DE102007016324A1

DE102007016324A1 - Verfahren zum Nachweis von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc)

Info

Publication number: DE102007016324A1
Application number: DE102007016324A
Authority: DE
Inventors: Claudia Engemann; Ulrike Krummrei; Christina König
Original assignee: Priontype & Co KG GmbH; Priontype & Cokg GmbH
Current assignee: Priontype & Co KG GmbH; Priontype & Cokg GmbH
Priority date: 2007-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2008-10-09
Also published as: WO2008122274A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrP<SUP>Sc</SUP>) in humanen Körperflüssigkeiten, insbesondere in Blut-, Plasma- und Serumproben des Menschen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrP^Sc) in humanen Körperflüssigkeiten, insbesondere in Blut-, Plasma- und Serumproben des Menschen.
Pathologisch verändertes Prion-Protein (PrP^Sc) ist der Erreger der Transmissiblen Spongiformen Enzephalopathien (TSE) beim Menschen und bei verschiedenen Tierarten (z. B. BSE für Bovine Spongiforme Enzephalopathie). Diese sind infektiöse und stets tödlich verlaufende degenerative Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Die dabei auftretenden histopathologischen Veränderungen im Gehirn gehen einher mit der Akkumulation von PrP^Sc, einem Konformer des natürlich vorkommenden zellulären Prion-Proteins (PrP^C). Die im Krankheitsverlauf auftretende Prionen-Replikation erfolgt durch direkte Wechselwirkung zwischen PrP^Sc und PrP^C, wodurch PrP^C die Konformation des pathologischen PrP^Sc annimmt. PrP^Sc ist im Unterschied zu PrP^C durch einen erhöhten β-Faltblatt-Anteil sowie eine hohe Resistenz gegenüber Proteasen (z. B. Proteinase K) gekennzeichnet.
Beim Menschen unterscheidet man vier Arten der TSE, die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD), das Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom (GSS), die familiäre fatale Insomnie (FFI) und Kuru. Die drei letztgenannten Erkrankungen treten nur äußerst selten bzw. geographisch begrenzt auf, dagegen wird CJD weltweit mit einer Häufigkeit von einem Fall auf einer Million Einwohner pro Jahr diagnostiziert. In über 90% der Fälle tritt die CJD sporadisch auf (sporadische CJD, sCJD). In diesen Fällen lässt sich keine Infektionsquelle erkennen. Darüber hinaus gibt es vererbte oder familiäre Formen der CJD (fCJD) und die iatrogene CJD (iCJD), die über äußere, meist medizinische Einflüsse, z. B. durch Transplantationen, übertragen wird.
Seit Ende 1995 diagnostiziert man jedoch in Großbritannien erste Fälle einer ungewöhnlichen CJD, die so genannte neue Variante der CJD oder vCJD. Nach dem heutigen Stand der Erkenntnis gibt es wenig Zweifel, dass die aufgetretenen Fälle der vCJD durch die Aufnahme des BSE-Erregers verursacht wurden. Man nimmt an, dass dies über die Nahrungsaufnahme, d. h. oral geschehen ist. Bislang wurden 198 Fälle bestätigt (Stand: Januar 2007; Quelle: The National Creutzfeldt-Jakob Disease Surveillance Unit, Edinburgh, Großbritannien).
Zunehmend wird ersichtlich, dass infektiöses PrP^Sc vom Tier auf den Menschen (BSE) und von Mensch zu Mensch übertragbar ist (Kuru). Damit einher geht die Gefahr der Übertragung von PrP^Sc durch Blutkonserven und Transplantate auf eine unüberschaubare Anzahl von Blut- und Organspendeempfängern. Es ist daher essentiell, alle Blutkonserven auf Prionen zu untersuchen. Zwei Kriterien sind dabei zu beachten: Erstens muss ein leicht handhabbarer Bluttest zur Verfügung stehen. Zweitens muss ein solcher Bluttest hochsensitiv sein, da in Körperflüssigkeiten nur geringste Mengen PrP^Sc vermutet werden. Die relativ lange Inkubationszeit birgt die Gefahr, dass Infizierte die Erreger beispielsweise durch Bluttransfusionen oder Organtransplantationen weitergeben. Daraus begründet sich ein hoher Bedarf an der hochsensitiven Detektion von Prionen in menschlichem Blut.
In der Literatur sind verschiedene Ansätze zur hochsensitiven Detektion von Prionen beschrieben. Ein sehr sensitiver Ansatz ist die Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA). Geringste nicht-detektierbare Mengen an PrP^Sc werden dazu angeregt, große Mengen an PrP^C ähnlich wie in der Polymerase-Kettenreaktion zu konvertieren. Diese Methode erlaubt erstmalig den biochemischen Nachweis von PrP^Sc im Blut von Scrapie-infizierten Hamster (Castilla et al., 2005). Weiterhin wurde mit dieser Methode PrP^Sc aus Hirnhomogenat einer Kuh nachgewiesen, die 32 Monate vorher oral mit BSE-positivem Hirnhomogenat experimentell infiziert wurde. Das Tier zeigte keine klinischen Symptome und war negativ in Standard-Western-Blot-Verfahren. Aus Hirnproben von Kontrolltieren konnte kein PrP^Sc amplifiziert werden (Soto et al., 2005). Weiterhin wurde PrP^Sc im Blut von Scrapie-infizierten Hamster in der präsymptomatischen Phase nachgewiesen (Saa et al., 2006). Der gravierende Nachteil dieser Methode ist jedoch die Infektiosität, die durch die Amplifizierung generiert wird. Die Anreicherung von PrP^Sc ist gefährlich; aus offensichtlichen Gründen wird die blutverarbeitende Industrie jede Infektiosität vermeiden wollen. PrP^Sc muss in Sicherheitslaboren der Stufe S3** gehandhabt werden, was in dem Kontext des Blutbankenscreenings nicht praktikabel ist.
Weitere Publikationen beschreiben die Prionendetektion im Blut von Scrapie-infizierten Schafen und von Rotwild mit Chronic Wasting Disease (TSE-Form beim Wild) in der Kapillarelektrophorese (Schmerr et al., 1999) und den Nachweis von femtomolaren Konzentrationen von PrP^Sc in Liquor von CJD-Patienten mit einem Prototyp der Zweifarben-Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (Zeiss; Bieschke et al., 2000). Diese Methoden sind durch aufwendige Geräte gestützt und sind daher für den Hochdurchsatz nicht geeignet.
Ein weiterer sehr sensitiver Test ist der sogenannte verbesserte CDI-Assay (Bellon et al., 2003); der Test dauert jedoch ca. 24 Stunden und ist deswegen für die Praxis nicht ausgereift.
Die derzeit empfindlichste Methode enzymatischer Signalverstärkung ist die 1985 von K. Mullis entwickelte Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR). Neben der Amplifikation und Modifikation von Nukleinsäuremolekülen zu präparativen Zwecken ermöglicht die PCR den extrem empfindlichen Nachweis von Ziel-Nukleinsäuren und hat als elementares Hilfsmittel der Forschung und medizinischen Diagnostik weite Verbreitung gefunden. Die zyklische Amplifikation des Templates erlaubt im Idealfall die Detektion eines einzelnen Moleküls DNA. Demgegenüber liegt die Nachweisgrenze eines konventionellen ELISAs typischerweise bei ca. 10^–16–10^–17 Mol Antigen, und auch mittels eines Radioimmunassays (RIA) können kaum weniger als 10^–18 Mol detektiert werden. Einzelne Ansätze zur Entwicklung hochempfindlicher enzymatischer Immuno-Assays auf Chemilumineszenzbasis mit Nachweisgrenzen bis zu einem Zeptomol (ca. 600 Moleküle) wurden zwar publiziert, sind jedoch als Routineverfahren nicht praxistauglich. Die Probleme ultrasensitiver Protein-Analytik liegen dabei hauptsächlich in der extremen Empfindlichkeit der Nachweisverfahren gegenüber unspezifischen Hintergrundsignalen, der Entwicklung und Anpassung einer Methodik für ein Anwendungsbeispiel, die sich nur mit hohem Arbeitsaufwand auf andere Anwendungen übertragen lässt sowie einem erhöhten apparativen, methodischen und zeitlichen Aufwand. Daher erscheint die Kombination der etablierten PCR-Methodik zur Signalverstärkung mit der spezifischen Antikörper-Antigen-Erkennung eines ELISA, wie sie 1992 von Sano et al. erstmals als Immun-PCR (IPCR) publiziert wurde, besonders interessant. Mit der Verbindung der zwei Standardmethoden der Nukleinsäure- und Protein-Analytik konnte in einem einfachen modularen Aufbau ein neuartiges, extrem sensitives Detektionsverfahren für Nicht-Nukleinsäuremoleküle vorgestellt werden. Die IPCR erlaubte bereits in einem ersten Modellversuch die Verbesserung der Nachweisgrenze eines konventionellen ELISA um ca. fünf Zehnerpotenzen.
Nach PCR-Amplifikation der Marker-DNA wird der Nachweis des Antigens indirekt über die quantitative Analyse der PCR-Produkte erreicht. Sano et al. konnten so den Nachweis von 500 Referenz-Molekülen des Modellantigens Rinderserumalbumin (bovines Serumalbumin, BSA) erreichen, was einer über 1000-fachen Steigerung der Empfindlichkeit gegenüber herkömmlichen Methoden zur Proteinanalytik entspricht. Während dieser Ansatz durch die Verwendung einer Proteinchimäre aus Streptavidin (STV) und Protein A zwar die Antigen-DNA-Kopplung in einem Inkubationsschritt ermöglicht, ist die Methode jedoch auf den Nachweis von Antigenen aus Proben beschränkt, die kein Immunglobulin G (IgG) enthalten, da Protein A gegen den Fc-Teil von IgG-Molekülen bindet. Eine alternative Vorgehensweise, die eine Übertragung der IPCR auf kommerziell verfügbare Reagenzien ermöglicht, wurde 1993 von Zhou et al. publiziert. Dabei wird in zwei Inkubationsschritten biotinylierter Antikörper mit biotinylierter DNA über die STV-Biotin-Wechselwirkung verbunden und so eine Kopplung des Antigens mit der Marker-DNA erreicht. Diese Methodik zeichnet sich neben einer leichten kommerziellen Zugänglichkeit biotinylierter Antikörper durch ihre enorme Flexibilität aus. Es kann praktisch jeder beliebige Antikörper und jedes beliebige DNA-Fragment biotinyliert werden. Zusätzlich bietet die Sequenzvielfalt der DNA ein nahezu unerschöpfliches Reservoir an spezifischen „Marker-Molekülen" für Multiplex-Ansätze zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antigene. Die IPCR wurde bislang zum Nachweis verschiedenster Antigene eingesetzt, beispielsweise zur Quantifizierung bakterieller Antigene, als Vergleichssystem zur Korrelation mit DNA- und mRNA-Analysen oder zur Quantifizierung humaner Enzyme bzw. Botenstoffe und in der Forschung von Prionen-Erkrankungen.
So wurde die Technik der Immuno-PCR bereits im Kontext der Prionendetektion angewandt, jedoch mit diskussionswürdigen Ergebnissen. Gofflot et al. (2005) beschreiben eine immunquantitative PCR (iqPCR) zur PrP-Detektion bei sporadischer CJD, die 10-fach sensitiver ist als ein entsprechender ELISA. Diese Sensitivität ist für Blutbankenscreening, speziell beim Einsatz von Poolproben, nicht ausreichend.
Ein ähnlicher Test wurde von Barletta et al. (2005) beschrieben. Dieser Test scheint jedoch wenig robust: Es werden zwei PCR-Amplifizierungen durchgeführt, unterbrochen von Überpipettieren in andere Reaktionsgefäße und Zugabe von frischen PCR-Reagenzien. Dem PCR-Sachverständigen leuchtet ein, dass diese Bedingungen unzuverlässige Ergebnisse liefern. Zudem diskutieren die Autoren selbst, dass „Variablen", wie z. B. das Verhältnis von Biotin zu Streptavidin im Konjugat, nicht einheitlich sind und zu Schwankungen der Testergebnisse führen. Der Proteinase K-Verdau beinhaltet mehrere Schritte, die die Aufarbeitung verkomplizieren. Insgesamt ist dieser Test zwar sehr sensitiv, scheint jedoch in einer Entwicklungsphase weit entfernt vom Stadium des Prototypen. Dieses scheint kein Verfahren, das das zuverlässige Blutbankenscreening erlaubt.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein sensitiveres, schnelleres und preisgünstigeres Verfahren zum Nachweis von PrP^Sc in Körperflüssigkeiten vom Menschen bereitzustellen.
Die Aufgabe wird durch den in den Patentansprüchen definierten Gegenstand gelöst.
Die nachfolgenden Figuren erläutern die Erfindung.
1 zeigt eine schematische Darstellung eines Immuno-PCR(IPCR)-Ansatzes im Sandwich-Format. Die Schritte sind analog zu einem ELISA im Sandwich-Format, allerdings ist der Detektions-Antikörper nicht mit einem Enzym sondern mit DNA (Marker-DNA) gekoppelt. Im Weiteren wird die Marker-DNA einer PCR-Amplifikation unterzogen. Die Quantifizierung des PCR-Produktes erlaubt eine indirekte Quantifizierung des Antigens über den Vergleich mit Eichreihen bekannter Antigen-Konzentrationen (externe Standards).
2 gibt in einer Graphik den Vergleich der Titration von recPrP und den Nachweis in ELISA-Verfahren und dem erfindungsgemäßen IPCR-Verfahren wieder.
3 zeigt das Ergebnis eines anti PrP-Western Blots. PrP aus bovinem Hirnhomogenat ist gespikt in Serum mit und ohne Proteinase K-Behandlung.
4 zeigt in einer Graphik das Ergebnis des Nachweises von gespiktem recPrP in Serum mit dem erfindungsgemäßen Verfahren.
5A und B zeigen das Ergebnis eines anti PrP-Western Blots. PrP aus bovinem Hirnhomogenat wurde mit verschiedenen Proteinase K-Konzentrationen behandelt. 5A: mAb mit Epitop in Proteinase K-resistenter Region von PrP; 5B: mAb mit Epitop in Proteinase K-labiler Region von PrP.
6 zeigt in einer graphischen Darstellung das Ergebnis des Vergleichs der Signalstärke von vCJD-positivem Hirnhomogenat gespikt in Plasma mit und ohne Anreicherung durch IP. Ohne IP wird eine Verdünnung von 1:1000 detektiert, mit IP dagegen wird selbst die 1:100000-Verdünnung eindeutig als positiv bestimmt. Die IP kann daher die nachgewiesene Menge PrP um den Faktor 100 steigern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrP^Sc) in humanen Körperflüssigkeiten, umfassend die Schritte,
Inkubieren einer isolierten Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit mit einer Protease, und anschließend
Immunpräzipitation zur Anreicherung von PrP^Sc, und anschließend
Nachweis von PrP^Sc aus der so behandelten Probe mittels Immun-PCR.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das in Körperflüssigkeiten enthaltene pathologisch veränderte Prion-Protein (PrP^Sc) aufbereitet. Ferner wird das natürlich vorkommende PrP^C aus der Probe entfernt. Aus einem größeren Probenvolumen wird dann PrP^Sc durch Immunpräzipitation angereichert. Durch die erfindungsgemäße Probenaufbereitung kann PrP^Sc in Körperflüssigkeiten z. B. mit einem immunologischen Nachweis unter Verwendung von anti-PrP-Antikörpern nachgewiesen werden. Das Verfahren ermöglicht den Nachweis mit einer hohen Sensitivität, so dass selbst geringste, bisher nicht nachweisbare Konzentrationen an PrP^Sc in Körperflüssigkeiten detektiert werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist für sämtliche Körperflüssigkeiten, wie z. B. Blut, Serum, Plasma, Tränenflüssigkeit, Augenkammerwasser, Liquor, Urin, Speichel, Lymphe, Peritonealflüssigkeit oder Milch geeignet. Bevorzugt wird das Verfahren für Plasma-, Blut- oder Serumproben verwendet, wobei die Proben insbesondere als Konserven vorliegen, die zur Verabreichung an andere Personen oder Patienten verwendet werden sollen.
In einem ersten Schritt wird die Probe zur Demaskierung der PrP^Sc Epitope einer Protease-Behandlung unterzogen. Dazu wird das Probenmaterial mit einer Protease, z. B. Proteinase K, versetzt. Für die Protease-Behandlung kann der Probe ein Detergenz bzw. eine Detergenz-haltige Lösung zugegeben werden. Das Detergenz kann ein ionisches, nicht-ionisches oder zwitterionisches Detergenz, wie z. B. Natriumdodecylsulfat (SDS), N-Lauroylsarcosinat, Natrium-Desoxycholat, Octylglucosid, Nonidet P-40, Triton X-100, Tween 20 oder 80, CHAPS, Zwittergent 3–14 sein. Bevorzugt ist die Zugabe von SDS oder Natrium-Desoxycholat in einer Endkonzentration im Bereich von etwa 0,1% bis etwa 10% in der Probe, insbesondere in einer Endkonzentration von etwa 1% SDS oder Natrium-Desoxycholat in der Probe. Der Protease-Verdau kann bei Standardbedingungen für die jeweilige Protease oder nach Angaben des Herstellers, vorzugsweise bei 37°C für 10 min durchgeführt werden. Die verwendete Enzymkonzentration kann je nach Probenmaterial im Bereich von etwa 10 μg/ml bis etwa 1000 μg/ml liegen, vorzugsweise werden etwa 800 μg/ml Enzym verwendet. Der Proteinase K-Verdau kann vorzugsweise bei 900 rpm in einem Thermomixer durchgeführt werden. Anschließend wird die Reaktion vorzugsweise durch sofortige Inkubation bei 95°C für 10 min abgestoppt.
In einem zweiten Schritt wird PrP^Sc mittels einer Immunpräzipitation (IP) angereichert. Für die Anreicherung wird ein fester Träger mit einem Antikörper gekoppelt, der spezifisch gegen PrP gerichtet ist. Als feste Träger werden vorzugsweise magnetische Beads, aber auch beispielsweise Beads bestehend aus Agarose, Sepharose oder Acryl, verwendet. Vorzugsweise werden Bruker MB-IAC ProtG, Bruker MBCovAC Select, Pierce Magnabind Protein A, Pierce Magnabind Protein G oder Dynabeads Protein A oder G für die Immunpräzipitation verwendet. Die an den festen Träger gekoppelten Antikörper können kommerziell erhältliche anti-PrP-Antikörper sein, wie z. B. WD3C7 von Biodesign International, F89/160.1.5 von Calbiochem, Klone SAF von Cayman Chemical, C-C2 von Priontype, 3F4 von Chemicon oder Dako, 6H4 und 34C9 von Prionics. Vorzugsweise werden WD3C7 oder 6H4 durch einen Crosslinker kovalent an die vorstehend aufgeführten festen Träger gekoppelt.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können 500 μl bis 5 ml Probe z. B. mit 10 μl bis 1 ml anti-PrP-Dynabeads (ca. 1,3 g/cm³; 2,8 μm ± 0,2 μm) für 1 bis 24 h, vorzugsweise etwa 2 h rotierend inkubiert werden. Anschließend können die Beads mit PBS, insbesondere mit 0,5 ml gewaschen werden, wobei der Waschvorgang etwa 6-mal, insbesondere 4-mal wiederholt werden kann. Das an Dynabeads gebundene PrP^Sc kann anschließend mit 10 μl bis 100 μl, vorzugsweise mit 30 μl einer Detergenz-haltigen gepufferten Lösung, vorzugsweise 1% Na-Desoxycholat in PBS bei 65°C bis 100°C, vorzugsweise bei 95°C für 5 min bis 15 min, insbesondere für 10 min eluiert werden.
In einem dritten Schritt wird das eluierte PrP^Sc mittels einer Immuno-PCR mit einem gegen PrP^Sc gerichteten Antikörper nachgewiesen. Der Antikörper ist dabei mit einer DNA gekoppelt, die in einer nachfolgenden Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert wird. Das Verfahren des Nachweises eines Agens mit Hilfe der Immuno-PCR ist dem Fachmann bekannt und bereits in US 5,665,539 beschrieben. Die mit dem Antikörper verbundene Nukleinsäure kann dabei frei gewählt werden. Vorzugsweise wird eine Nukleinsäure verwendet, die entweder vollständig künstlich ist oder die natürlicherweise in der Probe, in dem das Agens nachgewiesen werden soll, nicht vorhanden ist. Soll zum Beispiel das Agens, hier insbesondere PrP^Sc, in einer menschlichen Probe nachgewiesen werden, so wird als zu amplifizierende DNA selbstverständlich keine menschliche DNA verwendet werden. Die Nukleinsäure kann dabei auf verschiedenste Weise mit dem Antikörper verbunden sein. Ein geeignetes Verfahren beschreibt zum Beispiel die DE 19941756 . Dabei sind sowohl die Antikörper als auch die Nukleinsäuren mit Biotin gekoppelt und werden über ein für Biotin spezifisches Bindemolekül, vorzugsweise Streptavidin miteinander verbunden.
Die Immuno-PCR kann ferner durchgeführt werden, indem die Probe mit einem Träger inkubiert wird, der mit einem Antikörper gegen das nachzuweisende PrP^Sc beschichtet ist. PrP^Sc bindet dann den auf dem Träger befindlichen Antikörper. In einem nachfolgenden Schritt wird dann der mit der DNA markierte zweite Antikörper zugegeben. Dieser zweite Antikörper kann der gleiche Antikörper sein, der auf dem Träger gebunden ist. Dies kann insbesondere dann der Fall sein, falls PrP^Sc mehrere Epitope für diesen Antikörper besitzt. Es kann als markierter Antikörper aber auch ein von dem ersten Antikörper verschiedener Antikörper verwendet werden. Die Antikörper können insbesondere die vorstehend beschriebenen gegen PrP gerichteten Antikörper sein, wobei als Einfangantikörper insbesondere WD3C7 und als mit der Nukleinsäure markierter Antikörper 6H4 eingesetzt werden.
Für eine weitere Sensitivitätssteigerung der Immuno-PCR können den in der Immuno-PCR verwendeten Puffer zusätzliche stabilisierende Komponenten zugesetzt werden. Bei den Komponenten kann es sich um DNA, Proteine, Detergenzien und Chelat-bildende Stabilisatoren handeln.
Überraschend ist hierbei der Effekt, dass die einzelnen Komponenten sich dabei unterstützend ergänzen, so dass eine Kombination dieser Komponenten zu einer deutlichen Effizienzsteigerung der IPCR führt. Bei der verwendeten DNA handelt es sich hierbei bevorzugt um Gemische einer Vielzahl von DNA-Sequenzen, insbesondere um Präparationen von DNA-Gemischen für die Molekularbiologie beispielsweise aus Fischen, insbesondere Fischsperma DNA. Vorzugsweise wird für die den Puffer und Lösungen der Immuno-PCR zugesetzten DNA ein Gemisch aus verschiedenen genomischen DNAs verwendet. Dabei liegt die DNA vorzugsweise geschert vor. Für die verwendeten Proteine sind ebenfalls Proteingemische wie beispielsweise Milchpulver bevorzugt, um ein möglichst breites Angebot an Wechselwirkungsmöglichkeiten abzudecken. Als Detergenzien sind nicht-ionische Detergenzien wie beispielsweise die Moleküle der Tween-Familie (Tween 20, Tween 80) bevorzugt, als Chelatbildner erfolgt bevorzugt die Zugabe von EDTA zu den verwendeten Puffer mit Ausnahme des PCR-Puffers. In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung der experimentellen Bedingungen erfolgt daher die Verwendung eines einheitlichen Puffersystems basierend auf 20 mM Tris/HCl pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.1% Tween 20, 2.5% Magermilchpulver, 0,5 mg/ml DNA als Grundlage für alle verwendeten Wasch-, Blockierungs-, Verdünnungs- und Lagerungspuffer in der IPCR.
In der Praxis wird der für die Immuno-PCR verwendete Träger wie z. B. Membranen aus Nitrocellulose oder Polyvinyldifluorid, Nylon, Beads, oder PCR-Röhrchen, Kunststoff aus Polymeren wie Polypropylen, Polycarbonat, Polystyrol, z. B. eine Mikrotiterplatte wird mit einer Lösung beschichtet, die die spezifischen Antikörper enthält. Die Bindung der Fangmoleküle erfolgt durch Adsorption an die Oberfläche der festen Phase oder durch chemische Kopplungsmethoden, um Proteine an feste Träger zu binden. Vorzugsweise wird ein PrP-spezifischer Antikörper in einer Konzentration von 1–10 μg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,6, oder 50 mM Borsäure, pH 9,5 über Nacht durch Absorption an eine Plastikoberfläche, vorzugsweise eine Mikrotiterplatte gebunden. Anschließend wird die Antikörperlösung durch mehrmaliges Waschen der Mikrotiterplatte, vorzugsweise 3-mal, entfernt; dabei wird eine physiologische Salzlösung, vorzugsweise PBS, mit einem Detergenz, vorzugsweise einem nichtionischen Detergenz, vorzugsweise Tween-20, in einer Konzentration von 0,01 bis 1%, vorzugsweise 0,05% verwendet. Danach wird die Oberfläche mit einer proteinhaltigen Lösung abgesättigt, dabei können kommerzielle Reagentien, wie Stabilcoat oder Stabilguard von Surmodics, Superblock von Pierce oder das vorstehend genannte einheitliche Puffersystem oder selbst hergestellte proteinhaltige gepufferte Lösungen, wie BSA oder Casein (ca. 3–5%) in PBS oder DNA-Präparationen in gepufferten Lösungen, z. B. DNA-Fragmente aus Fischsperma eingesetzt werden. Die Inkubationszeit für die Absättigung beträgt zwischen 30 Minuten und 5 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bei Raumtemperatur. Danach wird die Lösung verworfen.
Anschließend wird die Probe mit der festen Phase zwischen 30 Minuten und 5 Stunden, vorzugsweise 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Aufbereitung von PrP^Sc aus Körperflüssigkeiten und zur Detektion von PrP^Sc. Erfindungsgemäß enthält das Kit die benötigten Reagenzien, Enzyme und Antikörper-beschichteten Platten. Das Kit enthält insbesondere einen detergenzhaltigen Puffer, eine Protease in fester Form oder in Lösung, eine oder mehrere Testplatten beschichtet mit anti-PrP Antikörper, Probenverdünner (PEST), eine Negativkontrolle, eine Positivkontrolle, Puffer A vorzugsweise als Konzentrat, Puffer B vorzugsweise als Konzentrat, Konjugatverdünner, Konjugat, PCR-Mastermix.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Protease-Behandlung
Es wird vermutet, dass PrP durch prominente Proteine im Blut (möglicherweise Chaperone, Albumin, Immunglobuline) maskiert wird und molekulare Wechselwirkungen mit PrP dadurch unterbunden werden (Telling et al., 1995; DebBurman et al., 1997). Zunächst wurde gezeigt, dass PrP in Serum oder Plasma maskiert vorliegen kann. In sogenannten Spiking-Experimenten wurde Serum oder Plasma mit Hirnhomogenat oder recPrP versetzt, um PrP-haltige Körperflüssigkeiten zu simulieren. Dazu wurden 100 μl Serum mit 10 μl 10%-igem Hirnhomogenat eines BSE-positiven Rindes gespikt und die Probe geteilt. Eine Hälfte wurde nicht behandelt, eine Hälfte mit 100 μg/ml Proteinase K für 37°C bei 10 Minuten inkubiert. Zur Demaskierung der PrP-Epitope wurden 500 μl Serum mit SDS versetzt, so dass die Endkonzentration bei 1% SDS lag. Beide Proben wurden in der SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit dem anti-PrP Antikörper WD3C7 (Biodesign International) analysiert. Die Visualisierung erfolgte durch Chemolumineszenz. In 3 wird deutlich, dass PrP gespikt in Serum (selbst im Gel!) nicht zugänglich für molekulare Wechselwirkungen ist: PrP ist nur nach PK-Verdau mit Antikörpern zu markieren und dadurch zu visualisieren. Für die Detektion von PrP ist es daher nötig, diese dominanten Serumproteine zu entfernen.
Beispiel 2: Sensitivität in Serum/Plasma
RecPrP wurde in verschiedenen Konzentrationen in Serumproben gespikt, die zuvor mit Proteinase K behandelt wurden, um die gleichen Bedingungen wie unter Beispiel 1 beschrieben zu erhalten. Diese Proben wurden mit den nachstehenden Verfahren analysiert. In 4 ist gezeigt, dass im Serum die Nachweisgrenze von 10 pg/ml recPrP bestätigt wird.
Beispiel 3: Beseitigung prominenter Proteine
Im nächsten Schritt wurde gezeigt, dass unter den gewählten Bedingungen für den Proteinase K Verdau PrP^C entfernt und gleichzeitig PrP^Sc nicht entfernt wird. Dies gilt als essentiell, da suboptimaler PK-Verdau zu falsch positiven oder falsch negativen Ergebnissen führen kann.
Dazu wurde BSE-positives Hirnhomogenat mit verschiedenen PK-Konzentrationen (25–800 μg/ml) 10 min bei 37°C behandelt. Auch hier wurde zur Demaskierung der PrP-Epitope 500 μl Serum mit SDS versetzt, so dass die Endkonzentration bei 1% SDS lag. Die Proben wurden geteilt, durch SDS-PAGE aufgetrennt und im Western Blot mit zwei verschiedenen anti-PrP Antikörpern analysiert (5).
5A zeigt, dass PrP^Sc bei allen gewählten Proteinase K-Konzentrationen nachweisbar bleibt. Hier wurde als Detektionsantikörper ein anti-PrP Antikörper mit Epitop in der Proteinase K-resistenten Region des Prion-Proteins verwendet (mAb WD3C7). PrP^Sc ist unter den gewählten Bedingungen stabil. 5B zeigt, dass in denselben PK-behandelten Proben PrP^C komplett verdaut ist. Hier wurde ein anti-PrP Antikörper (C-C2 von Priontype, Deutschland) mit Epitop in der Proteinase K-labilen Region des Prion-Proteins verwendet.
Beispiel 4: Immunpräzipitation
Durch Immunpräzipitation (IP) können Proteine aus größeren Volumina angereichert werden. Diese Aufkonzentrierung ermöglicht in Abhängigkeit vom verwendeten Antikörper eine hundert- bis tausendfache Sensitivitätssteigerung. Zunächst wurde der gereinigte mAb WD3C7 (Biodesign International) nach Angaben des Herstellers durch einen Linker an Dynabeads Protein G gekoppelt. Nicht gekoppelter freier Antikörper wurde durch mehrere Waschschritte entfernt. Nach der gleichen Vorschrift wurden zwei irrelevante mAbs zur Herstellung von Kontrollmatrices für die Kontrolle der IP an die Dynabeads gekoppelt. Hier wurde in keinem Fall PrP präzipitiert.
Im Anschluss an den wie in Beispiel 1 beschriebenen PK-Verdau wurde 500 μl Serum mit 10 μl WD3C7-Beads versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur rotiert. Anschließend wurde 4-mal mit PBS gewaschen. Die Elution von gebundenem PrP wurde mit 30 μl Natrium-Desoxycholat (1% in PBS; 10 min, 95°C) durchgeführt. Dieses Eluat wurde in der IPCR analysiert. 6 zeigt den Vergleich der Signalstärke von vCJD-positivem Hirnhomogenat gespikt in Plasma mit und ohne Anreicherung durch IP. Ohne IP wurde eine Verdünnung von 1:1000 detektiert, mit IP dagegen wurde selbst die 1:100000-Verdünnung eindeutig als positiv bestimmt. Die IP kann daher die nachgewiesene Menge PrP um Faktor 100 steigern.
Beispiel 5: Immuno-PCR
Für die Durchführung der Immuno-PCR wurden Nunc^TM Top-Yield^TM Streifen über Nacht bei 4°C mit Antikörperlösung (30 μl/Well; 5 μg/ml 6H4 (Prionics) in 35 mM NaHCO₃/15 mM Na₂CO₃, pH 9,6 oder in 50 mM Borsäure, pH 9,5 beschichtet. Im Anschluss wurden die Platten 3 × 1 min mit 240 μl/Well Waschpuffer A (Kat. Nr. 23-004, Chimera, Deutschland) gewaschen und dann 1 h bei RT mit 200 μl/Well Blockierungslösung (150 mM NaCl, 20 mM Tris, 4,5% Magermilchpulver (Oxoid), 1 mg/ml DNA MB-grade, cat.-no. 114671490001, Roche, Mannheim, Deutschland), 5 mM EDTA (Sigma, Deutschland)) oder 200 μl/Well Stabilguard (Surmodics, USA) nach Angaben des Herstellers inkubiert. Die Blockierungslösung wurde abgesaugt.
Für die IPCR wurden Kontrollen (Verdünnungsreihe recPrP als Standard und Positivkontrolle, PBS/0,05% Tween 20 als Negativkontrolle) und je 30 μl vorbereitete Proben auf der anti PrP-mAb-beschichteten Mikrotiterplatte inkubiert. Diese Primärinkubation erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur und 600 rpm. Es folgten Waschschritte 2 × 30 sec und 2 × 4 min mit je 240 μl/Well Waschpuffer B (Kat. Nr. 23-005, Chimera, Deutschland). Anschließend erfolgte die Inkubation mit DNA-gekoppeltem Detektionsantikörper, 45 min bei RT und 600 rpm. Es wurden 30 μl DNA-gekoppelter Detektionsantikörper in einer Konzentration von 1 pmol/ml in einer 1:270 Verdünnung in TBS-Konjugatverdünner (20 mM Tris/HCl pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,09% Tween 20, 0,5% Skim milk powder (LP0031, Oxoid), 0,1 mg/ml DNA (MB grade, cat.-no. 114671490001, Roche, Mannheim, Deutschland) eingesetzt. Es folgten Waschschritte 4 × 30 sec, 4 × 4 min und 3 × 1 min mit 240 μl/Well Waschpuffer B (Kat. Nr. 23-005, Chimera, Deutschland). Zum Start der PCR wurden je 30 μl/Well PCR-Mastermix (16 mM (NH₄)₂SO₄; 67 mMTris-HCl (pH 8 bei 25°C); 0,01% Tween 20; 1,5 mM MgCl₂; 0,5 mg/ml BSA; 0,2 mM dNTPs (e. a.); 0,2 μM TaqMan- oder Scorpions-Sonde; 1 pmol/μl primer (each); 0,05 U/μl Taq) zupipettiert. Der verwendete Mastermix von Chimera Biotech enthielt bereits die zur Amplifikation benötigten Primer in der geeigneten Konzentration sowie die für eine PCR üblichen Puffersubstanzen und Nukleotide.
Die PCR wird wie folgt durchgeführt:

Temperatur Dauer Wiederholungen

95°C 5 min 1×

50°C 30 s Messung am Ende dieses Schrittes

72°C 30 s 40×

95°C 20 s
Zur Auswertung wird der von der real-time PCR-Software ermittelte Ct-Wert herangezogen. Der Ct-Wert entspricht dem Zyklus, in dem das Fluoreszenz-Signal einen bestimmten Schwellenwert übersteigt. Da der Ct-Wert umgekehrt proportional zur Menge der Marker-DNA und damit auch zur Menge PrP ist, wird zur Quantifizierung der ΔCt-Wert wie folgt berechnet: ΔCt = Gesamtzyklenzahl (40) – Ct
Für die Quantifizierung wird ΔCt der Verdünnungsreihe gegen den dekadischen Logarithmus der Konzentration aufgetragen. Die durch lineare Regression ermittelte Gleichung wird zur Quantifizierung der Konzentration unbekannter Proben herangezogen.
Beispiel 6: Sensitivitätsvergleich des klassischen ELISA mit der entwickelten Methode
Um die Sensitivitäten des klassischen ELISA und der Immuno-PCR zu vergleichen, wurde recPrP in PEST in mehreren Schritten verdünnt und im klassischen ELISA analysiert. Parallel dazu wurde diese Verdünnungsreihe in dem Verfahren untersucht. Dazu wurden Nunc^TM Top-Yield^TM Streifen über Nacht bei 4°C mit Antikörperlösung wie in Beispiel 5 beschrieben beschichtet.
Die Detektion des gebundenen recPrP erfolgt über die Zugabe des DNA-gekoppelten Antikörpers WD3C7 und der Durchführung der IPCR wie in Beispiel 5 angegeben. 2 verdeutlicht die hohe Sensitivität des entwickelten Verfahrens anhand von Vergleichsdaten mit dem klassischen ELISA (gleiche Antikörperkombination mit kolorimetrischem Nachweis). Es sind die S/P-Quotienten beider Messmethoden gezeigt. Im konventionellen ELISA werden 100 ng/ml, in dem Verfahren 10 pg/ml detektiert. Das bedeutet eine 10000-fach höhere Sensitivität des Verfahrens im Vergleich zum ELISA.
Beispiel 7: Validierung

Die Eignung des Verfahrens zum Nachweis von PrP^Sc in Körperflüssigkeiten wurde anhand von Blindproben validiert. Dazu wurden Blindproben vom CJD Resource Centre des NIBSC (UK) untersucht, die erst nach Testung und Ergebnisübermittlung von der Behörde entschlüsselt wurden. Diese 22 Plasmaproben wurden vom NIBSC mit verschiedenen Mengen an Hirnhomogenat von vCJD-Patienten versetzt. Die Proben wurden mit Proteinase K verdaut, PrP durch IP angereichert und in der IPCR analysiert. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse der Aufarbeitung mit und ohne IP dargestellt. Die 1:100000-Verdünnung wird in der Probenvorbereitung mit IP als richtig positiv erkannt; dies entspricht einem Nachweis von 0,00024 nl 10-prozentigem Hirnhomogenat. Alle negativen Proben waren richtig negativ (n = 4, nicht gezeigt).

vCJD Hirnhomogenat in Plasma	Verfahren
	ohne IP		mit IP
1:100 1:1000 1:10000 1:100000 1:1000000	☑ ☑ ☒ ☒ ☒	richtig positiv richtig positiv negativ negativ negativ	☑ ☑ ☑ ☑ ☒	richtig positiv richtig positiv richtig positiv richtig positiv negativ

Tab. 1: Detektion von vCJD-positivem Hirnhomogenat gespikt in Plasma im Verfahren

Beispiel 8:
Die Spezifität des etablierten Verfahrens wurde durch Testung von Plasmaproben gesunder Probanden sowie von Alzheimer-Patienten überprüft. Alle 375 Proben wurden richtig negativ diagnostiziert. Das Verfahren besitzt eine Spezifität von 100%.

Verfahren

positiv negativ

Alzheimer-Patienten Gesunde Probanden 0 0 28 347

Gesamt 0 375

Tab. 2: Spezifität des Verfahrens
Beispiel 9: Übersicht über die Leistungsfähigkeit verschiedener Methoden zur Detektion von vCJD-Hirnhomogenat

Referenzmaterial der "WHO Working Group an International Reference Materials for the Diagnosis and Study of Transmissible Spongiform Encephalopathies" wurde mit verschiedenen Methoden in verschiedenen Laboren analysiert (Minor et al., 2004). Das Verfahren detektiert die geringste Menge vCJD-Hirnhomogenat (0,00024 nl, Tab. 3).

Labor	Methode	μl Hirnhomogenat (vCJD) detektiert
1 2 3 4 5 6 7a 7b PRIONTYPE PRIONTYPE	Western Blot (3F4) Western Blot (3F4) Western Blot (6H4) Western Blot (3F4) Western Blot (3F4) Western Blot (6H4) CDI CDI Immuno-PCR Immunpräzipitation + Immuno-PCR	0,091 0,20 0,60 0,067 0,25 0,18 0,076 0,00098 0,024 0,00024

Tab. 3: Übersicht über Methoden zur hochsensitiven Detektion von PrP

Literatur

Barletta J. M., Edelman D. C., Highsmith W. E., Constantine N. T. (2005) Detection of ultra-low levels of pathologic prion Protein in scrapie infected hamster brain homogenates using real-time immuno-PCR. J. Virol. Methods. 127, 154
Bellon A., Seyfert-Brandt W., Lang W., Baron H., Groner A., Vey M. (2003) Improved conformation-dependent immunoassay: suitability for human prion detection with enhanced sensitivity. J. Gen. Virol. 84, 1921
Bieschke J., Giese A., Schulz-Schaeffer W., Zerr I., Poser S., Eigen M., Kretzschmar H. (2000) Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 5468
Castilla J., Saa P., Soto C. (2005) Detection of prions in blood. Nat. Med. 11, 982
DebBurman S. K., Raymond G. J., Caughey B., Lindquist S. (1997) Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13938
Gofflot S., Deprez M., el Moualij B., Osman A., Thonnart J. F., Hougrand O., Heinen E., Zorzi W. (2005) Immunquantitative PCR for prion protein detection in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Clin Chem. 51, 1605
Minor P., Newham J., Jones N., Bergeron C., Gregori L., Asher D., van Engelenburg F., Stroebel T., Vey M., Barnard G., Head M.; WHO Working Group on International Reference Materials for the Diagnosis and Study of Transmissible Spongiform Encephalopathies. (2004) Standards for the assay of Creutzfeldt-Jakob disease specimens. J. Gen. Virol. 85, 1777
Saa P., Castilla J., Soto C. (2006) Presymptomatic detection of prions in blood. Science 313, 92
Sano T., Smith C. L., C.R. Cantor C.R. (1992) Immun-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science, 258, 120
Schmerr M. J., Jenny A. L., Bulgin M. S., Miller J. M., Hamir A. N., Cutlip R. C., Goodwin K. R. (1999) Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with a transmissible spongiform encephalopathy. J. Chromatogr. A. 853, 207
Soto C., Anderes L., Suardi S., Cardone F., Castilla J., Frossard M. J., Peano S., Saa P., Limido L., Carbonatto M., Ironside J., Torres J. M., Pocchiari M., Tagliavini F. (2005) Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding. FERS Lett. 579, 638
Telling G. C., Scott M., Mastrianni J., Gabizon R., Torchia M., Cohen F. E., DeArmond S. J., Prusiner S. B. (1995) Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79
Zhou, H., Fisher, R. J., Papas, T. S. (1993): Universal Immuno-PCR for Ultra-Sensitive Target Protein Detection, Nucleic Acids Res, 21, 6038–6039.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

- US 5665539 [0028]
- DE 19941756 [0028]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

- Castilla et al., 2005 [0006]
- Soto et al., 2005 [0006]
- Saa et al., 2006 [0006]
- Schmerr et al., 1999 [0007]
- Zeiss; Bieschke et al., 2000 [0007]
- Bellon et al., 2003 [0008]
- Gofflot et al. (2005) [0011]
- Barletta et al. (2005) [0012]
- Telling et al., 1995 [0036]
- DebBurman et al., 1997 [0036]
- Minor et al., 2004 [0052]
- Barletta J. M., Edelman D. C., Highsmith W. E., Constantine N. T. (2005) Detection of ultra-low levels of pathologic prion Protein in scrapie infected hamster brain homogenates using real-time immuno-PCR. J. Virol. Methods. 127, 154 [0052]
- Bellon A., Seyfert-Brandt W., Lang W., Baron H., Groner A., Vey M. (2003) Improved conformation-dependent immunoassay: suitability for human prion detection with enhanced sensitivity. J. Gen. Virol. 84, 1921 [0052]
- Bieschke J., Giese A., Schulz-Schaeffer W., Zerr I., Poser S., Eigen M., Kretzschmar H. (2000) Ultrasensitive detection of pathological prion protein aggregates by dual-color scanning for intensely fluorescent targets. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 5468 [0052]
- Castilla J., Saa P., Soto C. (2005) Detection of prions in blood. Nat. Med. 11, 982 [0052]
- DebBurman S. K., Raymond G. J., Caughey B., Lindquist S. (1997) Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 13938 [0052]
- Gofflot S., Deprez M., el Moualij B., Osman A., Thonnart J. F., Hougrand O., Heinen E., Zorzi W. (2005) Immunquantitative PCR for prion protein detection in sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Clin Chem. 51, 1605 [0052]
- Minor P., Newham J., Jones N., Bergeron C., Gregori L., Asher D., van Engelenburg F., Stroebel T., Vey M., Barnard G., Head M.; WHO Working Group on International Reference Materials for the Diagnosis and Study of Transmissible Spongiform Encephalopathies. (2004) Standards for the assay of Creutzfeldt-Jakob disease specimens. J. Gen. Virol. 85, 1777 [0052]
- Saa P., Castilla J., Soto C. (2006) Presymptomatic detection of prions in blood. Science 313, 92 [0052]
- Sano T., Smith C. L., C.R. Cantor C.R. (1992) Immun-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science, 258, 120 [0052]
- Schmerr M. J., Jenny A. L., Bulgin M. S., Miller J. M., Hamir A. N., Cutlip R. C., Goodwin K. R. (1999) Use of capillary electrophoresis and fluorescent labeled peptides to detect the abnormal prion protein in the blood of animals that are infected with a transmissible spongiform encephalopathy. J. Chromatogr. A. 853, 207 [0052]
- Soto C., Anderes L., Suardi S., Cardone F., Castilla J., Frossard M. J., Peano S., Saa P., Limido L., Carbonatto M., Ironside J., Torres J. M., Pocchiari M., Tagliavini F. (2005) Pre-symptomatic detection of prions by cyclic amplification of protein misfolding. FERS Lett. 579, 638 [0052]
- Telling G. C., Scott M., Mastrianni J., Gabizon R., Torchia M., Cohen F. E., DeArmond S. J., Prusiner S. B. (1995) Prion propagation in mice expressing human and chimeric PrP transgenes implicates the interaction of cellular PrP with another protein. Cell 83, 79 [0052]
- Zhou, H., Fisher, R. J., Papas, T. S. (1993): Universal Immuno-PCR for Ultra-Sensitive Target Protein Detection, Nucleic Acids Res, 21, 6038–6039 [0052]

Claims

Verfahren zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrP^Sc) in humanen Körperflüssigkeiten, umfassend die Schritte, a) Inkubieren einer isolierten Probe der zu untersuchenden Körperflüssigkeit mit einer Protease, und anschließend b) Immunpräzipitation zur Anreicherung von PrP^Sc, und anschließend c) Nachweis des in Schritt b) erhaltenen PrP^Sc mittels Immun-PCR.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Protease in Schritt a) Proteinase K ist und in einer Konzentration im Bereich von etwa 10 μg/ml bis etwa 1000 μg/ml, insbesondere mit einer Konzentration von 800 μg/ml in der Probe vorliegt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubation in Schritt a) in Gegenwart eines Detergenz beispielsweise SDS, N-Lauroylsarcosinat, Natrium-Desoxycholat, Octylglucosid, Nonidet P-40, Triton X-100, Tween, CHAPS, Zwittergent 3–14 durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Körperflüssigkeit Liquor, Blut, Plasma oder Serum ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) der feste Träger für die Immunpräzipitation Bruker MB-IAC ProtG, Bruker MBCovAC Select, Pierce Magnabind Protein A, Pierce Magnabind Protein G oder Dynabeads Protein A oder G ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt b) der Einfangantikörper bei der Immunpräzipitation WD3C7 von Biodesign International, F89/160.1.5 von Calbiochem, Klone SAF von Cayman Chemical, C-C2 von Priontype, 3F4 von Chemicon oder Dako, oder 6H4 oder 34C9 von Prionics ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt c) die Immuno-PCR in Gegenwart stabilisierender Komponenten durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die stabilisierenden Komponenten DNA, Proteine, Detergenzien oder Chelatbildner sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die stabilisierenden Komponenten ein Gemisch aus DNA, Proteinen, Detergenzien oder Chelatbildner sind.
Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, wobei die DNA genomische DNA insbesondere gescherte genomische DNA ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die DNA Fischsperma-DNA ist.
Kit zum Nachweis von pathologisch veränderten Prion-Proteinen (PrP^Sc) enthaltend einen detergenzhaltigen Puffer, Protease, Testplatten beschichtet mit anti-PrP Antikörper, Probenverdünner (PEST), Negativkontrolle, Positivkontrolle, Puffer A (20×-Konzentrat), Puffer B (20×-Konzentrat), Konjugatverdünner, Konjugat, PCR-Mastermix.