó 10 ciclos de inmunopurificación sobre el antígeno PrP^{Sc}, los fagos son aislados entre sí. La capacidad del fago específico de PrP^{Sc} o el Fab aislado para unirse al antígeno PrP^{c} puede ser doblemente verificada mediante ELISA con el antígeno PrP^{c}. Los fagos seleccionados resultantes son aquellos que se unen a PrP^{Sc}, pero no se unen a PrP^{c}.

Ejemplo 12 Selección de partículas de fago que expresan anticuerpos anti-PrP para identificar PrP^{Sc} prescindiendo de la isoforma

Se prepara una genoteca de anticuerpos de presentación en fagos como se ha descrito antes a partir de ARN de linfocitos de un ratón inmunizado con diversas isoformas de PrP^{Sc}, o a partir de una reserva de ARN de linfocitos de diversos ratones inmunizados con diferentes isoformas de PrP^{Sc}. Los fagos son inmunopurificados después con varios pocillos diferentes conteniendo antígenos de isoformas diferentes de PrP^{Sc}. Los fagos son inmunopurificados sobre cada isoforma de PrP^{Sc} siendo la selección para los fagos que se unen a la isoforma en cada fase. Los fagos son inmunopurificados durante un total de aproximadamente 5 a 10 ciclos en cada isoforma de PrP^{Sc}. Los fagos que quedan después de todas las fases de inmunopurificación frente a todas las isoformas sometidas a ensayo son aislados después. La inmunorreactividad de cada fago seleccionado o Fab aislado es sometida a ensayo mediante ELISA o transferencia Western o histoquímica frente a cada una de las diversas isoformas de PrP^{Sc}, así como en cuanto a la reactividad cruzada con PrP^{c}.

Ejemplo 13 Selección de partículas de fago que expresan anticuerpos anti-PrP específicos para las isoformas de PrP^{Sc}

Una genoteca de anticuerpos de presentación en fagos preparada a partir de ARN de linfocitos de un ratón inmunizado con una isoforma de PrP^{Sc} específica se prepara según los Ejemplos anteriores. Los fagos resultantes son seleccionados después por su capacidad para unirse solamente a una isoforma de PrP^{Sc} específica mediante inmunopurificación. En la inmunopurificación se utilizan diversos pocillos diferentes conteniendo antígenos de diferentes isoformas de PrP^{Sc}, incluyendo un grupo de pocillos conteniendo antígenos de la isoforma de PrP^{Sc} específica frente a la cual se desean anticuerpos específicos. Los fagos son inmunopurificados primero sobre las isoformas de PrP^{Sc} no deseables siendo la selección para los fagos que no se unen al antígeno. La inmunopurificación continúa durante un total de aproximadamente 5 a 10 ciclos en cada una de las isoformas de PrP^{Sc}. Los fagos que no se unían a las isoformas de PrP^{Sc} no deseables son inmunopurificados después durante aproximadamente 5 a 10 ciclos frente a la isoforma de PrP^{Sc} deseable, siendo la selección para la unión a los antígenos. Los fagos que quedan después de todos los ciclos de inmunopurificación son aislados. Estos fagos seleccionados son los que expresan anticuerpos con especificidad de unión sólo para la isoforma de PrP^{Sc} específica deseada. La inmunorreactividad de cada fago seleccionado o Fab aislado es sometida a ensayo mediante ELISA o transferencia Western frente a cada una de las diversas isoformas de PrP^{Sc}, así como en cuanto a la reactividad cruzada con PrP^{c}.

Ejemplo 14 Generación y caracterización de la reactividad en suero frente a PrP^{Sc} en ratones PrP^{%}

La experimentación mediante los Ejemplos anteriores establecía que el pronóstico primario indicativo del éxito en el aislamiento de un anticuerpo específico a partir de genotecas combinatorias con el intervalo de tamaño de 10^{7} pfu/ml es la reactividad en suero con el antígeno que se va a estudiar, y es este factor el que dicta por último la composición de la genoteca. Aunque los ratones Prnp^{0/0} lograban una fuerte respuesta inmune tras la inmunización con varillas priónicas o bien de ratón (Mo) o bien de hámster Sirio (SHa) compuestas por proteínas PrP 27-30, los títulos en suero más elevados fueron observados en las subclases IgG1 e IgG2b. Los títulos anti-PrP de IgG2a e IgG3 estaban próximos a los niveles de fondo de la reactividad observada para todas las subclases de IgG en el suero de ratones no inmunizados. En un intento de incrementar la respuesta inmune y aumentar el repertorio inmune frente a PrP^{Sc}, se inmunizaron ratones hembra Prnp^{0/0} (94% FVB) con liposomas que contenían SHaPrP 27-30. Para incrementar adicionalmente la diversidad de la respuesta inmune, los ratones fueron inmunizados utilizando protocolos tanto a largo como a corto plazo. En contraste con la inmunización con varillas de prión de SHa la inmunización con liposomas que contenían SHaPrP 27-30 daba como resultado un título de antisuero que incluye las cuatro subclases de IgG.

Ejemplo 15 Reactividad de sueros inmunizados con PrP frente a transferencias

Para investigar adicionalmente las propiedades de la IgG anti-SHaPrP 27-30 encontrada en sueros de ratones inmunizados con liposomas conteniendo SHaPrP 27-30, los autores de la presente invención sometieron a ensayo los sueros in situ con mecanismos de histotransferencia, en los que las secciones criostáticas de cerebro SHa infectado con scrapie eran transferidas sobre membranas de nitrocelulosa. Aunque ambos sueros mostraban cierta reactividad no específica frente a secciones de cerebro SHa normales tratadas con proteinasa K (PK), sólo lo sueros del ratón inmunizado a largo plazo mostraban una reactividad incrementada frente a las secciones de cerebro infectadas con scrapie SHa tratadas con PK. Esta reactividad también era evidente en diluciones de suero a 1/1.000 (resultados no mostrados). Ambos sueros mostraban una reactividad típica frente a las secciones de cerebro infectadas con scrapie SHa que fueron tratadas primero con PK y después expuestas a GdnSCN 3M durante 10 minutos. Los sueros de ratones hembra Prnp^{0/0} no inmunizados (94% FVB) no mostraban reactividad inmune frente a secciones de cerebro SHa infectadas con scrapie normales.

Tinción de SHaPrP 27-30 y SHaPrP 27-30 desnaturalizada en histotransferencias de cerebro de SHa infectado con scrapie

Se trataron las histotransferencias con proteinasa K para separar PrP^{Sc} del cerebro de SHa de control no inoculado normal y SHa que mostraba signos clínicos de scrapie tras la inoculación con priones Sc237. Para desnaturalizar SHaPrP 27-30, se trataron las histotransferencias con GdnSCN 3M durante 10 minutos. Las transferencias fueron incubadas durante la noche a 4ºC con sueros diluidos 1/200 de los ratones inmunizados a corto y largo plazo. Los resultados descritos aquí muestran una reactividad positiva clara de un antisuero con priones infecciosos no desnaturalizados, es decir, PrP^{Sc} nativa.

En la Figura 8 se muestran ocho histotransferencias teñidas de cerebro de SHa infectado con scrapie. Las histotransferencias fueron tratadas con proteinasa K para separar PrP^{c} del cerebro de SHa de control no inoculado, normal (A, C, E y G) y SHa mostrando signos clínicos de scrapie tras la inoculación con priones Sc 237 (B, D, F y H). Para desnaturalizar la SHaPrP 27-30, las histotransferencias fueron tratadas con GdnSCN 3M durante 10 minutos (C, D, G y H). Las transferencias fueron incubadas durante la noche a 4ºC con sueros diluidos 1/200 de ratones inmunizados a corto ((A-D) y largo (E-H) plazo. Los resultados muestran claramente la capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse a priones infecciosos, no desnaturalizados, nativos, es decir, unirse a PrP^{Sc} nativa.

Ejemplo 16 Generación de anticuerpos monoclonales a partir de los ratones inmunizados del ejemplo 14

En resumen, se construyeron ocho genotecas de presentación en fagos de Fab: IgG1k, IgG2ak, IgG2bk e IgG3k a partir del ARNm extraído de ratones inmunizados a corto y largo plazo. Para superar las dificultades con el aislamiento de fagos que expresan anti-Fab mediante inmunopurificaciónfrente a varillas priónicas conteniendo PrP 27-30, se utilizó un sistema de inmunopurificación en el que las genotecas son inmunopurificadas frente a SHa 27-30 biotinilada, dispersadas en liposomas, y unidas a placas de microtitulación revestidas con estreptavidina. Tras cinco ciclos de inmunopurificación, los extractos de E. coli de más de 50 clones reaccionaban con SHa 27-30 biotinilada, varillas de SHa 27-30 y SHa recombinante 90-231 en ELISA. Puesto que estos clones también reaccionan con PrP recombinantes correspondientes a restos SHaPrP 90-231, Melhorn, I., y col., High-level Expression and Characterization of a Purified 142 residue Polypeptide of the Prion Protein. Biochemistry 35, 5528-2237 (1.996), las ocho genotecas fueron inmunopurificadas frente a este antígeno para aislar con éxito más clones distintos de virtualmente todas las genotecas. Tras la secuenciación del ADN de la región plasmídica que codificaban la cadena pesada de IgG, se identificaron 30 Fabs como clones distintos.

Ejemplo 17 Caracterización de anticuerpos monoclonales

El ELISA inicial con extractos de E. coli de clones positivos sugería que los Fabs, en contraste con el anticuerpo monoclonal 3F4, Kascsak, R.J., y col., MousePolyclonal and Monoclonal Antibody to Scrapie Associated Fibril Proteins, J. Virol. 61, 3688-3693 (1.987), se unen a PrP 27-30 en estado nativo, es decir, sin una etapa de desnaturalización. Para caracterizar cuantitativamente la novedad de estos Fabs, los autores de la presente invención los purificaron y produjeron Fab 3F4 a partir de 3F4 monoclonal mediante escisión enzimática. Se realizó un ELISA normalizado para la detección de SHaPrP utilizando diferentes concentraciones de los Fabs purificados. En contraste con 3F4 que mostraba las propiedades de unión a SHa PrP características (unión basal a varillas priónicas y fuerte reactividad frente a SHaPrP 27-30 tras el tratamiento con GdnSCN 3M no desnaturalizado), los Fabs recién aislados reaccionaban frente a varillas priónicas sin etapa de desnaturalización alguna. La unión semi-máxima a varillas priónicas no desnaturalizadas se produce a una concentración de Fab de aproximadamente 0,5 pg/ml, indicando que el anticuerpo tiene una afinidad de unión aparente de aproximadamente 10^{8} moles/litro.

La Figura 9 es un gráfico que muestra la reactividad en un ELISA de los Fabs purificados frente a la proteína priónica SHaPrP 27-30. El anticuerpo 3F4 y los anticuerpos recombinantes fueron examinados a diferentes concentraciones en cuanto a la unión a pocillos de ELISA que estaban revestidos con 0,2 \mu/g de varillas priónicas de SHa infecciosas purificadas con sacarosa. Los resultados muestran claramente que todos los anticuerpos recombinantes de la invención tienen grados de unión a los priones sustancialmente mayores en comparación con el anticuerpo 3F4.

Protocolo para la reactividad en ELISA de Fabs purificados frente a la proteína priónica SHa 27-30 desnaturalizada

Se examinaron 3F4 purificado y los Fabs recombinantes a diferentes concentraciones en cuanto a la unión a pocillos de ELISA revestidos con 0,2 \mug de varillas priónicas de SHa purificada con sacarosa o bien nativa o bien desnaturalizada en el pocillo de ELISA con GdnSCN 3M durante 10 minutos.

La Figura 10 es un gráfico que muestra los resultados de la reactividad en ELISA de los Fabs purificados frente a la proteína priónica SHa 27-30 desnaturalizada. La Figura 10 es interesante en comparación con la Figura 9 ya que los anticuerpos recombinantes de la invención para la Figura 9 muestran un grado de afinidad por las varillas priónicas superior en comparación con 3F4 mientras todos los anticuerpos recombinantes si no fuera por R1 muestran un grado de afinidad inferior frente al antígeno desnaturalizado.

Ejemplo 18 Caracterización de anticuerpos monoclonales mediante inmunoprecipitación Inmunoprecipitación de SHaPrP 27-30

Para confirmar la actividad anti-PrP 27-30 de los Fabs así como para confirmar la incapacidad de 3F4 para unirse a SHaPrP 27-30 no desnaturalizada, se desarrolló un método de inmunoprecipitación utilizando liposomas conteniendo SHa 27-30. Los extractos de E. coli de Fab que producían clones inmunoprecipitaban el 40-50% de la SHaPrP 27-30 presente en la solución, mientras 3F4 en dilución de 1/500 inmunoprecipitaba sólo cantidades vestigiales de SHaPrP. Las concentraciones de Fab en los sobrenadantes bacterianos están típicamente en el orden de 1-10 pg/ml. Esto implica que la afinidad por el antígeno es elevada (del orden de 10^{7} - 10^{8} litros/mol o más). El anticuerpo 3F4 fue obtenido en forma de un fluido ascítico y se espera que tenga una concentración de aproximadamente 1 \mug/ml a la dilución utilizada en el experimento de inmunoprecipitación. La capacidad de los nuevos Fabs para inmunoprecipitar SHaPrP 27-30 en comparación con 3F4 fue determinada cuantitativamente con Fab mAbs purificados D4 y R2. El Fab 2R inmunoprecipitaba SHaPrP 27-30 fuertemente a concentraciones tan bajas como 0,1 pg/ml (50 ng en 500 pl) indicando una afinidad del orden de más de 10^{8} M^{-1} (es decir, 10^{8} litros/mol). El Fab 2R era menos potente pero inmunoprecipitaba claramente el antígeno más eficazmente que 3F4. Obsérvese que D4, R2, 6D2, D14, R1, y R10 hacen referencia todos a los anticuerpos de la invención.

Inmunoprecipitación de SHaPrP 27-30 con Fabs recombinantes

La capacidad de 3F4 diluido 1/500 y 100 \mul de extractos de E. coli conteniendo Fab para inmunoprecipitar SHaPrP 27-30 fue controlada mediante transferencia western. Todas las calles excepto la calle 14 son de inmunoprecipitaciones conteniendo Fab de IgG anti-ratón de cabra y proteína A-agarosa. Se añadieron 10 \mul de liposomas que contenían SHa PrP 27-30 a las calles 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13. Se añadieron 100 \mul de extractos de E. coli de diferentes clones diluidos 1/500 como sigue: calles 2-3, 6D2; calles 4-5, D14; calles 6-7, R1; calles 8-9, R10; calles 10-11, D4; calles 12-13, 3F4. La calle 14 fue cargada con 1/2 volumen de liposomas utilizados para las inmunoprecipitaciones.

Los resultados descritos antes se muestran en la fotografía de la Figura 11. La foto muestra claramente grados superiores de inmunoprecipitación cuando se utilizaban los anticuerpos recombinantes de la invención.

La Figura 12 es una foto que muestra la inmunoprecipitación de SHaPrP 27-30 con los Fabs purificados de la invención (2R y 4D) así como 3H4. La capacidad para inmunoprecipitar el antígeno es controlada por transferencia western. Todas las calles mostradas en la Figura 12 si nofuera por la calle 14, son inmunoprecipitaciones que contienen Fab de IgG anti-ratón de cabra y proteína-Agarosa. Para obtener los resultados se añadieron 10 \mul de liposomas que contenían SHaPrP 27-30 a todas las calles excepto a las calles 5, 9 y 13. Cada una de las calles se marca con las cantidades indicadas de Fabs purificados (nanogramos) que eran añadidas a todas las calles 2-13. La calle 14 fue cargada con la mitad de volumen de liposomas utilizados para la inmunoprecipitación. Los resultados muestran claramente un grado espectacularmente mayor de precipitación cuando se utilizan los anticuerpos 2R y 4D de la invención en comparación con 3F4.

Los datos del ELISA (Figura 9) muestran claramente un número de Fabs con una unión saturable a PrP 27-30 no desnaturalizada y una unión semi-máxima a aproximadamente 0,5 \mug/ml. Esto corresponde a una constante de afinidad aparente a 10^{8} M^{-1} (PM de Fab = 50.000). Al mismo tiempo, 3F4 muestra una unión insignificante fuera de 2 \mug/ml. Pasando a la PrP 27-30 desnaturalizada, Figura 10, los Fabs recombinantes se unen ahora a un nivel superior pero con una afinidad aparente similar. Esto sugiere que la desnaturalización ha revelado más sitios antigénicos pero sus afinidades son las mismas. Significativamente, 3F4 se está uniendo ahora comparablemente a los Fabs recombinantes con una afinidad aparente del orden de 10^{8} M^{-1}. La comparación de los datos de 3F4 de las Figuras 9 y 10 sugieren fuertemente la integridad de PrP 27-30 en la forma no desnaturalizada. Así se podría sostener que los Fabs recombinantes estaban reaccionando con una fracción de PrP desnaturalizada presente en la preparación de PrP 27-30. La carencia de reactividad de 3F4 con PrP 27-30 no desnaturalizada acoplada con su fuerte reactividad con PrP 27-30 desnaturalizada refuta esta interpretación y sugiere fuertemente que los Fabs recombinantes reconocen las varillas no desnaturalizadas con una elevada afinidad.

Los datos de inmunoprecipitación confirman los datos del ELISA. Concentraciones bajas de Fabs recombinantes como las encontradas en los sobrenadantes bacterianos brutos (típicamente 1-10 \mul/ml) son muy eficaces al inmunoprecipitar PrP 27-30 (Figura 11). Esto implica una afinidad del orden 10^{7} - 10^{8} M^{-1}. En condiciones de concentración comparables, 3F4 no produce precipitación significativa. Un análisis más cuantitativo (Figura 12) muestra que Fab R2 inmunoprecipita PrP 27-30 muy eficazmente con cierta titulación en el intervalo de 0,1-0,2 \mug/ml implicando una afinidad de unión del orden de 10^{8} M^{-1}. Fab 4D tiene una afinidad inferior y 3F4 inmunoprecipita muy débilmente. A partir de este experimento concreto se podía sostener que la afinidad de 3F4 es considerablemente menor de 5 x 10^{7} M^{-1} y probablemente menos de 10^{7} M^{-1}.

En resumen, los datos indican que los Fabs recombinantes tienen afinidades en el intervalo de 10^{7} - 10^{8} M^{-1}.

Claims (11)

1. Un anticuerpo caracterizado por su capacidad para unirse a PrP^{Sc} nativa in situ con una afinidad de unión de 10^{7} litros/mol o más.

2. Un anticuerpo según la reivindicación 1, donde el anticuerpo se une específicamente a PrP^{Sc} de un mamífero seleccionado entre un humano, una vaca, una oveja, un caballo, un cerdo, un perro, un pollo y un gato.

3. Un anticuerpo según la reivindicación 2, donde la afinidad de unión (K_{a}) es de 10^{8} litros/mol o más.

4. Un procedimiento para elaborar un anticuerpo como se ha reivindicado en la Reivindicación 1, 2 ó 3 que comprende:

(a)

inmunizar un mamífero huésped que tiene su gen de PrP endógeno suprimido con la proteína PrP para crear una respuesta inmune;

(b)

extraer células del mamífero huésped cuyas células son responsables de la producción de anticuerpos;

(c)

aislar el ARN de las células de (b);

(d)

transcribir inversamente el ARN para producir ADNc;

(e)

amplificar el ADNc utilizando un cebador;

(f)

insertar el ADNc de (e) en un vector de presentación de fagos para producir una genoteca de anticuerpos expresados en el fago;

(g)

inmunopurificar la genoteca frente a una muestra poniendo en contacto el fago con una composición que comprende proteínas PrP; y

(h)

aislar el fago que se une a la proteína PrP^{Sc}.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, que comprende adicionalmente la inmunopurificación de losanticuerpos frente a un antígeno dispersado en un liposoma donde el antígeno dispersado en un liposoma es un porción núcleo de PrP^{Sc} no digerida con la proteinasa K, cuya porción núcleo está biotinilada.

6. Un anticuerpo caracterizado por su capacidad para unirse a PrP^{Sc} nativa in situ con una afinidad de unión de 10^{7} litros/mol o más obtenible mediante un procedimiento según la reivindicación 4 ó 5.

7. Un método de detección de PrP^{Sc} nativa humana en una fuente que comprende:

poner en contacto un vitro una fuente de la que se sospecha que contiene PrP^{Sc} humana con una cantidad eficaz como diagnóstico de un anticuerpo que se une específicamente al 50% o más de la PrP^{Sc} humana nativa de la fuente; y

determinar si el anticuerpo se une específicamente a cualquier material de la fuente.

8. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 unido a una marca detectable, para su uso en un método que comprende inyectar el anticuerpo marcado en un animal para analizar in vivo la presencia de PrP^{Sc} nativa.

9. Un estuche, que comprende:

una superficie de soporte; y

un anticuerpo unido a la superficie del soporte,

caracterizado el anticuerpo por una capacidad para unir PrP^{Sc} nativa in situ con una afinidad de unión de 10^{7} litro/mol o más.

10. Un estuche según la reivindicación 9, donde el anticuerpo se caracteriza por una capacidad para unir el 50% o más de PrP^{Sc} en una muestra vertible líquida.

11. Un estuche según la reivindicación 9 ó 10, donde se unen una pluralidad de anticuerpos diferentes a la superficie del soporte y cada anticuerpo tiene una K_{a} de 10^{7} litros/mol o más en relación con PrP^{Sc}.