WO2005001481A1 - Nachweise von protease-resistentem prion-protein nach spontaner transformationsreaktion - Google Patents

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WO2005001481A1
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protease
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PCT/EP2004/006750
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Dieter Gassner
Ruth Golla
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F. Hoffmann-La Roche Ag
Roche Diagnostics Gmbh
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    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2828—Prion diseases

Definitions

  • the present invention relates to methods for the detection of infectious or pathogenic prion protein with improved sensitivity.
  • a de novo formation of protease-resistant prion protein PrPSc takes place through a spontaneous transformation reaction by means of interaction of non-pathogenic prion protein PrPc in the sample with protease-sensitive low-molecular PrPSc aggregates in order to form higher-molecular protease-resistant PrPSc aggregates.
  • Prions are the infectious particles responsible for transferable spongiform encephalopathies (TSE), such as Kuru, variant Creutzfeid-Jakob disease (vCJD), spongiform encephalopathy in cattle (BSE), chronic wasting disease (CWD) and scrapie.
  • TSE transferable spongiform encephalopathies
  • vCJD variant Creutzfeid-Jakob disease
  • BSE spongiform encephalopathy in cattle
  • CWD chronic wasting disease
  • scrapie The main component of prions is the glycoprotein PrPSc, which is a conformationally modified isoform of a normal cell surface protein PrPc (Prusiner, PNAS USA 95, 1363-1 383, 1 998).
  • PrPSc is able to replicate itself by converting normal prion molecules PrPc.
  • the model is based on the fact that the infectious particle is a multimeric, highly ordered aggregate of PrPSc, while a monomeric PrPSc molecule is unstable and is only stabilized by aggregation with other PrPSc molecules.
  • the rate-determining step of replication is thus the formation of a nucleus that functions to further stabilize PrPSc aggregates.
  • the PrPSc oligomer extends at the ends of the aggregate as new PrPc molecules attach, convert, and incorporate.
  • the kinetics of such a "nucleated prion replication" is thus limited by the number of PrPSc nuclei that are present in the sample and the potential for the interaction of PrPc and PrPSc with one another.
  • PrPSc The prion protein PrPSc is the only marker available to date for diagnosing diseases of the TSE type. However, the concentration of PrPSc is so low that it can only be diagnosed in the brain in the relatively late phases of a TSE disease. Thus there is only a very limited diagnostic window for the detection of TSE diseases.
  • Efforts are therefore being made to increase the sensitivity of the detection of PrPSc.
  • a method for increasing the sensitivity of the detection of PrPSc in a sample has recently been developed (Saborio et al., Nature 41 1, 810-813; 2001 and Soto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569-574, 2002, WO 02/04954).
  • This method known as protein misfolding cyclic amplification (PMCA)
  • PMCA protein misfolding cyclic amplification
  • the process usually consists of several cycles of experimentally accelerated prion replication. Each cycle consists of two phases. Interact in the first phase Smallest amounts of PrPSc with some PrPc molecules convert them and thereby induce the growth of PrPSc aggregates.
  • the method aims to achieve an exponential increase in the number of template units at the expense of a PrPc substrate with the aid of a cyclic reaction consisting of the phases of aggregation growth and multiplication of the template units.
  • the PMCA method used in the hamster model has also recently been described for other species, such as mice, sheep, goats, cattle and humans, with the indication that depending on which species was used, apparently depending on the physical state of the respective PrPSc Polymers in particular the ultrasound strength to be applied, which is necessary for the amplification, must be adapted (Anderes et al., Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1-3, 2002, Paris, France ).
  • Tzaban et al. (Biochemistry 41, 1 2868-1 2875, 2002) describe that in prion-infected hamster brains hitherto unknown protease-sensitive PrPSc species in the form of low-molecular aggregates available.
  • the protease resistance increases with the size of the aggregates.
  • Lucassen et al. (Biochem. 42 (2003), 4127-4135) describe an in vitro amplification of protease-resistant prion protein PrPSc by mixing scrapie-infected brain homogenate from hamsters or mice with homologous normal brain homogenates.
  • the object underlying the present invention was to provide a simple, fast and sensitive method for the detection of pathogenic prion protein PrPSc in a sample.
  • the solution to this problem according to the invention comprises the steps: (a) providing a sample to be examined,
  • the method according to the invention is based on the existence of protease-sensitive PrPSc aggregates (Tzaban et al., Supra) and their surprising ability to undergo a spontaneous transformation reaction to protease-resistant PrPSc aggregates.
  • the invention relates to methods for the detection of infectious prion protein with improved sensitivity.
  • PrPSc in addition to high-molecular protease-resistant PrPSc aggregates, there is also protease-sensitive, low-aggregated PrPSc in different aggregation states of heterogeneous polymer sizes.
  • This low-aggregated PrPSc can serve as a template for a spontaneous transformation reaction of an endogenously present PrPc in the sample, which allows the formation of protease-resistant PrPSc aggregates without involving amplification cycles.
  • non-pathogenic PrPc i.e. endogenous PrPc present in the sample and optionally added exogenous PrPc and its attachment to the different, low-aggregate and viable PrPSc crystallization nuclei leads to an increase in the concentration of highly aggregated and protease-resistant PrPSc polymer. This in turn leads to an increase in protease-resistant PrPSc aggregates and to a clearly recognizable increase in the sensitivity of the PrPSc detection in different detection methods.
  • the method according to the invention is suitable for the detection of prion protein from various organisms, such as cattle, mice, hamsters, sheep, Goat or human. It can be used to diagnose TSE diseases, for example in humans or also in domestic, farm and wild animals.
  • the method consists in an incubation step of a sample under membrane solubilization conditions, in which sphingomyelin / cholesterol-rich detergent-resistant membranes (DRM), so-called “lipid rafts” (Baron and Caughey, Journal Biological Chemistry 2003, Geb 1 9, e -pub, ahead of print) or caveolae-like domains (CLDs) (Vey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 93, 14945-14949, 1 996), to which apparently PrPc and PrPSc are associated via glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchors and promote the conversion of PrPc to PrPSc.
  • DRM sphingomyelin / cholesterol-rich detergent-resistant membranes
  • CLDs caveolae-like domains
  • PrPSc low-aggregated protease-sensitive PrPSc
  • rPrPSc higher-molecular protease-resistant PrPSc superaggregates
  • Step (a) of the method comprises providing a sample to be examined.
  • the sample can be derived from tissue or body fluids that may contain prion protein, such as brain, nerve tissue, or the lymphoreticular system, such as blood or blood components.
  • the samples are usually provided in the form of homogenates which contain a detergent containing "lipid raft", for example a nonionic detergent such as Triton X100. In particular in samples from bovine and human beings, preferably no ionic detergent such as SDS is added.
  • Samples from body fluids such as blood, cellular blood components, buffy coats etc. can be provided by enriching cells containing prion protein, for example by obtaining lymphocytes and other mononuclear cells from anticoagulated whole blood (for example Accuspin System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics).
  • the sample is preferably provided under almost physiological bonds, for example pH 6-8 and salt concentration corresponding to 50-500 mmol / l NaCl.
  • the sample is conveniently a protease inhibitor or a combination of protease inhibitors, e.g. B. (protease inhibitor cocktail complete, Röche Diagnostics) added to inactivate endogenous proteases present in the sample.
  • the sample is preferably used directly or freshly after homogenization, ie without freezing beforehand.
  • Step (b) of the method according to the invention preferably comprises incubating the sample under conditions in which there is a spontaneous transformation from protease-sensitive prion protein PrPSc to protease-resistant prion protein PrPSc.
  • This spontaneous transformation involves the attachment of non-pathogenic prion protein PrPc to the protease-sensitive prion protein PrPSc present in the sample.
  • exogenous non-pathogenic prion protein PrPc for example PrPc homogenate, which is able to adhere to the sample, can be added to the sample to further increase sensitivity to attach low molecular PrPSc aggregates.
  • the material added to the sample is preferably a fresh homogenate that has not been frozen after homogenization.
  • the sample is preferably incubated at a temperature of 20-55 ° C, in particular 35-50 ° C.
  • the incubation is carried out for a time sufficient to achieve an effective increase in sensitivity.
  • the incubation period is at least 10 minutes, e.g. from 10-240 min and particularly preferably from 15-120 min.
  • a disaggregation step can be carried out before step (b), in which high-molecular PrPSc aggregates originally present in the sample are disaggregated to low-molecular aggregates.
  • a step can include a single ultrasound treatment.
  • the method according to the invention without disaggregation of the aggregates formed in step (b) and in particular without amplification cycles, i.e. in particular without several successive ultrasound / incubation cycles.
  • the protease according to (c) of the method according to the invention is selected so that it is able to cleave non-pathogenic prion protein PrPc, while PrPSc is largely resistant to the cleavage, at least from high molecular weight aggregates.
  • An example of a suitable protease is Proteinase K. Proteinase K with a concentration of 50-100 tg / nl is particularly preferably used.
  • Step (d) of the method according to the invention comprises the determination of protease-resistant prion protein PrPSc in the sample.
  • This determination can be made qualitatively or / and quantitatively by all methods known in the prior art. Examples of suitable methods are immunological methods in which pathogenic prion protein is determined by reaction with a specific antibody.
  • the prion protein is determined by a Western blot.
  • the sample is electrophoretically separated under denaturing conditions, for example by SDS-PAGE, and the proteins contained therein are blotted onto a suitable membrane, for example a nitrocellulose or polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • the prion protein is made visible by reaction with polyclonal or monoclonal anti-prion antibodies, which can be labeled directly or can be detected by a labeled secondary antibody. Enzymatic labeling using a detectable substrate, for example a chemiluminescent substrate, is preferred. Commercially available anti-prion antibodies are mentioned in the examples.
  • the determination can also be carried out by an immunoassay, the sample being brought into contact with suitable detection reagents without prior electrophoretic separation.
  • the immunoassay is a sandwich assay using a solid phase, e.g. a biotinylated, and a labeled, e.g. an enzyme-labeled antibody against the prion protein.
  • the detection is particularly preferably carried out by a sandwich ELISA, an anti-prion antibody and an enzyme-antibody conjugate being used as the labeled secondary antibody together with a detectable enzyme substrate.
  • BSE beef homogenate (20% in 10% sucrose, ribolyzer), obtained from the obex region of the medulla oblongata (VLA case 99/00946), was diluted 10-fold with ice-cold:
  • Hamster homogenate (Hamster PrPc) was used as a control for comparison with bovine PrPc.
  • the homogenates were made using a Ribolyzer in homogenization vessels with Hybaid ceramic beads. After homogenization of normal brains in PBS buffer containing protease inhibitor cocktail complete, Triton-X100, as previously specified, was added and the samples were centrifuged at 3000 g for 3 min in an Eppendorf centrifuge.
  • the samples were digested with Proteinase K (100 // g / ml for 60 min at 37 ° C.). The reaction was stopped by adding the proteinase inhibitor PMSF to a final concentration of 40 mM. The samples were subjected to SDS-PAGE, followed by electroblotting on a PVDF membrane.
  • the membranes were blocked, washed (Dig-Block and Wash Buffer Reagent, Röche Diagnostics) and incubated with the monoclonal anti-prion antibody L42 (R-Biopharm, Darmstadt, 250 ng / ml, 1 h, room temperature), followed by incubation with sheep anti-mouse Ig alkaline phosphatase conjugate (40 mU / ml) - Fab fragment (Röche Diagnostics) for 30 min.
  • the reactivity on the membrane was developed using a CDP-Star chemiluminescent substrate (10 min), followed by visualization with a Lumilmager system (Röche Diagnostics).
  • the monoclonal anti-prion antibody L42 reacts with human, bovine and sheep PrP, but at most has a very weak reactivity with hamster PrP in a Western blot.
  • the results shown in FIGS. 1 and 2 show that a strong improvement in sensitivity was achieved by incubation at 47 ° C. A further increase in sensitivity was achieved by one-time sonification before incubation.
  • Hamster scrapie brains were homogenized using a sterile tissue crusher in Hank's balanced saline to obtain a 10% homogenate and centrifuged at about 2000 g for 15 minutes. The resulting supernatant was stored at -70 ° C.
  • 10% normal hamster brain homogenates were prepared using an Ultraturrax homogenizer in ice-cold PBS buffer containing protease inhibitor cocktail, Röche Diagnostics. Triton-X1 00 was added to a final concentration of 0.5% and the samples were centrifuged in an Eppendorf centrifuge at 3000 g for 3 min. As a control, 10% bovine brain homogenate was produced from the obex region of the medulla oblongata.
  • the samples were digested with Proteinase K (100 ⁇ g / ml for 60 min at 37 ° C.). The reaction was stopped by adding Pef to a final concentration of 10 mM. The samples were subjected to SDS-PAGE; followed by electroblotting on a PVDF membrane.
  • the membranes were blocked / washed (Dig-Block and Wash Buffer Reagent, Röche Diagnostics) and incubated with the 3F4 monoclonal anti-prion antibody (Signet Laboratories, USA, 500 ng / ml, 1 h, room temperature), followed by incubation with Sheep-anti-mouse-IgG-alkaline phosphatase conjugate (40 mU / ml) Fab fragment (Röche Diagnostics) for 30 min. The reactivity on the membrane was developed using the CDP-Star chemiluminescent substrate (15 min), followed by visualization using the Lumilmager system (Röche Diagnostics).
  • the monoclonal antibody 3F4 reacts with human and hamster PrP, but does not recognize bovine PrP in the Western blot.
  • the results of the experiment are shown in Figure 3.
  • the monoclonal antibody 3F4 reacts with immunoreactive peptide digestion products in the running front of the SDS gel after the Western blot due to the fact that hamster PrPc is still present in excess in the lanes 4 and 11.
  • a single ultrasound treatment results in a significant increase in PrPSc at the expense of PrPc (lanes 5/1 2; see the arrow in the figure).
  • Lanes 6-9 and 13-1 6 are characterized by the application of the PMCA method (2-5 cycles). A decrease in detectable PrPSc can be seen in lanes 9 and 1 6.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem bzw. pathogenem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt eine de novo Bildung von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc durch spontane Transformationsreaktion mittels Wechselwirkung von nichtpathogenem Prion-Protein PrPc in der Probe mit Protease-sensitiven niedermolekularen PrPSc-Aggregaten, um höhermolekulare Protease-resistente PrPSc-Aggregate zu bilden.

Description

Nachweis von Protease-resistentem Prion-Protein nach spontaner Transformationsreaktion Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem bzw. pathogenem Prion-Protein mit verbesserter Sensitivität. Hierzu erfolgt eine de novo Bildung von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc durch spontane Transformationsreaktion mittels Wechselwirkung von nicht- pathogenem Prion-Protein PrPc in der Probe mit Protease-sensitiven niedermolekularen PrPSc-Aggregaten, um höhermolekulare Protease- resistente PrPSc-Aggregate zu bilden.
Prionen sind die für übertragbare spongiforme Encephalopathien (TSE), wie etwa Kuru, Variante Creutzfeid-Jakob-Krankheit (vCJD), Spongiforme Encephalopathie beim Rind (BSE), chronische Auszehrungskrankheit (CWD) und Scrapie, verantwortlichen infektiösen Partikel. Der Hauptbestandteil von Prionen ist das Glycoprotein PrPSc, bei dem es sich um eine konformationell modifizierte Isoform eines normalen Zeiloberflächenproteins PrPc handelt (Prusiner, PNAS USA 95, 1363-1 383, 1 998). Das Krankheits- assoziierte Prionmolekül PrPSc ist in der Lage, sich durch Konversion von normalen Prionmolekülen PrPc zu replizieren.
Es wird angenommen, dass die Prionenreplikation nach dem "Nukleation/Polymerisations"-Modell erfolgt, basierend auf einem thermodynamischen Gleichgewicht von PrPc und PrPSc in Lösung (Jarrett and Landsbury, Cell, Vol 73, 1055-1058, 1993; Masel, Jansen and Nowak, Biophys. Chem. 77, 1 39-1 52, 1 999).
Das Modell basisert auf der Grundlage, dass das infektiöse Partikel ein multimeres, hoch geordnetes Aggregat von PrPSc darstellt, während ein monomeres PrPSc-Molekül unstabil ist und erst durch Aggregation mit anderen PrPSc-Molekülen stabilisiert wird. Der Geschwindigkeitsbestimmende Schritt der Replikation ist somit die Bildung eines Nukleus, der zur weiteren Stabilisierung von PrPSc-Aggregaten fungiert.
Das PrPSc-Oligomer verlängert sich an den Enden des Aggregats und zwar in dem Maße, wie neue PrPc-Moleküle angelagert, konvertiert und inkorporiert werden. Die Kinetik einer solchen "nukleierten Prionenreplikation" ist somit begrenzt durch die Anzahl von PrPSc-Nuklei, die in der Probe vorhanden sind und dem Potenzial der Interaktion von PrPc und PrPSc miteinander.
Zur Diagnose von Erkrankungen des TSE-Typs steht das Prion-Protein PrPSc als bisher einziger Marker zur Verfügung. Die Konzentration von PrPSc ist jedoch so gering, dass es selbst im Gehirn nur in den relativ späten Phasen einer TSE-Erkrankung diagnostisch nachweisbar ist. Somit existiert nur ein recht beschränktes diagnostisches Fenster zum Nachweis von TSE-Erkrankungen.
Es gibt daher Bestrebungen, die Sensitivität des Nachweises von PrPSc zu steigern. Basierend auf dem obigen Modell der Prionenreplikation wurde vor Kurzem ein Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität des Nachweises von PrPSc in einer Probe entwickelt (Saborio et al., Nature 41 1 , 810-813; 2001 und Soto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569-574, 2002, WO 02/04954). Dieses als Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA) bezeichnete Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer zu untersuchenden Probe mit nicht-pathogenem PrPc, wobei in der Probe vorhandene kleine Mengen an PrPSc mit zugesetztem PrPc unter Bildung von Aggregaten interagieren, das Desaggregieren gebildeter Aggregate und das Bestimmen von pathogenem PrPSc in der Probe. Üblicherweise besteht das Verfahren aus mehreren Zyklen einer experimentell beschleunigten Prionenreplikation. Jeder Zyklus besteht aus zwei Phasen. In der ersten Phase interagieren kleinste Mengen von PrPSc mit einigen PrPc-Molekülen, konvertieren diese und induzieren dadurch das Wachstum von PrPSc-Aggregaten.
In der zweiten Phase werden diese Aggregate durch die Applikation von Ultraschallwellen in kleine Teile zerlegt, wodurch die Anzahl von potenziellen Nuklei in jedem Zyklus exponentiell gesteigert wird. Die zyklische Natur der Methode erlaubt zumindest theoretisch soviele Zyklen bis der gewünschte Amplifizierungsstatus für die Detektion von PrPSc erreicht ist.
Letztlich hat die Methode das Ziel, einen exponentiellen Anstieg in der Anzahl von Templat-Einheiten zu erreichen und zwar auf Kosten eines PrPc- Substrates mit Hilfe einer zyklischen Reaktion, welche aus den Phasen Aggregationswachstum und Multiplikation der Templat-Einheiten besteht.
Das im Hamster-Modell angewandte PMCA-Verfahren wurde kürzlich ebenfalls für andere Spezies, wie Maus, Schaf, Ziege, Rind und Mensch, beschrieben mit dem Hinweis, dass in Abhängigkeit mit welcher Spezies gearbeitet wurde, offenbar in Abhängigkeit vom Aggregatzustand der jeweiligen PrPSc-Polymere insbesondere die zu applizierende Ultraschallstärke, die zur Amplifikation notwendig ist, angepasst werden muss (Anderes et al., Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1 .-3., 2002, Paris, France).
Die zyklische Methode zur Prionenamplifikation erscheint jedoch technisch anfällig und benötigt in der beschriebenen Art und Weise lange Inkubations- Sonifizierungs-Zyklen.
Tzaban et al. (Biochemistry 41 , 1 2868-1 2875, 2002) beschreiben, dass in Prionen-infizierten Hamstergehirnen bisher noch unbekannte Protease- sensitive PrPSc-Spezies in Form von niedermolekularen Aggregaten vorliegen. Mit zunehmender Größe der Aggregate nimmt die Proteaseresistenz zu. Es findet sich jedoch keinerlei konkreter Hinweis auf eine mögliche diagnostische Relevanz dieser Beobachtung.
Lucassen et al. (Biochem. 42 (2003), 4127-4135) beschreiben eine in vitro Amplifikation von Protease-resistentem Prion Protein PrPSc durch Vermischen von Scrapie-infiziertem Hirnhomogenat aus Hamster oder Maus mit homologen Normalhirnhomogenaten.
Horiuchi et al. (PNAS USA, 97 (2000), 5836-5841 ) untersuchen Bindungsinteraktionen zwischen heterologen und homologen Maus- und Hamster-PrP-lsoformen. Nach diesen Ergebnissen ist die homologe PrP-sen Bindung an PrP-res nicht begünstigt gegenüber einer heterologen PrP-sen Bindung.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin, ein einfaches, schnelles und sensitives Verfahren zum Nachweis von pathogenem Prion-Protein PrPSc in einer Probe bereitzustellen. Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe umfasst die Schritte: (a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe,
(b) Transformieren von endogen in der Probe vorhandenem Protease- sensitivem pathogenem Prion-Protein PrPSc durch Wechselwirkung mit nicht-pathogenem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc ohne Desaggregation von gebildeten PrPSc- Aggregaten,
(c) Inkubieren mit Protease und
(d) Bestimmen von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc in der Probe.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf der Existenz von Protease- sensitiven PrPSc-Aggregaten (Tzaban et al., supra) und deren überraschenden Fähigkeit, eine spontane Transformationsreaktion zu Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten einzugehen.
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis von infektiösem Prion- Protein mit verbesserter Sensitivität. Es erfolgt eine de novo Bildung von Protease-resistentem PrPSc durch spontane Transformationsreaktion mittels Wechselwirkung von endogenem natürlichen PrPc in der Probe mit Protease-sensitiven niedermolekularen PrPSc-Aggregaten, um höhermolekulare Protein-resistente PrPSc-Aggregate zu bilden.
Dabei wird davon ausgegangen, dass in einer für PrPSc positiven Probe neben hochmolekularen Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten auch Protease-sensitives niederaggregiertes PrPSc in unterschiedlichen Aggregationszuständen von heterogenen Polymergrößen existiert. Dieses niederaggregierte PrPSc kann einem endogen in der Probe vorhandenen PrPc als Templat für eine spontane Transformationsreaktion dienen, welche die Bildung von Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten ohne Einschaltung von Amplifikationszyklen erlaubt.
Unter entsprechenden Bedingungen wird somit durch in der Probe vorhandenes nicht-pathogenes PrPc, d.h. endogenes in der Probe vorhandenes PrPc und gegebenenfalls zugesetztes exogenes PrPc und dessen Anlagerung an die unterschiedlichen niederaggregierten und wachstumsfähigen PrPSc-Kristallisationskeime eine Erhöhung der Konzentration von hochaggregiertem und Protease-resistentem PrPSc- Polymer herbeigeführt. Dies führt wiederum zu einer Vermehrung von Protease-resistenten PrPSc-Aggregaten und zu einem klar erkennbaren Anstieg der Sensitivität des PrPSc-Nachweises in unterschiedlichen Detektionsverfahren.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zum Nachweis von Prion- Protein aus verschiedenen Organismen, wie Rind, Maus, Hamster, Schaf, Ziege oder Mensch. Es kann zur Diagnose von TSE-Erkrankungen, beispielsweise bei Menschen oder aber auch bei Haus-, Nutz- und Wildtieren, eingesetzt werden.
In ihrer einfachsten Ausführung besteht die Methode in einem Inkubationsschritt einer Probe unter Membransolubilisierungsbedingungen, bei denen Sphingomyelin/Cholesterin-reiche Detergenz-resistente Membranen (DRM), sogenannte "Lipid Rafts" (Baron and Caughey, Journal Biological Chemistry 2003, Geb 1 9, e-pub, ahead of print) bzw. Caveolae- artige Domänen (CLDs) (Vey et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Vol. 93, 14945-14949, 1 996) vorliegen, an welche offenbar PrPc und PrPSc via Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Ankern assoziiert sind und die eine Konversion von PrPc zu PrPSc fördern.
Unter entsprechenden Bedingungen findet dann durch PrPc/PrPSc-"Lipid Raft"-lnteraktion eine sogenannte spontane Transformationsreaktion statt, resultierend in einer Verschiebung von niederaggregiertem Protease- sensitivem PrPSc (sPrPSc) zu höhermolekularen Protease-resistenteren PrPSc-Superaggregaten (rPrPSc).
Die Vorteile des Verfahrens liegen auf der Hand: einfache Durchführbarkeit, Ausnutzung von endogenem PrPc-Substrat Ausnutzung von endogen vorhandenem, durch Proteaseverdau bisher verlorenem, niederaggregiertem sPrPSc und Transformation desselben zu hochaggregiertem rPrPSc zur Sensitivitätssteigerung einer konventionellen Nachweismethode. Sensitivitätssteigerung beim Nachweis von PrPSc in Geweben und z.B. zellulären Blutbestandteilen, wie Buffy Coat etc., in welchen nur geringe Konzentrationen von PrPSc (im Protease-sensitiven, also sPrPSc-Status)-Templat existieren bei potenziell hohem vorhandenen PrPc-Gehalt. Schritt (a) des Verfahrens umfasst die Bereitstellung einer zu untersuchenden Probe. Die Probe kann aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, die Prion-Protein enthalten können, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulären System, z.B. Blut oder Blutbestandteilen, stammen. Die Proben werden üblicherweise in Form von Homogenaten bereitgestellt, die ein "Lipid Raft" erhaltendes Detergenz, z.B. ein nichtionisches Detergenz, wie etwa Triton X100 enthalten. Insbesondere bei Proben aus Rind und Mensch wird vorzugsweise kein ionisches Detergenz wie etwa SDS zugesetzt. Proben aus Körperflüssigkeiten wie etwa Blut, zellulären Blutbestandteilen, Buffy Coats etc. können durch Anreicherung von Prion-Protein enthaltenden Zellen bereitgestellt werden, z.B. durch Gewinnung von Lymphozyten und anderen mononukleären Zellen aus antikoaguliertem Gesamtblut (z.B. Accuspin System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics). Die Probe wird vorzugsweise unter nahezu physiologischen Bindungen, z.B. pH 6-8 und Salzkonzentration entsprechend 50-500 mmol/l NaCI bereitgestellt. Der Probe wird günstigerweise ein Proteasehemmer oder eine Kombination von Proteasehemmern, z. B. (Protease-Inhibitor-Cocktail complete, Röche Diagnostics) zugesezt, um in der Probe vorhandene endogene Proteasen zu inaktivieren. Die Probe wird vorzugsweise nach der Homogenisierung direkt bzw. frisch, d.h. ohne vorheriges Einfrieren eingesetzt.
Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst vorzugsweise eine Inkubation der Probe unter Bedingungen, bei denen eine spontane Transformation von Protease-sensitivem Prion-Protein PrPSc zu Protease- resistentem Prion-Protein PrPSc erfolgt. Diese spontane Transformation umfasst eine Anlagerung von nicht-pathogenem Prion-Protein PrPc an das in der Probe vorhandene Protease-sensitive Prion-Protein PrPSc.
Gegebenenfalls kann der Probe zur weiteren Sensitivitätssteigerung exogenes nicht-pathogenes Prion-Protein PrPc, z.B. PrPc-Homogenat zugesetzt werden, welches in der Lage ist, sich an in der Probe vorhandene niedermolekulare PrPSc-Aggregate anzulagern. Das der Probe zugesetzte Material ist vorzugsweise ein frisches Homogenat, das nach der Homogenisierung nicht eingefroren wurde.
Die Probe wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 20-55 °C, insbesondere von 35-50 °C, inkubiert. Die Inkubation erfolgt für eine Dauer, die ausreicht, um eine wirksame Sensitivitätssteigerung zu erzielen. Vorzugsweise beträgt die Inkubationsdauer mindestens 10 min, z.B. von 10-240 min und besonders bevorzugt von 15-120 min. Gegebenenfalls kann vor Schritt (b) ein Desaggregierungsschritt durchgeführt werden, bei dem in der Probe ursprünglich vorhandene hochmolekulare PrPSc- Aggregate zu niedermolekularen Aggregaten desaggregiert werden. Beispielsweise kann ein solcher Schritt eine einmalige Ultraschallbehandlung umfassen. Es ist jedoch klarzustellen, dass das erfindungsgemäße Verfahren ohne Desaggregierung der in Schritt (b) gebildeten Aggregate und insbesondere ohne Amplifikationszyklen, d.h. insbesondere ohne mehrere aufeinander folgende Ultraschall/Inkubationszyklen, durchgeführt wird.
Die Protease gemäß (c) des erfindungegemäßen Verfahrens wird so gewählt, dass sie in der Lage ist, nicht-pathogenes Prion-Protein PrPc zu spalten, während PrPSc zumindest aus hochmolekularen Aggregaten weitgehend gegen die Spaltung resistent ist. Ein Beispiel für eine geeignete Protease ist Proteinase K. Besonders bevorzugt verwendet man Proteinase K einer Konzentration von 50-100 tg/nl.
Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Bestimmung von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc in der Probe. Diese Bestimmung kann nach allen im Stand der Technik bekannten Verfahren qualitativ oder/und quantitativ erfolgen. Beispiele für geeignete Methoden sind immunologische Verfahren, bei denen pathogenes Prion-Protein durch Reaktion mit einem spezifischen Antikörper bestimmt wird. ln einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Bestimmung von Prion-Protein durch einen Westernblot. Hierzu wird die Probe unter denaturierenden Bedingungen, z.B. durch SDS-PAGE, elektrophoretisch aufgetrennt und die darin enthaltenen Proteine auf eine geeignete Membran, z.B. eine Nitrocellulose- oder Polyvinylidenfluorid (PVDF)- Membran, geblottet. Dort wird das Prion-Protein durch Reaktion mit polyklonalen oder monoklonalen Anti-Prion-Antikörpern sichtbar gemacht, die direkt markiert sein können oder durch einen markierten Sekundärantikörper nachgewiesen werden können. Bevorzugt ist hierbei eine enzymatische Markierung unter Verwendung eines nachweisbaren Substrats, z.B. eines Chemilumineszenz-Sύbstrats. Kommerziell verfügbare Anti-Prion-Antikörper sind in den Beispielen genannt.
Andererseits kann die Bestimmung auch durch einen Immunoassay erfolgen, wobei die Probe - ohne vorherige elektrophoretische Auftrennung - mit geeigneten Nachweisreagenzien in Kontakt gebracht wird. Bevorzugt wird der Immunoassay als Sandwich-Assay unter Verwendung eines Festphasen-seitigen, z.B. eines biotinylierten, und eines markierten, z.B. eines Enzym-markierten Antikörpers gegen das Prion-Protein durchgeführt. Besonders bevorzugt erfolgt der Nachweis durch einen Sandwich-ELISA, wobei ein Anti-Prion-Antikörper und als markierter Sekundärantikörper ein Enzym-Antikörper-Konjugat zusammen mit einem nachweisbaren Enzymsubstrat verwendet wird.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Beispiele erläutert werden. Beispiele
Beispiel 1 : Amplifizierung von Rinder-PrPSc durch spontane Transformationsreaktion
BSE-Rinderhimhomogenat (20 % in 10 % Saccharose, Ribolyser), gewonnen aus der Obexregion der Medulla oblongata (VLA Fall 99/00946) wurde 10Ofach verdünnt mit eiskaltem:
(a) normalem Rinderhirnhomogenat, gewonnen aus der Obexregion der Medulla oblongata (10 % Homogenat in PBS-Puffer enthaltend Protease-lnhibitor-Cocktail complete, Röche Diagnostics, + 0,5 % Triton-X100) oder
(b) 10 % normalem Hamsterhirnhomogenat ( 10 % Homogenat in PBS- Puffer mit Protease-lnhibitor-Cocktail complete, Röche Diagnostics, + 0,5 % Triton-X100).
Das Hamsterhomogenat (Hamster PrPc) wurde als Kontrolle zum Vergleich mit Rinder-PrPc verwendet.
Die Homogenate wurden unter Verwendung eines Ribolysergeräts in Homogenisationsgefäßen mit Keramikbeads von Hybaid hergestellt. Nach Homogenisierung von Normalhirnen in PBS-Puffer, enthaltend Protease- lnhibitor-Cocktail complete, wurde Triton-X100, wie zuvor spezifiziert, zugegeben und die Proben bei 3000 g für 3 min in einer Eppendorf- Zentrifuge zentrifugiert.
Die Überstände von Normalhirnen wurden in ein Eisbad gegeben und wie zuvor spezifiziert mit BSE-Hirnhomogenat vermischt. 200 μ\ Aliquote wurden den folgenden Behandlungsprozeduren unterzogen, wobei 0 min bedeutet, dass die Proben im Eisbad gehalten wurden.
Es wurden folgende Proben in Figur 1 untersucht: Molekulargewichtsmarker: Figur 1 , Bahn 2;
Normales Rinderhirn (Verdauungskontrolle): Figur 1 , Bahn 3;
BSE-Rinderhirn, verdünnt mit normaler Hamsterprobe: Figur 1 , Bahn 4;
BSE-Rinderhirn, verdünnt mit normaler Rinderprobe:
Inkubation bei Raumtemperatur (25 °C) für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 1 , Bahnen 5-8;
Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 1 , Bahnen 9-1 2;
Einmalige Sonifizierung ( 1 Puls mit 1 5 sec, Intensität 50 %) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler) : Figur 1 , Bahnen 1 3-1 6;
Es wurden folgende Proben in Figur 2 untersucht:
Molekulargewichtsmarker: Figur 2, Bahn 1 ;
Normales Hamsterhirn (Verdauunqskontrolle): Figur 2, Bahn 2;
BSE-Rinderhirn verdünnt mit normaler Hamsterprobe:
Inkubation bei Raumtemperatur (25 °C) für 0/60 min unter Schütteln bei
500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 2, Bahnen 3-4;
Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 2, Bahnen 5-6; Einmalige Sonifizierung (1 Puls mit 1 5 sec, Intensität 50 %) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin) ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3) gefolgt von Inkubation bei 47 °C für 0/60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 2, Bahnen 7- 8;
Normales Rinderhirn (Verdauunqskontrolle): Figur 2, Bahn 9;
BSE-Rinderhirn, verdünnt mit Rinderprobe:
Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min unter Schütteln: Figur 2, Bahnen 10-1 3;
Einmalige Sonifizierung und Inkubation bei 47 °C für 0/1 5/30/60 min: Figur 2, Bahnen 14-1 7;
Unmittelbar anschließend wurden die Proben mit Proteinase K (100 //g/ml für 60 min bei 37 °C) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Proteinaseinhibitors PMSF auf eine Endkonzentration von 40 mM gestoppt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen, gefolgt von Elektroblotten auf eine PVDF-Mambran. Die Membranen wurden blockiert, gewaschen (Dig-Block- und Waschpuffer-Reagenz, Röche Diagnostics) und mit dem monoklonalen Anti-Prionenantikörper L42 (R-Biopharm, Darmstadt, 250 ng/ml, 1 h, Raumtemperatur) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Schaf-Anti-Maus-lg-alkalische Phosphatase-Konjugat (40 mU/ml) - Fab- Fragment (Röche Diagnostics) für 30 min. Die Reaktivität auf der Membran wurde durch Verwendung eines CDP-Star Chemilumineszenzsubstrats entwickelt (10 min), gefolgt durch Visualisierung mit einem Lumilmager- System (Röche Diagnostics). Der monoklonale Anti-Prionen-Antikörper L42 reagiert mit humanem, Rinder- und Schaf-PrP, hat aber allenfalls eine sehr schwache Reaktivität mit Hamster-PrP im Westernblot. Die in den Figuren 1 und 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass durch Inkubation bei 47 °C eine starke Sensitivitätsverbesserung erzielt wurde. Durch einmalige Sonifizierung vor der Inkubation konnte ein weiterer Sensitivitätsgewinn erreicht werden.
Beispiel 2: Amplifizierung von Hamster-PrPSc durch spontane Transformationsreaktion
Hamster-Scrapiehirne wurden unter Verwendung eines sterilen Gewebezerkleinerers in Hank's balancierter Salzlösung unter Gewinnung eines 10 %igen Homogenats homogenisiert und durch etwa 2000 g für 1 5 min zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde bei -70 °C aufbewahrt.
10 %ige Normal-Hamster-Hirnhomogenate wurden unter Verwendung eines Ultraturraxhomogenisators in eiskaltem PBS-Puffer, enthaltend Protease- lnhibitor-Cocktail, Röche Diagnostics, hergestellt. Triton-X1 00 wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben und die Proben in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 3000 g für 3 min zentrifugiert. Als Kontrolle wurde 10 %iges Rinderhirnhomogenat aus der Obexregion der Medulla oblongata hergestellt.
Überstände aus Normalhirnen wurden mit Hamsterscrapiehirnhomogenat (1 : 1 60, 1 :320) vermischt. 60 μ\ Aliquots wurden den folgenden Behandlungsschritten unterzogen und in Figur 3 untersucht:
Molekulargewichtsmarker: Figur 3, Bahn 1
Normales Hamsterhirn (Verdauungskontrolle): Figur 3, Bahn 2;
Scrapie-Hamsterhirn, verdünnt: Inkubation von Hamster-PrPSc mit Hamster-PrPc oder Rinder-PrPc als Kontrolle bei Raumtemperatur (25 °C) für 30 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 3, Bahnen 3 und 4 (Verdünnung 1 :1 60) und Bahnen 10 und 1 1 (Verdünnung 1 :320);
Einmalige Sonifizierung (10 Pulse von jeweils 0,9 sec mit 50 % Intensität) unter Verwendung eines Mikrosonicators (Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin), ausgestattet mit einem Becherresonator (BR30) und einer Probenhaltevorrichtung (EH3), gefolgt von einer Inkubation bei 47 °C 60 min unter Schütteln bei 500 Upm (Eppendorf-Schüttler): Figur 3, Bahn 5 (Verdünnung 1 : 1 60) und Bahn 1 2 (Verdünnung 1 :320).
Die Sonifizierungs/Inkubationszyklen wurden 2-5x durchgeführt: Figur 3, Bahnen 6-9 (Verdünnung 1 : 1 60) und Bahnen 13-1 6 (Verdünnung 1 :320).
Unmittelbar anschließend wurden die Proben mit Proteinase K (1 00 μg/ml für 60 min bei 37 °C) verdaut. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Pef ablock bis zu einer Endkonzentration von 10 mM gestoppt. Die Proben wurden einer SDS-PAGE unterzogen; gefolgt von Elektroblotten auf eine PVDF-Membran. Die Membranen wurden blockiert/gewaschen (Dig-Block- und Wasch-Pufferreagenz, Röche Diagnostics) und mit dem monoklonalen Anti-Prionenantikörper 3F4 (Signet Laboratories, USA, 500 ng/ml, 1 h, Raumtemperatur) inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Schaf-Anti- Maus-lgG-alkalischem Phosphatasekonjugat (40 mU/ml) Fab-Fragment (Röche Diagnostics) für 30 min. Die Reaktivität auf der Membran wurde unter Verwendung des CDP-Star Chemilumineszenz-Substrats entwickelt ( 1 5 min), gefolgt durch Visualisierung unter Verwendung des Lumilmagersystems (Röche Diagnostics). Der monoklonale Antikörper 3F4 reagiert mit humanem und Hamster-PrP, erkennt im Westernblot jedoch kein Rinder-PrP. Die Ergebnisse des Experiments sind in Figur 3 dargestellt. Wie durch den Pfeil in der Figur ersichtlich, reagiert der monoklonale Antikörper 3F4 mit immunreaktiven Peptid- Verdauungsprodukten in der Lauffrontdes SDS-Gels nach dem Westernblot aufgrund der Tatsache, dass Hamster-PrPc immer noch in Überschuss in den Aufgabespuren 4 und 1 1 vorliegt. Eine einzige Ultraschallbehandlung führt zu einem signifikanten Anstieg von PrPSc auf Kosten von PrPc (Bahnen 5/1 2; vgl. den Pfeil in der Figur). Die Spuren 6-9 und 13-1 6 zeichnen sich durch eine Anwendung der PMCA-Methode (2-5 Zyklen) aus. Es ist eine Abnahme an nachweisbarem PrPSc in den Spuren 9 und 1 6 zu erkennen.

Claims

Ansprüche
1 . Verfahren zum Nachweis von Prion-Protein PrPSc in einer Probe, umfassend die Schritte: (a) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe, (b) Transformieren von endogen in der Probe vorhandenem Protease-sensitivem pathogenem Prion-Protein PrPSc durch Wechselwirkung mit nicht-pathogenem Prion-Protein PrPc zu Protease-resistentem Prion-Protei n PrPSc, ohne Desaggregation von gebildeten PrPSc-Aggregaten, (c) Inkubieren mit Protease und (d) Bestimmen von Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc in der Probe.
2. Verfahren nach Anspruch 1 zum Nachweis von Prion-Protein aus Rind, Maus, Hamster, Schaf, Ziege oder Mensch.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe aus Gewebe oder Körperflüssigkeiten, wie etwa Hirn, Nervengewebe oder dem lymphoretikulärem System stammt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Detergenz enthaltende Probe untersucht.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (b) eine Inkubation der Probe unter Bedingungen umfasst, bei denen eine spontane Transformation von Protease- sensitivem Prion-Protein PrPSc zu Protease-resistentem Prion-Protein PrPSc erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation bei einer Temperatur von 20-55 °C, insbesondere von 40-50 °C, erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Inkubation für eine Zeitdauer von mindestens 1 0 min, insbesondere von 10-1 20 min, erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass vor Schritt (b) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Probe exogenes nicht-pathogenes Prion-Protein PrPc zugesetzt wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass homologes nicht-pathogenes Prion-Protein PrPc zugesetzt wird.
1 1 . Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (c) die Proteinase K verwendet wird.
1 2. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass man Proteinase K in einer Konzentration von 50-100 μng/ml verwendet.
1 3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) eine quantitative Bestimmung erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (d) die Bestimmung durch ein immunologisches Verfahren erfolgt.
1 5. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Western-Blot erfolgt.
1 6. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Immunoassay erfolgt.
1 7. Verfahren nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung durch einen Sandwich-Assay, insbesondere durch einen Sandwich-ELISA, erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 7 zur Diagnose von TSE-Erkrankungen.
19. Verfahren nach Anspruch 18 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen beim Menschen.
0. Verfahren nach Anspruch 18 zum Nachweis von TSE-Erkrankungen bei Haus-, Nutz- und Wildtieren.
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