JP2001516448A

JP2001516448A - 蛋白質の疾病関連立体構造の解析法

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Publication number: JP2001516448A
Application number: JP53606498A
Authority: JP
Inventors: スタンレービー．プルシナー; ジリジー．サファー
Original assignee: ザレジェンツオブザユニバーシティーオブカリフォルニア
Priority date: 1997-02-21
Filing date: 1998-02-20
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-02-20
Also published as: EP1416281A2; JP3774236B2; EP0970372A1; AU725844B2; DE970372T1; ES2218807T3; DE69823985D1; WO1998037411A1; EP1416281A3; DE69823985T2; AU6168898A; EP0970372B1; CA2278577A1; EP0970372A4; BR9807600A; ATE267394T1; US5891641A

Abstract

(57)【要約】試料中に蛋白質の疾病関連立体構造が存在するかどうか（例、PrP^ScまたはβA4のβシート型）を決定することを可能にする解析方法が開示される。試料を2つの部分に分割し、第1の部分は第1の固体支持体に架橋し、その後、その蛋白質の疾病型よりも非疾病型に対する親和性が高い（例、4〜30倍高い）標識抗体に接触させ、標識抗体に対する親和性が高い型に立体構造を変化させる。処理をした第2の部分はその後、第2の固体支持体に結合させ、標識抗体と接触させる。第1と第2の部分における蛋白質に対する標識抗体の結合レベルを決定し、各々で測定された量を比較する。2つの測定値の差により、試料中にその蛋白質の疾病関連立体構造が存在するかどうかが示される。本方法によって、疾病関連立体構造の濃度および特定の株の存在も決定できる。

Description

【発明の詳細な説明】蛋白質の疾病関連立体構造の解析法発明の分野本発明は、一般的に免疫測定法に関する。より具体的には、本発明は抗体に対する結合親和性が非常に低い可能性のある、蛋白質（PrP^Scのような）の疾病関連立体構造を検出することができ、さらに疾病を誘導する特定の株の同定を可能にする解析法に関する。発明の背景プリオンは、ヒトや動物の中枢神経系に、必ず死に至るプリオン病（海綿状脳症）を引き起こす感染性の病原体である。プリオンは、細菌、ウイルス、およびウイロイドとは大きく異なっている。プリオン蛋白質の感染が進むために核酸は必要ではないというのが、一般に認められている仮説である。プリオンおよびこれによって引き起こされる疾患の研究における重要な段階は、プリオン蛋白質と命名された蛋白質の発見および精製であった［Bolton，McKi nleyら、（1982）Science 218:1309〜1311；Prusiner，Boltonら、（1982）Bioc hemistry 21:6942〜6950；McKinley，Boltonら、（1983）Cell 35:57〜62］。その後、プリオン蛋白質をコードする完全な遺伝子のクローニング、塩基配列決定、およびトランスジェニック動物における発現がなされた。PrP^Cは単一コピーの宿主遺伝子によってコードされ［Basler，Oeschら、（1986）Cell 46:417〜428 ］、PrP^Cが発現されると通常は神経細胞の外表面に認められる。プリオン病はプリオン蛋白質の正常な型（PrP^C）が異常な型（PrP^Sc）に形質転換した結果、疾病が発生するということを示す証拠が多数ある。この2つの型の間には、アミノ酸配列の違いは検出されない。しかし、PrP^Cと比較した場合に、PrP^Scの立体構造の方がβシートの量が多く、αヘリックスの量が少ない[Pan，Baldwinら、（1 993）Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10962-10966;Safar，Rollerら、（1993） J Biol Chem 268:20276-20284]。感染したヒトまたは動物の脳に異常なPrP^Sc型が存在するというのが、唯一のプリオン病の特異的診断マーカーである。 PrP^Scはプリオン病（海綿状脳症）の伝染および発病の両方に鍵となる役割を果たしており、神経の変性の重要因子である[Prusiner（1997）神経疾患の分子的および遺伝的基礎(The Molecular and Genetic Basis of Neurological Disease，第 2版：103-143)]。動物で最も広く見られるプリオン病は、ヒツジおよびヤギのスクレイピーならびに畜牛のウシ海綿状脳症(BSE)である[WilesmithおよびWells（ 1991）Curr Top Microbiol Immunol 172:21-38]。ヒトでは4種類のプリオン病が同定されている：(1)クールー、(2)クロイツフェルト-ヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病(GSS)、および(4)致死性家族性不眠症（FFI）[Gajdusek（1997）Science 197:943-960;Medori，Tritschlerら(1992)N Engl J Med 326:444-449]。当初、遺伝性のヒトプリオン病の発表が難問を投げ掛けたが、これは後にPrPの細胞遺伝性の起源によって説明された。プリオンは複数の単離株（株）として存在し、異なる株が遺伝的に同一の宿主に感染したときに異なる生物学的特性を持つ[Prusiner（1997）神経疾患の分子的および遺伝的基礎(The Molecularand Genetic Basis of Neurological Diseas e，第2版：165-186)]。各株は潜伏期間、PrP^Sc蛋白質の蓄積の局所解剖学、および場合によっては脳の病理の分布および特性も異なっている[DeArmondおよびPru siner（1997）グリーンフィールドの神経病理学(Greenfield's Neuropathology) 、第6版:235-280]。PrP^Scがプリオンの主要な産物であり、さらに唯一の産物である可能性が非常に高いため、プリオン株の存在は、生物学的情報が核酸ではない分子にどのように暗号化されるかという難問を投げ掛けた。いくつかのプリオン単離株を含む脳のホモジネートの蛋白質の部分分解を行うと、電気泳動による移動性が僅かに異なるペプチドが生成することが分かった[BessenおよびMarsh（ 1992）J Viol 66:2096-2101;BessenおよびMarsh（1992）J Gen Virol 73:329-33 4;Telling，Parchiら(1996)Sicence 274:2079-2082]。これらの所見は、プリオンの異なる株のPrP^Sc分子は異なる立体構造を持ち、このため蛋白質分解による切断部位が異なることを示唆している。または、ここで観察された差異は、他の分子と異なる複合体を形成することによって、異なる株の間ではPrP^Sc中の切断部位が異なるとしても説明できる[MarshおよびBessen（1994）Phil Trans R Soc Lond B 343:413-414]。プリオンの異なる株の間ではプリオン蛋白質のグリコシル化のパターンが異なる可能性があると提唱した研究者もいる[Collinge，Sidle ら(1994)Nature 383:685-690;Hill，Zeidlerら(1997)Lancet 349:99-100]。しかし、複数のプリオン株を診断するために、グリコシル化とペプチドマッピングのパターンを使用する方法の信頼性は、現在まだ論争中である[Collings，Hillら(1997)Nature 386:564;Somerville，Chongら(1997)Nature 386;564]。変性後に免疫反応性を上昇させることによってPrP^Scを検出するシステムが、S erbanら、Neurology，Vol．40，No．1，Ja 1990によって提供されている。生物試料中の感染性PrP^Scを十分な感度で特異的に直接解析できれば、動物の接種の必要が全くなくなると考えられる。残念ながら、現在のPrP^Sc解析では、これは不可能だと思われる。現在のところ、プロテイナーゼＫおよびウェスタンブロットに基づくPrP^Sc検出法の検出限界は、1μg/ml程度と推定され、これは10⁴〜10⁵ 個の感染性プリオンに相当する。また、従来のプロテイナーゼＫに基づく解析法のPrP^Scに関する特異性は、疑いもなく感染性のあるプリオン調製品に、プロテイナーゼＫ抵抗性が相対的または全くないという最近の研究結果によって、疑わしくなった[Hsiao，Grothら(1994)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:9126-9130;T ellingら(1996)Genes & Dev.]。ヒトトランスチレチン(TTR)は、主にβシート構造を持つ4つの同一ユニットから成る正常な血漿蛋白質で、ホルモンであるチロキシンの輸送体の役割を果たす。TTRが異常な自己会合をしてアミロイドフィブリルを形成すると、老年性全身性アミロイドーシス(SSA)および家族性アミロイド多発神経障害(FAP)という、ヒトの2つの疾患がおきる[Kelly（1996）Curr Opin Strut Biol 6(1):11-7]。FAP におけるアミロイドの形成の原因は、TTR遺伝子中の点変異である。SSAの原因は不明である。臨床診断は、生検材料にアミロイド沈着物をインサイチューで検出することによって、組織学的に確立される。現在までに、インビボにおいてTTRがアミロイドに転換する機構に関しては、ほとんど知られていない。しかし、いくつかの研究室は、インビトロで、正常なヒトTTRを部分変性させることによって、アミロイドの転換が刺激されることを示した[McCutchen，Colonら(1993)Biochemistry 32(45):12119-27;McCutchenおよびKelly（1993）Biochem Biophys Res Commun197(2)415-21]。立体構造の転移機構には、重合して直線状のβシート構造を持つアミロイドフィブリルを形成する単量体の立体構造中間体が含まれている[Lai，Colonら(1996)Biochemistry 3 5(20):6470-82]。このプロセスは、チロキシンまたはトリヨードフェノールのような安定化分子と結合することによって、弱められる[Miroy，Laiら(1996)Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 93(26):15051-6]。以上の点を考慮すると、試料中の、トランスチレチンおよびプリオン蛋白質を含む病原性蛋白質の存在を試験するための、特異的で、処理量が多く、費用効率の高い解析法が必要なことは明らかである。本発明は、病原性蛋白質を検出するのみならず、特定の株を決定することのできる解析方法を提供する。発明の概要低レベルで存在する蛋白質の疾病型を検出するためには、2つの異なる方法が存在する。最も簡単な方法には、事前に決定した基準が計算されていることが必要で、2つの立体構造（第1の立体構造と、第2の疾病関連立体構造）を取る蛋白質を含む疑いのある試料を提供し、第2の立体構造のすべての蛋白質を抗体との結合親和性の高い異なる立体構造に転換するように試料を処理し、処理した試料に、第1の立体構造および/または異なる立体構造を取る蛋白質に対して第2の立体構造よりも高い親和性で結合する抗体を接触させ、蛋白質に対する抗体の結合レベルを決定し、事前に決定した基準と結合レベルを比較し、それによって、比較に基づき、第2の疾病関連立体構造を取る蛋白質を試料が含む可能性を決定することを含む。本明細書中に開示される方法によると、１x10³粒子／ml以下のレベルにある疾病型立体構造を検出することができる。本発明の解析法は、事前に決定してある基準を用いなくても実行できる。本解析方法は、（a）蛋白質（第1の立体構造および第2の疾病関連立体構造を有する）を含む疑いのある試料を提供し、（b）試料を第1および第2の部分に分割し、（c）第1の部分を、第2の立体構造よりも高い親和性で第1の立体構造に結合する抗体に接触させ、（d）第2の部分を、第2の立体構造を持つすべての蛋白質が、その抗体に対する親和性がより高い、異なる立体構造を取るように処理し、（e ）第2の部分を該抗体と接触させ、（f）該第1および第2の部分に対する抗体の結合の相対レベルを決定し、（g）比較によって第2の立体構造を取る蛋白質の有無を決定する段階を含む。本発明の解析法は、少なくとも2つの立体構造（例、未変性非疾病型立体構造および疾病型立体構造）を持ち、１x10³粒子/ml以下のレベルで存在する蛋白質を含む試料を解析するのに有用である。本発明は、詰まった構造の疾病型立体構造の蛋白質には結合しないか、比較的低い親和性を持つ抗体を使用する。有用な抗体の1つは、20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection )に1986年10月8日に寄託され、1989年2月21日発行で、選択的にPrP^Cに結合する抗体を開示するために参照として本明細書に組み入れられる米国特許第4,806,62 7号に開示されたハイブリドーマ細胞株ATCC HB9222によって産生されるモノクローナル抗体263K 3F4である。解析法の具体的な例は、第1と第2の部分に分けられる試料を提供することによって実施できる。第1の部分を第1の固体支持体に結合し、その後、疾病型に結合する抗体よりも高い親和性（例、4〜30倍高い親和性）で非疾病型の蛋白質に結合する標識抗体に接触させる。試料の第2の部分は、（存在するならば）試料中に存在する強く結合した疾病型蛋白質が、標識抗体に対して、より高い結合親和性を持つ緩い立体構造を取るように、処理する。処理後、第2の部分も固体支持体の表面に結合させる。その後、第1の部分に使用した標識抗体と同じタイプのものを第2の部分に接触させる。支持体上の蛋白質に結合する抗体の量に基づいて、第1の部分中の蛋白質レベルを決定する。第2の処理された部分中の蛋白質レベルも、同様にして決定する。この2つの差を決定し、第2の部分の蛋白質に結合する抗体量が、第1の部分よりも有意に高いことが判明した場合、元の試料中に強く結合した疾病関連立体構造を取る蛋白質が含まれていたと推定することができる。さらに、本明細書に記載される特に感度の高い解析系および公式を使用することによって、元の試料の単位体積当たりに含まれている疾病関連立体構造を持つ蛋白質の量を、決定することもできる。また、変性した蛋白質に結合する抗体と、変性していない蛋白質に結合する抗体との比率を決定することによって、存在する疾病関連蛋白質の特定の株を決定することができる。本発明の基本概念を示すためには、少なくとも2つの部分に分けられる開始試料が必要である。第1の部分は、蛋白質を処理せずに標識抗体に接触させ、第2の部分は、疾病型の立体構造を取るすべての蛋白質が、抗体に対してより高い結合親和性を持つ立体構造を取るように処理してから、標識抗体に接触させる。測定値を比較し（すなわち、一方から他方を差し引く）、2つの測定値の差に基づいて、疾病関連立体構造を取る蛋白質の存在を推定する。しかし、各解析のために2 つの測定値を得ることなく、本発明の基本概念を利用することも可能である。これは、統計的に有意な数の、密接に関連する試料に対してこの解析法を実行し、それに基づいて基準を確立することによって実施できる。基準が確立されれば、試料に疾病関連立体構造を取る蛋白質が全くない場合に観察される結合抗体の量が分かる。基準を用いて、その後、疾病関連立体構造を取るすべての蛋白質が、標識抗体に対する結合親和性がはるかに高い別の立体構造を取るように、試験する試料を処理する。そして、得られた測定値を基準と比較する。得られた測定値と基準との差が、一定の範囲を越えていれば、元の試料に疾病関連立体構造の蛋白質が含まれていたと推定することができる。本発明の第3の態様では、上記に開示される態様のいずれかおよび本明細書に提供される公式を利用して、元の試料中に存在する疾病関連立体構造の蛋白質の数を（定量的に）計算することができる。第4の態様では、試料中に存在する感染性蛋白質の特定の株が決定される。株は、試験試料の「蛋白質指数」を、所定の蛋白質の粒子株の既知の蛋白質指数と比較して決定する。試料の「蛋白質指数」は、末変性の蛋白質に結合する抗体量に対する、蛋白質の変性型に結合する抗体量の割合を決定して計算する。すべてのシステムと同様に、疾病型立体構造の蛋白質濃度に対する、非疾病型立体構造の濃度を低下させるように、試験する試料をあらかじめ処理することが好ましい。例えば、元の試料を、緩んだ非疾病型蛋白質を優先的に分解する化合物によって化学的に処理する、および/または非疾病型立体構造の蛋白質に優先的に結合し、それによってこれを除去するような抗体に接触させることができる。疾病型立体構造に選択的に結合して複合体を形成する化合物を添加し、複合体を沈殿させるために試料を遠心して、疾病型立体構造の蛋白質を濃縮し、その後、本明細書に記載される方法にしたがって試験することによって、本発明の様々な局面の感度をさらに上昇させることが可能な場合がある。そのような濃縮方法に関する明細は、本出願と同日付けで出願した、「疾病関連立体構造を持つ蛋白質の濃縮プロセス」という名称の同時係属出願、弁理士明細書番号6510/098001 に詳細に記述されている。上述の本発明の解析法の種々の態様は、すべて「直接」型の免疫測定法であり、試料中に存在する疾病関連立体構造の蛋白質の立体構造を変更するための処理をして、またはしないで、標識抗体を用いて試料を直接に解析するものである。「間接」解析法も使用できる。例えば、トランスジェニックマウスを使用して（存在するなら）試料中の疾病関連蛋白質の数を増加させ、得られるシグナルを強化することが、望ましいことがある。本発明のこれらの態様を実行するためには、まず、疾病関連立体構造の蛋白質を接種すると疾病の症状を発現するようにゲノムを修飾したトランスジェニックマウスに、試料を接種する。マウスに接種した後、十分な期間（例、30日）が経過した後に、トランスジェニック動物を屠殺して、マウス由来のホモジナイズした脳組織のような試料を用いて、上述の直接解析法を行う。本発明は、元の試料に疾病関連立体構造の蛋白質が含まれているかどうかの決定が成されるまでに必要な時間を短縮することによって、トランスジェニックマウスでプリオンを検出する能力を強化する。1996年6月6日に出願した係属中の米国特許出願第08/660,626号（参照として本明細書に組み入れられる）で開示したように、エピトープタグを付けたPrPを用いて、Tgマウスの脳からP rP^Scを親和性によって精製し、その後本発明の解析法を適用することも可能である。本発明がなければ、マウスに接種してから、接種したマウスが疾病の症状を実際に示すまで待たなくてはならない。マウスによっては、これに数カ月または数年かかる場合がある。本発明の解析方法は、少なくとも2つの立体構造を取る蛋白質が試料に含まれていることが疑わしい場合に、任意の種類の試料に適用できる。蛋白質は、既知の抗体、産生できる抗体、または他の特異的な結合パートナーに結合する、1つの立体構造を取る必要がある。第2の立体構造よりも第1の立体構造に対してはるかに高い親和性を持つ抗体または結合パートナーを用いることによって２つの構造が区別できるよう、第2の立体構造は、結合親和性の点で第1の立体構造と十分に差がある必要がある。最も簡単な概念では、本発明は、既知の標識抗体が、非疾病型蛋白質に高い親和性で結合し、同蛋白質が疾病関連立体構造をとる場合には結合しない（または非常に低い親和性で結合する）ような場合に、最もうまく働く。しかし、現実には、所定の蛋白質は2つ以上の立体構造を取る可能性がある。蛋白質は、複数の非疾病立体構造および複数の疾病関連立体構造を取る可能性がある（Tellingら、Science(1996)）。（1）少なくとも1つの非疾病型立体構造の結合親和性は、少なくとも1つの疾病型立体構造と異なっており、かつ、（2）蛋白質の疾病関連立体構造を処理して、結合親和性を実質的に上昇させることが可能であれば、蛋白質の非疾病型および疾病型という複数の立体構造が存在する場合でも、本発明は有用である。上述のように、本発明の解析法は、蛋白質が非疾病型および疾病関連立体構造を含むかぎり、任意の種類の蛋白質に関して任意の種類の試料の解析に使用できる。しかし、本発明は、以下の蛋白質の存在に関して試料を解析するために特に開発された：(1)PrP蛋白質を解析して、試料中に疾病型立体構造すなわちPrP^Sc を取るPrP蛋白質が含まれているかを決定する、(2)アルツハイマー病に関連する βA4の不溶性型、および(3)トランスチレチン。したがって、以下の開示の多くは、本発明の免疫測定法を用いて、試料中のPrP^Sc（または程度は低いものの、 βA4もしくはトランスチレチン(TTR)）の存在を検出することを目的とするものであるが、同じ一般的概念が、広範囲の様々な種類の蛋白質の疾病関連立体構造を検出するために適用できると理解される。さらに、本開示は、試料中の感染性プリオン（PrP^Sc）の特定の株を決定するための方法を記載することを特に目的としているが、異なる疾病に関連する他の圧縮性の蛋白質の特定の株の決定にも、同じ一般的概念が適用できると理解される。本PrP^Sc検出法は、選択された精製IgGをユーロピウムによって標識することによって、開発された。使用された抗体は、αヘリックス構造を含むPrP^C（非疾病型立体構造）に高い結合親和性を持つ。この抗体は、βシート構造を持つPrP^Sc （疾病型立体構造）には低い結合親和性を持つ。IgGは、一般的なモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または組換え抗体から得られ、典型的にはPrP^Cおよび折り畳まれていない構造のプリオン蛋白質の、90〜145または222〜231の配列を認識する。異なる立体構造を持つ組換えプリオン蛋白質を、グルタルアルデヒド活性化段階によってポリスチレンプレートに化学的に架橋した。90〜231の配列に相当する組換えシリアンハムスタープリオン蛋白質のαヘリックス、βシート、およびランダムコイル構造に対するEu標識IgGの相対的親和性は、96穴ポリスチレンプレートで、時間分解、解離増強蛍光法によって決定した。蛋白質に対する異なる標識抗体の相対的親和性の決定は、別の方法で行うことができる。しかし、蛋白質の疾病関連立体構造は、非疾病型立体構造と比べて非常に低い濃度で存在することが多い。したがって、蛋白質の疾病型立体構造の処理によって得られる何らかの増加を検出するためには、非常に感度の高い方法がしばしば必要になる。特に感度の高い方法の1つは、時間分解、解離増強蛍光法である。この方法を注意深く較正することによって、βシート構造から変性状態への移行に伴う抗体反応性のシグナルの上昇を検出することが可能である。このシグナルは、未変性のαヘリックスから、処理後の緩いまたは変性状態への変換で得られるシグナルと比較して、相対的に大きい。したがって、プリオン蛋白質の元の構造状態は、未変性状態と処理した状態のディファレンシャル解析によって、決定できる。βシート蛋白質を含まない試料を処理すると、免疫反応性にある程度の増加が見られる。この増加量を調整する必要があり、調整後の濃度または量を「調整量」と呼ぶ。PrP^Cのαヘリックス構造の結合を上回る（調整量を越えるもの）量の抗体特異的結合は、PrP^Scの病原性および感染性に必須のβシート構造の存在の尺度である。本発明の第1の目的は、未変性の非疾病型立体構造および疾病関連立体構造を取る蛋白質（例、PrP蛋白質、βA4蛋白質、およびトランスチレチン）を含むと疑われる試料の解析法に適用できる免疫測定法を提供することである。本発明の利点は、解析法で使用する抗体が、疾病関連立体構造の蛋白質に対して結合しないかまたは非常に低い結合親和性を持ち、疾病関連立体構造が非疾病型立体構造よりも低い濃度で存在しているとしても、疾病関連立体構造の蛋白質（例、PrP^Sc、βA4、およびトランスチレチン）の存在を、本免疫測定法で迅速かつ正確に決定できることである。本発明のもう1つの目的は、（1）病原性の粒子が試料中に存在するかどうかを決定するのみならず、（2）試料中の粒子の濃度を決定し、および（3）存在する粒子の特定の株を決定することが可能な解析法を提供することである。本発明の特徴は、トランスジェニック動物、例えば試料中の蛋白質の存在を検出するために使用されるマウスを用いて、得られたシグナルを増強することができることである。もう1つの特徴は、感度を増強するために、時間分解、解離増強蛍光法を使用することである。もう1つの利点は、１x10³粒子/ml以下の濃度の疾病型立体構造の蛋白質が検出可能なことである。 1つの具体的な目的は、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ネコ、イヌ、マウス、およびニワトリの組織および/または体液から得られた、またはそれに由来する、様々な試料中の感染性プリオン蛋白質の存在を決定するための診断解析法を提供することである。もう1つの具体的な目的は、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ネコ、イヌ、マウス、およびニワトリの組織および/または体液から得られた、またはそれに由来する、様々な試料中のβA4蛋白質の存在を決定するための診断解析法を提供することである。もう1つの目的は、プリオンを含む可能性のある試料を注射したトランスジェニック動物および非トランスジェニック動物の脳における、未変性で感染性のプリオン蛋白質を迅速に解析する方法を提供することである。もう1つの目的は、病原性蛋白質（例えば、プリオンまたはβシートβA4）の変性レベルを汚染除去後に解析することによって、その汚染除去手順を評価する方法を提供することである。もう1つの目的は、異なる蛋白質の疾病型立体構造に関連する疾病を治療する可能性を評価するために、種々の化合物の迅速なスクリーニング法を提供することである。例えば、種々の蛋白質立体構造（例、PrP^CまたはβA4のαヘリックス構造）に対する安定化効果、または蛋白質の病原性構造（例、PrP^ScまたはβA4 のβシート構造）に対する不安定化効果について化合物をスクリーニングすることなどによる。もう1つの目的は、プリオン病の治療可能性に関して、種々の薬学的化合物をスクリーニングする迅速な方法を提供することである。例えば、PrP^C蛋白質の正常なアイソフオームのαヘリックス構造に対する安定化効果、またはPrP^Sc蛋白質の病原性アイソフォームのβシート構造に対する不安定化効果について、化合物のスクリーニングすることなどによる。もう1つの利点は、蛋白質の感染性立体構造を直接認識することのできる抗体がなくても、PrP^Cのような蛋白質の正常な（非疾病型）アイソフォームのシグナルを除去するためのプロテイナーゼＫ段階を使用しなくても、本プロセスを実行できるということである。もう1つの利点は、本発明のプロセスでは、βA4またはトランスチレチンの病原性立体構造を直接認識することのできる抗体が不要だということである。本解析法の重要な特徴は、迅速で、費用効果が高く、処理量が多いデザインであり、96穴プレート1枚あたり、1日に96試料をスクリーニングするようにデザインできるということである。本発明のもう1つの局面は、ヒトおよび動物の組織、体液、ならびに医薬品から得られた試料中で、異常なアミロイド構造を取るTTRを定量的に検出する診断方法である。本発明のプロセスは、試料中に存在する混合物から、正常およびアミロイド構造のTTRを区別し、定量化する直接的で感度の高い方法を提供する。定量化は、ランダムコイル構造に対する、正常またはアミロイド構造のTTRに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体の親和性の差を測定することに基づく。本発明は、そのような定量化のために使用される評価方法および数学的公式を3種類記載している。 1つの重要な目的は、ヒト、霊長類、サル、ブタ、ウシ、ヒツジ、シカ、ヘラジカ、ネコ、イヌ、およびニワトリの組織から得られた、またはそれに由来する、様々な試料中の病原性TTRの特異的な診断解析法を提供することである。もう1つの目的は、トランスジェニック動物におけるTTRのアミロイド型の迅速な解析法を提供することである。もう1つの目的は、老年性全身性アミロイドーシス(SSA)および家族性アミロイド多発神経障害(FAP)の治療の可能性を持つ、様々な薬学的化合物をスクリーニングする迅速な方法を提供することである。そのような化合物は、TTRの正常な構造に対する安定化効果、またはTTRのアミロイド構造に対する不安定化効果について、スクリーニングする。さらにもう1つの目的は、天然または人工的なAPP遺伝子を持つトランスジェニック動物において、TTR遺伝子中の種々の自然突然変異およびデザインした変異が、TTR遺伝子産物の立体構造、安定性およびアミロイド形成に与える影響をスクリーニングするための、迅速な方法を提供することである。具体的な利点は、本発明の解析法により、病原性型のTTRを、変性した非病原性TTRとの混合物、または可溶性型TTRとの混合物中でも検出できる、例えば、１ x10³粒子/ml以下でも検出できる可能性があることである。本発明プロセスのこれらおよびその他の目的、利点、および特徴は、以下に図面を添付し、さらに完全に記述された、解析方法、抗体の作製および試験、並びにトランスジェニックマウスの詳細を読むことにより、当業者には明らかになると思われる。図面の簡単な説明図1は円偏光二色性(CD)分光法により決定された組換えSHaPrP90-231の立体構造のスペクトログラフで、208nmおよび222nmに最小値がある2つの主要なバンドはαヘリックス構造を示しており、217nmに最小値がある1本の負のバンドは、主にβシート構造の特徴である。図2は5%のPrP^0/0マウス脳ホモジネートの存在下における、αヘリックス構造および変性した組換えSHaPrP90-231の競合解析結果を示すグラフである。ユーロピウム標識3F4 IgGによって得られた傾斜の差と交差点は、各立体構造が異なる親和性と結合部位数を持つことを示す。さらに、データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図3は5%のPrP^0/0マウス脳ホモジネートの存在下における、αヘリックス構造の組換えSHaPrP90-231の直接解析法の較正を示すグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図4は5%のPrP^0/0マウス脳ホモジネートの存在下における、βシート構造の組換えSHaPrP90-231の直接解析法の較正を示すグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図5は5%のPrP^0/0マウス脳ホモジネートの存在下における、αヘリックスおよびβシート型のSHaPrP90-231の直接解析法のインプット-アウトプットの検証を示すグラフである。Ｘ軸の蛋白質量はアミノ酸分析によって決定し、Ｙ軸の蛋白質量は解析法から計算されている。図6は、αヘリックスおよびβシート構造の、処理済み（変性）および未変性のSHaPrP90-231の、Eu標識3F4 IgGで示したシグナルの間の比率を示すグラフである。データ点および棒線は４回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図7は正常なハムスター脳ホモジネート中のPrP^C蛋白質の直接解析の結果を示すグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEM を表わす。図8はスクレイピー感染ハムスター脳ホモジネート中のPrP^C+Scの直接解析の結果を示すグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図9はモデルから計算された、正常なハムスター脳中のPrP蛋白質の総量、および両方の脳中のβシートPrP^Scの量を表わすグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図10はモデルから計算された、スクレイピー感染ハムスター脳中のPrP蛋白質の総量、および両方の脳中のβシートPrP^Scの量を表わすグラフである。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図11は直接解析および公式から計算されたSHaPrP^Scのβシート型の量と感染性との相関を示すグラフで、精製SHaPrP^Scを5% PrP^0/0マウス脳ホモジネートの存在下で超音波処理し、記載されるように希釈した。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図12はαヘリックスおよびβシート構造の両方のβA4(1-40)の円偏光二色性(C D)分光法のグラフである。208nmおよび222nmの主要バンドはヘリックス構造、21 7nmの負のバンドは主にβシート構造を示す（pH7.4）。図13は可溶性A4β(1-40)の直接解析のグラフである。図14はA4β(1-40)のβシート型の直接解析のグラフである。図15は未変性に対する変性A4β(1-40)の比率を示すグラフである。図16は組換えShaPrP90-231が、72時間の37℃インキュベーションの間に、αヘリックスからβシート構造に転換することを、円偏光二色性(CD)分光法によって示す。蛋白質濃度は5mg/mlだった。図17は組換えShaPrP90-231が、72時間の37℃インキュベーションの間に、αヘリックスからβシート構造に転換することを、直接のディファレンシャル解析で示す。〜24時間で未変性の構造のシグナルが上昇することは、未変性の構造が不安定化し、より開放的な構造になった後に、βシートの二次構造に転換したことを示す（図16参照）。蛋白質濃度は5mg/mlだった。図18はHFIPおよびグリセロールの両方が、組換えShaPrP90-231のαからβへの構造変化を予防できることを示す。TRFシグナルの変化は、分数変化率として表わしてあり、正の値は安定化、負の値は不安定化を示す。実験条件は図16および 17と同じであった。図19：ペントサンポリサルフェートは低濃度でShaPrP90-231の未変性構造を安定化する。コンゴーレッドはShaPrP90-231の安定性に影響を与えない。TRFシグナルの変化は、分数変化率として表わしてあり、正の値は安定化、負の値は不安定化を示す。実験条件は図16および17と同じであった。図20：両性イオン界面活性剤ZW3-12は未変性のSha90-231のαヘリックス構造を不安定化した。実験条件は図16および17と同じであった。TRFシグナルの変化は、分数変化率として表してあり、正の値は安定化、負の値は不安定化を示す。図21は正常な立体構造の精製ヒトTTRの直接解析の較正を示す。プレートは、抗TTR一次抗体（Accurate Chemical and Scientific Corporation社、ニューヨーク州ウエストベリー）およびEu標識抗ウサギ二次抗体によって処理した。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図22はアミロイド構造の精製ヒトTTRの直接解析の較正を示す。プレートは、抗TTR一次抗体およびEu標識抗ウサギ二次抗体によって処理した。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図23は、上記のように処理した正常およびアミロイド構造の、変性および未変性TTRのシグナルの間の比率を示す。データ点および棒線は4回の独立した測定で得られた平均±SEMを表わす。図24：抗TTRポリクローナル抗体を用いた直接解析で得られたデータから、アミロイド構造のTTRの量を計算するための修正済み公式。一般的な等式からの変更は、正常及びアミロイド型TTRの、変性および未変性状態の逆転した比率を反映している。試料の変性状態の蛍光と、未変性の正常な蛋白質から変性した状態への転換で期待される蛍光との間の差異は、アミロイド構造のTTRの量と比例している。F_nは未変性構造の総シグナル；F_nNおよびF_nAは、それぞれ未変性の正常およびアミロイド構造のシグナル；F_nは変性状態のTTRの総シグナル；F_dNおよび F_dAは変性した正常またはアミロイド状態のTTRのシグナル；ΔF_n _→dは未変性から変性状態への転換におけるシグナルの総増加量；ΔF_Nn _→dは未変性から変性状態への転換における正常な構造のシグナルの増加量；ΔF_An _→dは未変性から変性状態への転換におけるアミロイド構造のシグナルの変化；f_Nn _→dは未変性から変性状態の正常TTRへの転換の相関係数。図25は「プリオン指数」（変性対未変性のPrP蛋白質に結合する抗体の割合）とμg/mlで表わしたPrP^Scの濃度のグラフである。示されている結果は、異なるプリオン株が感染したLVG/LAKシリアンハムスターの３つの異なる脳から得られた平均±SEMを表わす。好ましい態様の詳細な説明本解析法および方法を開示および説明する前に、本発明は記述された特定の抗体、蛋白質、標識、解析法または方法に限定されるものではなく、当然のことながら変更が可能であることを理解する必要がある。また、本発明の範囲は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるもので、本明細書で使用される用語は、特定の態様を説明するためにのみ使用されるもので、限定するためのものではないことも理解する必要がある。別に特記しない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同一の意味を有する。本発明の実施または試験においては、本明細書に記載したものと同様または同等の任意の材料および方法を利用することができるが、好ましい方法および材料は以下に記載する。本明細書に記載した刊行物はすべて、その文献に関して引用される方法および/または材料を説明または開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。本明細書記載の論文は、本出願の出願日以前のその開示のためのみに提供される。本明細書記載のいかなる開示も、先行発明に基づいて、本開示が成された日付を早める権利が本発明者らにはないと自認したと解釈されるべきではない。さらに、実際の発行日が本明細書記載のものとは異なることが明らかになった場合には、提供されている発行日は変更することになる。定義本明細書で使用される「蛋白質」と言う用語は、任意のアミノ酸配列を含み、糖蛋白質のような修飾された配列も含むことを意図している。この用語は、天然に存在する蛋白質およびペプチド、ならびに組換えまたは合成によって合成されるものも含む。本発明に関して使用される「蛋白質」という用語は、特に、同一または実質的に同一のアミノ酸配列を持つが、異なる三次元構造を持つ、少なくとも2つの異なる立体構造を取る、天然に存在する蛋白質を含むことを意図している。蛋白質の2つの立体構造には、疾病状態とは関連していない立体構造が少なくとも1つ、および疾病状態に関連する病原性の立体構造が少なくとも1つ含まれている。本開示と関連して使用される蛋白質の具体的な好ましい例は、PrP^Cと呼ばれる非疾病型と、PrP^Scと呼ばれる疾病関連型を含むPrP蛋白質である。プリオン蛋白質またはPrP蛋白質のPrP^Sc型は感染性で病原性であるが、他の蛋白質の疾病型は、病原性であるが感染性ではない。本明細書では、病原性という用語は、その蛋白質が実際に疾病を誘導するか、または単にその蛋白質が疾病と関連しており疾病が存在するときに存在するということを意味する場合がある。したがって、本開示と関連して使用される病原性蛋白質は、必ずしも、疾病の特異的な原因物質である蛋白質とは限らない。本明細書では「処理」「処理する」および類似の用語は互換可能に使用され、試料またはその一部ならびに具体的には試料中の蛋白質が、物理的および/または化学的に操作を受け、それによって試料中の疾病関連立体構造を持つ蛋白質が、抗体のような結合パートナーとさらに高い結合親和性を持つ異なる立体構造へと変化するプロセスを説明するために使用される。処理された蛋白質は、変性もしくは部分変性した蛋白質、または緩い立体構造の蛋白質とも呼ばれ、その立体構造は、抗体のような結合パートナーに対する、蛋白質の結合親和性を上昇させる。処理には、試料を熱、圧力、および/または化学物質に曝露することが含まれる。好ましい態様では、PrP^Sc（βシート構造を含む疾病関連立体構造）を含む試料を処理して、その蛋白質が、抗体結合親和性が4倍またはそれ以上高い、異なる立体構造（例、αヘリックス構造および/またはランダムコイル構造を含む）を取るようにする。「PrP蛋白質」「PrP」などの用語は、本明細書では互換可能に用いられ、ヒトおよび動物における疾患（海綿状脳症）を引き起こすことが知られている感染性粒子型PrP^Sc、および適切な条件下で感染性PrP^Sc型に変換される非感染型のPrP^C の両方を意味するものとする。「プリオン」、「プリオン蛋白質、および「PrP^Sc蛋白質」などの用語は、本明細書では互換可能に用いられ、PrP蛋白質の感染性PrP^Sc型を意味し、「蛋白質（protein）」および「感染（infection）」の2つの単語をつなげて短縮したものである。外粒子は、その全体ではないが大部分がPrP遺伝子によってコードされるPrP^Sc分子を含む。プリオンは、細菌、ウイルスおよびウイロイドとは異なる。既知のプリオンは、動物に感染し、ヒツジおよびヤギの神経系の伝染性変性疾患であるスクレイピーのほか、別名「狂牛病」と呼ばれるウシ海綿状脳症（BS E）およびネコのネコ海綿状脳症を引き起こす。ヒトが罹患するプリオン病としては、(1)クルー、(2)クロイツフェルト・ヤコブ病(CJD)、(3)ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（GSS）、および(4)致死性家族性不眠症（FFI）の4種類が知られている。本明細書で用いられる「プリオン」には、以上の疾患のすべてもしくは任意の1つ、または用いられる任意の動物、特にヒトおよび家畜における他の疾患を引き起こすすべての型のプリオンが含まれる。「PrP遺伝子」という用語は、本明細書では、既知の多型および病原性変異を含む蛋白質を発現する遺伝的材料を説明するために用いられる。「PrP遺伝子」という用語は一般に、任意の型のプリオン蛋白質をコードする任意の種の任意の遺伝子を意味する。一般的に知られたいくつかのPrP配列は、ガブリエル（Gabri el）ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:9097〜9101（1992）ならびに米国特許第5,565,186号および国際公開公報第97/04814号に記載されており、この文献はこのような配列を開示および説明するために参照として本明細書に組み入れられる。Pr P遺伝子は、本明細書で説明する「宿主」および「被験」動物を含む任意の動物、ならびにそのいずれかおよびすべての多型および変異から得ることができ、この用語は、まだ発見されていないその他のこのようなPrP遺伝子も含むことが認識される必要がある。このような遺伝子によって発現される蛋白質は、PrP^C（非疾患型）またはPrP^Sc(疾患型）のいずれかの型であると想定される。「抗体」とは、ある抗原と結合する能力を持つ免疫グロブリン蛋白質を意味する。本明細書で用いるような抗体には、抗体全体のほかに、関心対象のエピトープ、抗原または抗原性断片と結合しうる任意の抗体断片も含まれる（例えば、F( ab')、Fab、Fv）。本発明の解析法に好ましい抗体は、関心のある蛋白質、例えばA4βアミロイド蛋白質またはPrP蛋白質に、免疫反応性または免疫特異的であって、したがって、これに特異的および選択的に結合する。未変性の非疾病型および処理された疾病型の両方に免疫反応性および免疫特異的であり、未処理の疾病型にはそうではない抗体が好ましい（例、未変性PrP^Cおよび処理済みPrP^Scの両方に対して免疫反応性および免疫特異的ではあるが未変性PrP^Scにはそうではない）。PrPに対する抗体は、好ましくは免疫特異的で、例えば関連する材料に実質的に交差反応しない。本発明に関連して使用できるいくつかの特異的抗体は、抗体を開示し説明するために参照として本明細書に組み入れられる国際公開公報第97/10505号に開示されている。この公開PCT出願は、やはり参照として本明細書に組み入れられる米国特許出願第08/713,939号に相当する。PCT出願で開示されたPrP^Scに選択的に結合する抗体は、本発明で使用するべきではない。「抗体」という用語はすべての種類の抗体、例、ポリクローナル、モノクローナル、およびファージディスプレイ法を用いて生産される抗体を含む。本発明の特に好ましい抗体は、未変性のPrP^Cおよび処理済みPrP^Scの両方に比較的高い親和性を持つが、PrP^Scに対しては比較的低い結合親和性をもつか、実質的に親和性を持たない抗体である。さらに具体的には、本発明の抗体は、未変性のPrP^Scに対する結合親和性と比較して、好ましくは4倍またはそれ以上、より好ましくは15倍またはそれ以上、およびさらに好ましくは30倍またはそれ以上の結合親和性を、未変性のPrP^Cおよび変性PrP^Scの両方に対して持つ。「精製抗体」とは、天然の状態で付随しているその他の蛋白質、炭水化物および脂質を実質的に含まないものを意味する。このような抗体は、A4βまたはPrP^S ^c 蛋白質のβシート構造など治療された、または変性した病的構造の蛋白質（またはその抗原性断片）に「優先的に結合する」、すなわち、抗原性に関連のないその他の分子を実質的に認識しないか、または結合しない。本発明の精製された抗体は、好ましくは特定の種に対する免疫反応性および免疫特異性を有し、より好ましくは、天然のPrP^C、および天然のPrP^Scもしくは未処理のPrP^Scではなく治療型もしくは非変性型のPrP^CおよびPrP^Scに対して免疫特異的である。蛋白質（例えばPrP蛋白質）の「抗原性断片」とは、抗体と結合する能力を持つような蛋白質の部分を意味する。「特異的に結合する」とは、特定のポリペプチド、例えばPrP^CまたはA4β蛋白質などの蛋白質のエピトープに対する抗体の高いアビディティおよび／または高親和性結合を意味する。この特異的ポリペプチド上のエピトープに結合する抗体は、好ましくは他のいかなるエピトープに対する同一抗体の結合よりも強い。この特定のポリペプチド上のエピトープに結合する抗体は、好ましくは任意のその他のエピトープ、特に関心対象の特定のポリペプチドに付随する分子、または同一試料中にある分子中に存在すると思われるものに対する同一抗体の結合よりも強く、例えば抗体がほぼ独占的にエピトープ部位またはPrP^Scの処理により曝露されたエピトープ断片などの所望の蛋白質の断片に結合し、未処理の天然PrP^Sc に曝露された断片には結合しないような結合条件に調整することによって、PrP^S ^c などの蛋白質のエピトープ断片に、より強く結合する。「検出可能な標識が施された抗体」「検出可能な標識が施された抗PrP」または「検出可能な標識がなされた抗PrP断片」とは、検出可能な標識が結合された抗体（または結合特異性を保持している抗体断片）を意味する。検出可能な標識は、通常は化学結合によって結合させられるが、標識がポリペプチドである場合には、代わりに遺伝子操作法によって結合させてもよい。検出可能な標識が施された蛋白質を製造するための方法は、当技術分野では周知である。検出可能な標識が、当技術分野では知られているが、通常は、放射性同位体、発蛍光団（fluo rophore）、常磁性標識、酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ）、または検出可能な信号（例えば、放射能、蛍光、発色）を発するかもしくはその基質に標識を曝露した後に検出可能な信号を発するその他の成分もしくは化合物である。さまざまな検出可能な標識／基質の対（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ／ジアミノベンジジン、アビジン／ストレプトアビジン、ルシフェラーゼ／ルシフェリン）、抗体を標識するための方法、および標識された抗体を用いるための方法は、当技術分野では周知である（例えば、HarlowおよびLane編、（抗体：実験マニュアル（Antibodies:A Laboratory Manual）（1988）、Cold Spring Harbor Lab oratory Press、Cold Spring Harbor、NY）を参照のこと）。ユーロピウムは特に好ましい標識である。本明細書で用いる略号には以下のものが含まれる： CNSは中枢神経系； BSEはウシ海綿状脳症； CJDはクロイツフェルト・ヤコブ病； FFIは致死性家族性不眠症； GSSはゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病； Huはヒト； HuPrPはヒトプリオン蛋白質； Moはマウス； MoPrPはマウスプリオン蛋白質； SHaはシリアンハムスター； SHaPrPはシリアンハムスタープリオン蛋白質； Tgはトランスジェニック； Tg（SHaPrP）はシリアンハムスターのPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（HuPrP）は完全なヒトPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（ShePrP）は完全なヒツジPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； Tg（BovPrP）は完全なウシPrP遺伝子を含むトランスジェニックマウス； PrP^Scはプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； PrP^Cはプリオン蛋白質の細胞含有性の共通で、一般的アイソフォーム； MoPrP^Scはマウスプリオン蛋白質のスクレイピー型アイソフォーム； MHu2Mは、マウスPrP遺伝子のある領域が、マウスPrPと9コドン異なる対応したヒト配列によって置換されているキメラ型のマウス／ヒトPrP遺伝子； Tg(MHu2M)マウスは、キメラ型MHu2M遺伝子を含む本発明のトランスジェニックマウス； MHu2MPrP^Scは、キメラ型ヒト／マウスPrP遺伝子のスクレイピー型アイソフォーム； PrP^CJDはPrP遺伝子のCJD型アイソフォーム； Prnp^0/0は、MoPrP遺伝子などの内因性のプリオン蛋白質遺伝子の両方の対立遺伝子の除去を示し； Tg(SHaPrP^+/o)81／Prnp^0/0は、SHaPrPを発現するトランスジェニックマウスの特定の系統（81）であり、+／ｏはヘテロ接合体であることを示し； Tg（HuPrP）／Prnp^0/0は、ヒトプリオン蛋白質遺伝子（HuPrP）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交雑によって得られた雑種マウス； Tg（MHu2M）／Prnp^0/0は、キメラ型プリオン蛋白質遺伝子（MHu2M）を有するマウスと、内因性のプリオン蛋白質遺伝子の2つの対立遺伝子が破壊されたマウスとの交雑によって得られた雑種マウス； TTRはをトランスチレチン（transthyretin）示し； FVBは、FVBマウスの卵は比較的大きく外因性DNAのマイクロインジェクションに対する耐性が比較的高いため、トランスジェニックマウスの作出にしばしば用いられる標準的な同系交配系統のマウスを示し； [PrP_β]−βシート構造のプリオン蛋白質の濃度 [βA4_β]−βシート構造のβA4の濃度 [DRC]−蛋白質の疾病関連立体構造の濃度本発明の一般的局面本解析方法は、第1の立体構造および第2の疾病関連立体構造を取る蛋白質を含むと疑われる試料を提供することを含み、非疾病型立体構造の濃度と比較して、蛋白質の疾病型立体構造が非常に低い濃度で存在する場合にも、これを検出することができる。試料は第1の部分および第2の部分に分割される。第1の部分を好ましくは固体支持体の表面に結合し、その後、標識抗体と接触させる。この抗体は、第2の疾病関連立体構造の蛋白質に結合するよりも高い（4倍またはそれ以上）親和性で、第1の立体構造の蛋白質に結合する種類のものである。試料の第2の部分は、第2の疾病関連立体構造の蛋白質がすべて、末処理の第2の疾病関連立体構造の蛋白質に対する親和性と比較して、標識抗体に対して、より高い（4倍またはそれ以上）親和性を持つ、異なる立体構造を取るように処理する。処理後、第2の部分も、好ましくは固体支持体の表面に結合させる。支持体に結合した処理済み蛋白質を、第1の立体構造の蛋白質または異なる立体構造を取った蛋白質に抗体が結合できるような条件下で、標識抗体に接触させる。標識抗体が各部分に存在する適当な蛋白質と結合するために十分な時間、温度、化学的条件（例、pH）を与えた後、各部分に存在する蛋白質に対する標識抗体の結合レベルを決定する。時間分解、解離増強蛍光法のような非常に感度の高い解析法を使用し、約1x10³粒子/ml以下の範囲の濃度を検出することも可能にする。大部分の試料中では、疾病型構造の蛋白質の濃度は、非疾病型構造の蛋白質濃度と比較して、非常に低い（例、3桁以上の差）ため感度が高い必要がある。例えば、蛋白質の非疾病型立体構造は約1x10⁸粒子/mlの量で存在するが、この蛋白質の疾病型立体構造は僅か1x10⁴粒子/mlしか存在しない可能性がある。したがって、蛋白質の疾病型立体構造を処理して得られるシグナルの上昇は、非疾病型立体構造の蛋白質から得られるシグナルと比較して、非常に小さくなると思われる。試料の両方の部分の結合レベルが得られたら、このレベルを比較する。例えば、第1の部分の蛋白質に対する標識抗体の結合レベルを、第2の部分の蛋白質に対する抗体の結合レベルから、差し引く。第1の部分の蛋白質の結合親和性の上昇による差異を調整すると、この2つの差は、元の試料中に存在する、第2の疾病関連立体構造を持つ蛋白質の量を反映することになる。さらに具体的には、未変性の非疾病型立体構造にある蛋白質を処理した影響で、例えば、処理によって疾病関連立体構造の蛋白質のエピトープが露出するといったように、いくらか差が現れる蛋白質がある可能性がある。元の試料に第2の疾病関連立体構造の蛋白質が含まれているかどうかという疑問の結論を引き出す際に、この差を考慮する必要がある。この効果は図3および4で説明されている。図 3では、非疾病型立体構造の未変性蛋白質のみを含む未処理試料に対する抗体結合と、処理後の同じ未変性蛋白質との比較を示してある。図3に示されているように、処理により蛋白質の結合活性が増加しているという点において、より強いシグナルを示す処理蛋白質で得られる結果の間にはいくらかの差がある。しかし、図4は、元の試料に第2の疾病関連立体構造の蛋白質が含まれているときの同じ結果を示す。処理されない未変性の蛋白質は、非常に弱いシグナルを示す。しかし、処理された蛋白質は非常に強いシグナルを示す。処理済み試料と未処理試料との間の大きな差は、元の試料に第2の疾病関連立体構造を持つ蛋白質が含まれていて、これらの蛋白質は抗体に結合しないか、または非常に低い結合親和性で抗体に結合するということを、明らかに示している。しかし、処理後は、これらの蛋白質は、処理された非疾病型立体構造の蛋白質と同様に、またはほぼ同様に、またはこれ以上に抗体に対して強く結合する。本解析法を用いて、任意の種類の試料中の所定の蛋白質の疾病型立体構造の存在を試験できる。最も一般的に試験される試料には、生きた哺乳類由来の成分を含むか、加工時に生きた哺乳類由来の物質を使用する医薬品が含まれる。また、移植用の臓器および感染性プリオンを含む疑いのある牛肉のような食品も試験することが望ましい。本発明を用いて、医薬品、化粧品、生検または剖検組織、脳、脊髄、末梢神経、筋肉、脳脊髄液、血液および血液成分、リンパ節、ならびにプリオンのような蛋白質の疾病型が感染しているまたは感染している可能性のある動物またはヒト由来の培養物における、感染性PrP^Scのような1つまたは複数の種類の蛋白質の疾病型立体構造の存在を、試験することができる。処理または変性上述のように「処理」は、元々は詰まった疾病関連立体構造で存在する蛋白質に、抗体のような任意の結合パートナーに対して結合親和性の高まった緩い立体構造を取らせるようにする任意の物理的および/または化学的手段に、蛋白質を曝露することを含むことができる。一般に、本明細書で時には変性と呼ぶこともある処理には、蛋白質に対して、それまでは露出していなかった蛋白質上のエピトープを露出させ、新しく露出したエピトープに抗体または他の結合パートナーが結合できるようにする、何らかの手段を使用することが含まれる。使用できる処理方法には：(1)静水圧または温度のような物理的手段、(2)酸性またはアルカリ性pH、カオトロピック塩、変性性界面活性剤、およびプロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼ類のような化学的手段、ならびに(3)上記の組合わせが含まれる。処理時間は使用する処理方法によって異なるが、新しい結合部位を露出するためには十分であるが、蛋白質を完全に変性させるほど長くはない時間とする必要がある。前処理または蛋白質の除去/破壊試料のいずれの部分の処理または抗体試験を実行する前に、試料を前処理することが望ましい場合がある。前処理は、試料中に存在する蛋白質の非疾病型を破壊または除去するために行う。前処理方法の例には、蛋白質の非疾病型立体構造に結合する抗体を支持体表面に結合したカラムを作製し、それにより蛋白質の非疾病型立体構造をできるかぎり除くことが含まれる。または試料を、上記の「処理」の項で示したような、温度のみ、または酸もしくはアルカリなどの化学物質と組み合わせて長時間の静水圧などの物理的処理にかけることができるが、試料中に存在する比疾病型立体構造の蛋白質が破壊されるよう、比較的長時間、実行する。場合によっては、非疾病型および疾病型立体構造の蛋白質が破壊されることもある。しかし、非疾病型立体構造の蛋白質は、最初から緩い構造をしており、破壊を受けやすいため、このような蛋白質の破壊される割合のほうが相対的に高いと考えられる。したがって、前処理によって、疾病型立体構造の蛋白質濃度と比較して、非疾病型立体構造の蛋白質濃度が相対的に低い試料が得られる。これによって、解析法の感度が上昇し、より低い濃度の疾病型立体構造の蛋白質も検出可能になる。蛋白質の破壊によって疾病型立体構造が破壊されると感度が低下するため、蛋白質の破壊よりも除去のほうが好ましい。特に有用な前処理方法は、本出願と同じ日付けで出願した、「疾病関連立体構造を持つ蛋白質の濃縮プロセス」という名称の特許出願弁理士明細書番号6510/098001に開示されている。支持体表面への蛋白質の結合プラスチック支持体へのPrP蛋白質の化学的または親和性カップリングの方法は、広く論文に記述されており、様々である可能性がある。本診断解析法で使用される抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、または組換えFabであり、種特異的で、抗原の量が同一だと仮定したときに、未変性のPrP^CまたはPrP^Scの変性型に対して、感染性のPrP^Scに対する反応性より好ましくは少なくとも4倍弱い反応性で選択的に結合する必要がある。解析法を使用したプリオンの検出本発明の1つの局面は、未変性の感染型PrP^Sc蛋白質を、試料中、またはそのような物質を接種した感受性の動物の脳において、定量的に測定することによって、プリオン病を診断する2段階プロセスである。試料は、2つのアリコートに分割する。第1のアリコートは、非変性条件下で、すなわち、処理せずに、化学的活性化段階を通して未変性の立体構造で固体プラスチック支持体に架橋する。試料の第2の部分は、まず処理をしてから、プラスチック支持体に架橋する。この2つの部分試料を、その動物種の未変性のPrP^Cまたは処理済みPrP^Scを選択的に認識する標識抗体とインサイチューで反応させる。処理済みまたは未変性立体構造の PrP蛋白質に結合した抗体の量は、IgG標識のシグナルによって記録される。未変性のαヘリックス構造のPrP^Cで得られたシグナルの上昇から期待される量（すなわち調整量を越えた増加分）を上回る、変性試料で得られたシグナル分は、元の試料中の感染性βシート構造のPrP^Scの量の尺度である。PrP^Sc含有量の計算のために開発された公式は、本明細書の公式に示されており、実施例11に例示されている。プリオン病の診断は、3つの手順で確立される：(1)処理済み試料単独の測定、および正常な対照から得られたバックグラウンドのPrP^Cレベルを上回る、試験試料中の総PrP量の増加の検出；(2)所定の抗体に関する変性シグナルと未変性シグナルとの割合の計算、例えば、好ましくは、時間分解、解離増強蛍光法で、ユーロピウム標識3F4 IgGでの値が2.2を越えると、PrP^Scの存在を示す；(3)元の試料中の感染性βシート構造のPrP^Scの量の尺度としての、αヘリックス構造のPrP^C のシグナルの増加から期待される量を上回る、変性試料中のシグナル増加分の評価。好ましくは、（1）の段階の前に、本方法ではPrP^Scと比較してPrP^Cを多く除去または破壊する前処理段階を使用する。スクレイピー感染シリアンハムスターの脳では、この動物が発症したとき、Pr P^Scの濃度は、PrP^Cの濃度の5〜10倍である。この時点で、脳のプリオン力価は10 ％ホモジネートで10⁷〜10⁸ ID₅₀ユニット/mlである。本発明者らが開発した高度に定量的なシステムによって、PrP^Cシグナルを差し引くことができる。PrP^Sc 濃度がPrP^Cよりも高い場合には、容易に差し引くことができる。が、PrP^Sc濃度がPrP^Cよりもはるかに低い場合には、困難になる。上述の問題に対処するために、本解析法は抗原と抗体の異なる立体構造の間の親和性の原理を利用する。PrP^ScがPrP^Cよりもはるかに少ない場合にこの濃度を測定するためには、検出システムは非常に高い感度および少なくとも10⁴に渡る線形の範囲を持つ必要がある。本明細書に記載される解析法は、ユーロピウム標識IgGを用いて、（約）50pg/mlの濃度のPrP^Scも検出できる。ID₅₀ユニット当たり10⁵〜10⁶のPrP^Sc分子を仮定すると、本解析法では1mlあたり5x10²〜5x10³ID₅₀ ユニットを容易に検出できる。本解析法では、PrP^Sc濃度がPrP^C濃度の1％未満の混合物中で、PrP^Scを（直接法により）検出できる。免疫沈降法、サンドイッチ形式を使用した固相解析、Pr P^C除去のための界面活性剤抽出を伴う分画速心法、間接トランスジェニック動物法、またはこれらの組み合わせによって、さらに感度を上昇させることができる。控えめに見積もって、そのような手法を用いれば、１mlあたり5〜50 ID₅₀ユニット、またはそれほど控えめに見積もらなければ1mlあたり0.1〜0.01 ID₅₀ユニットの測定が可能になるはずである。そのような測定によって、感染性の「欠如」という、生物学的無菌性を確立する迅速で「積極的な」手段が提供できる。薬物の同定方法蛋白質の疾病関連立体構造の存在を同定できる上述の解析法は、蛋白質の疾病型立体構造に関連する疾病を治療または予防するための薬物として使用できる化合物の同定に応用できる。例えば、蛋白質の疾病関連立体構造を含むことが知られている組成物を、米国特許第5,565,186号および国際公開公報第97/04814号に開示および記述される種類のトランスジェニックマウスに接種する。その後、接種したマウスを、感染を予防すると信じられている化合物によって治療できる。潜伏期間のために十分な期間を置いた後、マウスの脳を抽出して、上述の解析法を用いて試験し、その治療用化合物が感染の予防に有効かどうかを決定する。本方法は、既に感染が起こっている場合に、特定の化合物が感染を安定化するか、すなわち疾病型立体構造の蛋白質の形成をさらに予防するかどうかを決定するためにも適用できる。本発明の解析法は、参照として本明細書に組み入れられる1995年11月2日出願済みの米国特許出願第08/556,823号で開示されている方法と組合わせて使用することもできる。この特許出願は、非疾病型立体構造の蛋白質と接触させて、化合物を疾病型立体構造に変換することのできる化合物を開示している。蛋白質の疾病関連立体構造の形成を予防する能力に関して、化合物をスクリーニングすることができるので、この方法は有用である。本発明の解析法によって、疾病関連立体構造の形成の予防に関して、任意の試験化合物の効果を正確に測定することが可能になる。上記の内容に基づいて、本発明は、第1の非疾病関連立体構造（例、PrP^C）および第2の疾病関連立体構造（例、PrP^Sc）を持つPrP蛋白質などの、任意の蛋白質の立体構造に影響を与える化合物のスクリーニング方法を含むと理解できる。本方法には、まず、第1の非疾病型立体構造で存在する蛋白質を持つ試料を提供することが含まれる。その後、試料を、治療の有用性についてスクリーニングする試験化合物に接触させる。試験化合物の添加後、第1の非疾病型立体構造の蛋白質を第2の疾病型立体構造に変換させる化合物または化合物群に、試料を接触させる。十分な時間を置いた後、本発明を用いて試料を解析する。本発明の解析法によって、蛋白質の非疾病型立体構造から疾病型立体構造への変換に、試験化合物がどのように影響したかを正確に決定できる。本開示を読む当業者には、立体構造の変化に影響を与える化合物の添加と比較して、試験化合物は種々の時点で添加できることが明らかであると思われる。したがって、本方法は、試験化合物が、非疾病型立体構造から疾病型立体構造へのさらなる変化を安定化させる能力を決定したり、および/または試験化合物が非疾病型立体構造から疾病型立体構造への変換の開始を予防する能力を決定するために使用できる。米国特許出願第08/556,823号は、非疾病型立体構造から疾病型立体構造への変換手段を開示しているが、同じ結果を得るための他の手段は、本出願を読み、それに関連する技術水準を検討することによって、当業者に明らかになると思われる。したがって、本発明は、蛋白質を第1の非疾病型立体構造から第2の疾病型立体構造へ変換するために使用され、本明細書記載の解析法を利用する、任意の物理的、化学的、または生物学的手法を含むことを意図している。さらに、本発明は本発明のスクリーニング法を実行した結果得られる治療用化合物、すなわち、本発明の手法で製造される化合物も含むことを意図している。抗体抗体の製造方法は、当業者に一般的に公知である。多くの場合、疾病型は非疾病型よりも詰まった立体構造を持ち、露出しているエピトープが少ないため、蛋白質の非疾病型または処理済みの疾病型にのみ結合する抗体は、容易に作製できる。例えば、処理済みのPrP^Sc蛋白質およびPrP^C蛋白質を検出する抗体は、組換えPrPのαヘリックス構造、動物の脳由来の末変性PrP^C、αヘリックスまたはランダムコイル構造の合成ペプチド、または変性PrP^ScもしくはPrP 27-30でウサギまたはマウスを免疫することにより作製できる。PrP^Scに対する親和性の少なくとも4倍の親和性をPrP^C（または同じ種のPrP^Scの変性した構造）に対して持つ抗体のみを、選択する。抗体の作製、精製、標識および検出方法は、多様である可能性がある。 IgGまたはFab'は、プロテインＡカラムを使った親和性HPLCおよびサイズ排除H PLCによって、異なる供給源から精製できる。精製抗体は、ユーロピウムで標識し、時間分解蛍光法によって検出できる。異なる立体構造のPrP蛋白質に結合する抗体は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定できる。しかし、固体支持体上のPrP結合IgGのインサイチューでの検出または溶液中での検出のシステムは、多様でありえる。さらに、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン−ビオチン増幅、または発色もしくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間接の免疫学的方法を使用することができる。本発明に使用できる抗体は、1986年10月8日に寄託された細胞株ATCC HB9222によって生産されるモノクローナル抗体263K 3F4を開示する、1989年2月21日発行の米国特許第4,806,627号に開示されており、これは参照として本明細書に組み入れられる。抗体を産生する細胞株は、20852メリーランド州ロックビル、パークローンドライブ12301、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(America n Type Culture Collection)から入手できる。一般に、スクレイピーの感染では免疫応答が起きず、宿主生物は同じ種由来の PrP^Scに免疫寛容になる。PrP^CまたはPrP^Scのいずれかに結合する抗体は、1997年 3月20日発行の国際公開公報第97/10505号に開示されている。PrP^Cには結合するがPrP^Scには結合しない任意の抗体が使用でき、当業者は、既知の手順を用いてそのような抗体を作製できる。例えば米国特許第5,223,409号のファージディスプレイ抗体ライブラリーの製造方法を参照。抗PrPポリクローナル抗体は、大量の蟻酸またはSDS変性SHaPrP27-30による免疫後に、ウサギで作製されている[Ben dheim，Barryら(1984)Nature 310:418-421;Bode，Pocchiariら(1985)J Gen Viro l 66:2471-2478;Safar，Ceroniら(1990)Neurology 40:513-517]。同様に、PrP 2 7-30に対する少数の抗PrPモノクローナル抗体もマウスで作製されている[Barry およびPrusiner（1986）J Infect Dis 154:518-521;Kascsak，Rubensteinら(198 7)J Virol 61:3688-3693]。これらの抗体は、蟻酸またはSDS変性PrP27-30に対して作製されたもので、SHaおよびヒトの両方の未変性PrP^Cおよび処理済みまたは変性PrP^Scを同様に認識するが、MoPrPには結合しない。予想どおり、これらの抗体のエピトープは、SHaとMoPrPとの間にアミノ酸の違いが含まれている領域の配列にマッピングされた[Rogers，Yehielyら(1993)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 9 0:3182-3186]。上記に引用した論文に記載される種類の多くの抗体が、PrP^Cおよび処理済みまたは変性PrP^Scに結合するが、未変性PrP^Scに結合しない理由は完全には明らかでない。特定の理論にこだわるわけではないが、蛋白質がPrP^C型の立体構造を取るときに露出しているエピトープが、比較的不溶性で小さく畳み込まれているPrP^S ^c 型の立体構造では、露出していないか、一部隠されているために、そのようなことが起こるということが示唆される。本発明の目的では、結合が起こらないというのは、平衡または親和性定数K_aが 10⁶l/モル以下であることを意味する。また、K_aが10⁷l/モル以上、好ましくは10⁸ l/モル以上であれば、結合が存在すると認識される。10⁷l/モル以上の結合親和性は、（1）単一のモノクローナル抗体（すなわち1種類の抗体が多数）、または（2）異なるモノクローナル抗体が多数（例、5種類の異なるモノクローナル抗体がそれぞれ多数）、または（3）多数のポリクローナル抗体による。(1)〜(3)の組み合わせを使用することも可能である。選択された好ましい抗体は、未変性のPrP^S ^c 構造への結合と比較すると、処理済みまたは変性PrP^Sc蛋白質に、少なくとも4 倍強く結合する。結合親和性の4倍の差は、上記の(1)〜(3)の数種類の異なる抗体を使用して達成することもでき、混合物中の抗体の中には、4倍未満の差しかないものもありえる。本発明の様々な種類の解析法に、1つまたは複数の異なる抗体を使用することができる。当業者は、抗体は既知の標識で標識し、現在利用できるロボット、サンドイッチ解析、電子検出器、フローサイトメトリー等に使用できることが認識できると思われる。定量計算上述の方法を用いて、処理していない試料から得られるシグナルの量と、処理された試料で得られるシグナルの量との差を計算できる。この差は、（非疾病型立体構造に対する処理の影響を調整した後、）元の試料中に存在する疾病型立体構造の蛋白質の量（濃度）を表わす。差を計算した後、以下の公式を用いて、元の試料の単位体積当たりに存在する疾病型立体構造の蛋白質の量を計算できる。 a）F_n＝F_n _α+F_n _β→F_n _α＝F_n−F_n _β,F_n _β〜バックグラウンド b）F_d＝F_d _α+F_d _β ΔF_n _→d＝ΔF_αn→d＋ΔF_βn→d ΔＦ_βn→d＝F_d−F_n−ΔF_αn→d [PrP_β]または[DRC]〜ΔF_βn→d＝F_d−(F_n*f_αn→d) 上記の各変数の定義は以下のとおりである。 F 蛍光シグナル（任意の検出可能シグナルが使用できることに留意されたい) F_n 未変性立体構造の蛍光シグナル F_n _αおよびF_n _β それぞれ未変性αヘリックスおよびβシート構造の蛍光シグナルＦ_d 処理済みまたは変性状態のPrPの蛍光シグナル F_d _αおよびF_d _β PrPの変性したαヘリックスおよびβシート状のシグナル ΔF_n _→d 未変性から変性状態への転換における蛍光シグナルの増加分 ΔＦ_αn→d 未変性から変性状態への転換におけるαヘリックス構造の蛍光シグナルの増加分 ΔF_βn→d 未変性から変性状態への転換におけるβシート構造のシグナルの増加分 f_αn→d αヘリックスのPrPの未変性から変性状態への転換の相関係数 [PrP_β] βシート構造のプリオン蛋白質の濃度 [DRC] 疾病関連立体構造の任意の蛋白質の濃度上記の公式は、βシート構造を取るプリオン蛋白質の濃度を特異的に計算するために使用される。しかし、同じ公式を用いて、任意の蛋白質の濃度、すなわち、[βA4_β]のような任意の圧縮型疾病型立体構造の蛋白質の濃度を計算できる。より一般的には、[DRC]は蛋白質の疾病関連立体構造の濃度を表す。具体的な例を提供するために、上記の定義は、特に、αヘリックス構造を含む少なくとも1つの緩い非疾病型立体構造（PrP^C）、およびβシート構造を含む少なくとも1つの圧縮型疾病関連立体構造（PrP^Sc）を含む、PrP蛋白質に関して提供されている。これらの公式は、試料中に存在する蛋白質の疾病関連立体構造の濃度を計算するために用いられる。上記に提供される具体的な公式および定義に従って、この公式は、βシート構造を含むプリオン蛋白質濃度の計算に使用される（実施例11参照）。上記の公式の計算に使用されるシグナルは、蛍光シグナルである。しかし、検出可能な任意のシグナルを使用できる。シグナルの合計はF_nによって表わされており、これは疾病関連および非疾病関連立体構造からのシグナルの組み合わせである。これは、上述の解析法では処理されない第1の部分から計算されるシグナルである。変数F_dは、試料の第2の部分を処理して得られるシグナルである。このシグナルは、処理された非疾病型立体構造の蛋白質および処理された疾病型立体構造の蛋白質から受け取るシグナルの組み合わせである。疾病関連立体構造の蛋白質が含まれていない試料を処理すると、シグナルに差が出ることが認識されている。正確な測定をするためには、この差を考慮する必要がある。未変性の試料と処理をした試料とのシグナルの差は、当然のことながら、疾病関連立体構造と非疾病型立体構造を処理して得られるシグナルの差の組み合わせである。疾病型立体構造を処理して得られるシグナルの増加、すなわち、未処理の疾病型立体構造のシグナルと、処理された疾病型立体構造からのシグナルとの差は、試料全体を処理して得られたシグナルを、未処理の非疾病型立体構造と処理後の非疾病型立体構造から得られるシグナルの増加分を計算して得られるシグナルから、差し引くことによって計算される。これらの等式を使うと、元の試料中に存在する疾病型立体構造の蛋白質濃度を提供する、最終等式を作製することができる（実施例11参照）。蛋白質株の識別（分類）ヒトを含む種々の動物は、異なる株の病原性蛋白質に感染する可能性がある。プリオン感染の異なる株に伴う異なる変異の一部を列挙するために、「変異の表」を本明細書中に提供する。個体がどの株に感染したかということは、そのような情報によって（1）より正確な診断ができる、（2）適切な治療が行える、または（3）その株と感染源と考えられる株とを比較することによって、感染源が決定できるという点で有用であるので、重要な場合がある。感染を引き起こす病原性蛋白質の特定の株は、本発明を用いて計算できる2種類の情報から、決定できる。実施例11は、本発明を用いてどのようにして絶対量、すなわち、特定のサイズの試料中のプリオン濃度を決定できるかを示す。実施例8は、変性：未変性PrP蛋白質への抗体結合の割合である、「プリオン指数」を計算する方法を示す。他の蛋白質の「蛋白質指数」は、任意の結合パートナーが蛋白質の変性：未変性型に結合する割合である。一般的には、「プリオン指数」は、単に、処理が蛋白質に与える効果を、数字で特徴づけるものである。特定の株を決定するためには、まず、各株の基準を計算する必要がある。これは、既知の量の既知の株に対する、特定の処理の影響（プリオン指数）を決定することで行う。これは、図25に示すように、プロットすることができる。いったん基準が計算されたら、他の試料の株も容易に決定できる。基準は、好ましくは、各株ごとにいくつかの異なる濃度を用いて計算される。単純な試料の株を決定するためには、試料中の蛋白質の濃度と、その濃度での処理の影響を計算する。その結果を基準（図25のような）と比較して、株を決定する。実施例18は、図25 と組合わせて、その具体的な実施例となっている。同一の濃度の同一の株は、所定の処理によって、同様な影響を受けると考えられる。しかし、同一の濃度の異なる株は、同一の処理によって異なる影響を受けるため、株を決定することが可能になる。不溶性蛋白質を伴う疾病本明細書に提供される開示の多くおよび具体的実施例は、試料中のPrP^Scの存在を決定することに関連する、解析法の使用法に関する。しかし、上記に示すように、本発明の解析法は、2つの異なる立体構造をとり、そのうちの1つが疾病に関連する任意の蛋白質の存在を決定するために適用できる。以下は、2つまたはそれ以上の異なる立体構造を取る不溶性蛋白質に関連する疾病の非限定的リストである。疾病不溶性蛋白質アルツハイマー病 APP、Aβペプチド、 α1アンチキモトリプシン、 tan、非Aβ成分プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、スクレイピーおよびウシ海綿状脳症 PrP^Sc ALS SODおよびニューロフィラメントピック病ピック小体パーキンソン病リューイ小体 I型糖尿病アミリン多発性骨髄腫-形質細胞異形成 IgGL鎖家族性アミロイド多発神経障害トランスチレチン甲状腺の髄様癌プロカルシトニン慢性腎不全 β₂ミクログロブリン鬱血性心不全心房性ナトリウム利尿因子老年性心臓および全身性アミロイドーシストランスチレチン慢性炎症血清アミロイドＡアテローム性動脈硬化 ApoA1 家族性アミロイドーシスゲルゾリン上記の不溶性蛋白質はそれぞれ、すべて本発明の範囲内に含まれる異なる株となるいくつかの異型または変異体を含んでいることに注意する必要がある。プリオン病に関連するPrP遺伝子における既知の病原性変異および多型性を以下に記載するが、ヒト、ヒツジ、およびウシの配列は、1996年10月15日発行の米国特許第 5,565,186号に記載されている。また、かかる蛋白質は、同一のアミノ酸配列で2つの異なる3次元構造を持つことにも注意する必要がある。1つの立体構造は疾病の特徴と関連し、一般に不溶性であるが、他の立体構造は疾病の特性と関連しておらず、可溶性である。本発明の方法は、記載された疾病、蛋白質、株に限定されない。 βA4のβシート型の検出本発明の1つの局面は、例えば脳または体液のような試料中のβA4蛋白質のβ シート型を定量的に測定することによって、蛋白質（βA4アミロイドーシス）の圧縮型の存在に基づいて、アルツハイマー病を診断するための2段階プロセスを含む。試料は、2つのアリコートに分けられる。第1のアリコートは、非変性条件下での化学的活性化段階により、未変性立体構造で固体プラスチック（長鎖ポリマー物質）支持体に架橋する。試料の第2の部分は、まず変性させてから、プラスチック支持体に架橋する。試料の両方の部分を、ヒトまたは特定の動物種の可溶性βA4または変性βA4を選択的に認識する標識抗体と、インサイチューで反応させる。変性または末変性立体構造のβA4蛋白質に結合した抗体量は、標識二次抗体のシグナルによって記録される。未変性αヘリックス立体構造のβA4蛋白質で得られるシグナルにおいて期待される変化と比較して、変性試料で得られるシグナルが上回る分は、元の試料中のβシート構造のβA4の量の尺度である。βA4 含有量の計算のために開発された公式は、PrP^Sc含量の計算と関連して上記に提供されている。 βA4アミロイドーシス（アルツハイマー病）の診断は、3つの手順で確立される：(1)変性試料単独の測定、および正常な対照から得られたバックグラウンドの可溶性βA4レベルを上回る、試験試料中の総βA4量（濃度）の増加の検出；(2 )所定の抗体に関する変性シグナルと未変性シグナルとの割合の計算（蛋白質指数）−例えば、モノクローナル抗体6F3Dおよびユーロピウム標識二次抗体で2を越える値；(3)元の試料中の感染性βシート構造のβA4の量の尺度としての、βA 4のαヘリックス構造のシグナルで期待される変化を上回る、変性試料のシグナルの変化の評価。βA4含有量の計算のために開発した公式は、上記に提供されている。試料中のPrP^Sc株を決定するために、上記に説明した方法と同じ方法を使用して、βA4の特定の株も決定できる。本発明は、医薬品、生検または剖検組織、脳、脊髄、末梢神経、筋肉、脳脊髄液、血液および血液成分、リンパ節、およびβA4蛋白質を発現するか発現する可能性のある動物またはヒト由来の培養物中の、βA4蛋白質の病原性の型の存在を検出するための、直接の診断方法を提供する。本発明によって、βA4蛋白質、または合成もしくは組換え由来のその断片の立体構造のαヘリックスからβシートへの移行を追跡し、βA4蛋白質の正常な可溶性立体構造を安定化し、それによって病原性で不溶性のβシート構造のβA4蛋白質への転換を予防する能力を持つ化合物をスクリーニングする方法を提供することが可能になる。試料の変性の典型的な方法には：(1)静水圧または温度のような物理的手段、( 2)酸性もしくはアルカリ性pH、カオトロピック塩、または変性性界面活性剤のような化学的手段、および(3)上記の組合わせが含まれる。βA4蛋白質のプラスチック支持体への化学的または親和性によるカップリングの方法は、入手可能な文献に記述されており、多様である可能性がある。診断解析法に使用される抗体は、ポリクローナルでも、モノクローナルでも、または組換えFabでもよく、種特異的であり、抗原の量が同一だと仮定したときに、αヘリックスおよびβシート構造のβA4の反応性の間に好ましくは少なくとも2倍の差を示して、可溶性または変性型のβA4に選択的に結合する必要がある。試料をプラスチック支持体に接着する方法は多様である可能性があり、入手可能な文献に記述されるように、共有結合でも非共有結合でもよい。実施例に記述された解析法の感度は、高親和性の抗体、サンドイッチ形式、免疫沈降、または分画遠心法を用いることによって、上昇する可能性がある。しかし、診断解析法には、同じ種の未変性のβシート型のβA4と比較して、変性型に対して少なくとも2倍の親和性を持つ抗体のみを使用する。抗体の作製、精製、標識および検出の方法は変更が可能である。βA4蛋白質の異なる立体構造に対する抗体の結合は、時間分解、解離増強蛍光法によって測定された。しかし、固体支持体上のβA4 結合IgGのインサイチューまたは溶液中の検出システムは変更可能であり、直接の放射性標識、蛍光、発光、アビジン-ビオチン増幅、または発色もしくは発光基質を使った酵素結合解析などの、直接または間接の免疫学的方法を使用することができる。実施例以下の実施例は、本発明の解析法を製造して使用する方法を当業者に完全に開示し説明するためのものであり、本発明者らが本発明と見なすものの範囲を限定するためのものではなく、以下の実験が実施されたすべてまたは唯一の実験であると示すまたは暗示するものでもない。使用する数字（例えば量、温度等）に関して正確性を保証する努力を行ったが、実験誤差および偏差を考慮する必要がある。別途記載されないかぎり、割合は重量割合、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏、および気圧は大気圧またはその近傍圧である。実施例1 組換えプリオン蛋白質の発現診断解析法の開発および較正のために、配列90〜231の組換えシリアンハムスタープリオン蛋白質を、記述されたようにしてαヘリックスまたはβシート立体構造に再生した[Mehlhorn，Grothら(1996)Biochemistry 35:5528-5537]。PCR(Pe rkin-Elmer)を使用して、大腸菌の分泌ベクターに連結するために、シリアンハムスタープリオン蛋白質の異なる部分に相当するDNAを増幅した。STIIシグナルペプチドのＣ末端コード配列内にMlu I制限部位を持ち、適切なPrP配列の最初の部分のアミノ酸を持つ、数種類の5'オリゴヌクレオチドプライマーを合成した[L ee，Moseleyら(1983)Infect Immun 42:264-268;Picken，Mazaitisら(1983)Infec t Immun 42:269-275]。各5'オリゴヌクレオチドと共に、PrPの3'末端、停止コドン、およびBam HI制限部位と一致する一つの3'オリゴヌクレオチドプライマーを使用した。PCR増幅産物を精製し、あらかじめMluI/Bam HIで消化しておいたベクターに連結し、DH5aを形質転換させた。PrPインサートを含むクローンの配列を決定し、プロテアーゼ欠失発現株27C7(ATCC# 55244)を形質転換させた。大規模の発現は、他の蛋白質について異なる培地を使って以前に記述されたようにして、実行した[Carter，Kelleyら（1992)Biotechnology 10:163-167]；アンピシリンを添加したLB培地中で一晩培養した500mLの培養物を、通気付きの10L の発酵槽（Braun、モデルE10）中の7Lの発酵培地中に接種した。高速撹拌で37℃ で細胞を培養し、リン酸を欠乏させることによって発現を誘導した。4時間後、5 0％グルコース溶液を1ml/minの速度で添加した；グルコースレベルはグルコース計量棒（Diastix，Miles Inc.）を用いてモニターした。運転中を通して、10% H₂ SO₄または24% NH₄OHを自動的に添加して、pH7.4を維持した。最終容量は10Lで、 36時間後に≧100のOD₆₀₀を達成した。10,000xgで30分間の遠心をして大腸菌を回収し、得られたペーストを-20℃で保存した。精製のために、100gの大腸菌ペーストを1Lの25mM Tris-HCl、pH8.0、5mM EDTA （緩衝液Ａ）に再懸濁した。これを10,000xgで20分間遠心し、可溶性ペリプラズム蛋白質を含む上清を廃棄した。沈殿を1Lの緩衝液Ａに再懸濁し、細胞粉砕装置（Microfluidics International、モデルMFI110）に2度通し、30,000xgで1時間遠心した。その後、上清を廃棄し、沈殿を緩衝液Ａで1回洗い、30,000xgでもう1 度1時間遠心した。この段階で、沈殿をさらに分離する前に-20℃で保存することもできた。その後、８M Gdn・HCl/25mM Tris-HCl、pH8.0/100mM DTT（緩衝液Ｂ）で可溶化し、14,000xgで20分間遠心して、残存する不溶性物質を除去した。総蛋白質量〜200mgを含む上清6mLのアリコートを、26mm x60cm HiLoad Superdex 200 カラム（Pharmacia）を用いたサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって、6M Gdn-HCl/12.5mM Tris-HCl、pH8.0/5mM DTT/1mM EDTA（緩衝液Ｃ）で2mL/minの流量で溶出して分離した。SDS-PAGEによって確認された、組換えプリオン蛋白質が濃縮された画分を集め、25mm x 25cm C-4カラム(Vydac)；緩衝液1：H₂O/0.1% TFA、緩衝液2：アセトニトリル/0.09% TFA、流量5mL/minという条件を用いて、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)でさらに精製した。組換え蛋白質rPr Pは、40%アセトニトリルを含む画分に見つかった。SEC溶出物をRP-HPLCにかける前に数日間4℃で保存すると、組換え蛋白質は、これよりも先に、35％アセトニトリルしか含まない画分で溶出された。還元された蛋白質および再生した酸化型の試料は、分子量のカットオフ10,000 DaでCentriconカラム(Amicon)を用いて濃縮した。還元型蛋白質用の緩衝液は、1 0mM MES，pH6.5で、酸化型は上述の再生緩衝液中で濃縮された。再生された酸化型および還元型のSHaPrP90-231蛋白質の立体構造は、円偏光二色性(CD)分光法によって、決定された（図1）。実施例2 正常ハムスター脳からのハムスターPrP^Cおよびスクレイピー感染ハムスター脳からのPrP^Scの精製実施例1で製造された両方の蛋白質は、プリオン解析用の基準として、および診断法の感度と線形性の確立に、使用された。精製されたシリアンハムスター脳Pr P^Cは、プリオン蛋白質の検出の較正用に用いて、αヘリックス、βシートおよび変性立体構造の組換えSHaPrP90-231の結果と相関させた。PrP^C蛋白質は、いくらかの小さな変更を加えたものの記述されたようにして精製された[Pan，Stahlら( 1992)Protein Sci 1:1343-1352;Pan，Baldwinら(1993)Proc．Natl．Acad．Sci． USA 90:10962-10966]。蛋白質の含有量は、アミノ酸分析で決定した。SDS-PAGE 後に銀染色およびウェスタンを行って示されたPrP^C蛋白質の純度は、≧95％だった。基準のシリアンハムスターPrP^Scは、わずかな変更を加えながら記述されたようにして、スクレイピー株Sc237感染ハムスター脳の標準的なプールから精製された[Turk，Teplowら(1988)Eur J Biochem 176:21-30]。脳内接種後のシリアンハムスターの潜伏期間解析によって決定された、この基準の感染性は、10^7.3ID₅ ₀ /mlで、比感染性は10^8.2ID₅₀/mg PrP^Sc蛋白質だった。しかし、比感染性は、ロットごとに±１0^0.5ID₅₀/mgの差がありえる。蛋白質含有量は、ウシ血清アルブミンを基準として使用したBCA解析によって決定した。この調整物は、銀染色とウェスタンブロット後に、SDS-PAGEで1本の主要なバンドを持ち、均一であると見なされた。実施例3 本解析法に使用する抗体の選択、標識、および検出方法抗体の生産および解析のプロトコールおよび方法は、一般的に別に記述されている[HarlowおよびLane(1988)前記：726]。本実施例および以下の実施例に記述されるデータは、シリアンハムスターPrPの配列90〜145(N12)および222〜231（P 3）[Barry，Vincentら(1988)J Immunol 140:1188-1193]に対応する合成ペプチドに対する、免疫親和性精製ポリクローナル抗体N12およびP3[Safar，Ceroniら(19 90)Neurology 40:513-517;Rogers，Servanら(1991)J Immunol 147:3568-3574]、および変性シリアンハムスターPrP27〜30に対するJS2[Safar，Ceroniら(1990)Ne urology 40:513-517]を用いて生成された。本解析法で使用されるモノクローナル抗体3F4の作製と解析は、別のところ[Kascsak，Rubensteinら(1987)J Virol 6 1:3688-3693]、および米国特許第4,806,627号にも記載されており、これらはすべて、本発明で使用できる抗体と、それらおよび関連する抗体を作製する方法を開示および記述するために、参照として本明細書に組み入れられる。プリオン蛋白質の変性型を認識する組換えFabは、最も最近作製された[Williamson， Peretzら(1996)Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:7279-7282]。 αヘリックス、βシート、およびランダムコイルの立体構造を取るSHaPrP90-2 31を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに共有結合で接着し、連続希釈した一次抗体とインキュベートした。各立体構造のSHaPrP90-231と反応するIgGの量は、通常のプロトコールにしたがって、Eu標識3F4IgGを用いて直接に決定するか、またはユーロピウム標識の抗ウサギまたは抗マウス抗体を用いて間接的に決定し、シグナルの総量は時間分解、解離増強蛍光法によって測定した。解析法の開発には、βシート構造のSHaPrP90-231に対する変性構造のシグナルの割合が、4またはそれ以上の抗体を選択した。実施例4 競合解析および直接解析の形式 αヘリックスまたはβシート構造に再生された精製組換えSHaPrP90-231を、Pr P^0/0マウスから得たプリオン蛋白質を含まない5％(w/v)脳ホモジネートで希釈した。脳ホモジネートは、プロテアーゼ阻害剤カクテル（1mM PMSF，2μg/mlアプロチニン、および2μg/mlロイペプチン）を含むTBS，pH7.4中で、プラスチックのディスポーザブルプローブを備えたPowerGenホモジナイザーで、30秒のバーストを3回行い、デスクトップ遠心機により500G、5℃で5分間遠心して作製した。得られた上清を、最終濃度4％(w/v)サルコシルを含むTBSで1:1に希釈し、PowerG enホモジナイザーで、30秒のバーストをさらに3回行い、ホモジナイズした。次に、αヘリックスまたはβシート構造を取る組換えSHaPrP90-231を様々に希釈したものをホモジネートに加えた。典型的な競合解析では、様々な立体構造を取る分析物のPrPをユーロピウム標識3F4 IgGとプレインキュベートした後、これをSDS変性した状態で、組換えShaP rP90-231でコートしたポリスチレンプレートへ移した。αヘリックスおよび変性状態（図2）の分析物SHaPrP90-231の結果は、プリオン蛋白質の立体構造が異なると、ユーロピウム標識3F4 IgGの利用できる結合部位および親和性の両方に、著しい差があることを示している。直接解析では、希釈曲線の各試料を2つの部分に分割した：(1)未処理で未変性と呼ぶ状態：(2)最終濃度4M Gdn HClと混合し、100℃で5分間加熱し、変性と呼ぶ状態。この2つの試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに添加した。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTBS，pH7.8でブロックした。次の段階では、0.05%（v/v）Tween 20（登録商標）を含むTBS，pH7.8 でプレートを3回洗い、上記のユーロピウム標識抗体とインキュベートした。ユーロピウム標識の販売元（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）が供給する増強用液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DEL FIA1234フルオロメーター（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。実施例5 異なる立体構造を持つSHaPrP90-231のディファレンシャル試験 Eu標識3F4 IgGを用いた直接解析法で得られたパラメーターを、濃度に対する関数としてプロットした。αヘリックス構造のSHaPrP90-231で得られた結果（図 3）は、αヘリックスおよび変性した蛋白質のシグナル間に、比較的小さな差があることを示している。5％脳ホモジネートの存在下における変性PrPの感度の限界は≦1ng/mlで、線形の範囲は3桁以上に渡っている。SHaPrP90-231のβシート型を用いた実験では（図4）、Eu標識3F4 IgGは、この蛋白質の変性型に強く結合する。これとは対照的に、この蛋白質の未変性βシート型との反応性は、蛋白質濃度を高くしても、バックグラウンドを僅かに上回るのみだった。プリオン蛋白質の未変性状態に対する変性状態の蛍光の比率としてこの結果を表現すると（図 3および4）、αヘリックス構造は1〜1.8で、βシート構造の組換えSHaPrP90-231 では5〜50である。この効果をさらに利用して、未知の構造のPrP試料の分析をしたが、ここでは、PrPの変性後のEu標識3F4 IgGのシグナルのわずかな上昇は、αヘリックス構造の特徴である。これとは対照的に、αヘリックス構造で期待される変化を上回るシグナルの大きな増加は、βシート構造のPrP90-231の診断となる（図3および4 ）。結果は、2つの形式で表現されている：(1)比率（図6）として。ここでは、組換えSHaPrP90-231の指数が≦1.8であれば、この蛋白質は元々すべてαヘリックス構造であり、指数が＞1.8であればβシート構造が存在していたことを示す；(2)本明細書に示され、実施例11に例示されている公式として。ここでは、αヘリックス構造で期待される以上のシグナルの過剰な増加は、βシート構造のSHaPrP90-2 31の量に比例する。実施例6 組換えSHaPrP90-231およびPrP^Cの定量解析 αヘリックスおよびβシート構造の変性ShaPrP90-231のインプット/アウトプット較正は、3桁に渡り線形で、解析に高い信頼性を与える（図5）。また、PrP⁰ ^/0 マウスホモジネートで連続希釈したPrP^Cも解析したが、3桁の線形範囲において高い信頼性を与えた。次に、5％PrP^0/0脳ホモジネートの存在下で、精製した感染性PrP^Scによって解析の較正を行った。PrP^Scを用いた較正により、同様な範囲で線形の応答が得られた。ディファレンシャル方法を用いた、変性脳PrP^Cシグナルと未変性脳PrP^Cシグナルとの比率は、Eu標識モノクローナル3F4 IgGで2.2（図7）、ポリクローナルN12 およびP3は1.0だった。PrP^Scの較正によって、Eu標識IgG 3F4では比率が≧20（図8）、N12およびP3では＞4が得られた。本明細書に示された公式を使うと、すべてのPrP^Cはαヘリックス構造の完全な範囲内だった。これとは対照的に、感染性のβシート構造のPrP^Scの計算値は、予想どおりプリオン蛋白質の総量に近かった。実施例7 生理的PrP^Cルベルを上回る総プリオン蛋白質の増加に基づくプリオン病の診断変性試料のシグナルの評価のみによる総PrPの正確な定量測定値では、5％の正常シリアンハムスター脳ホモジネート中のPrP^C平均値として5.0±0.2μg/ml（平均±SEM）が得られた（図9）。スクレイピー（Sc237株）感染ハムスター脳ホモジネートの、PrP^0/0マウス脳ホモジネートによる連続希釈では、測定値に広範囲の線形性が見られ、総PrP量として36.0±4μg/ml（図10）が得られた。プリオン蛋白質の蓄積のための唯一知られている条件は、感染性のPrP^Sc型の蓄積であるため、試験試料中の総PrP量の増加は、プリオンの存在を示している。このプリオン解析は：(1)正常な対照値を決定した後に、脳、組織試料、体液、もしくは医薬品で直接に使用；または(2)プリオンを含むと疑われる試験組織、体液、もしくは医薬品試料を脳内に接種した実験動物の脳における総PrPの上昇の検出によって、間接的に使用できる。実施例8 変性と未変性のPrPの間のシグナル比（「プリオン指数」）の上昇に基づくプリオン病の診断変性と未変性のシリアンハムスター脳PrP^C蛋白質の抗体親和性の比率は、Eu標識3F4 IgGでは広い濃度範囲に渡り、0.8〜2.2である。スクレイピー感染脳における比率は、線形性の範囲全体に渡り、これらの値を越える（図11）。「プリオン指数」は感染性PrP^Scおよびしたがってプリオンの存在を相対的に示すものとなる。このプリオン解析方法は：(1)正常な対照の指数を決定した後に、脳、組織試料、体液、もしくは医薬品で直接に使用；または(2)プリオンを含むと疑われる試験組織、体液、もしくは医薬品試料を脳内に接種した実験動物の脳において、上昇した変性/未変性プリオン蛋白質指数を検出することによって、間接的に使用されている。実施例9 PrP^Sc の含有量の計算によるディファレンシャル解析からのプリオン病の診断直接解析および本明細書に提供される公式を使用しても、正常な脳ホモジネート中にはβシート型のPrP^Scは検出されない。逆に、スクレイピー感染ハムスター脳の総PrPの大部分は、PrP^Scの蓄積によるものであった（図９および10）。プリオン力価と公式から計算されるPrP^Scとの相関は、広範囲に渡って線形性で、感度の限度は〜10³ID₅₀/mlである（図11）。この公式により、プリオン力価に定量的に相関を持つ、異常な立体構造のPrP蛋白質の存在が定量的に示される。このプリオン解析方法は：(1)脳、組織試料、体液、もしくは医薬品で直接に使用；または(2)プリオンを含むと疑われる試験組織、体液、もしくは医薬品試料を脳内に接種した実験動物の脳におけるPrP^Sc含有量を計算することによって、間接的に使用される。PrP^Scとプリオンの力価との較正曲線が確立したら、PrP^Sc含量から直接的に力価を推定することができる。実施例10 新たなプリオン生成および疾病の治療法として可能性のあるものをスクリーニングするための、インビトロにおけるPrP蛋白質の αヘリックスからβシートへの転換の測定 αヘリックス型の組換えSHaPrP90-231、またはSHaPrP29-231、または対応するプリオン蛋白質の組換えもしくは合成ペプチドの100μg/ml溶液のアリコートを、20mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.5中で、10^-3〜10^-6M濃度のグリセロール、シクロデキストリン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンゴーレッド、コレステロールエステル、ジミリストイルホスファチジルコリンと、37℃で24時間インキュベートする。その後、サンプルを2つの部分に分割する：(1)未処理で、未変性と呼ぶ状態：(2)最終濃度4M Gdn HClと混合し、100℃で5分間加熱し、変性と呼ぶ状態。この2つの試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに添加する。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTBS，pH7.8でブロックした。次の段階では、0.05%（v/v）Tween 20（登録商標）を含むTBS，pH7.8でプレートを3回洗い、ユーロピウム標識3F4 IGGとインキュベートした。ユーロピウム標識の販売元（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）が供給する増強用溶液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234 フルオロメーター（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。 PrPのαヘリックスからβシート構造への転換の度合いは、「プリオン指数」から、または本明細書に提供される公式から計算される。プリオン蛋白質の未変性様構造を見かけ上安定化することによって、転換を阻害する化合物は、インビボで治療効果を持つ可能性がある場合がある。実施例11 以下の実施例では、PrP^0/0マウス脳ホモジネートで4倍に希釈した、スクレイピー感染シリアンハムスター脳ホモジネートを用いた解析方法を示す。 a）各プレートは、変性SHaPrP90-231の5つの希釈点からなる内部基準を用いて較正される。総PrPの時間分解蛍光(TRF)は、Eu標識3F4 IgGによって発色させ、時間分解蛍光値をPrP濃度の関数としてプロットする（図4）。データは、最小二乗法を用いて線形または多項式内に適合させ、変性PrPの計算に最良の関数を選択する。 PrP[μg/ml]=-0.22935+0.00026567*[TRF]＋0.0000000012255*[TRF]²（1) b）プレートの残りでは、4倍に希釈してプラスチック支持体に架橋した未変性および変性のスクレイピー感染シリアンハムスター脳ホモジネートを、Eu標識3F 4 IgGとインキュベートした。PrP総量は、変性試料の蛍光シグナルから、上記の公式にしたがって計算する。c）変性試料と未変性試料との間の蛍光シグナルの比率を計算する：正常ハムスター脳ホモジネートから決定されるPrP^Cの正常値は2.2である；2.2を越える値は、異常と見なされ、PrP^Scの存在を示す。 d）未変性から変性状態への転移において、αヘリックスPrPに期待される蛍光シグナルを越える分は、PrP^Scの量の尺度であり、提供される公式にしたがって計算される： ΔＦ_βn→d＝F_d−(F_n*f_αn→d) （2）ここで、fは未変性から変性状態のPrP^Cへの転換における蛍光シグナルの係数の最大値であり；F_dは変性試料の蛍光であり；F_nは末変性試料の蛍光である。この後、ΔF_βn→dおよび等式(1)から、PrP^Scの量を計算する： βシート型プリオン蛋白質に正の値が計算されれば、PrP^Scの存在を示す。実施例12 可溶性（αヘリックス）および不溶性（βシート）型のβA4蛋白質の基準 βA4(1-40)およびβA4(1-42)の可溶性型は、Bachem（カリフォルニア州トランス市）から入手した。新しく凍結乾燥したペプチドの一部を、20％(v/v)HFIP（ヘキサフルオロイソプロパノール；1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール）または1％(w/v)SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）を含むPBS，pH7.4中に、最終濃度が50μMになるように溶解した；この蛋白質は「可溶性」と呼ばれ、使用時まで-80℃で保存された。ペプチドの第2の部分は、最終濃度が≧350μMとなるようにPBS，pH7.4中に再懸濁し、37℃で72時間インキュベートした。蛋白質のこの部分は「不溶性」と呼ばれ、使用時まで-80℃で保存された。両方の蛋白質は、解析法の開発の基準として、ならびに感度および線形性範囲を確立するために使用された。CD（円偏光二色性）分光法（図12）では、可溶性蛋白質がαヘリックス構造（図12の実線参照）を持つことが示された。これとは対照に、37℃で72時間処理されたβA4蛋白質は、完全にβシート型に転換していた（図12の破線参照）。解析に使用する抗体の選択、標識および検出方法抗体の生産および解析のプロトコールおよび方法は、一般的に他で記述されている[HarlowおよびLane(1988)前記：726]。本実施例および以下の実施例に記述されるデータは、ヒトβA4蛋白質の配列に相当する合成ペプチドに対して作製されたモノクローナル抗体6F3D（Research Diagnostics Inc.，ニュージャージー州フランダース）を用いて生成された。しかし、βA4蛋白質の合成アナログに対するポリクローナル抗体も使用できる。βA4蛋白質の変性型を認識する組換えFab も使用できる。 αヘリックス、βシート、およびランダムコイルの立体構造を取るβA4を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに共有結合で接着し、連続希釈した一次抗体と共にインキュベートした。各立体構造のβA4と反応するIgG の量は、通常のプロトコールにしたがって、ユーロピウム標識の抗ウサギまたは抗マウス抗体を用いて決定し、シグナルの総量は時間分解、解離増強蛍光法によって測定した。解析の開発には、βA4のβシート構造に対する変性構造のシグナルの割合が2またはそれ以上の抗体を選択した。直接解析および競合解析の形式直接解析では、αヘリックスおよびβシート型のβA4蛋白質の希釈曲線の各試料を2つのアリコートに分割した：(1)未処理（未変性と称する）；および(2)最終濃度4M Gdn・HCl/1％サルコシルと混合し、10℃で5分間加熱（「変性」と称する）。両方の試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、0.2％グルタルアルデヒドで2時間活性化したポリスチレンプレートに添加した。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTBS，pH7.8でブロックした。試料を0.05%（v/v）Tween 20（登録商標）を含むTBS，pH7.8で3 回洗い、βA4蛋白質に対する一次抗体（6F3D，Research Diagnostics Inc.，ニュージャージー州フランダース）とインキュベートした。試料を洗浄し、マウス IgGに対するユーロピウム標識の二次抗体（Wallac Inc.，フィンランド、ツウゥルク市）で発色させた。増強用溶液中（Wallac Inc.，フィンランド、ツウルク市）でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234 フルオロメーター（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。分析物の結果から、βA4蛋白質の立体構造が異なると、抗βA4 IgGの利用できる結合部位および親和性の両方に、著しい差があることが示される。本方法は、異なる立体構造を取る分析物βA4を抗βA4 IgGとプレインキュベートし、その後、Gdn・HCl変性状態の合成βA4蛋白質でコートされたポリスチレンプレートに移す、競合解析を用いて実施できる。 βA4の様々な立体構造のディファレンシャル試験 6F3D抗βA4 IgGを用いた直接解析で得られたパラメーターを、濃度の関数としたプロットした。βヘリックス構造のβA4で得られた結果（図13）は、βシートおよび変性蛋白質のシグナルの間に大きな差があることを示している。変性βA4 の感度の限界は≦1μg/mlで、線形性の範囲は２桁以上である。αヘリックス構造のβA4を用いた実験では（図14）、6F3D IgGはこの蛋白質の未変性および変性型に同じ強さで結合する。これとは対照的に、この蛋白質の末変性βシート型との反応性は、蛋白質濃度が高い場合にも、バックグラウンドを僅かに上回るのみだった。βA4の変性状態と未変性状態の蛍光の比率としてこの結果を表現すると（図15）、αヘリックス構造での比率は≦1で、特定の濃度でのβシート構造の βA4での比率は≧1.5である。この効果をさらに利用して、未知の構造のβA4試料の分析をしたが、ここでは、βA4の変性後のEu標識3F4 IgGのシグナルのわずかな上昇は、αヘリックス構造の特徴である。これとは対照的に、αヘリックス構造で期待される変化を上回るシグナルの大きな増加は、βシート構造の診断となる（図15）。結果は、2つの異なる形式で表現することができる：(1)比率（図15）として（ここでは、βA 4の指数が≦1.0であれば、この蛋白質は元々すべてαヘリックス構造であり、指数が＞1.5であればβシート構造が存在していたことを示す）；(2)上記の公式にしたがって（ここでは、αヘリックス構造で期待される以上のシグナルの過剰増加は、βシート構造のβA4の量に比例する）。実施例13 生理的レベルを上回る総βA4蛋白質の増加に基づくアルツハイマー病の診断変性試料のシグナルの評価のみによる総βA4の正確な定量測定は、未変性構造のβA4の測定よりも正確であると考えられる（図13および14）。この蛋白質の正常値は、βシート型のβA4蛋白質の抗体への反応性がより低いため、この相当部分を隠す可能性がある。βA4蛋白質の蓄積のための唯一知られている条件は、アルツハイマー病患者の脳におけるβシート型βA4の蓄積であるため、試験試料中の総βA4量の増加レベルは、病原性型βA4の存在を示している。このβA4解析は、βシート型βA4を含むと疑われる組織、体液、または医薬品試料に使用できる。変性型βA4と未変性型βA4とのシグナル比（「βA4アミロイド指数」）の上昇に基づくアルツハイマー病の診断変性と未変性のヒトβA4蛋白質の抗体親和性の比率は、6F3D IgGでは広い濃度範囲に渡り、0.8〜1.0である。βシート型βA4での比率は、線形性の範囲全体に渡り、これらの値を越えている（図15）。「βA4アミロイド指数」は病原性の不溶性βシートβA4の存在を相対的に示すものとなる。このβA4解析方法は、正常な対照の指数を決定した後に、脳、組織試料、体液、または医薬品で直接に使用できる。 βA4の含有量の計算によるディファレンシャル解析からのアルツハイマー病の診断直接解析および上記に示された公式を使用して、脳、組織試料、体液、または医薬品における、βシートβA4蛋白質の病原性型の量を計算できる。実施例14 疾病の治療法として可能性のあるものをスクリーニングするのための、インビトロにおけるβA4蛋白質のαヘリックスからβシートへの転換の測定 αヘリックス型の合成βA4(1-40)、または対応するβA4蛋白質の組換えもしくは合成ペプチドの350μM溶液のアリコートを、PBS、pH7.4中で、10^-3〜10^-6M濃度のグリセロール、シクロデキストリン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンゴーレッド、コレステロールエステル、ジミリストイルホスファチジルコリンと共に37 ℃で72時間インキュベートする。その後、試料を2つのアリコートに分割する：( 1)未処理で、1%サルコシルを含み、「未変性」と称する状態；および(2)最終濃度4M Gdn HCl/1％サルコシルと混合し、100℃で5分間加熱し、「変性」と称する状態。両方の試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに添加する。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTBS，pH7.8でブロックした。次の段階では、0.05%（v/v）Tween 20（登録商標）を含むTBS，pH7.8でプレートを3回洗い、6F3D IgGとインキュベートし、その後ユーロピウム標識抗マウス抗体とインキュベートした。増強用溶液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234フルオロメーター(Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。 βA4のαヘリックス構造からβシート構造への転換の度合いは、「アミロイド指数」（図15）または上述の公式から計算される。βA4蛋白質のαヘリックス構造を安定化することによって、転換を阻害する化合物は、成熟したアミロイドの形成を予防することにより、インビボで治療効果を持つ可能性がある場合がある。実施例15 正常およびアミロイド型TTRの基準 TTRの可溶性型は、シグマケミカル社（Sigma Chemical Comp.）から入手した。この蛋白質の1部を、100mM KCl緩衝液，pH7.4中に最終濃度0.5mg/mlになるように溶解した；この蛋白質は「正常」と呼ばれ、使用時まで-80℃で保存された。蛋白質の第2の部分は、記述されたようにしてアミロイドに転換された[Lai，C olonら(1996)Biochemistry 35(20):6470-82]。簡単に述べると、蛋白質濃度が0. 2mg/mlとなるように、この蛋白質を50mM酢酸ナトリウムを含む100mM KCl緩衝液、pH4.4に再懸濁し、37℃で72時間インキュベートした。蛋白質のこの部分は「アミロイド」と呼ばれ、使用時まで-80℃で保存された。濁度測定およびコンゴーレッド結合解析によって、アミロイドに効率良く転換されたことが検証された [Lai，Colonら(1996)Biochemistry 35(20):6470-82]。両方の蛋白質は、解析の開発の基準として、感度および線形性範囲を確立するために使用された。直接解析形式抗体の生産および解析のプロトコールおよび方法は、一般的に別に記述されている。本実施例および以下の実施例に記述されているデータは、精製ヒトTTRに対して生産された市販のポリクローナル抗体（Accurate Chemical and Scientif ic Corporation、ューヨーク州ウエストベリー）を用いて得られたものである。直接解析では、正常およびアミロイド型TTRの希釈曲線から取った蛋白質の各試料は2つのアリコートに分割された：(1)未処理で、「未変性」と称するもの： (2)最終濃度4M Gdn HCl/1％サルコシルと混合し、100℃で5分間加熱し、「変性」と称するもの。両方の試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、0.2％グルタルアルデヒドで2時間活性化したポリスチレンプレートに添加した。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTBS，p H7.8でブロックした。次の段階では、これを0.05%（v/v）Tween 20を含むTBS，p H7.8でプレートを3回洗い、TTR蛋白質に対する一次抗体（Accurate Chemical an d Scientific Corporation、ニューヨーク州ウエストベリー）と共にインキュベートし、洗浄し、ウサギIgGに対するユーロピウム標識の二次抗体（Wallac Inc. ，フィンランド、ツゥルク市）で発色させた。増強用溶液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234フルオロメーター（Wal lac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。実施例16 変性型と未変性型TTRの間のシグナル比（「TTRアミロイド指数」）の上昇に基づくSSAおよびFAPの診断変性と未変性の正常型ヒトTTR蛋白質の抗体親和性の比率は、ポリクローナル抗体では広い濃度範囲に渡り、1〜3:3である。アミロイド型TTRでの比率は、線形性の範囲全体に渡り、0.7〜1.0の間である（図18）。「TTRアミロイド指数」は病原性の不溶性アミロイド形成TTRの存在を相対的に示すものとなる。このTTR 解析方法は、正常な対照の指数を決定した後に、脳、組織試料、体液、または医薬品で直接に使用されている。 TTR アミロイドの含有量の計算によるディファレンシャル解析からの SSA およびFAPの診断直接解析の公式（図19）を使用して、末梢神経、組織試料、体液、または医薬品におけるアミロイド型TTRの量を計算できる。公式では（図19）、正常な構造のシグナルで期待されるよりも低いシグナルの増加量は、アミロイド型のTTRの量に比例する。実施例17 疾病の治療法として可能性のあるものをスクリーニングするための、インビトロにおけるTTRの正常型からアミロイド型への転換の測定正常型の合成TTR、または対応するTTRの組換えもしくは合成ペプチドの0.2mg/ mlのアリコートを、50mM酢酸ナトリウムを含む100mM KCl緩衝液pH4.4中で、10^-3 〜10^-6M濃度の試験済み有機化合物と、37℃で72時間インキュベートする。その後、サンプルを2つの部分に分割する：(1)未処理で、1%サルコシルを含み、「未変性」と称する状態；および(2)最終濃度4M Gdn HCl/1％サルコシルと混合し、100 ℃で5分間加熱し、「変性」と称する状態。両方の試料をH2Oで20倍に希釈し、その一部を、グルタルアルデヒドで活性化したポリスチレンプレートに添加する。 5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および６%ソルビトール(w/v)を含むTBS，pH7.8でブロックした。次の段階では、0.05%（v/v）Tween 2 0（登録商標）を含むTBS，pH7.8でプレートを3回洗い、抗TTRポリクローナル抗体（Accurate Chemical and Scientific Corporation、ニューヨーク州ウエストベリー）と共にインキュベートし、その後ユーロピウム標識抗ウサギ抗体とインキュベートした。増強用溶液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234フルオロメーター（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。 TTRの正常構造からアミロイド構造への転換の度合いは、「アミロイド指数」（図18）または公式（図19）から計算される。TTR蛋白質の正常型構造を安定化することによって、転換を阻害する化合物は、成熟したアミロイドの形成を予防することにより、インビボで治療効果を持つ可能性がある場合がある。実施例18 シリアンハムスターにおけるプリオン単離株（株）の分類以下のハムスター適合スクレイピー単離株を脳内注射することによって、シリアンハムスター(LVG/LAK)を感染させた。すなわち、以下のプリオン株を個々にいくつものハムスター群に感染させた：Drowsy(Dy)，139H，Hyper(Hy)，Me7，MT -C5,およびSc237。疾病の末期にこの動物を安楽死させ、直ちにその脳を凍結し、-70℃で保存した。脳は、プロテアーゼ阻害剤カクテル（PMSF 5mM、アプロチニンおよびロイペプチン4μg/ml）を含むPBS，pH7.4中で、PowerGenホモジナイザー（Fisher Scientific、ペンシルベニア州ピッツバーグ）で、3x30秒のバーストによって、氷上でホモジナイズした。得られた10％(w/v)ホモジネートをデスクトップ遠心機により500gで5分間遠心した。上清を、4％サルコシルを含むPB S、pH7.4と1:1で混合し、2つのアリコートに分割した：(1)未処理で未変性と称する状態：(2)最終濃度4M Gdn HClと混合し、80〜100℃で5分間加熱し、変性と称する状態。両方の試料をH₂Oで20倍に希釈し、その一部を、PBS中の0.2％グルタルアルデヒドで1時間活性化したポリスチレンプレートに添加した。5℃で一晩インキュベートしたプレートを、0.5% BSA(w/v)および6%ソルビトール(w/v)を含むTB S，pH7.8でブロックした。次の段階では、0.05%（v/v）Tween 20を含むTBS，pH7 .8でプレートを3回洗い、ユーロピウム標識モノクローナル抗体3F4と2時間インキュベートした。ユーロピウム標識の販売元（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）が供給する増強用溶液中でさらに7つの洗浄段階を実行した後、プレートの発色を行い、DELFIA 1234フルオロメーター（Wallac Inc.，フィンランド、ツゥルク市）でシグナルを計測した。PrP^Sc含有量と「プリオン指数」（変性型：未変性PrP蛋白質に結合する抗体の割合）は、実施例11および8に記載されるようにして計算し、図25に示すようにxy座標にプロットした。試験をして同じ計算が得られる他の試料は、同じ株のプリオンを含むと推定される。本明細書に示し説明する本発明は、最も実際的で好ましい態様であると考えられるものである。しかし、本発明の範囲内で、その態様からの逸脱も可能であること、および、本開示を読むことにより当業者には明らかな改変が想起されるだろうということは認識される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の段階を含む、蛋白質の第1の非病原性構造および蛋白質の第2の病原性構造を含む試料において選択された蛋白質の病原性型の存在を決定する方法：試料の第1の部分を、第2の構造よりも第1の構造に高い親和性を持つ結合パートナーに接触させて、第1の濃度を決定する段階；試料の第2の部分を、結合パートナーに対する第2の構造の結合親和性を上昇させるように処理する段階；試料の処理された第2の部分を結合パートナーと接触させて、第2の濃度を決定する段階；調整濃度を提供するために、第1の構造の蛋白質の結合パートナーに対する親和性の処理による増加分を補正するように、第2の濃度を調整する段階；および第1の濃度を調整濃度と比較して、第2の病原性構造を取る蛋白質の存在を決定する段階。２．第1の濃度および第2の濃度が時間分解、解離増強蛍光法で決定され；さらに蛋白質の第2の病原性構造が1x10³粒子/ml以下の濃度で試料中に存在し；さらに該蛋白質が、βA4蛋白質、PrP蛋白質、およびトランスチレチンからなる群より選択される、疾病の症状を示していない動物から試料を得る、請求項1記載の方法。３．蛋白質が固体支持体に結合され、処理が、第2の型の任意の蛋白質の少なくとも2％を結合型に転換するために十分な、熱、圧力、および化学的変性からなる群より選択される処理を試料に加えることを含み；結合パートナーが、第2の型に対する親和性よりも第1の型に対して少なくとも 10倍高い親和性を持つ標識抗体を含む、請求項1記載の方法。４．下記の段階を含む、結合パートナーに対する結合親和性の異なる第1の構造および第2の構造で存在する、選択された蛋白質の病原性型の存在を、非病原性構造を取る蛋白質の存在下で決定する方法：蛋白質の第2の構造を、結合パートナーに対して第2の構造よりも高い親和性を持つ結合型に転換するために試料を処理する段階；濃度を決定するために、処理した試料を結合パートナーに接触させる段階；調整濃度を提供するために、蛋白質の第1の構造の結合パートナーに対する親和性の処理による増加分を補正するように、濃度を調整する段階；該調整第1濃度を、対照濃度および事前に決定された基準濃度からなる群より選択される既知の濃度と比較して、試料中の第2の構造の蛋白質の存在を決定する段階。５．結合パートナーが標識抗体を含み、濃度がフローサイトメトリーを用いて決定され；調整濃度が、処理済み非感染対照試料から決定された既知の濃度または非感染群の処理済み試料からあらかじめ決定された既知の濃度と比較され；さらに抗体が3F4であり；さらに第2の構造の蛋白質が、1mlあたり1x10³蛋白質分子以下の濃度で試料中に存在し、且つ第1の構造の蛋白質が、1mlあたり1x10⁶蛋白質分子以上の濃度で試料中に存在する、請求項4記載の方法。６．下記の段階を含む、立体構造が異なる第1の型と第2の型とを有し該型のうちの1つがプリオンが仲介する疾病と関連している蛋白質により特徴づけられる、プリオンが仲介する疾病に対する治療活性を有する化合物の同定方法：プリオンが仲介する疾病に感受性の動物を提供する段階；試験化合物を該動物に投与する段階；該プリオンが仲介する疾病を誘導する段階；該動物から試料を得る段階；該蛋白質を含む試料の第1の部分を、該第2の型よりも該蛋白質の該第1の型に対する親和性が高い結合パートナーに接触させ、第1の濃度を決定する段階；該第2の型を該結合パートナーに対する親和性のより高い結合型に転換させるために、試料の第2の部分を処理する段階；第2の濃度を決定するために、処理済みの第2の部分を結合パートナーに接触させる段階；調整濃度を提供するために、第1の型の蛋白質の結合パートナーに対する親和性の処理による増加分を補正するように、第2の濃度を調整する段階；および第1の濃度を調整濃度と比較して、第2の型の蛋白質の構造を決定し、第2の型の蛋白質濃度に対する試験化合物の効果を推定する段階。７．下記の段階を含む、試料中の病原性蛋白質の株を決定する方法：試料中の蛋白質の病原性構造の濃度を決定する段階；蛋白質の病原性構造を、結合パートナーに対する結合親和性が病原性構造よりも高い構造に変換するように、試料を処理する段階；病原性構造に対する蛋白質処理の効果を決定する段階；および該決定された効果を、既知の濃度の既知の株についての既知の基準効果と比較し、それによって試料中の蛋白質の病原性構造の株を推定する段階。８．第2の型の蛋白質濃度を低下させることにより特徴付けられる、請求項6および7のいずれか一項記載の方法によって同定される化合物。９．下記の段階を含む、試料中の病原性蛋白質の株を決定する方法：試料中の蛋白質の病原性構造の濃度を決定する段階；蛋白質の病原性構造を、結合パートナーに対する結合親和性が病原性構造よりも高い構造に変換するように、試料を処理する段階；病原性構造に対する蛋白質処理の効果を決定する段階；および該決定された効果を、既知の濃度の既知の株についての既知の基準効果と比較し、それによって試料中の蛋白質の病原性構造の株を推定する段階。 10．病原性構造の濃度および処理による効果が、結合パートナーとしての標識抗体を用い、時間分解、解離増強蛍光法を用いて決定され；蛋白質の病原性構造がPrP^Scで、PrP^ScがプロテイナーゼＫで処理される、請求項9記載の方法。