DE19941756A1 - Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR - Google Patents
Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCRInfo
- Publication number
- DE19941756A1 DE19941756A1 DE19941756A DE19941756A DE19941756A1 DE 19941756 A1 DE19941756 A1 DE 19941756A1 DE 19941756 A DE19941756 A DE 19941756A DE 19941756 A DE19941756 A DE 19941756A DE 19941756 A1 DE19941756 A1 DE 19941756A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- oligomeric
- nucleic acid
- dna
- protein conjugates
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Komplexen als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren, insbesondere die Immuno-PCR. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate sind eine Gruppe von neuen oligomeren chemischen Strukturen, die hier der Einfachheit halber am Beispiel oligomerer DNA-Streptavidin-Aggregate dargestellt werden (siehe Zeichnung). Durch Umsetzung von mit zumindest zwei Bindemolekülen (z. B. Biotin) markierten DNA-Fragmenten (1) und für das Bindemolekül spezifischen Proteinen (z. B. Streptavidin 2) entstehen oligomere Molekülaggregate. Sie enthalten in ihren Randbereichen freie Bindungsstellen (3), die sich zur Ankopplung von weiteren Bindemolekül-derivatisierten Modulatormolekülen, wie z. B. Antikörpern (4), eignen. Die hierdurch zugänglichen oligomeren Molekülkomplexe eignen sich in vielfältiger Form für den Antigen-Nachweis, insbesondere sind sie bei der Immuno-PCR mit großem Vorteil einsetzbar. Die oligomeren Molekülkomplexe eignen sich als Hilfsmittel zur Signalverstärkung bei biochemisch-analytischen Verfahren zum Nachweis von Antigen, aber auch als definierte molekulare Marker sowie zur hochselektiven Vergrößerung molekularer Massen im Rahmen optischer, bildgebender oder schwingungsabhängiger Methoden. Außerdem kann eine Funktionalisierung der oligomeren Molekülkomplexe durch Umsetzung mit weiteren spezifisch-bindenden Molekülen, wie z. B. DNA-selektiven Diaminoplatinkomplexen (5), erfolgen, ...
Description
Verfahren zur Verknüpfung spezifischer Primärantikörper und Marker-DNA,
um immunologische Nachweisverfahren, insbesondere die Immuno-PCR, als
einfache "Eintopf-Reaktion" durchführen zu können.
Proteine und andere Antigene werden in zahlreichen Verfahren der
biomedizinischen, insbesondere der virologischen Routinediagnostik sowie in
weiten Bereichen der biologischen Forschung mit Hilfe immunologischer Methoden
nachgewiesen. Durch die übliche Kopplung spezifischer Antikörper an
nachgeschaltete biochemische Verstärker-Reaktionen werden mit kommerziellen
Systemen typischerweise Sensitivitäten bis in den Attomol-Bereich (1 amol = 1 ×
10-18 Mol) hinein erreicht. Durch den Einsatz der Polymerase-Kettenreaktion
(PCR) als Verstärker-Reaktion können Proteine neuerdings mit einer
Nachweisgrenze von bis zu 6 × 10-22 Mol erfaßt werden [T. Sano, C. L. Smith, C.
R. Cantor, Science 1992, 258, 120]. Bei dieser sogenannten Immuno-PCR wurde
Rinderserum-Albumin (BSA) als Antigen-Modelsubstanz in Mikrotiterplatten
immobilisiert, mit spezifischen Antikörpern markiert und in einem nachfolgenden
Inkubationsschritt durch Verwendung eines rekombinanten Proteinchimären aus
Protein A und Streptavidin mit einem biotinylierten DNA-Fragment verknüpft. Der
anschließende PCR-Nachweis des immobilisierten DNA-Markers erlaubte die
erwähnte Steigerung der Empfindlichkeit um das etwa 10.000-fache. Dieses
Verfahren war zunächst schwer reproduzierbar, wird aber inzwischen nach einigen
Modifikationen mit großem Erfolg eingesetzt [C. M. Niemeyer, D. Blohm, Nachr.
Chem. Techn. Lab. 1996, 44, 481]. Beispielsweise stellten Zhou et al. 1993 den
signalerzeugenden Komplex in der Immuno-PCR durch sequentielle Inkubation aus
den Einzelkomponenten her, indem an den antigenspezifischen Primärantikörper
zunächst ein biotinylierter Sekundärantikörper, dann Streptavidin und. erst
anschließend daran die biotinylierte Marker-DNA gebunden wurde [H. Zhou, R. J.
Fisher, T. S. Papas, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 6038]. Auf diese Weise kann
die Immuno-PCR zwar mittels kommerziell erhältlichen Reagenzien durchgeführt
werden, jedoch wird ihre Empfindlichkeit aufgrund der vielen Kopplungsschritte
wesentlich verschlechtert und ihre praktische Durchführung sehr erschwert. In
jüngster Zeit wurde gezeigt, daß zum Erreichen maximaler Sensitivität die
Primärantikörper in möglichst wenig Reaktionsschritten mit der Marker-DNA
verknüpft werden sollten [C. M. Niemeyer, M. Adler, D. Blohm, Anal. Biochem.
1997, 246, 140]. Beispielsweise kann dies durch die direkte kovalente
Verknüpfung des Antikörpers mit der Marker-DNA erreicht werden [E. R.
Hendrickson, T. M. Hatfield, T. M. Truby, R. D. Joerger, W. R. Majarian, R. C.
Ebersole, Nucleic Acids Res. 1995, 23, 522]. Nachteilig an letzterem Verfahren ist
allerdings, daß die Herstellung solcher IgG-DNA-Direktkonjugate mit sehr hohem
Kosten- und großem Zeitaufwand verbunden ist, weil einmal hergestellte Konjugate
in Bezug auf Antigenspezifität und DNA-Sequenz festgelegt sind und jede
Anwendung somit die spezielle Synthese eigener Direktkonjugate erfordert.
Stattdessen wird eine Methode benötigt, die es erlaubt, spezifische Primärantikörper
rasch und in präparativ-einfacher Weise mit einem DNA-Marker-Fragment zu
verknüpfen.
Dieses Problem wird durch das in Patentanspruch 1 genannte Verfahren
gelöst, in dem oligomere Molekülkomplexe als Reagenzien zur Markierung
beliebiger spezifischer Primärantikörper verwendet werden.
Grundlage der vorliegenden Erfindung ist die überraschende Beobachtung,
daß die Herstellung der erfindungsgemäßen oligomeren DNA-Protein-Konjugate
hochgradig reproduzierbar verläuft, wenn diese unter geeigneten
Reaktionsbedingungen durch Selbstorganisation aus Bindemolekül-modifizierten
Nucleinsäuren (z. B. Biotin-derivatisierter DNA) und für das Bindemolekül
spezifische Proteine (z. B. Streptavidin) hergestellt werden. Die Voraussetzung
hierfür ist, daß die Nucleinsäuren zumindest an jeweils beiden Enden mit
Bindemolekülen derivatisiert sind, und daß die Proteine zumindest zwei
Bindungsstellen für das Bindemolekül besitzen. Durch geeignete
Reaktionsbedingungen läßt sich erreichen, daß die durch Selbstorganisation
gebildeten DNA-Protein-Komplexe end- oder mittelständige freie Bindungsstellen
aufweisen, an die weitere funktionelle, Bindemolekül-modifizierte
Modulatormoleküle (z. B. Antikörper, Rezeptoren, Haptene, Chromophore,
Metallkolloide etc.) gebunden werden können. Hierdurch werden weitere
Funktionseinheiten an die einmal gebildeten DNA-Protein-Komplexe angekoppelt,
um z. B. eine spezifische Bindung an Zielstrukturen zu erreichen. Auch können
weitere Bindemolekül-modifizierte DNA- oder RNA-Einzelstränge mit komplett
oder partiell homologer oder auch vollständig nicht-komplementärer Sequenz in die
Reaktion eingeführt werden, um oligomere DNA-Protein-Konjugate mit speziellen
Eigenschaften zu erzeugen.
Die erfindungsgemäßen DNA-Protein-Konjugate besitzen aufgrund ihrer
oligomeren Natur einen Verstärker-Effekt, der speziell für Sekundär-Reagenzien
vorteilhaft ist, weil er die anschließenden Signalkaskaden und damit die Sensitivität
des Nachweisverfahrens insgesamt wesentlich zu steigern vermag. Ein weiterer
überraschender Vorteil der oligomeren DNA-Protein-Konjugate ist ihre im
Vergleich zu den Einzelreagenzien stark verminderte unspezifische Bindung an
Reaktionsgefäße sowie an die immobilisierten Proteinbestandteile, offenbar eine
Konsequenz der geringen unspezifischen Adsorptionseigenschaften des
Streptavidins und anderer günstiger Eigenschaften dieser Molekülklasse. Weiterhin
erwiesen sich die erfindungsgemäßen DNA-Protein-Komplexe
überraschenderweise als gut lagerbar, so daß sie als Universalreagenzien für die
Immuno-PCR und andere immunologische Nachweisverfahren deren zuverlässige
Standardisierung und einfach Durchführung erlauben.
Eine vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in Patentanspruch 6
gegeben, in dem die oligomeren DNA-Protein-Komplexe zur Markierung von
Bindemolekül-derivatisiertem Antikörper verwendet werden, der im Zuge einer
Immuno-PCR an Festphasen-immobilisiertes Nachweismolekül bindet. Hierdurch
entfallen langwierige Kopplungsschritte wie sie z. B. in der Immuno-PCR-Technik
nach Zhou et al. notwendig sind. Zusätzlich ergibt sich wegen der oligomeren
Natur der DNA-Protein-Komplexe ein beachtlicher Verstärkereffekt.
Eine weitere vorteilhafte Ausgestaltung der Erfindung ist in Patentanspruch
12 gegeben, in dem die oligomeren DNA-Protein-Komplexe zunächst
beispielsweise mit einem Antikörper modifiziert werden. Das so erhaltene
supramolekulare Aggregat bindet direkt an Festphasen-immobilisiertes
Nachweismolekül, ohne daß aufwendige multiple Kopplungsschritte erforderlich
sind. Vorteilhaft sind hierbei neben der einfachen experimentellen Handhabung und
des Verstärkereffektes vor allem die geringe Tendenz des oligomeren DNA-Protein-
Konjugates, unspezifisch an die Oberflächen der Reaktionsgefäße zu binden. Der
Nachweis des Immunkomplexes kann direkt mittels PCR-Technik erfolgen.
Alternativ kann die durch die Bindung des oligomeren Komplexes vergrößerte
Masse oder weitere am oligomeren Komplex gebundene Funktionseinheiten, z. B.
Fluorophore, zum Nachweis herangezogen werden.
Doppelt biotinylierte DNA wird durch PCR unter Verwendung zweier 5'-Biotin-
markierter Primer hergestellt (Abb. 1). Das doppelt markierte PCR-Produkt wird
über Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt und im Anschluß durch
Ultrafiltration oder durch Fällung konzentriert. Die so erhaltene DNA wird als etwa
1 µM Stammlösung bei -20°C aufbewahrt. Zur Synthese der oligomeren DNA-
Protein-Konjugate werden jeweils 2 µL dieser Stammlösung mit 18 µL 10 mM
Tris-Puffer, pH 7.5, verdünnt und mit 2 µL Streptavidin-Lösung im
Konzentrationsbereich zwischen 0.5 bis 50 µM, gelöst in 10 mM Tris-Puffer, pH
7.5, gemischt und vorzugsweise über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Inkubationszeit
kann aber in weiten Zeiträumen von Minuten bis hin zu mehreren Wochen variiert
werden, um die Ausbeuten einzelner Konjugatcluster-Fraktionen zu verändern.
Proben der Inkubationslösungen werden auf einem 2%-Agarose-Gel bei 100 V
elektrophoretisch getrennt. Nach Anfärbung der DNA-Banden mit 0.05 µg/ml
Ethidiumbromid lassen sich unter UV-Licht die charakteristischen Banden der
Konjugatcluster erkennen (Abb. 2). In Spur 1 (100 Moläquivalente Streptavidin pro
DNA) ist ein Fingerabdruck-ähnliches Bandenmuster zu erkennen, das die
verschiedenen oligomeren DNA-STV-Konjugate repräsentiert. Während bei
Überschuß an STV-Konjugate von vergleichsweise geringem Molekulargewicht
entstehen, werden durch Verringerung des STV-Überschusses oligomere Konjugate
mit hohem Molekulargewicht gebildet (Abb. 2, Spuren 3-5). In Gegenwart von
ausgewogenen Moläquivalenten zwischen Streptavidin und DNA bilden sich
nahezu ausschließlich hochmolekulare Konjugatcluster jenseits des
Molekulargewichtes von 12.2 Kilobasen (Abb. 2, Spur 4).
Doppelt biotinylierte DNA von nahezu beliebiger Länge, vorzugsweise jedoch 100
bis 1000 Basenpaare lang wird durch PCR unter Verwendung Biotin-markierter
Vorstufen, wie Biotin-markierter Nucleotide oder Biotin-markierter Primer
hergestellt. In der Praxis hat sich die Verwendung 5-Biotin-markierter Primer
bewährt. Alternativ können für die Synthese der biotinylierten DNA auch
enzymatisch oder chemisch-synthetisch hergestellte, Biotin-markierte,
einzelsträngige Nucleinsäurefragmente eingesetzt werden. Das Biotin-derivatisierte
Nucleinsäure-Produkt wird isoliert, beispielsweise über Ionenaustausch-
Chromatographie (MonoQ, Pharmacia) gereinigt und gegebenenfalls durch
Ultrafiltration aufkonzentriert, so daß sie, wie oben erwähnt, überlicherweise als
etwa 1 µM Stammlösung bei -20°C aufbewahrt werden kann. Die Herstellung
präparativer Mengen von oligomeren DNA-Protein-Konjugaten erfolgt je nach
gewünschter Maßstabsvergrößerung unter Beibehaltung des in Beispiel 1
dargestellten Syntheseprotokolls bei einem molaren DNA:STV-Verhältnis von 1 : 2.
Während der Inkubation, die vorzugsweise über Nacht bei 4°C erfolgt, bilden sich
oligomere DNA-STV-Konjugate, die durch Gelfiltration über eine Superdex-200-
Säule (Ausschlußvolumen von 600 kDa, Pharmacia) gereinigt werden. Sie eluieren
im Totvolumen der Säule (Abb. 3a). Stammlösungen, vorzugsweise in der
Konzentration von etwa 60 pM, werden mittels Ultrafiltration hergestellt und
können bei -20°C stabil gelagert werden. Alternativ können die erzeugten
oligomeren DNA-STV-Konjugate vor oder nach der Aufreinigung auch mit
biotinylierten Bindungsproteinen (Modulatoren) modifiziert und auf diese Weise
zusätzlich funktionalisiert werden. Hierzu fügt man dem beschriebenen Ansätzen
etwa 10 Moläquivalente Biotin-markierten Modulator hinzu, beispielsweise
biotinylierten Antikörper, und inkubiert mindestens eine Stunde bei 4°C. Die
Isolierung und Lagerung dieser oligomeren DNA-STV-Konjugate erfolgt in gleicher
Weise wie oben beschrieben.
Oligomere DNA-STV-Konjugate werden beispielsweise auf Basis eines doppelt
biotinylierten 450- bp-DNA-Fragments wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben
hergestellt, jedoch wird anstelle der Aufreinigung eine Funktionalisierung mit
Biotin derivatisierten Komponenten vorgenommen. Dabei können so
verschiedenartige Proteine eingesetzt werden wie z. B. Immunglobuline, Rezeptoren
oder Enzyme, aber auch Nucleinsäuren in Form von Desoxyribo-oligonucleotiden
oder Ribooligonucleotiden oder synthetischen Nucleinsäure-Derivaten nahezu
beliebiger Größe, niedermolekulare Verbindungen wie organische Haptene, Mono-,
Oligo- oder Polypeptide, Mono-, Oligo- oder Polysaccharide oder anorganische
oder organische Partikel wie Metallcluster und -kolloide, Vesikel oder Micellen. Im
vorliegenden Beispiel werden die oligomeren DNA-STV-Konjugate durch
Umsetzung mit Biotin-markiertem, gegen Kaninchen-IgG gerichtetes
Immunglobulin (IgG) von der Ziege funktionalisiert. Hierzu werden üblicherweise
etwa 10 Moläquivalente, bezogen auf die eingesetzte Menge an STV, in besonderen
Fällen aber auch weniger als ein bis mehr als 1000 Moläquivalente zum Rohprodukt
des oligomeren DNA-STV-Konjugates gegeben. Die Inkubationszeit reicht je nach
Modulator-Komponente über Zeiträume von einer Minute bis hin zu mehreren
Wochen, wird jedoch üblicherweise für eine Stunde bei 4°C durchgeführt. Im
vorliegen Fall werden 30 µL einer 2-µM-Lösung von Biotin-markiertem anti-
Kaninchen-IgG (Pharmingen) zum zuvor wie oben beschrieben hergestellten
oligomeren DNA-STV-Konjugate gegeben und für eine Stunde bei 4°C inkubiert.
Die entstandenen funktionalisierten oligomeren DNA-Protein-Konjugate werden
durch Standardmethoden auf Basis von Filtration, Dialyse, Chromatographie oder
Elektrophorese, die dem Fachmann vertraut sind, vorzugsweise jedoch im 50-mM-
Kaliumphosphat, pH 7.4, Puffer über die in Beispiel 2 beschriebene
Gelfiltrationschromatographie gereinigt (Abb. 3b), durch Ultrafiltration oder andere
äquivalente Verfahren aufkonzentriert und als Stammlösungen bei -20°C
aufbewahrt.
Als Antigen, das in diesem Fall mit Hilfe der Immuno-PCR nachgewiesen werden
soll, dient IgG des Kaninchens. Dieses Antigen wird in üblicherweise in 1 : 10
Verdünnungsschritten auf Mikrotiterplätten immobilisiert und durch Zugabe eines
biotinylierten anti-Kaninchen-IgG aus Ziege als Primärantikörper markiert. Von der
Stammlösung der oligomeren DNA-STV-Konjugate, wie sie unter Beispiel 2
hergestellt wurde, werden in Reaktionspuffer D Verdünnungen von 1 : 500
hergestellt und den Ansätzen 50-µL-weise hinzugefügt. Anschließend wird die
Immuno-PCR wie üblich durchgeführt. Zu Vergleichszwecken werden im
parallelen Ansatz Streptavidin und biotinylierte DNA sukzessive an den
biotinylierten Primärantikörper gekoppelt (Abb. 4A). Die PCR-Amplifikation der
DNA und die quantitative Bestimmung der Amplifikate erfolgen mittels PCR-
ELISA, wie beschrieben. Aus Abb. 4A ist klar erkennbar, daß der Signalverlauf bei
Verwendung der oligomeren DNA-STV-Konjugate im Vergleich zur sequentiell
durchgeführten Immuno-PCR mit einer mehr als 10-fachen Sensitivitätssteigerung
einhergeht. Dies ist zum einen auf den Verstärkereffekt durch die Bindung
oligomerer DNA-Streptavidin-Konjugatcluster und zum anderen auf eine
verminderte unspezifische Bindung der Cluster zurückzuführen.
Die Immuno-PCR mit Maus-IgG als nachzuweisendes Antigen wird im
wesentlichen wie im Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Nach Markierung des
fixierten Antigens mit einem als Primärantikörper dienenden anti-Maus-IgG des
Kaninchens werden oligomere DNA-STV-Konjugate an diesen Primärantikörper
gekoppelt, die mit biotinyliertem anti-Kaninchen IgG-funktionalisiert worden
waren. Üblicherweise wird dieses Sekundärreagenz, das wie unter Beispiel 3
beschrieben hergestellt wird, als 1 : 500-Verdünnung in Reaktionspuffer D
eingesetzt. Zu Vergleichszwecken wird im parallelen Ansatz biotinyliertes anti-
Kaninchen-IgG als Sekundärantikörper an den unmarkierten, Antigen-gebundenen
Primärantikörper gekoppelt und mit Hilfe eines oligomeren DNA-STV-Konjugates
markiert (Abb. 4B). PCR-Amplifikation des Markers und quantitative Bestimmung
des Amplifikats mittels PCR-ELISA erfolgen wie beschrieben. Aus Abb. 4B geht
klar hervor, daß die Verwendung der Immunglobulinmodifizierten oligomeren
DNA-STV-Konjugate die Sensitivität der unmodifizierten DNA-STV-Oligomere
noch übertrifft. Dies ist sowohl auf den Verstärkungseffekt durch die Bindung der
oligomeren DNA-Streptavidin-Konjugates als auch auf die nochmals deutlich
verminderte unspezifische Bindung der oligomeren DNA-Protein-Konjugate
zurückzuführen.
Oligomere Konjugate werden aus DNA und STV hergestellt, wobei eine der
Komponenten zuvor mit einem Sondenmolekül modifiziert wurde. Als
Sondenmoleküle kommen Enzyme, Fluorophore oder Radioisotope oder andere
nachweisbare Gruppen in Frage, die am STV oder an die DNA gekoppelt werden,
im vorliegenden Beispiel wird STV verwendet, das zuvor kovalent mit einem Eu-
Chelat markiert wurde und deshalb mittels Zeit-aufgelöster Fluoreszenzanalyse
nachweisbar ist. Im vorliegenden Beispiel wird IgG des Kaninchens als
Modelantigen mit Hilfe eines two-sided ELISA nachgewiesen. Das Antigen wird
üblicherweise in 1 : 10-Verdünnungsschritten auf Mikrotiterplatten immobilisiert, die
zuvor mit anti-Kaninchen IgG als "Fänger-Antikörper" funktionalisiert wurden. Die
Detektion des nachzuweisenden Antigens erfolgt mit Hilfe eines biotinylierten anti-
Kaninchen-IgG aus Ziege als Primärantikörper. Anschließend wird, nach der unter
Beispiel 2 beschriebenen Methode ein oligomeres DNA-Streptavidin-Konjugat
ausgehend von doppelt biotinylierter DNA und Eu-Chelat-markiertem Streptavidin
(Wallac ADL) hergestellt und als Verdünnungen von 1 : 1000 in Reaktionspuffer D
zu den Ansätzen 50-µL-weise hinzugefügt, um den biotinylierten Primärantikörper
zu markieren (Abb. 5A, rechts). Zu Vergleichszwecken werden im parallelen
Ansatz Eu-markiertes Streptavidin direkt an den biotinylierten Primärantikörper
gekoppelt (Abb. 5A, links). Nach erfolgter Inkubation werden überschüssige
Reagenzien durch Waschen entfernt: und die Fluoreszenz an einem Victor-Multilabel
Counter (Wallac ADL) quantifiziert. Der in Abb. 5B gezeigte Signalverlauf läßt klar
erkennen, daß bei Verwendung des oligomeren DNA-STV-Konjugates deutlich
stärkere Signale und eine verbesserte Nachweisgrenze resultieren. Dies ist auf den
Verstärkungseffekt durch die Bindung oligomerer Konjugate und die daraus
resultierende stärkere Markierung des Antigens mit Fluorophoren sowie die
verminderte unspezifische Bindung der Protein-DNA-Cluster zurückzuführen.
Oligomere DNA-Protein-Konjugate werden als Verstärker-Reagenzien in
analytischen Verfahren eingesetzt, die auf Massendetektion beruhen. Zur
Demonstration werden Au(111)-beschichtete Schwingquarze mit einer
Resonanzfrequenz von 10 MHz nach bekannten Chemisorptionsverfahren mit 5'-
Thiol-modifizierten Fänger-Oligonucleotiden beschichtet. Als DNA-Protein-
Konjugat wird ein nach bekannten Methoden hergestelltes kovalentes Konjugat aus
DNA und Streptavidin verwendet, an das ein biotinyliertes Immunoglobulin-
Molekül, anti-Maus-IgG aus Ziege, als Massenverstärker gekoppelt ist (Abb. 6 A).
Zu Vergleichszwecken werden im parallelen Ansatz sukzessiv zunächst ein Biotin-
markiertes, komplementäres Oligonucleotid und erst dann ein kovalentes Konjugat
aus Streptavidin und Alkalischer Phosphatase gekoppelt (Abb. 6B). Als Kontrolle
werden Quarze verwendet, die mit einem nicht-komplementären Fänger-
Oligonucleotid beschichtet wurden. Die nach den einzelnen Bindungsschritten zu
beobachtende Verringerung der Resonanzfrequenz der Quarz-Mikrowaagen (Abb. 6C)
repräsentiert die Massen der an der Quarzoberfläche gebundenen Moleküle. Wie
aus dem Histogramm der Frequenzänderungen von Sensor- und Kontrollquarzen
deutlich erkennbar, beruht die Bindung der Moleküle auf spezifischer DNA-
Hybridisierung. Während die sukzessive Bindung von Oligonucleotid und Protein
(Testsystem 2) im Mittel zu einer Änderung von ca. -70 Hz führt, bewirkt die
Bindung des IgG-DNA-Konjugates ein etwa dreifach stärkeres Signal (Testsystem
1: DNA-IgG-Konjugat). Dies läßt sich einerseits auf die Reduzierung der
Bindungsschritte bei Verwendung des DNA-Protein-Konjugates, andererseits sich
auf dessen höhere Masse zurückführen. Die Funktionalität des IgG-modifizierten
DNA-Konjugates wird durch die Bindung von Maus-IgG-Antigen demonstriert
(Abb. 6C: Testsystem 1: Bindung des Antigens). Die im Vergleich zum
Kontrollquarz vierfach stärkere Frequenzabnahme ist auf die spezifische Bindung
des Antigens durch das immobilisierte IgG-haltige DNA-STV-Konjugat
zurückzuführen.
Abb. 1 Präparation von oligomeren DNA-Protein-Konjugaten
Abb. 2 Charakterisierung der oligomeren DNA-Protein-Konjugate
Abb. 3 Präparative Herstellung von oligomeren DNA-Protein-Konjugaten
Abb. 4 Verwendung der oligomeren DNA-Protein-Konjugate in der
Immuno-PCR
Abb. 5 Verwendung oligomerer DNA-Protein-Konjugate als Verstärker-
Reagenz in immunologischen Detektionsverfahren
Abb. 6 Verwendung von Immunglobulin-funktionalisierten-Konjugaten als
Verstärkerreagenzien in der massensensitiven Detektion von
Nucleinsäuren mittels Quarz-Mikrowaagen
Schematische Darstellung der Präparation von oligomeren DNA-Protein-
Konjugaten. Doppelt biotinylierte DNA (1) wird durch PCR unter
Verwendung zweier 5'-Biotin-markierter Primer hergestellt und zur Synthese
der oligomeren DNA-Protein-Konjugate mit Streptavidin (2) gemischt. Durch
Selbstorganisation bilden sich oligomere DNA-Protein-Konjugate in denen
das Streptavidin noch über freie Bindungsstellen (3) für Biotin verfügt. Die
oligomeren Konjugate können in-situ direkt nach der Präparation, oder
alternativ nach erfolgter Isolierung und Aufreinigung, weiter funktionalisiert
werden, indem biotinylierte Komponenten, beispielsweise biotinylierte
Antikörper (4), an das Streptavidin oder aber Nucleinsäure-spezifische
Modulatoren, z. B. Diaminoplatin-Komplexe (5), gebunden werden.
a.) 2%ige Agarose-Gelelektrophorese zur Analyse verschiedener oligomerer
DNA-STV-Konjugate, hergestellt aus doppelsträngiger DNA der Länge von
86 bp (2A.), 124 bp (2B.), 169 bp (2C.) und 256 bp (2D.) und STV. Spur
M: Molekulargewichtsmarker, 1 kB DNA-Ladder (Gibco); In den Spuren 1
bis 6 ist das relative Mischungsverhältnis von DNA zu STV von 1 : 100 bis
5 : 1 variiert. In den Spuren 7-9 sind zum Vergleich Proben aufgetragen, die
aus monobiotinylierter DNA und STV hergestellt wurden. Das
Kopplungsverhältnis DNA : STV in diesen Proben beträgt 1 : 5, 1 : 1 und 5 : 1.
Im Falle der oligomeren DNA-STV-Konjugate ist zu beobachten, daß
hochmolekulare Konjugate bevorzugt bei äquimolaren
Mischungsverhältnissen (Spuren 3 und 4) auftreten. Die verbleibende Biotin-
Bindungsfähigkeit wird demonstriert, indem biotinylierter Antikörper zu den
oligomeren DNA-STV-Konjugaten gegeben wird. Dies bewirkt eine
vollständige Retardierung des Bandenmusters, so daß nur eine einzige
immobile Bande im hochmolekularen Bereich des Gels verbleibt.
A.) Chromatogramm der Gelfitrations-Trennung eines Molekulargewichts-
Standards. Die relativen Motekulargewichte der Testsubstanzen sind über den
Pfeilen angegeben.
B.) Chromatogramm der Gelfitrations-Trennung eines bis-biotinylierten
DNA-Marker-Fragments der Länge von 169 Basenpaaren.
C.) Chromatogramm der Gelfiltrations-Trennung eines Immunglobulin
modifizierten oligomeren DNA-STV-Konjugates, hergestellt aus äquimolaren
Mengen einer doppelt-biotinylierten 169-bp-DNA und STV. Nach erfolgter
Aggregation wurde das oligomere Konjugat mit biotinyliertem Antikörper
gekoppelt und das so entstandene Konjugat gelfiltrationschromatographisch
gereinigt. Das oligomere Konjugat (a) eluiert im Totvolumen der Säule. Die
Peaks b-d repräsentieren nicht umgesetzte DNA (b), überschüssigen
Antikörper (c) und Rinderserumalbumin aus dem Lagerpuffer (d).
Vergleich der Signalverläufe von Immuno-PCR-Nachweisreaktionen unter
Verwendung von olifomeren DNA-Protein-Konjugaten als
Markierungsreagenzien (a) mit konventionell durch sukzessive
Inkubationsschritte durchgeführter Immuno-PCR (b) und analogem ELISA-
Nachweis (c). Die Signalverläufe geben relative Signalintensitäten bezogen
auf Negativkontrollen der Immuno-PCR wieder, in denen kein Antigen im
Reaktionsansatz vorhanden war. A.) Nachweis von Immunglobulin aus
Kaninchen als Modellantigen. Imimobilisierte Antigen-Verdünnungen wurden
zunächst mit biotinyliertem anti-Kaninchen-IgG gekoppelt und anschließend
entweder sequentiell mit STV und biotinylierter DNA (konventionelle
Immuno-PCR, b) oder mit einem zuvor hergestellten oligomeren DNA-STV
Konjugat markiert (a). Der Signalverlauf bei Verwendung der oligomeren
Konjugate zeigt, das diese Reagenzien im Vergleich zur sequentiellen
Immuno-PCR eine mehr als 10-fach gesteigerte Sensitivität bewirken. Dies
ist auf den Verstärkereffekt durch die Bindung oligomerer DNA-Streptavidin-
Konjugate und auf eine verminderte unspezifische Bindung der Oligomere
zurückzuführen. B.) Verwendung eines Antikörper-funktionalisierten DNA-
Protein-Konjugates als Sekundärreagenz in der Immuno-PCR, gezeigt
anhand des Nachweises von Immunglobulin aus Maus als Modellantigen.
Immobilisierte Antigen-Verdünnungen wurden zunächst mit einem
Primärantikörper, dann mit biotinyliertem anti-Kaninchen-IgG gekoppelt und
anschließend mit einem zuvor hergestellten oligomeren DNA-STV-Konjugat
(b) markiert. In einer parallelen Meßreihe wurde ein gereinigtes Antikörper-
funktionalisiertes oligomeres Konjugat (Abb. 3) zum Nachweis des an
immobilisiertes Antigen gekoppelten Primärantikörpers verwendet (a). Die
Signalverläufe zeigen, daß mit Hilfe der funktionalisierten oligomeren
Konjugate im Vergleich zu den unmodifizierten DNA-STV-Oligomeren mehr
als 10-fach gesteigerte Sensitivität und deutlich höhere Signalintensitäten
erreicht werden. Dies ist auf den Verstärkereffekt durch die Bindung
oligomerer DNA-Streptavidin-Konjugate und auf die verminderte
unspezifische Bindung der Konjugate zurückzuführen.
A.) Schematische Darstellung des two-sided-ELISA-Nachweises von IgG aus
Kaninchen als Modellantigen. Das Antigen wird auf Mikrotiterplatten
immobilisiert, die zuvor mit anti-Kaninchen IgG als "Fänger-Antikörper"
beschichtet wurden. Die Detektion des gebundenen Antigens erfolgt mit Hilfe
eines biotinylierten anti-Kaninchen-IgG aus Ziege als Primärantikörper. Als
Nachweisreagenz wird ein oligomeres DNA-STV-Konjugat ausgehend von
doppelt biotinylierter DNA und Eu-Chelat-markiertem Streptavidin (Abb. 5A
rechter Teil) sowie zum Vergleich kommerziell erhältliches Eu-markiertes
Streptavidin direkt an den biotinylierten Primärantikörper gekoppelt (Abb. 5A
linker Teil). Die Quantifizierung erfolgt durch zeitaufgelöste Fluoreszenz-
Messung. B.) Die Signalverläufe geben relative Fluoreszenz-
Signalintensitäten bezogen auf Negativkontrollen der Immuno-PCR wider, in
denen kein Antigen im Reaktionsansatz vorhanden war. Der Signalverlauf
zeigt, daß bei Verwendung des oligomeren DNA-Protein-Konjugates deutlich
stärkere Signale und eine verbesserte Nachweisgrenze resultieren. Dies ist auf
den Verstärkungseffekt durch die Bindung oligomerer Konjugate und den
daraus resultierenden höheren Markierungsgrad des Antigens mit
Fluorophoren sowie die verminderte unspezifische Bindung der Protein-DNA-
Konjugate zurückzuführen.
A.) Schematische Darstellung des Testsystems: Als DNA-Protein-Konjugat
wird ein kovalentes Konjugat aus DNA und Streptavidin verwendet, an das
ein biotinyliertes Immunoglobulin-Molekül, anti-Maus-IgG aus Ziege, als
Massenverstärker gekoppelt ist. Nach Bindung an auf Schwingquarzen
immobilisierten Oligonucleotiden kann im weiteren eine Bindung von Antigen
erfolgen. B.) Schematische Darstellung des zu Vergleichszwecken
verwendeten Testsystems 2: An die Quarz-gebundenen Fänger-
Oligonucleotide wird sukzessiv zunächst ein Biotin-markiertes,
komplementäres Oligonucleotid und erst dann ein kovalentes Konjugat aus
Streptavidin und Alkalischer Phosphatase gekoppelt. C.) Histogramme der
gemessenen Frequenzänderungen von Sensor- und Kontrollquarzen, letztere
sind mit einem nicht-komplementären Oligonucleotid beschichtet. Die zu
beobachtende Verringerung der Resonanzfrequenz repräsentiert die
Massenzunahme durch die an der Quarz-Mikrowaage gebundenen Moleküle.
Die niedrige Frequenzänderung der Kontrollquarze zeigt, daß die Bindung
der Moleküle auf spezifischer DNA-Hybridisierung beruht. Während die
sukzessive Bindung von Oligonucleotid und Protein zu einer Änderung von
ca. -70 Hz führt (Testsystem 2), bewirkt die Bindung des IgG-DNA-
Konjugates ein etwa dreifach stärkeres Signal (Testsystem 1: DNA-IgG
Konjugat). Dies läßt sich einerseits auf die Reduzierung der Bindungsschritte
bei Verwendung des DNA-Protein-Konjugates, andererseits sich auf dessen
höhere Masse zurückführen. Die Funktionalität des IgG-modifizierten DNA-
Konjugates wird durch die Bindung von Maus IgG-demonstriert (Testsystem
1: Bindung des Antigens). Die im Vergleich zum Kontrollquarz vierfach
stärkere Frequenzabnahme ist auf die spezifische Bindung des Antigens
durch das immobilisierte IgG-haltige Konjugat zurückzuführen.
Claims (21)
1. Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Komplexen
als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren, insbesondere der
Immuno-PCR.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß oligomere Protein-
Nucleinsäure Konjugate bestehend aus
- 1. a.) Nucleinsäuren, die mit mindestens zwei Bindemolekülen verknüpft sind, und
- 2. b.) Proteinen, die mindestens zwei Bindungsstellen für das Bindemolekül besitzen,
als Reagenzien in immunologischen Nachweisverfahren verwendet werden.
3. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß nicht alle Bindungsstellen der Proteine b) durch die mit den
Nucleinsäuren a) verknüpften Bindemoleküle abgesättigt sein müssen.
4. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei der Nucleinsäure (a) um einzel- oder
doppelsträngige Desoxyribonucleinsäuren, Ribonucleinsäuren oder modifizierte
artifizielle Nucleinsäuren wie Peptidnucleinsäuren, Alanylpeptidnucleinsäuren,
Phosphothioatnucleinsäuren oder andere Nucleinsäure-Analoga handelt.
5. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Protein (b) um Avidin, Streptavidin,
Rezeptoren oder Antikörper oder andere Bindeproteine handelt.
6. Oligomere Nucleinsäureprotein-Konjugate nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß als Bindemoleküle Biotin, Digoxigenin, Fluorescein,
Dinitrophenol oder andere niedermolekulare organische Haptene wie z. B. Peptide
mit spezifischer Erkennungssequenz eingesetzt werden.
7. Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 1-5, dadurch
gekennzeichnet, daß sie zur Signalerzeugung bzw. Signalverstärkung in
immunologischen Nachweisverfahren, insbesondere in der Immuno-PCR,
verwendet werden.
8. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 1-5, dadurch
gekennzeichnet, daß weitere, Bindemolekül-derivatisierte Modulatormoleküle über
die Nucleinsäure (a) oder das Protein (b) an den oligomeren Komplex gebunden
sind.
9. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Bindemolekül-derivatisierten
Modulatormolekülen um Antikörper, Rezeptoren, Enzyme oder andere
Bindeproteine handelt.
10. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 7-8, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Bindemolekül-derivatisierten
Modulatormolekülen um einzel- oder doppelsträngige Nucleinsäuren wie DNA,
RNA oder modifizierte artifizielle Nucleinsäuren handelt.
11. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 7-9, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Bindemolekül-derivatisierten
Modulatormolekülen um niedermolekulare organische Verbindungen wie
Pharmakophore, Chromophore, Fluorophore, Mono-, Oligo- oder Polypeptide,
Mono-, Oligo- oder Polysaccharide oder biologisch-aktive Wirksubstanzen
handelt.
12. Oligomere Nucleinsäure-Protein-Konjugate nach Anspruch 7-10, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei den Bindemolekül-derivatisierten
Modulatormolekülen um Verbindungen wie Metall- und Halbmetallkolloide und
Cluster, Borane, Carborane, Kohlenstoff-Allotrope wie Polyacetylene, Fullerene
und Nanoröhren oder organische Vesikel oder Mizellen handelt.
13. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach Anspruch
1-11 zur Signalverstärkung in immunologischen Nachweisverfahren, insbesondere
in einer Immuno-PCR.
14. Kompetitives immunologisches Nachweisverfahren, wobei das
Nachweismolekül, das mit einem Bindemolekül verknüpft ist, zunächst mit einem
oligomeren Nucleinsäure-Protein-Komplex gemäß Anspruch 1-11 inkubiert wird
und anschließend eine Immuno-PCR durchgeführt wird.
15. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach
Anspruch 1-11 zum Nachweis von niedermolekularen Verbindungen wie
beispielsweise Hormone, pharmakologische oder pflanzenwirksame Wirkstoffe
und deren Abbauprodukte oder Drogen und deren Abbauprodukte oder
Wirksubstanzen anderer Art.
16. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach
Anspruch 1-11 zum Nachweis von Nucleinsäuren.
17. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach Anspruch
1-11 als Verstärkerreagenz in Nachweisverfahren, die auf optischen Methoden
beruhen wie beispielsweise Oberflächenplasmon-Resonanz, Reflexions-
Interferenz-Spektroskopie oder Detektion mittels Reflexionsgitterkoppler,
Resonanzspiegel-Sensor und analogen Techniken.
18. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach Anspruch
1-11 als Verstärkerreagenz in Nachweisverfahren, die auf massensensitiven
Methoden beruhen wie beispielsweise die Detektion durch Quarz-Mikrowaagen
oder Impedanzspektroskopie.
19. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach Anspruch
1-11 als Markierungs-Reagenzien für die Immun-Elektronenmikroskopie oder
anderen bildgebenden Verfahren, wie beispielsweise als Kontrastmittel oder
Radiodiagnostika für medizinische Anwendungen.
20. Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten nach Anspruch
1-11 als therapeutische Reagenzien für medizinische Anwendungen, beispielsweise
als Radiotherapeutika, Cytostatika oder ähnliche biologisch wirksame
Verbindungen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19941756A DE19941756B4 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19941756A DE19941756B4 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19941756A1 true DE19941756A1 (de) | 2001-03-08 |
DE19941756B4 DE19941756B4 (de) | 2013-05-16 |
Family
ID=7920506
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19941756A Expired - Lifetime DE19941756B4 (de) | 1999-09-02 | 1999-09-02 | Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19941756B4 (de) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10125538A1 (de) * | 2001-05-23 | 2002-12-05 | Chimera Biotec Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Substanzen |
EP1270738A1 (de) * | 2001-06-18 | 2003-01-02 | chimera biotec GmbH | Verfahren zum Nachweis von Substanzen in Flüssigkeiten |
WO2005017195A1 (de) * | 2003-07-18 | 2005-02-24 | Eppendorf Ag | Auf replikation von gebundenen nukleinsäuren basierendes verfahren zum nachweis von biomolekülen |
WO2006056478A1 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | Klinikum Der Universität Regensburg | Kits and methods for detecting methylated dna |
DE102007016324A1 (de) | 2007-04-04 | 2008-10-09 | Priontype Gmbh & Co.Kg | Verfahren zum Nachweis von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc) |
US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
WO2016097305A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Probiodrug Ag | Novel method for the detection of pglu-abeta peptides |
-
1999
- 1999-09-02 DE DE19941756A patent/DE19941756B4/de not_active Expired - Lifetime
Cited By (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10125538A1 (de) * | 2001-05-23 | 2002-12-05 | Chimera Biotec Gmbh | Verfahren zum Nachweis von Substanzen |
EP1270738A1 (de) * | 2001-06-18 | 2003-01-02 | chimera biotec GmbH | Verfahren zum Nachweis von Substanzen in Flüssigkeiten |
WO2005017195A1 (de) * | 2003-07-18 | 2005-02-24 | Eppendorf Ag | Auf replikation von gebundenen nukleinsäuren basierendes verfahren zum nachweis von biomolekülen |
WO2006056478A1 (en) * | 2004-11-29 | 2006-06-01 | Klinikum Der Universität Regensburg | Kits and methods for detecting methylated dna |
US9074013B2 (en) | 2004-11-29 | 2015-07-07 | Sequenom, Inc. | Means and methods for detecting methylated DNA |
US9249464B2 (en) | 2004-11-29 | 2016-02-02 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
US9873919B2 (en) | 2004-11-29 | 2018-01-23 | Sequenom, Inc. | Reagents for detecting methylated DNA |
US10487351B2 (en) | 2004-11-29 | 2019-11-26 | Sequenom, Inc. | Kits and methods for detecting methylated DNA |
DE102007016324A1 (de) | 2007-04-04 | 2008-10-09 | Priontype Gmbh & Co.Kg | Verfahren zum Nachweis von pathologisch verändertem Prion-Protein (PrPSc) |
WO2016097305A1 (en) | 2014-12-19 | 2016-06-23 | Probiodrug Ag | Novel method for the detection of pglu-abeta peptides |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DE19941756B4 (de) | 2013-05-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE69735532T2 (de) | Bestimmung von antigenen mittels oligonukleotid-antikörper-konjugaten | |
DE69432419T2 (de) | Ein elektrochemiluminescenter nachweis von nukleinsäuren auf basis der selbsttragenden sequenzreplikation | |
DE69828502T2 (de) | Verfahren zum Nachweis von biologischen Molekülen in biologischen Proben mittels Bakteriophagen | |
EP0197266B1 (de) | Verfahren und Träger zur Sequenzanalyse von Nucleinsäuren | |
DE19941756B4 (de) | Verfahren zur Verwendung von oligomeren Nucleinsäure-Protein-Konjugaten als Reagenzien für immunologische Nachweisverfahren insbesondere die Immuno-PCR | |
EP1186669B1 (de) | Verfahren zur spezifischen Bestimmung von DNA-Sequenzen mittels paralleler Amplifikation | |
EP0882985A2 (de) | Immunchemische Bestimmung von multivalenten Analyten | |
DE202021004362U1 (de) | Kontrollen für Proximity-Detection-Assays | |
DE69728370T2 (de) | Analyseverfahren basierend auf Signalverstärkung | |
DE10145226A1 (de) | Herstellung von trägergebundenen Molekülen | |
DE19902391A1 (de) | Verfahren zur reversiblen, ortsspezifischen, hocheffizienten und gleichzeitigen Immobilisierung verschiedenartiger (biologischer) Makromoleküle auf Festphasen | |
DE19745668A1 (de) | Definierte Kopplung von biotechnologischen Funktionseinheiten | |
WO2000039581A2 (de) | Testsystem zur erkennung verschiedener marker, seine herstellung sowie verwendung | |
DE19959857C1 (de) | Testsystem zum Nachweis von Analyten sowie ein Verfahren zur Herstellung und Verwendung | |
DE19923966C2 (de) | Erkennungssystem zur Auftrennung von Probenbestandteilen, seine Herstellung und Verwendung | |
EP1478776B1 (de) | Verfahren zur qualitativen und quantitativen bestimmung von genetischem material | |
DE102013213279B4 (de) | Universelles Verfahren zur Detektion von diversen Analyten in Form von Nukleinsäuresequenzen | |
DE19721698A1 (de) | Verbesserter einschichtiger Biosensor | |
DE19602300A1 (de) | Verfahren zur Immobilisierung von Biopolymeren | |
EP1451319A2 (de) | Verfahren zur identifizierung von interaktionspartnern mittels phage display | |
WO2002101393A2 (de) | Verfahren zur identifizierung von wechselwirkungen zwischen proteinen und dna-fragmenten eines genoms | |
DE10128093A1 (de) | Verfahren zum Nachweis von Substanzen und Artikel zur Durchführung dieser Verfahren | |
EP0983379A1 (de) | Verfahren und kit zur detektion von mutationen in dna's mit hilfe von restriktionsenzymen | |
EP1646726A1 (de) | Auf replikation von gebundenen nukleinsäuren basierendes verfahren zum nachweis von biomolekülen | |
WO2002044405A2 (de) | Verfahren und kit zum direkten nachweis von nukleotidsequenzen, aminosäuresequenzen oder antigenen |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8181 | Inventor (new situation) |
Free format text: NIEMEYER, CHRISTOF, 28213 BREMEN, DE ADLER, MICHAEL, 27607 LANGEN, DE BLOHM, DIETMAR, PROF. DR., 27711 OSTERHOLZ-SCHARMBECK, DE |
|
8101 | Request for examination as to novelty | ||
8105 | Search report available | ||
8110 | Request for examination paragraph 44 | ||
R018 | Grant decision by examination section/examining division | ||
R020 | Patent grant now final |
Effective date: 20130817 |
|
R071 | Expiry of right |