DE10119713A1 - Verfahren zur Untersuchung von Prion-Protein enthaltenden Proben auf das eventuelle Vorliegen der PrPSc-Form - Google Patents

Abstract

Ein Verfahren zur Untersuchung von Prion-Protein enthaltenden Proben auf das eventuelle Vorliegen der PrP·Sc·-Form, bei dem (Schritt a) die Probe mit Protease versetzt wird zur Verdauung Protease sensitiver Proteine bzw. Proteinbereiche, die Probe (Schritt b) nach Verdauung darauf überprüft wird, ob in ihr der Bereich PrP 27-30 des Prion-Proteins enthalten ist, der in der PrP·Sc·-Form des Prion-Proteins Protease resistent ist und aus dem positiven Nachweis von PrP 27-30 auf das Vorliegen von PrP·Sc· in der Probe geschlossen wird, ist dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt b) die Probe zusätzlich darauf überprüft wird, ob eine vollständige Verdauung des Protease sensitiven Bereichs des Prion-Proteins stattgefunden hat.

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren nach dem Oberbegriff des Anspru­ ches 1.

Gattungsgemäße Verfahren werden z. Zt. insbesondere bei Screening- Untersuchungen von Säugetieren, z. B. Schlachtvieh, auf übertragbare, degenera­ tive neurologische Erkrankungen angewandt. Solche Erkrankungen, die unter dem Begriff spongiforme Enzephalopatien oder auch Prionerkrankungen zusam­ mengefaßt werden, treten als BSE bei Rindern und z. B. als Scrapies bei Schafen, oder als Kuru oder Creuzfeldt-Jakob-Krankheit bei Menschen auf.

Wie oben erwähnt sind Prionerkrankungen übertragbar, wobei die Infektiösität noch nicht vollständig geklärt ist. Als einziges mit dem infektiösen Agens asso­ ziiertes Molekül wurde bislang ein krankheitsspezifisches Prion-Protein (PrP^Sc) gefunden, das eine abnorme Isoform eines normalen Säugetierproteins (PrP^c) un­ bekannter Funktion ist. Beide Isoformen PrP^Sc und PrP^c stimmen bezüglich Mole­ kulargewicht und Aminosäuresequenz überein. Sie unterscheiden sich in ihrer räumlichen Faltung.

Viele Indizien, insbesondere die Abwesenheit von anderen Molekülen außer PrP^Sc im Prion und vor allem die Abwesenheit von Nukleinsäuren, deuten dar­ aufhin, daß PrP^Sc wahrscheinlich die zentrale Rolle bei der Auslösung der oben genannten Krankheiten zukommt. Es wird angenommen, daß PrP^Sc-Proteine in der Lage sind, normale PrP^c-Proteine in die krankheitsspezifische Faltung zu konvertieren, was die Infektiösität von PrP^Sc-Proteinen erklären würde.

Gattungsgemäße Tests gehen daher von PrP^Sc als zentralem Krankheitsmolekül aus und überprüfen, ob das z. B. in einer Hirnprobe eines Säugetiers enthaltene Prion-Protein auch in der PrP^Sc-Form vorliegt. Falls ja, wird davon ausgegangen, daß das Säugetier, dem die Probe entnommen wurde, infiziert war.

Dabei enthalten, wie erwähnt, Proben aus infizierten Quellen nicht ausschließlich PrP^Sc sondern daneben auch Prion-Protein in der PrP^c-Form. Während des Ver­ fahrens muß also eine Differenzierung zwischen der PrP^c und der eventuell vor­ liegenden PrP^Sc-Form erfolgen.

In diesem Zusammenhang macht man sich zunutze, daß die PrP^c-Form vollstän­ dig Protease-verdaubar ist, während bei der PrP^Sc-Form nur ein C-terminaler Be­ reich Protease sensitiv und ein als PrP 27-30 bezeichneter Bereich des Prion- Proteins Protease resistent ist.

Bei herkömmlichen Tests wird daher die zu untersuchende Probe zunächst in einem ersten Schritt (Schritt a) mit einer Protease verdaut, wobei davon ausge­ gangen wird, daß nach Verdauung in der Probe keine Protease sensitiven Berei­ che des Prion-Proteins mehr enthalten sind und bei infektiösem Probematerial nur der Protease resistente Bereich PrP 27-30 der PrP^Sc-Form übrig bleibt. Dement­ sprechend wird nach der Verdauung in einem weiteren Schritt (Schritt b) ledig­ lich überprüft, ob der Bereich PrP 27-30 in der Probe nachzuweisen ist oder nicht. Zum Nachweis werden z. B. spezifische im Bereich PrP 27-30 bindende Antikörper eingesetzt. Eventuell gebildete Antikörper-PrP 27-30-Komplexe wer­ den dann mittels herkömmlicher Methoden z. B. Elisa-Tests nachgewiesen. Ist der Nachweis positiv, d. h. lassen sich z. B. Antikörper-PrP 27-30 Komplexe nachwei­ sen, so wird davon ausgegangen, daß die Probe PrP^Sc enthält und daß das Säuge­ tier, aus dem die Probe stammt, infiziert war.

Ein Problem bei den herkömmlichen Tests ist, daß sie mit einem indirekten Nachweis arbeiten. Mit anderen Worten, aus der Tatsache, daß nach der Verdau­ ung ggf noch PrP 27-30 nachweisbar ist, wird geschlossen, daß es sich um den entsprechenden Protease resistenten Bereich aus PrP^Sc handelt, ohne daß die ein­ gesetzte Methode diesen sicher von einem aus PrP^c stammenden Bereich diffe­ renzieren kann. Unter ungünstigen Umständen, z. B. bei schwierig zu bearbeiten­ dem Probematerial, kann es theoretisch zu falsch positiven Ergebnissen kommen.

Aufgabe der Erfindung ist es, gattungsgemäße Verfahren so weiterzubilden, daß eine sicherere Aussage möglich ist.

Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren, das die kennzeichnenden Merk­ male des Anspruches 1 aufweist.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist vorgesehen, daß nach dem Verdau­ ungsschritt (Schritt a) die Probe in Schritt b nicht nur darauf überprüft wird, ob in ihr der Bereich PrP 27-30 enthalten ist, sondern zusätzlich geprüft wird, ob in der Probe noch Protease-sensitive Bereiche des Prion-Proteins enthalten sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt damit, gleichzeitig eine Aussage über das eventuelle Vor- bzw. Nichtvorliegen von PrP 27-30 in der verdauten Probe und eine Aussage darüber, ob die Verdauung vollständig war oder nicht.

Der positive Nachweis von PrP 27-30 in einer verdauten Probe wird nur dann als Hinweis auf PrP^Sc gewertet, wenn gleichzeitig in der verdauten Probe keinerlei Protease sensitive Bereiche des Prion-Proteins mehr nachweisbar sind. Lassen sich solche Protease sensitiven Bereiche auch nach Verdauung noch in der Probe nachweisen, so ist der eventuelle Nachweis von PrP 27-30 kein eindeutiger Hin­ weis auf PrP^Sc sondern könnte auch bedeuten, daß ein entsprechende Bereich der PrP^c-Form nicht vollständig verdaut war. In diesem Fall müßte die Probe noch einmal untersucht werden mit z. B. höheren Proteasekonzentrationen oder länge­ ren Verdauungszeiten.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich also falsch positive Untersu­ chungsergebnisse in besonders sicherer und einfacher Weise ausschließen.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung erfolgt der Nachweis von PrP 27-30 bzw. Protease sensitiver Bereiche des Prion-Proteins mittels spezifisch in den jeweiligen Bereichen am Prion-Protein-bindenden Molekülen, die im folgen­ den als Molekül A (spezifisch für einen Protease sensitiven Bereich) und Mole­ kül B (spezifisch für den Bereich PrP 27-30) bezeichnet werden sollen.

Ein übliches Verfahren gemäß dieser Ausgestaltung sieht vor, daß in Schritt a die Verdauung der Probe erfolgt und in Schritt b die Moleküle A und B der verdau­ ten Probe zugesetzt werden und überprüft wird, ob sich in der Probe Komplexe aus dem Prion-Protein mit dem Molekül A und/oder B gebildet haben. In Abhän­ gigkeit davon, ob und welche Komplexe sich gebildet haben, erfolgt dann die Auswertung.

Lassen sich nur Komplexe aus Molekül B und Prion-Protein nachweisen, so ent­ hält die Probe PrP^Sc. Liegen zusätzlich Komplexe vor, die das Molekül A enthal­ ten, so besteht die Gefahr eines falsch positiven Ergebnisses. Lassen sich keine Komplexe oder nur Komplexe mit Molekül A finden, so ist die Probe negativ.

Als Moleküle A und B können insbesondere Antikörper, die spezifisch die ent­ sprechenden Bereiche des Prion-Proteins erkennen, eingesetzt werden. Genauso gut ist es aber auch möglich, andere spezifisch bindende Moleküle z. B. RNA- Moleküle eingesetzt werden.

Der Nachweis der gebildeten Komplexe kann standardmäßig erfolgen. Zumeist ist vorgesehen, daß eine der beiden Komponenten des gebildeten Komplexes trä­ gergebunden ist. Denkbar ist z. B., daß Mikrotiterplatten eingesetzt werden, die mit Molekül A oder B beschichtet sind. Ebensogut ist es denkbar, daß das Pro­ bematerial vor Aufarbeitung fixiert wird, so daß überschüssige nicht gebundene Moleküle A und B leicht durch Waschen entfernt werden können. Denkbar ist natürlich auch, daß ohne Feststoffbindung gearbeitet wird und vor dem Nachweis eventuell gebildete Komplexe mittels Immunpräzipitation, Zentrifugation oder durch sonstige Methoden angereichert werden.

Der eigentliche Nachweis der Moleküle A und B bzw. der mit diesen Molekülen gebildeten Komplexe, kann wiederum auf übliche Weise erfolgen. Wie oben an­ gesprochen handelt es sich bei den Molekülen A und B in der Regel um Antikör­ per. Zum Nachweis können weitere Antikörper eingesetzt werden, die die Mole­ küle A und B spezifisch erkennen und die eine Markierung tragen, die einen Nachweis ermöglicht.

Der Nachweis kann z. B. mittels Elisa-Test erfolgen, d. h. die weiteren Antikörper tragen als Markierung ein Enzym, das eine spezifische nachweisbare Reaktion katalysiert. Die Antikörper könnten allerdings auch direkt z. B. mit Farbstoff mar­ kiert sein. Denkbar wäre selbstverständlich auch, daß die als Molekül A oder B eingesetzten Antikörper markiert und mit z. B. Elisa-Test nachgewiesen werden können.

Es gibt weiterhin unterschiedliche Varianten, wie das erfindungsgemäße Verfah­ ren durchgeführt werden kann.

Denkbar wäre z. B., der Probe nach Verdauung in Schritt b die Moleküle A und B gemeinsam zuzusetzen. In diesem Fall wäre es allerdings erforderlich, für die Moleküle A und B bzw. die entsprechend mit diesen Molekülen gebildeten Kom­ plexe zwei unterschiedliche Nachweissysteme vorzusehen, die deutlich vonein­ ander differenzierbare Signale liefern. Im Hinblick auf die erforderliche Auflö­ sung der beiden Signale und auch auf eine Standardisierung könnte diese Vari­ ante mit Problemen verbunden sein.

Eine besonders bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht daher vor, daß die Probe nach Verdauung in zwei Teile aufgeteilt wird und jeweils der eine Teil mit dem Molekül A und der andere Teil mit dem Molekül B versetzt wird. Beide Teilproben können dann mit gleichen Nachweissystemen auf eventuell gebildete Komplexe mit den Molekülen A oder B untersucht werden. Diese Ausgestaltung hat den Vorteil, daß keinerlei Probleme mit der Auflösung bestehen (naturgemäß) und eine besonders gute Standardisierung möglich ist.

Claims (5)

1. Verfahren zur Untersuchung von Prion-Protein enthaltenden Proben auf das eventuelle Vorliegen der PrP^Sc-Form, bei dem

• a) die Probe mit Protease versetzt wird zur Verdauung Protease sensitiver Proteine bzw. Proteinbereiche,
• b) die Probe nach Verdauung darauf überprüft wird, ob in ihr der Bereich PrP 27-30 des Prion-Proteins enthalten ist, der in der PrP^Sc-Form des Prion-Proteins Protease resistent ist und
• c) aus dem positiven Nachweis von PrP 27-30 auf das Vorlie­ gen von PrP^Sc in der Probe geschlossen wird, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt b) die Probe zusätzlich darauf überprüft wird, ob eine vollständige Verdauung des Protease sensitiven Bereichs des Prion-Proteins stattgefunden hat.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt b) die Probe mit an das Prion-Protein bindenden Molekülen A und B versetzt wird, wobei Molekül A in einem Protease sensitiven Bereich des PrP- Proteins bindet, und Molekül B im Bereich PrP 27-30 bindet, und daran anschließend eventuell in der Probe gebildete Komplexe aus Prion-Protein und den Molekülen A und/oder B nachgewiesen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die in Schritt b) eingesetzten Moleküle A und/oder B Antikörper sind.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Nachweis der Moleküle A und B über ELISA-Tests erfolgt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß im Schritt b) zunächst die Probe in zwei Ansätze aufgeteilt wird und jedem der Ansätze dann jeweils die Moleküle A oder B zugesetzt werden.