JP3495738B2 - 天然ＰｒＰｓｃ特異的抗体 - Google Patents

天然ＰｒＰｓｃ特異的抗体

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、抗体を入手するための方法、および該抗体
を使用するためのアッセイに関する。より具体的には、
本発明は、天然発生型のPrPScと特異的に結合する抗体
を入手するための方法に関する。
発明の背景 プリオンは、ヒトおよび動物において中枢神経系の海
綿状脳症を引き起こす感染性病原体である。プリオン
は、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。現在
の有力な仮説は、プリオン蛋白質の感染性には核酸成分
は必要でないというものである。さらに、１つの種の動
物（例えばヒト）を感染させるプリオンは、別の種（例
えばマウス）を感染させないと考えられる。
プリオンおよびこれによって引き起こされる疾患の研
究における重要な段階は、プリオン蛋白質（「PrP」）
と命名された蛋白質の発見および精製であった［Bolton
ら、Science 218:1309〜11（1982）;Prusinerら、Bioch
emistry 21:6942〜50（1982）;McKinleyら、Cell 35:57
〜62（1983）］。その後、プリオン蛋白質をコードする
完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定、およびト
ランスジェニック動物における発現がなされた。PrPcは
単一コピーの宿主遺伝子によってコードされ［Basler
ら、Cell 46:417〜28（1986）］、通常は神経細胞の外
表面に認められる。プリオン病は、PrPcがPrPScと呼ば
れる変異型に変換されることによって起こる。しかし、
PrPcの実際の生物学的または生理学的な機能は不明であ
る。
動物およびヒトの伝染性神経変性疾患の伝染および発
病にはいずれもプリオン蛋白質（PrPSc）のスクレイピ
ー型アイソフォームが必要である。これについては、プ
ルシナー（Prusiner,S.B）、「プリオン病の分子生物学
（Molecular biology of Prion Disease）」、Scienc
e、252:1515〜1522（1991）を参照されたい。動物で最
も頻度の高いプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレ
イピー、ならびにウシの牛海綿状脳症（BSE）である［W
ilesmith,JおよびWells,Microbiol.Imunol.172:21〜38
（1991）］。ヒトでは以下の４種類のプリオン病が確認
されている：（１）クルー、（２）クロイツフェルト・
ヤコブ病（CJD）、（３）ゲルストマン・ストロイスラ
ー・シャインカー病（GSS）、および（４）致死性家族
性不眠症（FFI）［Gajdusek,D.C.,Science 197:943〜96
0（1977）;Medoriら、N.Eng.J.Med.326:444〜449（199
2）］。ヒトのプリオン病が散発性、遺伝性および感染
性の疾患として出現する理由は、当初は謎であったが、
現在ではPrPの細胞遺伝学的な由来によって説明されて
いる。
CJD患者の大部分は散発性であるが、約10〜15％はヒ
トPrP遺伝子の変異によって生じる常染色体優性遺伝疾
患として遺伝する［Hsiaoら、Neurology 40:1820〜1827
（1990）;Goldfarbら、Science 258:806〜808（1992）;
Kitamotoら、Proc.R.Soc.Lond.（in press）（199
4）］。死体脳下垂体に由来するヒト成長ホルモン、お
よび硬膜移植片に起因する医原性CJDも発生している［B
rownら、Lancet 340:24〜27］。CJDと、スクレイピーに
感染したヒツジの肉の消費などの感染原因との関係を明
らかにするために多くの試みがなされたが、医原的に引
き起こされた発症例を除いて、現在までに同定されたも
のはない［Harries−Jonesら、J.Neurol.Neurosurg.Psy
chiatry 51:1113〜1119（1988）］。一方、ニューギニ
ア高地に住むフォレ族および近隣種族に数十年にわたっ
て病害をもたらしてきたクルーは、儀式として行われる
カニバリズム（人喰い）の際の感染によって蔓延したと
考えられている［Alpers,M.P.、神経系の遅発性伝染病
（Slow Transmissible Diseases of the Nervous Syste
m）、第１巻、S.B.PrusinerおよびW.J.Hadlow編（New
York;Academic Oress）、pp.66〜90（1979）］。
CJDの実験用霊長類への一次伝染（initial transmiss
ion）には、ウィリアム・ハドロー（William Hadlow）
によるクルーとスクレイピーとの類似性の認識にさかの
ぼる長い歴史がある。1959年にハドローは、クルーが原
因で死亡した患者から調製した抽出物を非ヒト霊長類に
接種してその動物の観察を続ければ、長期の潜伏期の後
に本症を発病することが予想されると提唱した［Hadlo
w,W.J.,Lancet 2:289〜290（1959）］。７年後に、ガジ
ュセック（Gajdusek）、ギブス（Gibbs）およびアルパ
ース（Alpers）は、クルーにチンパンジーへの伝染性が
あり、潜伏期が接種後18〜21カ月であることを示した
［Gajdusekら、Nature 209:794〜796（1966）］。クル
ーの神経病理学的所見とCJDのそれとの類似性［Klatzo
ら、Lab Invest.8:799〜847（1959）］が契機となり、
後者にもチンパンジーを用いた類似の実験が行われ、CJ
Dも伝染することが1968年に報告された［Gibbs,Jr.ら、
Science 161:388〜389（1968）］。過去25年の間に、CJ
D、クルーおよびGSSの約300症例がさまざまな無尾猿お
よび有尾猿（apes and monkeys）へ伝染している。
このような実験に伴う高額の出費、動物数の不足、お
よびしばしば指摘される非人道性などは、この種の研究
を制約しており、このため、知識の蓄積の妨げとなって
いる。最も信頼性の高い伝染データは非ヒト霊長類を用
いた試験によって得られるとの指摘は以前からあるが、
ヒトプリオン病の症例の一部は、明らかに規則性には欠
けるものの、齧歯類にも伝染している［Gibbs,Jr.ら、
神経系の遅発性伝染病（Slow Transmissible Diseases
of the Nervous System）、第２巻、S.B.Prusinerおよ
びW.J.Hadlow編（New York;Academic Oress）、pp.87〜
110（1979）;Takeishiら、ヒトおよび動物のプリオン病
（Prion Diseases of Humans and Animals）、Prusiner
ら編（London:Ellis Horwood）、pp.129〜134（199
2）］。
パッチソン（Pattison）は、ヒツジと齧歯類との間の
スクレイピー病原体の移行に関する研究の中で、ヒトプ
リオン病の齧歯類への伝染が稀であることを「種間障
壁」の例として挙げている［Pattison,I.H.,HINDB Mono
graph 2,D.C.Gajdusek,G.J.,Gibbs,Jr.およびM.P.Alper
s編（Washington,D.C.:U.S.Government Printing）、p
p.249〜257（1965）］。以上の調査では、プリオンの１
つの種から他の種への一次的移行には長期の潜伏期が必
要であり、また発症に至る動物は稀であった。一方、同
一種における二次的移行は、すべての動物が発症し、潜
伏期間も著しく短いことが特徴である。
シリアンハムスター（SHa）とマウスとの間にみられ
る種間障壁の分子的基盤はPrP遺伝子の配列にあること
が、トランスジェニック（Tg）マウスを用いて示されて
いる［Scottら、Cell 59:847〜857（1989）］。SHaPrP
とMoPrPとは、254アミノ酸残基のうち16カ所が異なる
［Baslerら、Cell 46:417〜428（1986）;Lochtら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 83:6372〜6376（1986）］。SHaPr
Pを発現しているTg（SHaPrP）マウスでは、SHaプリオン
を接種した際の潜伏期に短縮が認められる。ヒトまたは
ヒツジPrPの導入遺伝子を発現したマウスで同じような
試験を行った場合には種間障壁は解消されず、感染した
動物の比率は極めて低く、潜伏期も極めて長い。したが
って、例えばヒトプリオンの場合には、何らかの試料が
プリオンに感染しているか否かを判定するために試料を
確実に試験することを目的として、トランスジェニック
動物（別の種のPrP遺伝子を含むマウスなど）を用いる
ことはできない。このような試験が存在しないことによ
る健康上のリスクの重大性は以下に例示する。
ヒト脳下垂体に由来するHGHを投与された後にCJDを発
症した若年成人の数は45例を上回る［Kochら、N.Eng.J.
Med.313:731〜733（1985）;Brownら、Lancet 340:24〜2
7（1992）;Fradkinら、JAMA 265:880〜884（1991）;Buc
hananら、Br.Med.J.302:824〜828（1991）］。幸いなこ
とに今日では組換えHGHが用いられているが、HGHの高値
によって誘発されるwtPrPcの発現の増強がプリオン病の
発病を引き起こす可能性がわずかながらあることも指摘
されている［Lasmezasら、Biochem.Biophys.Res.Commu
n.196:1163〜1169（1993）］。脳下垂体から調製された
HGHがプリオンによって汚染されていることは、疑いの
あるロットのHGHを接種されたサルが66カ月後にプリオ
ン病を発症したことからも裏づけられている［Gibbs,J
r.ら、N.Eng.J.Med.328:358〜359（1993）］。プリオン
病の潜伏期が長いことから、医原性CJDの全容が明らか
になるには何十年もかかり、その間に世界中の多数の人
々がHGHを投与された。医原性CJDは、ヒト脳下垂体由来
の性腺刺激ホルモンを投与された不妊症の女性４例［He
alyら、Br.J.Med.307:517〜518（1993）;Cochiusら、Au
st.N.Z.J.Med.20:592〜593（1990）;Cochiusら、J.Neur
osurg.Psychiatry 55:1094〜1095（1992）］のほか、硬
膜移植を受けた少なくとも11例に発症したとみられてい
る［Nisbetら、J.Am.Med.Assoc.261:1118（1989）;Thad
aniら、J.Neurosurg.69:766〜769（1988）;Willsonら、
J.Neurosurg.Psychiatric 54:940（1991）;Brownら、La
ncet 340:24〜27（1992）］。このような医原性CJDの症
例の存在は、プリオンによって汚染された可能性のある
医薬品に対するスクリーニングの必要性を強調するもの
である。
最近、フランスの２人の医師が、死体から抽出した成
長ホルモンを投与された小児に対する過失致死の罪で告
発された。この小児はクロイツフェルト・ヤコブ病を発
症した。（New Sciensist,July 31,1993,4ページを参
照）。パスツール研究所（Pasteur Institute）によれ
ば、1983年から1985年中期までにヒト成長ホルモンを投
与された若年者におけるCJDの発症例は1989年以来24例
報告されている。これらの小児の15例はすでに死亡し
た。現在では、死体から抽出した成長ホルモンを投与さ
れたフランスの小児数百人がCJDを発病する危険にさら
されていると考えられる（New Sciensist,November 20,
1993,10ページ参照）。PrPモノクローナル抗体を作出し
ようという今までの試みは、失敗に終わっている（Barr
yおよびPrusiner,J.Infectious Diseases Vol.154,No.
3,518〜521（1986）参照）。したがって、疾患の原因と
なる化合物を検出するための解析法が必要である。特
に、CJDの原因となるプリオンが試料材料中に存在する
か否かを試験するための簡便で費用効果の高い解析系に
対する必要性が明らかに存在する。本発明はこのような
解析法を提供するものである。
発明の概要 本発明の抗体は、インサイチューで、天然のプリオン
蛋白質（すなわち、天然のPrPSc）と高度の結合親和性
を示して特異的に結合すると考えられる。本抗体は、あ
る基質の上に配置し、ある試料に関して、その試料が病
原型のプリオン蛋白質を含むか否かを判定するためのア
ッセイに用いることができる。本抗体は、以下の特徴の
１つまたはそれ以上を特徴とする：（１）感染性プリオ
ンを中和する能力、（２）インサイチューでプリオン蛋
白質（PrPSc）と結合する、すなわち細胞培養物中また
はインビボで、プリオン蛋白質の処理（例えば変性させ
る）を要せずに天然型のプリオン蛋白質と結合する、お
よび（３）組成物中のPrPSc型（すなわち疾患型）プリ
オン蛋白質の高い比率と結合する、例えばPrPSc型プリ
オン蛋白質の50％またはそれ以上と結合する。好ましい
抗体は、さらに（４）特定の種の哺乳動物のみのプリオ
ン蛋白質と結合する、例えばヒトプリオン蛋白質とは結
合するがその他の哺乳動物のプリオン蛋白質とは結合し
ない、という能力を特徴とする。
１つの重要な目的は、天然のプリオン蛋白質（Pr
PSc）と結合する抗体を提供することである。
もう１つの目的は、特定の種の動物のプリオン蛋白質
（PrPSc）のエピトープと特異的に結合し、その他の種
の動物のプリオン蛋白質（PrPSc）とは結合しない抗体
を提供することである。
もう１つの目的は、疾患に関連したプリオン蛋白質
（PrPSc）（例えばヒトPrPScなど）と特異的に結合し、
疾患に関連しない変性PrP蛋白質（例えばヒトPrPc）と
は結合しないモノクローナル抗体を提供することであ
る。
さらにもう１つの目的は、１つまたはそれ以上の種の
動物に由来する１つまたはそれ以上の種類のプリオン蛋
白質と結合する能力を特徴とするさまざまな特異的抗体
の作製を可能とするための具体的な方法を提供すること
である。
本発明のもう１つの目的は、PrPSc型のPrP蛋白質を検
出するためのアッセイを提供することである。
本発明のもう１つの目的は、疾患に関連したプリオン
蛋白質（PrPSc）と疾患に関連しないPrPCとの区別を可
能とするためのアッセイを提供することである。
もう１つの目的は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、イ
ヌ、ネコまたはニワトリなどの特定の種の天然のPrPSc
と特異的に結合するプリオンを検出することである。
本発明の１つの利点は、ある試料における天然のPrP
Scの存在を検出するための、迅速で、効率的で、経済的
なアッセイが提供されることである。
１つの明確な利点は、本アッセイを、該プリオンを含
む可能性がある医薬品（天然の供給源に由来するも
の）、食品、化粧品または任意の材料などの製品におけ
るプリオン（すなわちPrPSc）の有無に関するスクリー
ニング法として用いることができ、これによって、この
種の製品の安全性に関するさらなる保証が提供されるこ
とである。
もう１つの利点は、PrPCを変性させるプロテアーゼと
ともに本抗体を用いることができ、それによって感染型
（PrPSc）プリオンと非感染型（PrPC）プリオンとを区
別するための手段が提供されることである。
本発明のさらにもう１つの利点は、本発明の抗体が、
例えばPrPScを中和するなど、天然型のプリオンの感染
性を中和する能力によって特徴づけられることである。
もう１つの利点は、本発明の抗体が、インサイチュー
で（PrPSc）プリオン蛋白質と結合する、すなわち細胞
培養物またはインビボにおいて、プリオン蛋白質を特別
に処理、単離または変性させなくとも自然な状態の天然
型の（PrPSc）プリオンと結合すると考えられることで
ある。
もう１つの利点は、本発明のプリオン蛋白質が、感染
型のプリオン蛋白質（例えばPrPSc）の比較的高い割合
と結合する、例えば組成物中のPrPSc型プリオン蛋白質
の50％またはそれ以上と結合すると考えられることであ
る。
本発明の１つの重要な特徴は、本方法によって、抗体
を（１）製品を精製するためのプリオンの中和、（２）
プリオン蛋白質の抽出、および（３）治療法、などの用
途に特に適合させる、同一または個々に操作された特徴
を有する、さまざまに異なる種類のプリオン蛋白質抗体
を作製することが可能となることである。
本発明の１つの特徴は、抗体の作製にファージディス
プレイライブラリーを用いることである。
本発明のもう１つの特徴は、ファージに対して、その
表面に抗体の特異的結合蛋白質が発現されるよう遺伝的
操作を加えることである。
本発明の上記ならびにその他の目的、利点および特徴
は、以下により完全に詳述するキメラ型遺伝子、アッセ
イ法およびトランスジェニックマウスに関する詳細を読
むことによって当業者には明らかになると思われる。
図面の簡単な説明 図１は、正常野生型のヒトPrP蛋白質と正常野生型の
マウスPrP蛋白質との間の相違点を示すPrP蛋白質の部分
の模式図である。
図２は、マウスPrPのアミノ酸配列を、マウスPrPとヒ
トPrPとの間の明確な相違点とともに示したものであ
る。
図３は、マウスPrPのアミノ酸配列を示しており、特
にマウスPrPとウシPrPとの間の相違点を示したものであ
る。
図４は、マウスPrPのアミノ酸配列を示しており、特
にマウスPrPとヒツジPrPとの間の明確な相違点を示した
ものである。
図５は、変性マウスPrP 27〜30に対するマウス（D728
2）の血清の反応に関して、血清希釈度と405nmにおける
光学濃度との関係を示した棒グラフである。
図６は、マウスD7282から得たIgG1ライブラリーを変
性MoPrP 27〜30ロッドに対してパニング（panning）す
ることによって作製した、選択された（Ａ）重鎖および
（Ｂ）軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示したものであ
る。
図７は、PrPに対する１回のパニングで得られたファ
ージクローンの一部に関して導出されたアミノ酸配列を
示したものである。
図8A〜8Hは、SHaPrP 27〜30および変性SHaPrP 27〜30
の染色結果を示すヒストブロット8A、8B、8C、8D、8E、
8F、8Gおよび8Hの写真である。
図９は、プリオン蛋白質SH a27〜30に対する精製Fab
のELISA反応性を示すグラフである。
図10は、変性プリオン蛋白質SH a27〜30に対する精製
FabのELISA反応性を示すグラフである。
図11は、本発明の組換えFabによるSHaPrP 27〜30のア
ミノ沈降を示す写真である。
図12は、本発明の精製FabによるSHaPrP 27〜30のアミ
ノ沈降を示す写真である。
好ましい態様の詳細な説明 本発明の抗体、解析法およびその使用を提供する方法
を開示し説明する前に、本発明が、特定の抗体、解析法
または方法に制限されるものではなく、それらは当然な
がら変更がありうることが理解される必要がある。ま
た、本明細書で用いる用語は特定の態様のみを説明する
ためのものであり、本発明の範囲を限定するものではな
く、それは添付した請求の範囲によってのみ制限される
ことも理解される必要がある。
別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語
はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理
解しているものと同一の意味を有する。本発明の実施ま
たは試験においては、本明細書に記載したものと同様ま
たは同等の任意の材料および方法を利用することができ
るが、好ましい方法および材料は以下に記載する。本明
細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用
される方法および／または材料を説明または開示する目
的で、参照として本明細書に組み入れられる。
「PrP蛋白質」「PrP」などの用語は、本明細書では互
換可能に用いられ、ヒトおよび動物における疾患（海綿
状脳症）を引き起こすことが知られている感染性粒子型
PrPSc、および適切な条件下で感染性PrPSc型に変換され
る非感染型のPrPSの両方を意味するものとする。
「プリオン」、「プリオン蛋白質、および「PrPSc蛋
白質」などの用語は、本明細書では互換可能に用いら
れ、PrP蛋白質の感染性PrPSc型を意味し、「蛋白質（pr
otein）」および「感染（infection）」の２つの単語を
つなげて短縮したものであり、その全体ではないが大部
分がPrP遺伝子によってコードされるPrPSc分子を含む。
プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異な
る。既知のプリオンには、動物を感染させて、ヒツジお
よびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピー
のほか、別名狂牛病と呼ばれるウシ海綿状脳症（BSE）
およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こすものがある。
ヒトが罹患するプリオン病としては、（１）クルー、
（２）クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）、（３）ゲ
ルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GS
S）、および（４）致死性家族性不眠症（FFI）の４種類
が知られている。本明細書では用いられるプリオンに
は、以上の疾患のすべてもしくは任意の１つ、または用
いられる任意の動物、特にヒトおよび家畜における他の
疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。
「PrP遺伝子」という用語は、本明細書では、図２〜
５に示した蛋白質ならびに本明細書に「病原性の変異お
よび多型」との小見出しを付けて一覧を示したものなど
の多型物および変異物を発現する遺伝的材料を説明する
ために用いられる。「PrP遺伝子」という用語は一般
に、任意の型のプリオン蛋白質をコードする任意の種の
任意の遺伝子を意味する。一般的に知られたいくつかの
PrP配列は、ガブリエル（Gabriel）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89:9097〜9101（1992）に記載されており、
この文献はこのような配列を開示および説明するために
参照として本明細書に組み入れられる。PrP遺伝子は、
本明細書で説明する「宿主」および「被験」動物を含む
任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべての多型
および変異から得ることができ、この用語は、まだ発見
されていないその他のこのようなPrP遺伝子も含むこと
が認識される必要がある。このような遺伝子によって発
現される蛋白質は、PrPC（非疾患型）またはPrPSc（疾
患型）のいずれかの型であると想定される。
「標準化プリオン調製物」「プリオン調製物」「調製
物」などの用語は、例えばプリオン病の徴候を呈する１
組の哺乳動物からの脳組織などであって、その哺乳動物
が、（１）本明細書に記載の導入遺伝子を含む、（２）
除去された内因性PrP遺伝子を有する、（３）遺伝的に
異なる種からのPrP遺伝子の多数のコピーを有する、ま
たは（４）除去された内因性PrP遺伝子と遺伝的に異な
る種からのPrP遺伝子との雑種であるような、PrPプリオ
ンに関連したものと実質的に同じ遺伝的材料を含む哺乳
動物の脳組織から得られる、プリオン含有組成物を説明
するために、本明細書では互換可能に用いられる。標準
化プリオン調製物を得るための哺乳動物は、プリオンの
接種の結果として、および／または例えば多数のコピー
のPrP遺伝子などの遺伝的に改変された構成に起因する
疾患の発症のために、CNS機能障害の臨床徴候を呈す
る。
「人工的なPrP遺伝子」という用語は、本明細書にお
いて、「キメラ型PrP遺伝子」のほか、宿主動物（マウ
スなど）のゲノムに含められた際に、例えばヒト、ウシ
またはヒツジなどの遺伝的に異なる被験動物のみを通常
は感染させるプリオンに対する感染性をその哺乳動物が
獲得するような、組換えによって構築されたその他の遺
伝子も包含するために用いられる。一般に、人工的な遺
伝子には、異なるコドン、好ましくは遺伝的に異なる哺
乳動物（ヒトなど）の対応するコドンとの置換によって
天然の配列の１つまたはそれ以上（しかし全体ではな
く、一般的には40個未満）のコドンが遺伝的に改変され
ている哺乳動物のPrP遺伝子のコドン配列が含まれる。
遺伝的に改変された哺乳動物は、遺伝的に異なる哺乳動
物のみを感染させるプリオンに関して試料を解析するた
めに用いられる。人工的な遺伝子の実例は、マウスのす
べてのコドンがヒト、ウシまたはヒツジの異なるコドン
によって置換されてはいないという条件の下で、図２、
３、および４に示した通りのマウスのコドンの同じ相対
的位置が、図に示したヒト、ウシおよびヒツジのコドン
から選択された１つまたはそれ以上のコドンによって異
なる形に置換された配列をコードするマウスPrP遺伝子
である。人工的なPrP遺伝子は、遺伝的に異なる動物の
コドンを含むだけでなく、天然のPrP遺伝子とは関連し
ないもののそれが動物に挿入されると通常は遺伝的に異
なる動物のみを感染させるプリオンに対する感染性が該
動物に付与されるようなコドンおよびコドン配列も含ま
れる。
「キメラ型遺伝子」「キメラ型PrP遺伝子」「キメラ
型プリオン蛋白質遺伝子」などの用語は、１つまたはそ
れ以上のコドンがヒト、ウシまたはヒツジなどの遺伝的
に異なる被験動物からの対応するコドンによって置換さ
れた、マウスなどの宿主動物のコドンを含む人工的に構
築された遺伝子を意味するために、本明細書では互換可
能に用いられる。１つの特殊な例においては、キメラ型
遺伝子は、宿主動物種（マウスなど）となる哺乳動物の
PrP遺伝子の開始配列および終止配列（すなわち、Ｎ末
端コドンおよびＣ末端コドン）を含み、また第２の種
（ヒトなど）の被験哺乳動物のPrP遺伝子の対応部分の
ヌクレオチド配列も含む。キメラ型遺伝子を、宿主の種
となる哺乳動物のゲノムに挿入すると、第２の種の哺乳
動物のみを通常は感染させるプリオンに対する感染性が
哺乳動物に付与される。本明細書で開示する好ましいキ
メラ型遺伝子は、マウスPrP遺伝子の開始および終止配
列、ならびにそれによって発現する蛋白質に９残基の相
違が生じるような様式でマウスPrP遺伝子とは異なる対
応するヒト配列によって置換された非末端配列領域を含
むMHu2Mである。
「プリオンに関連した遺伝的材料」という用語は、プ
リオンに感染する動物の能力に影響を及ぼす任意の遺伝
的材料を包含するものである。したがって、この用語は
「PrP遺伝子」「人工的なPrP遺伝子」「キメラ型PrP遺
伝子」または「除去されたPrP遺伝子」の任意のものを
包含し、本明細書ではプリオンに感染する動物の能力に
影響を及ぼすそれらの改変とも定義される。標準化プリ
オン調製物は、動物のすべてが同一型のプリオンに感染
しほぼ同時に感染の徴候を呈するように、そのすべてが
プリオンに関連した実質的に同一な遺伝的材料を有する
動物を用いて作製される。
「宿主動物」および「宿主哺乳動物」という用語は、
その動物の体内に通常は存在しない遺伝的材料を含むよ
うに、そのゲノムを遺伝学的および人工的に操作された
動物を説明するために用いられる。例えば、宿主動物に
は、そのPrP遺伝子が除去された、すなわち非機能的遺
伝子が付与されたマウス、ハムスターおよびラットが含
まれる。宿主は、抗体を産生させるためにプリオン蛋白
質を接種される。抗体を産生する細胞は、ファージライ
ブラリーを作出するための遺伝的材料の供給源である。
その他の宿主動物は、天然の（PrP）遺伝子を有すると
考えられる動物、または人工的遺伝子の挿入によっても
しくは遺伝的に異なる被験動物の天然のPrP遺伝子の挿
入によって、改変された動である。
「被験動物」および「被験哺乳動物」という用語は、
宿主動物のPrP遺伝子と被験動物のPrP遺伝子との間に相
違があるという点で宿主動物と遺伝的に異なる動物を説
明するために用いられる。被験動物は、それに対する感
染性を被験動物が一般に有するようなプリオンが任意の
試料に含まれているか否かを判定するための解析試験を
実施したいと考える対象となる任意の動物であってよ
い。例えば、被験動物は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、
ウマ、ネコ、イヌまたはニワトリであってもよく、その
被験動物のみを通常は感染させるプリオンが特定の試料
に含まれるか否かを判定することができる。
「遺伝的に異なる動物」および「遺伝的に異なる哺乳
動物」という用語は、宿主動物の天然のPrPコドン配列
と遺伝的に異なる被験動物との相違点が、17個またはそ
れ以上のコドン、好ましくは20またはそれ以上のコド
ン、最も好ましくは28〜40コドンであるような動物を説
明するために用いられる。したがって、マウスのPrP遺
伝子は、ヒト、ウシまたはヒツジのPrP遺伝子に関して
は遺伝的に異なるが、ハムスターのPrP遺伝子に関して
は遺伝的に異なっていない。
「除去されたプリオン蛋白質遺伝子」「破壊されたPr
P遺伝子」などの用語は、その遺伝子の機能を失わせる
ような様式で改変された（例えば、ヌクレオチドの付加
および／または除去）、内因性のPrP遺伝子を意味する
目的で本明細書では互換可能に用いられる。非機能的な
PrP遺伝子の実例およびそうしたものを作成する方法
は、「ビューラー（Ｂeler）,H.ら、「神経細胞表面P
rP蛋白質を欠失したマウスの正常発達（Normal develop
ment of mice lacking the neuronal cell−surface Pr
P protein）」、Nature 356、577〜582（1992）」およ
びウェイスマン（Weisman）の国際公開公報第93/10227
号に記載されている。遺伝子を除去する方法は、「カペ
チ（Capecchi）、Cell 51:503〜512（1987）」に開示さ
れており、これらの文献はすべて参照として本明細書に
組み入れられる。好ましくは、２つの対立遺伝子はいず
れも破壊される。
「雑種動物」「トランスジェニック雑種動物」などの
用語は、除去された内因性のプリオン蛋白質遺伝子を有
する第１の動物と、（１）キメラ型遺伝子もしくは人工
的なPrP遺伝子、または（２）遺伝的に異なる動物のPrP
遺伝子のいずれかを含む第２の動物との交雑によって得
られる動物を意味する目的で、本明細書では互換可能に
用いられる。例えば、雑種マウスは、マウスPrP遺伝子
が除去されたマウスと、（１）ヒトPrP遺伝子（これは
多数のコピーが存在してもよい）または（２）キメラ型
遺伝子を含むマウスとの交雑によって得られる。雑種と
いう用語には、結果として得られる子孫が、遺伝的に異
なる種のみを通常は感染させるプリオンに対する感染性
を有するものであれば、２つの雑種の同系交配による子
孫を含む任意の雑種の子孫が含まれる。雑種動物は、プ
リオンを接種し、本発明のモノクローナル抗体を産生さ
せるハイブリドーマの作製のための細胞の供給源として
用いることができる。
「感染性を有する」「プリオンに対する感染性を有す
る」などの用語は、遺伝的に異なる被験動物のみを通常
は感染させるプリオンを接種した場合に疾病を発症する
ようなトランスジェニック被験動物または雑種被験動物
を説明するために、本明細書では互換可能に用いられ
る。この用語は、キメラ型PrP遺伝子が存在しなければ
ヒトプリオンに感染しないと考えられるものの、キメラ
型遺伝子が存在する場合にはヒトプリオンに対する感染
性を有するような、トランスジェニックマウスTg（MHu2
M）などのトランスジェニック動物または雑種動物を説
明するために用いられる。
「抗体」とは、ある抗原と結合する能力を持つ免疫グ
ロブリン蛋白質を意味する。本明細書で用いるような抗
体には、抗体全体のほかに、関心対象のエピトープ、抗
原または抗原性断片と結合しうる任意の抗体断片も含ま
れる（例えば、Ｆ（ab'）２、Fab'、Fab、Fv）。
本発明の抗体は、PrPSc蛋白質に対する免疫反応性ま
たは免疫特異性を有し、このため、それと特異的および
選択的に結合する。自然または天然のPrPScに対する免
疫反応性または免疫特異性を有する抗体が好ましい。Pr
PScに対する抗体は、好ましくは免疫特異的であり、す
なわち関連した材料との交差反応性を実質的に持たな
い。「抗体」という用語は、すべての種類の抗体（例え
ばモノクローナル抗体）を包含するが、本発明の抗体
は、好ましくは本明細書に記載するファージディスプレ
イ法を用いて産生される。
「精製抗体」とは、天然の状態で付随している他の蛋
白質、炭水化物および脂質を実質的に含まないものを意
味する。このような抗体は、天然のPrPSc蛋白質（また
はその抗原性断片）と「優先的に結合する」、すなわ
ち、抗原性に関連のないその他の分子を実質的に認識せ
ず結合しない。本発明の精製された抗体は、好ましくは
特定の種のPrPSc蛋白質に対する免疫反応性および免疫
特異性を有し、より好ましくは天然のヒトPrPScに対し
て免疫特異的である。
PrP蛋白質の「抗原性断片」とは、本発明の抗体と結
合する能力を持つような蛋白質の部分を意味する。
「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチド、す
なわちPrPSc蛋白質のエピトープに対する抗体の高いア
ビディティおよび／または高親和性結合を意味する。こ
の特定のポリペプチド上のエピトープに対する抗体の結
合は、好ましくは任意のその他のエピトープ、特に関心
対象の特定のポリペプチドに付随する分子、または同一
試料中にある分子中に存在すると思われるものに対する
同一抗体の結合よりも強く、例えば抗体がほぼ独占的に
PrPScと結合してPrPScの変性断片とは結合しないような
結合条件に調整することによって、PrPCの変性断片より
もPrPScとより強く結合する。関心対象のポリペプチド
と特異的に結合する抗体は、その他のポリペプチドと弱
いが検出可能なレベル（例えば、関心対象のポリペプチ
ドに関して示された結合の10％またはそれ未満）で結合
してもよい。このような弱い結合、またはバックグラウ
ンド結合（background binding）は、関心対象の化合物
またはポリペプチドに対する特異的抗体の結合により、
例えば適切な対照を用いることによって容易に区別可能
である。一般に、インサイチューで107l/molまたはそれ
以上、好ましくは108l/molまたはそれ以上の結合親和性
で天然のPrPScと結合する本発明の抗体は、PrPScと特異
的に結合するといわれている。一般に、106l/molまたは
それ未満の結合親和性を有する抗体は、現在用いられて
いる従来の方法を用いた場合に検出可能なレベルで抗原
と結合しないと思われるため、有用でない。
「検出可能な標識がなされた抗体」「検出可能な標識
がなされた抗PrP」または「検出可能な標識がなされた
抗PrP断片」とは、検出可能な標識が結合された抗体
（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味す
る。検出可能な標識は、通常は化学結合によって結合さ
せられるが、標識がポリペプチドである場合には、代わ
りに遺伝子操作法によって結合させてもよい。検出可能
な標識がなされた蛋白質を生産するための方法は、当技
術分野では周知である。検出可能な標識は、当技術分野
で周知のさまざまなこの種の標識から選択してよいが、
通常は、放射性同位体、発蛍光団（fluorophore）、常
磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダー
ゼ）、または検出可能な信号（例えば、放射能、蛍光、
発色）を発するかもしくはその基質に標識を曝露した後
に検出可能な信号を発するその他の成分もしくは化合物
である。さまざまな検出可能な標識／基質の対（例え
ば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジ
ン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／
ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および標
識された抗体を用いるための方法は、当技術分野では周
知である（例えば、HarlowおよびLane編、（抗体：実験
マニュアル）（Antibodies:A Laboratory Manual）（19
88）、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Sp
ring Harbor、NY）を参照のこと）。
「処理」「処理する」などの用語は、本明細書では一
般に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得
ることを意味する。この効果は、ある疾患もしくその症
状を完全または部分的に防止する点で予防的であっても
よく、ならびに／またはある疾患および／もしくはその
疾患に起因する有害効果を部分的または完全に治癒させ
る点で治療的であってもよい。本明細書で用いられる
「処理」とは、哺乳動物、特にヒトにおける疾患に対す
るあらゆる処理を範囲に含んでいて、 （ａ）その疾患を発症しやすいと考えられるがまだその
疾患を有するとは診断されていない対象における疾患の
発症の防止、 （ｂ）疾患の抑制、すなわちその進展を停止させるこ
と、または （ｃ）疾患の緩和、すなわち疾患の緩解をもたらすこ
と、を含む。本発明は、感染性プリオンを有する患者に
対する処理を目的としており、特に、PrPScの感染によ
ってウシ海綿状脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、致
死性家族性不眠症またはゲルストマン・ストロイスラー
・シャインカー病などの中枢神経系疾患に罹患したヒト
に対する処理を目的としている。
本明細書で用いる略号には以下のものが含まれる： CNSは中枢神経系、 BSEはウシ海綿状脳症、 CJDはクロイツフェルト・ヤコブ病、 FFIは致死性家族性不眠症、 GSSはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー
病、 Huはヒト、 HuPrPはヒトプリオン蛋白質、 Moはマウス、 MoPrPはマウスプリオン蛋白質、 SHaはシリアンハムスター SHaPrPはシリアンハムスタープリオン蛋白質、 Tgはトランスジェニック、 Tg（SHaPrP）はシリアンハムスターのPrP遺伝子を含む
トランスジェニックマウス、 Tg（HuPrP）は完全なヒトPrP遺伝子を含むトランスジェ
ニックマウス、 Tg（ShePrP）は完全なヒツジPrP遺伝子を含むトランス
ジェニックマウス、 Tg（BovPrP）は完全なウシPrP遺伝子を含むトランスジ
ェニックマウス、 PrPScはプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォー
ム、 PrPCはプリオン蛋白質の細胞含有性の共通で、一般的ア
イソフォーム、 MoPrPScはマウスプリオン蛋白質のスクレイピー型アイ
ソフォーム、 MHu2Mは、マウスPrP遺伝子のある領域が、マウスPrPと
９コドン異なる対応したヒト配列によって置換されてい
るキメラ型のマウス／ヒトPrP遺伝子、 Tg（MHu2M）マウスは、キメラ型MHu2M遺伝子を含む本発
明のトランスジェニックマウス、 MHu2MPrPScは、キメラ型ヒト／マウスPrP遺伝子のスク
レイピー型アイソフォーム、 PrPCJDはPrP遺伝子のCJD型アイソフォーム、 Prn−ｐ0/0は、MoPrP遺伝子などの内因性のプリオン蛋
白質遺伝子の両方の対立遺伝子の除去を示し、 Tg（SHaPrP＋/o）81/Prn−ｐ0/0は、SHaPrPを発現する
トランスジェニックマウスの特定の系統（81）であり、
＋/oはヘテロ接合体であることを示し、 Tg（HuPrP）/Prnp0/0は、ヒトプリオン蛋白質遺伝子（H
uPrP）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝
子の２つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交雑によ
って得られた雑種マウス、 Tg（MHu2M）/Prnp0/0は、キメラ型プリオン蛋白質遺伝
子（MHu2M）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白
質遺伝子の２つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交
雑によって得られた雑種マウスを示す。
FVBは、FVBマウスの卵は比較的大きく外因性DNAのマ
イクロインジェクションに対する耐性が比較的高いた
め、トランスジェニックマウスの作出にしばしば用いら
れる標準的な同系交配系統のマウスである。
本発明の一般的な局面 本発明の核心は、PrPSc蛋白質と特異的に結合し、好
ましくはインサイチューで単一の種の（例えばヒトの）
天然の非変性PrPSc蛋白質と、107l/molまたはそれ以
上、好ましくは108l/molまたはそれ以上の親和性で結合
し、さらに好ましくはヒトPrPScのみと結合してヒトPrP
Cの変性断片とは結合しない抗体である。本抗体は、PrP
蛋白質遺伝子のさまざまな変異体および／または多型物
によってコードされるすべての蛋白質と結合してもよ
い。または、その一連の各抗体がPrP遺伝子の異なる変
異体または多型物によってコードされる蛋白質と特異的
に結合する、一連の抗体（２種またはそれ以上の異なる
抗体）が提供される。本抗体は支持体表面と結合させ
て、特定の型のヒトPrPScの有無に関するインビトロで
の試料のアッセイのために用いることができる。また、
本抗体を検出可能な標識と結合させて、特定の型の天然
型PrPScの有無に関するインビボでのアッセイのために
動物に注入することもできる。
あらゆる任意の抗原から抗体を作製する諸手順が知ら
れているが、例えばPrPScなどの特定の蛋白質と結合す
る抗体を作製することは特に困難であることが、これま
での実践によって明らかにされている。PrPScに対する
抗体を得ることに伴う難しさは、一部には、それが特殊
および未知の性質を持つことに関係している。本明細書
に記載する手順に従うことによってインサイチューで天
然のPrPScと結合する抗体が得られており、本明細書に
記載された手順で従うことにより、PrPScおよび抗体の
作製が困難なその他の蛋白質に対するその他の抗体を得
ることができる。
本発明の抗体を生産するためには、宿主哺乳動物に対
するプリオン蛋白質、すなわち感染症PrPScの接種から
始めることが好ましい。宿主哺乳動物は任意の哺乳動物
であってよく、好ましくは本明細書で定めるマウス、ラ
ット、モルモットまたはハムスターなどの種類の宿主哺
乳動物であり、最も好ましくはマウスである。宿主動物
には、好ましくは遺伝的に異なる種である別の種にとっ
て内因性であるプリオン蛋白質が接種される。例えば、
マウスにヒトプリオン蛋白質が接種される。好ましく
は、この宿主哺乳動物には、遺伝的に異なる哺乳動物種
の感染性プリオン蛋白質が接種される。例えば、マウス
にヒトPrPScが接種される。この様式で正常な宿主哺乳
動物を用いた場合でも、一部の抗体を作製することは可
能である。しかし、宿主動物がプリオン蛋白質の遺伝子
を有しており、遺伝的に異なる種に由来するプリオンを
接種された場合には、抗体としては、たとえそれが生じ
たとしても、宿主動物のプリオン蛋白質のエピトープと
遺伝的に異なる種のエピトープとの間に相違点があるエ
ピトープに関するもののみが生じると思われる。これは
実質的に、生じる可能性のある抗体の量を制限し、感染
型のプリオン蛋白質と選択的に結合するが非感染型の変
性断片とは結合しない抗体を見いだす能力を低下させ
る。このため、異なる種のプリオン蛋白質同士を区別す
る抗体を作製しようと試みていないのであれば、抗体作
製過程を、除去された（ablated）プリオン蛋白質遺伝
子、すなわち、Prnp0/0と略記するヌル（null）PrP遺伝
子を有する哺乳動物を用いて開始することが好ましい。
したがって、本発明は一般にこのような「ヌル」哺乳動
物の使用と関連して記載され、特に「ヌルマウス」と関
連して記載される。
抗体はまず、内因性PrP遺伝子が除去された、すなわ
ちPrP遺伝子が機能しないようにされた宿主動物（例え
ばマウス）を作出することによって作製される。除去さ
れたPrP遺伝子を有するマウスを「ヌルマウス」と呼
ぶ。ヌルマウスは、正常なマウスPrP遺伝子へのDNAの断
片の挿入および／または遺伝子の一部の除去によって破
壊されたPrP遺伝子を供することで作製することができ
る。この破壊された遺伝子はマウス胚に注入され、相同
組換えを介して内因性PrP遺伝子と置換される。
ヌルマウスには、抗体の形成を促すためにプリオンが
接種される。さらに、抗体が最大限に生じるようにアジ
ュバントおよびプリオンの注入が一般に用いられる。
続いてこのマウスを屠殺し、骨髄および脾臓の細胞を
摘出する。細胞を溶解し、RNAを抽出してcDNAに逆転写
させる。続いて、抗体の重鎖および軽鎖（またはその部
分）をPCRによって増幅する。増幅されたcDNAライブラ
リーはそのまま用いてもよく、または、一定の範囲の変
異体を作り出し、それによってライブラリーのサイズを
大きくするための操作の後に用いてもよい。
続いて、１つのベクターが、重鎖の断片をコードする
cDNA挿入物をベクターの第１の発現カセット中に含み、
軽鎖の断片をコードするcDNA挿入物をベクターの第２の
発現カセット中に含むように、IgGの重鎖をコードする
増幅されたcDNAおよび軽鎖をコードする増幅されたcDNA
をファージディスプレイベクター（例えば、pComb3ベク
ター）に挿入することによって、IgGファージディスプ
レイライブラリーを構築する。
続いて、当技術分野で周知の方法を用いて、連結され
たベクターを繊維状ファージM13にパッケージングす
る。続いて、ファージ粒子の数を増幅するために、パッ
ケージングがなされたライブラリーを用いて大腸菌の培
養物を感染させる。細菌細胞が溶菌を生じた後に、ファ
ージ粒子を単離してパニング手順に用いる。
作製されたライブラリーを、プリオンを含む組成物に
対してパニングする。続いて、例えばヒトPrPScなどのP
rPScと選択的に結合する抗体断片を単離する。
PrP蛋白質の詳細 PrP 27〜30と命名される、精製された感染性プリオン
の主要な構成要素は、偏在性の細胞蛋白質であるPrPCの
疾患発症性の形態であるより大きな天然蛋白質PrP
Scの、プロテイナーゼＫ抗体性の中核部である。PrPSc
はスクレイピーに感染した細胞のみに認められるが、Pr
PCは感染細胞および非感染細胞の両方に存在しており、
このことはPrPScが感染性プリオン粒子の唯一ではない
としても主要な構成要素であることを意味する。PrPCお
よびPrPScはいずれも同じ単一コピーの遺伝子によって
コードされるため、PrPCからPrPScが生じる機序の解明
へ向けて多大な努力が払われた。この目標の中心に位置
するものは、これらの２つの分子の間の物理的および化
学的な差異の特徴を示すことであった。PrPScがPrPCと
区別される性質には、溶解度の低さは（Meverら、198
6、PNAS）、抗原性の弱さ（Kascack、J.Virol 1987;Ser
ban D.1990）、プロテアーゼ抵抗性（Oeschら、1985 Ce
ll）、およびPrP 27〜30の、スクレイピーに罹患した脳
で認められるPrPアミロイド斑（Prusinerら、Cell 198
3）と超微細構造的および組織化学的なレベルで極めて
類似したロッド状凝集物への重合化が含まれる。プロテ
イナーゼＫを用いることにより、PrPCは変性させうる
が、PrPScは変性させないことが可能である。これまで
に、PrPScへの変換をもたらすPrPCにおけるトランジシ
ョン後化学修飾を同定するためのさまざまな試みがなさ
れたが、結局は失敗に終わった（Stahlら、1993 Bioche
mistry）。この結果、PrPCおよびPrPScは実際には同一
分子の配座異性体（conformational isomer）であると
提唱されている。
従来の技法を用いてPrPの立体配座を記載すること
は、溶解度の問題および十分量の純粋な蛋白質を生産す
る際の困難さが妨げとなっていた。しかし、PrPCおよび
PrPScは、立体配座的には異なる。いくつかの種に由来
するPrPのアミノ酸配列に基づいた理論的計算では、分
子中に４つの推定上のらせん状モチーフが予測されてい
る。実験的な分光学的データからは、PrPCにおけるこれ
らの領域は事実上β−シートを有しないα−ヘリックス
配置をとることが示されている（Panら、PNAS 1993）。
これと極めて対照的に、同じ試験ではPrPScおよびPrP 2
7〜30がアミロイド蛋白質に典型的なβ−シートをかな
り高い割合で含むことが明らかになっている。さらに、
PrPのアミノ酸残基90〜145に対応する伸長性の合成ペプ
チドを用いた試験では、これらの切断型の分子が溶解条
件を変更することによってα−ヘリックスまたはβ−シ
ート構造のいずれかに変換されると考えられることが示
されている。PrPCのPrPScへのトランジションには、そ
れまでα−ヘリックスであった領域がβ−シート構造を
とることが必要である。
一般に、スクレイピー感染では免疫応答が生じず、宿
主生物体は同一種からのPrPScに対する耐性を有する。
多量のSHaPrP 27〜30による免疫化を受けた後にウサギ
ではポリクローナル抗PrP抗体が産生されている（Bendh
eimら、PNAS 1985、Bodeら、J.Gen Virol.1985）。同様
にマウスでも抗PrPモノクローナル抗体がいくつか産生
されている（Kascackら、J.Virol.1987、Barryら、J.In
fect.Dis.1986）。これらの抗体は、SHaおよびヒトに由
来する天然のPrPCおよび変性PrPScの両方を同等によく
認識する能力を持つが、MoPrPとは結合しない。当然な
がら、これらの抗体のエピトープは、SHa−とMoPrPとの
間で異なるアミノ酸を含む配列の領域にマッピングされ
た（Rogersら、J.mmunol.1993）。
上記の部分で引用した刊行物に記載された型の抗体
が、PrPCとは結合するが、PrPScとは結合しない理由は
完全には明らかになっていない。特定の理論の立場をと
らずとも、PrPCの立体配座の中に蛋白質がある場合に露
出されるエピトープが、露出されていないか、または蛋
白質が比較的非溶解性であって互いにより緊密に折り畳
まれているようなPrPScの立体配置の中に一部が隠れて
いるために、このようなことが起こる可能性があること
が示唆される。PrPScに対する極めてわずかな結合は起
こると思われるため、PrPCと結合するがPrPScとは結合
しない抗体という表現は絶対的な意味では正しくない
（しかし、一般に受け入れられている意味では正しい）
ことが指摘されている。本発明の目的に関して、全く結
合が生じないという表現は、平衡定数（equilibrium co
nstant）または結合定数（affinity constant）Kaが106
l/molまたはそれ未満であることを意味する。さらに、K
aが107l/molまたはそれ以上、好ましくは108l/molまた
はそれ以上である場合には、結合が存在すると認識され
る。107l/molまたはそれ以上の結合親和性は、（１）単
一のモノクローナル抗体（すなわち、１つの種類の抗体
が多数ある）、（２）複数の異なるモノクローナル抗体
（例えば、５種の異なるモノクローナル抗体のそれぞれ
が多数ある）、または（３）多数のポリクローナル抗
体、によると考えられる。また、（１）〜（３）の併用
も可能である。
好ましい抗体は、試料中のPrPScの50％またはそれ以
上と結合すると思われる。しかし、上記の（１）〜
（３）のようないくつかの異なる種類の抗体を用いるこ
とによってこれが達成される場合もありうる。異なる抗
体の数を増やすことは、単一の抗体を用いた場合と比べ
て、試料中におけるPrPScのより高い割合と結合させる
上でより有効であることが明らかになっている。例え
ば、単一の抗体「Ｑ」の６つのコピーを用いると、試料
中のPrPScの40％と結合すると思われる。同様の結果
は、抗体「Ｒ」および「Ｓ」の６つのコピーを用いても
得られるとする。しかし、「Ｑ」「Ｒ」および「Ｓ」の
それぞれを２コピーずつ用いた場合、この６個の抗体は
試料中のPrPScの50％を超える割合と結合すると思われ
る。したがって、PrPScと結合する２種またはそれ以上
の抗体を併用することにより、すなわちPrPScに対する
結合親和性Kaが107l/molまたはそれ以上である２種また
はそれ以上の抗体を併用することによって、相乗効果を
得ることができる。このため、D4、R2、6D2、D14、R1お
よびR10ならびに／または関連した抗体の併用によっ
て、相乗的な結果が提供されうる。
抗体／抗原の結合力 ある抗原と抗体とを結合させる力には、本質的には、
２つの関連しない蛋白質、すなわちヒト血清アルブミン
およびヒトトランスフェリンなどのその他の巨大分子の
間に生じる非特異的相互作用と異なる点はない。これら
の分子間力は、（１）静電力、（２）水素結合、（３）
疎水結合、および（４）ファン・デル・ワールス力とい
う４つの一般的な領域に分類することができる。静電力
は、２つの蛋白質の側鎖上にある反対に荷電したイオン
基同士の間の引力によるものである。この引力（Ｆ）
は、荷電体の間の距離（ｄ）の二乗に反比例する。水素
結合力は、−OH、−NH2および−COOHなどの親水基同士
の間に可逆性の水素性架橋が形成されることによっても
たらされる。この種の力は、以上の基を有する２つの分
子がどれだけ近く配置されるかに大きく依存している。
疎水結合力は、水中で油の細かい粒子が融合して単一の
大きな油滴を形成するのと同じように働く。したがっ
て、バリン、ロイシンおよびフェニルアラニンの側鎖な
どの非極性で疎水性の基は、水性環境において会合しよ
うとする傾向がある。最後のファン・デル・ワールス力
は、外部電子雲の間の相互作用によって分子間に生じる
力である。
以上の異なる型の力のそれぞれに関するより詳細な情
報は、I.M.ロイッティ（Roitti）編の「本質的免疫学
（Essential Immunology）」（第６版）、ブラックウェ
ル・サイエンティフィック・パブリケーションズ（Blac
kwell Scieitific Publications）、1988から入手する
ことができる。本発明に関して有用な抗体は、これらの
力のすべてを発揮する。PrP蛋白質に対する高度の親和
性または結合強度を有する抗体、特にインサイチューで
PrPScに対する高度の結合強度を有する抗体を得ること
は、これらの力を多量に累積させることによってはじめ
て可能となる。
抗体／抗原の結合強度の測定 ある抗体とある抗原との間の結合親和性は、上記の力
のすべてに関する測定値を累積する測定によって測定す
ることができる。このような測定を実施するための標準
的な手順はすでにあり、天然のPrPScを含むPrP蛋白質に
対するインサイチューでの本発明の抗体の親和性の測定
に直接適用することができる。
抗体／抗原の結合親和性を測定するための１つの標準
的な方法は、抗原に対しては透過性であるが抗体に対し
ては非透過性である材料を含む容器である透析嚢（dial
ysis sac）の使用によるものである。抗体と完全または
部分的に結合した抗原は、透析嚢内部の水などの溶媒中
に位置する。続いてこの嚢を、抗体または抗原を含まな
い、例えば水などの溶媒のみを含むより大きな容器の内
部に配置する。透析膜を介して拡散しうるのは抗原のみ
であるため、透析嚢内部の抗原の濃度と、外側のより大
きな容器の内部の抗原の濃度とは平衡に近づいていくと
考えられる。透析嚢をより大きな容器中に配置して平衡
に到達するまでの時間をおいた後に、透析嚢内部および
周囲の容器の内部の抗原の濃度を測定し、続いて濃度の
差を決定することが可能である。これにより、透析嚢内
で抗体と結合したままの抗原の量、および抗体と解離し
て周囲容器中に拡散した量を算出することができるよう
になる。拡散によって進入するあらゆる抗原を除去する
ために周囲容器の内部の溶媒（例えば水）を常に交換す
ることによって、透析嚢内部にある抗原を抗体から完全
に解離させることができる。周囲の溶媒を交換しない場
合には、この系はある平衡に達すると思われ、反応、す
なわち抗体と抗原との間の会合および解離に関する平衡
定数（Ｋ）を算出することができる。この平衡定数
（Ｋ）は、透析嚢内部で抗原と結合した抗体の濃度を、
遊離抗体の結合部位の濃度と遊離抗原の濃度とをかけた
値で割った値として算出される。平衡定数または「Ｋ」
値は、一般にリットル／モルの単位で計測される。この
Ｋ値は、遊離状態にある抗原および抗体と、結合型の抗
原および抗体との間の自由エネルギーの差（Δｇ）を測
定したものである。以下に説明するファージディスプレ
イ法を用いた場合には、得られる抗体は107l/molまたは
それ以上の親和性すなわちＫ値を有する。
抗体の結合活性 上記の通り、「親和性」という用語は、１つの抗体の
１つの抗原決定基との結合を記載するものである。しか
し、実際の大部分の環境では、１つの抗体と多価抗原と
の相互作用が問題となる。「結合活性（avidity）」と
いう用語は、この結合を表現するために用いられる。結
合活性に寄与する因子は複雑であり、抗原上の各決定基
を指向する任意の血清における抗体の不均一性、および
決定基それ自体の不均一性が含まれる。大部分の抗原が
多価であることは、２つの抗原分子が１つの抗体によっ
て結合するという個々の抗体の連結の算術的合計よりも
常に大きく、通常は数倍の大きさである興味深い「ボー
ナス」効果をもたらす。したがって、１つの抗血清と１
つの多価抗原との間で測定される結合活性は、１つの抗
体と１つの抗原決定基との間の親和性よりも幾分高いと
考えられる。
抗体を作製するためのヌルPrPマウス 本発明により、耐性の問題は回避され、PrP遺伝子（P
rnp）の両方の対立遺伝子が除去されたマウス（Prn
p0/0）を一部に用いて、Moおよびその他のPrP上の広範
なエピトープを認識する能力を持つ一連のモノクローナ
ル抗体がより効率的に作製される（Buelerら、1992）。
これらのPrP欠損マウス（またはヌルマウス）は、その
発達および行動の点では正常マウスと区別不能である。
これらのヌルマウスは、感染性MoPrPScの大脳内接種後
にもスクレイピーに対する抵抗性を示す（Buelerら、19
93 Cell;Prusinerら、PNAS 1992）。さらに、Prnp0/0マ
ウスは、アジュバントとして比較的少量の精製されたSH
aPrP 27〜30を用いて免疫化を行った後にMo−、SHaおよ
びヒトPrPに対するIgG血清抗体価を生じると考えられる
（Prusinerら、PNAS 1993）。抗体が産生されるための
十分な時間をおいた後に、免疫化されたPrnp0/0マウス
を屠殺し、従来の方法でハイブリドーマを作製した。こ
れらのマウスに由来する融合細胞は、PrPに特異的な抗
体を分泌した。しかし、これらのハイブリドーマは、数
時間を超えてPrP特異的抗体を分泌することはなかっ
た。これでは十分に成功したとは思われないという観点
から、異なる手法を用いた。
ファージディスプレイ コンビナトリアル抗体ライブラリー技術、すなわち、
M13繊維状ファージの表面に発現させた抗体ライブラリ
ーからの抗原に基づく選択は、モノクローナル抗体の作
製に新たな手法を提供するものであり、プリオンの問題
に関して特に適切であるハイブリドーマ法と比較して多
くの利点を持つ（Huseら、1989;Barbasら、1991;Clacks
onら、1991;BurtonおよびBarbas、1994）。本発明は、M
oPrPによって免疫化されたPrnp0/0マウスから調製した
ファージ抗体ライブラリーから得たPrP特異的モノクロ
ーナル抗体を提供する目的でこの種の技術を用いる。本
発明では、インサイチューでMoPrPを認識する第１のモ
ノクローナル抗体が提供され、ヌルマウスから特異的な
抗体をクローニングするためのコンビナトリアルライブ
ラリーの応用が示される。ファージディスプレイ技術を
用いる大規模なコンビナトリアルライブラリーの作製に
含まれる一般的な方法は、1993年６月29日に発行された
米国特許第5,223,409号に記載および開示されており、
この特許はファージディスプレイ法の開示および記載の
ために参照として本明細書に組み入れられる。
ヌル動物 本発明は、本明細書では主としてヌルマウス、すなわ
ち、PrP遺伝子の両方の対立遺伝子が除去されたFVBマウ
スに関して記載される。しかし、その他の宿主動物も使
用可能であり、好ましい宿主動物はマウスおよびハムス
ターであるが、中でもマウスは、トランスジェニック動
物の作出に関してかなりの知識が存在する点で最も好ま
しい。可能な宿主動物には、ハツカネズミ属（マウスな
ど）、ドブネズミ属（ラットなど）、アナウサギ属（ウ
サギなど）、ならびにハムスター（Mesocricetus）属
（ハムスターなど）およびモルモット属（モルモットな
ど）から選択される属に所属するものが含まれる。一般
に、正常な成体重量が1kg未満であるような哺乳動物は
繁殖および維持が容易であって使用可能である。
PrP遺伝子 PrP遺伝子を構成する遺伝的材料は、多くの異なる動
物種に関して知られている（Gabrielら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89:9097〜9101（1992）を参照）。さらに、
異なる哺乳動物のPrP遺伝子の間にはかなりの相同性が
存在する。例えば、マウスPrPのアミノ酸配列をヒト、
ウシおよびヒツジのPrPと比較したものを、その相違点
のみに関して示した図２、３および４を参照されたい。
PrP遺伝子に関する遺伝的な相同性はかなり高いもの
の、この違いには場合によっては意義がある。より具体
的に言えば、異なる哺乳動物のPrP遺伝子によってコー
ドされる蛋白質におけるわずかな違いのために、１つの
哺乳動物（ヒトなど）に感染するプリオンは、異なる種
の哺乳動物（マウスなど）には通常は感染しない。この
「種間障壁」のため、ヒトなどの異なる動物を通常は感
染させるプリオンが特定の試料に含まれるか否かを判定
するためにマウスなどの通常の動物（すなわち、PrP蛋
白質に関連した遺伝的材料が操作されていない動物）を
用いることは一般的には可能ではない。本発明は、抗体
がデザインされる対象である任意の種の動物の天然のPr
PSc蛋白質と結合する抗体を提供することによって、こ
の問題点を解決する。
病原性の変異および多型 ヒトPrP遺伝子に多くの病原性変異が知られている。
さらに、ヒト、ヒツジおよびウシのPrP遺伝子には多型
が存在することが知られている。以下は、このような変
異および多型を一覧表として示したものである。
ヒト、ヒツジおよびウシのPrP遺伝子のDNA配列は決定
されているため、それぞれの場合において、それらのそ
れぞれのプリオン蛋白質の完全なアミノ酸配列を予測す
ることが可能である。大多数の個体で生じる正常なアミ
ノ酸配列は、野生型のPrP配列と呼ばれる。この野生型
配列は、特定の特徴的な多型的変異を生じることが多
い。ヒトPrPの場合には、残基129（Met/Val）および219
（Glu/Lys）に２種のアミノ酸多型がみられる。ヒツジP
rPは、残基171および136に２種のアミノ酸多型を有し、
ウシPrPは成熟型プリオン蛋白質のアミノ端領域内に８
アミノ酸モチーフ配列の５回または６回の反復を有す
る。これらの多型はいずれもそれ自体に病原性はない
が、プリオン病に影響を及ぼすと考えられる。これらの
正常変異とは異なり、遺伝性ヒトプリオン病の形質を分
離させる、PrPの特定のアミノ酸残基またはオクタリピ
ート（８単位反復;octarepeat）の数が変化するような
ヒトPrP遺伝子の特定の変異が同定されている。
変異および多型を示した上記の一覧表にさらに大きな
意味を持たせるために、すでに発表されているPrP遺伝
子の配列を参照することができる。例えば、ニワトリ、
ウシ、ヒツジ、ラットおよびマウスのPrP遺伝子は開示
されており、ガブリエル（Gabriel）ら、Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 89:9097〜9101（1992）に掲載されている。
シリアンハムスターに関する配列は、バスラー（Basle
r）ら、Cell 46:417〜428（1986）に掲載されている。
ヒツジのPrP遺伝子はゴールドマン（Goldmann）ら、Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 87:2476〜2480（1990）に掲載さ
れている。ウシに関するPrP遺伝子の配列はゴールドマ
ンら、J.Gen.Virol.72:201〜204（1991）に掲載されて
いる。ニワトリPrP遺伝子に関する配列はハリス（Harri
s）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:7664〜7668（199
1）に掲載されている。ミンクに関連するPrP遺伝子の配
列はクレッチマー（Kretzschmer）ら、J.Gen.Virol.73:
2757〜2761（1992）に掲載されている。ヒトPrP遺伝子
の配列はクレッチマーら、DNA 5:315〜324（1986）に掲
載されている。マウスのPrP遺伝子の配列はロホト（Loc
ht）ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:6372〜6376（198
6）に掲載されている。ヒツジに関するPrP遺伝子の配列
はウェスタウェイ（Westaway）ら、Genes Dev.8:959〜9
69（1994）に掲載されている。以上の刊行物はすべて、
PrP遺伝子およびPrPのアミノ酸配列を開示および説明す
る目的で本明細書に参照として組み入れられる。
ヒトプリオンの「系統」 齧歯類における研究では、プリオンの系統によってPr
PScの蓄積に異なるパターンが生じ［Heckerら、Genes
＆ Development 6:1213〜1228（1992）;DeArmondら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6449〜6453（1993）］、それ
がPrPScの配列によって劇的に変化することが示されて
いる［Carlsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、印刷中（1
994）］。長い間、プリオンの多様性の分子的基盤は、
スクレイピーに特異的な核酸に起因するとされてきた
［Briceら、J.Gen.Virol.68:79〜89（1987）］が、これ
は全く発見されていない［Meyerら、J.Gen.Virol.72:37
〜49（1991）;Kellingら、J.Gen.Virol.73:1025〜1029
（1992）］。プリオンの系統を説明するための他の仮説
には、PrPのAsnに結合した糖鎖の違い［Heckerら、Gene
s ＆ Development 6:1213〜1228（1992）］およびPrPSc
の複数の配座異性体（conformer）［Prusiner,S.B.、Sc
ience 252:1515〜1522（1991）］によるものが含まれ
る。Tg（MHu2M）マウスにおけるPrPScのパターンは、CJ
Dのために死亡したヒトから得た３種類の接種物に関し
て極めて類似していた。
接種を受けたTg（MHu2M）マウスの脳におけるPrPScの
蓄積パターンは、RMLプリオンおよびHuプリオンについ
ては著しく異なっていた。しかし、MoPrPScを含むRMLプ
リオン接種物は比較的多量のMoPrPScの形成を促した
が、HuPrPCJDを含むHuプリオン接種物はMHu2MPrPScの産
生を誘発した。神経細胞の空胞化および星状神経膠腫を
特徴とする神経病理学的変化の分布は、RMLプリオンま
たはHuプリオンを接種されたTg（MHu2M）マウスの脳に
おけるPrPScの蓄積パターンと同様である。
標準化プリオン調製物 標準化プリオン調製物は、本発明のアッセイを試験
し、それによりアッセイの信頼性を高めるために作製さ
れる。この調製物は任意の動物から得ることができる
が、被験動物のプリオンを含む脳材料を有する宿主動物
から得ることが好ましい。例えば、ヒトプリオン蛋白質
遺伝子を含むトランスジェニックマウスは、ヒトプリオ
ンを産生するとができ、このようなマウスの脳は標準化
ヒトプリオン調製物を作製するために用いることができ
る。さらに、本調製物が「標準」であるためには、それ
は好ましくは一連（例えば、100、1,000またはそれ以上
の動物）の実質的に同一な動物から得られる。例えば、
極めて多数のヒトPrP遺伝子（すべての多型および変
異）のコピーをすべてが含む100匹のマウスは、疾患を
自然発症すると思われ、各々から得た脳組織を組み合わ
せることによって有用な標準化されたプリオン調製物が
作製されうると考えられる。
標準化プリオン調製物は、上述されたタイプの任意の
改変された宿主動物を用いて作製することができる。例
えば、ヒト、ウシ、ヒツジまたはウマなどの遺伝的に異
なる種のみを一般的には感染させるプリオンに対する感
染性を獲得し、その改変された宿主動物がプリオンの接
種から350日後またはそれ以内の期間のうちにCNS機能障
害の臨床徴候を発症するように遺伝的に改変されたマウ
ス、ラット、ハムスターまたはモルモットを用いて、標
準化プリオン調製物を作製することができる。最も好ま
しい宿主動物はマウスであり、その理由は一部には、使
用に高額の費用を要しないため、およびトランスジェニ
ックマウスの作出に関して得られている経験の量が他の
種類の宿主動物の作出に関する量よりも豊富であるため
である。標準化されたプリオン調製物の作製に関する詳
細は、1995年８月31日に提出された「試料中のプリオン
を検出する方法、および同目的で使用されるトランスジ
ェニック動物」と題する米国特許出願である米国特許出
願番号第08/521,992号、および1996年７月30日に提出さ
れた「試料中のプリオンの検出、ならびに同目的で使用
されるプリオン調製物およびトランスジェニック動物」
と題する米国特許出願である弁理士明細書番号第06510/
056001号に記載されており、これらの２件の出題はいず
れも参照として本明細書に組み入れられる。
マウスなどの適切な種類の宿主を選択したならば、次
の段階は、標準化プリオン調製物の作製に用いるために
適した種類の遺伝的操作を選択することである。例え
ば、マウスは、本発明のキメラ型遺伝子の挿入によって
遺伝的に改変されたマウスであってもよい。この群のマ
ウスは、キメラ型遺伝子の発現レベルを上昇させるため
に、多数のコピーのキメラ型遺伝子の導入および／また
は複数のプロモーターを導入されたものでもよい。また
は、内因性PrP遺伝子が除去されたマウスと、ゲノム内
にヒトPrP遺伝子が挿入されたマウスとの交雑による本
発明の雑種マウスを用いることもできる。当然ながら、
このような雑種マウスにはさまざまな下位区分がある。
例えば、発現の増強のために、ヒトPrP遺伝子を、多数
のコピーとして挿入すること、および／または複数のプ
ロモーターとともに使用することもできる。さらにもう
１つの選択肢として、さまざまに異なる種類のプリオ
ン、すなわち２つまたはそれ以上の種類の被験動物のみ
を一般的には感染させるものに対する感染性を有するマ
ウスを作出するために、ゲノム内に複数の異なるPrP遺
伝子を挿入することによってマウスを作出することもで
きる。例えば、ヒトの配列の一部、ウシの配列の一部を
含む独立したキメラ型遺伝子、およびヒツジの配列の一
部を含むさらにもう１つのキメラ型遺伝子を含むキメラ
型遺伝子を含むマウスを作出することもできる。３つの
異なる種類のキメラ型遺伝子のすべてがマウスのゲノム
に挿入された場合には、そのマウスはヒト、ウシおよび
ヒツジのみを一般的には感染させるプリオンに対する感
染性を有すると考えられる。
適切な哺乳動物（マウスなど）および適切な様式の遺
伝的改変（例えばキメラ型PrP遺伝子の挿入）を選択し
た後の次の段階は、プリオンに関連した遺伝的材料に関
して実質的に同一な多数のそのような哺乳動物を作出す
ることである。より具体的には、作出されるそれぞれの
マウスは、ゲノム内に同一のキメラ型遺伝子を実質的に
同一のコピー数で含むものであろう。これらのマウス
は、マウスの95％またはそれ以上が接種から350日後ま
たはそれ以内のうちにCNS機能障害の臨床徴候を発症し
て、すべてのマウスがほぼ同一時点、例えば互いに30日
以内にこのようなCNS機能障害を発症するように、プリ
オンに関連した遺伝的材料に関して十分に遺伝的に同一
である必要がある。
このようなマウスの、例えば50匹またはそれ以上、よ
り好ましくは100匹またはそれ以上、さらに好ましくは5
00匹またはそれ以上の多数の群が作出された場合には、
その次の段階は、遺伝的に異なる哺乳動物のみを一般的
には感染させるプリオン、例えばヒト、ヒツジ、ウシま
たはウマからのプリオンをマウスに接種することであ
る。異なる群の哺乳動物に与える量はさまざまであって
よい。哺乳動物にプリオンを接種した後は、その哺乳動
物が例えばCNS機能障害の臨床徴候などのプリオン感染
症の症状を呈するまでその哺乳動物を観察する。プリオ
ン感染症の徴候を呈した後に、それぞれの哺乳動物の脳
または少なくとも脳組織の一部を摘出する。摘出された
脳組織をホモジェネートすることにより、標準化プリオ
ン調製物が提供される。
トランスジェニックマウスの群に遺伝的に異なる動物
からのプリオンを接種する代わりに、プリオンに関連し
た疾患を自然発症するマウスを作出することも可能であ
る。これは例えば、マウスゲノムに極めて多数のコピー
のヒトPrP遺伝子を導入することによって実施すること
ができる。コピー数を例えば100またはそれ以上に増や
した場合には、マウスはCNS機能障害の臨床徴候を自然
発症し、かつその脳組織内にはヒトを感染させる能力を
有するプリオンを有すると考えられる。これらの動物の
脳またはこれらの動物の脳組織の部分を摘出およびホモ
ジェネートして、標準化プリオン調製物を作製すること
が可能である。
標準化プリオン調製物は、そのまま使用することも、
さまざまに異なる種類の陽性対照が提供されるような様
式で希釈してごく一部を使用することもできる。より具
体的には、既知の量のさまざまなこのような標準化調製
物を、第１の組のトランスジェニック対照マウスに接種
するために用いることができる。実質的に同一な第２の
組のマウスには、試験される材料、すなわちプリオンを
含む可能性のある材料を接種する。実質的に同一な第３
の群のマウスには、いかなる材料も注入しない。続い
て、この３つの群を観察する。マウスにいかなる材料も
注入していないことから、第３の群は当然ながら発病し
ないはずである。もしこのようなマウスが発病するよう
であればアッセイは正確でなく、これはおそらく疾患を
自然発症するマウスが作出された結果であると思われ
る。標準化調製物を注入された第１のマウスが発病しな
い場合もアッセイは不正確であり、これはおそらく、そ
のマウスが、遺伝的に異なる哺乳動物のみを一般的には
感染させるプリオンを接種した場合に発病するように正
しく作出されていないためであると考えられる。しか
し、第１の群が発病して第３の群が発病しない場合に
は、アッセイは正確であると推定することができる。し
たがって、第２の群が発病しなければ被験材料はプリオ
ンを含んでおらず、第２の群が発病すれば被験材料には
プリオンが含まれる。
本発明の標準化プリオン調製物を用いることにより、
プリオンを含む高度に希釈された組成物を作製すること
ができる。例えば、100万分の１もしくはそれ未満の割
合、または10億分の１もしくはそれ未満の割合で含む組
成物を作製することができる。このような組成物は、プ
リオンの有無の検出における本発明の抗体、アッセイお
よび方法の感度の試験に用いることができる。
プリオン調製物は、一定量のプリオンを含むと考えら
れ、同型の背景から抽出されている点で望ましい。した
がって、調製物中の混入物は一定であり、制御可能であ
る。標準化プリオン調製物は、さまざまな医薬品、全
血、血液分画、食品、化粧品、臓器、ならびに特に生き
たヒトまたは死体に由来する臓器、血液およびその製品
などの（生きている、または死亡した）動物に由来する
任意の材料におけるプリオンの有無を判定するためのバ
イオアッセイの実施において有用であると考えられる。
したがって、標準化プリオン調製物は、調製物を添加し
て特定の過程に関する変動の減少を評価するような、精
製プロトコールのバリデーションに有意義である。
有用な用途 上記および以下の詳細な実施例でさらに説明するよう
に、本発明の方法を、広い範囲のさまざまな抗体、すな
わち、さまざまな特定の特徴を有する抗体を作製するた
めに用いることが可能である。例えば、単一の種の体内
で通常生じるプリオン蛋白質のみと結合し、その他の種
の体内で通常生じるプリオン蛋白質とは結合しない抗体
を作製することができる。さらに、感染型プリオン蛋白
質（例えばPrPSc）のみと結合し、非感染型（例えばPrP
C）とは結合しないように抗体をデザインすることもで
きる。続いて、単一の抗体または一連の異なる抗体を用
いてアッセイ装置を作成することもできる。このような
アッセイ装置は、当業者に公知の従来の技術を用いて調
製することができる。抗体の公知の技法を用いて精製お
よび単離し、公知の手順を用いて支持体表面に結合させ
ることもできる。これによって得られる、抗体が結合し
た表面は、試料をアッセイして１種またはそれ以上の種
類の抗体がその試料に含まれるか否かを判定するために
用いることができる。例えば、ヒトPrPScのみと結合す
る抗体をある材料の表面に付着させることができ、ある
試料をプロテイナーゼＫによって変性させることができ
る。変性した試料を、材料の表面に結合した抗体と接触
させる。全く結合が生じなければ、その試料にはヒトPr
PScが含まれていないと推論することができる。
また、本発明の抗体は、プリオンを中和する能力によ
っても特徴づけられる。具体的には、本発明の抗体をプ
リオンと結合させることによってプリオンの感染性は失
われる。したがって、本発明の抗体組成物をあらゆる任
意の製品に添加して、この製品中に存在するあらゆる感
染性プリオン蛋白質を中和することができる。このた
め、ある製品が感染性プリオン蛋白質を含む可能性のあ
る天然供給源から生産される場合には、本発明の抗体を
予防措置として添加し、それによって感染性プリオン蛋
白質に起因する感染の可能性をなくすことができると思
われる。
本発明の抗体は、イムノアフィニティークロマトグラ
フィー技術と組み合わせて用いることができる。より具
体的には、本抗体をクロマトグラフィーカラム内の１つ
の材料の表面上に配置することができる。その後に、精
製しようとする組成物をカラムへ通過させることができ
る。精製しようとする試料に、抗体と結合する何らかの
プリオン蛋白質が含まれていれば、それらのプリオン蛋
白質（PrPSc）は試料から除去され、それによって精製
されると思われる。
最後に、本発明の抗体は、哺乳動物の処理に用いるこ
とができる。本抗体を予防的に与えることも、感染性プ
リオン蛋白質にすでに感染していて、上記のアッセイの
使用によってこの種の感染が判定された個体に投与する
ことも可能である。投与する必要のある抗体の正確な量
は、患者の年齢、性別、体重および病状などの多数の因
子に応じて異なる。当業者は、少量の抗体を投与してそ
の効果を判定し、その後に用量を調整することによって
正確な量を決定することができる。用量は0.01mg/kgか
ら約300mg/kgまでの範囲が可能であり、好ましくは約0.
1mg/kgから約200mg/kg、より好ましくは約0.2mg/kgから
約20mg/kgを、１日１回またはそれ以上の回数に分け
て、１日または数日にわたって投与することが示唆され
ている。プリオンの感染性の「リバウンド」の発生を避
けるために、抗体は２〜５日またはそれ以上の連続した
日数にわたって投与することが好ましい。
実施例 以下の実施例は、本発明のキメラ型遺伝子、トランス
ジェニックマウスおよびアッセイの作成および使用の仕
方に関する完全な開示および説明を当業者に提供するた
めに記載されており、本発明らが発明とみなしている内
容の範囲を制限するものではない。使用する数字（例え
ば、量、温度など）に関して正確であるように努力は払
っているが、実験的誤差および偏差が含まれていると考
慮されるべきである。別に特記しない限り、各部分は総
重量にしめる部分重量であり、分子量は加重平均された
分子量であり、温度は℃で示し、圧力は大気圧またはそ
の近傍圧である。
抗体（Fab）を発現するファージディプレイ抗体ライブ
ラリーの構築 抗体、特に抗体のFab部分を発現させるためのファー
ジディプレイライブラリーの構築は、当技術分野では周
知である。好ましくは、抗体を発現するファージディプ
レイ抗体ライブラリーは、1993年６月29日に発行された
米国特許第5,223,409号、および1992年９月16日に提出
された米国特許出願第07/945,515号に記載された方法に
従って調製され、これらは参照として本明細書に組み入
れられる。本発明の抗体を作製するために、本開示を用
いて、一般的な方法の手順を適合させることが可能であ
る。
プリオン特異的抗体をコードするRNAの単離 一般に、抗PrP抗体に関するファージディスプレーラ
イブラリーは、抗PrP抗体をコードするRNAを含むRNAの
プールをまず単離することによって調製される。これを
達成するには、ある動物（例えば、マウス、ラットまた
はハムスター）に対して関心対象のプリオンによる免疫
化を施す。しかし、通常の動物は、プリオンに対する抗
体を検出可能または十分に高いレベルでは産生しない。
この問題は、（PrP）遺伝子が両方の対立遺伝子とも除
去された動物に対して免疫化を行うことによって回避さ
れる。このようなマウスはPrnp0/0を命名されており、
このようなマウスを作出するための方法はビューラー
（Ｂeler）、Nature（1992）および1993年５月27日に
刊行されたワイスマン（Weismann）による国際公開公報
第93/10227号に開示されている。「ヌル」動物へのプリ
オンの接種により、プリオンに対するIgG血清力価がも
たらされる（Prusinerら、PNAS 1993）。１つの好まし
い態様では、免疫化のために選択される動物は、ビュー
ラーおよびワイスマンによって記載されたPrnp0/0マウ
スである。
一般に、「ヌル」動物において血清抗体反応を誘発さ
せるために必要なプリオンの量は、約0.01mg/kgから約5
00mg/kgまでである。
プリオン蛋白質は、動物に対して、一般に注射、好ま
しくは腹腔内または静脈内注射、より好ましくは腹腔内
注射によって投与される。動物には１回注射を行った
後、引き続いて少なくとも１回から４回のブースター
（booster）注射、好ましくは３回のブースター注射を
行う。免疫化の後に、当技術分野では周知の方法に従っ
て、ELISAまたはウエスタンブロット法などの標準的な
免疫学的アッセイを用いて、その動物の抗血清のプリオ
ンに対する反応性を試験することが可能である（例え
ば、HarlowおよびLane、1988、抗体：実験マニュアル
（Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harb
or Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照
のこと）。プリオン結合性の抗血清を有する動物に対し
て、さらにプリオンを注射することによって追加抗原刺
激（boost）を行ってもよい。
血清の抗体レベルは、抗体分泌の予測値であり、した
がって、リンパ球、特に形質細胞における特定のmRNAの
レベルの予測値でもある。このため、血清抗体、特に比
較的高レベルの血清抗体の検出は、そのような血清抗体
をコードするmRNAを産生する形質細胞などの高レベルの
リンパ球と相関している。このため、プリオン蛋白質に
よる免疫化を受けたマウスから単離された形質細胞は、
特にその形質細胞が最後の注射による追加抗原刺激から
短期間（例えば、約２〜５日、好ましくは３日）のうち
にマウスから単離された場合には、プリオン特異的抗体
を産生するリンパ球（例えば形質細胞）を高い比率で含
むと思われる。このため、マウスの免疫化およびその後
の注射による追加抗原刺激は、マウスの形質細胞の全集
団の中に依存する抗PrP抗体産生性の形質細胞の全体的
な比率を高めるに有用である。さらに、抗PrP抗体は最
高血清レベルまたはその付近で産生されるため、抗PrP
抗体産生性の形質細胞は抗PrP抗体を産生しているとこ
ろであり、このためこれらの抗体をコードするmRNAも最
高レベルまたはその付近である。
抗原特異的抗体の血清レベル、このような抗原特異的
抗体を産生するリンパ球の数、および抗原特異的抗体を
コードするmRNAの総量の間に見られる上記の相関によっ
て、関心対象の抗原特異的抗体をコードするmRNAに富む
mRNAのプールを単離するための手段が提供される。当技
術分野で周知の方法に従って（例えば、Huseら、Scienc
e 1989を参照）、形質細胞を含むリンパ球を、プリオン
による免疫化を受けた動物の脾臓および／または骨髄か
ら単離する。好ましくはリンパ球は、最後の追加抗原刺
激から約２〜５日後、好ましくは約３日後に単離する。
続いて、これらの細胞から全RNAを抽出する。哺乳動物
細胞からRNAを単離するための方法は、当技術分野では
周知である（例えば、Sambrookら、1989、分子クローニ
ング：実験マニュアル（Molecular Cloning:A Laborato
ry Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Co
ld Spring Harbor、NYを参照）。
リンパ球mRNAからの、抗体をコードするcDNAの産生 当技術分野で周知の方法に従い（例えば、Sambrook
ら、前記を参照）、逆転写酵素を用いて、単離したRNA
からcDNAを産生させ、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を
用いて、抗体の重鎖または軽鎖をコードするcDNAを増幅
する。重鎖または軽鎖をコードするcDNAを増幅するため
に用いる3'プライマーは、特定の抗体サブクラスの重鎖
または軽鎖抗体に共通した既知のヌクレオチド配列に基
づく。例えば、IgG1サブクラスの重鎖を増幅するために
は、IgG1の重鎖をコードする遺伝子の定常領域に基づく
１組のプライマーを用いることができ、一方、IgG1サブ
クラスの軽鎖を増幅するためには、IgG1の軽鎖をコード
する遺伝子の定常部分に基づく別の組のプライマーが用
いられる。5'プライマーは、データベース中の多数の可
変領域の検討に基づいて得られたコンセンサス配列であ
る。このようにして、特定の抗体クラスまたはサブクラ
スのすべての抗体をコードするDNAが、増幅されたDNAに
よってコードされる抗体の抗原特異性にはかかわらずに
増幅される。重鎖または軽鎖をコードする遺伝子全体を
増幅することが可能である。または、そのPCR増幅産物
が、その対応する重鎖または軽鎖と会合して、抗原結合
において機能する、すなわちプリオン蛋白質と選択的に
結合することができる重鎖または軽鎖遺伝子産物をコー
ドする限りにおいて、重鎖または軽鎖をコードする遺伝
子の一部のみを増幅してもよい。好ましくは、このファ
ージディスプレイ産物は、FabまたはFv抗体断片であ
る。
増幅のために選択された、抗体をコードするcDNAは、
任意のアイソタイプをコードすることができ、好ましく
はIgGのサブクラスをコードする。模範的なマウスIgGサ
ブクラスには、IgG1、IgG2a、IgG2b、およびIgG3が含ま
れる。増幅を目的とする特定の抗体サブクラスをコード
するcDNAの選択は、例えば、抗原に対するその動物の血
清抗体の反応などを含む種々の因子によって異なる。好
ましくは、PCR増幅を目的として選択される、抗体サブ
クラスをコードするcDNAは、その動物が最も高い抗体価
を有する抗体を産生する抗体サブクラスのものである。
例えば、血清IgG1の抗体価が、血清抗体反応において検
出される他のどのIgGサブクラスよりも高ければ、IgG1
をコードするcDNAをcDNAプールから増幅する。
好ましくは、重鎖および軽鎖を形質細胞cDNAから増幅
することにより、１）重鎖cDNAの増幅産物を含んでい
て、その重鎖が特定の抗体サブクラスのものであるcDNA
プール、および２）軽鎖cDNAの増幅産物を含んでいて、
その軽鎖が特定の抗体サブクラスのものであるcDNAプー
ル、という２つの別々に増幅されたcDNAプールが作製さ
れる。
トランスジェニック動物からの抗体 ある動物にある抗原を感染させて、その後に抗体産生
に寄与する細胞（およびそのDNA）を取り出すことによ
って抗体をコードする遺伝子材料を得ることに加えて、
キメラ型マウス／ヒトもしくは完全なヒト抗体を作製す
るために、トランスジェニック動物の作出または上記の
技術およびトランスジェニック技術の使用によって遺伝
的材料を得ることも可能である。キメラ型または完全に
外来性の免疫グロブリンを作製するための技術には、所
望の抗原と結合する免疫グロブリンの全体または一部を
コードする遺伝子的材料がその生殖細胞系に挿入された
トランスジェニック動物の細胞からの入手が含まれる。
完全なヒト抗体は、ヒト抗体をコードする遺伝子材料が
そのゲノムに挿入されたトランスジェニック動物に産生
させることができる。トランスジェニック動物にこのよ
うな抗体を産生させるための技術は、1990年４月19日に
刊行された国際公開公報第93/10227号に記載されてい
る。さらに、グッドハード（Goodhartd）ら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A.第84巻4229〜4233ページ、1987年６
月、およびブッチーネ（Bucchine）ら、Nature、第326
巻、409〜411ページ、1987年３月26日も参照され、これ
らはすべて、トランスジェニック動物に抗体を産生させ
る方法の開示および記載のために参照として本明細書に
組み入れられる。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーとともに用いる
ためのベクター 続いて、重鎖をコードするcDNAおよび軽鎖をコードす
るcDNAのそれぞれを、適したベクターの別々の発現カセ
ット中に挿入する。好ましくは、本ベクターは、アミノ
末端からカルボキシ末端の順に、１）原核生物の分泌シ
グナルドメイン、２）異種ポリペプチドをコードするDN
A（例えば、重鎖または軽鎖をコードするcDNAのいずれ
か）のための、重鎖cDNAのための発現カセット中にある
挿入部位、および３）繊維状ファージ膜アンカードメイ
ン、を含む融合ポリペプチドをコードしていて、これを
発現する能力を有するヌクレオチド配列を含む。
本ベクターは、融合ポリペプチドを発現させるために
原核生物または哺乳動物のDNAの発現調節配列、好まし
くは原核生物の調節配列を含む。このDNA発現調節配列
は、構造遺伝子の産物を発現するための任意の発現シグ
ナルを含むことができ、異種ポリペプチドの発現のため
に、発現カセットに機能的に結合した5'および3'要素を
含むことができる。この5'調節配列には、転写を開始す
るための１つのプロモーター、および上流にある翻訳可
能な配列の5'末端で機能的に結合された１つのリボソー
ム結合部位が規定される。このベクターは、原核細胞、
好ましくは大腸菌などのグラム陰性細胞における維持お
よび複製のための複製開始点をさらに含む。また、本ベ
クターは、その発現によって、そのベクターによる形質
転換を受けた原核または真核細胞に薬剤耐性などの選択
的な利点が付与される遺伝子も含むことができる。
繊維状ファージ膜アンカーは、好ましくは、繊維状フ
ァージ粒子の基質と会合し、それによって融合ポリペプ
チドをファージ表面に取り込む能力を持つcp IIIまたは
cp VIIIコート蛋白質の１つのドメインである。分泌シ
グナルは、その蛋白質がグラム陰性菌の周辺質膜（peri
plasmic membrane）を標的とするようにさせる、蛋白質
のリーダーペプチドドメインである。グラム陰性菌（大
腸菌など）に関するこのようなリーダー配列は、当技術
分野では周知である（例えば、Oliverら、Neidhard,F.
C.（編）、大腸菌およびネズミチフス菌（Escherichia
coli and Salmonella typhimurium）、American Societ
y for Microbiology、Washington,D.C.、1:56〜69、198
7）。
ファージディスプレイベクター中で用いるための繊維状
ファージ膜アンカー ベクターのための好ましい膜アンカーは、繊維状ファ
ージM13、f1、fdおよび同等の繊維状ファージから得る
ことができる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子
IIIおよび遺伝子VIIIによってコードされるコート蛋白
質中に認められる。繊維状ファージのコート蛋白質の膜
アンカードメインはコート蛋白質のカルボキシ末端領域
の一部であり、脂質二重膜の両端に架橋するための疎水
性アミノ酸残基の領域、および膜の細胞質面に通常認め
られ、膜から伸長する荷電アミノ酸残基を含む。ファー
ジf1では、遺伝子VIIIコート蛋白質の膜架橋領域は、第
41位から第52位までのカルボキシ末端の11残基を含む
（Ohkawaら、J.Biol.Chem.、256:9951〜9958、1981）。
模範的な膜アンカーは、cp VIIIに対して第25位から40
位までの残基を含むと考えられる。したがって、好まし
い膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、M13繊維
状ファージ遺伝子のVIIIコード蛋白質に由来する（cp V
IIIまたはCP 8とも呼ばれる）。遺伝子VIIIコート蛋白
質は、成熟した繊維状ファージの大半のファージ粒子上
に存在し、典型的にはコート蛋白質が約2500〜3000コピ
ー存在する。
もう１つの好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残
基配列は、M13繊維状ファージ遺伝子IIIのコート蛋白質
に由来する（cp IIIとも呼ばれる）。遺伝子IIIのコー
ト蛋白質は、成熟した繊維状ファージのファージ粒子の
一端に存在し、典型的にはコート蛋白質が約４〜６コピ
ー存在する。繊維状ファージ粒子、それらのコート蛋白
質、および粒子集団の構造に関する詳細な説明は、ラシ
ェッド（Rached）ら（Microbiol.Rev.、50:401〜427、1
986）およびモデル（Model）ら（バクテリオファージ：
第２巻（Bacteriophage:Vol.2）、R.Calender編、Plenu
m Publishing Co.,p375〜456、1988）による総説の中に
見いだされる。
好ましくは、繊維状ファージ膜アンカーをコードする
DNAは、ファージ膜アンカーをコードするDNAを容易に切
除することができ、ベクターの発現カセットの残りの部
分を破壊することなくベクターが取り除かれるように、
ライブラリーベクター中のcDNA挿入物の3'側に挿入され
る。ファージ膜アンカーをコードするDNAのベクターか
らの除去、および適切な宿主細胞における本ベクターの
発現により、可溶性の抗体（Fab）断片の産生がもたら
される。この可溶性Fab断片はファージと結合した状態
のFabの抗原性を保持しており、このため、抗体の全体
（断片化していないもの）が用いられるアッセイおよび
治療法に用いることができる。
本発明とともに用いるためのベクターは、ヘテロ二量
体の受容体（１つの抗体または抗体Fabなどのようなも
の）を発現する能力を有する必要がある。すなわち、本
ベクターは２つの別々のcDNA挿入物（例えば、重鎖cDNA
および軽鎖cDNA）を独立に包含および発現する能力を有
する必要がある。各発現カセットは、その繊維状ファー
ジのアンカー膜をコードするDNAが重鎖cDNAに関する発
現カセット中のみに存在する場合を除いて、上記の諸要
素を含むことができる。したがって、抗体またはFabが
ファージの表面上に発現される場合には、ファージ表面
には重鎖ポリペプチドのみが係留される。軽鎖はファー
ジ表面に直接的には結合しないが、重鎖ポリペプチドの
自由部分（すなわち、ファージ表面と結合していない重
鎖の部分）との会合を介してファージと間接的に結合す
る。
好ましくは、本ベクターは、定方向性連結を可能とす
る１つのヌクレオチド配列、すなわち、ポリリンカーを
含む。ポリリンカーは、上流および下流に位置する複製
および輸送のための翻訳可能なDNA配列と機能的に結合
していて、ベクター中へのDNA配列の定方向性連結のた
めの部位または手段を提供する、発現ベクターの１つの
領域である。典型的には、定方向性ポリリンカーは、２
つまたはそれ以上の制限酵素認識配列すなわち制限部位
が規定されたヌクレオチド配列である。制限酵素による
切断が起こると、この２つの部位から、翻訳可能なDNA
配列をDNA発現ベクターに連結することができる付着末
端が生じる。好ましくは、この２つの付着末端は非相補
的であり、このためにカセット中へのcDNAの定方向性挿
入が可能となる。ポリリンカーは１つまたは複数の定方
向性クローニング部位を提供するものであり、挿入され
たcDNAの発現期間中に翻訳されてもされなくてもよい。
好ましくは、本発現ベクターは、繊維状ファージ粒子
の形態における操作を可能とするものである。このよう
なDNA発現ベクターは、適切な遺伝的相補体が提示され
た場合に、そのベクターが１本鎖複製形態の繊維状ファ
ージとして複製され、繊維状ファージ粒子中にパッケー
ジングされるように、繊維状ファージの複製開始点が規
定された１つのヌクレオチド配列をさらに含む。この特
徴は、本DNA発現ベクターに対して、引き続いて行う個
々のファージ粒子の単離のためにファージ粒子中にパッ
ケージングされる能力を提供する（例えば、単離された
細菌コロニーの感染、およびその中での複製による）。
繊維状ファージの複製開始点は、複製開始、複製終
了、および複製によって生じた複製形態のパッケージン
グのための部位が規定された、ファージのゲノムの１つ
の領域である（例えば、Raschedら、Microbiol.Rev.、5
0:401〜427、1986;Horiuchi、J.Biol.Chem.188:215〜22
3、1986を参照のこと）。本発明における使用のために
好ましい繊維状ファージの複製開始点は、M13、f1また
はfdファージの複製開始点である（Shortら、Nucl.Acid
s Res.、16:7583〜7600、1988）。好ましいDNA発現ベク
ターは、発現ベクターpCOMB8、pCKAB8、pCOMB2−８、pC
OMB3、pCKAB3、pCOMB2−３、pCOMB2−3'およびpCOMB3H
である。
pComb3Hベクターは、（ｉ）重鎖および軽鎖が個々の
プロモーターではなく単一のLacプロモーターによって
発現され、（ii）重鎖および軽鎖が、同一のリーダー配
列（pHB）ではなく２種類の異なるリーダー配列（pg1B
およびompA）を有する、改変型のpComb3である。pComb3
Hに関する参考文献には、ワング（Wang）ら（1995）、
J.Biol.Chem.、印刷中がある。pComb3Hの原理は、基本
的にはpComb3に関するものと同じである。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーの作製 重鎖および軽鎖のcDNAを発現ベクター内にクローニン
グした後、適切な繊維状ファージを用いて全ライブラリ
ーのパッケージングを行う。続いて、このファージを用
いてファージ感受性の細菌培養物（大腸菌の菌株など）
を感染させ、ファージの複製および細胞の溶解を行わせ
てから、破壊された細菌細胞の細片から溶解物を単離す
る。このファージ溶解物には、免疫化された動物から単
離されてクローニングされた重鎖および軽鎖を表面に発
現する繊維状ファージが含まれる。一般に、重鎖および
軽鎖はFab抗体断片としてファージ表面上に存在し、Fab
の重鎖は融合ポリペプチドの繊維状ファージ膜アンカー
部分を介してファージ表面に係留されている。軽鎖は重
鎖と結合して抗原結合部位を形成する。キメラ型抗体を
作製する方法は、1989年３月28日にキャビリー（Cabill
y）らに発行された米国特許第4,816,567号に記載されて
おり、これはこのような手順の開示および記載のために
参考として本明細書に組み入れられる。さらにボブルゼ
ッカ（Bobrzecka）ら、Immunology Letters、２、p.151
〜155（1980）およびコニーツニー（Konieczny）ら、Ha
ematologia 14（１）、p.85〜91（1981）も参照された
く、以上は参照として本明細書に組み入れられる。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーからのプリオン
抗原特異的Fabの選択 １つのプリオン抗原と特異的に結合するFabまたは抗
体を発現するファージは、モノクローナル抗体および／
またはポリクローナル抗体の同定および単離のためのさ
まざまな手順のいずれを用いて単離することもできる。
このような方法には、イムノアフィニティー精製（例え
ば、抗体を結合させたカラムに対するファージの結合）
および抗体パニング法（例えば、抗原に対する高い結合
親和性を持つファージを選択するための、固体支持体に
結合させた抗原に対する反復実施例によるファージの結
合）が含まれる。好ましくは、ファージは、当技術分野
で周知の技法を用いるパニングによって選択される。
抗PrP抗体を発現するファージの同定および単離の後
には、ファージを用いて細菌培養物を感染させることが
でき、そこで単一のファージ単離物が同定される。それ
ぞれの別個のファージ単離物を、上記の１つまたは複数
の方法を用いてさらにスクリーニングすることができ
る。抗原に対するファージの親和性をさらに確実にする
ため、および／または抗原に対するファージの相対的親
和性を決定するために、その抗体またはFabをコードす
るDNAをファージから単離して、ベクター内に含まれる
重鎖および軽鎖のヌクレオチドを、当技術分野で周知の
方法（例えば、Sambrookら、前記を参照）を用いて決定
することができる。
ファージディスプレイ抗体ライブラリーから選択された
ファージからの可溶性Fabの単離 可溶性抗体またはFabは、抗体の重鎖に関する発現カ
セットと関連した繊維状ファージアンカー膜をコードす
るDNAを切除することにより、同じ二シストロン性（dic
istronic）ベクターの改変型ディスプレイから産生させ
ることができる。好ましくは、アンカー膜をコードする
DNAは、重鎖発現カセットの残りの部分の破壊、または
発現ベクターのその他のあらゆる部分の破壊を起こさず
にアンカー膜配列の切除を可能とする、好都合な制限部
位に隣接している。続いて、アンカー膜配列を持たない
改変されたベクターに、その改変ベクターのパッケージ
ングおよび細胞細胞への感染を行った後に、可溶性重鎖
と同時に可溶性軽鎖を産生させる。
または、ベクターが適切な哺乳動物の発現配列を含む
場合には、Fabを産生させるために、改変されたベクタ
ーを用いて真核細胞（例えば、哺乳動物または酵母細
胞、好ましくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハ
ムスター卵巣（CHO）細胞）に形質転換を施すこともで
きる。改変されたベクターが真核細胞での発現を生じな
い場合には、好ましくは本ベクターは、適切なベクター
へのサブクローニングのために、重鎖および軽鎖の両方
の発現カセットを単一のDNA断片として切除されうる。
真核細胞および／または原核細胞における蛋白質の発現
のためには、多数のベクターが、商業的に入手可能およ
び／または当技術分野で周知である（例えば、Sambrook
ら、前記を参照）。
商業的アッセイ 以下の実施例14〜18、特に実施例17は、何ら変性を生
じさせずに、PrPScに対して特異的に結合する抗体の単
離を示している。PrP蛋白質（すなわち、PrPCおよびPrP
Sc）を含む試料は、プロテアーゼＫ（PK）による消化を
用いて変性させることができる。この種のものの使用
は、PrPCは消化するが、PrPScは消化しないと考えられ
る。したがって、消化実施後に、実施例17の通りに、適
切な結合条件下でこの試料を抗体（例えばR2）と接触さ
せる。好ましくは、この抗体はある基質と結合してお
り、試料を抗体が表面に結合された基質材料と容易に接
触させられるように配置することができる。材料が基質
表面に結合した抗体と結合すれば、感染性PrPScの存在
が確認される。
本発明の商業的な態様では、本発明の抗体をサンドイ
ッチ型アッセイにおいて用いることが望ましい。より具
体的には、本発明の抗体を、１つの基質支持体表面に結
合させることができる。試験しようとする試料を、結合
が生じる条件下で支持体表面と接触させる。その後、反
応していない部分をブロックし、その上にあらゆる蛋白
質と結合すると思われる普遍的抗体を表面と接触させ
る。検出可能な標識がなされた普遍的抗体を、支持体表
面上の抗体と結合したあらゆるPrPScと結合させる。結
合が生じると標識が発色などによって検出可能となり、
それによって標識の存在が示され、そのことから試料中
のPrPScの存在が間接的に示される。本アッセイは、100
万分の１またはそれ未満、さらに10億分の１またはそれ
未満の割合の量で存在するプリオン（PrPSc）の検出が
可能である。PrPScは、（ａ）動物供給源から抽出され
た治療的に活性な成分を含む薬学的製剤、（ｂ）ヒト供
給源から抽出された成分、（ｃ）ヒト供給源から抽出さ
れた器官、組織、体液または細胞、（ｄ）注射剤、経口
剤、クリーム剤、坐剤および肺内投与製剤からなる群よ
り選択される製剤、（ｅ）化粧品、および（ｆ）哺乳動
物の細胞培養物から抽出された薬学的に活性な化合物、
からなる群より選択される１つの供給源の中に存在する
可能性がある。また、このような供給源の材料は、本発
明の抗体を添加することにより、PrPSc蛋白質が除去ま
たは中和されるよう処理することが可能である。また、
本発明には、それを必要とするある哺乳動物に対する、
PrPSc蛋白質の感染性を中和する能力を特徴とする抗体
であって、PrPSc蛋白質と選択的に結合する抗体の治療
的有効量の投与を含む、処理の方法も含まれる。
一般化された手順 本発明の抗体は、さまざまな技法によって得ることが
できると思われる。しかし、一般的な手順には、ファー
ジ表面上における蛋白質（すなわち、抗体またはその一
部）のライブラリーの合成が含まれる。続いて、このラ
イブラリーを、PrP蛋白質を含む組成物、特にPrPScを含
む天然に生じる組成物と接触させる。PrP蛋白質と結合
するファージを、続いて単離し、PrP蛋白質と結合する
抗体またはその一部を単離する。その抗体またはその一
部をコードする遺伝子材料の配列を決定することが望ま
しい。さらに、その他の抗体の産生のために、この配列
を増幅して、それ単独またま他の遺伝的材料とともに適
切なベクターおよび細胞系列に挿入することができる。
例えば、PrPScと結合する可変領域をコードする配列
を、定常／可変構築物を産生する１つの抗体のヒト定常
領域をコードする１つの配列と融合させることができ
る。この構築物を増幅して、ヒト化抗体の産生のために
適した細胞系列への挿入が可能なベクターに挿入するこ
ともできる。このような手順は、1989年３月28日にキャ
ビリー（Cabilly）らに発行された米国特許第4,816,567
号に記載されており、これはこのような手順の開示およ
び記載のために参照として本明細書に組み入れられる。
さらにボブルゼッカ（Bobrzecka）ら、Immunology Lett
ers、２、p.151〜155（1980）およびコニーツニー（Kon
ieczny）ら、Haematologia 14（１）、p.85〜91（198
1）も参照され、以上も参照として本明細書に組み入れ
られる。
PrP蛋白質と結合する抗体またはその部分をコードす
る遺伝的材料が単離された場合には、その遺伝的材料を
用いて、PrPに対するより高い親和性を有する他の抗体
またはその一部を産生させることが可能である。これ
は、位置指定突然変異誘発の技術、またはランダム突然
変異誘発および選択によって実施される。具体的には、
配列内部にある個々のコドンまたはコドンの群を除去す
るか、異なるアミノ酸をコードするコドンによって置換
する。この結果、多数の異なる配列の形成、増幅、およ
び付加的なファージの表面上における抗体またはその一
部の変異体の発現のための使用が可能となる。これらの
ファージは、続いて、PrP蛋白質に対する抗体の結合親
和性の試験のために用いることができる。
ファージライブラリーは、各種の異なる方法で作製す
ることができる。１つの手順によれば、マウスまたはラ
ットなどの１つの宿主細胞にPrP蛋白質による免疫化、
好ましくはPrPScによる免疫化を施す。免疫化は、より
多量および多種の抗体を形成させるためにアジュバント
を併用して実施してもよい。抗体が産生されるための十
分な時間をおいた後に、接種された宿主哺乳動物から抗
体産生をもたらす細胞を採取する。採取した細胞からRN
Aを単離し、cDNAライブラリーを作製するために逆転写
にかける。抽出したcDNAをプライマーを用いて増幅し、
適切なファージディスプレイベクターに挿入する。この
ベクターにより、ファージ表面上に抗原またはその一部
を発現させる。ディスプレイベクターへの挿入の前に、
cDNAに位置指定突然変異を施すことも可能である。具体
的には、より規模の大きいライブラリー（すなわち、多
数の変異体を有するライブラリー）を作製するために、
コドンを除去するか、または異なるアミノ酸を発現する
コドンによって置換し、続いてそれをファージの表面上
に発現させる。その後、上記の通りに、ファージを試料
と接触させ、PrP蛋白質と結合したファージを単離す
る。
実施例 以下の実施例は、本発明のアッセイおよび組換え抗Pr
P抗体の作成および使用の仕方に関する完全な開示およ
び説明を当業者に提供するために記載されており、本発
明らが発明とみなしている内容の範囲を制限するもので
はない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関し
て正確であるように努力は払っているが、実験的誤差お
よび偏差が含まれていると考慮されるべきである。別に
特記しない限り各部分は総重量にしめる部分重量であ
り、分子量は加重平均された分子量であり、温度は℃で
示し、圧力は大気圧またはその近傍圧である。
実施例１ MoPrP 27〜30の精製 MoPrP 27〜30の精製ロッドは、RMLプリオン（チャン
ドラースクレイピー単離物（Chandler R.L.、1961、Lan
cet、1378〜1379））を接種され、臨床的に罹患したCD
−１マウスの脳から調製した。プリオンのロッドは、以
前に記載されている通りに（Prusiner,McKinley 1983 C
ell）、ショ糖密度勾配分画によって回収した。簡潔に
示すと、48〜60％（重量／容積比）ショ糖中に沈殿する
プリオンのロッドを含む分画を、蒸留水にて2:1に希釈
し、100,000×ｇの遠心処理を４℃で６時間行った。ペ
レットを水中に再懸濁し、再度遠心処理にかけた後に、
0.2％サルコシルを含む、Ca/Mg非含有リン酸緩衝生理食
塩水（PBS）中にロッドを再懸濁した。PrP 27〜30は、S
DS−PAGEおよび銀染色分析によって決定された主要な蛋
白質であった。蛋白質の定量化は、既知の量のウシ血清
アルブミンを蛋白質濃度の標準として用いるビシンコニ
ン酸色素結合法によって実施した。
実施例２ Prnp0/0マウスの免疫化 PrP遺伝子の両方の対立遺伝子（Prnp）が除去されたP
rnp0/0マウスに対して、実施例１に記載した通りに単離
した、精製されたMoPrP 27〜30のロッドによる免疫化を
施した。Prnp0/0マウスおよび本系統を作出するための
方法は、当技術分野では周知である（Ｂelerら、199
2）。Prnp0/0マウスは、発達および行動の点では正常マ
ウスと区別不能であり、感染症MoPrPScの大脳内接接種
後にもスクレイピーに対する抵抗性を示し（Ｂeler
ら、1993 Cell;Prusinerら、PNAS 1993）、アジュバン
トとして比較的少量の精製されたSHaPrP 27〜30を用い
て免疫化を行った後にMo−、SHaおよびヒトPrPに対する
IgG血清抗体価を生じると考えられる（Prusinerら、PNA
S 1993）。
６週齢のPrnp0/0マウス３匹（３）に対して、完全フ
ロインドアジュバント中に十分に乳化させたMoPrP 27〜
30ロッド100μｇの腹腔内注射による免疫化を施した。
引き続いてマウスに対して、１回目はロッド100μｇを
含み、２回目はロッド50μｇを含む不完全フロインドア
ジュバントにより、２週間間隔で２回の追加抗原刺激を
行った。２回目の追加抗原刺激から４日後に、以下の実
施例３に記載した通りに、各マウス血清のプリオン蛋白
質に対する反応性を分析した。抗PrP反応性の抗血清を
有していたマウスに対して、２回目の追加抗原刺激から
14日後に、50μｇのプリオンロッドを含む不完全フロイ
ンドアジュバントによる３回目の注射による追加抗原刺
激を行った。
実施例３ MoPrP 27〜30による免疫化を受けたPrnp0/0マウスの血
清反応性 コンビナトリアルライブラリーからの特異的な抗体の
単離が成功したことを示す主要な予測指標は、検討しよ
うとする抗原に対する血清抗体の反応性である（Burton
およびBarbas、Adv.Immunol.1994）。血清の抗体レベル
は、抗体分泌の予測因子であり、このため形質細胞中の
特定のmRNAのレベルの予測因子でもある。抗体をコード
するcDNAライブラリーの組成物を最終的に指示するの
は、この後者の因子である。
２回目の追加抗原刺激から４日後に、実施例２で説明
した通りにMoPrP 27〜30による免疫化を受けたPrnp0/0
マウスの尾部から採血し、続いて実施する免疫学的分析
のために、抗血清を−20℃で保存した。免疫化を受けた
マウス血清（IgG1、IgG2a、IgG2bおよびIgG3の各抗体サ
ブクラス）の、変性および非変性のMo−およびShaPrP 2
7〜30に対する反応性をELISAで測定した。ELISAのウェ
ルには、40μg/mlのPrPロッドを含むpH8.6の100mM重炭
酸ナトリウム50μｌを用いて４℃で一晩コーティングを
施した。ELISAにおける抗原としては変性PrPロッドを用
い、6Mイソチオシアン酸グアニジウム50μｌ添加して室
温で15分放置した後に、ウェルをCa/Mg非含有PBSで６回
洗った。続いて、３％BSAを含むCa/Mg非含有PBSによっ
てすべてのウェルをブロックした。抗血清はPBSによっ
て連続希釈し、ウェルとともに37℃で１時間インキュベ
ートした。余剰の抗血清を10.05％Tween 20を含むPBSで
10回洗うことによって除去し、IgG1、IgG2a、IgG2bおよ
びIgG3マウス抗体のいずれかと特異的に結合する標識化
ヤギ抗マウス抗体を用いて結合状態の抗血清を検出し
た。
３匹のマウスはすべて抗PrP IgG抗体を産生した。こ
れらのマウスのうちD7282と命名した１匹の血清反応性
を、免疫化されたマウスの抗体反応の模範例として図５
に示した。Mo−およびSHaのPrP抗原に対する血清抗体価
が最も高かったのは、IgG1およびIgG2サブクラスであっ
た。これに対して、IgG2aおよびIgG3の抗PrP抗体価は、
免疫化を受けていないPrnp0/0マウスの血清におけるす
べてのIgGサブクラスで認められたバックグラウンドレ
ベルの反応性と近似していた。抗体価は、変性ロッドに
対する値の方が非変性ロッドに対するものよりも高かっ
た。Mo−およびSHaの変性ロッドに対する血清反応性の
類似は、この２つの蛋白質の間にアミノ酸配列の高度の
相同性があることを反映する可能性が高いと考えられ
る。しかし、非変性Mo−ロッドに対してかなり高い血清
反応性（変性MoPrP 27〜30に関するレベルの約40〜50％
の値）がみられたものの、非変性SHaロッドに関する反
応性はバックグラウンドレベルにあった。
実施例４ 抗PrP抗体をコードするmRNAの単離、およびファージデ
ィスプレイ抗体ライブラリーの構築 注射による最後の追加抗原刺激から３日後に、D7282
マウスを屠殺し、骨髄および脾臓組織からRNAを調製し
た。マウス脾臓からの全RNAの調製は、当技術分野で周
知の方法（Huseら、Science 1989）に従って実施した。
骨髄組織からのRNAの調製は、まずマウスの両側後肢か
ら脛骨および腓骨を摘出することによって行った。続い
て骨を各端部の近傍で切断し、27ゲージ針を用いて骨小
腔にイソチオシアン酸グアニジウムを注入することによ
り、それらの内容物を流し出した。続いて、マウス脾臓
に関して説明するものと同じようにしてRNAの調製を続
けた。
続いてこのRNA調製物をプールし、当技術分野で周知
の方法に従って、逆転写酵素を用いてmRNAからcDNAを作
製した。D7282マウスのmRNAから、１）IgG1ライブラリ
ー、および２）IgG2bライブラリーの２つのcDNAライブ
ラリーを独立に構築した。これらのライブラリーの各々
について、重鎖をコードするcDNAおよび軽鎖のcDNAを、
プールしたcDNAの別々の分画からPCRによって別々に増
幅した。IgG1サブクラスのマウス軽（κ）鎖および重
（α１またはα2b）鎖をコードするDNA断片のPCR増幅に
用いたオリゴヌクレオチド5'および3'プライマーは、ヒ
ューズ（Huse）ら（Science 1989）が用いたものと同じ
であり、表１に提示しているその他の重鎖プライマーお
よび表１に提示している重鎖ポリマーと同じであった。
プライマーは、重鎖断片をコードするcDNAの増幅に用い
た。
PCRはパーキンエルマー（Perkin Elmer）9600を用い
て実施し、94℃での変性を30秒間、52℃でのハイブリダ
イゼーションを60秒間、および72℃での伸長を60秒間行
う増幅処理を35周期にわたって行った。
この結果得られた、IgG1ならびにIgG2bサブクラスの
重鎖および軽鎖をコードする増幅されたcDNAを、ベクタ
ーpComb3にクローニングした。pComb3ベクターを用い
て、繊維状ファージの表面上に表示されたFab抗体ライ
ブラリーを調製する方法はすでに記載されている（Will
iamsonら、PNAS、1993;Barbasら、PNAS 1991）。簡潔に
示すと、各ベクターがベクターの１つの発現カセット中
に重鎖断片をコードする１つのcDNA挿入物を含んで、ベ
クターの別の発現カセット中に軽鎖断片をコードするcD
NA挿入物が挿入されるように、IgG1またはIgG2bの重鎖
をコードする増幅されたcDNAおよび軽鎖をコードする増
幅されたcDNAをpComb3ベクター内に挿入することによっ
て、IgG1またはIgG2bのファージディスプレイライブラ
リーを構築する。その結果得られるIgG1ライブラリーは
約９×106個の独立したクローンを含んでおり、得られ
たIgG2bライブラリーは約７×105個の独立したクローン
を含んでいた。
続いて、この連結されたベクターに、当技術分野で周
知の方法（例えば、Sambrookら、前記を参照）を用い
て、繊維状ファージM13によるパッケージングを施し
た。続いて、ファージ粒子の数を増幅するために、パッ
ケージングがなされたライブラリーを用いて大腸菌の培
養物を感染させる。細菌細胞の溶解が生じた後に、ファ
ージ粒子を単離し、次に行うパニング手順に用いた。後
の増幅および使用のために、ファージライブラリーはい
くつかに均等に分割して保存する。ファージライブラリ
ーの別々の分割物は、後の増幅および使用のため分けて
保存する。
実施例５ PrPとの結合に関するファージディスプレイ抗体ライブ
ラリーのスクリーニング 抗原結合性ファージを、（Burtonら、PNAS 1991、Bar
bas Lerner Methods in Enzymol 1991）に記載されたパ
ニング手順によってELISAウェルに結合させたPrP抗原に
対する変性MoPrP 27〜30ロッドの結合性に関して選択し
た。簡潔に示すと、40μg/mlのMoPrPロッドを含むpH8.6
の100mM重炭酸ナトリウム50μｌによって、ELISAウェル
に４℃で一晩コーティングを施した。続いて、6Mイソチ
アン酸グアニジウム50μｌとともに室温で15分インキュ
ベートすることによってPrPロッドを変性させ、その後
にウェルをCa/Mg非含有PBSで６回洗った。続いて３％BS
Aを含むCa/Mg非含有PBSによってすべてのウェルをブロ
ックした。
抗体ファージの均等分割物を、PrPコートした別々のE
LISAウェルに対して適用した。パニング実験では、１ウ
ェル当たり合計約１×1010個の抗体ファージを添加し
た。
このファージを、強く結合したMoPrP抗原とともに37
℃で２時間インキュベートした。結合しなかったファー
ジを0.05％Tween 20を含むPBSで10回洗うことによって
除去した。続いて、結合したファージを酸溶出によって
ウェルから取り外してプールし、再増幅の後に２回目の
パニングの対象とした。
パニングを５回実施することによってIgG1ライブラリ
ーを選択した。１回目のパニングから５回目までの測定
の間に、PrPコードを施したELISAウェルから溶出したフ
ァージの数によって決定されるPrP特異的抗体ファージ
は40倍に増幅された。
実施例６ 選択された抗体産生ファージによる可溶性Fabの産生 ４回目および５回目のパニング時に溶出されたファー
ジクローンから可溶性Fabが産生された。選択されたフ
ァージクローンから得たDNAを単離し、適切な制限酵素
を用いて、pComb3Hベクターからファージコート蛋白質I
II（繊維状ファージ膜アンカー）を取り除いた。このDN
Aは自己連結を起こし、それによって可溶性Fabを発現す
る能力を持つベクターが生じる（可溶性Fabを産生させ
る手順は（Barbasら、PNAS 1991）に詳細な記載があ
る）。続いて、以上のベクターを別々に用いてFabを発
現するように細菌に形質転換を施し、単離された形質転
換体を選択する。
Fabの発現は、細菌培養物にイソプロピルβ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドを加えて一晩放置することで誘導
させた。この細菌に遠心処理を施し、この結果得られた
細菌ペレットに超音波処理または３回の凍結解凍処理を
行い、細菌の脂肪膜周辺腔からFabを放出させた。続い
て、ELISAでPrPに対する細菌Fab上清の反応性を検討し
た。
実施例７ 抗PrP FabのPrP抗原との結合に関するELISA分析 実施例６で産生された可溶性Fabの、変性および非変
性PrP抗原ならびに合計PrPペプチドとの結合を、実施例
３で説明したELISAアッセイを用いて評価した。合成PrP
ペプチドは、当技術分野で周知である従来のペプチド合
成手順を用いて作製した。
変性MoPrPロッドに対する４回目のパニング時に採取
したFabクローンのうち、変性PrPに対する反応性を有し
ていたのは５％未満であったが、５回目の同じパニング
の際に採取したクローンの約50％はPrP抗原を認識し
た。ELISAでは、このパニングで得たすべての反応性ク
ローンは、変性MoおよびSHaロッドと特異的に結合する
能力を持っていたが、どちらの種の非変性ロッドとも結
合しなかった。さらに、すべての抗PrP Fabが、Moおよ
びSHaのPrPの残基90〜145にわたる範囲の合成ペプチド
を認識せず、このことから以上の抗体はプリオン蛋白質
の残基146から231までの間に結合することが示唆され
た。
実施例８ プリオンに感染した、および感染していない齧歯類の脳
組織に対する、選択された抗PrP抗体（Fab）の結合に関
する分析 ファージディスプレイ抗体ライブラリーのパニングに
よって同定された抗体の反応性を、プリオンに感染した
齧歯類の脳組織のSDS/PAGE、および選択されたFabを用
いるウエスタンブロット分析によって検討した。プリオ
ンに感染した、および感染していないマウスの脳組織か
ら得た蛋白質を、免疫反応性を検討する抗原として用い
た。抗原は、Ca/Mg非含有PBS中に浸したマウス脳組織を
20ゲージ針に５回通過させ、続いて22ゲージ針に10回通
過させて破砕することによって調製した。続いて、10％
（重量／容積比）ホモジェネートに1600×ｇ、４℃の遠
心処理を５分間行った。上清蛋白質の均等分割物を0.2
サルコシルを含むCa/Mg非含有PBSによって希釈し、最終
濃度を1mg/mlとした。この希釈物を等容積の非還元性２
倍SDS/PAGE試料緩衝液と混合し、５分間煮沸した後にSD
S/PAGE（Laemmli,U.K.（1970）Nature（London）227、6
80〜685）にかけた。免疫ブロット法は、1:1000に希釈
したマウスIgG一次抗血清を用いて、以前に記載されて
いる通りに実施した（Panら、PNAS 1993）。
実施例９ 核酸の塩基配列決定 いくつかのPrP特異的クローンに関して、抗体の軽鎖
および重鎖の可変領域のヌクレオチドならびにアミノ酸
配列を決定した。核酸の塩基配列決定は、Taq蛍光ジデ
オキシヌクレオシド終結サイクルシークエンシングキッ
ト（Applied Biosystems）を用いて、モデル373A自動DN
Aシークエンサー（Applied Biosystems）によって行っ
た。抗体の軽鎖配列を解明するためのプライマーは、
（−）鎖とハイブリダイズするプライマーMoSeqKb［5'
−CAC GAC TGA GGC ACC TCC−3'］およびOmpSeq［5'−A
AG ACA GCT ATC GCG ATT GCA G−3'］であり、重鎖につ
いては（＋）鎖と結合するMOIgGGzSeq［5'−ATA GCC CT
T GAC CAG GCA TCC CAG GGT CAC−3'］および（−）鎖
と結合するPelSeq［5'−ACC TAT TGC CTA CGG CAG CCG
−3'］である。
変性PrPに対する１回のパニングで得たいくつかのフ
ァージクローンに関して導出されたアミノ酸配列を図６
および７に提示した。図６は、マウスD7282から得たIgG
1ライブラリーの変性MoPrP 27〜30ロッドに対するパニ
ングによって作製され、選択された重鎖（Ａ）および軽
鎖（Ｂ）の可変領域のアミノ酸配列を示している。以上
の配列は極めて類似しているが、不均一な部分も多数含
んでおり、これはマウスをPrP抗原に反復曝露した後の
体細胞変異の結果である可能性が高い。これらのクロー
ンで検討した重鎖配列はすべて、極めて類似した配列を
含んでいた。特に重鎖相補性決定領域３（HCDR3）は、
検討したすべてのFabクローンにおいてヌクレオチドレ
ベルで一致していた。重鎖のCDR1、CDR2、フレームワー
ク（FR）３およびFR4にはわずかな差異が認められた。
これらの差異は多数であったため、PCRまたは塩基配列
決定時の誤差のためとは考えにくく、おそらくはマウス
が抗原による反復刺激を受けたことによる体細胞変異の
間に生じたものと考えられる。軽鎖の配列も極めて類似
していたが、可変領域の全体にわたって局所的な不均一
性が認められ、これもおそらく体細胞変異に起因すると
考えられた。
実施例10 存在する抗体によるエピトープのマスキング後の抗プリ
オン抗体の選択 変性PrPに対するIgG1ライブラリーのパニングによっ
て、おそらく単一のエピトープを指向する１つのクロー
ンの体細胞変異体と考えられる、一連の関連した抗体が
作製された（実施例９）。他のエピトープに対する抗体
を得るため、通常のやり方のパニングを行う前に、上記
の一連のものに由来するプロトタイプ抗体をELISAウェ
ル中にある変性PrPに添加した。以降のすべてのパニン
グ段階でこのマスキング抗体を用いた。この手順を用い
た場合、抗体は、ELISAにおいて変性PrPと反応する異な
る配列に由来していた。これらの抗体は、PrP上の異な
るエピトープを指向する可能性が高いと考えられる。マ
スキングの手順は、ディツェル（Ditzel）ら（1985）J.
Immunol.に記載されている通りに実施した。PrPと相互
作用する抗体以外の分子を用いてマスキングを実施する
ことも可能と思われる。
実施例11 PrPScに対して特異的な抗PrP抗体を発現するファージ粒
子の選択 PrPScと結合するがPrPCとは結合しないファージクロ
ーンを同定するために、各実施例で説明したものと同様
のファージディスプレイ抗体ライブラリーに対してパニ
ングを行う。PrPSc抗原およびPrPC抗原は、ELISAアッセ
イに関して記載した通りに、マイクロタイター用ディッ
シュの別々のウェルに結合させる。ファージディスプレ
イ抗体ライブラリーをまずPrPCの入ったELISAウェルに
対してパニングする。結合しなかったファージはウェル
から取り除いてプールする。PrPC抗原と結合したファー
ジはウェルから採取し、廃棄するか、または後の分析の
ためにプールする。続いて、プールした非結合性のファ
ージをPrPCが入ったELISAウェルに再び添加して、PrPC
に対して結合しない点に基づいて再度選択する。PrPC抗
原上で何度か繰り返して選択した後に、ファージをプー
ルし、PrPSc抗原を含むELISAウェルに対するパニングを
行った。このパニングを数回繰り返し、それによってPr
PSc抗原と結合するファージがさらに複数回のパニング
によって選択されるようにした。PrPSc抗原に対するパ
ニングを５〜10回行った後に、ファージをそれぞれ単離
した。PrPSc特異的ファージまたは単離されたFabのPrPC
抗原に対する結合能は、PrPC抗原を用いるELISAによっ
て再確認が可能である。この結果選択されるファージ
は、PrPScと結合するが、PrPCとは結合しない。
実施例12 アイソフォームとは無関係にPrPScを同定する抗PrP抗体
を発現するファージ粒子の選択 PrPScアイソフォームによる複数回の免疫化を受けた
マウスから得たリンパ球RNAから、またはさまざまな種
類のPrPScアイソフォームによる免疫化を受けた数匹の
マウスから得たリンパ球RNAのプールから、上記の通り
に、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを調製す
る。続いて、このファージをPrPScの異なるアイソフォ
ームに由来する抗原を含む複数の異なるウェルを用いて
パニングする。ファージのパニングは、各段階でそのア
イソフォームと結合するファージを選択しながら、PrP
Scの各アイソフォームに対して行う。ファージのパニン
グは、PrPScの各アイソフォームについて合計約５〜10
回実施する。検討したすべてのアイソフォームに対する
パニングの全段階の後に残ったファージを続いて単離す
る。選択された各ファージまたは単離されたFabの免疫
反応性を、種々のPrPScアイソフォームのそれぞれに対
するELISA、ウエスタンブロット法または組織化学的分
析によって検討し、同じくPrPCとの交差反応性も検討し
た。
実施例13 PrPScのアイソフォームに特異的な抗PrP抗体を発現する
ファージ粒子の選択 特定のPrPScアイソフォームによる免疫化を受けたマ
ウスのリンパ球mRNAから調製されるファージディスプレ
イ抗体ライブラリーを、上記の実施例に従って調製す
る。続いて、結果として得られたファージを、１つの特
定のPrPScアイソフォームのみと結合する能力に関して
パニングによって選択する。このパニングには、それに
対する特異的抗体が望まれる特定のPrPScアイソフォー
ムに由来する抗原を含む一式のウェルを含む、PrPScの
さまざまなアイソフォームに由来する抗原を含む複数の
異なるウェルを用いる。まずファージを、望ましくない
PrPScアイソフォームに対してパニングし、その抗原と
結合しないファージを選択する。パニングは、PrPScア
イソフォームのそれぞれに関して合計約５〜10回連続し
て行う。続いて、望ましくないPrPScアイソフォームと
結合しないファージを、望ましいPrPScアイソフォーム
に対して約５〜10回パニングして、抗原と結合するもの
を選択する。すべてのパニングを実施した後に残ったフ
ァージを単離する。選択されたこれらのファージは、望
ましい特定のPrPScアイソフォームのみに対する結合特
異性を有する抗体を発現するものである。選択された各
ファージまたは単離されたEabの免疫反応性を、種々のP
rPScアイソフォームのそれぞれに対するELISAまたはウ
エスタンブロットによって検討し、同じくPrPCとの交差
反応性も検討する。
実施例14 Prnp0/0マウスにおけるPrPScに対する血清反応性の生成
および特徴分析 上記の実施例に示した実験法により、107pfu/ml前後
のサイズを有するコンビナトリアルライブラリーからの
特異的な抗体の単離が成功したことを示す主要な予測指
標が、検討しようとする抗原に対する血清抗体の反応性
であり、ライブラリーの組成物を最終的に指示するの
は、この因子であることが確立された。Prnp0/0マウス
は、PrP 27〜30蛋白質を有するマウス（Mo）またはシリ
アンハムスター（SHa）のプリオンロッドのいずれかに
よる免疫化により、直ちに強い免疫応答を明らかに示し
たが、最も高い血清抗体価が認められたのは、IgG1およ
びIgG2サブクラスであった。IgG2aおよびIgG3の抗PrP抗
体価は、免疫化を受けていないPrnp0/0マウスの血清で
すべてのIgGサブクラスに関して認められたバックグラ
ウンドレベルの反応性と近似していた。PrPScに対する
免疫応答を高め、免疫レパートリー（immune repertoir
e）を増大させる試みにおいて、Prnp0/0（94％FVB）雌
マウスにSHaPrP 27〜30を含むリポソームによる免疫化
を行った。免疫応答の多様性をさらに高めるために、短
期的および長期的手順の両方を用いてマウスに免疫化を
施した。SHaプリオンロッドによる免疫化の場合とは対
照的に、SHaPrP 27〜30を含むリポソームによる免疫化
では、４種のIgGサブクラスのすべてを含む抗血清抗体
価が得られた。
実施例15 ヒストブロットに対する、PrPによる免疫化で得られた
血清の反応性 SHaPrP 27〜30を含むリポソームによる免疫化を受け
たマウスから得た血清中に認められたIgG抗SHaPrP 27〜
30の性質をさらに調べるために、本発明者らは、正常お
よびスクレイピーに感染したSHaの脳のクリオスタット
切片をニトロセルロース膜上に移行させるヒストブロッ
ト法により、血清をインサイチューで検討した。プロテ
イナーゼＫ（PK）で処理した正常SHaの脳切片には両方
の血清とも若干の非特異的反応性を示したが、PKで処理
したSHaスクレイピー感染脳切片に対する反応性の増加
が示されたのは長期的な免疫化を受けたマウスからの血
清のみであった。この反応性は、血清を1/1000に希釈し
た場合にも明らかであった（結果は提示せず）。いずれ
の血清とも、まずPKで処理して、続いて3M GdnSCNに10
分間曝露させたPK処理SHaスクレイピー感染脳切片に対
しては典型的な反応性を示した。免疫化を受けていない
Prnp0/0（94％FVB）雌マウスからの血清は、正常なSHa
脳切片、スクレイピー感染SHa脳切片に対して全く免疫
反応性を示さなかった。
スクレイピーに感染したSHa脳のヒストブロットにおけ
るSHaPrP 27〜30および変性SHaPrPの染色 正常な、接種を受けていない対照SHa、およびSc237プ
リオンの接種後にスクレイピーの臨床徴候を呈したSHa
からPrPCを除去するために、ヒストブロットをプロテイ
ナーゼＫによって処理した。SHaPrPを変性させるため
に、ヒストブロットを3M GdnSCNで10分間処理した。短
期的および長期的な免疫化を受けたマウスから得た血清
の1/200希釈物とともに、ブロットを４℃で一晩インキ
ュベートした。本明細書に記載した結果では、抗血清
が、変性していない感染性プリオン、すなわち天然のPr
PScと明らかな陽性の反応を生じることが示された。
図８は、スクレイピーに感染したSHa脳に関する、染
色された８種の異なるヒストブロットを示している。正
常な、接種を受けていない対照SHa（Ａ、Ｃ、Ｅおよび
Ｇ）、およびSc237プリオンの接種後にスクレイピーの
臨床徴候を呈したSHa（Ｂ、Ｄ、ＦおよびＨ）からPrPC
を除去するために、以上のヒストブロットをプロテイナ
ーゼＫによって処理した。SHaPrPを変性させるために、
ヒストブロットを3M GdnSCNで10分間処理した（Ｃ、
Ｄ、ＧおよびＨ）。短期的（Ａ〜Ｄ）および長期的（Ｅ
〜Ｈ）な免疫化を受けたマウスから得た血清の1/200希
釈物とともに、ブロットを４℃で一晩インキュベートし
た。以上の結果から、本発明の抗体が天然の変性してい
ない感染性プリオンに対する結合能を有する、すなわち
天然のPrPScに対する結合能を有することが明らかに示
された。
実施例16 実施例14の免疫化マウスからのモノクローナル抗体の作
製 合計８種のファージFabディスプレイライブラリーを
構築した：短期的および長期的な免疫化を受けたマウス
から採取したmRNAからのIgG1κ、IgG2aκ、IgG2κおよ
びIgG3κである。PrP 27〜30を含むプリオンロッドに対
するパニングによって抗PrP Fabを発現するファージを
単離する際の困難さを克服するために、ライブラリーを
ビオチン化SHa 27〜30に対してパニングし、リポソーム
中に分散化させて、ストレプトアビジンでコートしたマ
イクロタイター用プレートと結合させる１つのパニング
系を用いた。５回のパニングの後に、50種を超えるクロ
ーンからの大腸菌抽出物を、ELISAにてビオチン化SHa 2
7〜30、SHa 27〜30ロッドおよび90〜231組換えSHaと反
応させた。これらのクローンは、SHaPrPの残基90〜231
に対応する組換えrPrPとも反応するため（メルホーン
（Melhorn,I）ら、プリオン蛋白質の精製された142残基
ポリペプチドの高レベルの発現および特徴分析（High−
level Expression and Characterization of a Purifie
d 142−residue Polypeptide of the Prion Protei
n）、Biochemistry 35、5528〜2237（1996））、事実上
すべてのライブラリーからより異質なクローンを首尾よ
く単離するために、８種のライブラリーのすべてをこの
抗原に対してパニングした。IgGの重鎖をコードするプ
ラスミドの領域のDNAシークエンシングにより、別個の
クローンとして30種のFabが同定された。
実施例17 モノクローナル抗体の特徴分析 陽性クローンからの大腸菌抽出物による最初のELISA
により、3F4モノクローナル抗体とは異なり（カスザッ
ク（Kascsak,R.J.）ら、「スクレイピーに関連した繊維
性蛋白質に対するマウスのポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体（Mouse polyclonal and monoclonal anti
body to scrapie−assocoated fibril proteins）」、
J.Virol.61:3688〜3693（1987））、以上のFabは、天然
の状態の、すなわち変性段階を経ずともPrP 27〜30と結
合することが示唆された。これらのFabの新規性を定量
的な特徴として示すために、本発明者らはそれらを精製
し、酵素的切断によってモノクローナル抗体3F4から3F4
Fabを作製した。さまざまな濃度の精製Fabを用いて、S
HaPrPの検出のための標準的なELISAを実施した。特徴的
なSHa PrPの結合特性（プリオンロッドに対する基礎的
結合、および3M非変性GdnSCNで処理されたSHaPrP27〜30
に対する強い反応性）を示した3F4とは対照的に、新た
に単離されたFabは何ら変性段階を経ずともプリオンロ
ッドと反応した。非変性プリオンロッドとの最大半減結
合（half−maximal binding）が得られたのはFabの濃度
が約0.5pg/mlの場合であり、このことから、本抗体の見
かけの結合親和性は約108l/molであることが示された。
図９は、プリオン蛋白質SHa 27〜30に対する精製Fab
のELISA反応性を示したグラフである。さまざまな濃度
の抗体3F4および組換え抗体の、ショ糖精製を行った0.2
μｇの感染性SHaプリオンロッドでコートしたELISAウェ
ルに対する結合性を評価した。この結果から、本発明の
すべての組換え抗体は、抗体3F4と比べて、プリオンに
対して実質的により高い結合性を有することが明らかに
示された。
変性プリオン蛋白質SHa 27〜30に対する精製FabのELISA
反応性に関する手順 さまざまな濃度の精製3F4 Fabおよび組換えFabを、シ
ョ糖精製を行った天然型またはELISAウェル中にて3M非
変性GdnSCNで10分間処理した変性型のSHaプリオンロッ
ド0.2μｇによってコートしたELISAウェルに対する結合
性について評価した。
図10は、変性プリオン蛋白質SHa 27〜30に対する精製
FabのELISA反応性を示したグラフである。図９と比較し
て図10は、図９の通りの本発明の組換え抗体は3F4と比
べてプリオンロッドに対するより高い親和性を示した
が、R1を除くすべての組換え抗体は変性抗原に対してよ
り低い親和性を示した点で興味深い。
実施例18 免疫沈降法によるモノクローナル抗体の特徴分析 SHaPrP 27〜30の免疫沈降 Fabの抗PrP 27〜30活性の確認と同時に、3F4が非変性
SHaPrP 27〜30と結合する能力を持たないことの確認の
ために、SHa 27〜30を含むリポソームを用いる免疫沈降
法を開発した。Fab産生クローンからの大腸菌抽出物よ
り、溶液中に存在するSHaPrP 27〜30の40〜50％が免疫
沈降を生じたが、1/500に希釈した3F4によって免疫沈降
を生じたのは痕跡量のSHaPrPのみであった。細菌上清に
おけるFabの濃度は典型的には１〜10pg/mlのオーダーで
あった。このことは、抗原に対する親和性が高いことを
意味する（107〜108l/molまたはそれ以上）。抗体3F4は
腹水として得られ、免疫沈降実験では約１μg/mlの濃度
に希釈して使用されたものと考えられる。新たなFabがS
HaPrP 27〜30の免疫沈降をもたらす能力を、3F4との比
較により、精製したFab mAb D4およびR2を用いて評価し
た。Fab 2Rは、0.1pg/ml（500pl中に50ng）という低濃
度でもSHaPrP 27〜30を強力に免疫沈降させ、このこと
から、親和性が108M-2（すなわち108l/mol）よりも高い
オーダーであることが示された。Fab 2Rの能力はそれよ
りも低かったが、3F4よりは効率的に明らかな抗原の免
疫沈降を引き起こした。D4、R2、6D2、D14、R1およびR1
0はすべて本発明の抗体として言及されることに留意す
る必要がある。
組換えFabによるSHaPrP 27〜30の免疫沈降 1/500に希釈した3F4、およびFabを含む大腸菌抽出物1
00μｌがSHaPrP 27〜30の免疫沈降を引き起こす能力
を、ウエスタンブロット法によって観測した。レーン14
を除くすべてのレーンは、ヤギ抗マウスIgG Fabおよび
プロテインＡアガロースを含む免疫沈降物である。レー
ン１、３、５、７、９、11、13にはSHaPrP 27〜30を含
むリポソーム10μｌを添加した。異なるさまざまなクロ
ーンからの1/500に希釈した大腸菌抽出物100μｌを以下
の通りに添加した：レーン２〜３、6D2;レーン４〜５、
D14;レーン６〜７、R1;レーン８〜９、R10;レーン10〜1
1、D4;レーン12〜13、3F4。レーン14には免疫沈降に用
いた量の1/2の容積のリポソームをロードした。
上記の結果は、図11の写真に示されている。写真に
は、本発明の組換え抗体を用いた場合により高度の免疫
沈降が生じたことが示されている。
図12は、本発明の精製されたEab（2Rおよび4D）なら
びに3F4によるSHaPrP 27〜30の免疫沈降を示す写真であ
る。抗原の免疫沈降を引き起こす能力はウエスタンブロ
ット法によって観測した。レーン14を除くすべてのレー
ンは、ヤギ抗体マウスIgG FabおよびプロテインＡアガ
ロースを含む免疫沈降物である。結果を得るために、レ
ーン５、９および13を除くすべてのレーンに、SHaPrP 2
7〜30を含むリポソーム10μｌを添加した。レーン２〜1
3の各レーンには、添加した精製Fabの量（ng）をあわせ
て表示した。レーン14には、免疫沈降に用いた量の半分
の容積のリポソームをローディングした。以上の結果
は、本発明の抗体2Rおよび4Dを用いた場合には、3F4と
比べて著しく高度の免疫沈降が生じたことを示してい
る。
ELISAのデータ（図９）は、多数のFabが非変性PrP 27
〜30と飽和性結合を生じ、その最大半減結合が0.5μ/ml
前後であることを明らかに示している。これは見かけの
結合定数108M-1（Fabの分子量＝50,000）に対応する。
同時に、3F4は２μg/mlまでの範囲で明らかな結合性を
示さなかった。図10に示した変性PrP 27〜30との場合に
は、組換えFabはより高いレベルで結合するが、見かけ
の親和性は同程度である。このことは、変性がより抗原
性の高い部位で生じたものの、それらの親和性は変わら
なかったことを示唆する。重要なことに、3F4はこの場
合には組換えFabと同程度に結合し、見かけの親和性は1
08M-1のオーダーである。図９および図10の3F4に関する
データの比較から、非変性型におけるPrP 27〜30の完全
性が強く示唆される。このことから、これらの組換えFa
bが、PrP 27〜30の調製物中に存在する変性PrPの分画と
反応したと考えることも可能であろう。しかし、3F4が
非変性PrP 27〜30との反応性を示さず、さらに変性PrP
27〜30とは強い反応性を示したことは、この解釈を否定
するものであり、これらの組換えFabが非変性ロッドを
高い親和性で認識することを強く示唆している。
免疫沈降データは、ELISAのデータを裏づけるもので
ある。粗細菌上清中に認められるような低濃度の組換え
Fab（典型的には１〜10μl/ml）は、PrP 27〜30を免疫
沈降させる高い効力を有する（図11）。これは107〜108
M-1のオーダーの親和性を意味する。これに相当する濃
度条件下では、3F4は明らかな沈降を引き起こさない。
より定量的な分析（図12）では、Fab R2が0.1〜0.2μg/
mlの範囲の若干の滴下によって非常に効率的にPrP 27〜
30の免疫沈降を引き起こすことが示されており、これは
結合親和性が108M-1のオーダーであることを意味する。
Fab 4Dの親和性はこれよりも低く、3F4による免疫沈降
は実際に極めて弱いものであった。この詳細な実験から
みて、3F4の親和性は５×107M-1よりもかなり低く、お
そらく107M-1よりも低いと考えられる。
これらを総合すると、以上のデータは、これらの組換
えFabが107〜108M-1の範囲の親和性を有することを示し
ている。
本明細書では、本発明に関して最も実践的であって好
ましい態様と考えられるものを示し、説明している。し
かし、この内容からの逸脱も本発明の範囲にあり、本開
示を読むことにより当業者には改変が想起されることが
理解される必要がある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 プルシナー スタンレー ビー. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ン フランシスコ パチェコ ストリー ト 400 (72)発明者 ウィリアムソン アール．アンソニー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ン ディエゴ カミニト エル リンコ ン 3574 アパートメント 102 (72)発明者 バートン デニス アール. アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ラ ジョラ ビューモント アベニュー 6044 (56)参考文献 特開 平４−211395（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−205691（ＪＰ，Ａ) 特表 平４−502700（ＪＰ，Ａ) 特表 平７−501798（ＪＰ，Ａ) Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．135，Ｎｏ. １，ｐ．603−613 Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．40, ｐ．518−522 Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊ ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎ ｅ，1986年 ２月27日，Ｖｏｌ．314, Ｎｏ．９，ｐ．547−551 Ｊｏｕｒｎａｌ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃ ｈｅｍ．，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ 18 Ｄ，Ａｂｓｔｒａｃｔ Ｔ304 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 16/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】以下の段階を含む過程によって作製され
    る、PrPScと特異的に結合する107l/molの結合親和性を
    有する抗体：（ａ）ファージ上において抗体ライブラリ
    ーを合成する段階であり、該ファージが、両PrP遺伝子
    が除去されかつ免疫反応を惹起するためにPrPScにより
    免疫化された哺乳動物由来の遺伝材料を含むものである
    段階、（ｂ）ファージをPrP蛋白質を含む組成物と接触
    させることにより、試料に対してライブラリーをパニン
    グする段階、及び（ｃ）PrPSc蛋白質と結合するファー
    ジを単離する段階。
  2. 【請求項２】ファージ上における抗体ライブラリーが、
    （1a）免疫応答を生じさせるための、PrP蛋白質によ
    る、内因性の両PrP遺伝子が除去されている宿主哺乳動
    物の免疫化、（2a）宿主哺乳動物からの、抗体の産生を
    引き起こす細胞の採取、（3a）（2a）の細胞からのRNA
    の単離、（4a）cDNAを作製するためのRNAの逆転写、（5
    a）プライマーを用いてのcDNAの増幅、および（6a）抗
    体がファージ上に発現されるようなファージディスプレ
    イベクターへの（5a）のcDNAの挿入、によって調製され
    る、請求項１記載の抗体。
  3. 【請求項３】リポソーム中に分散された抗原が、プロテ
    イナーゼＫによって消化されないPrPScのコア部分であ
    って、該コア部分がビオチン化されている、リポソーム
    中に分散された抗原に対して抗体をパニングする段階、
    をさらに含む過程によって得られる、請求項１記載の抗
    体。
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