ES2209108T3 - Ensayo inmunologico para encefalopatias espongiformes. - Google Patents
Ensayo inmunologico para encefalopatias espongiformes.Info
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Abstract
UN SISTEMA PARA LABORATORIO CLINICO ES CAPAZ DE PROCESAR AUTOMATICAMENTE, INCLUIDA LA CLASIFICACION, DE RECIPIENTES DE MUESTRAS MULTIPLES. EL SISTEMA COMPRENDE UN CONTROLADOR CENTRAL, UN PUESTO DE TRABAJO (100), UNO O MAS ANALIZADORES (2000), Y UNA CENTRIFUGA AUTOMATIZADA (1000). LA ESTACION DE TRABAJO (100) TIENE DETECTORES AUTOMATICOS PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN SOPORTE (14) QUE SOSTENGA RECIPIENTES DE MUESTRAS (12). LA ESTACION DE TRABAJO (100) TIENE UN LECTOR DE CODIGO DE BARRAS PARA LEER LOS CODIGOS DE BARRAS DE LOS RECIPIENTES. EL SISTEMA CUENTA CON UN SUBSISTEMA DE TRANSPORTE, PREFERENTEMENTE UN BRAZO DE ROBOT (700) DE LA ESTACION DE TRABAJO Y UN BRAZO DE ROBOT (2002) DEL ANALIZADOR, PARA TRANSPORTAR LOS RECIPIENTES DE MUESTRAS (12), MOVIENDOLOS A Y DESDE LA ESTACION DE TRABAJO (100), A Y DESDE LOS ANALIZADORES (2000) Y A Y DESDE LA CENTRIFUGA (1000). LA CENTRIFUGA SE CARGA CON CANGILONES (1200) QUE CONTIENEN RECIPIENTES DE MUESTRAS (12). LA ESTACION DE TRABAJO (100) PUEDE LLEVAR UN SISTEMA DE BALANZA (800) PARA CALCULAR EL PESO DE LOS CANGILONES (1200) UTILIZADOS. LA ESTACION DE TRABAJO (100) PUEDE TENER TAMBIEN UN DESTAPONADOR (900) PARA RETIRAR AUTOMATICAMENTE LAS TAPAS DE LOS RECIPIENTES DE MUESTRAS.
Description
Ensayo inmunológico para encefalopatías
espongiformes.
La presente invención se refiere al método de
detección de Encefalopatías Espongiformes Transmisibles y a un
ensayo inmunológico o test para Encefalopatías Espongiformes
Transmisibles (EET).
Las Encefalopatías Espongiformes son un grupo de
enfermedades neurológicas degenerativas. Hay varios ejemplos de
Encefalopatías Espongiformes incluyendo BSE (Encefalopatía
Espongiforme Bovina), Scrapie, Enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob (ECJ), síndrome de
Gerstmann-Straussler-Scheinker,
Kuru, Encefalopatía de visón transmisible, enfermedad degenerativa
crónica del venado bura, encefalopatías espongiformes felinas y
otras encefalopatías espongiformes encontradas en animales tales
como alce, gran antílope, antílope nyala, antílope gemsbok o orix y
tigres. También se ha revelado que BSE puede ser transmitida bajo
condiciones de laboratorio a ratones y cerdos. Este cruce de
barreras de especies por el agente infectivo ha llevado a aumentar
la creencia de que se puede dar el caso de transferencia a
humanos.
La encefalopatía espongiforme bovina (BSE) es un
trastorno cerebral degenerativo del ganado que es conocida
popularmente como "enfermedad de las vacas locas". Tiene un
periodo de incubación lento, hasta de cuatro o cinco años con
síntomas de degeneración progresivos del estado mental en vacas
incluyendo pérdida de coordinación y modo de andar tambaleante,
pérdida de interés por lo que la rodea, desinterés por las comidas
y el agua, o comportamiento impredecible, incluyendo agresividad.
El ganado afectado muestra los síntomas cuando tiene de tres a diez
años de edad.
Identificada primero en el Reino Unido en
Noviembre del 1986, desde entonces se han registrado más de 100.000
casos. Los análisis post mortem del ganado afectado revelan
un patrón característico de vacuolación en el tejido cerebral
debido a la destrucción de células neuronales y la deposición de
fibras proteicas atípicas, que dan al cerebro una textura esponjosa
(espongiforme). Enfermedades espongiformes similares han sido
reconocidas en humanos (por ejemplo, la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob o CJD) hace más de un siglo y en
ovejas (scrapie) hace más de 200 años. Se pensó que el agente
responsable de BSE y sus homólogos es una proteína infectiva
conocida como prión. El prión es una partícula infectiva que
comprende tan sólo una proteína y no ácido nucleico, la presencia
del ácido nucleico se requiere en el caso de un virus convencional.
En Scrapie una proteína en particular conocida como proteína prión
o PrP^{SC}, se ha hallado al co-purificar con
infectividad y puede producir una condición similar al Scrapie en
cultivos de células cerebrales de otros animales, tales como
hámsters bajo condiciones de laboratorio. PrP^{SC}es el único
componente conocido de las fibras de proteína características
depositadas en el tejido cerebral de ovejas infectadas con Scrapie.
Esta proteína, PrP^{SC} parece conllevar una modificación
estructural, mientras que el término PrP^{c} se usa respecto su
homólogo celular normal de PrP^{SC}. La función natural de
PrP^{C} no es conocida, pero si parece tener probablemente una
estructura esencial o papel funcional en el organismo.
Tejido animal reciclado, que ha sido
habitualmente usado para alimentar a diario a las vacas británicas
como suplemento proteínico, ha sido identificado como la fuente de
la infección. Se cree que BSE se originó inicialmente a partir de
cerebros de oveja infectados con scrapie y que su aparición se
aceleró accidentalmente por la ingestión de tejido cerebral
extraído de vacas que habían sido infectadas con BSE. Por lo tanto,
el Gobierno Británico introdujo la obligación de destruir los
animales sospechosos y sus cuerpos a principios de 1988. La
alimentación a partir de tejido animal para las vacas fue prohibida
en Gran Bretaña en Julio de 1988.
Desde el informe inicial de la enfermedad, los
consumidores han temido que ésta pueda ser transferible a humanos a
través de la leche o productos cárnicos de vaca, particularmente
desde que se conoce el Kuru, una enfermedad relacionada conocida
por transmitirse mediante el ritual de canibalismo entre tribus de
hombres en Nueva Guinea. A finales de 1990, el consumidor se
preocupa de la transmisión de BSE a humanos provocando un colapso
en el mercado de la carne de vaca. Un caso similar afectó a Alemania
a mediados de 1994.
Se identificaron en 1996 diez casos de un tipo
nuevo descrito de CJD fatal (Variante de CJD). Las víctimas tenían
diferentes síntomas de tejido cerebral, todos tenían menos de 42
años, y no tenían un historial hereditario de la enfermedad. Se ha
sugerido que las víctimas puedan haber contraído la enfermedad a
través del contacto con ganado infectado por BSE antes de que se
llevara a cabo la erradicación de animales sospechosos. La
identificación de la variante CJD condujo a una caída dramática en
el consumo de carne de ternera en Gran Bretaña, y la prohibición de
la importación de ternera británica y en algunos casos de Irlanda
en varios países del mundo.
Por lo tanto, por tanto razones económicas como
veterinarias, existe una necesidad urgente de proporcionar un
método para diagnosticar y un kit de diagnóstico para detectar
infección con BSE, Scrapie y otras Encefalopatías Espongiformes
relacionadas, en ganado vivo, cuerpos de animales y generalmente en
carne.
WO-A-937/11155 de
Proteus Molecular Design Ltd. revela métodos de obtención de
anticuerpos contra una secuencia peptídica sintética y el uso de
anticuerpos en inmunoensayos que detectan encefalopatías.
US-A-4.806.627
revela un anticuerpo monoclonal capaz de unirse a proteínas
asociadas a scrapie en un complejo
antígeno-anticuerpo.
WO-A-97/37227
enseña un método de diagnóstico de encefalopatías usando secuencias
polipeptídicas a partir de proteínas priones obtenidas de carne de
ovejas afectadas por scrapie para generar anti-suero
específico para estas proteínas.
WO-A-97/10505
enseña un ensayo para la detección de proteínas priones patógenas
usando un anticuerpo que une al prión asociado a la proteína.
Es por lo tanto un objeto de la presente
invención proporcionar un método de ensayo de ganado,
particularmente cuerpos de animales, para el agente infectivo
responsable de BSE. Es por tanto un objetivo que el método de
protección sea rápido, con el resultado disponible de algún modo en
horas, que debería ser barato, confiable y de uso fácil.
Tal método de detección debería tener la ventaja
de prevenir la entrada de carne infectada en la cadena alimentaria
humana, eliminando así la posibilidad de que los humanos contraigan
la variante de CJD u otras enfermedades relacionadas que se pueden
transmitir por comer carne infectada. Esto tiene la ventaja a su
vez que recuperaría la confianza del consumidor en la carne y
productos cárnicos, que sería ventajoso para tanto la comunidad de
granjas como la industria cárnica en general.
Actualmente no hay un test disponible que pueda
identificar cuerpos de carne o ganado infectados, y no hay un
producto adecuado que pueda calmar el miedo del público al consumo
de carne.
La invención actual suministra un ensayo
inmunológico para el agente putativo PrP^{SC} la proteína prión
patógena que se cree que es la responsable de las Encefalopatías
Espongiformes.
De acuerdo con la presente invención se
proporciona un método "in vitro" para detectar el
agente putativo para EET en animales que comprende la reacción de
una muestra de tejido corporal extraída de un animal en un ensayo
inmunológico con un anticuerpo marcado que es capaz de reaccionar
con PrP^{SC} y determinar la cantidad de anticuerpo marcado unido
a la muestra, en donde el anticuerpo es un anticuerpo específico de
prión construido contra una o más de las siguientes secuencias:
El anticuerpo usado en el ensayo es
preferiblemente un anticuerpo C5 para PrP^{SC} que está
disponible de Proteus, Inglaterra, llamado aquí reactivo de
diferenciación.
En una realización preferida, el ensayo
inmunológico es un ensayo competitivo en que un soporte sólido,
convenientemente una placa micro-titulada, es
pre-cubierta con un conjugado
péptido-proteína vehículo, se añaden la muestra de
tejido animal y un anticuerpo anti-péptido al
soporte sólido, permitiendo la reacción y el lavado del soporte, se
añade un anticuerpo anti-(anticuerpo anti-péptido)
marcado, permitiendo así la reacción, se lavar, se añade un
reactivo señal y se lee la señal. El marcador puede ser peroxidasa
de rábano picante.
El anticuerpo primario usado en el ensayo es
preferiblemente un anticuerpo antiPrP^{SC} de conejo y el
anticuerpo secundario se selecciona preferiblemente de cabra,
oveja, burro u otro anticuerpo anti-conejo.
En una realización particular se usó un ensayo de
ELISA para identificar el fragmento peptídico de PrP^{SC}, pero
también se pueden usar otros ensayos inmunológicos adecuados.
En una realización preferida se usa un ensayo de
quimioluminiscencia potenciado para ayudar a la detección del
agente PrP^{SC}. Los animales pueden ser normalmente ganado,
ovejas y cerdos y la muestra de tejido puede ser adecuadamente
tomada del cuerpo de dichos animales.
Los pasos que se incluyen son:
- 1.
- Limpieza del tejido nervioso para permitir la detección del agente putativo para PrP^{SC} (la proteína prión patógena que se cree que es la responsable de las Encefalopatías Espongiformes),
- 2.
- Paso de cebo de ensayo que implica la adición de agentes específicos (anticuerpos);
- 3.
- ELISA usando pocillos pre-cubiertos con el fragmento peptídico de PrP^{SC};
- 4.
- Ensayo de quimioluminiscencia potenciado para la detección de un agente PrP^{SC}, y
- 5.
- Determinación de resultados
En particular el ensayo implica un ensayo para la
proteína PrP^{SC} que es la proteína prión infectiva encontrada
en BSE. El ensayo es capaz de distinguir entre PrP^{SC} y
PrP^{SC} que es la proteína prión BSE normal. La proteína
PrP^{SC} es una serie de péptidos en una triple hélice mientras
que en PrP^{SC} un tercio de la molécula está en la forma de
lámina beta-plegada.
Es particularmente importante que el ensayo pueda
discriminar entre PrP^{C} natural y PrP^{SC}, ya que PrP^{C}
se encuentra en sujetos normales mientras que ambos PrP^{C} y
PrP_{SC}, se encuentran en sujetos enfermos.
En una invención particularmente preferida, una
muestra de tejido del SNC, convenientemente una sección transversal
de la médula espinal, es extraída del cuerpo animal, se homogeniza,
se filtra y se coloca en la placa micro-titulada.
La muestra entonces reacciona en un ensayo inmunológico con un
anticuerpo como se describe anteriormente.
La invención también proporciona un kit de ensayo
para la detección de EET en animales que comprenden un anticuerpo
anti-péptido tal como se define anteriormente.
El método permite la detección rápida de un
agente EET en un cuerpo, estando los resultados disponibles en
horas, normalmente tras alrededor de una hora y media a dos horas.
De ese modo el cuerpo se puede eliminar del matadero antes de pasar
por la cadena alimentaria humana.
La invención será ahora descrita en gran detalle
con referencia a los Ejemplos.
Los requerimientos para el inmunoensayo EET Enfer
son los siguientes:
- a)
- Una muestra del tejido del SNC.
- b)
- Una serie de tratamientos preparativos de la muestra
- c)
- Un anticuerpo específico de prión
- d)
- Método sensible de detección
a) Una muestra del tejido SNC es extraída del
cuerpo de una vaca en el momento de ser matada usando un
dispositivo de muestra especializado (disponible de Medisteel,
Dublín, Irlanda). Esta muestra de tejido tal puede ser una sección
transversal de la médula espinal que puede ser extraída de la
muestra para un análisis confirmatorio si fuera necesario. La
muestra se dispone en un contenedor universal y se identifica con un
número de identificación fácil de seguir es decir, un número
marcado en el cuerpo de 4 dígitos EU, una etiqueta marcada en la
oreja numerada del departamento irlandés de Agricultura o un número
otorgado por el matadero fácil de comprobar. La muestra es
transportada al laboratorio para su ensayo.
b) Al llegar la muestra al laboratorio es
identificada usando un código de barras. El código de barras
asignado a cada muestra incorpora la información del matadero de
origen, la fecha de la matanza del animal y un número de
identificación de la muestra trazable. Una cantidad de cada muestra,
en el rango de peso de 0,3 g a 1,1 g es extraída y dispuesta dentro
de una bolsa Stomacher para homogeneizar. A esta bolsa que contiene
una sección de la muestra original se le asignará un código de
barras idéntico al de la muestra original. Esto permite una
trazabilidad completa a lo largo del sistema. Un volumen fijo de
tampón de Homogeneización se añade a la bolsa Stomacher y la muestra
se homogeniza. La muestra después es distribuida por duplicado
sobre una placa microtitulada de 96 pocillos preparada. Un volumen
fijado de Tampón diferencial es aplicado a la placa
micro-titulada e incubada. Un volumen fijado de
Tampón de cebo se añade después a las muestras en las placas e
incubadas. Hasta que este paso complete el proceso de preparación
de la muestra.
c) Las muestras están ahora listas para el
inmunoensayo. Éste requiere un anticuerpo específico de prión. Este
anticuerpo se obtiene de conejos como péptido prión sintético. Un
volumen fijado de este anticuerpo específico se añade a la placa
micro-titulada, es incubado y lavado. Un volumen
fijado de un segundo anticuerpo se añade a la placa, se incuba y se
lava. La detección de los resultados es ahora posible.
d) La detección de los resultados es por métodos
de quimioluminiscencia potenciada. Un volumen fijado de reactivo de
quimioluminiscencia se añade a la placa
micro-titulada y se incuba. La señal luminosa se
mide usando un quimioluminómetro Labsystems, los resultados se
asignan al correspondiente código de barras y el informe de los
resultados se imprime.
Tampón de Homogeneización Enfer (HB)
Osmosis reversa acuosa
Reactivo de diferenciación
Control positivo
Control negativo
Tampón de cebo de inmunoensayo Enfer (IPB)
Solución de tampón fosfato 1,5 M (PBS)
Solución de tampón fosfato 150 mM (PBS)/Tween 20
(0,05%)
Solución de cloruro sódico (NaCl)
Péptido Anti-PrP de conejo en 150
mM PBS/Tween 20 (0,05%) diluido tal como se indica por el
proveedor
Suero de cabra normal
Conjugado de IgG anti-conejo de
burro con peroxidasa de rábano picante en PBS 150 mM/Tween 20
(0,05%) diluida tal como indica el proveedor Amerlite Reagent™
Johnson & Johnson Clinical diagnostics.
Lector de códigos de barras y base de datos
informatizada interconectada
Impresora de etiquetas de códigos de barras
Mezcladora rotativa (botella)
Lector de quimioluminiscencia de placas
micro-tituladas de 96 pocillos
Incubador con agitación de placas
micro-tituladas de 96 pocillos (2)
Lavador de placas micro-tituladas
de 96 pocillos (2)
Micro-computadora
Impresora láser
Software "habitual" de
micro-computadora - proceso de datos e informe de la
conservación a congelación profunda -20ºC
Conservación a refrigeración 4ºC
Sistema de osmosis reversa acuosa
Pipetas de 8 viales automáticas
Dispensador de tiras para placa
micro-titulada automático
Mezclador Vortex
Pipetas Pasteur desechables
Homogenizador y bolsas Stomacher (cantidad
variable)
Cuchillas
Bolsas de muestra y sistema de transporte
seguros
Sistema de armario de seguridad de clase II
Autoclave
La muestra debe ser tal que sea capaz de la
detección de la proteína PrP^{SC} en la médula espinal.
El tamaño de la muestra será suficiente para
permitir el análisis y si fuera necesario, se pueda repetir o
realizar un análisis confirmatorio.
Las muestras se recogerán de tal modo que permita
la identificación de la muestra en el laboratorio.
El método de empaquetamiento, conservación y
transporte al laboratorio mantendrá la integridad de la muestra tal
que los resultados del análisis no se vean perjudicados.
Las muestras para análisis se transportarán al
laboratorio, en contenedores sellados y aislados.
7,5 ml de tampón de homogeneización (HB) se
añaden a cada muestra.
La muestra se sella y se pone en el
homogeneizador, se homogeneiza durante 3 minutos.
Extraer la muestra del homogeneizador y tras la
acumulación de 40 muestras, se ponen las muestras en un estante
designado.
Aplicar 0,02 ml de reactivo de diferenciación a
cada pocillo de la placa micro- titulada
pre-cubierta excepto en los pocillos A1, A2.
Transferir, en orden, el código de barras
identificativo de cada muestra a la
micro-computadora mediante un escáner de códigos de
barra.
Aplicar 0,18 ml de muestra a cada pocillo excepto
A1, A2, A3, A4 (controles).
Cubrir la placa con un sellador de placas
micro-tituladas.
Incubar la placa micro-titulada
durante 1 hora a 37ºC, agitando.
Lavar los pocillos de las placas
micro-tituladas 8x con 0,4 ml de una solución de
NaCl.
Dispensar 0,25 ml del Tampón de Cebo de
Inmunoensayo a cada pocillo. Incubar la placa
micro-titulada durante 15 minutos a 37ºC,
agitando.
Lavar los pocillos de la placa
micro-titulada 4x con 0,4 ml de una solución
PBS/Tween 20 (0,05%).
Dispensar 0,2 ml de anticuerpo primario en cada
pocillo de la placa micro-titulada.
Incubar la placa micro-titulada
durante 40 minutos, con agitación, a 37ºC.
Lavar los pocillos de la placa
micro-titulada 4x con 0,4 ml de una solución
PBS/Tween 20 (0,05%).
Dispensar 0,2 ml de anticuerpo secundario en cada
pocillo de la placa micro-titulada
Incubar la placa micro-titulada
durante 30 minutos, con agitación a 37ºC.
Lavar los pocillos de la placa
micro-titulada 4x con 0,4 ml de una solución
PBS/Tween (0,05%) Dispensar 0,15 ml de reactivo Amerlite™ en cada
pocillo de la placa micro- titulada.
Incubar la placa micro-titulada
durante 3 minutos, con agitación, a 37ºC.
Leer la luminiscencia en el lector
Reducción de los datos e interpretación
- *
- péptido Anti-PrP de conejo, se guarda congelado y diluido para trabajar con validez como indica el proveedor.
- *
- Conjugado de IgG anti-conejo de burro - peroxidasa de rábano picante (HRP), conservado a 4ºC, para ser diluida tal como se indica por el proveedor.
- *
- suero de cabra normal, conservado a 4ºC, para diluirse apropiadamente.
Suministrado por Veterinary Research
Laboratories, Abbotstown, Dublín.
Enfer Scientific Ltd.
Co. Tipperary
Irlanda.
Diagrama de
flujo
Muestra de tejido del
SNC
\downarrow
Homogeneización y
preparación
\downarrow
Inmunoensayo
\downarrow
Informe de los
resultados
1.1 1g de tejido SNC se extrae de la muestra y se
pone en una bolsa Stomacher.
1.2 15 ml de Tampón de Homogeneización se añaden
a la sección.
1.3 Esta mezcla se homogeneiza durante 3 minutos
usando un homogeneizador Stomacher.
1.4 El homogenado resultante se filtra a través
de un filtro de 1 micrón.
2.1 Placa micro-titulada de 96
pocillos preparada mediante la dispensación de 200 ul de Agente
Adherente en cada pocillo e incubando durante toda la noche a
37ºC.
2.2 Lavar la placa 4XPBST (5 x Comprimidos de
solución tampón de fosfatos, suministrados por Sigma, U.K. a 1
litro de H_{2}O/Tween 20 1% de osmosis reversa) (150 mM) antes de
su uso.
2.3 200 ul de control blanco (tal como agua,
solución salina o tampón) se dispensan por duplicado en la placa,
posiciones A1,2.
2.4 200 ul de control negativo (conocido como
homogenado BSE negativo) se dispensa -4 réplicas- en la placa,
posiciones B1,2 C1,2. El homogenado BSE negativo conocido es
suministrado por el Veterinary Research Laboratory. Abbotstown,
Castleknock, Dublín, Irlanda.
2.5 200 ul de control positivo (homogenado BSE
negativo conocido, disponible en Veterinary Research Laboratory,
Abbotstown, Castlenock, Dublín, Irlanda) se dispensa -4 réplicas-
en la placa, posiciones D1,2 E1,2.
2.6 200 ul de cada homogenado filtrado se
dispensa por duplicado en la placa, manteniendo las posiciones.
2.7 50 ul de Tampón Diferencial se dispensa en la
placa llevando el volumen de los pocillos a 250 ul.
2.8 La placa se cubre con un sellador de placas
microtituladas y se incuba a 20ºC durante 30 minutos.
2.9 La placa se centrifuga durante 30 minutos a
2000 rpm.
2.10 La placa entonces se lava 4 veces con 150 mM
PBST.
2.11 50 ul de Tampón de cebo se añadieron a cada
pocillo de la placa micro-titulada y la placa se
incubó durante 1 hora a 37ºC.
2.12 La placa se lava 4 veces con 150 mM
PBST.
3.1 250 ul de anticuerpo específico de prión
primario, un anticuerpo de péptido anti-prión de
conejo a una dilución de 1:2000, se dispensa en la placa.
3.2 La placa se incuba a temperatura ambiente
durante 40 minutos.
3.3 La placa se lava 4 veces con 150 mM PBST.
3.4 250 ul de anticuerpo secundario, un HRP de
burro anti-conejo a una dilución de 1:2000 se
dispensa en la placa y la placa se incuba a 37ºC durante 30
minutos.
3.5 La placa se lava 4 veces con 150 mM PBST.
4.1 250 ul de reactivo de quimioluminiscencia
potenciado (reactivo amerlite, suministrado por Johnson &
Johnson Clinical Diagnostics, U.K.) se añade a la placa.
4.2 La placa se incuba a temperatura ambiente
durante 10 minutos.
4.3 La señal luminosa se lee usando un
Quimioluminómetro Labsystems (suministrado por Medical Supply Co.,
Dublín, Irlanda) que es un lector de barrido de longitud de onda.
El dispositivo lee la luminiscencia de cada pocillo de la placa por
barrido del espectro entero de
IR-visible-UV y extrapolando los
resultados.
4.4 Las señales luminosas de la placa se
transfieren a un paquete de software al gusto del consumidor
(disponible de G.K.S. Software, Dublín, Irlanda)
4.5 A cada señal luminosa se le asigna un código
de barras correspondiente y un informe impreso.
4.6 Los resultados se muestran en Unidades
luminosas de quimioluminiscencia L.U.
1. Agente de adhesión a la placa, Tampón de
Homogeneización, tampón de cebo y tampón diferencial se suministran
por Enfer Products Ltd.
2. Anticuerpos específicos de prión
-anti-PrP- se suministran por Enfer Products y son
anticuerpos de conejo obtenidos a partir de los siguientes péptidos
de prión sintéticos.
Todas las secuencias usadas aquí se dan usando
abreviaciones en un código de tres letras I.U.P.A.C. estándar para
los residuos de aminoácidos tal como se encuentra a
continuación:
A-Alanina,
C-Cisteína, D-Ácido aspártico, E-Ácido glutámico,
F-Fenilalanina, G-Glicina,
H-Histidina, I-Isoleucina,
K-Lisina, L-Leucina,
M-Metionina, N-Asparagina,
P-Prolina, Q-Glutamina,
R-Arginina, S-Serina,
T-Treonina, V-Valina,
W-Triptófano y Y-Tirosina.
Ambas secuencias subrayadas (un péptido de 34
aminoácidos y un péptido de 40 aminoácidos) se usan para obtener
anticuerpos anti-PrP de conejo. Los péptidos se
conjugan para activar la ovalbúmina y se inyectan
intra-muscularmente en adyuvante completo de Freund.
Las inyecciones booster son sub-cutáneas y se usa
adyuvante completo de Freund. Los conejos se desangran a los 30
días.
3. El reactivo de quimioluminiscencia es
suministrado por Johnson & Johnson, Clinical Diagnostics, U.K.
y los resultados se miden usando un quimioluminómetro
Labsystems.
Los datos generados en un control positivo y en
un control negativo, en un total de 10 ensayos se proporcionan en
la Tabla 1. Estos controles se han estimado positivos y negativos
por dos métodos diferentes no relacionados -histologia (HIS) e
inmunohistoquímica (ICC), los métodos que últimamente se usan para
confirmar los resultados obtenidos usando el Enfer test. Las
variaciones inter-ensayo basadas en estas dos
muestras son del 19% para el control positivo y 93%
para el control negativo. Estos datos indican que el ensayo tiene
una reproductibilidad aceptable. Otro control también se incluyó en
este estudio. Éste era un péptido control que permite el estudio de
la variación entre ensayos debido a la diferencia entre anticuerpos
del día a día. Estos datos se incluyen en la Tabla 1. De nuevo la
variación inter-ensayo a 14% es satisfactoria.
La variación intra-ensayo se
determinó usando los mismos tipos de control que aquellos usados
para el estudio inter-ensayo (positivo, negativo y
péptido) y haciendo 23 réplicas de cada control en una placa
simple. Los datos generados en estos controles se proporcionan en la
Tabla 2 mostrando una variación del 9% del control positivo,
11% para el péptido control y 57% para el control
negativo.
Varios estudios de estabilidad se llevaron a cabo
con el propósito de esta validación.
En este caso una muestra se homogeneizó y se
dividió en alícuotas. Durante un período de siete días, el mismo
homogenado se ensayó en cuatro ocasiones usando alícuotas
conservadas a -20ºC, 2-8ºC, y en dos ocasiones
usando alícuotas conservadas a temperatura ambiente y 37ºC. Los
resultados, descritos en la Tabla 3, muestran que la señal luminosa
es estable, permitiendo la variación inter-ensayo,
durante este periodo con condiciones de conservación de -20ºC, con
algo de deterioro a 2-8ºC, temperatura ambiente y
37ºC.
Este estudio se elaboró para determinar la fecha
de caducidad del tampón de homogeneización con propósitos de
producción. Un protocolo similar al que se traza en (a) anterior
fue seguido de los resultados proporcionados en la Tabla 4. De
nuevo los resultados muestran que HB es estable para su uso.
El anticuerpo sin diluir se puede conservar
congelando durante un periodo de tiempo indefinido. No obstante, el
anticuerpo diluido con capacidad de trabajar usando PBS/Tween 20
(0,05%) no es estable como anticuerpo concentrado y entonces se
realizó un estudio de estabilidad. Las diluciones de anticuerpo de
1:1K se hicieron en 9 ocasiones durante un periodo de 72 días. En el
día final del estudio cada una de las 9 preparaciones de aplicó a
una placa recubierta de antígenos y se realizó un ELISA. Los
resultados se presentan en la Tabla 5 y a partir de estos datos se
puede ver que la capacidad de trabajar del anticuerpo es estable
durante al menos un periodo de 70 días.
Este ensayo de estabilidad se llevó a cabo para
asegurar que el ensayo no se vería afectado si algún factor
resultara en un retraso en la homogeneización de la muestra tras
añadir el HB. El tampón de homogeneización se añadió a la muestra
en la proporción de 1g de cerebro a 15 ml de tampón y la mezcla se
dejó a temperatura ambiente durante toda la noche (15 horas). La
muestra se homogeneizó tras ese tiempo y el inmunoensayo se llevó a
cabo. Los resultados se muestran en la Tabla 6 (-2 muestras
ensayadas, una sin y una con retraso). El tratamiento realizado no
tenía diferencias con el resultado eventual.
El valor en cada punto de datos está representado
por 3 réplicas
Claims (6)
1. Un método "in vitro" para la
detección del agente putativo para una EET en animales que
comprende la reacción de una muestra de tejido corporal cogida de
un animal en un ensayo inmunológico con un anticuerpo marcado que es
capaz de reaccionar con PrP^{SC} y determinar la cantidad de
anticuerpo marcado unido a la muestra, caracterizado en que
el anticuerpo es un anticuerpo específico de prión obtenido contra
una o más de las siguientes secuencias:
2. Un método tal como se reivindica en la
reivindicación 1 en donde los anticuerpos son anticuerpos dirigidos
contra las secuencias subrayadas de la reivindicación 1.
3. Un método tal como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en donde el ensayo inmunológico
es un ensayo competitivo en que un soporte sólido, convenientemente
una placa micro-titulada, se
pre-cubre con un conjugado
proteína-péptido vehículo, se añaden la muestra de
tejido animal y un anticuerpo anti-péptido al
soporte sólido, permitiendo la reacción y se lava el soporte, se
añade un anticuerpo anti-(anticuerpo anti-péptido)
marcado, permitiendo la reacción, se lava, se añade el reactivo
señal y se lee la señal.
4. El método tal como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en donde los animales se
seleccionan de ganado, ovejas y cerdos y la muestra de tejido se
toma del cuerpo de tales animales.
5. Un método tal como se reivindica en cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en donde una muestra de tejido
del SNC, convenientemente una sección transversal de la medula
espinal, se usa para el ensayo.
6. Un kit de prueba para la detección de EET en
animales comprendiendo un anticuerpo anti-péptido,
en donde el anticuerpo es un anticuerpo específico de prión
dirigido contra una o más de las siguientes secuencias
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