DE69823985T2

DE69823985T2 - Nachweis der krankheitsbedingten konformation eines proteins

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Publication number: DE69823985T2
Application number: DE69823985T
Authority: DE
Inventors: B. Stanley PRUSINER; G. Jiri SAFAR
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2018-02-21
Also published as: DE69823985D1; JP2001516448A; EP0970372B1; AU725844B2; DE970372T1; BR9807600A; EP1416281A2; JP3774236B2; WO1998037411A1; CA2278577A1; US5891641A; ATE267394T1; EP0970372A1; AU6168898A; EP1416281A3; ES2218807T3; EP0970372A4

Description

Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen Immuntests. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Test, der den Nachweis einer Krankheit, die mit der Konformationsform eines Proteins (wie PrP^Sc) verbunden ist, die eine sehr geringe Antikörperbindungsaffinität aufweisen kann und ferner die Identifikation des für diese Krankheit verantwortlichen bestimmten Stamms gewährt.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Prionen sind infektiöse Pathogene, die ausnahmslos tödliche Prionenkrankheiten (spongiforme Enzephalopathien) des zentralen Nervensystems bei Mensch und Tier verursachen. Prionen unterscheiden sich deutlich von Bakterien, Viren und Viroiden. Die vorhenschende Hypothese ist, dass keine Nukleinsäure nötig ist, um die Infektiösität eines Prionproteins voranschreiten zu lassen.
Bei einem Hauptschritt in der Studie von Prionen und der durch sie verursachten Krankheiten handelte es sich um die Entdeckung und Reinigung eines als Prionprotein bezeichneten Proteins [Bolton, McKinley et al. (1982) Science 218: 1309–1311; Prusiner, Bolton et al.. (1982) Biochemistry 21: 6942: 6950; Mc-Kinley, Bolton et al. (1983) Cell 35: 57–62]. Vollständige Prionprotein kodierende Gene wurden daher geklont, sequenziert und in transgene Tiere exprimiert. PrP^C wird durch ein Einzelkopiewirtsgen [Basler, Oesch et al. (1986) Cell 46: 417–428] kodiert, und wenn PrP^C exprimiert wird, ist es im Allgemeinen auf der Außenoberfläche von Neuronen zu finden. Viele Beweisreihen zeigen, dass Prionkrankheiten aus der Transformation der normalen Form von Prionprotein (PrP^C) zu der abnormalen Form (PrP^SC) führen. Es gibt keinen nachweisbaren Unterschied in der Aminosäuresequenz der beiden Formen. Jedoch weist PrP^SC im Vergleich zu PrP^C eine Konformation mit höherem β-Faltblatt und geringerem α-Helixgehalt auf [Pan, Baldwin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10962–10966; Safar, Roller et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 20276–20284]. Die Gegenwart der abnormalen PrP^SC-Form in Gehirnen von infizierten Menschen oder Tieren ist das einzige krankheitsspezifische diagnostische Erkennungsmerkmal von Prionkrankheiten.
PrP^SC spielt sowohl bei der Übertragung als auch bei der Pathogenese von Prionkrankheiten (spongiformen Enzephalopathien) eine Schlüsselrolle und ist ein entscheidender Faktor bei der Neuronendegeneration [Prusiner (1977) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2. Ausgabe: 103–143]. Bei den verbreitesten Prionkrankheiten bei Tieren handelt es sich um die Traberkrankheit von Schafen und Ziegen und die spongiforme Rinderenzephalopathie (BSE) beim Rind [Curr. Top. Microbiol. Immunol. 172: 21–38]. Vier Prionkrankheiten von Menschen wurden identifiziert: (1) Kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Streussler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) die tödlich verlaufende angeborene Insomnie (FFI) [Gajdusek (1977) Science 197: 943–960; Medori, Tritschler et al. (1992) N. Engl. J. Med. 326: 444–449]. Anfänglich gab die Einordnung der vererbten menschlichen Prionkrankheiten ein Rätsel auf, das durch den zellulären genetischen Ursprung von PrP erklärt wurde.
Prionen liegen in Mehrfachisolaten (Stämmen) mit ausgeprägten biologischen Eigenschaften vor, wenn diese Stämme genetisch identische Wirte infizieren [Prusiner (1997) The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease, 2. Ausgabe: 165–186]. Die Stämme unterscheiden sich durch die Inkubationszeit, durch die Topologie der PrP^Sc-Proteinablagerung und in manchen Fällen auch durch die Ausbreitung und Eigenschaften der Gehirnpathologie [DeArmond and Prusiner (1997) Greenfield's Neuropathology, 6. Ausgabe: 235–280]. Da PrP^Sc die Hauptkomponente und sehr wahrscheinlich die einzige Komponente von Prionen ist, gab die Gegenwart von Prionstämmen ein Rätsel darüber auf, wie eine biologische Information in einem anderen Molekül als ein Nukleinsäuren umfassendes Molekül abgeglichen werden kann. Es wurde gefunden, dass durch die teilweise proteolytische Behandlung von einigen Prionisolate enthaltenden Gehirnhomogenaten Peptide mit leicht unterschiedlichen elektrophoretischen Laufverhalten gebildet werden [Bessen and Marsh (1992) J. Virol. 66: 2096–2101; Bessen and Marsh (1992) J. Gen. Virol. 73: 329–334; Telling, Parchi et al. (1996) Science 274: 2079–2082]. Diese Funde wiesen aufgrund der unterschiedlichen Konformation von PrP^Sc-Molekülen in verschiedenen Prionstämmen auf verschiedene proteolytische Spaltungsstellen hin. Alternativ dazu könnten die beobachteten Unterschiede durch die Bildung von verschiedenen Komplexen mit anderen Molekülen, die ausgeprägte Spaltungsstellen in PrP^Sc in unterschiedlichen Stämmen bilden, erklärt werden [Marsh and Bessen (1994) Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. 343: 413–414]. Einige Forscher schlugen vor, dass sich verschiedene Prionisolate in den Glykosylierungsmustern von Prionprotein unterscheiden [Collinge, Sidle et al. (1996) Nature 383: 685–690; Hill, Zeidler et al. (1997) Lancet 349: 99–100]. Jedoch wird gegenwärtig immer noch die Zuverlässigkeit sowohl von Glykosylierungsabbildungsmustern und Peptidabbildungsmustern in den Diagnostiken von multiplen Prionstämmen diskutiert [Collings, Hill et al. (1997) Nature 386: 564; Somerville, Chong et al. (1997) Nature 386: 564].
Ein System zum Nachweis von PrP^Sc durch Erhöhen der Immunreaktivität nach Denaturierung wird in Serban, et al., Neurology, Band 40, Nr. 1, Ja 1990 bereitgestellt. Ausreichend empfindliche und spezifische Direkttests für infektiöses PrP^Sc in biologischen Proben könnten möglicherweise den Bedarf an Tierbeimpfungen dauerhaft eliminieren. Unglücklicherweise scheint derartiges mit gegenwärtigen PrP^Sc-Tests nicht möglich zu sein – es ist zu erwarten, dass die gegenwärtige Empfindlichkeitsgrenze der PrP^Sc-Bestimmung auf der Basis von Proteinase-K oder Western-Blot in einem Bereich von 1 μg/ml liegt, was 10⁴–10⁵ prioninfektiösen Einheiten entspricht. Zudem ist die Spezifität der traditionellen Tests auf PrP^Sc auf der Basis von Proteinase-K angesichts der Funde von nur relativer oder keiner Proteinase-K-Resistenz von unzweifelhaft infektiösen Prionpräparaten fraglich [Hsiao, Groth et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9126–9130; Telling, et al. (1996) Genes & Dev. 10(14) 1736–1750].
Menschliches Transthyretin (TTR) ist ein normales Plasmaprotein, das aus vier identischen, überwiegend β-Faltblattstruktur-Einheiten zusammengesetzt ist und als Transportmittel des Hormons Thyroxin dient. Ein abnormaler Selbstzusammenschluss von TTR zu amyloiden Fibrilen verursacht zwei Formen von menschlicher Krankheit, nämlich die senile systemische Amyloidose (SSA) und die angeborene Amyloidpolyneuropathie (FAP) [Kelly (1996) Curr Opin Strut Biol 6(1): 11–7]. Im Falle von Amyloidbildung in FAP handelt es sich um Punktmutationen im TTR-Gen; die Ursache von SSA ist unbekannt. Die klinische Diagnose begründet sich historisch auf dem Nachweis in situ von Ablagerungen von Amyloid in bioptischem Material.
Bis heute ist wenig über den Mechanismus der TTR-Umwandlung in vivo zu Amyloid bekannt. Jedoch zeigten verschiedene Labore, dass die Amyloidumwandlung in vitro durch partielle Denaturierung von normalem menschlichem TTR stimuliert werden kann [McCutchen, Colon et al. (1993) Biochemistry 32(45): 12119–27; McCutchen and Kelly (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 197(2) 415–21]. Der Mechanismus des Konformationsübergangs beinhaltet ein Konformationszwischenprodukt, das zu linearen β-Faltblatt-strukturierten, amyloidstrukturierten Amyloid-Fibrilen polymerisiert [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistry 35(20): 6470–82]. Das Verfahren kann durch Binden mit stabilisierenden Molekülen wie Thyroxin oder Triiodphenol entschärft werden [Miroy, Lai et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(26): 15051–6].
Kascsak et al (1993) Dev. Bio. Stand. 80, 141–151 beschreibt die Verwendung von Antikörpern für PrP bei der Diagnose von übertragbaren spongiformen Enzephalopathien. WO 93/23432 beschreibt lösliche Prionpolypeptide mit modifizierten C-Termini und Verfahren zum Nachweis der löslichen Polypeptide. US Patent Nr. 5,565,186 (Prusiner et al.), das ein US-Patent dieser Erfinder ist, be schreibt ein Verfahren zum Nachweis von Prionen unter Verwendung eines transgenen Tiers. WO 97/43649 beschreibt Chaperone, die an Prionproteine binden und die Isoformen von PrP^C und PrP^Sc unterscheiden können.
Im Hinblick auf die vorstehenden Punkte besteht ein deutlicher Bedarf nach einem spezifischen und billigen Test mit hohem Durchfluss zum Testen von Probenmaterial auf die Gegenwart eines pathogenen Proteins, einschließlich Transthyretin und Prionprotein. Die vorliegende Erfindung bietet einen Test, der nicht nur pathogene Proteine, sondern auch den spezifischen Stamm bestimmen kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es gibt zwei verschiedene Verfahren zum Nachweis von geringen Gehalten einer Krankheitskonformation eines Proteins. Das einfachste Verfahren erfordert die Berechnung eines vorbestimmten Standards und umfasst das Bereitstellen einer Probe, die im Verdacht steht, ein Protein zu enthalten, das zwei Konformationen (eine erste Konformation und eine zweite krankheitsverbundene Konformation) annimmt, Behandeln der Probe zum Umwandeln eines beliebigen Proteins in der zweiten Konformation zu einer anderen Konformation, die eine höhere Antibindungsaffinität aufweist, In Kontaktbringen der behandelten Probe mit einem Antikörper, der an das Protein in seiner ersten Konformation und/oder die andere Konformation mit einer höheren Affinität als die zweite Konformation bindet, Bestimmen des Bindungsgrads des Antikörpers an Protein, und Vergleichen des Bindungsgrads mit dem vorbestimmten Standard, um dadurch auf der Basis des Vergleichs die Wahrscheinlichkeit zu bestimmen, dass die Probe das Protein in der zweiten, krankheitsverbundenen Konformation enthält. Die hier offenbarte Methodologie gewährt den Nachweis der Krankheitskonformation mit einem Gehalt von 1 × 10³ Teilchen/ml oder weniger.
Der Test der Erfindung kann auch ohne die Verwendung eines vorbestimmten Standards durchgeführt werden. Dieses Testverfahren umfasst (a) Bereitstellen einer Probe, die im Verdacht steht, dass sie ein Protein (mit einer ersten Konformation und mit einer zweiten krankheitsverbundenen Konformation) enthält, (b) Aufteilen der Probe in einen ersten und zweiten Teil, (c) In Kontaktbringen des ersten Teils mit einem Antikörper, der die erste Konformation mit höherer Affinität als die zweite Konformation bindet, Behandeln des zweiten Teils zum Bewirken dessen, dass ein beliebiges Protein in der zweiten Konformation eine andere Konformation mit einer höheren Affinität für den Antikörper annimmt, (e) In Kontaktbringen des zweiten Teils mit dem Antikörper, (f) Bestimmen der relativen Antikörperbindungsgrade an den ersten und zweiten Teil und (g) Bestimmen der Gegenwart oder Abwesenheit von Protein in der zweiten Konformation auf der Basis des Vergleichs.
Der Test der Erfindung ist beim Testen von proteinhaltigen Proben nützlich, wobei die Proteine in mindestens zwei Konformationen (z. B. einer nativen Nichtkrankheitskonformation und einer Krankheitskonformation) mit Gehalten von 1 × 10³ Teilchen/ml oder weniger vorliegen. Die vorliegende Erfindung verwendet Antikörper, die nicht binden oder einen relativ geringen Affinitätsgrad für die eng konfigurierte Krankheitskonformation des Proteins aufweisen. Ein nützlicher Antikörper ist der monoklonale Antikörper 263K 3F4, der durch die Hybridoma-Zellreihe ATCC HB9222 hergestellt wird, die am 8. Oktober 1986 in American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 hinterlegt wurde und in US-Patent 4,806,627, erteilt am 21. Februar 1989, hier unter Bezugnahme eingebracht, zum Offenbaren von selektiv PrP^C bindenden Antikörpern offenbart und beschrieben ist.
Ein spezifisches Beispiel für den Test kann durch Bereitstellen einer Probe durchgeführt werden, die in einen ersten Teil und in einen zweiten Teil aufgeteilt ist. Der erste Teil ist an einen ersten festen Träger gebunden und wird dann mit einem markierten Antikörper, der die Nichtkrankheitsform des Proteins mit einem höhe ren Affinitätsgrad (z. B. der um 4- bis 30-fach höheren Affinität) als der Antikörper an die Krankheitsform bindet. Der zweite Teil der Probe wird in derselben Weise behandelt, wodurch bewirkt wird, dass die eng gebundene Krankheitsform des (wenn überhaupt) in der Probe vorliegenden Proteins eine entspanntere Konformation annimmt, die eine höhere Bindungsaffinität zu dem markierten Antikörper aufweist. Nach der Behandlung wird der zweite Teil ebenso an die Oberfläche eines festen Trägers gebunden. Anschließend wird der zweite Teil mit demselben Typ an markierten Antikörpern, die für den ersten Teil verwendet wurden, in Kontakt gebracht. Auf der Basis der Antikörperbindungsproteinmenge auf dem Träger wird dann der Proteingehalt im ersten Teil bestimmt. Der Proteingehalt im zweiten behandelten Teil wird in derselben Weise bestimmt. Die Differenz zwischen den beiden wird bestimmt, und falls gefunden wurde, dass die Bindungsmenge von Antikörpern an Proteinen im zweiten Teil deutlich höher als diejenige im ersten Teil ist, ist es möglich, zu folgern, dass die ursprüngliche Probe Proteine in der eng gebundenen, krankheitsverbundenen Konformation enthielt. Ferner ist es durch die Verwendung von hier bereitgestellten Formeln und eines besonders empfindlichen Testsystems möglich, die Menge der krankheitsverbundenen Konformation des in der ursprünglichen Probe pro Volumeneinheit vorliegenden Proteins zu bestimmen. Weiterhin ist es durch Bestimmen des Verhältnisses von Antikörperbindung an denaturiertem Protein zu der Antikörperbindung an nativem Protein möglich, den bestimmten Stamm eines vorliegenden krankheitsverbundenen Proteins zu bestimmen.
Zum Aufzeigen des Grundkonzepts der vorliegenden Erfindung ist es nötig, eine Ausgangsprobe einzuschließen, die in mindestens zwei Teile aufgeteilt wird. Der erste Teil wird ohne Behandlung des Proteins mit markierten Antikörpern in Kontakt gebracht und der zweite Teil mit markierten Antikörpern behandelt, nachdem die Proteine in einer Weise behandelt wurden, die bewirkt, dass beliebige Proteine in der Krankheitskonformation eine Konformation annehmen, die einen höheren Bindungsaffinitätsgrad für die Antikörper aufweist. Die Messwerte werden verglichen (d. h. einer vom anderen subtrahiert) und die Gegenwart von Proteinen in der krankheitsverbundenen Konformation auf der Basis der Differenz zwischen den zwei Messwerten abgeleitet. Jedoch ist es möglich, das Grundkonzept der vorliegenden Erfindung ohne Erhalt von zwei Messwerten für jeden Test zu verwenden. Dies kann durch Ermitteln eines Standards auf der Basis der Durchführung des Tests einer statistisch bedeutenden Anzahl an eng verwandten Proben durchgeführt werden. Nach Ermittlung des Standards ist der Antikörperbindungsgrad bekannt, der beobachtet werden sollte, wenn die Probe keine Proteine in der krankheitsverbundenen Konformation enthält. Unter Verwendung des Standards wird dann eine zu testende Probe so behandelt, dass beliebige Proteine in der krankheitsverbundenen Form zu einer anderen Konformation, die einen viel höheren Bindungsaffinitätsgrad für die markierten Antikörper aufweist, umgewandelt werden. Die erhaltene Messung wird dann mit dem Standard verglichen. Liegt die Differenz zwischen dem Standard und der erhaltenen Messung außerhalb eines vorgegebenen Bereichs, kann gefolgert werden, dass die ursprüngliche Probe Proteine in der krankheitsverbundenen Konformation einschloss.
In einer dritten Ausführungsform der Erfindung kann eine der vorstehend offenbarten Ausführungsformen zusammen mit den hier bereitgestellten Formen zur Berechnung (quantitativ) der Anzahl an Proteinen in der in der ursprünglichen Probe vorliegenden krankheitsverbundenen Konformation verwendet werden.
In einer vierten Ausführungsform wird der bestimmte Stamm an in einer Probe vorliegendem infektiösem Protein bestimmt. Der Stamm wird durch Abgleichen des „Proteinindexes" der getesteten Probe mit dem bekannten Proteinindex eines Teilchenstamms eines vorgegebenen Proteins bestimmt. Der „Proteinindex" der Probe wird durch Bestimmen des Verhältnisses der die denaturierte Form des Proteins bindenden Antikörpermenge zu der das native Protein bindenden Antikörpermenge berechnet.
Gemäß einem der Systeme ist es bevorzugt, die zu testende Probe in einer Weise vorzubehandeln, die die Konzentration der Nichtkrankheitsform in Bezug auf die Konzentration der Krankheitsform des Proteins senkt. Zum Beispiel kann die anfängliche Probe mit einer Verbindung chemisch behandelt werden, die vorzugsweise die entspannte, Nichtkrankheitsform des Proteins zersetzt, oder sie wird für Antikörper freigelegt, die sich vorzugsweise daran binden und dadurch die Nichtkrankheitsform des Proteins entfernen.
Es kann möglich sein, die Empfindlichkeit von verschiedenen Aspekten der Erfindung durch Konzentrieren der Krankheitskonformation eines Proteins durch Zugabe einer selektiv an der Krankheitskonformation bindenden Verbindung zur Bildung eines Komplexes und Zentrifugieren der Probe zum Ausfällen des Komplexes, der dann gemäß dem hier beschriebenen Verfahren getestet wird, zu verbessern. Spezifitäten im Hinblick auf solche Konzentrationsverfahren sind im Einzelnen in unserer begleitenden Anmeldung, Prozessnummer des Bevollmächtigten 6510/098001, eingereicht mit demselben Datum wie die vorliegende Anmeldung, mit dem Titel „Process for Concentrating Protein with Disease-Related Conformation" (nun veröffentlicht als WO99/42487) beschrieben.
In verschiedenen Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Tests der Erfindung bedeuten alle „direkten" Typen von Immuntests, dass die Probe direkt mit dem markierten Antikörper entweder mit oder ohne Behandlung zum Ändern der Konformation einer beliebigen krankheitsverbundenen Konformation von in der Probe vorliegenden Proteinen getestet wird. Ein „indirekter" Test kann ebenso verwendet werden. Zum Beispiel kann es erwünscht sein, die Anzahl an krankheitsverbundenen Proteinen in der Probe (wenn überhaupt) durch die Verwendung einer transgenen Maus und damit ein beliebiges erhaltenes Signal zu erhöhen. Zur Durchführung dieser Ausführungsformen der Erfindung wird die erste Probe zum Beimpfen einer transgenen, ein modifiziertes Genom aufweisenden Maus verwendet, so dass sie Krankheitssymptome beim Beimpfen mit Proteinen in der krankheitsverbundenen Konformation entwickelt. Nach Beimpfen der Mäuse lässt man eine ausreichende Zeitdauer (z. B. 30 Tage) vergehen, wonach das transgene Tier getötet und eine Probe wie homogenisiertes Gehirngewebe von der Maus in dem wie vorstehend beschriebenen direkten Test verwendet wird. Die vorliegende Erfindung verbessert die Fähigkeit, bei transgenen Mäusen Prionen nach Verkürzen der Zeitdauer, welche vergehen muss, bis eine Bestimmung durchgeführt werden kann, wie, ob die ursprüngliche Probe Proteine in der krankheitsverbundenen Form einschloss, nachzuweisen. Es wäre auch möglich, wie in WO 97/46572 offenbartes, Epitop-markiertes PrP anzuwenden, um das PrP^Sc aus dem Gehirn einer Tg-Maus durch Affinität zu reinigen und anschließend den Test der vorliegenden Erfindung anzuwenden. Ohne die vorliegende Erfindung wird die Maus beimpft, und es muss dann gewartet werden, bis die beimpfte Maus tatsächlich Krankheitssymptome zeigt. Abhängig von der Maus dauert es mehrere Monate oder sogar Jahre.
Die Testmethodologie der vorliegenden Erfindung kann auf jeden beliebigen Probetyp angewandt werden, wenn die Probe im Verdacht steht, dass sie ein mindestens in zwei Konformationen vorkommendes Protein enthält. Das Protein muss in einer Konformation vorkommen, die an bekannte Antikörper, Antikörper, die gebildet werden, oder andere spezifische Bindungspartner bindet. Die zweite Konformation muss von der ersten Konformation in Bezug auf ihre Bindungsaffinität ausreichend unterschiedlich sein, so dass die zwei Konformationen durch Verwendung von Antikörpern oder Bindungspartnern, die einen viel höheren Affinitätsgrad für die erste Konformation als für die zweite Konformation aufweisen, unterschieden werden können. In ihrer begreifend einfachsten Form funktioniert die Erfindung am besten, wenn ein bekannter markierter Antikörper mit einem hohen Affinitätsgrad an eine Nichtkrankheitsform eines Proteins und nicht (oder nur mit einem extrem niedrigen Affinitätsgrad) an dasselbe Protein bindet, wenn es in seiner krankheitsverbundenen Konformation vorliegt. Jedoch kann in der Realität ein vorgegebenes Protein mehr als zwei Konformationen aufweisen. Das Protein kann mehr als eine Nichtkrankheitskonformation und mehr als eine krankheitsverbundene Konformation aufweisen (Telling et al. Science (1996)). Die Erfindung ist immer noch nützlich, wenn mehrere Konformationen von Nichtkrankheits- und Krankheitsformen des Proteins vorliegen; mit der Maßgabe, dass (1) mindestens eine Nichtkrankheitsform sich von mindestens einer Krankheitsform in Bezug auf ihre Bindungsaffinität unterscheidet; und (2) es möglich ist, die krankheitsverbundene Konformation des Proteins so zu behandeln, dass ihre Bindungsaffinität im Wesentlichen erhöht wird.
Wie vorstehend angegeben, kann der Test der Erfindung zum Testen eines beliebigen Typs einer Probe für einen beliebigen Proteintyp verwendet werden, mit der Maßgabe, dass das Protein eine nichtkrankheits- und eine krankheitsverbundene Konformation einschließt. Jedoch wurde die Erfindung insbesondere entwickelt, um Proben auf die Gegenwart von (1) PrP-Proteinen und Bestimmen dessen, ob die Probe ein PrP-Protein in seiner Krankheitskonformation, d. h. PrP^Sc einschloss, (2) unlöslichen Formen von βA4, verbunden mit Alzheimer-Krankheit und (3) Transthyretin zu testen. Demzufolge richtet sich der Hauptteil der folgenden Offenbarung auf die Verwendung des Immuntests der vorliegenden Erfindung zum Nachweis der Gegenwart von entweder PrP^Sc (oder einem geringerem Grad an βA4 oder Transthyretin (TTR)) in einer Probe, wobei es klar sein sollte, dass dieselben allgemeinen Konzepte auf den Nachweis von krankheitsverbundenen Konformationen eines breiten Bereichs an verschiedenen Proteintypen anwendbar ist. Ferner richtet sich die Offenbarung insbesondere auf das Beschreiben dessen, wie der bestimmte Stamm von infektiösen Prionen (PrP^Sc) in einer Probe bestimmt wird, wobei es klar sein sollte, dass dieselben allgemeinen Konzepte zum Bestimmen des bestimmten Stamm von anderen mit verschiedenen Krankheiten verbundenen eingeschränkten Proteinen anwendbar ist.
Das vorliegende Verfahren zum PrP^Sc-Nachweis wurde durch Markieren von selektiertem, gereinigtem IgG mit Europium entwickelt. Die verwendeten Antikörper weisen eine hohe Bindungsaffinität für PrP^C (Nichtkrankheitskonformation) auf, das eine α-helikale Konfiguration umfasst. Die Antikörper weisen eine geringe Bindungsaffinität für PrP^Sc (Krankheitskonformation) auf, das eine β-Faltblatt-Konfiguration umfasst. Das IgG kann von üblichen monoklonalen, polyklonalen oder rekombinanten Antikörpern erhalten werden, die typischerweise die Sequenz 90-145 oder 222-231 von PrP^C und konformationell ungefaltetes Prionprotein erkennen. Verschiedene Konformationen eines rekombinanten Prionproteins wurden mit Polystyrolplatten durch einen Glutaraldehydaktivierungsschritt chemisch vernetzt. Die relativen Affinitäten des Eu-markierten IgG mit α-helikaler, β-Faltblatt- und statistischer Spiralenkonfiguration eines rekombinanten Prionproteins eines Syrienhamsters, entsprechend der Sequenz 90–231, wurden durch zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz in einem Polystyrolplattenformat mit 96 Vertiefungen bestimmt.
Eine Bestimmung der relativen Affinitäten von unterschiedlichen markierten Antikörpern für Proteine kann durch verschiedene Verfahren durchgeführt werden. Jedoch liegt die krankheitsverbundene Konformation eines Proteins in Bezug auf diejenige der Nichtkrankheitskonformation häufig in einer sehr geringen Konzentration vor. Demzufolge sind häufig sehr empfindliche Verfahren zum Nachweis einer durch die Behandlung der Krankheitskonformation des Proteins verursachten Erhöhung erforderlich. Bei einem besonders empfindlichen Verfahren handelt es sich um die zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz.
Durch sorgfältiges Kalibrieren dieses Verfahrens ist es möglich, die Signalerhöhung in der Antikörperreaktivität beim Übergang von β-Faltblatt-Konformationszustand zum denaturierten Zustand nachzuweisen. Dieses Signal ist mit demjenigen, das aus der Transformation von seinem α-helikalen oder dem behandelten entspannten oder denaturierten Zustand erhalten wird, stark vergleichbar. Folglich kann der ursprüngliche Konformationszustand von Prionprotein durch den unterschiedlichen Test in nativen und behandelten Zuständen festgesetzt werden. Wird eine Probe, die kein β-Faltblatt-Protein enthält, behandelt, wird eine geringe Erhöhung der Immunreaktivität erhalten. Diese Erhöhungsmenge muss vor und nach der Durchführung angepasst werden, so dass die erhaltene Konzentration oder Menge als „angepasste Menge" bezeichnet wird. Die Menge an antikörperspezifischer Bindung gegenüber derjenigen, die für eine α-helikale Konformation von PrP^C (unterhalb der angepassten Menge) erhalten wird, ist ein Maß für die Gegenwart von β-Falltblatt-Konformation, die für Pathogenität und Infektiösität von PrP^Sc wichtig ist.
Eine primäre Aufgabe der Erfindung ist es, einen Immuntest bereitzustellen, der zum Testen von proteinhaltigen Proben anwendbar ist, wobei die Proben im Verdacht stehen, ein Protein zu enthalten, das in einer nativen Nichtkrankheitskonformation und einer krankheitverbundenen Konformation vorliegt (z. B. PrP-Protein, βA4-Protein und Transthyretin).
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, dass der Immuntest die Gegenwart von Proteinen in der krankheitsverbundenen Konformation (z. B. PrP^Sc, βA4 und Transthyretin) schnell und genau bestimmen kann, obwohl der im Test verwendete Antikörper das Protein in der krankheitsverbundenen Konformation nicht bindet oder einen sehr geringen Bindungsaffinitätsgrad dafür aufweist und diese krankheitsverbundene Konformation in geringerer Konzentration als die nichtkrankheitsverbundene Konformation vorliegt.
Eine andere Aufgabe der Erfindung ist es, einen Test bereitzustellen, der es ermöglicht, nicht nur zu bestimmen (1), ob ein pathogenes Teilchen in einer Probe vorliegt, sondern auch (2) die Konzentration der Teilchen in einer Probe und (3) den besonderen Stamm an vorliegenden Teilchen zu bestimmen.
Ein Merkmal der Erfindung ist es, dass das erhaltene Signal durch die Verwendung von transgenen Tieren, z. B. Mäusen, die zum Nachweis der Gegenwart eines Proteins in einer Probe verwendet werden, verbessert werden kann.
Ein anderes Merkmal ist es, dass eine zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz zum Erhöhen der Empfindlichkeit verwendet wird.
Ein anderer Vorteil ist es, dass der Test Gehalte an Krankheitskonformation eines Proteins mit einer Konzentration von 1 × 10³ Teilchen/ml oder weniger nachweisen kann.
Eine spezifische Aufgabe ist es, einen diagnostischen Test zum Bestimmen der Gegenwart von infektiösem Prionprotein in verschiedenen Probematerialien bereitzustellen, die von Geweben und/oder Körperflüssigkeiten vom Menschen, Primaten, Affen, Schwein, Rind, Schaf, Hirsch, Elch, der Katze, Hund, Maus und Huhn erhalten oder abgeleitet sind.
Eine andere spezifische Aufgabe ist es, einen diagnostischen Test zum Bestimmen der Gegenwart von βA4-Protein in verschiedenen Probematerialien bereitzustellen, die von Geweben und/oder Körperflüssigkeiten vom Menschen, Primaten, Affen, Schwein, Rind, Schaf, Hirsch, Elch, Katze, Hund, Maus und Huhn erhalten oder abgeleitet sind.
Eine andere Aufgabe ist es, einen schnellen Test auf natives infektiöses Prionprotein in den Gehirnen von transgenen oder nichttransgenen Tieren bereitzustellen, welchen ein möglicherweise Prionen enthaltendes Probematerial injiziert wird.
Eine andere Aufgabe ist es, ein Verfahren zum Bewerten von Dekontaminationsverfahren durch Testen des Denaturierungsgrades von pathogenen Proteinen (z. B. Prionen oder β-Faltblatt-βA4) nach solchen Behandlungen bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe ist es, ein schnelles Verfahren zum Screenen von verschiedenen Verbindungen zum Bewerten ihres Potentials zur Behandlung von Krankheiten, die mit diesen Konformationen von verschiedenen Proteinen verbunden sind, wie zum Screenen von Verbindungen, auf deren stabilisierende Wirkung, auf verschiedene Proteinkonformationen (z. B. PrP^C oder α-helikale Konformation von βA4) oder deren destabilisierenden Einfluss auf die pathogene Konformation (z. B. PrP^Sc oder β-Faltblatt-Konformation von βA4) eines Proteins bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe ist es, ein schnelles Verfahren zum Screenen von verschiedenen pharmazeutischen Verbindungen mit einem Potential für Prionkrankheitsbehandlung wie durch Screenen von Verbindungen auf deren stabilisierende Wirkung auf α-helikale Konformation oder eine normale Isoform des PrP^C-Proteins oder deren destabilisierenden Einfluss auf die β-Faltblatt-Konformation der pathogenen Isoform des PrP^Sc-Proteins bereitzustellen.
Ein anderer Vorteil ist, dass das Verfahren ohne einen Antikörper, der direkt eine infektiöse Konformation eines Proteins erkennen kann, und ohne die Verwendung eines Proteinase-K-Schritts zum Eliminieren des Signals von normalen (Nichtkrankheits-)Isoformen des Proteins wie PrP^C durchgeführt werden kann.
Ein anderer Vorteil ist, dass im erfindungsgemäßen Verfahren kein Antikörper nötig ist, der pathogene Konformation von βA4 oder Transthyretin direkt erkennen kann.
Ein wichtiges Merkmal des Versuchs ist der schnelle und billige Aufbau mit hohem Durchfluss, der mit der Kapazität zum Screenen von 96 Proben pro Tag pro Platte mit 96 Vertiefungen aufgebaut werden kann.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist das diagnostische Verfahren zum quantitativen Nachweis von TTR in der abnormalen Amyloidkonformation im von menschlichem und tierischem Gewebe, Körperflüssigkeiten und Arzneimitteln erhaltenen Probematerial. Das erfindungsgemäße Verfahren stellt ein direktes empfindliches Verfahren zum Unterscheiden und Bemessen der normalen Amyloidkonformationen von TTR in einem in Probematerialien vorliegenden Gemisch bereit.
Die Bemessung basiert auf der Messung der Differenz der Affinitäten von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern mit TTR in normaler oder amyloider Konformation gegen statistische Spiralenkonformation. Die vorliegende Erfindung beschreibt drei Bewertungsverfahren und die mathematische Formel, die für eine solche Mengenbestimmung verwendet wird.
Eine wichtige Aufgabe ist es, einen spezifischen diagnostischen Test für pathogenes TTR in verschiedenen Probematerialien bereitzustellen, die von Geweben vom Menschen, Primaten, Affen, Schwein, Rind, Schaf, Hirsch, Elch, Katze, Hund und Huhn erhalten oder abgeleitet sind.
Eine andere Aufgabe ist es, einen schnellen Test auf die Amyloidform von TTR in transgenen Tieren bereitzustellen.
Eine andere Aufgabe ist es, ein schnelles Verfahren zum Screenen von verschiedenen pharmazeutischen Verbindungen mit dem Potential zur Behandlung von senilen systemischen Amyloidosen (SSA) und angeborener amyloidotischer Polyneuropathie (FAP) bereitzustellen. Solche Verbindungen werden auf ihre stabilisierende Wirkung auf normale Konformation von TTR oder ihren destabilisierenden Einfluss auf die Amyloidkonformation von TTR gescreent.
Noch eine andere Aufgabe ist es, ein schnelles Verfahren zum Screenen des Einflusses von verschiedenen spontanen und aufgebauten Mutationen im TTR-Gen auf die Konformation, Stabilität und Amyloidbildung solcher TTR-Genprodukte in natürliche oder künstliche APP-Gene beherbergenden, transgenen Tieren bereitzustellen.
Ein spezifischer Vorteil ist, dass der erfindungsgemäße Test pathogene Formen von TTR in einem Gemisch mit denaturierten nichtpathogenen Formen desselben oder in einem Gemisch mit einer löslichen Form von TTR z. B. weniger als 1 × 10³ Teilchen/ml nachweisen kann.
Diese und andere Aufgaben, Vorteile und Merkmale des erfindungemäßen Verfahrens werden für den Fachmann durch Lesen der Einzelheiten über das Testverfahren, der Antikörperentwicklung und des Antikörpertestens und der transgenen Maus, wie vollständiger nachstehend mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen beschrieben, verständlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Spektogramm der Konformation von rekombinantem SHaPrP90-231, wie durch die Spektroskopie des zirkulären Dichroismus (CD) beschrieben, die zwei Hauptbanden mit Minima bei 208 und 222 nm zeigen, was α-helikale Konformation anzeigt, wobei eine einzelne negative Bande mit einem Minimum bei 217 nm für überwiegend β-Faltblatt-Konformation charakteristisch ist;
2 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse von wiederholten Tests von rekombinantem SHaPrP90-231 in α-helikalen und denaturierten Konformationen in Gegenwart von 5%igem PrP^0/0-Mäusegehirnhomogenat zeigt, wobei die Differenz in der Neigung und die mit Europium markierten 3F4 IgG erhaltenen Kreuzungspunkte anzeigen, dass jede Konformation sowohl eine unterschiedliche Affinität als auch eine unterschiedliche Anzahl an Bindungsstellen aufweist, und wobei ferner die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
3 ist ein Diagramm, das die Kalibrierung eines direkten Tests mit rekombinantem SHaPrP90-231 in α-helikaler Konformation in Gegenwart von 5%igem PrP^0/0-Mäusegehirnhomogenat zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
4 ist ein Diagramm, das die Kalibrierung eines direkten Tests mit rekombinantem SHaPrP90-231 in β-Faltblatt-Konformation in Gegenwart von 5%igem PrP^0/0-Mäusegehirnhomogenat zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
5 ist ein Diagramm, das die Ein-Ausgabebewertung eines direkten Tests für sowohl α-helikale als auch β-Faltblattformen von SHaPrP90-231 in Gegenwart von 5%igem PrP^0/0-Mäusegehirnhomogenat zeigt, wobei die Menge des Proteins auf der X-Achse durch Aminosäureanalyse bestimmt wurde und die Menge des Proteins auf der Y-Achse aus dem Test berechnet wurde;
6 ist ein Diagramm, das das Verhältnis zwischen den Signalen von behandeltem (denaturiertem) und nativem SHaPrP90-231 in α-helikalen und β-Faltblatt-Konformation zeigt, die mit Eu-markiertem 3F4 IgG entwickelt wurden, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
7 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines direkten Tests für PrP^C-Protein im normalen Hamstergehirnhomogenat zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
8 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse eines direkten Tests für PrP^C+Sc in mit Traberkrankheit infiziertem Hamstergehirnhomogenat zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
9 ist ein Diagramm, das die Gesamtmenge an PrP-Proteinen in normalem Hamstergehirn und die Menge an β-Faltblatt-PrP^Sc in beiden Gehirnen, berechnet aus dem Modell, zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
10 ist ein Diagramm, das die Gesamtmenge an PrP-Proteinen in mit Traberkrankheit infizierten Hamstergehirnen und die Menge an β-Faltblatt-PrP^Sc in beiden Gehirnen, berechnet aus dem Modell, zeigt, wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
11 ist ein Diagramm, das die Beziehung der Infektiösität und der Menge an β-Faltblattform von SHaPrP^Sc, wie berechnet aus dem direkten Test und der Formel, zeigt, wobei gereinigtes SHaPrP^Sc in Gegenwart von 5%igem PrP^0/0-Mäusegehirnhomogenat beschallt und wie beschrieben verdünnt wurde und wobei die Datenpunkte und -balken einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM darstellen;
12 ist ein Diagramm, von βA4(1-40) in sowohl α-helikaler als auch β-Faltblatt-Konformation, hergestellt durch die Spektroskopie des zirkulären Dichroismus (CD), das eine Hauptbande bei 208 und 222 nm für die helikale Konformation und eine einzelne negative Bande bei 217 nm für die überwiegende β-Faltblatt-Konformation (bei pH 7,4) zeigt;
13 ist ein Diagramm für einen direkten Test für lösliches A4β(1-40);
14 ist ein Diagramm eines direkten Tests für die β-Faltblattform von A4β(1-40);
15 ist ein Diagramm, das das Verhältnis von denaturiertem zu nativem A4β(1-40) zeigt;
16 zeigt die Umwandlung von rekombinantem SHaPrP90-231 von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation während einer Inkubation bei 37°C für eine Dauer von 72 Stunden, wie bestimmt durch eine Spektroskopie des zirkulären Dichroismus (CD). Die Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml;
17 zeigt die Umwandlung von rekombinantem SHaPrP90-231 von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation während einer Inkubation bei 37°C für eine Dauer von 72 Stunden, wie bestimmt durch den direkten Differentialtest. Das erhöhte Signal von nativer Konformation bei ~24 Stunden gibt die Destabilisierung von nativer Struktur mit offenerer Konformation, gefolgt von der Umwandlung zur sekundären β-Faltblatt-Struktur (siehe 16) an. Die Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml;
18 zeigt, dass sowohl HFIP als auch Glyzerin einen Übergang von α- zu β-Konformation von rekombinantem SHaPrP90-231 verhindern kann. Die Änderungen im TRF-Signal werden als fraktionelle Änderungen ausgedrückt, wobei positive Werte Stabilisierung, negative Destabilisierung angeben. Die Versuchsbedingungen waren wie in 16 und 17;
19: Pentosanpolysulfat stabilisiert die native Konformation von SHaPrP90-231 bei geringen Konzentrationen; Congo red hat keine Wirkung auf die Stabilität von SHaPrP90-231. Die Änderungen im TRF-Signal sind als fraktionelle Änderung ausgedrückt, wobei ein positiver Wert Stabilisierung, ein negativer Destabilisierung angibt. Die Versuchsbedingungen waren wie in 16 und 17;
20: zwitter-ionisches Detergens ZW3-12 destabilisiert die native Konformation von α-helikalem SHa90-231. Die Versuchsbedingungen waren wie in 16 und 17; die Änderungen im TRF-Signal sind als fraktionelle Änderung ausgedrückt, wobei ein positiver Wert Stabilisierung, ein negativer Destabilisierung angibt;
21 zeigt eine Kalibrierung des direkten Tests mit gereinigtem menschlichem TTR in normaler Konformation. Die Platten wurden mit primären anti-TTR-Antikörpern (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) und sekundären Eu-markierten anti-Kaninchen-Antikörpern entwickelt. Die Datenpunkte und -balken stellen einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM dar;
22 zeigt eine Kalibrierung des direkten Tests mit gereinigtem menschlichem TTR in Amyloidkonformation. Die Platten wurden mit primären anti-TTR-Antikörpern und sekundären Eu-markierten anti-Kaninchen-Antikörpern entwickelt. Die Datenpunkte und -balken stellen einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM Mittelwert ± SEM dar;
23 zeigt das Verhältnis zwischen Signalen von denaturiertem und nativem TTR in normalen und amyloiden Konformationen, entwickelt wie vorstehend beschrieben. Die Datenpunkte und -balken stellen einen aus vier unabhängigen Messungen erhaltenen Mittelwert ± SEM dar;
24: Modifizierte Formel zum Berechnen der Menge von TTR in Amyloidkonformation aus den Daten, die durch den direkten Test mit polyklonalen anti-TTR-Antikörpern erhalten wurden. Die Änderungen aus der allgemeinen Gleichung geben das umgekehrte Verhältnis von denaturierten und nativen Zuständen für normale und amyloide Formen von TTR wieder. Die Differenz zwischen der Fluoreszenz vom denaturierten Zustand der Probe und derjenigen, die für den Übergang vom nativen normalen Protein zum denaturierten Zustand erwartet wird, ist proportional der Menge von TTR in Amyloidkonformation. F_n-Gesamtsignal von nativer Konformation; F_nN und F_nA- die Signale von nativer normaler beziehungsweise amyloider Konformation; F_d-Gesamtsignal von TTR in denaturiertem Zustand; F_dN und F_dA sind die Signale von denaturierten normalen oder amyloiden Zuständen von TTR; ΔF_n–,d- die Gesamterhöhung des Signals beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand: ΔF_Nn–,d-Erhöhung des Signals von normaler Konformation im Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand; ΔF_An–,d-Änderung des Signals von Amyloidkonformation beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand; f_Nn–,d-Korrelationsfaktor für den Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand von normalem TTR;
25 ist ein Diagramm des „Prionenindex" (der das Verhältnis von Antikörperbindung zu denaturiertem gegen natives PrP-Protein ist) gegen die Konzentration von PrP^Sc in μg/ml. Die gezeigten Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM, erhalten aus drei verschiedenen mit verschiedenen Prionenstämmen infizierten Gehirnen von LVG/LAK-Syrienhamstern dar.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORM
Bevor die vorliegenden Tests und Verfahren offenbart und beschrieben werden, sollte es klar sein, dass diese Erfindung auf die bestimmten Antikörper, Proteine, Markierungen, Tests oder Verfahren nicht beschränkt ist und als solche natürlich variieren kann. Es sollte auch klar sein, dass die hier verwendete Terminologie nur zum Beschreiben von besonderen Ausführungsformen und nicht zur Beschränkung gedacht ist, da der Umfang der vorliegenden Erfindung nur durch die beigefügten Ansprüche beschränkt ist.
Wenn nicht anders angegeben, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe dieselbe Bedeutung, wie sie für den Fachmann, welchem diese Erfindung gehört, verständlich sind. Obwohl beliebige Verfahren und Materialien, die zu denjenigen, die hier beschrieben sind, ähnlich oder gleich sind, bei der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben.
Die hier erörterten Veröffentlichungen dienen lediglich zur Beschreibung der zur Offenbarung vor dem Anmeldedatum der vorliegenden Erfindung. Nichts soll hier so aufgefasst werden, dass die vorliegende Erfindung gegenüber einer solchen Veröffentlichung aufgrund einer früheren Erfindung vorbekannt ist. Ferner können die bereitgestellten Veröffentlichungsdaten geändert werden, falls gefunden wird, dass das tatsächliche Veröffentlichungsdatum von dem hier bereitgestellten verschieden ist.
DEFINITIONEN
Der wie hier verwendete Begriff „Protein" soll eine beliebige Aminosäuresequenz umfassen und modifizierte Sequenzen wie Glykoproteine einschließen. Der Begriff schließt natürlich vorkommende Proteine und Peptide sowie diejenigen, die rekombinant oder synthetisiert sind, ein. Wie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet, soll der Begriff „Protein" spezifisch natürlich vorkommende Proteine abdecken, die in mindestens zwei verschiedenen Konformationen vorkommen, wobei beide Konformationen dieselbe oder im Wesentlichen dieselbe Aminosäuresequenz, jedoch verschiedene dreidimensionale Strukturen aufweisen. Die zwei Konformationen des Proteins schließen mindestens eine nicht mit einem Krankheitszustand verbundene Konformation und mindestens eine mit einem Krankheitszustand verbundene – pathogene – Konformation ein. Ein spezifisches und bevorzugtes Beispiel eines wie in Verbindung mit dieser Offenbarung verwendeten Proteins ist ein PrP-Protein, das die Nichtkrankheitsform, bezeichnet als die PrP^C-Form, und die krankheitsverbundene Form, bezeichnet als PrP^Sc, einschließt. Obwohl ein Prionprotein oder die PrP^Sc-Form eines PrP-Proteins infektiös und pathogen ist, ist die Krankheitskonformation von anderen Proteinen nicht infektiös, obwohl sie pathogen ist. Wie hier verwendet, kann der Begriff „pathogen" bedeuten, dass das Protein tatsächlich die Krankheit verursacht, oder kann einfach bedeuten, dass das Protein mit der Krankheit verbunden ist und deshalb bei vorliegender Krankheit vorhanden ist. Folglich handelt es sich bei einem pathogenen Protein, wie in Verbindung mit dieser Offenbarung verwendet, nicht unbedingt um ein Protein mit der spezifischen Ursache einer Krankheit.
Die Begriffe „behandeln", „Behandlung" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet, um ein Verfahren zu beschreiben, durch welches eine Probe oder ein Teil davon und speziell Proteine in der Probe physikalisch und/oder chemisch so manipuliert werden, dass bewirkt wird, dass Proteine in einer Probe in einer krankheitsverbundenen Konformation zu einer anderen Konformation mit einer höheren Bindungsaffinität mit einem Bindungspartner wie einem Antikörper geändert werden. Behandelte Proteine werden auch als denaturierte oder teilweise denaturierte Proteine oder Proteine in entspannter Konformation bezeichnet, wobei die Konformation die Bindungsaffinität des Proteins an einen Bindungspartner wie einen Antikörper erhöht. „Behandeln" schließt das Unterziehen der Probe der Wärme, dem Druck und/oder den Chemikalien ein. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Proben, die PrP^Sc (das die krankheitsverbundene Konformation, umfassend β-Faltblatt-Strukturkonfigurationen) enthalten, so behandelt, dass das Protein eine andere Konformation (z. B. eine α-helikale Konfiguration und/oder eine statistische Spiralenkonfiguration) mit einer vierfachen oder noch größeren Antikörperbindungsaffinität annimmt.
Die Begriffe „PrP-Protein", „PrP" und dergleichen werden hier abwechselnd verwendet und sollen sowohl die infektiöse Teilchenform PrP^Sc, von welcher bekannt ist, dass sie Krankheiten (spongiforme Enzephalopathie) bei Mensch und Tier verursacht, als auch die nichtinfektiöse Form PrP^C, die unter geeigneten Bedingungen zu der infektiösen PrP^Sc-Form umgewandelt wird, einschließen.
Die Begriffe „Prion", „Prionprotein" und „PrP^Sc-Protein" und dergleichen werden hier zum Bezeichnen der infektiösen PrP^Sc-Form von PrP abwechselnd verwendet, wobei es sich hierbei um eine Verkürzung der Worte „Protein" und „Infektion" handelt. Die Teilchen sind größtenteils, wenn nicht ausschließlich aus von einem PrP-Gen kodierten PrP^Sc-Molekülen zusammengesetzt. Prionen unterscheiden sich von Bakterien, Viren und Viroiden. Bekannte Prionen infizieren Tiere unter Verursachung von Traberkrankheit, einer übertragbaren degenerativen Krankheit des Nervensystems von Schafen und Ziegen, sowie spongiforme Rinderenzepha lopathie (BSE) oder „Rinderwahn" und die spongiforme Katzenenzephalopathie von Katzen. Vier Prionkrankheiten, von welchen bekannt ist, dass sie Menschen befallen, sind (1) Kuru, (2) Creutzfeldt-Jakob Krankheit (CJD), (3) Gerstmann-Straussler-Scheinker-Krankheit (GSS) und (4) tödlich verlaufende angeborene Insomnie (FFI). Wie hier verwendet, schließt „Prion" alle Formen von Prionen, die alle oder beliebige dieser Krankheiten verursachen, oder andere in beliebigen Tieren verwendete und insbesondere bei Mensch und Farmhaustieren ein.
Der Begriff „PrP-Gen" wird hier verwendet, um ein Proteine exprimierendes genetisches Material, einschließlich bekannte Polymorphismen und pathogene Mutationen, zu beschreiben. Der Begriff „PrP-Gen" bedeutet im Allgemeinen ein beliebiges Gen von einer beliebigen Spezies, die eine beliebige Form eines Prionproteins kodiert. Einige allgemein bekannte PrP-Sequenzen sind in Gabriel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9097–9101 (1992), U.S. Patent 5,565,186 und WO97/04814 beschrieben. Das PrP-Gen kann von einem beliebigen Tier, einschließlich den hier beschriebenen „Wirts"- und „Versuchs"-Tieren und beliebigen und allen Polymorphismen und Mutationen davon stammen, wobei es erkennbar ist, dass die Begriffe andere solche noch zu entdeckende PrP-Gene einschließen. Das durch solch ein Gen exprimierte Protein kann entweder eine PrP^C-(Nichtkrankheits-) oder PrP^Sc-(Krankheits-)Form annehmen.
Der Begriff „Antikörper" steht für ein Immunglobulinprotein, das ein Antigen binden kann. Der wie hier verwendete Begriff Antikörper bedeutet, dass er den gesamten Antikörper sowie beliebige Antikörperfragmente (z. B. F(ab)', Fab, Fv), einschließt, die das Epitop, Antigen, oder Antigenfragment von Interesse binden können. Bevorzugte Antikörper für Tests der Erfindung sind immunreaktiv oder immunspezifisch und binden deshalb spezifisch und selektiv an ein Protein von Interesse, z. B. an A4β-Amyloidprotein oder ein PrP-Protein. Antikörper, die immunreaktiv oder sowohl für die native Nichtkrankheitsform als auch für die behandelte Krankheitsform, jedoch nicht für die unbehandelte Krankheitsform (z. B. sowohl für natives PrP als auch behandeltes PrP^Sc, jedoch nicht für natives PrP^Sc) immunspezifisch sind, sind bevorzugt. Antikörper für PrP sind vorzugsweise immunspezifisch, z. B. im Wesentlichen nicht kreuzungsreaktiv mit verwandten Materialien. Einige spezifische Antikörper, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden können, sind in der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO97/10505 offenbart. In der PCT-Anmeldung offenbarte Antikörper, die selektiv PrP^Sc binden, sollten in der vorliegenden Erfindung nicht verwendet werden. Der Begriff „Antikörper" umfasst alle Antikörpertypen, z. B. polyklonale, monoklonale und diejenigen, die durch die Phagendisplaymethodologie hergestellt werden. Besonders bevorzugte Antikörper der Erfindung sind Antikörper, die einen relativ hohen Affinitätsgrad sowohl für natives PrP^C als auch behandeltes PrP^Sc, jedoch einen geringen oder im Wesentlichen keinen Bindungsaffinitätsgrad für PrP^Sc aufweisen. Insbesondere weisen die Antikörper der Erfindung vorzugsweise eine vierfache oder größere, fünfzehnfache oder größere oder noch stärker bevorzugt dreißigfache oder größere Bindungsaffinität sowohl für natives PrP^Sc als auch denaturiertes PrP^Sc verglichen mit der Bindungsaffinität für natives PrP^Sc auf.
„Gereinigter Antikörper" bedeutet derjenige, der ausreichend frei von anderen Proteinen, Kohlehydraten und Lipiden ist, mit welchen er gewöhnlich verbunden ist. Solch ein Antikörper „bindet bevorzugt" an eine behandelte oder denaturierte Krankheitskonformation eines Proteins wie die β-Faltblatt-Konformation von A4β oder PrP^Sc-Protein (oder ein antigenes Fragment davon) und erkennt im Wesentlichen nicht oder bindet nicht an andere antigenisch und verwandte Moleküle. Ein gereinigter Antikörper der Erfindung ist vorzugsweise immunreaktiv mit und immunspezifisch für eine spezifische Spezies und stärker bevorzugt immunspezifisch für natives PrP^C und für behandelte oder denaturierte Formen von PrP^C und PrP^Sc, jedoch nicht für natives oder unbehandeltes PrP^Sc.
„Antigenes Fragment" eines Proteins (z. B. eines PrP-Proteins) bedeutet ein Teil eines solchen Proteins, der einen Antikörper binden kann.
Der Begriff „bindet spezifisch" bedeutet eine hohe Avidität und/oder hohe Affinitätsbindung eines Antikörpers an ein spezifisches Polypeptid, z. B. Epitop eines Proteins, z. B. ein PrP^C- oder ein A4β-Protein. Die Antikörperbindung an sein Epitop an diesem spezifischen Polypeptid ist vorzugsweise stärker als die Bindung desselben Antikörpers an ein beliebiges anderes Epitop, insbesondere diejenigen, die in Molekülen in Verbindung mit oder in derselben Probe von dem spezifischen Polypeptid von Interesse vorliegen können, z. B. bindet er stärker an Epitopfragmente eines Proteins wie PrP^Sc, so dass durch Anpassen der Bindungsbedingungen der Antikörper fast ausschließlich an Epitopstellen oder Fragmenten eines gewünschten Proteins wie eines Epitopfragments, das durch Behandlung von PrP^Sc und nicht nativen unbehandelten PrP^Sc freigelegt ist, bindet.
Die Begriffe „nachweisbar markierter Antikörper", „nachweisbar markiertes Anti-PrP" oder „nachweisbar markiertes Anti-PrP-Fragment" bedeuten ein Antikörper (oder ein Bindungsspezifität beibehaltendes Antikörperfragment) mit einer angehängten nachweisbaren Markierung. Die nachweisbare Markierung ist gewöhnlich durch chemische Konjugation angehängt, falls jedoch die Markierung ein Polypeptid ist, könnte sie in einer anderen Ausführungsform durch genetische Aufbautechniken angehängt sein. Verfahren zur Herstellung von nachweisbar markierten Proteinen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Auf dem Fachgebiet bekannte nachweisbare Markierungen sind jedoch gewöhnlich Radioisotope, Fluorophore, paramagnetische Markierungen, Enzyme (z. B. Meerrettich-Peroxidase) oder andere Einheiten oder Verbindungen, die entweder ein nachweisbares Signal (z. B. Radioaktivität, Fluoreszenz, Farbe) oder ein nachweisbares Signal nach Einwirken der Markierung auf ihr Substrat aussenden. Verschiedene nachweisbare Markierung/Substrat-Paare (z. B. Meerrettich-Peroxidase/Diaminobenzidin, Avidin/Streptavidin, Luciferase/Luciferin), Verfahren zum Markieren von Antikörpern und Verfahren zur Verwendung von markierten Antikörper sind dem Fachgebiet bekannt (siehe z. B. Harlow and Lane, Hg. (Antibodies: A Laboratory Manual (1988) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)). Europium ist eine besonders bevorzugte Markierung.
Hier verwendete Abkürzungen schließen ein:
ZNS für zentrales Nervensystem;
BSE für spongiforme Rinderenzephalopathie;
CJD für Creutzfeldt-Jakob-Krankheit
FFI für tödlich verlaufende angeborene Insomnie;
GSS für Gerstmann-Strassler-Scheinker-Krankheit;
Hu für menschlich;
HuPrP für menschliches Prionprotein;
Mo für Maus;
MoPrP für Mäuse-Prionprotein;
SHa für Syrienhamster:
SHaPrP für ein Prionprotein eines Syrienhamsters;
Tg für transgen;
Tg(SHaPrP) für eine transgene Maus, enthaltend das PrP-Gen eines Syrienhamsters;
Tg(HuPrP) für transgene Mäuse, enthaltend das vollständige humane PrP-Gen;
Tg(ShePrP) für transgene Mäuse, enthaltend das vollständige Schaf-PrP-Gen;
Tg(BovPrP) für transgene Mäuse, enthaltend das vollständige Kuh-PrP-Gen;
PrP^Sc für die Traberkrankheit-Isoform des Prionproteins;
PrP für die zellulär enthaltende übliche normale Isoform des Prionproteins;
MoPrP^Sc für die Traberkrankheit-Isoform des Mäuseprionproteins;
MHu2M für ein chimäres Mäuse/menschliches PrP-Gen, wobei eine Region des
Mäuse-PrP-Gens durch eine entsprechende menschliche Sequenz ersetzt ist, die sich vom Mäuse-PrP an neun Kodons unterscheidet;
Tg(MHu2M)-Mäuse sind transgene Mäuse der Erfindung, die das chimäre MHu2M-Gen einschließen;
MHu2MPrP^Sc für die Traberkrankheit-Isoform des chimären menschlichen/Mäuse-PrP-Gens;
PrP^CJD für die CJD-Isoform eines PrP-Proteins;
Prnp^0/0 für die Ablation von beiden Allelen eines endogenen Prionproteingens, z. B. des MoPrP-Gens;
Tg(SHAPrP^+/0)81/Prnp^0/0 für eine bestimmte Reihe (81) von transgenen Mäusen, die SHaPrP exprimieren, +/0 gibt heterozygot an;
Tg(HuPrP)/Prnp^0/0 für eine Hybridmaus, die durch Kreuzen einer Maus mit einem menschlichen Prionproteingen (HuPrP) erhalten wird, mit einer Maus, in welcher beide Allele des endogenen Prionproteingens unterbrochen sind;
Tg(MHu2M)/Prnp^0/0 für eine Hybridmaus, die durch Kreuzen einer Maus mit einem chimären Prionproteingen (MHuPrP) erhalten wird, mit einer Maus, in welcher beide Allele des endogenen Prionproteingens unterbrochen sind;
TTR für Transthyretin;
FVB für einen standardmäßigen Inzuchtstamm von Mäusen, der häufig bei der Herstellung von transgenen Mäusen verwendet wird, da Eier der FVB-Mäuse relativ groß sind und Mikroinjektion von exogener DNA relativ gut tolerieren;
[PrP_β]-Konzentration von Prionprotein von β-Faltblatt-Konformation;
[βA4_β]-Konzentration von βA4 in β-Faltblatt-Konformation;
[DRC]-Konzentration einer krankheitsverbundenen Konformation eines Proteins.
ALLGEMEINE ASPEKTE DER ERFINDUNG
Das Testverfahren umfasst das Bereitstellen einer Probe, welche im Verdacht steht, dass sie ein Protein enthält, das eine erste Konformation und eine zweite krankheitsverbundene Konformation annimmt und eine Krankheitsformation des Proteins nachweisen kann, wenn es in sehr geringer Konzentration in Bezug auf die Konzentration der Nichtkrankheitskonformation vorliegt. Die Probe wird in einen ersten Teil und in einen zweiten Teil aufgeteilt. Der erste Teil wird vorzugsweise an die Oberfläche eines festen Trägers gebunden und anschließend mit einem markierten Antikörper in Kontakt gebracht. Der Antikörper ist von einem Typ, der das Protein in seiner ersten Konfiguration mit einem höheren (einem vierfachen oder größeren) Affinitätsgrad als das Protein in seiner zweiten krank heitsverbundenen Konformation bindet. Der zweite Teil der Probe wird dann in einer Weise behandelt, die bewirkt, dass ein beliebiges Protein in der zweiten, krankheitsverbundenen Konformation eine andere Konformation annimmt, wobei die Konformation verglichen mit der Affinität für das Protein in der unbehandelten zweiten krankheitsverbundenen Konformation einen höheren Affinitätsgrad (den vierfachen oder größeren) für den markierten Antikörper aufweist. Der behandelte zweite Teil wird dann vorzugsweise an die Oberfläche des festen Trägers gebunden. Das an den Träger gebundene behandelte Protein wird dann mit einem markierten Antikörper unter Bedingungen, die die Bindung des Antikörpers an Proteine in der ersten Konfiguration oder Proteine in der angenommenen anderen Konfiguration gewähren, in Kontakt gebracht.
Nachdem die markierten Antikörper unter ausreichenden Zeit-, Temperatur- und chemischen Bedingungen (z. B. pH-Wert) zum Binden der in den jeweiligen Teilen vorliegenden geeigneten Proteine bereitgestellt wurden, wird der Bindungsgrad des markierten Antikörpers am Protein in jedem Teil bestimmt. Ein hochempfindlicher Test wie ein Test, der zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz beinhaltet, wird verwendet, wodurch es möglich wird, Konzentrationen in einer Menge im Bereich von etwa 1 × 10³ Teilchen pro ml oder weniger nachzuweisen. Ein hoher Empfindlichkeitsgrad ist erforderlich, da in den meisten Proben die Proteinkonzentration in der Krankheitskonformation im Vergleich zu der Proteinkonzentration der Nichtkrankheitskonformation z. B. um drei Größenordnungen oder mehr unterschiedlich, sehr gering ist. Zum Beispiel kann die Nichtkrankheitskonformation des Proteins in einer Menge von etwa 1 × 10⁸ Teilchen/ml vorliegen, während die Krankheitskonformation des Proteins nur in einer Menge von 1 × 10⁴ Teilchen/ml vorliegt. Folglich ist eine Erhöhung des Signals, das aufgrund der Behandlung der Krankheitskonformation des Proteins zu bemerken ist, in Bezug auf das Signal, das von dem Protein in der Nichtkrankheitskonformation erhalten wird, sehr klein.
Nachdem der Bindungsgrad für beide Teile der Probe erhalten ist, werden die Grade verglichen. Zum Beispiel wird der Bindungsgrad eines markierten Antikörpers an einem Protein im ersten Teil vom Bindungsgrad eines Antikörpers am Protein im zweiten Teil subtrahiert. Die Differenz zwischen den beiden gibt nach Anpassen der Differenzen, die (wenn überhaupt) durch Erhöhen der Bindungsaffinität des Proteins im ersten Teil bewirkt wurden, die in der ursprünglichen Probe vorliegende Menge des in der zweiten krankheitsverbundenen Konformation vorliegenden Proteins an.
Insbesondere können bei einigen Proteinen aufgrund der Wirkung der Behandlung der in der nativen Nichtkrankheitskonformation vorliegenden Proteine einige Differenzen vorhanden sein – z. B. werden mehr Epitope des Proteins in krankheitsverbundener Konformation für die Behandlung freigelegt. Diese Differenz sollte beim Ziehen von Rückschlüssen in Bezug dessen in Betracht gezogen, ob die ursprüngliche Probe Proteine in der zweiten krankheitsverbundenen Konformation einschloss. Eine Berücksichtigung dieser Wirkung ist in den 3 und 4 dargestellt. In 3 ist ein Vergleich der Antikörperbindung an eine unbehandelte Probe dargestellt, die nur natives Protein in ihrer Nichtkrankheitsform mit demselben nativen Protein nach Behandlung enthält. Wie in 3 dargestellt, liegt eine geringe Differenz zwischen den Ergebnissen, die mit dem Protein behandelt wurden und die ein stärkeres Signal zeigen, vor, in dem die Behandlung die Bindungsaffinität des Proteins erhöhte. Jedoch zeigt 4 dieselben Ergebnisse, wenn die ursprüngliche Probe in der zweiten krankheitsverbundenen Konformation vorliegende Proteine einschloss. Die nativen nicht behandelten Proteine stellen ein sehr schwaches Signal bereit. Jedoch stellen die behandelten Proteine ein sehr starkes Signal bereit. Die große Differenz zwischen den behandelten und unbehandelten Proben wird aus der Angabe dessen deutlich, dass die ursprüngliche Probe Proteine mit der zweiten krankheitsverbundenen Konformation einschloss, indem diese Proteine an Antikörper nicht binden oder an Antikörper mit sehr niedrigen Affinitätsgrad binden. Jedoch binden nach Be handlung diese Proteine an Antikörpern so wie oder fast wie oder besser als die behandelten Proteine in der Nichtkrankheitskonformation.
Der Test kann zum Testen der Gegenwart der Krankheitskonformation eines vorgegebenen Proteins in jedem beliebigen Probetyp verwendet werden. Einige der typischsten zu testenden Proben schließen Arzneimittel ein, die von lebenden Säugern abgeleitete Komponenten einschließen oder bei ihrer Verarbeitung von lebenden Säugern abgeleitete Materialien verwenden. Es wäre wünschenswert, Organe zur Transplantation und Nahrungsmittel wie Rindfleisch zu testen, die im Verdacht stehen, dass sie infektiöse Prionen enthalten. Die Erfindung könnte zum Testen auf die Gegenwart der Krankheitskonformation eines oder mehrerer Proteintypen wie infektiöses PrP^Sc in Arzneimitteln, Kosmetika, Biopsie- oder Autopsiegewebe, Gehirn, Rückenmark, Peripheralnerven, Muskeln, Hirnflüssigkeit, Blut oder Blutkomponenten, Lymphknoten und in vom Tier oder Menschen abgeleiteten Kulturen, die durch Krankheitsformen von Proteinen wie Prionen infiziert oder möglicherweise infiziert sind, verwendet werden.
BEHANDLUNG ODER DENATURIERUNG
Wie vorstehend angegeben, kann „Behandeln" das Einwirken auf die Proteine von beliebigen physikalischen und/oder chemischen Mittel einschließen, die bewirken, dass das ursprünglich in einer engen krankheitsverbundenen Konformation vorliegende Protein eine entspanntere Konformation mit einem höheren Bindungsaffinitätsgrad für einen beliebigen Bindungspartner wie Antikörper annimmt. Im Allgemeinen beinhaltet die Behandlung oder Denaturierung, wie sie manchmal hier bezeichnet wird, dass das Protein mit einigen Mitteln in Verbindung gebracht wird, die bewirken, dass Epitope auf dem Protein, für welches sie vorher nicht freigelegt waren, so freigelegt werden, dass ein Antikörper oder ein anderer Bindungspartner das neu freigelegte Epitop binden kann. Die Verfahren der Behandlung, die verwendet werden können, schließen ein: (1) physikalische Verfahren, wie hydrostatischer Druck oder Temperatur, (2) chemische Verfahren, wie saurer oder alkalischer pH-Wert, chaotropische Salze, Denaturierungsdetergentien und Proteinasen wie Proteinase K und (3) Kombinationen von Vorstehendem.
Die Behandlungszeit variiert abhängig von der verwendeten Behandlung, sollte jedoch für eine ausreichende Zeitdauer zum Freilegen von neuen Bindungsstellen, jedoch nicht so lange, dass das Protein vollständig denaturiert wird, durchgeführt werden.
VORBEHANDELN ODER PROTEINENTFERNUNG/-ZERSTÖRUNG
Vor der Durchführung des Antikörpertests des jeweiligen Teils der Probe kann es erwünscht sein, die Probe einer Vorbehandlung zu unterwerfen. Die Vorbehandlung wird durchgeführt, um die Nichtkrankheitsform des in der Probe vorliegenden Proteins zu zerstören oder zu entfernen. Beispiele für die Vorbehandlungsmethodologie schließen das Herstellen einer Säule ein, die an die Trägeroberflächen gebundene Antikörper einschließt, wobei die Antikörper an die Nichtkrankheitskonformation des Proteins binden, wodurch soviel der Nichtkrankheitskonformation der Proteine wie möglich entfernt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Probe einer physikalischen Behandlung wie lang anhaltendem hydrostatischem Druck oder Temperatur allein oder in Kombination mit Chemikalien wie Säuren oder Basen wie vorstehend bei der „Behandlungs"phase angegeben, jedoch für eine längere Dauer und in einer solchen Weise, dass die in der Probe vorliegenden Proteine zerstört werden, wobei die Proteine in der Nichtkrankheitskonformation vorliegen, unterworfen werden. In manchen Fällen werden Proteine in der Nichtkrankheits- und Krankheitskonformation zerstört. Jedoch wird ein relativ höherer Prozentgehalt der Proteine in der Nichtkrankheitskonformation zerstört, da diese Proteine anfänglich in einer losen Konformation vorliegen, die für Zerstörung angreifbarer ist. Folglich führt die Vorbehandlungsmethodologie zu einer Probe, die eine relativ geringere Konzentration der Nichtkrankheitskonformation des Proteins in Bezug auf die Konzentration der Krankheitskonformation des Proteins einschließt. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Tests, wodurch es möglich wird, niedrigere Konzentrationen der Krankheitsform des Proteins nachzuweisen. Die Entfernung von Proteinen ist gegenüber der Zerstörung bevorzugt, da sie die verminderte Empfindlichkeit der Krankheitskonformation zerstört. Ein besonders nützliches Vorbehandlungsverfahren ist in unserer Patentanmeldung, Prozessnummer des Bevollmächtigen 6510/098001, eingereicht gleichzeitig mit der vorliegenden Anmeldung mit dem Titel („Process for Concentrating Protein Disease-Related Confirmation" (nun veröffentlicht als WO99/42487)) offenbart.
AUFBRINGEN VON PROTEINEN AUF TRÄGEROBERFLÄCHEN
Das Verfahren von chemischer Kopplung oder Affinitätskopplung von PrP-Protein an den Kunststoffträger ist allgemein in verfügbarer Literatur beschrieben und kann variieren. Bei den im diagnostischen Test verwendeten Antikörpern handelt es sich um polyklonales, monoklonales oder rekombinantes Fab, und sie müssen Spezies sein, die mit der bevorzugten Bindung an natives PrP^C oder der denaturierten Form von PrP^Sc mit vorzugsweise mindestens vierfach geringerer Reaktivität mit infektiösem PrP^Sc spezifisch sind, indem sie dieselbe Menge des Antigens annehmen.
VERWENDUNG DES TESTS ZUM NACHWEIS VON PRIONEN
Bei einem Aspekt der Erfindung handelt es sich um ein zweistufiges Verfahren zum Diagnostizieren einer Prionkrankheit durch quantitatives Messen der nativen infektiösen Form von PrP^Sc-Protein in einem Probenmaterial oder in Gehirn von Tieren, die in Verdacht stehen, mit einem solchen Material beimpft zu sein. Die Probe wird in zwei Aliquots aufgeteilt. Der erste Aliquot wird mit der festen Kunststoffoberfläche in nativer Konformation durch einen chemischen Aktivierungsschritt unter nicht denaturierenden Bedingungen, d. h. ohne Behandlung, vernetzt. Der zweite Teil der Probe wird zuerst behandelt und dann mit dem Kunststoffträger vernetzt. Beide Teile des Probenmaterials reagieren in situ mit den markierten Antikörpern, die vorzugsweise natives PrP^C oder behandeltes PrP^Sc einer vorgegebenen Tierspezies erkennen. Die Menge des zum Behandeln gebundenen Antikörpers oder der nativen Konformationen von PrP-Protein wird durch das Signal der IgG-Markierung aufgezeichnet. Das Übermaß des mit der denaturiereen Probe erhaltenen Signals gegenüber demjenigen, das von einer Erhöhung des Signals zu erwarten ist, das mit der nativen α-helikalen Konformation von PrP^C erhalten wird (d. h. der Erhöhung gegenüber der eingestellten Menge) ist das Maß für die Menge von infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem PrP^Sc in der ursprünglichen Probe. Die zur Berechnung des PrP^Sc-Gehalts entwickelte Formel ist in den hier bereitgestellten Formeln dargestellt und in Beispiel 11 veranschaulicht.
Die Diagnose einer Prionkrankheit gründet sich auf drei Verfahren: (1) Messung einer behandelten Probe allein und durch Nachweisen der Erhöhung in der Gesamt-PrP-Menge in der untersuchten Probe über den Hintergrundgehalten von aus normalen Kontrollen erhaltenem PrP^C; (2) Berechung des Verhältnisses zwischen denaturiertem gegen nativem Signal für einen vorgegebenen Antikörper – z. B. geben Werte, die höher als 2,2 sind, für Europium-markiertes 3F4 IgG vorzugsweise unter Verwendung von zeitaufgelöster, durch Dissoziation verstärkter Fluoreszenz die Gegenwart von PrP^Sc an; (3) Bewertung des Übermaßes des Signals der denaturierten Probe gegenüber demjenigen, das aus einer Erhöhung im Signal für eine α-helikale Konformation von PrP^C als Maß der Menge von infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem PrP^Sc in der ursprünglichen Probe erwartet wird. Vorzugsweise verwendet Schritt 1 einen Vorbehandlungsschritt, wobei PrP^C in relativen Mengen, die größer als diejenigen von PrP^Sc sind, entfernt oder zerstört wird.
In einem mit Traberkrankheit infiziertem Syrienhamstergehirn ist die Konzentration von PrP^Sc um das 5–10fache höher als diejenige von PrP^C, wenn die Tiere erkranken. Zu diesem Zeitpunkt beträgt der Priontiter in deren Gehirnen 10⁷–10⁸ ID₅₀-Einheiten/ml von 10% Homogenat. Das von uns entwickelte hoch quantitative System gewährt die Subtraktion des PrP^C-Signals. Die Subtraktion kann leicht durchgeführt werden, wenn die Konzentration von PrP^Sc größer als diejenige von PrP^C ist. Jedoch wird die Subtraktion schwierig, wenn die Konzentration von PrP^Sc viel geringer als diejenige von PrP^C ist.
Um das vorstehende Problem anzugehen, verwendet der vorliegende Test das Affinitätsprinzip zwischen verschiedenen Konformationen von Antigen und Antikörper. Zum Messen der Konzentration von PrP^Sc, wenn sie viel geringer als diejenige von PrP^C ist, weist das Nachweissystem eine extreme Empfindlichkeit und einen linearen Bereich von mindestens 10⁴ auf. Der hier beschriebene Test kann unter Verwendung von Europium-markiertem IgG leicht PrP^Sc mit einer Konzentration von (etwa) 50 pg/ml nachweisen. Unter Annahme von 10⁵–10⁶ PrP^Sc Moleküle pro ID₅₀-Einheit kann der vorliegende Test leicht 5 × 10²–5 × 10³ ID₅₀-Einheiten pro ml nachweisen.
Der Test kann PrP^Sc (durch ein direktes Verfahren) in Gemischen nachweisen, in welchen die Konzentration von PrP^Sc weniger als 1% der Konzentration von PrP^C beträgt. Eine zusätzliche Empfindlichkeit kann durch Immunpräzipitation unter Verwendung eines Sandwich-Formats für einen Festzustandstest, Differentialzentrifugation mit Detergenzextraktion zum Entfernen von PrP^c, das indirekte transgene Tierverfahren oder Kombinationen dieser Verfahren erzielt werden. Eine vorsichtige Schätzung lautet dahingehend, dass ein solches Verfahren eine Messung zwischen 5 und 50 ID₅₀-Einheiten pro ml gewähren sollte oder weniger vorsichtig, zwischen 0,1 und 0,01 ID₅₀ Einheiten pro ml messen sollte. Solche Messungen würden ein schnelles „positives" Mittel zum Bewirken von biologischer Sterilität, das die „Abwesenheit" von Infektiösität ist.
VERFAHREN ZUR ARZNEIMITTELIDENTIFIKATION
Der vorstehend beschriebene Test, der die Gegenwart einer Krankheit verbundenen Konformation eines Proteins identifizieren kann, kann zum Identifizieren von Verbindungen angewandt werden, die dann als Arzneimittel zur Behandlung oder Verhütung von mit der Krankheitskonformation des Proteins verbundenen Krankheiten verwendet werden könnten. Zum Beispiel können Zusammensetzungen, von welchen bekannt ist, dass sie krankheitsverbundene Konformationen eines Proteins einschließen, zum Beimpfen einer transgenen Maus des im U.S. Patent 5,565,186 und in der PCT-Veröffentlichung WO97/04814 offenbarten und beschriebenen Typs verwendet werden. Die beimpfte Maus kann dann mit einer Verbindung behandelt werden, von welcher angenommen wird, dass sie die Infektion verhindert. Nach Bereitstellen einer ausreichenden Zeitdauer der Inkubation wird das Mäusegehirn dann extrahiert und unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests zur Bestimmung, ob die Behandlungsverbindung beim Verhindern von Infektion wirksam war, getestet. Die Methodologie könnte auch auf Situationen angewandt werden, in welchen die Infektion schon stattgefunden hat, um zu bestimmen, ob eine bestimmte Verbindung die Infektion stabilisieren, d. h., eine weitere Bildung der krankheitsverbundenen Konformation des Proteins verhindern könnte.
Der Test der vorliegenden Erfindung kann in Kombination mit der in der früher eingereichten WO97/16728 offenbarten Methodologie verwendet werden. Diese Anmeldung offenbart Verbindungen, die mit Proteinen in einer Nichtkrankheitskonformation in Kontakt gebracht werden können, um diese Verbindungen zu einer Krankheitskonformation umzuwandeln. Die Methodologie ist dahingehend nützlich, dass sie gewährt, dass Verbindungen auf ihre Fähigkeit zum Verhindern der Bildung der krankheitsverbundenen Konformation des Proteins gescreent werden können. Der Test der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, die Wirkung einer beliebigen Testverbindung beim Verhindern der Bildung der krankheitsverbundenen Konformation genau zu messen.
Auf der Basis von Vorstehendem ist ersichtlich, dass die Erfindung ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen einschließt, die die konformationelle Form eines beliebigen Proteins, das eine erste nichtkrankheitsverbundene Konformation (z. B. PrP^C) und eine zweite krankheitsverbundene Konformation (z. B. PrP^Sc) aufweist, beeinflussen kann. Das Verfahren beinhaltet: zuerst Bereitstellen einer Probe mit dem in der ersten Nichtkrankheitskonformation vorliegenden Protein. Die Probe wird dann mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht, die auf ihre therapeutische Verwendbarkeit zu screenen ist. Nach Zugabe der Testverbindung wird die Probe dann mit einer Verbindung oder einer Gruppe von Verbindungen in Kontakt gebracht, die induzieren, dass das Protein in der ersten Nichtkrankheitskonformation zu der zweiten Krankheitskonformation umgewandelt wird. Nach Verstreichenlassen einer ausreichenden Zeitdauer wird die Probe dann unter Verwendung der vorliegenden Erfindung getestet. Der Test der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, genau zu bestimmen, wie die Testverbindung die Umwandlung des Proteins von der Nichtkrankheitskonformation zu der Krankheitskonformation beeinflusste. Es ist dem diese Offenbarung lesenden Fachmann klar, dass die Testverbindung zu verschiedenen Zeitpunkten in Bezug auf die Zugabe der die konformationelle Änderung beeinflussenden Verbindung zugesetzt werden kann. Dadurch kann die Methodologie zum Bestimmen der Fähigkeit einer Testverbindung zum Stabilisieren von weiteren Änderungen von der Nichtkrankheitskonformation zu der Krankheitskonformation und/oder zum Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung zum Verhindern der Initiierung einer beliebigen Umwandlung von der Nichtkrankheitskonformation zu der Krankheitskonformation verwendet werden. Obwohl WO97/16728 ein Mittel zum Umwandeln einer Nichtkrankheitskonformation zu einer Krankheitskonformation offenbart, sind andere Mittel zum Erhalt desselben Ergebnisses dem Fachmann beim Lesen der vorliegenden Erfindung und beim Rückblicken auf den Stand der Technik in Verbindung damit klar. Demzufolge soll die vorliegende Erfindung ein beliebiges physikalisches, chemisches oder biologisches Mittel umfassen, das zum Umwandeln eines Proteins in einer ersten Nichtkrankheitskonformation zu einer zweiten krankheitsverbundenen Konformation und unter Anwenden des hier beschriebenen Tests verwendet wird. Ferner soll die vorliegende Erfindung therapeutische Verbindungen, die als Ergebnis der Durchführung des Screeningverfahrens der Erfindung erhalten werden, d. h. durch das Verfahren der Erfindung hergestellte Verbindungen, umfassen.
ANTIKÖRPER
Verfahren zum Bilden von Antikörpern sind dem Fachmann allgemein bekannt. Dadurch, dass die Krankheitsform oftmals eine engere Konfiguration als die Nichtkrankheitsform mit weniger freigelegten Epitopen aufweist, können leicht Antikörper gebildet werden, die nur die Nichtkrankheitsform des Proteins oder die behandelte Krankheitsform binden. Zum Beispiel können Antikörper, die behandelte Formen von PrP^Sc-Protein und PrP^C-Protein nachweisen, durch Immunisieren von Kaninchen oder Mäusen mit α-helikalen Konformationen von rekombinantem PrP, nativem PrP^C von Tiergehirnen, synthetischen Peptiden in α-helikalen oder statistischen Spiralenkonformationen oder gegen denaturiertes PrP^Sc oder PrP 27–30 gebildet werden. Nur Antikörper mit einer Affinität, die um mindestens das 4fache höher als für PrP^c (oder der denaturuierten Konformation von PrP^Sc derselben Spezies) verglichen mit deren Affinität für PrP^Sc ist, sollten ausgewählt werden. Das Verfahren der Antikörperbildung, Reinigung, Markierung, und des Nachweises können variieren.
Das IgG oder die Fabs können durch Affinitäts-HPLC unter Verwendung einer Protein-A-Säule und Größenausschluss-HPLC von verschiedenen Quellen gereinigt werden. Die gereinigten Antikörper können mit Europium markiert und durch zeitaufgelöste Fluoreszenz nachgewiesen werden. Die Antikörperbindung an verschiedenen Konformationen von PrP-Protein kann durch zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen werden. Jedoch kann das Nachweissystem von PrP-gebundenem IgG auf einem festen Träger in situ oder in Lösung variieren. Ferner ist es möglich, direkte oder indirekte immunologische Verfahren, einschließlich direkte Radiomarkierungen, Fluoreszenz, Lumineszenz, Avidin-Biotinamplifikation oder enzymgebundene Tests mit Farb- oder Lumineszenz-Substraten zu verwenden.
Ein Antikörper, der in der Erfindung verwendet werden kann, ist in US 4,806,627 , erteilt am 21. Februar 1989, offenbart, die einen monoklonalen Antikörper 263K 3F4 offenbart, der durch die Zellreihe ATCCHB9222, hinterlegt am 8. Oktober 1986, hergestellt wird und hier unter Bezugnahme eingebracht ist. Die den Antikörper herstellende Zellreihe kann von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 erhalten werden.
Im Allgemeinen versagt die Traberkrankheitinfektion bei der Herstellung einer Immunreaktion, wobei der Wirtsorganismus PrP^Sc von derselben Spezies toleriert. Antikörper, die entweder an PrP^C oder PrP^Sc binden können, sind in WO97/10505, veröffentlicht am 20 März 1997, offenbart. Jede beliebige Antikörperbindung an PrP^C und nicht an PrP^Sc kann verwendet werden, und der Fachmann kann solche unter Verwendung von bekannten Verfahren bilden, siehe z. B. Verfahren zur Herstellung von Pagen-Display-Antikörpergenbanken in US 5,223,409 . Polyklonale Anti-PrP-Antikörper wurden somit in Folge von Immunisierung mit großen Mengen an Ameisensäure oder SDS-denaturiertem SHaPrP 27–30 in Kaninchen angehoben. [Bendheim, Barry et al. (1984) Nature 310: 418–421; Bode, Pocchiari et al. (1985) J. Gen. Virol. 66: 2471–2478; Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513–517]. Gleichermaßen wurden mehrere Anti-PrP-monoklonale Antikörper gegen PrP 27–30 in Mäusen hergestellt. [Barry und Prusiner (1986) J. Infect. Dis. 154: 518–521; Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J. Virol. 61: 3688–3693] Diese Antikörper wurden gegen Ameisensäure- oder SDS-denaturiertes PrP 27–30 gebildet und können natives PrP^C und behandeltes oder denaturiertes PrP^Sc sowohl von SHa als auch von Menschen gleich gut erkennen, jedoch nicht an MoPrP binden. Nicht überraschend wurden die Epitope dieser Antikörper von Regionen der Aminosäuredifferenzen zwischen SHa und MoPrPr enthaltenden Sequenz aufgenommen. [Rogers, Yehiely et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 3182–3186].
Es ist nicht völlig klar, warum viele Antikörper des in den vorstehend genannten Publikationen beschriebenen Typs an PrP^C und unbehandeltes oder denaturiertes PrP^Sc, jedoch nicht an natives PrP^Sc binden. Ohne an eine bestimmte Theorie ge bunden zu sein, wird darauf hingewiesen, dass dies erfolgen kann, da Epitope, die freigelegt werden, wenn das Protein in der PrP^C-Konformation nicht freigelegt ist oder teilweise in der PrP^Sc-Konfiguration versteckt ist – wobei das Protein relativ unlöslich und kompakter zusammengefaltet ist.
Zum Zwecke der Erfindung bedeutet eine Angabe darüber, dass keine Bindung stattfindet, dass die Gleichgewichts- oder Affinitätskonstante K_a 10⁶ l/mol oder weniger beträgt. Ferner ist eine Bindung so zu erkennen, dass sie vorliegt, wenn K_a 10⁷ l/mol oder mehr, vorzugsweise 10⁸ l/mol oder mehr beträgt. Die Bindungsaffinität von 10⁷ l/mol oder mehr kann auf Grund (1) eines einzelnen monoklonalen Antikörpers (d. h. von großen Zahlen an einer Art von Antikörpern) oder (2) einer Vielzahl von verschiedenen monoklonalen Antikörpern (z. B. großen Anzahlen von jedem von fünf verschiedenen monoklonalen Antikörpern) oder (3) großen Anzahlen an polyklonalen Antikörpern erfolgen. Es ist auch möglich, Kombinationen von (1)–(3) zu verwenden. Ausgewählte bevorzugte Antikörper binden, verglichen mit deren Bindung an die native Konformation von PrP^Sc, um das vierfache eifriger als die behandelten oder denaturierten PrP^Sc-Formen des Proteins. Die vierfache Differenz in der Bindungsaffinität kann unter Verwendung von mehreren verschiedenen Antikörpern als pro vorstehende (1)–(3) und als solche könnten einige der Antikörper in einem Gemisch weniger als eine vierfache Differenz aufweisen.
Eine Vielzahl von verschiedenen Testtypen der Erfindung kann mit einem oder mehreren verschiedenen Antikörpern verwendet werden. Der Fachmann erkennt, dass Antikörper mit bekannten Markierungen markiert und mit gegenwärtig verfügbaren Robotern, Sandwichtests, elektronischen Detektoren, Fließzytometrie und dergleichen verwendet werden können.
QUANTITATIVE BERECHNUNGEN
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Methodologie ist es möglich, die Differnez zwischen der von einer nichtbehandelten Probe erhaltenen Signalmenge und dem mit einer behandelten Probe erhaltenen Signal zu berechnen. Die Differenz stellt (nach Anpassen auf die Wirkung der Behandlung auf die Nichtkrankheitskonformation) die Menge (Konzentration) des Proteins in Krankheitskonformation, wenn es in der ursprünglichen Probe vorliegt, dar. Nach Erhalt der Differenz kann die hervorgebrachte Formel zum Berechnen der Proteinmenge in der Krankheitskonformation, die in der unsprünglichen Probe vorliegt, pro Volumeneinheit berechnet werden. a) Fn = Fnα + Fnβ → Fnα = Fn – Fnβ'Fnβ~Hintergrund b) Fd = Fdα + Fdβ ΔFn–d = ΔFαn–d + ΔFβn–d ΔFβn–d = Fd – Fn – ΔFαn–d [PrPβ] oder [DRC] ~ ΔFβn–d = Fd – (Fn*fαn–d)
Die Definition für jede der vorstehenden Variablen ist nun bereitgestellt.
F-Fluoreszenzsignal (man beachte, dass jedes nachweisbare Signal verwendet werden könnte);
F_n-Fluoreszenzsignal der nativen Konformation
F_nα und F_nβ Fluoreszenzsignale der nativen α- helikalen bzw. β-Faltblatt-Konformationen;
F_d-Fluoreszenzsignal von PrP in behandeltem oder denaturiertem Zustand
F_dα und F_dβ- sind die Signale von denaturiertem α-helikalen oder β-Faltblattzuständen von PrP;
ΔF_n→d-Erhöhung des Fluoreszenzsignals beim Übergang von nativen zu denaturiertem Zustand;
ΔF_nα→d-Erhöhung des Fluoreszenzsignals von α-helikaler Konformation beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand;
ΔF_βn→d-Erhöhung des Signals der β-Faltblatt-Konformation beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand;
f_αn→d-Korrelationsfaktor des Übergangs von nativem zu denaturiertem Zustand von α-helikalen PrP;
[PrP_β]-Konzentration von Prionprotein in β-Faltblatt-Konformation
[DRC]-Konzentration eines beliebigen Proteins in krankheitsverbundener Konformation.
Die vorstehend bereitgestellte Formel wird zum spezifischen Berechnen der Konzentration von Prionprotein in der β-Faltblatt-Konformation verwendet. Jedoch kann dieselbe Formel zum Berechnen der Konzentration eines beliebigen Proteins, d. h. der Konzentration einer beliebigen eingeschränkten Krankheitskonformation eines Proteins wie [βA4_β] verwendet werden. Allgemeiner stellt [DRC] die Konzentration der krankheitsverbundenen Konformation eines Proteins dar.
Zum Bereitstellen eines spezifischen Beispiels wurden die vorstehenden Definitionen spezifisch in Bezug auf PrP-Proteine bereitgestellt, wobei die Proteine mindestens eine entspannte Nichtkrankheitskonformation (PrP^C), die eine α-helikale Konfiguration einschließt, und mindestens eine eingeschränkte krankheitsverbundene Konformation (PrP^Sc), die eine β-Faltbaltt-Konfiguration einschließt, einschließen. Die Formeln werden zum Berechnen der Konzentration der krankheitsverbundenen Konformation des in der Probe vorliegenden Proteins verwendet. Gemäß den vorstehend bereitgestellten spezifischen Formeln und Definitionen werden die Formeln zum Berechnen der Konzentration von Prionproteinen verwendet, die die β-Faltblatt-Konfiguration einschließen (siehe Beispiel 11).
Das beim Berechnen der vorstehenden Formel verwendete Signal ist ein Fluoreszenzsignal. Jedoch kann jedes beliebige nachweisbare Signal verwendet werden. Das Gesamtsignal ist durch F_n dargestellt, das aus einer Kombination des Signals, das von der krankheits- und nichtkrankheitsverbundenen Konformationen empfangen wird, ist. Dies ist ein Signal, das aus dem nicht durch den vorstehend beschriebenen Test behandelten Teil Nr. 1 berechnet werden würde. Die Variable Fd ist das Signal, das durch Behandeln von Teil Nummer 2 der Probe erhalten wird. Das Signal ist eine Kombination des Signals, das aus dem behandelten Protein in der Nichtkrankheitskonformation plus dem behandelten Protein in der Krankheitskonformation empfangen wird.
Es ist erkennbar, dass eine Differenz in dem Signal, das durch Behandeln einer keine krankheitsverbundene Konformation des Proteins einschließenden Probe erhalten wird, vorliegt. Die Differenz sollte den Erhalt einer genauen Ablesung nachweisen. Die Differenz im Signal, das zwischen der nativen Probe und der behandelten Probe erhalten wird, ist natürlich eine Kombination der Differenz in dem Signal, das durch Behandeln der krankheitsverbundenen Konformation und der nicht krankheitsverbundenen Konformation erhalten wird. Die Erhöhung im Signal, das durch Behandeln der Krankheitskonformation erhalten wird, d. h., die Differenz zwischen dem Signal der unbehandelten Krankheitsformation und dem Signal, das von der behandelten Krankheitskonformation empfangen wird, kann durch Subtrahieren des Signals, das aus der Behandlung der gesamten Probe empfangen wird, von dem Signal, das durch Berechnen der Erhöhung des Signals, das von der unbehandelten Nichtkrankheitskonformation und der behandelten Nichtkrankheitskonformation erhalten wird, berechnet werden. Unter Verwendung dieser Gleichungen ist es möglich, die Endgleichung herzustellen, die die Konzentration des in der ursprünglichen Probe vorliegenden Proteins in der Krankheitskonformation bereitstellt (siehe Beispiel 11).
DIFFERENZIEREN (TYPIFIZIEREN) VON PROTEINSTÄMMEN
Verschiedene Tiere (einschließlich Menschen) können mit verschiedenen Stämmen von pathogenen Proteinen infiziert werden. Eine „Mutationstabelle" ist hier bereitgestellt, die einige der verschiedenen Mutationen, die mit verschiedenen Stämmen von Prioninfektionen verbunden sind, aufzählt. Zeitweise kann es wichtig sein, welcher spezifische Stamm ein Individuum infizierte, da eine solche Information (1) beim Bereitstellen einer genaueren Diagnose, (2) beim Verabreichen der geeigneten Behandlung oder (3) beim Bestimmen der Quelle der Infektion durch Abgleichen des Stamms mit einem Stamm in einer möglichen Infektionsquelle nützlich sein kann.
Der bestimmte Stamm eines pathogenen, eine Infektion verursachenden Proteins kann aus zwei Informationsteilen bestimmt werden, die unter Verwendung der vorliegenden Erfindung berechnet werden können. Beispiel 11 zeigt, wie die vorliegende Erfindung zum Bestimmen der absoluten Menge, d. h. der Konzentration von Prionen in einer Probe mit vorgegebener Größe verwendet werden kann. Beispiel 8 zeigt, wie der „Prion-Index", der das Verhältnis von Antikörperbindung an denaturiertem: nativem PrP-Protein ist, berechnet werden kann. Ein „Protein-Index" für andere Proteine ist das Bindungsverhältnis eines beliebigen Bindungspartners an der denaturierten: nativen Form des Proteins. Allgemein gesagt, ist der „Prion-Index" einfach eine numerische Charakterisierung des Einflusses, die die Behandlung auf das Protein hat.
Zur Bestimmung des bestimmten Stamms muss zuerst ein Standard für jeden Stamm berechnet werden. Dies wird durch Bestimmung des Einflusses (Prion-Index) einer bestimmten Behandlung auf eine bekannte Menge eines bekannten Stamms durchgeführt. Dies kann wie in 25 dargestellt graphisch dargestellt werden. Ist der Standard berechnet, kann der Stamm der anderen Proben leicht bestimmt werden – die Standards werden vorzugsweise bei einer Anzahl von verschiedenen Konzentrationen für jeden Stamm berechnet. Zum Bestimmen des Stamms einer einfachen Probe wird die Proteinkonzentration in der Probe unter Einfluss der Behandlung auf diese Konzentration berechnet. Die Ergebnisse werden auf den Standard (wie in 25) zum Bestimmen des Stamms abgeglichen. Beispiel 18 ist ein spezifisches Beispiel in Kombination mit 25. Dieselbe Konzentration desselben Stamms wird in derselben Weise durch eine vorgegebene Behandlung bewirkt. Jedoch wird dieselbe Konzentration von verschiedenen Stämmen verschiedenartig durch dieselbe Behandlung bewirkt, wodurch es möglich wird, den Stamm zu bestimmen.
KRANKHEITEN, DIE MIT UNLÖSLICHEN PROTEINEN VERBUNDEN SIND

Der Hauptteil der Offenbarung und der spezifischen Beispiele, die hier bereitgestellt sind, betreffen die Verwendung des Tests in Verbindung mit der Bestimmung der Gegenwart von PrP^Sc in der Probe. Wie jedoch vorstehend angegeben, kann der Test der Erfindung zum Bestimmen der Gegenwart eines beliebigen Proteins angewandt werden, das zwei verschiedene Konformationsformen annimmt, wobei eine davon mit der Krankheit verbunden ist. Bei Folgendem handelt es sich um eine nicht beschränkende Aufzählung von Krankheiten, die mit unlöslichen Proteinen verbunden sind, die zwei oder mehrere verschiedene Konformationen annehmen.

Krankheit	Unlösliche Proteine
Alzheimer-Krankheit	APP, Aβ-Peptid, α1-Antichymotrypsin, Tan, nicht-Aβ-Komponente
Prionkrankheiten Creutzfeld-Jakob-Krankheit Traberkrankheit und spongiforme Rinderenzephalopathie	PrP^Sc
ALS	SOD und Neurofilament
Pick-Krankheit	Pick-Körper
Parkinson-Krankheit	Lewy-Körper
Diabetes Typ 1	Amylin
Multiple Myelom-Plasma Zell-Dyskrase	IgGL-Kette
Angeborene amyloidotische Polyneuropathie	Transthyretin
Medulläres Schilddrüsen-Karzinom	Procalcitonin
Chronisches Nierenversagen	β₂-Mikroglobulin
Kongestives Herzversagen	Atrial natriuretischer Faktor
Senile Herz- und systemische Amyloidose	Transthyretin
Chronische Entzündung	Serum Amyloid A
Atherosklerose	ApoA1
Angeborene Amyloidose	Gelsolin

Es sollte angemerkt werden, dass die unlöslichen Proteine, die vorstehend aufgezählt sind, jeweils eine Anzahl von Varianten oder Mutationen einschließen, die zu verschiedenen Stämmen führen, die alle durch das Vorliegende umfasst sind. Bekannte pathogene Mutationen und Polymorphismen im mit Prionkrankheiten verbundenen PrP-Gen sind nachstehend und die Sequenzen von Mensch, Schaf und Rind in US 5,565,186 , erteilt am 15. Oktober 1996, angegeben.
Mutationstabelle
Es sollte angemerkt werden, dass solche Proteine zwei verschiedene dreidimensionale Konformationen mit derselben Aminosäuresequenz aufweisen. Eine Konformation ist mit Krankheitsmerkmalen verbunden und im Allgemeinen unlöslich, wohingegen die andere Konformation nicht mit Krankheitsmerkmalen verbunden und löslich ist. Die Methodologie der vorliegenden Erfindung ist auf die aufgezählten Krankheiten, Proteine und Stämme nicht beschränkt.
NACHWEIS DER β-FALTBLATTFORM VON βA4
Ein Aspekt der Erfindung beinhaltet ein zweistufiges Verfahren zum Diagnostizieren von Alzheimer-Krankheit auf der Basis der Gegenwart einer eingeschränkten Form eines Proteins (βA4-Amyloidose) durch quantitatives Messen der β-Faltblattform eines βA4-Proteins in einem Probenmaterial, z. B. im Gehirn oder in Körperflüssigkeiten. Die Probe wird in zwei Aliquots aufgeteilt. Das erste Aliquot wird mit einem festen Kunststoff-(langkettiges polymeres Material)Träger in nativer Konformation durch einen chemischen Aktivierungsschritt unter nicht denaturierenden Bedingungen vernetzt. Der zweite Teil der Probe wird zuerst denaturiert und dann mit dem Kunststoffträger vernetzt. Beide Teile des Probenmaterials reagieren in situ mit den markierten Antikörpern, die vorzugsweise lösliche βA4- oder denaturiertes βA4 des Menschen oder einer vorgegebenen Tierspezies erkennen. Die Menge des an denaturierten oder nativen Konformationen von βA4-Protein bindenden Antikörpers wird durch das Signal des markierten zweiten Antikörpers aufgezeichnet. Das Übermaß des mit der denaturierten Probe erhaltenen Signals verglichen mit der erwarteten Änderung im mit der nativen α-helikalen Konformation von βA4-Protein erhaltenen Signal ist das Maß der Menge an β-Faltblatt-strukturiertem βA4 in der ursprünglichen Probe. Die zur Berechnung des βA4-Gehalts entwickelte Formel ist vorstehend in Verbindung mit der Berechnung des PrP^Sc-Gehalts bereitgestellt.
Die Diagnose von βA4-Amyloidose (Alzheimer-Krankheit) gründet sich auf drei Verfahren: (1) Messung der denaturierten Probe allein und Nachweisen der Erhöhung der gesamten βA4-Menge (Konzentration) in der geprüften Probe über den Hintergrundgehalten von aus normalen Kontrollen erhaltenem löslichem βA4; (2) Berechnung des Verhältnisses zwischen denaturiertem gegenüber nativem Signal für einen vorgegebenen Antikörper (Protein-Index) – z. B. Werte von größer als zwei für den monoklonalen Antikörpern 6F3D und Europium-markierten sekundären Antikörper; (3) Bewertung der Änderung des denaturierten Probensignals gegenüber der erwarteten Änderung im Signal für α-helikale Konformation von βA4 als Maß der Menge von infektiösem β-Faltblatt-strukturiertem βA4 in der ursprünglichen Probe. Die zur Berechung des βA4-Gehalts entwickelte Formel ist vorstehend bereitgestellt. Der bestimmte Stamm von βA4 kann auch unter Verwendung derselben Methodologie bestimmt werden, die vorstehend zum Bestimmen des PrP^Sc-Stamms in einer Probe beschrieben ist.
Die Erfindung stellt ein direktes Diagnoseverfahren zum Nachweis der Gegenwart von pathogenen Formen von βA4-Protein in Arzneimittel, Biopsie- oder Autopsiegewebe, Gehirn, Rückenmark, peripheren Nerven, Muskeln, Hirnflüssigkeit, Blut und Blutkomponenten, Lymphknoten und in von Tier oder Mensch abgeleiteten Kulturen, die potentiell βA4-Protein exprimieren, bereit. Die Erfindung ermöglicht es, den Übergang von α-Helix- zu β-Faltblatt-Konformation eines βA4-Proteins oder seiner Fragmente synthetischen oder rekombinanten Ursprungs zu verfolgen, und ein Verfahren zum Screenen von Verbindungen auf ihre Fähigkeit zum Stabilisieren der normalen löslichen Konformation von βA4-Protein und folglich zum Verhindern der Umwandlung in pathogenes, unlösliches und β-Faltblatt-strukturiertes βA4-Protein bereitzustellen.
Typische Verfahren der Probendenaturierung schließen ein: (1) physikalische Verfahren (wie hydrostatischer Druck oder Temperatur), (2) chemische Verfahren (wie saurer oder alkalischer pH-Wert, chaotropische Salze oder Denaturierungsdetergentien) und (3) eine Kombination von Vorstehendem. Verfahren zum chemischen Koppeln oder Affinitätskoppeln von βA4-Protein an einen Kunststoffträger sind in der verfügbaren Literatur beschrieben und können variieren. Bei in diagnostischem Versuch verwendeten Antikörpern kann es sich um ein polyklonales, monoklonales oder rekombinantes Fab handeln, und sie müssen Spezies sein, mit der bevorzugten Bindung an die lösliche oder denaturierte Form von βA4 mit vorzugsweise mindestens der zweifachen Differenz in der Reaktivität zwischen α-helikalen und β-Faltblatt-strukturiertem βA4 unter Annahme derselben Antigenmenge.
Verfahren zur Probenanlagerung an den Kunststoffträger können variieren, und es kann sich dabei um eine kovalente oder nicht kovalente Anlagerung, wie in der verfügbaren Literatur beschrieben, handeln. Die Empfindlichkeit des in den Beispielen beschriebenen Tests kann unter Verwendung von Hochaffinitätsantikörpern, Sandwichformat, Immunpräzipitaion oder Differentialzentrifugation erhöht werden. Jedoch sollten nur die Antikörper mit einer Affinität von mindestens dem zweifachen für denaturiertes und verglichen mit der nativen β-Faltblatt-Konformation von βA4 derselben Spezies für den diagnostischen Test verwendet werden. Die Verfahren der Antikörperbildung, Reinigung, Markierung und des Nachweises können variieren. Die Antikörperbindung an verschiedene Konformationen von βA4-Protein wurde durch zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen. Jedoch kann das Nachweissystem von βA4-gebundenen IgG auf festem Träger in situ oder in Lösung variieren und direkte oder indirekte immunologische Verfahren, einschließlich direkte Radiummarkierungen, Fluoreszenz, Lumineszenz, Avidin-Biotin, Amplifikation, oder enzymgebundene Tests mit Farb- oder Lumineszenzsubstraten verwenden.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele sind eingebracht, damit dem Fachmann eine vollständige Offenbarung und Beschreibung darüber bereitgestellt wird, wie die Tests der vorliegenden Erfindung durchzuführen sind, und sollen weder den Rahmen dessen, was die Erfinder als ihre Erfindung betrachten, begrenzen, noch sollen sie so verstanden werden, dass die nachstehenden Versuche alle oder die einzigen durchgeführten Versuche sind. Bemühungen wurden durchgeführt, um die Genauigkeit in Bezug auf die verwendeten Angaben (z. B. Mengen, Temperatur, usw.) zu gewährleisten, jedoch sollten einige Versuchsfehler und Abweichungen berücksichtigt werden. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Teile Gewichtsteile, ist Molekulargewicht das Gewichtsmittel des Molekulargewichts, ist Temperatur in Grad Zentigrad angegeben und liegt der Druck bei oder in der Nähe von Atmosphärendruck.
BEISPIEL 1
EXPRESSION VON REKOMBINANTEN PRIONPROTEINEN
Zur Entwicklung und Kalibrierung der diagnostischen Tests wurden rekombinante Syrianhamster-Prionproteine der Sequenz 90–231 in α-helikale oder β-Faltblatt-Konformationen neu gefaltet [Mehlhorn, Groth et al. (1996) Biochemistry 35: 5528–5537].
PCR (Perkin-Elmer) wurde zum Amplifizieren der DNA verwendet, die den verschiedenen Teilen des Syrienhamster-Prionproteins entspricht, um sie in Sekretionsvektoren von E. coli zu binden. Verschiedene 5'-Oligonukleotidprimer wurden mit einer MluI-Restriktionsstelle in der C-terminalen Kodierungssequenz des STII-Signalpeptids [Lee, Moseley et al. (1983) Infect. Immun. 42: 264–268; Picken Mazaitis et al. (1983) Infect. Immun. 42: 269–275] und die anfänglichen Aminosäuren der entsprechenden PrP-Sequenz synthetisiert. Ein 3'-Oligonukleotidprimer, der dem 3'-Ende von PrP entspricht, ein Stoppkodon und eine BamHI-Restriktionsstelle wurden mit jedem der 5'-Oligonukleotide verwendet. Die PCR-amplifizierten Produkte wurden gereinigt, in die vorher mit MluI/BamHI aufgeschlossenen Vektoren verknüpft und in DH5a transformiert. Die die PrP-Verknüpfung enthaltenden Klone wurden sequenziert und in den Protease-armen Expressionsstamm 27C7 (ATCC# 55244) transformiert.
Eine Expression in großem Maßstab wurde, wie vorstehend für andere Proteine beschrieben, unter Verwendung eines anderen Mediums [Carter, Kelley et al. (1992) Biotechnologie 10: 163–167] durchgeführt; 500 ml einer Kultur, die man in LB Medium, ergänzt mit Ampicillin, über Nacht wachsen ließ, wurden in 7 l Fermentationsmedium in einem belüfteten Fermentator mit einem Volumen von 10 l (Braun, Modell E10) geimpft. Man ließ die Zellen bei 37°C mit einer hohen Rührgeschwindigkeit wachsen, und die Expression wurde durch Phosphat-Entzug induziert. Nach 4 Stunden wurde eine 50%ige Glukoselösung mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min zugesetzt; die Glukosegehalte wurden unter Verwen dung eines Glukose-Tauchstabs (Diastix, Miles Inc.) überwacht. Ein pH-Wert von 7,4 wurde während des Durchgangs durch die automatische Zugabe von 10%iger H₂SO₄ oder 24%iger NH₄OH beibehalten. Das Endvolumen betrug 10 l, wobei ein OD₆₀₀ von ≥ 100 nach 36 Stunden erzielt wurde. Das E. coli wurde durch Zentrifugation mit 10.000 × g für eine Dauer von 30 Minuten geerntet und die erhaltene Paste bei –20°C gelagert.
Zur Reinigung wurden 100 g der Paste aus E. coli in 1 l 25 mM Tris·HCl, pH 8,0, 5 mM EDTA (Puffer A), resuspendiert. Dies wurde bei 10.000 × g für eine Dauer von 20 Minuten zentrifugiert und der lösliche periplasmische Proteine enthaltende Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 l Puffer resuspendiert, zweimal durch eine Zell-Aufbrechapparatur (Mikrofluidics International, Modell MF110) geleitet und mit 30.000 × g für eine Dauer von 1 Stunde zentrifugiert, wonach der Überstand verworfen und das Pellet einmal in Puffer A gewaschen und wieder mit 30.000 × g für eine Dauer von 1 Stunde zentrifugiert wurde. In diesem Zustand konnte das Pellet bei –20°C vor der weiteren Abtrennung gelagert werden. Es wurde anschließend in 8 M Gdn·HCl/25 mM Tris-HCl, pH 8,0/100 mM DTT (Puffer B) angelöst und bei 14.000 × g für eine Dauer von 20 Minuten zentrifugiert, um den übrigen unlöslichen Stoff zu entfernen. Aliquots von 6 ml des 200 mg Gesamtprotein enthaltenden Überstands wurden durch Größenausschlusschromatographie (SEC) unter Verwendung einer Säule des Typs Hi-Load Superdex 200 (Pharmacia), eluierend mit 6 M Gdn·HCl/12,5 mM Tris-HCl, pH 8,0/5 mM DTT/1 mM EDTA (Puffer C) mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/Min, abgetrennt. Die Fraktionen, die mit dem rekombinanten Prionprotein, wie durch SDS-PAGE identifiziert, angereichert waren, wurden gepoolt und weiter durch Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) unter Einsatz einer C-4 Säule mit 25 mm × 25 cm (Vydac); Puffer 1: H₂O/0,1% TFA, Puffer 2: Acetonitril/0,09% TFA, Fließgeschwindigkeit 5 ml/Minute, gereinigt. Das rekombinante Protein rPrP wurde in Fraktionen gefunden, die 40% Acetonitril enthielten. Wurde SEC-Eluat bei 4°C für eine Dauer von einigen Tagen vor der RP-HPLC gelagert, wurde das rekombinante Protein in früheren Fraktionen, enthaltend nur 35%iges Acetonitril, eluiert.
Proben des reduzierten Proteins und der neu gefalteten oxidierten Form wurden unter Verwendung einer Centricon-Säule (Amikon) mit einem Molekulargewichtsabschnitt von 10.000 Da konzentriert. Der Puffer für das reduzierte Protein war 10 mM MES (pH 6,5), wohingegen die oxidierte Form in dem vorstehend beschriebenen Puffer für die Neufaltung konzentriert wurde. Die Konformationen der neu gefalteten oxidierten und reduzierten Formen von SHaPrP90-231-Protein wurden durch Spektroskopie des zirkulären Dichroismus (CD) (1) bestimmt.
BEISPIEL 2
REINIGUNG VON HAMSTER-PRP^C AUS NORMALEN UND PRP^SC AUS MIT DER TRABERKRANKHEIT INFIZIERTEN HAMSTERGEHIRNEN
Beide durch Beispiel 1 hergestellten Proteine wurden als Standards für den Priontest und zum Aufbau des Empfindlichkeits- und des Linearitätsbereiches des diagnostischen Verfahrens verwendet. Das gereinigte PrP^C des Syrienhamstergehirns wurde zur Kalibrierung des Prionprotein-Nachweises verwendet und mit Ergebnissen, die von rekombinantem SHaPrP90-231 in α-helikalen, β-Faltblatt- und denaturierten Konformationen erhalten wurden, korreliert. Das PrP^C-Protein wurde wie beschrieben mit einigen geringfügigen Modifikationen gereinigt [Pan, Stahl et al. (1992) Protein Sci. 1: 1343–1352; Pan, Baldwin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10962–10966]. Der Proteingehalt wurde durch Aminosäureanalyse bestimmt. Die Reinheit von PrP^C-Protein, wie auf SDS-PAGE, gefolgt Silberfärben und Western gezeigt, betrug ≥ 95%.
Standardmäßiges Syrienhamster-PrP^Sc wurde von einem Standardpool von mit dem Traberkrankheit-Stamm Sc237 infizierten Hamstergehirnen wie beschrieben, nur mit geringfügigen Modifikationen gereinigt [Turk, Teplow et al. (1988) Eur. J. Biochem. 176: 21–30]. Die Infektiösität dieses Standards, wie bestimmt durch einen Inkubationszeittest von Syrienhamstern nach intrazerebraler Beimpfung, betrug 10^7,3 ID₅₀/ml und die spezifische Infektiösität 10^8,2 ID₅₀/mg PrP^Sc-Protein. Jedoch kann die spezifische Infektiösität von Charge zu Charge um ±10^0,5 ID₅₀/mg variieren. Der Proteingehalt wurde durch den BCA-Test unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Das Präparat wurde mit einer Hauptbande auf SDS-PAGE nach Silberfärben und Western Blots als homogen betrachtet.
BEISPIEL 3
SELEKTIONS-, MARKIERUNGS- UND NACHWEISVERFAHREN VON IM TEST VERWENDETEN ANTIKÖRPERN
Die Protokolle und Verfahren der Antikörperherstellung und Charakterisierung sind im Allgemeinen andernorts beschrieben [Harlow and Lane (1988) vorstehend: 726]. Die in diesem und in den folgenden Beispielen beschriebenen Daten wurden mit den immunaffinitäts-gereinigten polyklonalen Antikörper N12 und P3 [Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513–517; Rogers, Serban et al. (1991) J. Immunol. 147: 3568–3574], gebildet gegen synthetische Peptide, entsprechend der Sequenz 90-145 (N12) und 222-231 (P3) von Syrienhamster-PrP [Barry, Vincent et al. (1988) J. Immunol. 140: 1188–1193], hergestellt; JS2 wurde gegen denaturiertem Syrienhamster-PrP 27-30 [Safar, Ceroni et al. (1990) Neurology 40: 513–517] hergestellt. Die Entwicklung und Eigenschaften des im Test verwendeten monoklonalen Antikörpers 3F4 sind andernorts [Kascsak, Rubenstein et al. (1987) J. Virol. 61: 3688–3693] und in US 4,806,627 beschrieben, wobei alle davon hier unter Bezugnahme zum Offenbaren und Beschreiben von Antikörpern, die mit der Erfindung verwendet werden können, und Verfahren zur Herstellung derjenigen und verwandten Antikörpern eingebracht sind. Die das rekombinante Fab erkennenden denaturierten Formen von Prionprotein wurden jüngst entwickelt. [Williamson, Peretz et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 7279–7282].
SHaPrP90-231 in α-helikalen, β-Faltblatt- und statistischen Spiralenkonformationen wurde kovalent an Glutaraldehyd-aktivierte Polystyrol-Platten gebunden und mit reihenverdünnten primären Antikörper inkubiert. Die mit jeder Konformation von SHaPrP90-231 reagierende IgG-Menge wurde entweder direkt mit Eu-markiertem 3F4 IgG oder indirekt mit Europium-markiertem Antikaninchen- oder Antimäuse-Antikörper gemäß üblichen Protokollen bestimmt, und das Gesamtsignal wurde durch zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen. Für die Versuchsentwicklung wurden Antikörper ausgewählt, bei welchen das Signalverhältnis von denaturierter gegen β-Faltblatt-Konformation von SHaPrP90-231 gleich oder höher als 4 war.
BEISPIEL 4
KONKURRENZFÄHIGES UND DIREKTES TESTFORMAT
Gereinigtes rekombinantes SHaPrP90-231, neu in α-helikale oder β-Faltblatt-Konformation gefaltet, wurde in 5%igem (g/v) Gehirnhomogenat, erhalten von einer PrP^0,0-Maus und enthaltend kein Prionprotein, verdünnt. Das Gehirnhomogenat wurde durch Verstärkungen von 30 Sekunden in einem PowerGen-Homogenisator, ausgestattet mit einer Kunststoffwegwerfsonde in TBS, pH 7,4, enthaltend einen Proteasehemmer-Cocktail (1 mM PMSF, 2 μg/ml Aprotinin, und 2 μg/ml Leupeptin) hergestellt und bei 5°C für eine Dauer von 5 Minuten mit 500 g in einer Desktop-Zentrifuge gedreht. Der erhaltene Überstand wurde in TBS mit einem Endvolumen von 4% (G/V) von Sarcosyl auf 1 : 1 verdünnt und wieder durch drei Verstärkungen mit 30 Sekunden in einem PowerGen-Homogenisator homogenisiert. Als Nächstes wurde das Homogenat mit verschiedenen Verdünnungen von rekombinantem SHaPrP90-231 in α-helikalen oder β-Faltblatt-Konformationen vermischt.
In einem typischen konkurrenzfähigen Test wird das Analyt-PrP in verschiedenen Konformationen mit Europium-markierten 3F4 IgG vorinkubiert und dann auf die Polystyrol-Platte, beschichtet mit rekombinantem SHaPrP90-231 in SDS- denaturiertem Zustand, überführt. Die Ergebnisse für Analyt-SHaPrP90-231 in α-helikalem und denaturiertem Zustand (2) gab eine deutliche Differenz sowohl in den verfügbaren Bindungsstellen als auch in der Affinität von Europium-markiertem 3F4 IgG mit verschiedenen Konformationen von Prionprotein an.
Im direkten Test wurde jede Probe der Verdünnungskurve in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt und als nativ bezeichnet, (2) gemischt mit endgültigen 4 M Gdn·HCl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C und als denaturiert bezeichnet. Beide Proben wurden auf das Zwanzigfache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf mit Glutaraldehyd aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit den vorstehend aufgezählten Europium-markierten Antikörpern inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in einer Verstärkerlösung, bereitgestellt durch den Lieferanten der Europium-Markierung (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
BEISPIEL 5
DIFFERENTIALTEST FÜR VERSCHIEDENE KONFORMATIONEN VON SHAPRP90-231
Die aus dem direktem Test mit Eu-markiertem 3F4 IgG erhaltenen Parameter wurden als Funktion der Konzentration aufgezeichnet. Die mit SHaPrP90-231 in α-helikaler Konformation (3) erhaltenen Ergebnisse geben die relativ kleine Differenz zwischen dem Signal von α-helikalem und denaturiertem Protein an. Die Empfindlichkeitsgrenze für denaturiertes PrP in Gegenwart von 5%igem Gehirnhomogenat beträgt ≤ 1 ng/ml, und die Linearität liegt im Bereich von 3 Größenordnungen. In den Versuchen mit der β-Faltblattform von SHaPrP90-231 (4) bindet Eu-markiertes 3F4 IgG stark an die denaturierte Form des Proteins. Im Gegensatz dazu überstieg die Reaktivität mit der nativen β-Faltblattform des Proteins den Hintergrund sogar mit hohen Proteinkonzentrationen nur unwesentlich. Werden die Ergebnisse als Verhältnis der Fluoreszenz des denaturierten gegen den nativen Zustand des Prionproteins exprimiert (3 und 4), beträgt das Verhältnis der α-helikalen Konformation 1–1,8 und für rekombinantes SHaPrP90-231 in β-Faltblatt-Konformation 5–50.
Diese Wirkung wurde ferner zum Analysieren von PrP-Proben von unbekannter Konformation verwendet, wobei die geringe Erhöhung im Signal von Eu-markiertem 3F4 IgG nach der Denaturierung von PrP ein Merkmal von α-helikaler Konformation ist. Im Gegensatz dazu ist die große Erhöhung im Signal über der erwarteten Änderung für α-helikale Konformation für den PrP90-231 in β-Faltblatt-Konformation diagnostisch (3 und 4). Die Ergebnisse sind in zwei verschiedenen Formen ausgedrückt: (1) als Verhältnis (6), wobei der Index ≤ 1,8 für rekombinantes SHaPrP90-231 angibt, dass das Protein ursprünglich in der gesamten α-helix-Konformation vorlag, und der Index > 1,8 die Gegenwart von β-Faltblatt-Konformation angibt; (2) als hier dargestellte und in Beispiel 11 veranschaulichte Formel, wobei die übermäßige Erhöhung des Signals gegenüber derjenigen, die für eine α-helikale Konformation erwartet wird, zu der Menge von SHaPrP90-231 in β-Faltblatt-Konformation proportional ist.
BEISPIEL 6
QUANTITATIVER TEST FÜR REKOMBINANTES SHaPrP90-231 UND PrP^C
Die Ein-/Ausgabe-Kalibrierung für denaturiertes SHaPrP90-231 in sowohl α-helikaler als auch β-Faltblatt-Konformation war in drei Größenordnungen linear und stellt einen hohen Zuverlässigkeitsgrad (5) für den Test bereit. Ebenso getestet wurde PrP^c, reihenverdünnt in PrP^0,0-Mäuse-Homogenat, was Ergebnisse mit hohem Zuverlässigkeitsgrad im Linearitätsbereich von 3 Größenordnungen bereitstellte. Als Nächstes wurde der Test durch gereinigtes infektiöses PrP^Sc in Gegenwart von 5%igem PrP^0,0-Gehirnhomogenat kalibriert. Die Kalibrie rung mit PrP^Sc stellte eine lineare Reaktion innerhalb eines ähnlichen Bereichs bereit.
Unter Verwendung des Differentialverfahrens betrug das Verhältnis zwischen dem Signal von denaturiertem gegen natives Gehirn-PrP^c für Eu-markiertes monoklonales 3F4 IgG 2,2 (7), für polyklonales N12 und P3 1,0. Die Kalibrierung für PrP^Sc ergab ein Verhältnis von ≥ 20 (8) für 3F4-Eu-markiertes IgG und > 4 für N12- und P3-Antikörper. Unter Verwendung der wie hier dargestellt entwickelten Formel wurde das gesamte PrP^c in vollständigem Bereich in α-helikaler Konformation gefunden. Im Gegensatz dazu wurde die berechnete Menge von PrP^Sc in infektiöser β-Faltblatt-Konformation als nahe der Gesamtmenge von Prionprotein erwartet.
BEISPIEL 7
DIAGNOSE VON PRIONKRANKHEIT AUF DER BASIS DER ERHÖHUNG VON PRIONPROTEIN ÜBER PHYSIOLOGISCHEN PrP-GEHALTEN
Eine genaue quantitative Messung von Gesamt-PrP durch ausschließliches Bewerten des Signals von der denaturierten Probe ergab einen mittleren Wert von PrP^c in 5%igen normalen Syrienhamstergehirnhomogenaten von 5,0 ± 0,2 μg/ml (Mittelwert ± SEM) (9). Die Reihenverdünnung von mit Traberkrankheit (Stamm Sc237) infiziertem Hamstergewebehomogenat in einem PrP^0,0-Mäusegehirnhomogenat ergab Werte von Gesamt-PrP von 36,0 ± 4 μg/ml (10) mit einer breiten Linearität der Messung. Da die einzige Bedingung für die Anhäufung von Prionprotein die Anhäufung der infektiösem PrP^Sc-Form ist, ist der Gesamtgehalt von Gesamt-PrP in der getesteten Probe für die Gegenwart von Prionen indikativ. Dieser Priontest kann verwendet werden (1) in direktem Modus in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach Bestimmung der normalen Kontrollwerte; oder (2) in indirektem Modus durch Nachweis der Bewertung des Gesamt-PrPs im Gehirn eines Versuchstiers, das intrazerebral mit einer getesteten Gewebe-, Körperflüssigkeit- oder Arzneimittelprobe, die im Verdacht steht, Prionen zu enthalten, beimpft wurde.
BEISPIEL 8
DIAGNOSE VON PRIONKRANKHEIT AUF DER BASIS DER ERHÖHUNG DES SIGNALVERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVES PrP („PRION-INDEX")
Das Verhältnis zwischen Antikörperaffinität für denaturiertes gegen natives Syrienhamster-Gehirn PrP^c-Protein liegt in dem breiten Konzentrationsbereich für Eu-markiertes 3F4 IgG zwischen 0,8–2,2. Das Verhältnis in mit Traberkrankheit infiziertem Gehirn liegt innerhalb des vollständigen Linearitätsbereichs über diesen Werten (11). Der „Prion-Index" liefert einen relativen Indikator für die Gegenwart von infektiösem PrP^Sc und deshalb Prionen. Dieser Modus von Prionentest wird verwendet (1) in direktem Modus in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach Bestimmung des Indexes für normale Kontrollen oder (2) im indirekten Modus durch Nachweis des erhöhten denaturierten/nativen Prionprotein-Indexes im Gewebe von Versuchstieren, die intrazerebral mit einer getesteten Gewebe-, Körperflüssigkeit- oder Arzneimittelprobe, die im Verdacht steht, Prionen zu enthalten, beimpft wurden.
BEISPIEL 9
DIAGNOSE VON PRIONKRANKHEIT AUS DEM DIFFERENTIALTEST DURCH BERECHNEN DES PrP^SC-GEHALTS
Unter Verwendung des direkten Tests und der hier bereitgestellten Formeln, liegt keine nachweisbare Menge der β-Flatblattform von PrP^Sc in normalem Gehirnhomogenat vor. Umgekehrt begründete sich das Gesamt-PrP in mit Traberkrankheit infiziertem Hamstergehirn auf der Akkumulation von PrP^Sc (9 und 10). Die durch die Formel berechnete Beziehung zwischen dem Priontiter und PrP^Sc weist einen breiten Linearitäts- und Empfindlichkeitsabschnitt von ~10³ ID₅₀/ml (11) auf. Die Formel liefert einen quantitativen Indikator für die Gegenwart von PrP-Protein in abnormaler Konformation, die quantitativ mit den Priontiter korreliert. Dieser Priontestmodus wird verwendet (1) in direktem Modus in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln; oder (2) in indirektem Modus durch Berechnen des PrP^Sc-Gehalts im Gehirn von Versuchstieren, die intrazerebral mit einer getesteten Gewebe-, Körperflüssigkeit- oder Arzneimittelprobe, die im Verdacht steht, Prionen zu enthalten, beimpft wurden. Nach Aufbau einer Kalibrierungskurve zwischen PrP^Sc und Priontiter ist es möglich, den Titer direkt aus dem PrP^Sc-Gehalt abzuschätzen.
BEISPIEL 10
DIE MESSUNG VON α-HELIX-ZU-β-FALTBLATT-UMWANDLUNG VON PrP-PROTEIN IN VITRO ZUM SCREENEN VON PRIONBILDUNG VON NEUEM UND MÖGLICHE KRANKHEITSTHERAPEUTIKA
Die Aliquots einer 100 μg/ml-Lösung der α-helikalen Form von rekombinantem SHaPrP90-231 oder SHaPrP29-231, oder entsprechende rekombinante oder synthetische Peptide des Prionproteins werden in 20 mM Na-Acetatpuffer, pH 5,5, für eine Dauer von 24 Stunden bei 37°C mit Konzentrationen von 10^–3–10^–6 M von Glyzerin, Cyclodextrinen, Heparin, Heparinsulfat, Congo Red, Cholesterinester, Dimyristoyl, Phosphatidylcholin inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt, bezeichnet als nativ; (2) gemischt mit endgültigen 4 M Gdn·HCl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C, bezeichnet als denaturiert. Beide Proben werden auf das 20fache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf mit Glutaraldehyd aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V), blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit Europium-markiertem 3F4 IgG inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkerlösung, bereitgestellt durch den Lieferanten der Europium-Markierung (Wallac Inc., Turku, Finnland), entwickelt und das Signal auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finnland) gezählt.
Der Umwandlungsgrad von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation von PrP wird aus dem „Prion-Index" oder in einer anderen Ausführungsform aus den hier bereitgestellten Formeln berechnet. Einige Verbindungen, die die Umwandlung durch deutliches Stabilisieren der nativ-ähnlichen Konformation von Prionprotein hemmen können, weisen in vivo ein therapeutisches Potential auf.
BEISPIEL 11
Das Testverfahren ist in den folgenden Beispielen mit Traberkrankheit infiziertem Syrienhamster-Gehirnhomogenat, verdünnt auf das Vierfache in PrnP^0/0-Mäusegehirnhomogenat, dargestellt:

a) Jede Platte wird mit einem inneren Standard, bestehend aus fünf Verdünnungspunkten von denaturiertem SHaPrP90-231, kalibriert. Die zeitaufgelöste Fluoreszenz (TRF) von Gesamt-PrP wird mit Eu-markiertem 3F4 IgG entwickelt und die zeitaufgelösten Fluoreszenz-Werte werden als Funktion der PrP-Konzentration aufgezeichnet (4). Die Daten werden einer linearen oder polynominalen Gleichung unter Verwendung des Verfahrens des niedrigsten Quadrats angepasst, und die beste Funktion für die Berechnung von denaturiertem PrP wird ausgewählt: PrP[μg/ml] = 0,22935 + 0,00026567*[TRF] + 0,0000000012255*[TRF]2 (1)
b) Auf dem Rest der Platte wurden native und denaturierte Aliquots von mit Traberkrankheit infiziertem Syrienhamster-Gehirnhomogenat, auf das Vierfache verdünnt und mit dem Kunststoffträger vernetzt, mit Eu-markiertem 3F4 IgG inkubiert. Der Gesamt-PrP-Gehalt wird gemäß der vorstehenden Formel von dem Fluoreszenz-Signal der denaturierten Probe berechnet.
c) Das Verhältnis der Fluoreszenzsignale zwischen denaturierten und nativen Proben wird berechnet:
Der Normalwert für PrP^c, bestimmt von normalem Hamstergehirnhomogenat, beträgt 2,2; die Werte über 2,2 werden als abnormal angesehen und geben die Gegenwart von PrP^Sc an.
d) Das Übermaß des Fluoreszenzsignals gegenüber dem für α-helikales PrP, das beim Übergang von nativ zu denaturiertem Zustand erwartet wird, ist ein Maß der PrP^Sc-Menge und wird gemäß der bereitgestellten Formel berechnet: ΔFβn–d = Fd – (Fn*fαn–d) (2) wobei f der Maximalwert für den Faktor für das Fluoreszenzsignal beim Übergang von nativem zu denaturiertem Zustand von PrP^Sc ist; Fd die Fluoreszenz der denaturierten Probe ist; und F_n die Fluoreszenz der nativen Probe ist. Die Menge an PrP^Sc wird dann aus ΔF_βn–d und der Gleichung (1) berechnet:
Der positive Wert, der für die β-Faltblattform von Prionprotein berechnet ist, gibt die Gegenwart von PrP^Sc an.

BEISPIEL 12
STANDARDS VON LÖSLICHEN (α-HELIKALEN) UND UNLÖSLICHEN (β-FALTBLATT) FORMEN VON βA4-PROTEIN
Lösliche Formen von βA4(1-40) und βA4(1-42) wurden von Bachem (Torrance, CA) erhalten. Ein Teil des frisch lyophilisierten Peptids wurde in PBS, pH 7,4, enthaltend 20% (V/V) HFIP (Hexafluorisopropanol; 1,1,1,3,3,3-Hexafluor-2-propanol), oder 1%igem (G/V) SDS (Natriumdodecylsulfat) mit einer Endproteinkonzentration von 50 μM angelöst; dieses Protein wurde als „löslich" bezeichnet und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Ein zweiter Teil des Peptids wurde in PBS, pH 7,4 mit einer Endkonzentration von ≥ 350 μM resuspendiert und für eine Dauer von 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Teil des Proteins wurde als „unlöslich" bezeichnet und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert.
Beide Proteine wurden als Standards für die Testentwicklung und zum Etablieren des Empfindlichkeits- und Linearitätsbereichs verwendet. Die Spektroskopie des CD (zirkulärer Dichroismus) (12) zeigte, dass das lösliche Protein eine α-helikale Konformation aufwies (siehe die durchgehende Linie von 12). Im Gegensatz dazu wurde das βA4-Protein, das für eine Dauer von 72 Stunden bei 37°C behandelt war, vollständig zur β-Faltblatt-Konformation umgewandelt (siehe die gestrichelte Linie von 12).
SELEKTIONS-, MARKIERUNGS- UND NACHWEISVERFAHREN VON IM TEST VERWENDETEN ANTIKÖRPERN
Die Protokolle und Verfahren der Antikörperherstellung und -charakterisierung sind im Allgemeinen andernorts beschrieben [Harlow and Lane (1988) obenstehend: 726]. Die in diesem und den folgenden Beispielen beschriebenen Daten wurden mit dem monoklonalen Antikörper 6F3D, entwickelt gegen synthetisches Peptid, entsprechend der Sequenz von menschlichem βA4-Protein (Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ) gebildet. Jedoch könnten auch polyklonale Antikörper verwendet werden, die gegen das synthetische Analogon von βA4-Protein hergestellt sind. Rekombinante Fab-erkennende denaturierte Formen von βA4-Protein könnten ebenso verwendet werden.
βA4-Protein in α-helikalen, β-Faltblatt- und statistischen Spiralenkonformationen wurden kovalent an die glutaraldehyd-aktivierten Polystyrol-Platten gebunden und mit reihenverdünnten primären Antikörpern inkubiert. Die mit jeder Konformation von βA4 reagierende IgG-Menge wurde mit Europium-markiertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Mäuse-Antikörper gemäß gewöhnlichen Protokollen bestimmt und das Gesamtsignal wurde durch zeitaufgelöste, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz gemessen. Antikörper mit dem Signalverhältnis von denaturierter gegen β-Faltblatt-Konformation von βA4 gleich oder höher als 2 wurden zum Entwickeln des Tests ausgewählt.
DIREKTES UND KONKURRENZFÄHIGES TESTFORMAT
Im direkten Versuch wurde jede Probe der Verdünnungskurve von α-helikalen und β-Faltblattformen von βA4-Protein in zwei Aliquots aufgeteilt (1) unbehandelt, bezeichnet als nativ; und (2) gemischt mit endgültigen 4 M Gdn·HCl/1% Sarcosyl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C (bezeichnet als „denaturiert"). Beide Proben wurden auf das 20-fache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf mit 0,2% Glutaraldehyd für eine Dauer von 2 Stunden aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Die Platten wurden dann drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit primären Antikörpern gegen βA4-Protein (6F3D, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ) inkubiert. Die Proben wurden gewaschen und dann mit Europium-markierten, sekundären Antikörpern gegen Mäuse-IgG (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkerlösung (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finnland) signalgezählt. Die Ergebnisse für den Analyt geben eine deutliche Differenz sowohl in den verfügbaren Bindungsstellen als auch in der Affinitäts-anti-βA4 IgG in verschiedenen Konformationen von βA4-Protein an.
Das Verfahren könnte unter Verwendung eines konkurrenzfähigen Tests durchgeführt werden, in welchem das Analyt-βA4 in verschiedenen Konformationen mit einem anti-βA4 IgG vorinkubiert und dann auf die Poylstyrol-Platte, beschichtet mit synthetischem βA4-Protein in Gdn·HCl-denaturiertem Zustand, überführt wird.
DIFFERENTIALTEST FÜR VERSCHIEDENE KONFORMATIONEN VON βA4
Die aus dem Direkttest mit 6F3D-anti-βA4-IgG erhaltenen Parameter wurden als Funktion der Konzentration graphisch dargestellt. Die mit βA4 in β-helikaler Konformation (13) erhaltenen Ergebnisse zeigen eine große Differenz zwischen dem Signal von β-Faltblättern und denaturiertem Protein. Die Empfindlichkeitsgrenze für denaturiertes βA4 beträgt ≤ 1 μg/ml und der Linearitätsbereich liegt über zwei Größenordnungen. In den Experimenten mit der α-helikalen Form von βA4 (14) bindet 6F3D IgG gleich stark an sowohl native und denaturierte Formen des Proteins. Im Gegensatz dazu überstieg die Reaktivität mit der nativen β-Faltblattform des Proteins sogar bei hohen Protein-Konzentrationen nur geringfügig den Hintergrund. Werden die Ergebnisse als Verhältnis der Fluoreszenz von denaturierten gegen native Zustände des βA4 ausgedrückt (15), beträgt das Verhältnis für die α-helikale Konformation ≤ 1 und für die βA4- in β-Faltblatt-Konformation in einem vorgegebenen Konzentrationsbereich ≤ 1,5.
Diese Wirkung wurde zum Analysieren von βA4-Proben von unbekannter Konformation verwendet, wobei eine kleine Erhöhung im Signal von Eu-markiertem 3F4 IgG nach Denaturierung von βA4 ein Merkmal von α-helikaler Konformation vorliegt. Im Gegensatz dazu ist die große Erhöhung im Signal über den erwarteten Bereich von α-helikaler Konformation für die β-Faltblatt-Konformation diagnostisch (15). Diese Ergebnisse können in zwei verschiedenen Formen ausgedrückt werden (1) als Verhältnis (15), wobei ein Index von ≤ 1,0 für βA4 angibt, dass das Protein ursprünglich insgesamt in α-Helix-Konformation vorlag und ein Index von > 1,5 an die Gegenwart von β-Faltblatt-Konformation angibt; (2) durch die vorstehend dargestellte Formel, wobei die übermäßige Erhöhung des Signals über derjenigen, die für eine α-helikale Konformation erwartet wird, zu der Menge von βA4 in β-Faltblatt-Konformation proportional ist.
BEISPIEL 13
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT AUF DER BASIS DER ERHÖHUNG VON GESAMT-βA4-PROTEIN ÜBER PHYSIOLOGISCHEN GEHALTEN
Die genaue quantitative Messung von Gesamt-βA4 durch ausschließliches Bewerten des Signals der denaturierten Probe ist scheinbar genauer als die Messung von βA4 in nativer Konformation (13 und 14). Der Norμalwert für das Protein kann einen deutlichen Teil der β-Faltblattform von βA4-Protein aufgrund der geringen Reaktivität dieser Form mit Antikörpern verbergen. Aufgrund der nur einzigen bekannten Bedingung zur Akkumulation von βA4-Protein ist die Akkumulation der β-Faltblattform von βA4 in Gehirnen von Patienten mit Alzheimer-Krankheit der erhöhte Gehalt an Gesamt-βA4 in der behandelten Probe für die Gegenwart von pathogenen Formen von βA4 indikativ. Dieser βA4-Test kann in Gewebe-, Körperflüssigkeit- oder Arzneimittelproben, die im Verdacht stehen, dass sie β-Faltblattformen von βA4 enthalten, verwendet werden.
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT AUF DER BASIS DER ERHÖHUNG DES SIGNALVERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVEM βA4 („βA4-AMYLOID-INDEX")
Das Verhältnis zwischen der Antikörperaffinität für denaturiertes gegen natives menschliches βA4-Protein liegt im breiten Konzentrationsbereich für 6F3D IgG zwischen 0,8–1,0. Das Verhältnis für β-Faltblatt-βA4 liegt innerhalb des vollständigen Linearitätsbereich über diesen Werten (15). Der „βA4-Amyloid-Index" liefert einen relativen Indikator für die Gegenwart von pathogenen unlöslichen β-Faltblatt-βA4. Dieser Modus des βA4-Tests kann in direktem Modus in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach Bestimmung des Indexes für normale Kontrollen verwendet werden.
DIAGNOSE VON ALZHEIMER-KRANKHEIT AUS DIFFERENTIALTEST DURCH BERECHNEN DES βA4-GEHALTS
Unter Verwendung des direkten Tests und der vorstehend dargestellten Formel kann die Menge von pathogenen Formen von β-Faltblatt-βA4-Protein in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimittelproben berechnet werden.
BEISPIEL 14
DIE MESSUNG VON α-HELIX ZU β-FALTBLATT-UMWANDLUNG VON βA4-PROTEIN IN VITRO ZUM SCREENEN DES POTENTIALS VON KRANKHEITSTHERAPEUTIKA
Die Aliquots einer Lösung mit 350 μM der α-helikalen Form von synthetischem βA4(1-40) oder entsprechend den rekombinanten oder synthetischen Peptiden des βA4-Proteins werden in PBS, pH 7,4, für eine Dauer von 72 Stunden bei 37°C mit Konzentrationen von 10^–3–10^–6 M von Glyzerin, Cyclodextrinen, Heparin, Heparinsulfat, Congo Red, Cholesterinester, Dimyristoyl Phosphatidylcholin inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt, enthaltend 1% Sarcosyl und bezeichnet als „nativ"; und (2) gemischt mit endgültigem 4 M Gdn HCl/1% Sarcosyl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C, bezeichnet als „denaturiert". Beide Proben werden auf das 20fache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf mit Glutaraldehyd aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit 6F3D IgG und dann mit Eu-markiertem Anti-Mäuse-Antikörper inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkerlösung entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs (Wallac Inc., Turku, Finnland) signalgezählt.
Der Umwandlungsgrad von α-helikaler zu β-Faltblatt-Konformation von βA4 wird aus dem „Amyloid-Index" (15) oder in einer anderen Ausführungsform aus der vorstehend dargestellten Formel berechnet. Eine beliebige Verbindung, die die Umwandlung durch Stabilisieren der α-helikalen Konformation von βA4-Protein hemmt, kann in vivo ein therapeutisches Potential zum Verhindern der Bildung von reifem Amyloid aufweisen.
BEISPIEL 15
STANDARDS VON NORMALEN UND AMYLOIDEN FORMEN VON TTR
Lösliche Formen von TTR wurden von Sigma Chemical Comp. erhalten. Ein Teil des Proteins wurde in 100 mM KCl-Puffer, pH 7,4, mit einer Endproteinkonzentration von 0,5 mg/ml angelöst; dieses Protein wurde als „normal" bezeichnet und bei –80°C bis zur Verwendung gelagert. Der zweite Teil des Proteins wurde wie beschrieben in ein Amyloid umgewandelt [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistry 35(20): 6470–82]. Kurz gesagt, wurde das Protein in 100 mM KCl-Puffer, enthaltend 50 mM Natriumacetat, pH 4,4, mit einer Proteinkonzentration von 0,2 mg/ml resuspendiert und für eine Dauer von 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Dieser Teil des Proteins wurde als „Amyloid" bezeichnet und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Die Turbidimetrie und der Congo Red-Bindungstest wiesen die effiziente Umwandlung zu Amyloid nach [Lai, Colon et al. (1996) Biochemistry 35(20): 6470–82]. Beide Proteine wurden als Standards für die Testentwicklung und zum Etablieren des Sensitivitäts- und Linearitätsbereichs verwendet.
DIREKTES TEST-FORMAT
Die Protokolle und Verfahren der Antikörperherstellung und -charakterisierung sind im Allgemeinen andernorts beschrieben. Die in diesen und in den folgenden Beispielen beschriebenen Daten wurden mit im Handel erhältlichen polyklonalem Antikörper, entwickelt gegen gereinigtes menschliches TTR (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY), gebildet.
Im direkten Test wurde jede Proteinprobe, die der Verdünnungskurve von normalen und Amyloid-Formen von TTR entnommen war, in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt und als „nativ" bezeichnet; (2) gemischt mit endgültigem 4 M Gdn·HCl/l% Sarcosyl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C und bezeichnet als „denaturiert". Beide Proben wurden auf das 20fache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf mit 0,2% Glutaraldehyd für eine Dauer von 2 Stunden aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit primären Antikörpern gegen TTR (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) inkubiert, gewaschen und dann mit Europium-markierten, sekundären Antikörpern gegen Kaninchen-IgG (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkerlösung entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 1234 (Wallac Inc. Turku, Finnland) signalgezählt.
BEISPIEL 16
DIAGNOSE VON SSA UND FAP AUF DER BASIS DER ERHÖHUNG DES SIGNALVERHÄLTNISSES ZWISCHEN DENATURIERTEM GEGEN NATIVES TTR („TTR-AMYLOID-INDEX")
Das Verhältnis zwischen der Antikörperaffinität für denaturierte Formen gegen native Form von normalem menschlichem TTR liegt im Konzentrationsbereich für polyklonalen Antikörper von 1–3 : 3. Das Verhältnis für die Amyloid-Form von TTR liegt innerhalb des vollständigen Linearitätsbereichs zwischen 0,7–1,0 (18). Der „TTR-Amyloid-Index" liefert einen relativen Faktor für die Gegenwart von pathogenen unlöslichen und Amyloid-bildendem TTR. Dieser Modus des TTR-Tests wird in direktem Modus in Gehirn-, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln nach der Bestimmung des Indexes für normale Kontrollen verwendet.
DIAGNOSE VON SSA UND FAP VON DIFFERENTIALTEST DURCH BERECHNEN DES TTR-AMYLOID-GEHALTS
Durch Verwendung der direkten Testformel (19) kann die Menge an der Amyloidform von TTR in peripheren Nerven, Gewebeproben, Körperflüssigkeiten oder Arzneimitteln berechnet werden. In der Formel (19) ist die niedrigere als die erwartete Erhöhung des Signals für die normale Konformation proportional zu der Menge an TTR in der Amyloid-Konformation.
BEISPIEL 17
DIE MESSUNG VON NORMAL-ZU-AMYLOID-UMWANDLUNG VON TTR IN VITRO ZUM SCREENEN DER POTENTIELLEN KRANKHEITSTHERAPEUTIKA
Die Aliquots einer Lösung von 0,2 mg/ml der normalen Form von synthetischem TTR oder entsprechender rekombinanter oder synthetischer Peptide des TTR, werden in 100 mM KCl-Puffer, enthaltend 50 mM Natriumacetat, pH 4,4 für eine Dauer von 72 Stunden bei 37°C mit Konzentrationen von 10^–3–10^–6 M von getesteten organischen Verbindungen inkubiert. Die Proben werden dann in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt, enthaltend 1% Sarcosyl und bezeichnet als „nativ"; (2) gemischt mit endgültigen 4 M Gdn·HCl/1% Sarcosyl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 100°C, bezeichnet als „denaturiert". Beide Proben auf das 20fache mit H₂O verdünnt und Aliquots auf mit Glutaraldehyd aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die bei 5°C über Nacht inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05 (V/V) Tween^® 20 gewaschen und mit polyklonalem Anti-TTR-Antikörper (Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY) inkubiert und dann mit Anti-Kaninchen-Antikörper Eu-markiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen sie ben Waschschritten in Verstärkerlösung entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 1234 (Wallac Inc., Turku, Finnland) signalgezählt.
Der Umwandlungsgrad von normaler zu amyloider Konformation von TTR wird aus dem „Amyloid-Index" (18) oder in einer anderen Ausführungsform durch die Formel (19) berechnet. Eine beliebige Verbindung, die die Umwandlung durch Stabilisieren von normaler Konformation von TTR hemmt, kann ein therapeutisches Potential in vivo durch Verhindern der Bildung von reifem Amyloid aufweisen.
BEISPIEL 18
TYPIFIZIEREN VON PRIONISOLATEN (STÄMMEN) IN SYRIENHAMSTERN
Syrienhamster (LVG/LAK) wurden durch intrazerebrale Injektion der folgenden Hamster-angepassten Traberkrankheit-Isolate infiziert, das heißt, verschiedene Gruppen von Hamstern wurden mit einzelnen Prionstämmen wie folgt infiziert: Drowsy (Dy), 139H, Hyper (Hy), Me7, MT-C5, und Sc237. Die Tiere wurden in Endstadien der Krankheit getötet und ihre Gehirne unmittelbar eingefroren und bei –70°C gelagert. Die Gehirne wurden auf Eis durch 3 × 30-sekündige Schläge des PowerGen-Homogenisators (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in PBS, pH, 7,4 enthaltend Protease-Hemmer-Cocktail (PMSF 5 mM, Aprotinin und Leupeptin 4 μg/ml), homogenisiert. Die erhaltenen 10%-igen (G/V) Homogenate wurden für eine Dauer von 5 Minuten bei 500 g auf einer Desktop-Zentrifuge gedreht. Der Überstand wurde mit 4% Sarcosyl in PBS, pH 7,4 auf 1 : 1 gemischt und in zwei Aliquots aufgeteilt: (1) unbehandelt und bezeichnet als nativ; (2) gemischt mit endgültigen 4 M Gdn·HCl und erwärmt für eine Dauer von 5 Minuten bei 80–100°C und bezeichnet als denaturiert. Beide Proben wurden auf das 20fache durch H₂O verdünnt und Aliquots auf für eine Dauer von 1 Stunde mit 0,2% Glutaraldehyd in PBS aktivierte Polystyrol-Platten aufgebracht. Die über Nacht bei 5°C inkubierten Platten wurden mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,5% BSA (G/V) und 6% Sorbit (G/V) blockiert. Im nächsten Schritt wurden sie drei Mal mit TBS, pH 7,8, enthaltend 0,05% (V/V) Tween^® 20 gewaschen und für eine Dauer von 2 Stunden mit dem Europium-markierten monoklonalen Antikörper 3F4 inkubiert. Die Platten wurden nach zusätzlichen sieben Waschschritten in Verstärkerlösung, bereitgestellt von dem Lieferanten der Europium-Markierung (Wallac Inc., Turku, Finnland) entwickelt und auf einem Fluorometer des Typs DELFIA 12347 (Wallac Inc., Turku, Finnland) signalgezählt. Der PrP^Sc-Gehalt und „Prion-Index" (Verhältnis von Antikörperbindung an denaturiertem: nativem PrP-Protein) wurde wie in den Beispielen 11 und 8 beschrieben berechnet und in xy-Koordinaten, wie in 25 dargestellt, graphisch dargestellt. Es war anzunehmen, dass die anderen Proben, die getestet wurden und zu den gleichen Berechnungen führten, denselben Prionstamm enthielten.
Die gegenwärtige Erfindung ist hier dargestellt und beschrieben, indem sie als die praktischsten und bevorzugten Ausführungsformen betrachtet wird. Es ist jedoch erkennbar, dass der Rahmen der Erfindung verlassen werden kann und offensichtliche Modifikationen dem diese Offenbarung lesenden Fachmann augenscheinlich sind.

Claims

Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins einer patogenen Form eines ausgewählten Proteins in einer Probe umfassend eine erste, nicht patogene Konformation des Proteins und eine zweite patogene Konformation des Proteins, wobei das Verfahren umfasst: In Kontaktbringen eines ersten Teils der Probe mit einem Bindungspartner, wobei der Bindungspartner eine höhere Affinität für die erste Konformation als für die zweite Konformation aufweist, und Bestimmen einer ersten Konzentration; Behandeln eines zweiten Teils der Probe, um die zweite Konformation in eine Konformation mit einer höheren Bindungsaffinität für den Bindungspartner zu ändern; In Kontaktbringen des behandelten zweiten Teils der Probe mit dem Bindungspartner, um eine zweite Konzentration zu bestimmen; Anpassen der zweiten Konzentration, um eine angepasste Konzentration bereitzustellen, wobei die Anpassung die erhöhte Affinität des Proteins in der ersten Konformation für den Bindungspartner kompensiert, die aus der Behandlung resultiert; und Vergleichen der ersten Konzentration mit der angepassten Konzentration, um die Gegenwart des Proteins in der zweiten patogenen Konformation zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe von einem Tier erhalten wird, das keine Krankheitssymptome zeigt; wobei die erste Konzentration und die zweite Konzentration unter Verwendung von zeitaufgelöster, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz bestimmt werden; wobei ferner die zweite, patogene Konformation des Proteins in der Probe in einer Konzentration von 1 × 10³ Partikel pro ml oder weniger vorhanden ist; wobei außerdem das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe βA4 Protein, PrP Protein und Transthyretin.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Probe an eine feste Oberfläche gebunden ist, und bei dem die Behandlung das Unterwerfen des zweiten Teils der Probe einer Behandlung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hitze, Druck und chemische Denaturierung umfasst, ausreichend um mindestens 2% jeglichen Proteins in der zweiten Form in die Bindungsform zu überführen; wobei der Bindungspartner einen markierten Antikörper umfasst, der eine Affinität für die erste Konformation aufweist, die mindestens viermal höher ist als seine Affinität für die zweite Konformation.
Verfahren zum Bestimmen des Vorhandenseins einer patogenen Form eines ausgewählten Proteins in einer Probe, die eine erste nicht patogene Konformation des Proteins und eine zweite patogene Konformation des Proteins umfasst, wobei das Verfahren umfasst: Behandeln der Probe, um die zweite Konformation des Proteins in eine Bindungskonformation zu überführen, die eine Affinität für einen Bindungspartner aufweist, die höher ist als diejenige der zweiten Konformation; In Kontaktbringen der behandelten Probe mit dem Bindungspartner, um eine Konzentration zu bestimmen; Anpassen der Konzentration, um eine angepasste Konzentration bereitzustellen, die die erhöhte Affinität der ersten Konformation des Proteins für den Bindungspartner kompensiert, die aus der Behandlung resultiert; und Vergleichen der angepassten ersten Konzentration mit einer bekannten Konzentration ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einer Kontrollkonzentration und einer vorherbestimmten Standardkonzentration, um das Vorhandensein des Proteins in der zweiten Konformation in der Probe zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem der Bindungspartner einen markierten Antikörper umfasst, und bei dem die Konzentration unter Verwendung von Flußcytometrie bestimmt wird; wobei die angepasste Konzentration mit einer bekannten Konzentration verglichen wird, die bei einer behandelten, nicht infizierten Kontrollprobe bestimmt wurde, oder verglichen wird mit einer bekannten Konzentration, vorherbestimmt bei einer behandelten Probe aus einer nicht infizierten Population; wobei ferner der Antikörper 3F4 ist; wobei außerdem ferner das Protein in der zweiten Konformation in der Probe in einer Konzentration von 1 × 10³ Proteinmolekülen oder weniger pro ml vorhanden ist und wobei das Protein in der ersten Konformation in der Probe in einer Konzentration von 1 × 10⁶ Proteinmolekülen oder mehr pro ml vorhanden ist.
Verfahren zum Identifizieren einer Verbindung mit einer therapeutischen Aktivität gegen eine Prion-vermittelte Krankheit, wobei die Prion-vermittelte Krankheit charakterisiert ist durch ein Protein mit einer ersten Form und einer zweiten Form, die sich in der Konformation unterscheiden, wobei eine der Formen mit der Prion-vermittelten Krankheit assoziiert ist, wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen eines Tieres, das für eine Prion-vermittelte Krankheit empfänglich ist; Verabreichen einer Testverbindung an das Tier; Induzieren der Prion-vermittelten Krankheit; Erhalten einer Probe von dem Tier; In Kontaktbringen eines ersten Teils der Probe, die das Protein enthält, mit einem Bindungspartner, wobei der Bindungspartner eine höhere Affinität für die erste Form des Proteins als für die zweite Form aufweist, und Bestimmen einer ersten Konzentration; Behandeln eines zweiten Teils der Probe, um die zweite Form in eine Bindungsform zu überführen, die eine höhere Affinität für den Bindungspartner aufweist; In Kontaktbringen des behandelten zweiten Teils mit dem Bindungspartner, um eine zweite Konzentration zu bestimmen; Anpassen der zweiten Konzentration, um eine angepasste Konzentration bereitzustellen, die die erhöhte Affinität des Proteins in der ersten Form für den Bindungspartner kompensiert, die aus der Behandlung resultiert; und Vergleichen der ersten Konzentration mit der angepassten Konzentration, um die Konzentration des Proteins in der zweiten Form zu bestimmen, und um die Auswirkung der Testverbindung auf die Konzentration des Proteins in der zweiten Form abzuleiten.
Verfahren zum Bestimmen eines Stammes eines patogenen Proteins in einer Probe mit: Bestimmen der Konzentration einer patogenen Konformation eines Proteins in einer Probe; Behandeln der Probe auf eine Weise, so dass die patogene Konformation des Proteins in eine Konformation umgewandelt wird, die eine höhere Bindungsaffinität für einen Bindungspartner als die patogene Konformation aufweist; Bestimmen der Auswirkung der Behandlung des Proteins auf die patogene Konformation; und Vergleichen der bestimmten Auswirkung mit einer bekannten Standardauswirkung für einen bekannten Stamm bei einer bekann ten Konzentration und dadurch Ableiten des Stammes der patogenen Konformation des Proteins in der Probe.
Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Konzentration der patogenen Konformation und die Auswirkung durch die Behandlung unter Verwendung eines markierten Antikörpers als Bindungspartner und unter Verwendung zeitaufgelöster, durch Dissoziation verstärkte Fluoreszenz bestimmt werden; wobei die patogene Konformation des Proteins PrP^Sc ist und das PrP^Sc mit Proteinase K behandelt wird.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1, 2, 4, 6 und 7, wobei der Bindungspartner ein Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper eine Affinität für die erste Konformation aufweist, die mindestens zehnmal höher ist als seine Affinität für die zweite Konformation.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei der Antikörper eine Affinität für die erste Konformation aufweist, die mindestens dreißigmal höher ist als seine Affinität für die zweite Konformation.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper eine Affinität für die erste Konformation aufweist, die mindestens viermal höher ist als seine Affinität für die zweite Konformation.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Antikörper eine Affinität für die erste Konformation aufweist, die mindestens dreißigmal höher ist als seine Affinität für die zweite Konformation.