DE10354207B3 - Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) und Kit zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) und Kit zur Durchführung des Verfahrens Download PDF

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufbereitung von Körperflüssigkeiten als Voraussetzung für den Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrP·Sc·) in lebenden Organismen sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) in lebenden Organismen sowie einen Kit zur Durchführung des Verfahrens.
  • Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSE) sind beim Menschen und bei verschiedenen Tierarten auftretende, infektiöse und stets tödlich verlaufende degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die dabei auftretenden histopathologischen Veränderungen im Gehirn gehen einher mit der Akkumulation von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc), einem Konformer des natürlich vorkommenden zellulären Prion-Proteins (PrPC). Die im Krankheitsverlauf auftretende Prionen-Replikation erfolgt durch direkte Wechselwirkung zwischen PrPSc und PrPC, wodurch dem normalen PrPC die Konformation des pathologischen PrPSc aufgezwungen wird. PrPSc ist im Unterschied zu PrPC durch einen erhöhten β-Faltblatt-Anteil sowie eine hohe Resistenz gegenüber Proteasen (z.B. Proteinase K) gekennzeichnet.
  • Diese Resistenz von PrPSc wird derzeit in der in-vitro-Diagnostik zum Nachweis der Bovinen Spongiformen Enzephalopathie (BSE) genutzt. Das Prinzip der derzeitigen Testsysteme besteht darin, dass Gewebeteile des Stammhirns (Obex-Region) homogenisiert und mit Proteinase K behandelt werden. Durch die Protease-Behandlung wird das normale PrPC vollständig abgebaut, während PrPSc aus BSE-infizierten Tieren lediglich um einige Aminosäuren verkürzt wird, was eine Reduktion der relativen Molekülmasse von 33-35 kDa auf 27-30 kDa zur Folge hat. Im Anschluss daran wird das verbleibende PrP mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern im Western-Blot oder ELISA-Verfahren detektiert.
  • Der entscheidende Nachteil dieser Testsysteme ist die geringe Sensitivität. Da die PrPSc-Konzentration bei BSE-infizierten Rindern für die gegenwärtigen Testsysteme ausschließlich im zentralen Nervensystem (ZNS) ausreichend hoch ist, beschränkt sich die bisherige Diagnostik auf post-mortem-Tests und setzt eine Inkubationszeit des infizierten Organismus von mindestens 18 Monaten bis zu mehreren Jahren voraus. Nach heutigem Kenntnisstand ist die Krankheit auch auf den Menschen übertragbar und ruft nach einer Inkubationszeit von einem bis zu mehreren Jahren die neue Variante der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (nvCJD) hervor. Die relativ lange Inkubationszeit birgt die Gefahr, dass Infizierte die Erreger beispielsweise durch Bluttransfusionen oder Organtransplantationen weitergeben. Daraus begründet sich ein hoher Bedarf an der frühzeitigen Diagnose der TSE.
  • Um die TSE-Diagnostik bereits zu einem frühen Zeitpunkt der Infektion, am noch lebenden Organismus durchführen zu können, muss der Nachweis von PrPSc in Körperflüssigkeiten bzw. Biopsiematerial ermöglicht werden.
  • In der WO 02/057789 A2 ist ein Verfahren zum Nachweis von TSE beschrieben, umfassend das Behandeln einer Gewebe- oder Blutprobe mit Alkohol und einem Detergenz, das Zufügen eines Agens, das das normale Prion-Protein degradiert, das Zufügen eines Agens, das das abnormale Prion-Protein degradiert, das Zufügen eines spezifischen Antikörpers gerichtet gegen Prion-Proteine und das Nachweisen einer Antikörperbindung. In der WO 03/00121 A1 wird ein Nachweisverfahren für Prion-Proteine in Gewebeproben des Hirns beschreiben, das die Aufarbeitung des Gewebes mittels Lyse, das Aufbringen des Lysats auf eine Membran, das Inkubieren der aufgebrachten Proteine mit einer Protease oder umgekehrt, das Zufügen eines spezifischen Antikörpers gerichtet gegen Prion-Proteine und das Nachweisen einer Antikörperbindung beinhaltet.
  • Nach WO 02/066987 A2 werden Teile des Auges, insbesondere Kammerwasser, als Probenmaterial für die TSE-Diagnose vorgeschlagen. Dazu wird ausgeführt, dass sich Kammerwasser insbesondere für die in vivo-Diagnosik der TSE eignet, da zur Probengewinnung lediglich ein geringfügiger tierärztlicher Eingriff, die Punktion des Kammerwassers, notwendig ist. In der WO 02/066987 A2 sind jedoch keine Beispiele für eine Durchführung des beschriebenen Verfahrens aufgeführt. Darüber hinaus erwiesen sich die vorgeschlagenen Probenaufbereitungen für einen Nachweis von PrPsc im Auge als untauglich und führten nicht zum Erfolg.
    •
  • Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Nachweis von PrPSc in Körperflüssigkeiten bereitzustellen, das sensitiv genug ist, PrPSc nachzuweisen, ohne dass die potentiell infizierten Organismen getötet werden müssen. Ferner soll ein Kit zur Durchführung des Verfahrens angegeben werden.
  • Die Aufgabe wird durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1 und einen Kit mit den Merkmalen des Patentanspruchs 7 gelöst.
  • Die nachfolgenden Abbildungen erläutern die Erfindung.
    •
  • 1a und 1b zeigt die Notwendigkeit der Proteinase K-Behandlung als Teil des Probenaufbereitungsverfahrens für Körperflüssigkeiten. Jeweils 6 Liquor- und Augenkammerwasser-Proben von BSE-positiven und BSE-negativen Rindern wurden dem Probenaufbereitungsverfahren mit und ohne Proteinase K-Behandlung unterzogen. Die Bestimmung des resultierenden PrPSc-Gehaltes erfolgte in einem PrPSc-spezifischen ELISA KW bedeutet Augenkammerwasser.
  • 2 zeigt vergleichend die Ergebnisse des Probenaufbereitungsverfahrens mit und ohne Hitzeschritt während der Resolubilisierung der Probe. Jeweils 4 Liquor- und 2 Augenkammerwasserproben von BSE-positiven und BSL-negativen Rindern wurden dem Probenaufbereitungsverfahren unterzogen. Die Detektion des resolubilisierten PrPSc erfolgte in einem PrPSc-spezifischen ELISA. KW bedeutet Augenkammerwasser.
  • Als "BSE-positive Rinder" werden hier solche Tiere bezeichnet, in deren Stammhirn-Gewebe post mortem Proteinase K-resistentes PrPSc nachgewiesen werden kann. Körperflüssigkeiten von BSE-positiven Rindern wurden den lebenden Tieren entnommen, eingelagert und nach den post mortem Nachweisen als Probenmaterial verwendet.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) in Körperflüssigkeiten, umfassend die Schritte,
    • a) inkubieren einer isolierten Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit mit N-Lauroylsarcosin mit einer Konzentration im Bereich von 0,1% bis 30%, und anschließend
    • b) Durchführung einer Protease-Behandlung, und anschließend
    • c) Mischen der Probe mit einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln und anschließender Zentrifugation der Probe, und anschließend
    • d) Inkubation der Probe mit einem Resolubilisierungspuffer, entfaltend ein Detergenz, ein chaotropes Reagenz und einen Chelatbildner, und anschließend
    • e) Nachweisen der pathologisch veränderten Prion-Proteine (PrPSc).
  • Vorzugsweise liegt N-Lauroylsarcosin in einer Pufferlösung vor. Vorzugsweise kann nach Schritt b) die Probe einer Protein-Präzipitation und einer anschließenden Resolubilisierung unterzogen werden. Vor der erfindungsgemäßen Probenbehandlung, also vor Schritt a), kann die Probe zur Abtrennung fester Bestandteile gegebenenfalls einem Zentrifugations- und/oder Filtrationsschritt unterzogen werden.
  • Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in Körperflüssigkeiten enthaltene pathologisch veränderte Prion-Protein (PrPSc) aufbereitet. Ferner wird das natürlich vorkommende PrPSc aus der Probe entfernt. Durch die erfindungsgemäße Probenaufbereitung kann PrPSc in Körperflüssigkeiten z.B. mit einem immunologischen Nachweis unter Verwendung von anti-PrP-Antikörpern nachgewiesen werden. Das Verfahren ermöglicht den Nachweis mit einer hohen Sensitivität, sodass selbst geringste bisher nicht nachweisbare Konzentrationen an PrPSc in Körperflüssigkeiten detektiert werden können. Dadurch ist es möglich, lebende Tiere oder Menschen bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt nach der Infektion mit den TSE-auslösenden Prionen, vorzugsweise innerhalb der ersten 6 Monate, zu untersuchen und bei Nachweis von PrPSc als infiziert zu klassifizieren. Dies war bisher nicht möglich, da derart sensitive Tests nicht zur Verfügung standen und darüber hinaus die Nachweise nur post mortem aus Hirngewebe durchgeführt werden konnten.
  • Die zu untersuchenden Körperflüssigkeiten können von allen Organismen stammen, die sich mit Prionen infizieren können. Vorzugsweise stammen die Körperflüssigkeiten von Säugetieren, insbesondere von Rindern, Schafen, Ziegen, Maultieren, Elchen, Rot- und Damwild, Mäusen, Hamstern oder Menschen.
  • Das Probenaufbereitungsverfahren ist für sämtliche Körperflüssigkeiten, wie z.B. Blut, Serum, Plasma, Tränenflüssigkeit, Augenkammerwasser, Liquor, Urin, Speichel, Lymphe, Peritonealflüssigkeit oder Milch geeignet, wobei das Verfahren mit Augenkammerwasser oder Liquor bevorzugt ist.
  • In einem ersten Schritt wird die isolierte Probe mit einer Detergenz-haltigen Lösung behandelt. Dadurch wird erreicht, dass PrPSc in vollständig unlöslichen Komplexen vorliegt. Als Detergenz wird ein anionisches Detergenz, nämlich N-Lauroylsarcosin in einer Konzentration im Bereich von 0,1% bis 30%, vorzugsweise 20% verwendet. Die Lösung kann eine puffernde Substanz enthalten, die vorzugsweise im alkalischen Bereich (pH 8,0 bis 11,0) puffert, wie z.B. TRICIN-NaOH-Puffer, BICIN-NaOH-Puffer, Glycin/NaOH-Puffer, Tris-HCl-Puffer, Phosphat-Puffer oder Carbonat-Puffer. Bevorzugt wird die Verwendung von 50 mM Glycin/NaOH pH 9,5.
  • Anschließend erfolgt eine enzymatische Behandlung, die einen Großteil der vorhandenen Proteine, z.B. PrPSc-maskierende Proteine, proteolytisch spaltet. Zur Demaskierung der Epitope wird die Probe nach vorstehend beschriebener Probenvorbereitung einer Protease-Behandlung unterzogen. Dazu wird das Probenmaterial mit einer Protease, z.B. Proteinase K, behandelt. Der Protease-Verdau kann bei Standardbedingungen für die jeweilige Protease oder nach Angaben des Herstellers, vorzugsweise bei 37°C für 10 min durchgeführt werden. Die verwendete Enzymkonzentration kann je nach Probenmaterial im Bereich von etwa 10 μg/ml bis etwa 100 μg/ml liegen, vorzugsweise werden etwa 50 μg/ml Enzym verwendet.
  • Anschließend wird angereichert, indem zuerst ein Fällungsschritt mit organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird und die Lösung anschließend zentrifugiert wird. Zur Fällung von PrPSc wird ein Gemisch aus organischen Lösungsmitteln, wie z.B. Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Aceton, Isopropanol, Isoamylalkohol, verwendet, vorzugsweise Isoamylalkohol plus Aceton im Verhältnis 70:30. Die Probenlösung wird mit dem Lösungsmittelgemisch im Verhältnis 2:1 vermischt. Durch kräftiges Mischen wird die Suspension aus Probenlösung und N-Lauroylsarcosin-Lösung geklärt. Dies ist erforderlich, um PrPSc durch Zentrifugation sedimentieren zu können. Die Zentrifugation erfolgt für 2 bis 20 min bei 2000 bis 22000 × g und 0 bis 37°C, vorzugsweise für 5 min bei 16000 × g und 4°C. Andere anionische Detergentien als N-Lauroylsarcosin, z.B SDS oder nicht-ionische oder zwitterionische Detergentien sind hierfür nicht geeignet. Weiterhin sollte die N-Laurylsarcosin-Konzentration im Schritt a) bei mindestens 20% liegen, damit der Fällungsschritt durchgeführt werden kann.
  • Anschließend wird ein Resolubilisierungsschritt durchgeführt. Der dabei verwendete Puffer enthält ein Detergenz, ein chaotropes Reagenz und einen Chelatbildner. Bevorzugt wird folgender Puffer verwendet: 50 mM Tris pH 7,4, 8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 10 mM EDTA. Die Auswahl der in dem Puffer enthaltenen Substanzen ist so gewählt, dass Aggregation von PrPSc unterbunden wird, um die maximale Menge an PrPSc wieder in Lösung zu bekommen. Die Inkubation der Probe wird bei 100°C für mindestens 2 min und maximal 20 min durchgeführt.
  • Anschließend wird das in den vorhergehenden Verfahrensschritten aufbereitete PrPSc in einem beliebigen Verfahren nachgewiesen. Dazu können immunchemische (z.B. ELISA, Western Blot, Immunpräzipitation), biophysikalische (z.B. Massenspektrometrie, Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie), biochemische (z.B. Bestimmung biochemischer Parameter, wie z.B. relative Molmasse, N-terminale bzw. C-terminale Aminosäuresequenz, Assoziations- und Dissoziationskonstanten von Bindungspartnern) oder biologische (z.B. Cytotoxizitätsassay) Nachweisverfahren zum Einsatz kommen.
  • Das Verfahren wird durch die folgenden Ausführungsbeispiele näher erläutert.
  • Beispiel 1: Zusammensetzung der Detergenz-haltigen Pufferlösung
  • Die Detergenz-haltige Pufferlösung (nachfolgend als Denaturierungspuffer bezeichnet) hat die Funktion, PrPSc von maskierenden Proteinen der jeweiligen Körperflüssigkeit zu dissoziieren und damit PrPSc in unlösliche Komplexe zu bringen, während die restlichen Probenbestandteile in Lösung gebracht werden. Die Effizienz des Denaturierungspuffers zeigt sich nach Zusatz eines Proteinfällungsreagenz. Ist die Probenlösung dann klar, sind abgesehen von den PrPSc-Komplexen nahezu alle Probenbestandteile in Lösung geblieben. Folglich kann nur PrPSc durch eine anschließende Zentrifugation sedimentiert und damit angereichert werden. Bleibt oder wird die Probenlösung nach Zugabe des Fällungsreagenz trüb, bedeutet das, dass ein Großteil der in der Probe enthaltenen Fremdbestandteile nicht in Lösung gehalten werden konnte und damit während der Zentrifugation zusammen mit dem PrPSc sedimentiert.
  • Daher wurde die Eignung der verschiedenen Lösungen als Denaturierungspuffer anhand von Trübungsmessungen beurteilt. Dazu wurden je 100 μl Probe (Augenkammerwasser von BSE-negativen Rindern) mit dem gleichen Volumen Denaturierungspuffer versetzt und sorgfältig gemischt. Anschließend wurden 100 μl Fällungsreagenz (Isoamylalkohol plus Aceton, 7:3) zugegeben und kräftig gevortext. Die Trübung von jeweils 100 μl der denaturierten Proben wurde in Mikrotiterplatten photometrisch bei 620 nm (Tecan Sunrise, Tecan, Schweiz) bestimmt.
  • Das Ergebnis der Trübungsmessungen ist in Tabelle 1 dargestellt. Die meisten der getesteten Lösungen zeigten optische Dichten zwischen 0,3 und 1,1, sind also nicht oder nur bedingt als Denaturierungspuffer in diesem System geeignet. Lediglich ein alkalischer Puffer mit einem N-Lauroylsarcosin-Gehalt von 20% war in der Lage, alle Bestandteile des Augenkammerwassers in Lösung zu bringen (OD620 0,049).
  • Mit anderen Körperflüssigkeiten wie beispielsweise Liquor und Plasma, sowie mit homogenisierten Gewebeproben wurden vergleichbare Ergebnisse erzielt.
  • Tabelle 1: Vergleich verschiedener Denaturierungspuffer
    Figure 00100001
  • Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Beispiel 2: Zusammensetzung des Fällungsreagenz
  • Im Anschluss an den Protease-Verdau kann durch Proteinfällung mit organischen Lösungsmitteln eine Anreicherung von PrPSc erzielt werden. Dazu wurden verschiedene Lösungsmittelgemische und andere gängige biochemische Proteinfallungs-substanzen analog Beispiel 1 unter Verwendung von 50 mM Glycin pH 9.5 mit 20% N-Lauroylsarcosin als Denaturierungspuffer getestet. Die Fällungseffizienz wurde durch Messung des Proteingehaltes in Überstand und Niederschlag bestimmt. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die erzielten Ergebnisse.
  • Tabelle 2: Vergleich verschiedener Fällungsreagenzien
    Figure 00120002
  • Figure 00130001
  • Isoamylalkohol-Aceton-Gemische erwiesen sich am geeignetsten als Fällungsreagenz. Dabei ist ein höherer Isoamylalkohol-Anteil förderlich. Am effektivsten wird die Fällung bei Einsatz eines Isoamylalkohol-Aceton-Gemisches im Verhältnis 70:30.
  • Beispiel 3: Protease-Behandlung
  • PrPSc liegt in Körperflüssigkeiten durch andere Proteine maskiert vor. Daher ist in unbehandelten Körperflüssigkeiten wie Liquor, Plasma und Augenkammerwasser von BSE-positiven Rindern PrPSc nicht nachweisbar. Zur Demaskierung wurde eine Protease-Behandlung (z.B. Proteinase K) durchgeführt. Dazu wurden je 6 BSE-positive und BSE-negative Liquor- und Augenkammerwasser-Proben mit Denaturierungspuffer (50 mM Glycin pH 9.5, 20% N-Lauroylsarcosin) versetzt und für 10 min bei 37°C mit Proteinase K (50 μg/ml) inkubiert. Als Kontrolle wurden die gleichen Proben ohne Proteinase K inkubiert. Die Reaktion wurde durch Proteinfällung mit einem Isoamylalkohol-Aceton-Gemisch (70:30) abgestoppt. Das gefällte Protein wurde durch Zentrifugation für 5 min bei 16000 × g und 4°C sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen. Das erhaltenen Pellet wurde in 50 mM Tris pH 7,4, 8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 10 mM EDTA resolubilisiert.
  • In der Probe enthaltenes PrPSc wurde wie folgt nachgewiesen:
    Eine MTP (Nunc-ImmunoTM Plate MaxisorpTM Surface, F96 (Nunc, Roskilde, Dänemark)), wurde mit dem Peptid KLVFF beschichtet. Die Beschichtung erfolgte durch Inkubation mit 100 μl Peptidlösung (10 μg/ml in 0,1 M Carbonatpuffer pH 9,6) pro Kavität für 16 h bei 4°C. Anschließend wurde die Flüssigkeit abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer (PBS; 0,05% Tween 20; pH 7,2) pro Kavität gewaschen. Freie Bindungsplätze wurden durch Inkubation mit 0,5% Casein in Waschpuffer bei Raumtemperatur für 1 h blockiert. Nach einem Waschschritt (dreimal 300 μl Waschpuffer pro Kavität) wurde die beschichtete MTP mit 100 μl pro Kavität der PrPSc-haltigen Probe für 1 h bei Raumtemperatur mit Folie abgedeckt inkubiert. Nicht gebundenes Probenmaterial wurde abgesaugt und die MTP dreimal mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität gewaschen. Die Inkubation mit dem Detektions-Antikörper (2 μg/ml F89, Sigma-Alderich, Taufkirchen, Deutschland) erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur. Anschließend wurde die Platte wieder dreimal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen und für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Ziege-anti-Maus IgG-Peroxidasekonjugat (1:20000 in Waschpuffer, Jackson, USA) inkubiert. Überschüssiges Konjugat wurde durch fünfmaliges Waschen mit 300 μl Waschpuffer pro Kavität entfernt. Nach Zugabe der Substratlösung (TMB) wurde die Farbentwicklung nach 15 min durch Zusatz von 1 M H2SO4 abgestoppt und die Farbintensität durch Extinktions-Messung bei 450 nm (Referenz 620 nm) registriert. Die gemessene Extinktion ist der an die Peptide gebundenen Menge an PrPSc proportional.
  • Aus 1a und 1b geht hervor, das PrPSc nur in Proteinase K-behandelten Proben sicher nachweisbar ist.
  • Beispiel 4: Ermittlung der optimalen Zusammensetzung des Resolubilisierungspuffers
  • Durch die Behandlung mit Denaturierungspuffer und Fällungsreagenz lag das in der Probe enthaltene PrPSc in unlöslicher Form vor und musste daher für einen immunologischen Nachweis in Lösung gebracht werden. Dazu wurden Resolubilisierungspuffer unterschiedlicher Zusammensetzung verwendet. Liquorproben von BSE-positiven und BSE-negativen Rindern wurden analog Bsp. 3. aufbereitet. Das nach Zentrifugation erhaltene Pellet wurde in 50 μl des entsprechenden Resolubilisierungspuffers aufgenommen und zur Verbesserung der Löslichkeit für 5 min auf 100°C erhitzt. Anschließend wurden die Proben mit dem PrPSc-spezifischen ELISA wie in Beispiel 3 beschrieben analysiert. Die resultierenden optischen Dichten, als Maß für den PrPSc-Gehalt, sind in Tab. 3 zusammengefasst. Ein Puffer mit der Zusammensetzung:
    50 mM Tris pH 7,4, 8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 10 mM EDTA erwies sich als effizientester Resolubilisierungspuffer.
  • Anschließend wurde die Notwendigkeit des Hitzeschrittes überprüft. Dazu wurden 4 BSE-positive und 4 BSE-negative Liquorproben, sowie 2 BSE-positive und 2 BSE-negative Augenkammerwasserproben wie oben beschrieben aufbereitet. Nach Zugabe des Resolubilisierungspuffers wurden die Proben geteilt. Ein Teil wurde dem Hitzeschritt (5 min 100°C) unterzogen und anschließend analysiert, während der andere Teil sofort analysiert wurde. 2 illustriert die Notwendigkeit des Hitzeschrittes zur vollständigen Resolubilisierung des PrPSc. Ohne Erhitzen gehen ca. 80% des Signals verloren.
  • Tabelle 3: Vergleich verschiedener Resolubilisierungspuffer
    Figure 00150001

Claims (7)

  1. Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) in Körperflüssigkeiten, umfassend die Schritte, a) Inkubieren einer isolierten Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit mit N-Lauroylsarcosin mit einer Konzentration im Bereich von 0,1% bis 30%, und anschließend b) Durchführung einer Protease-Behandlung, und anschließend c) Mischen der Probe mit einem Gemisch aus organischen Lösungsmitteln und anschließender Zentrifugation der Probe, und anschließend d) Inkubation der Probe mit einem Resolubilisierungspuffer, enthaltend ein Detergenz, ein chaotropes Reagenz und einen Chelatbildner, und anschließend e) Nachweisen der pathologisch veränderten Prion-Proteine (PrPSc).
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei N-Lauroylsarcosin in einem Puffer enthaltend 50 mM Glycin/NaOH, pH 9,5 vorliegt.
  3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Protease-Behandlung mit Proteinase K in einer Konzentration im Bereich von etwa 10 μg/ml bis etwa 100 μg/ml durchgeführt wird.
  4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Puffer 50 mM Tris pH 7,4, 8 M Harnstoff, 2% CHAPS, 10 mM EDTA ist und die Inkubation bei 100°C für mindestens 2 min und höchstens 20 min durchgeführt wird.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspüche, wobei das organische Lösungsmittel aus 70% Isoamylalkohol und 30% Aceton besteht.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeit, Augenkammerwasser oder Liquor ist.
  7. Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrPSc) enthaltend einen detergenzhaltigen Puffer aus 50 mM Glycin/NaOH pH 9,5 und N-Laurylsarcosin mit einer Konzentration im Bereich von 0,1% bis 30%, einen weiteren Behälter mit einer Protease einen weiteren Behälter enthaltend ein organisches Lösungsmittel und einen weiteren Behälter enthaltend einen Resolubilisierungspuffer.
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