DE10125538A1 - Verfahren zum Nachweis von Substanzen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweisen einer Substanz in wässriger Lösung. Dabei wird eine Oberfläche bereitgestellt, die mit einer Anker-Reagenz versehen ist. Weiter wird ein Marker-Konjugat bereitgestellt, das aus einer Nucleinsäure und einer Erkennungsgruppe besteht. Die nachzuweisende Substanz, das Marker-Konjugat und die mit dem Anker-Reagenz beschichtete Oberfläche werden zusammen gebracht. Durch die Gegenwart der nachzuweisenden Substanz wird die Bindung des Marker-Konjugats an die mit dem Anker-Reagenz beschichtete Oberfläche behindert. Die Bestimmung der nachzuweisenden Substanz erfolgt durch die Bestimmung der durch die Anwensenheit der nachzuweisenden Substanz induzierten Verringerung der über das Anker-Reagenz an die Oberfläche gebundenen Menge des Marker-Konjugats.

Description

Die Einführung von Antikörper- oder Rezeptor-basierten Immunoassays in den 60'er und 70'er Jahren führte zur Entwicklung einer Vielzahl hochspezifischer Verfahren, um Analytsubstanzen empfindlich und präzise nachzuweisen. J. R. Crowther beschreibt in ELISA: Theory and Practice, Humana Press Inc. (1995), dass zur Steigerung der Nachweisempfindlichkeit häufig Enzym-verstärkte Assays oder Radioimmuno-Assays eingesetzt werden. Hierbei werden typischerweise Nachweisgrenzen bis in den Attomol- Bereich erzielt (1 amol = 1 × 10^-18 Mol).

Der sensitive Nachweis von niedermolekularen Analytsubstanzen ist für viele Bereiche relevant, die von der biomedizinischen Grundlagenforschung über die Wirkstoff-Analytik bis hin zu analytisch/diagnostischen Fragestellungen reichen. Von besonderem wirtschaftlichem Interesse ist dabei der Nachweis von:

• - Doping-Substanzen:
  Der hochsensitive Nachweis von Haptenen ist im Bereich der Sportmedizin und Doping-Analytik von besonderem Interesse zum Nachweis von verbotenen Substanzen in biologischen Matrices wie Haarmaterial, Blut oder Urin
• - Pharmakophore und andere Wirkstoffe:
  Für die Identifizierung von Pharmakophoren in Molekülen sowie zur Feststellung von Rezeptorbindungseigenschaften werden sensitive rezeptorvermittelte Nachweisverfahren benötigt (Pharmacophore Perception, Development and Use in Drug Design, Ed. O. F. Güner, International University Line (2000)).
• - Drogen:
  Der hochsensitive Nachweis von Drogen aus biologischen Matrices ist von hoher Bedeutung im Bereich der Rechtsmedizin, der Pathologie und der Pharmakologie
• - Pestizide und andere Umweltgifte:
  In der Lebensmittelkontrolle, sowie in der Umwelt-Analytik ist es von großem Interesse die zum Teil hochtoxischen Pestizide und Umweltgifte in geringsten Konzentrationen nachweisen und quantifizieren zu können.

Da derartige niedermolekulare Analytsubstanzen aus sterischen Gründen in der Regel nur ein Antikörpermolekül binden können und die direkte Bindung an die Oberfläche erschwert ist, muss für den Nachweis von niedermolekularen Substanzen eine Variante der ELISA-Methodik verwendet werden, die als "competitive ELISA" (cELISA) bezeichnet wird. Hierbei wird nicht die Zunahme eine nachzuweisenden Substanz direkt gemessen, sondern es wird die Menge eines konkurrierenden "kompetitiven" Reagenzes im Verhältnis zur Menge der nachzuweisenden Substanz bestimmt. So wird im cELISA häufig ein Konjugat aus der nachzuweisenden Analytsubstanz und einem signalerzeugenden Enzym verwendet, das mit dem Analyten um (Antikörper- )Bindungsstellen auf einer Oberfläche konkurriert. Die Praxis zeigt, dass derartige kompetitive Immunoassays deutlich sensitiver sind als beispielsweise Chromatographieverfahren, was sich anhand einer durchschnittlich um den Faktor 100 niedrigeren Nachweisgrenze deutlich macht (Winklmair, M. et al., Fresenius J Anal Chem, 358, 614-622 (1997); Van Bocxlaer, J. F. et al., Mass Spectrom Rev 19 (4), 165-214 (2000)).

Da allerdings in vielen Fällen die Nachweisgrenze eines cELISA nicht ausreicht, um niedrigkonzentrierte, niedermoleklare Analytsubstanzen nachzuweisen, besteht ein generelles, bislang ungelöstes Problem darin, derartige Substanzen insbesondere aus komplexen Matrices, wie z. B. Blutserum, mit hoher Empfindlichkeit und Sicherheit nachzuweisen.

T. Sano et al., Science, 258, 120 (1992) beschreiben die Methode der Immuno-PCR, bei der die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Verstärker-Reaktion benutzt wird, um Proteine mit einer Nachweisgrenze von bis zu 6 × 10^-22 Mol zu erfassen. Bei dieser Immuno-PCR wurde Rinderserum-Albumin (BSA) als Antigen-Modelsubstanz in Mikrotiterplatten immobilisiert, mit einem spezifischen biotinylierten Antikörper markiert und in einem nachfolgenden Inkubationsschritt durch Verwendung eines rekombinanten Proteinchimären aus Protein A und Streptavidin mit einem biotinylierten DNA-Fragment verknüpft. Der anschließende PCR-Nachweis des immobilisierten DNA-Markers erbrachte die oben genannte Nachweisgrenze. C. M. Niemeyer, Biospektrum, 5, 486 (1999) beschreibt, dass dieses Verfahren wegen der vielfältigen Inkubations- und Waschschritte sehr aufwendig ist und praktisch nicht reproduzierbar war, und erst nach einigen Modifikationen mit Erfolg eingesetzt wird. Auch dann ist die Methode jedoch auf den Nachweis hochmolekularer Analytsubstanzen, z. B. Proteine, beschränkt und nicht auf den Nachweis niedermolekularer Substanzen anwendbar.

H. Zhou et al., Nucleic Acids Res, 21, 6038 (1993) stellten beispielsweise den signalerzeugenden Komplex in der Immuno-PCR durch sequentielle Inkubation aus den Einzelkomponenten her, indem an den antigenspezifischen Primärantikörper zunächst ein biotinylierter Sekundärantikörper, dann Streptavidin und erst anschließend daran die biotinylierte Marker-DNA gebunden wurde. Auf diese Weise kann die Immuno-PCR zwar mittels kommerziell erhältlichen Reagenzien durchgeführt werden, jedoch wird ihre Empfindlichkeit aufgrund der vielen Kopplungsschritte wesentlich verschlechtert und ihre praktische Durchführung sehr erschwert. C. M. Niemeyer et al., Anal. Biochem, 246, 140 (1997) zeigten, daß zum Erreichen maximaler Sensitivität in der Immuno-PCR die Primärantikörper in möglichst wenig Reaktionsschritten mit der Marker-DNA verknüpft werden sollten. E. R. Hendrickson et al., Nucleic Acids Res, 23, 522 (1995) zeigt, dass dies beispielsweise durch die direkte kovalente Verknüpfung des Antikörpers mit der Marker- DNA erreicht werden kann. US 5,985,548 zeigt, dass dieser Ansatz für die Mehrfach- Bestimmung Oberflächen-immobilisierter Analytsubstanzen genutzt werden kann. Nachteilig an letzterem Verfahren ist allerdings, daß die Herstellung solcher Antikörper- DNA Direktkonjugate mit sehr hohem Kosten- und großem Zeitaufwand verbunden ist, weil einmal hergestellte Konjugate in Bezug auf Antigenspezifität und DNA-Sequenz festgelegt sind und jede Anwendung somit die spezielle Synthese eigener Direktkonjugate erfordert. C. M. Niemeyer et al., Nucleic Acids Res, 27, 4553 (1999) zeigten, dass die Kupplung von spezifischem Primärantikörper und Marker-DNA rasch und in präparativ­ einfacher Weise durch selbstorganisiert-gebildete Oligomere aus bis-biotinylierter DNA und Streptavidin vorgenommen werden kann.

Zwar werden durch die oben beschriebenen Methoden verbesserte Nachweisgrenzen erzielt, alle diese Verfahren basieren jedoch auf sogenannten Sandwich-Immunoassays (two-sided Immunoassays) bei denen der Nachweis hochmolekularer Analytsubstanzen, wie z. B. Proteine, durch eine doppelte Bindung zweier Antikörpermoleküle gelingt. Damit sind diese Techniken für den Nachweis niedermolekularer Substanzen nicht geeignet.

Eine Aufgabenstellung der vorliegenden Erfindung war es nun, eine Nachweismethode zu entwickeln, die es erlaubt, niedermolekulare Analytsubstanzen aus komplexem Probenmaterial mit möglichst hoher Empfindlichkeit und Sicherheit nachzuweisen. Eine weitere (Teil-)Aufgabe bestand darin, die für einen solchen Nachweis benötigten Reagenzien durch modulare Verwendung molekularer Komponenten herstellen zu können, um diesen Nachweis einerseits experimentell einfach durchführbar und andererseits leicht an eine Vielzahl nachzuweisender Substanzen adaptieren zu können.

Diese Aufgaben werden gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis einer Substanz in wässriger Lösung, umfassend die Schritte:

• 1. a.) Bereitstellung einer mit einem Anker-Reagenz verbundenen Oberfläche
• 2. b.) Bereitstellung eines Marker-Konjugates aus einer Nucleinsäure und einer Erkennungsgruppe, dessen Bindung an die mit dem Anker-Reagenz beschichtete Oberfläche durch die Gegenwart der nachzuweisenden Substanz behindert wird.
• 3. c.) Zusammenbringen von nachzuweisender Substanz, Marker-Konjugat und der mit dem Anker-Reagenz beschichteten Oberfläche
• 4. d.) Nachweis des Marker-Konjugates
• 5. e.) Bestimmung der nachzuweisenden Substanz durch Bestimmung der durch die Anwesenheit der nachzuweisenden Substanz bewirkte Verringerung der Menge an über das Anker-Reagenz an die Oberfläche gebundenem Marker-Konjugat

Die Schaffung einer Konkurrenzsituation zwischen der nachzuweisenden Substanz und dem Marker-Konjugat um Bindungsstellen am Anker-Reagenz erlaubt dabei die überraschend sensitive Detektion der nachzuweisenden Substanz in einem kompetitiven Assay. Diese Konkurrenzsituation kann vorteilhaft durch zwei verschiedene Vorgehensweisen erreicht werden:

• 1. f.) Immobilisierung eines Anker-Reagenzes an einer Oberfläche das die nachzuweisende Substanz bindet. Die Konkurrenz erfolgte dann zwischen der nachzuweisenden Substanz in Lösung und dem Marker-Konjugat um die Bindungsstellen des Anker-Reagenz. Das Marker-Konjugat besteht hierbei aus der nachzuweisenden Substanz, bzw. einer strukturchemisch identischen oder ähnlichen Gruppe, und einer Marker-Nucleinsäure (siehe Fig. 1a).
• 2. g.) Immobilisierung der nachzuweisenden Substanz, bzw. einer strukturchemisch identischen oder ähnlichen Gruppe, als Anker-Reagenz an einer Oberfläche und anschließende kompetitive Bindung zwischen der in Lösung befindlichen nachzuweisenden Substanz und der an der Oberfläche befindlichen Ankergruppe um Kupplung mit einem Marker-Konjugat, das aus einem Bindungsmolekül gegen die nachzuweisende Substanz und einer Marker-Nucleinsäure besteht (siehe Fig. 1b).

Eine Oberfläche im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jede mit Anker- Reagenzien verbindbare Oberfläche sein. Insbesondere kann es sich um eine Glas-, Silizium- oder Metalloberflächen oder eine andere, vorzugsweise zur Herstellung von Biochips geeignete Oberfläche handeln. Unter den Metalloberflächen sind Gold- oder goldbeschichtete Oberflächen bevorzugt. Es kann sich jedoch auch um Kunststoffoberflächen, insbesondere Polystyrol- oder Polycarbonat-Oberflächen handeln, wie sie insbesondere in Mikrotiterplatten-Kavitäten vorliegen. Bei der Oberfläche kann es sich auch um die Oberfläche vorzugsweise magnetischer Mikropartikel handeln, wie sie zur Extraktion von Nucleinsäuren aus Flüssigkeiten verwendet werden.

Die Oberfläche kann mit die Verfahrensdurchführung nicht störenden Substanzen beschichtet (geblockt) werden. Insbesondere kann die Oberfläche mit Gelantine, Milchpulver und/oder Rinderserum-Albumin (BSA) beschichtet sein. Die Oberfläche kann auch mit Nucleinsäuren versehen sein, soweit diese die Durchführung des Nachweisverfahrens nicht beeinträchtigen.

Bevorzugt ist ein Vorgehen wie unter f.) beschrieben, bei dem als Anker-Reagenzien Bindungsmoleküle verwendet werden.

Bindungsmoleküle im Sinne des Nachweisverfahrens sind solche Substanzen oder Substanzgemische, die unter den gewählten Verfahrensbedingungen vorzugsweise selektiv an die nachzuweisende Substanz binden können. Bindungsmoleküle können insbesondere Rezeptoren und Enzyme sein, aber auch mono- und/oder polyclonale Immunglobuline, insbesondere solche vom Typ G, und deren Fragmente sein. Solche Fragmente sind insbesondere bekannt unter den Bezeichnungen Fab, F(ab)₂, dsFv-Fragmente, scFv- Fragmente und Single-Chain-Antikörper. Die Verwendung polyclonaler Immunglobuline als Bindungsmolekül des Anker-Reagenz und/oder Marker-Konjugats ist wegen ihrer im Vergleich zu monoclonalen Immunglobulinen häufig höheren Stabilität und häufig leichte­ ren Verfügbarkeit bevorzugt. Die Anker-Reagenzien und/oder Marker-Konjugate umfassen, wenn das Bindungsmolekül ein Substanzgemisch mehrerer Substanz-Varianten wie beispielsweise ein polyclonales Immunglobulin ist, jeweils in einem Molekül mehrere der Substanz-Varianten (beispielsweise mehrere der Varianten eines polyclonalen Immun­ globulins) oder sind jeweils Gemische aus Anker-Reagenzien bzw. Marker-Konjugaten, deren Moleküle sich voneinander jeweils in ihren Bindungsmolekül-Varianten (beispielsweise den einzelnen Varianten eines polyclonalen Immunglobulins) unterscheiden. Desweiteren können Anker-Reagenzien auch niedermolekulare Stoffe sein wie Peptide, Peptoide, Haptene und Nucleinsäure-Bindungsreagenzien wie Aptamere oder Ribozyme.

Ebenfalls bevorzugt ist ein Vorgehen wie unter g.) beschrieben, nach dem die Immobilisierung der nachzuweisenden Substanz, bzw. einer strukturchemisch identischen oder ähnlichen Gruppe, als Anker-Reagenz an einer Oberfläche erfolgt. Hierbei führt die kompetitive Bindung zwischen der in Lösung befindlichen nachzuweisenden Substanz und der an der Oberfläche befindlichen Ankergruppe um die Kupplung mit einem Marker- Konjugat, das aus einem Bindungsmolekül gegen die nachzuweisende Substanz und einer Marker-Nucleinsäure besteht, zur Erzeugung spezifischer Signale, deren Stärke von der Menge an vorhandener Analytsubstanz abhängt. Bei diesem Vorgehen wird das Anker- Reagenz so ausgewählt, dass es der nachzuweisenden Substanz in seinem strukturchemischen Aufbau möglichst ähnlich ist (vgl. auch Fig. 1b). Dies bedeutet beispielsweise, dass für den Nachweis von Testosteron eben diese Testosteron-Gruppe als Anker-Reagenz mit der Oberfläche verknüpft wird.

Nucleinsäuren im Sinne des Nachweisverfahrens sind Substanzen, die eine oder mehrere Nucleobasen (Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin, Uracil) oder deren funktionale Analoga, wie zum Beispiel Hypoxanthin, umfassen. Die Nucleobasen sind dabei vorzugsweise mit einem Zucker, insbesondere mit einer Pentose, Pentopyranose oder Pentofuranose verbunden. Besonders bevorzugt sind dabei Ribose und Desoxyribose. Die Zucker wiederum sind vorzugsweise über Phosphodiester-Bindungen miteinander verknüpft. Der Begriff Nucleinsäure umfasst auch sogenannte Peptid-Nucleinsäuren, bei denen das Zuckerphosphat-Rückgrat durch Aminosäuren, die durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind, ersetzt ist (PNAs, siehe dazu beispielsweise E. Uhlmann, Biol. Chem, 1045-1052 (1998); P. Nielsen, Acc. Chem. Res., (32), 624-630 (1999)), und Pyranosyl- Nucleinsäuren wie p-RNAs (sie dazu beispielsweise M. Bolli, R. Micura, A. Eschenmoser, Chem. Biol., (4), 309-320 (1997)).

Nachzuweisende Substanzen sind vorzugsweise niedermolekulare Verbindungen wie Pharmakophore, Drogen, Dopingmittel, Hormone, oder andere Wirkstoffe oder Metabolite.

Dabei kann es sich auch um Proteine, Rezeptoren, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Lipide oder andere Makromoleküle handeln. Besonders bevorzugt durch den Einsatz eines kompetitiven Verfahrens ist dabei der Nachweis niedermolekularer Verbindungen, das heißt Verbindungen die aufgrund ihrer geringen Größe unter 10 kDa nicht oder nur bedingt durch einen konventionellen (two-sided) Sandwich-Assay nachweisbar sind, da sie von der Bindungstasche des Antikörpers eingeschlossen werden und so keine freie weitere Bindungsstelle für einen zweiten Antikörper mehr aufweisen. Ebenso bevorzugt ist der Nachweis von Markromolekülen, wie beispielsweise Rezeptoren, besonders aus biologischen Matrices.

Marker Konjugat im Sinne des Verfahrens ist ein Konjugat aus einer Nukleinsäure und einer Erkennungsgruppe. Bevorzugt besteht das Marker Konjugat aus einer Nucleinsäure, die kovalent mit einer Erkennungsgruppe verbunden ist. Besonders bevorzugt ist ein Konjugat, welche ein Bindungsprotein enthält, um eine Nucleinsäure mit einer Erkennungsgruppe nicht-kovalent zu kuppeln. Erkennungsgruppen sind vorzugsweise Gruppen die der nachzuweisenden Substanz strukturchemisch identisch oder sehr ähnlich sind. Ebenfalls bevorzugt als Erkennungsgruppe sind Bindungsmoleküle.

Die zweite (Teil-)Aufgabe, der modulare Zugang zu den für das erfindungsgemäße Nachweisverfahren benötigten Reagenzien, wird gelöst durch Verwendung von vorab hergestellten Konjugaten aus biotinylierten Nucleinsäuren und Biotin-Bindungsproteinen, wie Streptavidin, Avidin oder rekombinant- oder chemisch-modifizierten Derivaten dieser Proteine. Wie in Niemeyer, Curr. Opin. Chem. Biol., 4 609-18 (2000) beschrieben, sind (Strept)Avidin-Nucleinsäure-Konjugate zwar seit langem bekannt, bislang galt jedoch die Meinung, dass es nicht möglich ist, solche mit Erkennungsgruppen versehende Konjugate mit einheitlich definierter Struktur als Reagenzien für Immunoassays herzustellen. Grundlage dieser Erfindung war nun der überraschende Befund, das sogenannte DNA- Streptavidin Nanoringe (vgl. hierzu Niemeyer et al., Angew. Chem., 112, 3183 (2000)) durch Absättigung mit einem hohen Überschuss an biotinylierten Erkennungsgruppen modifiziert werden können, und dass die entstandenen Konjugate eine Reihe von Eigenschaften aufweisen, die sie als Reagenzien für das erfindungsgemäße Verfahren prädestinieren. So sind sie nicht nur einfach und in großen Mengen herstellbar und außerordentlich stabil gegenüber physikalisch-chemischen Belastungen, sondern sie besitzen auch die vollständige Funktionalität der biotinylierten Erkennungsgruppe. So binden sie überraschend effizient an Oberflächen-gebundene Anker-Reagenzien, insbesondere wenn es sich hierbei um Bindungsmoleküle wie Antikörper gegen die Erkennungsgruppe handelt. Darüber hinaus lässt sich die Nucleinsäure einfach und effizient mit der PCR vervielfältigen.

Ebenfalls überraschend war der Befund, dass sich die DNA-Streptavidin Nanoringe mit praktisch beliebigen niedermolekularen biotinylierten Erkennungsgruppen modifizieren lassen. Hierdurch werden sie dem aufgabengemäßen, modularen Aufbau der Marker- Konjugat Reagenzien in vorzüglicher Weise gerecht, da biotinylierte Erkennungsgruppen vom Fachmann über eine Vielzahl bekannter chemischer Synthesewege herstellbar sind (vgl. z. B. T. Kaiser, et al., Anal Biochem, 282, 173 (2000)) und diese biotinylierten Erkennungsgruppen nach einem Baukastenprinzip mit den DNA-Streptavidin Nanoringen zu Marker-Konjugaten gekuppelt und dann als lagerfähige Substanzen eingesetzt werden können.

Erkennungsgruppen sind vorzugsweise Gruppen die der nachzuweisenden Substanz strukturchemisch identisch oder sehr ähnlich sind, so dass beispielsweise die Bindung von Antikörpern gegen die nachzuweisende Substanz durch die Erkennungsgruppe effizient unterdrückt wird. Besonders bevorzugt ist die Verwendung von biotinylierten Erkennungsgruppen die mit den DNA-Streptavidin Nanoringen vorteilhaft einfach verknüpft werden können. Bevorzugt ist ebenso ein Verfahren zur Verwendung von kovalent an Oligonucleotiden gebundenen Erkennungsgruppen, zur Herstellung von kovalenten Marker-Konjugaten mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Bei den Erkennungsgruppen handelt es sich also um die gleichen strukturchemisch identischen oder sehr ähnlichen niedermolekularen Verbindungen wie die nachzuweisenden Substanzen, typischerweise also Pharmakophore, Drogen, Dopingmittel, Hormone, oder andere Wirkstoffe oder Metabolite. Jedoch kann es sich auch um Proteine, Glykoproteine, Kohlenhydrate, Lipide oder andere Makromoleküle handeln.

Der qualitative und vorzugsweise quantitative Nachweis der im Marker-Konjugat enthaltenen Nucleinsäure kann, gegebenenfalls unter Einschalten eines Waschschrittes, auf zahlreiche verschiedene Weisen erfolgen. Insbesondere kann die Nucleinsäure radioaktiv markiert sein/werden und radiographisch nachgewiesen werden. Sie kann jedoch auch mit Nucleinsäure-bindenden Farbstoffen, insbesondere Fluoreszenz-Farbstoffen, nachgewiesen werden. Dabei ist es besonders bevorzugt, wenn die Farbstoffe über eine zu einem Abschnitt der Nucleinsäure komplementäre Sonde an die Nucleinsäure gebunden sind bzw. werden. Die Sonde kann auch, wie in herkömmlichen Verfahren üblich, mit Enzymen verbunden sein, die selbst leicht nachweisbar sind oder die Erzeugung eines leicht nachweisbaren Produkts bewirken.

Besonders bevorzugt ist ein Verfahren, bei dem die, im Marker-Konjugat enthaltene, Nucleinsäure zum Nachweisen amplifiziert wird.

Zur Amplifikation von Nucleinsäuren sind eine Reihe von Verfahren bekannt. Zu den bekannten Verfahren gehören insbesondere die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), rolling- circle-Amplifikation (RCA), Ligase-Kettenreaktion (LCR) und nucleic-acid-sequence- based-Amplifikation (NASBA). Diese ermöglichen es, auch kleinste Mengen einer Nucleinsäure bis hin zu wenigen hundert, zehn oder gar einem einzigen Molekül zu vervielfältigen. Dadurch kann das Vorliegen eines einzigen oder weniger Moleküle der Nucleinsäure qualitativ und/oder quantitativ nachgewiesen werden.

Zur Vervielfältigung der im Marker-Konjugat enthaltenen Nucleinsäure und gegebenenfalls zu deren Nachweis sind insbesondere PCR-Verfahren geeignet und bevorzugt. Die Durchführung solcher Verfahren ist seit langem gängige Praxis, so dass die zur Durchführung einzustellenden Verfahrensparameter anhand einfacher Vorversuche oder anhand des allgemeinen Fachwissens leicht optimiert werden können. Ferner sind die zur Durchführung solcher Verfahren benötigten Substanzen verhältnismäßig preiswert sowie leicht und schnell erhältlich. Die zur Durchführung der Amplifikation benötigten Geräte sind zudem in der überwiegenden Zahl der molekularbiologischen Forschungsinstitute und/oder Arbeitsgruppen bereits vorhanden.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Figuren und einiger Ausführungsbeispiele näher beschrieben. Es stellen dar:

Fig. 1a schematische Darstellung der kompetitiven Bindung einer nachzuweisenden Substanz und eines Marker-Konjugates an eine mit einem Bindungsmolekül als Anker-Reagenz modifizierten Oberfläche;

Fig. 1b schematische Darstellung der kompetitiven Bindung einer homogen-gelösten nachzuweisenden Substanz und eines der nachzuweisenden Substanz strukturchemisch-ähnlichen, Oberflächen-gebundenen Anker-Reagenz an ein Marker-Konjugat;

Fig. 2 schematische Struktur verschiedener Marker-Konjugate: 1. eines DNA- Streptavidin Nanoringes, der mit biotinylierten Erkennungsgruppen gekuppelt ist, sowie 2. eines kovalenten DNA-Erkennungsgruppe-Konjugats;

Fig. 3 Elektrophoretische Charakterisierung von DNA-Streptavidin Nanoringen, die mit unterschiedlichen biotinylierten Erkennungsgruppen verknüpft sind, anhand ihrer thermischen Stabilität;

Fig. 4 Nachweis von Fluorescein. Darstellung der relativen Signalintensitäten gegen die Konzentration der nachzuweisenden Substanz (Fluorescein).

Fig. 1a zeigt schematisch den möglichen Ablauf des kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahrens nach Vorgehen f.). Der Nachweis erfolgt durch die kompetitive Kupplung (a-­ d) einer nachzuweisenden Substanz (Kreis) und eines Marker-Konjugats an einen festphasenimmobilisierten Antikörper als Anker-Reagenz sowie die anschließende Signalerzeugung (e):

• 1. a.) Immobilisierung eines Antikörpers (Y-förmig dargestellt) an eine Oberfläche.
• 2. b.) Zugabe von freier nachzuweisender Substanz (Kreis) sowie einem kompetitiven Marker-Konjugats (x) zu dem festphasenimmobilisierten Antikörper als Anker- Reagenz.
• 3. c.) Kompetitive Immobilisierung von nachzuweisender Substanz und Marker- Konjugat entsprechend ihres Konzentrationsverhältnisses.
• 4. d.) Entfernen von nicht immobilisierten Reagenzien durch stringentes Waschen der Oberfläche.
• 5. e.) Nachweis (Ausrufungszeichen) der immobilisierten Nucleinsäure des Marker- Konjugats.

Im zweiten Ausführungsbeispiel wurde Anti-Fluorescein-IgG (Sigma) als Anker-Reagenz verwendet, als Marker-Konjugat wurde ein mit biotinyliertem Fluorescein funktionalisierter DNA-Streptavidin-Nanoring beziehungsweise ein kovalentes DNA- Fluorescein Konjugat eingesetzt.

Im dritten Ausführungsbeispiel wurde Anti-beta-Endorphin-IgG (Sigma) als Anker- Reagenz verwendet, als Marker-Konjugat wurde ein mit biotinyliertem beta-Endorphin funktionalisierter DNA-Streptavidin-Nanoring eingesetzt.

Fig. 1b zeigt schematisch den möglichen Ablauf des kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahrens nach Vorgehen g.). Der Nachweis erfolgt durch die kompetitive Kupplung (a-­ d) einer nachzuweisenden Substanz (Kreis) und der kompetitiven festphasenimmobilisierten Substanz, als Anker-Reagenz, an ein Marker-Konjugat sowie die anschließende Signalerzeugung (e):

• 1. a.) Immobilisierung der kompetitiven Substanz an eine Oberfläche.
• 2. b.) Zugabe von freier nachzuweisender Substanz (Kreis) sowie eines Antikörper- Nucleinsäure-Konjugats (x) als Marker-Konjugat zu dem Anker-Reagenz.
• 3. c.) Immobilisierung des Marker-Konjugats an die frei nachzuweisende Substanz und an das Anker-Reagenz entsprechend ihres Konzentrationsverhältnisses.
• 4. d.) Entfernen von nicht Festphasen-gebundenen Reagenzien durch stringentes Waschen der Oberfläche.
• 5. e.) Nachweis (Ausrufungszeichen) der immobilisierten Nucleinsäure des Marker- Konjugats.

Fig. 2

• 1. zeigt schematisch den Aufbau eines funktionalisierten Nanorings aus Streptavidin (Kreis), einer doppelt biotinylierten Nucleinsäure (N) und einer biotinylierten Erkennungsgruppe (E).
• 2. zeigt schematisch den Aufbau eines kovalenten Konjugats aus einer Nucleinsäure (N) und einer kovalent gebundenen Erkennungsgruppe (E).

Fig. 3 zeigt die Abhängigkeit der Thermostabilität der DNA-Streptavidin-Nanoringe von dem gebundenen biotinylierten Hapten. Bei diesen, im ersten Ausführungsbeispiel beschriebenen Untersuchungen wurde der Anteil des DNA-Streptavidin-Nanorings, der bei einer definierten Temperatur noch stabil war, in einem 1,5 prozentigen Agarosegel densitometrisch bestimmt. Es wurden exemplarisch DNA-Streptavidin-Nanoringe ohne Funktionalisierung (1) und funktionalisiert mit biotinyliertem Fluorescein (2) und Aminobiotin (4) dargestellt.

Fig. 4 zeigt die Auswertung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Fluorescein. Als Anker-Reagenz wurde wie im zweiten Ausführungsbeispiel beschrieben Anti-Fluorescein-IgG verwendet, das Marker-Konjugat war ein Fluorescein funktionalisierter DNA-Streptavidin-Nanoring.

Ausführungsbeispiele 1. Ausführungsbeispiel Bildung und Stabilität der DNA-Streptavidin-Nanoringe

In diesem Ausführungsbeispiel wurde der STV-DNA Nanoring mit unterschiedlichen biotinylierten Haptenen funktionalisiert und anschließend auf seine Thermostabilität hin überprüft. Die Thermostabiltätskontrolle wurde durch Erhitzen des DNA-Streptavidin- Nanorings in einem Thermocycler sowie anschließender densitometrischen Quantifzierung der Zersetzungsprodukte in einem Agarosegel bestimmt.

Herstellung der markierten DNA-Streptavidin-Nanoringe

Die Herstellung des DNA-Streptavidin-Nanorings aus doppelt biotinylierter Nucleinsäure und dem tetravalenten Biotin-Bindungsprotein Streptavidin (STV; IBA Göttingen) erfolgte durch thermische Denaturierung eines DNA-STV Netzwerks. Solche Netzwerke wurden bereits ausführlich in der Literatur (Niemeyer, C. M. et al., Nucleic Acids Res 27 (23), 4553-61 (1999)) beschrieben. Als Nucleinsäure wurde dabei das ebenfalls in der Literatur (Niemeyer, C. M. et al., Nucleic Acids Res 27 (23), 4553-61 (1999)) beschriebene DNA-Fragment "AG" verwendet, ein doppelt 5'-biotinylierter Doppelstrang (ds) mit 169 Basenpaaren Länge. Diese Nucleinsäure ist mittels präparativer PCR durch Einsatz der beiden biotinylierten Primer bcA (Tabelle 1, Interactiva) und bG (Tabelle 1, Interactiva) aus der kommerziell erhältlichen Phagen- DNA M13mp18 (New England Biolabs) herstellbar.

Tabelle 1

Verwendete Oligonucleotid-Sequenzen

Zur Herstellung des selbst-assemblierenden Netzwerks wurden 373,2 pmol STV und 186,6 pmol AG in ein Volumen von 500 µl TE-Puffer (10 mM Tris-Cl, 1 mM EDTA, pH 7,5) pipettiert. Dieser Ansatz wurde 20 Minuten bei RT schüttelnd inkubiert. Anschließend wurden 500 µl TE zugefügt und der Ansatz in 20 × 50 µl Aliquote aufgeteilt.

Die Initiation der Nanoring-Bildung wurden durch die Inkubation für 90 s bei 85°C in einem Thermo-Cycler (MJ Research: PTC-200) und sofort anschließender Abkühlung für 10 Minuten auf Eis erreicht.

Für die Funktionalisierung des DNA-Streptavidin-Nanorings wurde 5 µM biotinyliertes Hapten (Tabelle 2) zu dem erneut zusammengeführten Ansatz zugegeben und für 20 Minuten bei RT auf einem Orbital-Schüttler inkubiert. Ebenso kann der DNA- Streptavidin-Nanoring ohne Funktionalisierung aufgereinigt werden (Tabelle 2, 1).

Tabelle 2

Funktionalisierung des DNA-Streptavidin-Nanorings mit Haptenen

Für die Aufreinigung des Hapten markierten DNA-Streptavidin-Nanorings wurde 1/5 Volumen 5 × Loading Buffer (20% Ficoll 400, 100 mM EDTA, 0,1% Bromphenolblau, 0,1% Xylenxyanol, pH 7,4) zugegeben und das Konjugat wurde in einem 1 prozentigen Agarose-Gel für 25 Minuten bei 120 Volt in einer Gelelektrophoresekammer (gibco) aufgetrennt. Nach Beendigung der Gelelektrophorese wurde das Gel mit einer Ethidiumbromid Färbelösung (2,5 µg/ml Ethidiumbromid (Serva) in Tris-Puffer (100 mM)) angefärbt. Die Produktbande wurde anschließend extrahiert und in einem Ultrafree-DA DNA-Extraktionsgefäß (Millipore) 10 Minuten bei 5000 rpm zentrifugiert. Nach der Elution aus dem Gel wurde der Ansatz in einem Centricon-30 Röhrchen auf ~300 µl eingeengt und in TE umgepuffert. Abschließend wurde der funktionalisierte DNA-Streptavidin-Nanoring im Photometer anhand seines DNA-Anteils quantifiziert. Der isolierte DNA-Streptavidin-Nanoring wurde nach Überführung in ein silikonisiertes Reaktionsgefäß (Biozym) bei 4°C gelagert.

Thermostabilitätskontrolle und Gelelektrophorese der DNA-Streptavidin-Nanoringe

Bei den Thermostabilitätsbestimmungen wurden je 10 µl der modifizierten DNA- Streptavidin-Nanoringe in einem Thermocycler (MJ Research) für 90 s bei Temperaturen zwischen 55°C und 95°C inkubiert und anschließend für 10 min auf Eis abgekühlt. Für die Charakterisierung der DNA-Streptavidin-Nanoringe wurden Gelelektrophorese- Methoden verwendet.

Die Aufbereitung der Proben und die Gelelektrophorese wurde wie bereits oben stehend beschrieben in einem 1,5 prozentigen Agarosegel durchgeführt.

Ergebnisse

Es konnte in diesem Ausführungsbeispiel überraschend gezeigt werden, dass die Thermostabilität des DNA-Streptavidin-Nanoringe abhängig von der gebundenen biotinylierten Substanz ist (Fig. 3; Tabelle 3).

Tabelle 3

Thermostabilität der funktionalisierten DNA-Streptavidin-Nanoringe

Angegeben wurde die Temperatur in °C bei der noch 50% der DNA-Streptavidin-Nanoringe stabil waren (TD₅₀). Nomenklatur der DNA-Streptavidin-Nanoringe siehe Tabelle 2.

Dabei zeigte sich zudem sehr überraschend, dass die DNA-Streptavidin-Nanoringe auch nach der Funktionalisierung äußerst stabil bleiben und das sie sowohl nicht- funktionalisiert als auch funktionalisiert über einen längeren Zeitraum bei 4°C gelagert werden können.

2. Ausführungsbeispiel Nachweis von Fluorescein mittels des kompetitiver erfindungsgemäßen Verfahrens

In diesem Ausführungsbeispiel wurden Antikörper gegen Fluorescein als Anker-Reagenz sowie Fluorescein markierte STV-DNA Nanoringe (Fsc-Nanoringe) oder kovalente Fluorescein-DNA-Konjugate (Fsc-DNA) als Marker-Konjugat, zum kompetitiven Nachweis der niedermolekularen Substanz Fluorescein, verwendet. Der Nachweis wurde mittels der kombinierten Inkubation von Fluorescein und dem Marker-Konjugat auf einer mit Anti-Fluorescein-IgG beschichteten Oberfläche und anschließender PCR zur Amplifikation der im immobilisierten Marker-Konjugat enthaltenen Nucleinsäure durchgeführt. Die abschließende Detektion des PCR-Amplifikates erfolgte durch einen PCR-ELISA.

Herstellung von kovalenten Fluorescein-DNA-Konjugaten (Fsc-DNA)

Diese Fluorescein markierte Nucleinsäure ist mittels präparativer PCR durch Einsatz des Primers cA (Tabelle 4, Interactiva) und des Fluorescein gelabelten Primers fscG (Tabelle 4, Interactiva) aus der kommerziell erhältlichen Phagen-DNA M13mp18 (New England Biolabs) herstellbar. Die dabei verwendeten Amplifizierungs-Bedingungen wurden bereits in der Literatur (Niemeyer, C. M. et al., Nucleic Acids Res 27 (23): 4553-61 (1999)) beschrieben.

Tabelle 4

Verwendete Oligonucleotid-Sequenzen

Die Herstellung der Fluorescein markierten Nanoringe erfolgte wie im ersten Ausführungsbeispiel beschrieben.

Beschichtung von Mikrotiter-Modulen mit Anti-Fluorescein-Antikörpern

Die nicht-kovalente Verknüpfung der Mikrotiter-Module mit dem zur Immobilisierung des kompetitiven Reagenzien benötigten Anti-Fluorescein-IgG erfolgte durch Physisorption des Antikörpers an die zu funktionalisierende Oberfläche (Niemeyer, C. M. et al., Anal Biochem, 246 (1), 140-5 (1997))

Zunächst wurde eine Anti-Fluorescein-IgG (Sigma) Verdünnung von 10 pM in Immobilisierungs-Puffer (50 mM BH₃O₃, 1 µg/ml BSA, pH 9,5) hergestellt. In jedes well eines Top-Yield Moduls (Nung) wurden 30 µl der IgG Verdünnung aufgetragen und 12 Stunden bei 4°C inkubiert. Nicht gebundenes IgG wurde im Anschluss durch dreimaliges, je dreiminütiges Waschen mit 240 µl TBS-Puffer (20 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, pH 7,5) je Kavität entfernt. Danach wurde für mindestens 12 h bei 4°C ein Blockierungsschritt gegen unspezifische Wechselwirkungen mit 240 µl MESTBS-Puffer (TBS, 45% Milchpulver (Oxoid), 0,2% NaN₃, 5 mM EDTA, 1 mg/ml DNA MB-grade (Roche)) pro Kavität durchgeführt. Die Anti-Fluorescein-IgG beschichteten Mikrotitermodule können bis zu eine Woche mit diesem Puffer gelagert werden. Direkt vor dem Einsatz in dem kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahren wurden die Anti-Fluorescein-IgG beschichtete Top-Yield Module zweifach 30 Sekunden und zweifach fünf Minuten mit je 240 µl TETBS (TBS, 5 mM EDTA, 0,05% Tween-20) pro Kavität gewaschen.

Immobilisierung der DNA und des Haptens auf Mikrotiterplatten

Für die kompetitive Immobilisierung wurden das nachzuweisende Fluorescein und das Marker-Konjugat vor dem Auftragen auf die Anti-Fluorescein-IgG beschichteten Top- Yield Module gemischt.

Die Konzentration in dem Gemisch betrugen für das Marker-Konjugat 5 nM, das Fluorescein (Sigma) lag je nach Kavität in einer Verdünnung von 3-10000 pM vor. Das Gemisch wurde in einer Heat-Resistant-Plate V96 (Nunc) mit RDB-Puffer (MESTBS: TETBS = 1 : 10) oder in standardisiertem Humanserum (BISEKO), als Beispiel für eine biologische Matrix, verdünnt.

Je Kavität wurden 30 µl des Gemisches auf eine Anti-Fluorescein-IgG beschichtete Mikrotiterplatte aufgetragen und 30 min bei RT unter Schütteln inkubiert.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Detektion

Zum Nachweis der im Marker-Konjugat enthaltenen Nucleinsäure "AG" wurde eine enzymatische Vervielfältigung mittels PCR durchgeführt (Niemeyer, C. M. et al., Nucleic Acids Res 27 (23): 4553-61 (1999)). Vor diesem Amplifikationsschritt wurde zunächst dreifach für je dreißig Sekunden und vierfach für je vier Minuten mit 240 µl TETBS je Kavität unter orbitalem Schütteln bei Raumtemperatur gewaschen. Abschließend wurde noch zweifach für je eine Minute mit 240 µl TBS je Kavität gewaschen, um das PCR- hemmende EDTA des TETBS-Puffers aus den Kavitäten zu entfernen.

Die Module wurden mit Klebefolie (Plate Sealers, Dynex) verschlossen. Die Durchführung der PCR erfolgte in einem Gene Amplifying System 9600 (Perkin Elmer) oder alternativ in einem PTC-200 (MJ-Research) Thermalcycler mit 96-well Heizblock und aktiviertem Heizdeckel. Die PCR wurde wie in Niemeyer et al. (1997, 1999) beschrieben durchgeführt.

Der PCR-Mastermix enthielt biotinylierte Primer und Digoxigenin-dUTP, die durch eine zweifache Funktionalisierung des PCR-Amplifikates eine Detektion des erzeugten Nucleinsäure mittels PCR-ELISA erlauben. Dieses in der Literatur (Niemeyer, C. M. et al., Anal Biochem, 246 (1), 140-5 (1997)) beschriebene Verfahren ermöglichte über die Kupplung des biotinylierten PCR-Amplifikates an STV-beschichtete Mikrotitermodulen und anschließende Verknüpfung mit einem Anti-Digoxigenin Antikörper-Enzymkonjugat (Roche) einen empfindlichen, quantifizierbaren und reproduzierbaren enzymatischen Nachweis des Amplifikates. Dabei wurde für eine maximale Sensitivität des Assays das Fluoreszenz-generierenden Substrat AttoPhos™ (Roche) der alkalischen Phosphatase eingesetzt und mittels eines VICTOR 1420 Multilabelcounters (Wallac) das Fluoreszenzsignal vermessen.

Ergebnisse

Es konnte gezeigt werden, dass mit der durchgeführten Vorgehensweise zum Aufbau des kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahrens (Fig. 1a) der Nachweis von ca. 3 Picomolar Fluorescein möglich war (Tabelle 5, a). Bei einer Nachweisgrenze konventioneller kompetitiver Verfahren zum Nachweis von Haptenen, die im Idealfall im oberen picomolaren bis nanomolaren Bereich liegt (Van Bocxlaer et al., Mass Spectrom Rev, 19 (4), 165-214 (2000); Beike, J. et al., Int J Legal Med, 112 (1), 8-14 (1999); Winklmair, M. et al., Fresenius J Anal Chem, 358, 614-622 (1997)), entspricht dies einer Verbesserung der Nachweisempfindlichkeit um einen Faktor < 10. Durch den Einsatz des funktionalisierten DNA-Streptavidin-Nanoringe wurde in diesem Assay zudem, im Vergleich zu kovalenten DNA-Fluoresein-Konjugaten, ein überraschender Gewinn an Sensitivität erzielt (Fig. 4; Tabelle 5, b).

Tabelle 5

Ergebnisse des 2. Ausführungsbeispiels: Nachweis von Fluorescein (Fsc)

Angegeben sind jeweils relative Signalintensitäten, bezogen auf eine Kontrolle ohne Marker-Konjugat = 1. Der mittlere Fehler der Werte liegt bei ca. 15%.

Es konnte ebenso gezeigt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis von Fluorescein in komplexen Matrices wie Humanserum durchführbar ist (Tabelle 5, c).

3. Ausführungsbeispiel Nachweis von beta-Endorphin

In diesem Ausführungsbeispiel wurden Antikörper gegen beta-Endorphin (Sigma) als Anker-Reagenz sowie ein mit biotinyliertem beta-Endorphin (Sigma) markierter DNA- Streptavidin-Nanoring (beta-Endorphin-Nanoring) als Marker-Konjugat, zum kompetitiven Nachweis der niedermolekularen Substanz beta-Endorphin (Sigma) verwendet. Der Nachweis wurde mittels der kombinierten Inkubation von beta-Endorphin und der beta-Endorphin markierten DNA-Streptavidin-Nanoringe auf einer mit Anti-beta- Endorphin-Antikörpern beschichteten Oberfläche und anschließender PCR zur Amplifikation der im DNA-Streptavidin-Nanoring enthaltenen Nucleinsäure durchgeführt. Die abschließende Detektion des PCR-Amplifikates erfolgte durch einen PCR-ELISA. Die Durchführung der Experimente erfolgte entsprechend dem kompetitiven Nachweis von Fluorescein.

Ergebnisse

Es konnte überraschend gezeigt werden, dass mit der durchgeführten Vorgehensweise zum Aufbau des kompetitiven erfindungsgemäßen Verfahrens (Fig. 1a) und der Verwendung funktionalisierbarer DNA-Streptavidin-Nanoringe eine einfache Übertragung dieser Methode auf verschiedene Substanzen möglich ist (Tabelle 6). Dies wurde gezeigt durch die Abnahme der Signalintensität bei Anwesenheit der nachzuweisenden Substanz beta-Endorphin.

Tabelle 6

Ergebnisse des 3. Ausführungsbeispiels: Nachweis von beta-Endorphin

Angegeben sind jeweils absolute Fluorezenzintensitäten [a. u.]. Der mittlere Fehler der Werte liegt bei ca. 15%. Die Kontrolle enthält kein freies beta-Endorphin.

4. Ausführungsbeispiel Festphasen-Immobilisierung von Testosteron markierten DNA- Streptavidin-Nanoringen

In diesem Ausführungsbeispiel wurden Antikörper gegen Testosteron (Sigma) als Anker- Reagenz sowie ein mit biotinyliertem Testosteron (Luppa, P. et al., Clin Chem, 43(12), 2345-52 (1997)) markierter DNA-Streptavidin-Nanoring (Testosteron-Nanoring) als Marker-Konjugat verwendet. Die Immobilisierung wurde mittels der Inkubation von Testosteron markiertem DNA-Streptavidin-Nanoring auf einer mit Anti-Testosteron- Antikörpern beschichteten Oberfläche und anschließender PCR zur Amplifikation der im immobilisierten DNA-Streptavidin-Nanoring enthaltenen Nucleinsäure durchgeführt. Die abschließende Detektion des PCR-Amplifikates erfolgte durch einen PCR-ELISA. Die Durchführung der Experimente erfolgte entsprechend dem kompetitiven Nachweis von Fluorescein, jedoch ohne Anwesenheit der nachzuweisenden Substanz.

Ergebnisse

Es konnte gezeigt werden, dass die Testosteron funktionalisierten DNA-Streptavidin- Nanoringe spezifisch an die Antikörper beschichtete Oberfläche binden und somit für das kompetitive erfindungsgemäße Verfahren einsetzbar sind (Tabelle 7).

Tabelle 7

Ergebnisse des 4. Ausführungsbeispiels: Festphasen-Immobilisierung von Testosteron

Angegeben sind jeweils relative Einheiten. In der Positivkontrolle (PK) wurde der Testosteron- Nanoring auf Anti-Testosteron-IgG beschichteten Mikrotitermodulen immobilisiert. In den Negativkontrollen fehlte der Anti-Testosteron-Antikörper (NK 1) und der Testosteron-Nanoring (NK 2). Die Signalintensitäten wurde auf die NK 2 = 1 normiert. Der mittlere Fehler der Werte liegt bei ca. 15%.

Claims (11)

1. Verfahren zum Nachweis einer Substanz in wässriger Lösung, umfassend die Schritte:

• 1. a.) Bereitstellung einer mit einem Anker-Reagenz verbundenen Oberfläche
• 2. b.) Bereitstellung eines Marker-Konjugates aus einer Nucleinsäure und einer Erkennungsgruppe, dessen Bindung an die mit dem Anker-Reagenz beschichteten Oberfläche durch die Gegenwart der nachzuweisenden Substanz behindert wird.
• 3. c.) Zusammenbringen von nachzuweisender Substanz, Marker-Konjugat und der mit dem Anker-Reagenz beschichteten Oberfläche
• 4. d.) Nachweis des Marker-Konjugates
• 5. e.) Bestimmung der nachzuweisenden Substanz durch Bestimmung der durch die Anwesenheit der nachzuweisenden Substanz bewirkte Verringerung der Menge an über das Anker-Reagenz an die Oberfläche gebundenem Marker-Konjugat

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Anker-Reagenz ein Bindungsmolekül gegen die nachzuweisende Substanz ist, und die Erkennungsgruppe des Marker- Konjugates eine strukturchemisch identische oder ähnliche Gruppe wie die nachzuweisende Substanz ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das Anker-Reagenz eine strukturchemisch identische oder ähnliche Gruppe wie die nachzuweisende Substanz, und die Erkennungsgruppe des Marker-Konjugates ein Bindungsmolekül gegen die nachzuweisende Substanz ist.

4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zum Nachweis der Marker-Nucleinsäure diese amplifiziert wird.

5. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der nachzuweisenden Substanz um niedermolekulare Verbindungen wie Pharmakophore, Drogen, Dopingmittel, Hormone, oder andere Wirkstoffe oder Metabolite handelt.

6. Testassay um in einer wässrigen Lösung eine oder mehrerer Substanzen nachzuweisen, dadurch gekennzeichnet, dass mit der wässrigen Lösung mehrere Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt werden, wobei sich die Verfahren jeweils in der Spezifität der Bindungsmoleküle sowie der Sequenz oder Art der Marker-Nucleinsäure voneinander unterscheiden.

7. Marker-Konjugat zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das die Nucleinsäure und die Erkennungsgruppe des Marker-Konjugats über Biotin und Streptavidin, Avidin oder rekombinant- oder chemisch-modifizierte Derivate dieser Proteine verknüpft sind.

8. Marker-Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsgruppe des Marker-Konjugats über eine Biotingruppe an ein Konjugat aus einer Anzahl an Biotin-bindenden Proteinen und biotinylierten Nucleinsäuren erhalten wird.

9. Marker-Konjugat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Erkennungsgruppe des Marker-Konjugats über eine Biotingruppe mit einem DNA-Streptavidin Nanoring, bestehend aus einem doppelt­ biotinyliertem Doppelstrang-DNA Fragment und einem Molekül Streptavidin, verknüpft wird.

10. Kit zum Herstellen eines Marker-Konjugats nach Anspruch 7-9, umfassend:

• a) eine Erkennungsgruppe,
• b) eine Nucleinsäure,
• c) Mittel zum Verbinden der Erkennungsgruppe mit der Nucleinsäure, bzw. Mittel zum Verbinden des ersten Bindungsmoleküls mit der zweiten Nucleinsäure und Mittel zum Verbinden des zweiten Bindungsmoleküls mit der dritten Nucleinsäure.

11. Kit zur Durchführung eines der Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend:

• 1. a.) eine mit einem Anker-Reagenz beschichtete Oberfläche,
• 2. b.) ein Marker-Konjugat, bzw. Mittel zur Herstellung von Marker-Konjugaten.