WO2006048164A1 - Aptamerbasiertes testsystem - Google Patents

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WO2006048164A1
WO2006048164A1 PCT/EP2005/011477 EP2005011477W WO2006048164A1 WO 2006048164 A1 WO2006048164 A1 WO 2006048164A1 EP 2005011477 W EP2005011477 W EP 2005011477W WO 2006048164 A1 WO2006048164 A1 WO 2006048164A1
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WO
WIPO (PCT)
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aptamer
binding
test system
zone
detection structure
Prior art date
Application number
PCT/EP2005/011477
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen OBERSTRASS
Reinhard Schaper
Original Assignee
Analyticon Biotechnologies Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Analyticon Biotechnologies Ag filed Critical Analyticon Biotechnologies Ag
Publication of WO2006048164A1 publication Critical patent/WO2006048164A1/de

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers

Definitions

  • the invention relates to an aptamer-based assay system for detecting a species of analytes in a test liquid with detection of a signal dependent on a detection structure
  • a detection structure comprising a species of oligofunctional reaction units, each having at least one analyte-binding first aptamer and at least one of the first aptamer and having a second aptamer capable of binding to binding regions of the detection structure, wherein the first aptamer and the second aptamer of each reaction unit are linked such that binding of the first aptamer of a reaction unit to an analyte simultaneously binding of the second aptamer of the same reaction unit to a binding region of the Detection structure inhibited.
  • the invention further relates to a test method for detecting a species of analytes in a test liquid with detection of a signal dependent on a detection structure, wherein a species of oligofunctional reaction units, each having at least one analyte-binding first aptamer and at least one with the first aptamer having linked and bindable with binding regions of the detection structure, second aptamer, via bonds of first aptamers with analytes and via bonds of second aptamers to binding regions of the detection structure, wherein the first aptamer and the second aptamer of each reaction unit are linked such that binding of the first aptamer of a reaction unit with an analyte inhibits simultaneous binding of the second aptamer of the same reaction unit to a binding region of the detection structure ,
  • test system and method are known from WO 99/60169 A1.
  • an aptamer is meant a functional oligonucleotide moiety. It is known that oligonucleotides, i. Fold DNA or RNA sequences from a few bases (up to a few 100 bases) into 3-dimensional structures that may depend on sequence, environmental parameters, binding environment, etc. Depending on the extent of the 3-dimensional structure, such aptamers can interact with, in particular bind with corresponding regions of target molecules. In principle, all more complex organic compounds are suitable as target molecules, especially biomolecule groups, such as, for example, proteins, nucleic acids, haptens, hormones, drugs, etc. In this case, the aptamer corresponds to binding regions of the target molecule which are unique to the target molecule or only in a small group of Target molecules occur, the binding between aptamer and target molecule may be specific or at least selective.
  • aptamers Their ability to bind to specific areas of their target molecules allows aptamers to be used to specifically influence molecular functions.
  • the enzymatic function of certain proteins can be understood Aptamers regulate, for example, by the aptamer binding, a refolding of the protein is initiated or by the catalytic center of an enzyme is sterically inhibited.
  • Examples of such regulatory effects of aptamers are known from "Isozyme-specific Inhibition of Protein Kinase C by RNA-Aptameres" by Conrad R. Keranen, LM; Allington, AD; Newton, AC in The Journal of Biological Chemistry, Vol. 269, No.
  • aptamers having desired properties are usually selected in selection methods, such as, for example, the so-called SELEX method for RNA aptamers.
  • selection methods such as, for example, the so-called SELEX method for RNA aptamers.
  • sequence of an aptamer having the desired properties is known, it is also possible to represent such an aptamer by conventional methods of nucleic acid synthesis and / or duplication (e.g., PCR).
  • the individual aptamers bind either to an analyte or to a so-called fluorescence beacon also present in the test system, an oligonucleotide structure having two fluorophores, which is a so-called FRET pair (Fluorescence resonance energy transfer) form, in particular, the distance of the FRET partners is chosen so small that it comes in the unbound beacon to an efficient deletion of the donor fluorescence.
  • FRET pair Fluorescence resonance energy transfer
  • the aptamer loses its ability to bind with an analyte through refolding.
  • the donor fluorescence can therefore serve as a measure of the amount of beacon-bound, ie not bound by analyte aptamers, and thus indirectly for the amount of analytes present in the test liquid.
  • a disadvantage of this known test system is that aptamer, beacon and analyte must each be tuned to each other in a unique way.
  • the development of new test systems for new analytes is therefore very expensive.
  • the measurement of FRET efficiencies requires highly complex and very expensive fluorescence gauging stations that make the prior art test method unsuitable for routine high throughput sampling.
  • WO 02/061079 A2 discloses a test system in which the abovementioned oligofunctional reaction units are designed as crosslink structures with two aptameric functional heads for coupling an analyte to a detectable unit.
  • an aptamer specific for the analyte is coupled to a second aptamer which is capable of binding streptavidin by means of a coupling unit designated as "adaptamer.”
  • streptavidin can be used as a link to biotinylated, detectable units, such as Fluorescent markers, color reaction-causing enzymes, particulate direct markers, etc. can be used.
  • detectable units such as Fluorescent markers, color reaction-causing enzymes, particulate direct markers, etc.
  • the principle of the known test system is based on the direct labeling of the analytes by aptamer-containing cross-link structures, which in turn are labeled or markable with further, detectable units.
  • a disadvantage of this known test system is the relative insensitivity and lack of flexibility of such direct tests, in which the sensitivity of the measuring apparatus for the detection of the signal is limited by a minimum absolute amount or concentration of the analyte. In particular, very low analyte concentrations can not be reliably measured or detected with such direct tests.
  • a direct test in the form of an aptamer-based signal / reporter test system is also known from WO 01/57259 A1.
  • a signal in the form of a conformational change is passed on to a covalently bound, non-aptameric reporter molecule, which subsequently generates an enzymatic signal.
  • the chain of influence between signaling and reporter molecule is purely unidirectional from the signal to the reporter molecule.
  • Object of the present invention is to develop a generic test system or a generic test method such that greater flexibility and sensitivity in the detection of analytes is achieved.
  • first aptamer and the second aptamer of each reaction unit are further linked together such that binding the second aptamer of a reaction unit with a binding region of the detection structure, a simultaneous binding of the first Aptamers the same reaction unit with an analyte inhibited.
  • first aptamer and the second aptamer of each reaction unit are further linked such that binding the second aptamer of a reaction unit to a binding region of the detection structure simultaneously binds the reaction first aptamer of the same reaction unit with an analyte.
  • an essential feature of the invention is that, in contrast to the prior art, the oligofunctional, in particular bifunctional reaction unit is configured not as a crosslink structure but with at least pairwise exclusively bindable aptamer functional units.
  • bifunctional reaction units for the purpose of simplifying the understanding of the invention.
  • inventive concept is also applicable to reaction units with more than two aptameric function heads.
  • the required aptamers are first prepared individually and by known selection or synthesis methods.
  • the selection or synthesis of the aptamers is such that the binding of the first aptamer with the analyte and / or the binding of the second aptamer with the Binding region of the detection structure is selective, in particular specific.
  • the size of the aptamers may vary depending on the manufacturing process and application. Sequences of approximately 40 nucleotides or less have been found to be particularly beneficial for most analytes of interest. Aptamers which occupy a "hairpin" structure and have a more or less distinct helical axis are preferably used.
  • the binding sites for the target molecules, ie analyte or binding region of the detection structure are preferably perpendicular to the helical axis and are not within the range of curvature of the hairpin ".
  • the helical axis e.g. be curved by incorporation of unpaired nucleic acids, so that in the region of curvature of the hairpins lying binding sites of the aptamers are arranged adjacent in the reaction unit.
  • the aptameric functional heads of the reaction unit are covalently linked together. This can be done, for example, by one-piece chemical synthesis, by ligation with a DNA or RNA ligase, or by chemical or photoactivatable couplers that are incorporated into an aptameric functional head by chemical synthesis and then chemically bridged with one lead to other aptameric function head.
  • the aptamers are preferably arranged so that their respective helical axes are combined to a long axis, ie, substantially aligned with each other.
  • the binding sites on the reaction unit are geometrically arranged to lie on the same side of the helical region.
  • the mutual inhibition of the bonds with the target molecules is facilitated.
  • this can be achieved simply by inserting as many base pairs of an inert sequence, preferably with the basic structure G (C) I G (C) 2 G (C) 3 G (C) 4, etc., in an empirical procedure until due to steric optimization results in the greatest possible inhibition effect.
  • the aptameric function heads can be connected to one another directly or via a coupling unit.
  • the first aptamer and the second aptamer of the same reaction unit overlap each other in regions.
  • two aptameric function heads have parts of their nucleotide sequence in common. It is obvious that in such an embodiment the mutual inhibition effect is particularly great.
  • the first aptamer and the second aptamer of the same reaction unit are spatially separated.
  • detection structure is to be understood broadly and encompasses both molecular and apparatus structures.
  • the test system and method according to the invention so that the binding of the second aptamer to a binding region of the Detection structure does not affect the signal dependent on the detection structure signal.
  • the detection structure could include a particulate direct label.
  • biotin-luted nanoparticles could preferably serve, for example, which adhere to streptavidin bound by the second aptamer.
  • the signal depends on a binding state of the detection structure with the second aptamer. In this case, otherwise required cleaning steps for separating unbound detection structure components can be omitted.
  • the detection structure comprises a species of enzymes coupled to binding regions of the detection structure whose enzymatic reaction with a species of substrates causes a change in a detectable size.
  • usable enzymes are, for example, oxido-reductases (eg alcohol dehydrogenase, glucose oxidase, peroxidase, luciferic acid, etc.), transferases (eg hexokinase), hydrolases (eg phosphatase, urease, lysozyme, nucleases, etc.), lyases (eg dichloromethane Dehalogenase, etc.), isomerases (eg, retinal isomerase), synthetases (eg, RNA ligase, DNA ligase, etc.), etc.
  • a different size can be used as a detectable signal. Examples include color changes, extinction or transmission changes, changes in optical polarization, pH changes
  • binding the second aptamer of a reaction unit having a binding region inhibits the enzymatic reaction of the enzyme coupled to this binding region with the substrate. This can be achieved, for example, by refolding the enzyme, initiated by the binding of the aptamer, or, preferably, by the binding region in each case lying in the region of the catalytic center of the enzyme and this being blocked by the binding of the second aptamer.
  • the detection structure comprises a species of first fluorescence-active components coupled to binding regions of the detection structure.
  • first fluorescence-active components any units which are themselves fluorophores or which can influence the fluorescence of other adjacent fluorophores are understood as fluorescence-active components.
  • the first fluorescence-active component is a fluorophore
  • reaction units which have bound to the detection structure with their second aptamer can be detected by the fluorescence of this fluorophore.
  • the reaction units are each provided with a second fluorescence-active component which, depending on the binding state of the second aptamer with a binding region of the detection structure with the first fluorescence-active component, which is coupled with this binding region in optically detectable way interacts.
  • a second fluorescence-active component which, depending on the binding state of the second aptamer with a binding region of the detection structure with the first fluorescence-active component, which is coupled with this binding region in optically detectable way interacts.
  • the interacting first and second fluorescence-active components each have a partner of a Represent FRET pair.
  • One partner acts as a donor, while the other acts as an acceptor or quencher.
  • the detection structure comprises a surface and / or mass occupation sensitive sensor arrangement.
  • the detection structure is an apparative structure.
  • sensor units that can be excited to mechanical vibrations and whose mechanical impedance can be measured by spectral analysis of the resulting mechanical vibrations are suitable as surface and / or mass occupation-sensitive sensor arrangements.
  • the mechanical impedance depends on the area or mass occupancy.
  • Such sensor units are very small in size and available in integrated circuit design.
  • the sensor arrangement has a plurality of binding regions that can be bonded to the second aptamers.
  • reaction units that do not bind with an analyte bind directly to the sensor structure.
  • the sensor unit must then be correspondingly sensitive.
  • the test system comprises a species of mediator units, each having a bondable to the second aptamer binding region, wherein the mediator units can be coupled depending on the binding state of their binding areas with the sensor unit.
  • a so-called strip test is suitable for domestic use, in which the detection is carried out optically, in particular as part of a color reaction and particularly preferably as part of an enzyme-mediated color reaction.
  • Such a test system is advantageously distinguished by the fact that the enzymes coupled with the binding regions and the oligofunctional reaction units are contained in a first zone of a porous support, wherein at least the oligofunctional reaction units are fixed in the dry state of the porous support and after wetting the first zone with the test liquid are movable at least within the first zone, so that a competitive reaction of the oligofunctional reaction units with the analytes on the one hand and the binding regions on the other hand done and wherein the substrates are contained in a second zone adjacent to the first zone and fixed in the dry state of the porous support in the second zone and movable after wetting the second zone with the test liquid from the second zone into the first zone.
  • Responsiveness depends on the binding state of the enzyme with the second aptamer. However, if the enzyme and the reaction unit are in close proximity in a first zone, the substrate must first migrate to the enzyme. This ensures that the enzyme-substrate reaction takes place after the enzyme-reaction unit reaction.
  • the first and the second zone by means of a semi-permeable membrane, which prevents a crossing of the enzymes from the first zone to the second zone and a crossing of the substrates of the second zone is allowed in the first zone, are separated from each other. In this way, the time it takes the enzyme and substrate to find each other is prevented from being shortened by the enzyme "migrating" to the substrate.
  • the buildup is Such a membrane for the expert is no difficulty.
  • the enzymes are permanently fixed in the first zone. This can be done for example by means of a biotin / streptavidin coupling with the material of the porous support.
  • first and second zones next to one another on the test strip.
  • first zone and the second zone are arranged in two superimposed layers of the porous support.
  • the first zone is subdivided into at least a first subzone which contains the enzymes and a second subzone which contains the reaction units.
  • the first partial zone and the second partial zone may be arranged in two superimposed layers of the porous carrier, wherein a particularly favorable layer sequence is: first partial zone, second partial zone, optionally semi-permeable membrane, second zone.
  • FIG. 1 shows a schematic schematic diagram of the test system according to the invention
  • FIG. 2 shows a schematic representation of an exemplary reaction unit
  • Figure 3 a schematic representation of another exemplary reaction unit
  • Figure 4 a schematic representation of a strip test according to the invention.
  • FIG. 1 shows a schematic representation of the test system according to the invention.
  • Core of the test system are reaction units 10, each having two aptamer function heads 12 and 14.
  • the aptameric function heads 12 and 14 are interconnected via a coupling structure 16.
  • a first aptamer 12 is selected or synthesized such that it can bind selectively and in particular specifically with an analyte.
  • the second aptamer 14 is selected or synthesized such that it can bind permanently to the catalytic center 22 of an enzyme 20. That is, by binding the aptamer 14 to the enzyme 20, its catalytic center 22 is blocked.
  • reaction units 10 analytes 18 and enzymes 20 are mixed in a first test step. This is preferably carried out in a test liquid whose physical properties, such as temperature, pH, etc., are suitably chosen so that the said and other physiological functions of the reactants involved can proceed.
  • Some of the reaction units 10 bind with their first aptamer 12 with the analytes 18 (arrow 28).
  • Other reaction units 10 bind with their second aptamer 14 to the catalytic centers 22 of enzymes 20 (arrow 30). Simultaneous binding of an analyte 18 and an enzyme 20 to a reaction unit 10 is not possible due to the 3-dimensional structure of the reaction unit 10. Rather, these reactions inhibit each other, so that there is a competitive test principle.
  • a substrate 32 is added to the test liquid (arrow 34), which undergoes an enzymatic reaction with temporary binding to the catalytic center 22 of the enzyme 20 (symbolized by reaction arrow 36).
  • the substrate 32 is changed by the enzyme 20, which can lead to a detectable signal, for example a color change, a pH change, a change in an optical polarization, etc.
  • the strength of the enzymatic reaction and thus the strength of the signal is dependent on the amount of available, unbound enzyme 20 (arrow 38) and thus indirectly on the amount of the analyte 18 in standardized test conditions.
  • the aptamers 12 and 14 each consist of a so-called "hairpin" with a curvature 122, 142 of unpaired nucleic acids and a helical region 124, 144 of paired nucleic acids 14 are each selected and / or synthesized such that they are capable of binding with their respective target molecules (analyte 18 or enzyme 20) and are preferably selective, in particular specific
  • the aptamer 14 shows a further loop 146 to a To symbolize the difference of the 3-dimensional structure of the aptamer 14 against the aptamer 12.
  • the aptamers 12 and 14 are interconnected by means of a coupling structure 16, not shown.
  • the coupling structure 16 may also be formed as a suitable oligonucleotide structure, wherein the exact structure and sequence as well as the connection method is suitably to be selected by a person skilled in the art.
  • FIG. 3 schematically illustrates another embodiment of a reaction unit 10 having two aptamers 12 and 14.
  • the aptamers 12 and 14 each have a hairpin 122, 142, but with their helical regions 124, 144.
  • both aptamers 12 and 14 each have another loop 126, 146 which is responsible for their binding to the particular target molecule , 144 are selected so that the additional loops 126, 146 on the same side (at the top in FIG. 3) of the Reaction structure 10 are.
  • additional pairs of nucleic acid may be incorporated to extend the helical structure to achieve the orientation shown in FIG.
  • FIG. 4 shows schematically the structure of a so-called strip test, which realizes the test principle according to the invention.
  • Reaction units 10, analytes 18, enzymes 20 and substrates 32 are as shown in FIG.
  • the strip test of FIG. 4 has two superimposed layers of porous carrier material, for example nitrocellulose.
  • porous carrier material for example nitrocellulose.
  • reaction units 10 and enzymes 20 are applied in such a way that they are immobilized in the dry state of the support material, while they can move in the wet state of the support material in this and in particular react with each other.
  • a substrate species 32 is arranged in the same way.
  • reaction units 10 and enzymes 20 may also be arranged in different subregions of the upper layer 50.
  • the layers 50 and 52 are separated by a semi-permeable membrane 54.
  • the pores of this membrane 54 allow the substrate 32 to diffuse from the lower layer 52 into the upper layer 50 when the support is in a wet state.
  • diffusion of the enzyme 20 from the upper layer 50 into the lower layer 52 is prevented by the membrane 54.
  • Part 4a shows the described initial state in a dry carrier.
  • Subfigure 4b symbolizes the addition of Analyte 18 containing test liquid 58 (arrow 60).
  • the reactants In the carrier moistened by the test fluid 58, the reactants begin to migrate with the liquid in the carrier due to the acting capillary forces.
  • this competitive reaction is not disturbed by binding of substrates 32 to the enzymes 20, since these are spatially separated in the lower layer 52 and only have to diffuse through the membrane 54 into the upper layer 50. They reach the unbound enzymes 20 only at a time when the competitive reaction has already reached equilibrium or at least progressed to a defined degree.
  • FIG. 4d indicates the last test step in which the substrates 32 react with the enzymes 20 and generate the detectable signal.

Abstract

Aptamerbasiertes Testsystem und Verfahren zum Nachweis einer Spezies von Analyten (18) in einer Testflüssigkeit (58) unter Detektion eines von einer Detektionsstruktur (20) abhängigen Signals, umfassend eine Spezies oligofunktionaler Reaktionseinheiten (10), die jeweils wenigstens ein mit einem Analyten (18) bindungsfähiges, erstes Aptamer (12) und wenigstens ein mit dem ersten Aptamer (12) verknüpftes und mit Bindungsbereichen (22) der Detektionsstruktur (20) bindungsfähiges, zweites Aptamer (14) aufweisen, wobei das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) jeder Reaktionseinheit (10) derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des ersten Aptamers (12) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten (18) ein simultanes Binden des zweiten Aptamers (14) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) inhibiert und ein Binden des zweiten Aptamers (14) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) ein simultanes Binden des ersten Aptamers (12) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten (18) inhibiert.

Description

Aptamerbasiertes Testsystem
Beschreibung
Die Erfindung bezieht sich auf ein aptamerbasiertes Testsystem zum Nachweis einer Spezies von Analyten in einer Testflüssigkeit unter Detektion eines von einer Detektionsstruktur abhängigen Signals, umfassend eine Spezies oligofunktionaler Reaktionseinheiten, die jeweils wenigstens ein mit einem Analyten bindungsfähiges, erstes Aptamer und wenigstens ein mit dem ersten Aptamer verknüpftes und mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur bindungsfähiges, zweites Aptamer aufweisen, wobei das erste Aptamer und das zweite Aptamer jeder Reaktionseinheit derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des ersten Aptamers einer Reaktionseinheit mit einem Analyten ein simultanes Binden des zweiten Aptamers derselben Reaktionseinheit mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur inhibiert.
Die Erfindung bezieht sich weiter auf ein Testverfahren zum Nachweis einer Spezies von Analyten in einer Testflüssigkeit unter Detektion eines von einer Detektionsstruktur abhängigen Signals, wobei eine Spezies oligofunktionaler Reaktionseinheiten, die jeweils wenigstens ein mit einem Analyten bindungsfähiges, erstes Aptamer und wenigstens ein mit dem ersten Aptamer verknüpftes und mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur bindungsfähiges, zweites Aptamer aufweisen, über Bindungen erster Aptamere mit Analyten und über Bindungen zweiter Aptamere mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur binden, wobei das erste Aptamer und das zweite Aptamer jeder Reaktionseinheit derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des ersten Aptamers einer Reaktionseinheit mit einem Analyten ein simultanes Binden des zweiten Aptamers derselben Reaktionseinheit mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur inhibiert.
Ein derartiges Testsystem und ein derartiges Verfahren sind bekannt aus WO 99/60169 Al.
Unter einem Aptamer versteht man eine funktionale Oligonukleotideinheit. Es ist bekannt, dass Oligonukleotide, d.h. DNA- oder RNA-Sequenzen aus wenigen Basen (bis zu wenigen 100 Basen) zu 3-dimensionalen Strukturen falten, die von Sequenz, Umgebungsparametern, Bindungsumfeld etc. abhängig sein können. Je nach Ausprägung der 3-dimensionalen Struktur können solche Aptamere mit korrespondierenden Bereichen von Zielmolekülen in Wechselwirkung treten, insbesondere binden. Als Zielmoleküle kommen prinzipiell sämtliche komplexeren organischen Verbindungen infrage, vor allem Biomolekülgruppen, wie beispielsweise Proteine, Nukleinsäuren, Haptene, Hormone, Drogen etc.. Korrespondiert dabei das Aptamer mit Bindungsbereichen des Zielmoleküls, die für das Zielmolekül einzigartig sind oder lediglich bei einer kleinen Gruppe von Zielmolekülen auftreten, kann die Bindung zwischen Aptamer und Zielmolekül spezifisch oder zumindest selektiv sein.
Durch ihre Bindungsfähigkeit an bestimmte Bereiche ihrer Zielmoleküle können Aptamere zur gezielten Beeinflussung molekularer Funktionen genutzt werden. Beispielsweise lässt sich die enzymatische Funktion bestimmter Proteine durch Aptamere regulieren, indem beispielsweise durch die Aptamer- Bindung eine Umfaltung des Proteins initiiert wird oder indem das katalytische Zentrum eines Enzyms sterisch inhibiert wird. Beispiele für derartige, regulatorische Wirkungen von Aptameren sind bekannt aus „Isozyme-spezific Inhibition of Protein Kinase C by RNA-Aptameres" von Conrad R.; Keranen, L.M. ; Allington, A.D.; Newton, A.C. in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 269, Nr. 51, Seite 32051-32054 (1994) sowie „Controlling Protein Activity with Ligand- Regulated RNA Aptamers" von Vuyisich, M.; Beal, P.A. in Chemistry & Biology, Bd. 9, Seite 901-913 (2002) .
Da sich die speziellen Bindungseigenschaften derzeit schlecht aus der reinen Nukleinsäuresequenz vorhersagen lassen, werden Aptamere mit gewünschten Eigenschaften üblicherweise in Selektionsverfahren, wie beispielsweise dem sogenannten SELEX-Verfahren für RNA-Aptamere, selektioniert. Ist die Sequenz eines Aptamers mit den gewünschten Eigenschaften bekannt, ist es jedoch auch möglich, ein solches Aptamer mit herkömmlichen Methoden der Nukleinsäure-Synthese und / oder -Vervielfältigung (z.B. PCR) zu repräsentieren.
Aus der US 6,177,555 Bl ist es bekannt, sich die selektiven Bindungseigenschaften von Aptameren im Rahmen von Testsystemen zum Nachweis spezieller Analyten, für welche die Aptamere selektiv sind, zu Nutze zu machen. In der genannten Druckschrift wird ein Testsystem offenbart, bei welchem eine Aptamerspezies mit einer in einer Testlösung enthaltenen Spezies von Analyten zur Wechselwirkung gebracht wird. Die einzelnen Aptamere binden dabei jeweils entweder an einen Analyten oder an ein ebenfalls in dem Testsystem vorhandenes sogenanntes Fluoreszenz-Beacon, eine Oligonukleotidstruktur mit zwei Fluorophoren, die ein sogenanntes FRET-Paar (Fluorezenz-Resonanz-Energie-Transfer) bilden, insbesondere ist der Abstand der FRET-Partner so klein gewählt, dass es im ungebundenen Beacon zu einer effizienten Löschung der Donor- Fluoreszenz kommt. Bei Bindung des Beacons mit dem Aptamer wird die Beacon-Sequenz in die Aptamer-Sequenz integriert. Hierdurch kommt es zu einer Umfaltung des neuen Gesamtmoleküls und insbesondere zu einer Vergrößerung des Abstandes der FRET-Partner, was zu einer Aufhebung der Löschung der Donor-Fluoreszenz führt. Gleichzeitig verliert das Aptamer durch die Umfaltung seine Bindungsfähigkeit mit einem Analyten. Die Donor-Fluoreszenz kann daher als Maß für die Menge Beacon-gebundener, d.h. nicht durch Analyten gebundener Aptamere, und somit indirekt für die Menge der in der Testflüssigkeit vorliegenden Analyten dienen.
Nachteilig an diesem bekannten Testsystem ist, dass Aptamer, Beacon und Analyt jeweils in einzigartiger Weise aufeinander abgestimmt sein müssen. Die Entwicklung neuer Testsysteme für neue Analyten ist daher sehr aufwendig. Zudem erfordert die Messung von FRET-Effizienzen hochkomplexe und sehr teuere Fluoreszenz-Messstationen, die das bekannte Testverfahren für Routinemessungen mit hohem Probendurchsatz ungeeignet machen.
Aus der WO 02/061079 A2 ist ein Testsystem bekannt, bei dem die oben genannten oligofunktionalen Reaktionseinheiten als Crosslink-Strukturen mit zwei aptameren Funktionsköpfen zu Kopplung eines Analyten mit einer detektierbaren Einheit ausgestaltet sind. Hierzu wird ein für den Analyten spezifisches Aptamer mittels einer als „Adaptamer" bezeichneten Koppeleinheit mit einem zweiten Aptamer gekoppelt, welches in der Lage ist, Streptavidin zu binden. Bekanntermaßen kann Streptavidin als Verbindungsglied zu biotinilierten, detektierbaren Einheiten, wie etwa Fluoreszenz-Markern, Farbreaktionen auslösenden Enzymen, partikelförmigen Direktmarkierungen etc. verwendet werden. Das Prinzip des bekannten Testsystems beruht auf der direkten Markierung der Analyten durch aptamerhaltige Crosslink- Strukturen, die ihrerseits mit weiteren, detektierbaren Einheiten markiert oder markierbar sind.
Nachteilig bei diesem bekannten Testsystem ist die relative Insensitivität und mangelnde Flexibilität derartiger Direkttests, bei denen die Sensitivität der Messapparatur zur Detektion des Signals durch eine Mindest-Absolutmenge bzw. -Konzentration des Analyten beschränkt ist. Insbesondere sehr geringe Analytkonzentrationen sind mit solchen Direkttests nicht zuverlässig mess- oder detektierbar.
Auch aus der WO 01/57259 Al ist ein Direkttest in Form eines aptamerbasiertes Signal-/Reporter-Testsystems bekannt. Dabei wird bei Bindung eines Liganden an ein Signal-Aptamer ein Signal in Form einer Konformationsänderung an ein kovalent gebundenes, nicht-aptamerisches Reportermolekül weitergegeben, welches in der Folge ein enzymatisches Signal erzeugt. Die Beeinflussungskette zwischen Signal- und Reportermolekül ist rein unidirektional vom Signal- zum Reportermolekül.
Ebenfalls einen Direkttest offenbart die gattungsbildende WO 99/60169 Al. Dabei wird versucht, den vorgenannten Nachteil dadurch zu überwinden, dass die Detektionsstruktur kovalent oder pseudoirreversibel mit der Reaktionseinheit, insbesondere dem ersten Aptamer, gebunden ist. Auf diese Weise wird ein Überschuss an freien (signalgebenden) Enzymen vermieden. Diese zusätzliche Kopplung ist jedoch mit erhöhtem Synthetisierungsaufwand und daher mit erhöhten Kosten verbunden. Außerdem ist eine zusätzliche biomolekulare Bindung in der Regel mit einem Stabilitätsverlust des gebildeten Komplexes verbunden. Dies macht zusätzliche Aufreinigungsschritte bei der Herstellung erforderlich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein gattungsgemäßes Testsystem bzw. ein gattungsgemäßes Testverfahren derart weiterzubilden, dass größere Flexibilität und Sensitivität beim Nachweis von Analyten erzielt wird.
Diese Aufgabe wird in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 1 dadurch gelöst, dass das erste Aptamer und das zweite Aptamer jeder Reaktionseinheit weiter derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des zweiten Aptamers einer Reaktionseinheit mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur ein simultanes Binden des ersten Aptamers derselben Reaktionseinheit mit einem Analyten inhibiert.
Diese Aufgabe wird weiter in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs von Anspruch 28 dadurch gelöst, dass das erste Aptamer und das zweite Aptamer jeder Reaktionseinheit weiter derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des zweiten Aptamers einer Reaktionseinheit mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur ein simultanes Binden des ersten Aptamers derselben Reaktionseinheit mit einem Analyten inhibiert.
Die Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Testsystems und des erfindungsgemäßen Testverfahrens sowie besonders günstige Ausführungsformen beider, die Gegenstand der abhängigen Ansprüche sind, werden nachfolgend gemeinsam beschrieben.
Ein wesentliches Merkmal der Erfindung ist, dass, im Gegensatz zum Stand der Technik, die oligofunktionale, insbesondere bifunktionale Reaktionseinheit nicht als Crosslink-Struktur sondern mit wenigstens paarweise exklusiv bindungsfähigen aptameren Funktionseinheiten ausgestaltet wird. Im Rahmen der nachfolgenden Beschreibung wird zum einfacheren Verständnis der Erfindung im Wesentlichen auf bifunktionale Reaktionseinheiten Bezug genommen. Es sei jedoch ausdrücklich angemerkt, dass das erfindungsgemäße Konzept auch auf Reaktionseinheiten mit mehr als zwei aptameren Funktionsköpfen anwendbar ist.
Durch exklusive Bindung der Reaktionseinheit entweder an einen Analyten oder an einen Bindungsbereich der Detektionsstruktur lassen sich die Vorteile, die mit der Verwendung von Aptameren verbunden sind, auch bei kompetitiven Tests nutzen. Kompetitive Tests sind jedoch insbesondere im Bereich kleiner Analytkonzentrationen deutlich sensitiver als Direkttests, da sich durch geeignete Auswahl der Konzentrationen der Reaktionspartner die messbaren Signale in einen für die verwendete Detektionsapparatur jeweils optimalen Intensitätsbereich transformieren lassen.
Zur Herstellung der Reaktionseinheiten zur Verwendung im Rahmen der Erfindung werden zunächst die benötigten Aptamere einzeln und nach bekannten Selektions- bzw. Syntheseverfahren hergestellt. Vorzugsweise erfolgt die Auswahl bzw. Synthese der Aptamere so, dass das Binden des ersten Aptamers mit dem Analyten und / oder das Binden des zweiten Aptamers mit dem Bindungsbereich der Detektionsstruktur selektiv, insbesondere spezifisch ist.
Die Größe der Aptamere kann je nach Herstellungsverfahren und Anwendungsbereich unterschiedlich sein. Als besonders günstig für die meisten, interessierenden Analyten haben sich Sequenzen von ungefähr 40 Nukleotiden oder weniger erwiesen. Vorzugsweise werden Aptamere verwendet, die eine „Hairpin"- Struktur einnehmen und eine mehr oder weniger deutliche helikale Achse aufweisen. Die Bindungsstellen für die Zielmoleküle, d.h. Analyt oder Bindungsbereich der Detektionsstruktur, stehen vorzugsweise senkrecht zur helikalen Achse und liegen nicht im Krümmungsbereich des „Hairpins". Bei einer anderen Ausführungsform kann auch die helikale Achse, z.B. durch Einbau ungepaarter Nukleinsäuren gekrümmt sein, so dass im Krümmungsbereich der „Hairpins" liegende Bindungsstellen der Aptamere in der Reaktionseinheit benachbart angeordnet sind.
Günstigerweise sind die aptameren Funktionsköpfe der Reaktionseinheit kovalent miteinander verbunden. Dies kann beispielsweise durch chemische Synthese an einem Stück, durch enzymatische Verbindung (Ligation) mit einer DNA- oder RNA- Ligase oder durch chemische oder photoaktivierbare Koppler geschehen, die in einen aptameren Funktionskopf durch chemische Synthese eingebaut werden und dann zu einer chemischen Verbrückung mit einem anderen aptameren Funktionskopf führen. Bei einer bifunktionalen Reaktionseinheit sind die Aptamere vorzugsweise so angeordnet, dass ihre jeweiligen helikalen Achsen zu einer langen Achse kombiniert werden, d.h. im Wesentlichen miteinander fluchten. Günstigerweise sind die Bindungsstellen an der Reaktionseinheit geometrisch so angeordnet, dass sie auf der gleichen Seite des helikalen Bereichs liegen. Auf diese Weise wird die gegenseitige Inhibition der Bindungen mit den Zielmolekülen erleichtert. Technisch lässt sich dies einfach erreichen, indem in einem empirischen Verfahren so viele Basenpaare einer inerten Sequenz, vorzugsweise mit der Grundstruktur G(C)IG(C)2G(C)3G(C)4 u.s.w., eingefügt werden, bis sich aufgrund sterischer Optimierung ein größtmöglicher Inhibitionseffekt ergibt. Je nach Ausführungsform können also die aptameren Funktionsköpfe direkt oder über eine Kopplungseinheit miteinander verbunden sein.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform ist vorgesehen, dass das erste Aptamer und das zweite Aptamer derselben Reaktionseinheit einander bereichsweise überlappen. Das bedeutet, dass zwei aptamere Funktionsköpfe Bereiche ihrer Nukleotidsequenz gemeinsam haben. Es ist offensichtlich, dass bei einer solchen Ausführungsform der wechselseitige Inhibitionseffekt besonders groß ist. Selbstverständlich ist es jedoch auch möglich, dass das erste Aptamer und das zweite Aptamer derselben Reaktionseinheit räumlich getrennt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung ist der Begriff der „Detektionsstruktur" weit zu verstehen und umfasst sowohl molekulare als auch apparative Strukturen. Nachfolgend sollen verschiedene, besonders günstige Ausführungsformen dargestellt werden.
Grundsätzlich ist es zwar möglich, das erfindungsgemäße Testsystem und -verfahren so zu konfigurieren, dass die Bindung des zweiten Aptamers an einen Bindungsbereich der Detektionsstruktur das von der Detektionsstruktur abhängige Signal nicht beeinflusst. Beispielsweise könnte die Detektionsstruktur eine partikelförmige Direktmarkierung umfassen. Hierzu könnten etwa vorzugsweise biotinilierte Nanopartikel dienen, die an von dem zweiten Aptamer gebundenem Streptavidin haften.
In vielen Fällen günstiger ist es jedoch, wenn das Signal von einem Bindungszustand der Detektionsstruktur mit dem zweiten Aptamer abhängt. In diesem Fall nämlich können ansonsten erforderliche Reinigungsschritte zur Separation ungebundener Detektionsstrukturanteile entfallen.
Als besonders vorteilhaft hat sich erwiesen, wenn die Detektionsstruktur eine Spezies von mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur gekoppelten Enzymen umfasst, deren enzymatische Reaktion mit einer Spezies von Substraten eine Änderung einer detektierbaren Größe verursacht. Beispiele für einsetzbare Enzyme sind etwa Oxido-Reduktasen (z.B. Alkohol- Dehydrogenase, Glucose-Oxidase, Peroxidase, Luziferasse etc.), Transferasen (z.B. Hexokinase), Hydrolasen (z.B. Phosphatase, Urease, Lysozym, Nukleasen etc.), Lyasen (z.B. Dichlormethan-Dehalogenase etc.), Isomerasen (z.B. Retinalisomerase) , Synthetasen (z.B. RNA-Ligase, DNA-Ligase etc.) etc.. Je nach Enzym/Substrat-System kann eine andere Größe als detektierbares Signal genutzt werden. Beispiele hierfür sind Farbänderungen, Extinktions- oder Transmissionsänderungen, Änderungen einer optischen Polarisation, pH-Änderungen, Änderungen elektrischer Leitfähigkeit, Änderungen akustischer Leitfähigkeit etc..
Um eine besonders starke Abhängigkeit des detektierten Signals vom Bindungszustand der Detektionsstruktur mit dem zweiten Aptamer zu erreichen, kann günstigerweise vorgesehen sein, dass ein Binden des zweiten Aptamers einer Reaktionseinheit mit einem Bindungsbereich die enzymatische Reaktion des mit diesem Bindungsbereich gekoppelten Enzyms mit dem Substrat inhibiert. Dies kann beispielsweise durch Umfaltung des Enzyms, initiiert durch die Bindung des Aptamers, oder, vorzugsweise, dadurch erreicht werden, dass der Bindungsbereich jeweils im Bereich des katalytischen Zentrums des Enzyms liegt und dieses durch das Binden des zweiten Aptamers blockiert wird.
Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass die Detektionsstruktur eine Spezies von mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur gekoppelten, ersten fluoreszenzaktiven Komponenten umfasst. Als fluoreszenzaktiven Komponenten werden im Rahmen dieser Beschreibung jegliche Einheiten aufgefasst, die entweder selbst Fluorophore sind oder die Fluoreszenz anderer benachbarter Fluorophore beeinflussen können. Ist die erste fluoreszenzaktive Komponente ein Fluorophor, lassen sich Reaktionseinheiten, die mit ihrem zweiten Aptamer an die Detektionsstruktur gebunden haben, durch die Fluoreszenz dieses Fluorophors nachweisen.
In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung ist vorgesehen, dass die Reaktionseinheiten jeweils mit einer zweiten fluoreszenzaktiven Komponente versehen sind, die in Abhängigkeit von dem Bindungszustand des zweiten Aptamers mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur mit der ersten fluoreszenzaktiven Komponente, die mit diesem Bindungsbereich gekoppelt ist, in optisch detektierbarer Weise wechselwirkt. Dies lässt sich insbesondere realisieren, wenn die miteinander wechselwirkenden ersten und zweiten fluoreszenzaktiven Komponenten jeweils einen Partner eines FRET-Paares darstellen. Dabei wirkt einer der Partner als Donor, während der andere als Akzeptor oder Löscher (Quencher) wirkt. Aufgrund der starken Abstandsabhängigkeit (im Wesentlichen R"6, wo R der Abstand der FRET-Partner ist) wird ein nennenswerter Energietransfer von Donor zu Akzeptor nur im Fall der Bindung des zweiten Aptamers an die Detektionsstruktur stattfinden. Die Effizienz des Transfers kann z.B. durch Beobachtung der Donor-Fluoreszenz, der Akzeptor-Fluoreszenz und / oder des Verhältnisses beider ermittelt werden.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst die Detektionsstruktur eine flächen- und / oder massenbelegungsempfindliche Sensoranordnung. Dies ist eine Ausführungsform, bei dem die Detektionsstruktur eine apparative Struktur ist. Als flächen- und / oder massenbelegungsempfindliche Sensoranordnungen eignen sich beispielsweise Sensoreinheiten, die zu mechanischen Schwingungen anregbar sind und deren mechanische Impedanz durch Spektralanalyse der resultierenden mechanischen Schwingungen messbar ist. Die mechanische Impedanz ist abhängig von der Flächen- bzw. Massenbelegung. Derartige Sensoreinheiten sind sehr kleinformatig und in integrierter Schaltungsbauweise erhältlich.
Bei einer Ausführungsform ist dabei vorgesehen, dass die Sensoranordnung eine Mehrzahl von mit den zweiten Aptameren bindungsfähigen Bindungsbereichen aufweist. Dies bedeutet, dass Reaktionseinheiten, die nicht mit einem Analyten binden, direkt an die Sensorstruktur binden. In vielen Fällen ist jedoch vorteilhaft, die Reaktionseinheiten möglichst klein und damit mit geringer Masse auszubilden. Entsprechend sensitiv muss dann jedoch die Sensoreinheit ausgebildet sein. Bei einer alternativen Weiterbildung der Erfindung ist daher vorgesehen, dass das Testsystem eine Spezies von Mittlereinheiten umfasst, die jeweils einen mit dem zweiten Aptamer bindungsfähigen Bindungsbereich aufweisen, wobei die Mittlereinheiten in Abhängigkeit von dem Bindungszustand ihrer Bindungsbereiche mit der Sensoreinheit koppelbar sind. Durch diese Mittlereinheiten, die beispielsweise als Proteine mit deutlich größerer Masse als die Reaktionseinheiten ausgebildet sein können, können die für den Nachweis wirksamen Massen erhöht werden, was einer Signalverstärkung und somit einer leichteren Detektion durch die Sensoreinheit entspricht.
Ausgehend von der hier offenbarten technischen Lehre, kann der Fachmann die Erfindung in einer Laborumgebung leicht umsetzen. Beim Einsatz außerhalb des Labors, beispielsweise bei Schwangerschaftstests für den Hausgebrauch, können jedoch zusätzliche Maßnahmen erforderlich werden. Für den Hausgebrauch bietet sich insbesondere ein sogenannter Streifentest an, bei dem die Detektion optisch, insbesondere im Rahmen einer Farbreaktion und besonders bevorzugt im Rahmen einer enzymvermittelten Farbreaktion erfolgt. Ein solches Testsystem zeichnet sich günstigerweise dadurch aus, dass die mit den Bindungsbereichen gekoppelten Enzyme sowie die oligofunktionalen Reaktionseinheiten in einer ersten Zone eines porösen Trägers enthalten sind, wobei wenigstens die oligofunktionalen Reaktionseinheiten in trockenem Zustand des porösen Trägers räumlich fixiert und nach Benetzung der ersten Zone mit der Testflüssigkeit wenigstens innerhalb der ersten Zone beweglich sind, so dass eine kompetitive Reaktion der oligofunktionalen Reaktionseinheiten mit den Analyten einerseits und den Bindungsbereichen andererseits erfolgen kann, und wobei die Substrate in einer der ersten Zone benachbarten zweiten Zone enthalten und in trockenem Zustand des porösen Trägers in der zweiten Zone fixiert und nach Benetzung der zweiten Zone mit der Testflüssigkeit von der zweiten Zone in die erste Zone beweglich sind. In der Regel wird es nämlich günstig sein, wenn die Wechselwirkung zwischen Enzym und Substrat erst erfolgt, wenn die kompetitive Wechselwirkung zwischen erstem Aptamer und Analyt einerseits und zweitem Aptamer und dem mit dem Enzym gekoppelten Bindungsbereich andererseits abgeschlossen oder zumindest weit fortgeschritten ist. Dies gilt insbesondere für solche Fälle, in denen die enzymatische
Reaktionsfähigkeit von dem Bindungszustand des Enzyms mit dem zweiten Aptamer abhängt. Liegen jedoch Enzym und Reaktionseinheit hinsichtlich ihrer Wechselwirkung in naher Nachbarschaft in einer ersten Zone vor, muss das Substrat erst zu dem Enzym wandern. Dadurch wird sichergestellt, dass die Enzym-Substrat-Reaktion zeitlich nach der Enzym- Reaktionseinheit-Reaktion erfolgt.
Um die zeitliche Trennung der Reaktionen weiter zu verbessern, ist bei einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, dass die erste und die zweite Zone mittels einer semipermeablen Membran, die ein Übertreten der Enzyme von der ersten Zone in die zweite Zone verhindert und ein Übertreten der Substrate von der zweiten Zone in die erste Zone gestattet, voneinander getrennt sind. Auf diese Weise wird verhindert, dass die Zeit, die Enzym und Substrat benötigen, um zueinander zu finden, dadurch verkürzt wird, dass das Enzym dem Substrat „entgegenwandert". Da Enzyme in der Regel deutlich größer sind als ihre korrespondierenden Substrate, stellt der Aufbau einer derartigen Membran für den Fachmann keine Schwierigkeit dar. Alternativ oder zusätzlich kann vorgesehen sein, dass die Enzyme dauerhaft in der ersten Zone fixiert sind. Dies kann beispielsweise mittels einer Biotin / Streptavidin-Kopplung mit dem Material des porösen Trägers erfolgen.
Grundsätzlich ist es zwar möglich, die erste und zweite Zone auf dem Teststreifen nebeneinander anzuordnen. Insbesondere bei Verwendung einer semipermeablen Membran kann es jedoch günstiger sein, wenn die erste Zone und die zweite Zone in zwei übereinanderliegenden Schichten des porösen Trägers angeordnet sind.
Zur Umsetzung der Teststreifen-Variante der Erfindung ist es nicht erforderlich, dass die Enzyme und die
Reaktionseinheiten in der ersten Zone durchmischt vorliegen. Vielmehr ist bei einer besonderen Ausführungsform vorgesehen, dass die erste Zone in wenigstens eine erste Teilzone, welche die Enzyme enthält und eine zweite Teilzone, welche die Reaktionseinheiten enthält, unterteilt ist. Insbesondere können die erste Teilzone und die zweite Teilzone in zwei übereinander liegenden Schichten des porösen Trägers angeordnet sein, wobei eine besonders günstige Schichtabfolge lautet: erste Teilzone, zweite Teilzone, optional semipermeable Membran, zweite Zone.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich der nachfolgenden, speziellen Beschreibung und den Zeichnungen.
Es zeigen:
Figur 1: eine schematische Prinzipskizze des erfindungsgemäßen Testsystems, Figur 2: eine schematische Darstellung einer beispielhaften Reaktionseinheit,
Figur 3: eine schematische Darstellung einer weiteren beispielhaften Reaktionseinheit und
Figur 4: eine schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Streifentest.
Figur 1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Testsystems. Kern des Testsystems sind Reaktionseinheiten 10, die jeweils zwei aptamere Funktionsköpfe 12 und 14 aufweisen. Die aptameren Funktionsköpfe 12 und 14 sind über eine Kopplungsstruktur 16 miteinander verbunden. Ein erstes Aptamer 12 ist derart selektiert oder synthetisiert, dass es selektiv und insbesondere spezifisch mit einem Analyten 18 binden kann. Das zweite Aptamer 14 ist derart selektiert oder synthetisiert, dass es mit dem katalytischen Zentrum 22 eines Enzyms 20 dauerhaft binden kann. Das bedeutet, durch Bindung des Aptamers 14 mit dem Enzym 20 wird dessen katalytisches Zentrum 22 blockiert.
Wie durch die Pfeile 24 und 26 angedeutet, werden in einem ersten Testschritt Reaktionseinheiten 10, Analyten 18 und Enzyme 20 gemischt. Dies erfolgt vorzugsweise in einer Testflüssigkeit, deren physikalische Eigenschaften, wie Temperatur, ph-Wert etc. geeignet gewählt sind, so dass die genannten und weitere physiologische Funktionen der beteiligten Reaktanden ablaufen können. Einige der Reaktionseinheiten 10 binden mit ihrem ersten Aptamer 12 mit den Analyten 18 (Pfeil 28). Andere Reaktionseinheiten 10 binden mit ihrem zweiten Aptamer 14 mit den katalytischen Zentren 22 der Enzyme 20 (Pfeil 30). Eine simultane Bindung eines Analyten 18 und eines Enzyms 20 mit einer Reaktionseinheit 10 ist aufgrund der 3-dimensionalen Struktur der Reaktionseinheit 10 nicht möglich. Vielmehr inhibieren sich diese Reaktionen gegenseitig, so dass ein kompetitives Testprinzip vorliegt.
Nach Einstellung eines Gleichgewichts wird der Testflüssigkeit ein Substrat 32 zugegeben (Pfeil 34), welches unter zeitweiliger Bindung an das katalytische Zentrum 22 des Enzyms 20 eine enzymatische Reaktion durchläuft (symbolisiert durch Reaktionspfeil 36). Im Rahmen der enzymatischen Reaktion wird das Substrat 32 von dem Enzym 20 verändert, was zu einem detektierbaren Signal, beispielsweise eine Farbänderung, eine pH-Änderung, eine Änderung einer optischen Polarisation etc., führen kann. Die Stärke der enzymatischen Reaktion und damit die Stärke des Signals ist bei standardisierten Testbedingungen abhängig von der Menge des zur Verfügung stehenden, ungebundenen Enzyms 20 (Pfeil 38) und damit indirekt von der Menge des Analyten 18. Im Gegensatz zu einem Direkttest hat ein derartiger, kompetitiver Test den Vorteil, dass durch geeignete Wahl der Mengen bzw. Konzentrationen von Reaktionseinheiten 10, Enzymen 20 und Substraten 32 in Abstimmung auf die erwartete Menge bzw. Konzentration an Analyten 18 eine Signalstärke erzeugt werden kann, die für die jeweilige Testapparatur, beispielsweise eine Extinktions-Messvorrichtung, optimiert ist. Figur 2 zeigt in schematischer Darstellung einen beispielhaften Aufbau einer Reaktionseinheit 10. Die Aptamere 12 und 14 bestehen jeweils aus einem sogenannten „Hairpin" mit einer Krümmung 122, 142 aus ungepaarten Nukleinsäuren und einem helikalen Bereich 124, 144 aus gepaarten Nukleinsäuren. Die Aptamere 12 und 14 sind jeweils so selektiert bzw. synthetisiert, dass sie mit ihren jeweiligen Zielmolekülen (Analyt 18 bzw. Enzym 20) bindungsfähig und vorzugsweise selektiv, insbesondere spezifisch sind. In der beispielhaften Darstellung von Figur 2 zeigt das Aptamer 14 eine weitere Schleife 146, um einen Unterschied der 3-dimensionalen Struktur des Aptamers 14 gegenüber dem Aptamer 12 zu symbolisieren.
Die Aptamere 12 und 14 sind mittels einer nicht näher dargestellten Kopplungsstruktur 16 miteinander verbunden. Die Kopplungsstruktur 16 kann ebenfalls als geeignete Oligonukleotidstruktur ausgebildet sein, wobei die genaue Struktur und Sequenz sowie das Verbindungsverfahren anwendungsbezogen vom Fachmann geeignet zu wählen ist.
Figur 3 stellt schematisch eine weitere Ausführungsform einer Reaktionseinheit 10 mit zwei Aptameren 12 und 14 dar. Wie auch bei dem Ausführungsbeispiel von Figur 2 weisen die Aptamere 12 und 14 jeweils einen „Hairpin" 122, 142 auf, sind jedoch mit ihren helikalen Bereichen 124, 144 so miteinander verbunden, dass ihre helikalen Achsen im Wesentlichen miteinander fluchten. Bei dem Ausführungsbeispiel von Figur 3 weisen beide Aptamere 12 und 14 jeweils eine weitere Schleife 126, 146 auf, die für ihre Bindung mit dem jeweiligen Zielmolekül verantwortlich ist. Die helikalen Bereiche 124, 144 sind so gewählt, dass die zusätzlichen Schleifen 126, 146 auf der gleichen Seite (oben in Figur 3) der Reaktionsstruktur 10 liegen. Gegebenenfalls können zusätzliche Nukleinsäure-Paare eingebaut werden, um die Helixstruktur so zu erweitern, dass die in Figur 3 dargestellte Ausrichtung zustande kommt.
Figur 4 zeigt schematisch den Aufbau eines sogenannten Streifentest, der das erfindungsgemäße Testprinzip verwirklicht. Reaktionseinheiten 10, Analyten 18, Enzyme 20 und Substrate 32 sind wie in Figur 1 dargestellt. Der Streifentest von Figur 4 weist zwei übereinanderliegende Schichten porösen Trägermaterials, beispielsweise Nitrocellulose, auf. In einer oberen Schicht 50 sind Reaktionseinheiten 10 und Enzyme 20 in einer Weise aufgebracht, dass sie im trockenen Zustand des Trägermaterials immobilisiert sind, während sie sich in feuchtem Zustand des Trägermaterials in diesem bewegen und insbesondere miteinander reagieren können. In der unteren Schicht 52 des Trägermaterials ist eine Substratspezies 32 in gleicher Weise angeordnet. Alternativ zu der in Figur 4 dargestellten Anordnung können Reaktionseinheiten 10 und Enzyme 20 auch in unterschiedlichen Teilbereichen der oberen Schicht 50 angeordnet sein.
Die Schichten 50 und 52 sind durch eine semipermeable Membran 54 voneinander getrennt. Die Poren dieser Membran 54 gestatten es dem Substrat 32, in feuchtem Zustand des Trägers aus der unteren Schicht 52 in die obere Schicht 50 zu diffundieren. Eine Diffusion des Enzyms 20 von der oberen Schicht 50 in die untere Schicht 52 wird hingegen von der Membran 54 unterbunden.
Teilfigur 4a zeigt den beschriebenen Ausgangszustand bei trockenem Träger. Teilfigur 4b symbolisiert die Zugabe von Analyten 18 enthaltender Testflüssigkeit 58 (Pfeil 60). In dem durch die Testflüssigkeit 58 befeuchteten Träger beginnen die Reaktanden aufgrund der wirkenden Kapillarkräfte mit der Flüssigkeit in dem Träger zu wandern. Dabei kommt es zu der im Zusammenhang mit Figur 1 bereits beschriebenen kompetitiven Reaktion zwischen Reaktionseinheiten 10 und Analyten 18 einerseits und Reaktionseinheiten 10 und Enzymen 20 andererseits (Teilfigur 4c). Diese kompetitive Reaktion wird zunächst nicht durch Bindung von Substraten 32 an die Enzyme 20 gestört, da diese räumlich abseits in der unteren Schicht 52 vorliegen und erst durch die Membran 54 in die obere Schicht 50 eindiffundieren müssen. Sie erreichen die ungebundenen Enzyme 20 erst zu einem Zeitpunkt, zu dem die kompetitive Reaktion bereits ein Gleichgewicht gefunden hat oder zumindest bis zu einem definierten Grad fortgeschritten ist.
Figur 4d deutet den letzten Testschritt an, bei dem die Substrate 32 mit den Enzymen 20 reagieren und das detektierbare Signal erzeugen.
Natürlich stellen die beschriebenen und durch die Figuren illustrierten Ausführungsbeispiele lediglich besonders vorteilhafte, exemplarische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Insbesondere in Bezug auf den konkreten Detektionsvorgang und Detektionsapparatur steht dem Fachmann ein breites Spektrum an Möglichkeiten offen, wie dies im allgemeinen Teil der Beschreibung angedeutet wurde.

Claims

Patentansprüche
Aptamerbasiertes Testsystem zum Nachweis einer Spezies von Analyten (18) in einer Testflüssigkeit (58) unter Detektion eines von einer Detektionsstruktur (20) abhängigen Signals, umfassend eine Spezies oligofunktionaler Reaktionseinheiten (10), die jeweils wenigstens ein mit einem Analyten (18) bindungsfähiges, erstes Aptamer (12) und wenigstens ein mit dem ersten Aptamer (12) verknüpftes und mit Bindungsbereichen (22) der Detektionsstruktur (20) bindungsfähiges, zweites Aptamer (14) aufweisen, wobei das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) jeder Reaktionseinheit (10) derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des ersten Aptamers (12) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten (18) ein simultanes Binden des zweiten Aptamers (14) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) inhibiert dadurch gekennzeichnet, dass das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) jeder Reaktionseinheit (10) weiter derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des zweiten Aptamers (14) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) ein simultanes Binden des ersten Aptamers (12) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten (18) inhibiert.
2. Testsystem nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Binden des ersten Aptamers (12) mit dem Analyten (18) und / oder das Binden des zweiten Aptamers (14) mit dem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) selektiv, insbesondere spezifisch ist.
3. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Aptamer (12; 14) einer Reaktionseinheit (19) eine Hairpin-Struktur (122; 142) und einen helikalen Bereich (124; 144) aufweist.
4. Testsystem nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Aptamer (12; 14) beim Binden mit einem Bindungspartner (18; 20) in einem Bereich (126; 146) bindet, der senkrecht zur Längsachse des helikalen Bereichs (124; 144) steht und nicht im Bereich der Krümmung (122; 142) der Hairpin-Struktur liegt.
5. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass diejenigen Bereiche (126; 146) des ersten und des zweiten Aptamers (12; 14) einer Reaktionseinheit (10), mit denen diese mit ihren jeweiligen Bindungspartnern (18; 20) binden können, auf derselben Seite der Reaktionseinheit (10) liegen.
6. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Signal von einem Bindungszustand der Detektionsstruktur (20) mit dem zweiten Aptamer (14) abhängt.
7. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) derselben Reaktionseinheit (10) einander bereichsweise überlappen.
8. Testsystem nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) derselben Reaktionseinheit (10) räumlich getrennt angeordnet sind.
9. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) derselben Reaktionseinheit (10) mittels einer Kopplungsstruktur (16) miteinander verbunden sind.
10. Testsystem nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Kopplungsstruktur (16) eine Oligonukleotidstruktur umfasst.
11. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsstruktur eine Spezies von mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur gekoppelten Enzymen (20) umfasst, deren enzymatische Reaktion mit einer Spezies von Substraten (32) eine Änderung einer detektierbaren Größe verursacht.
12. Testsystem nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass ein Binden des zweiten Aptamers (14) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur die enzymatische Reaktion des mit diesem Bindungsbereich (22) gekoppelten Enzyms (20) mit dem Substrat (32) inhibiert.
13. Testsystem nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Bindungsbereich jeweils im Bereich des katalytischen Zentrums (22) des Enzyms (20) liegt und dieses durch das Binden des zweiten Aptamers (14) blockiert wird.
14. Testsystem nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die mit den Bindungsbereichen (22) gekoppelten Enzyme (20) sowie die oligofunktionalen Reaktionseinheiten (10) in einer ersten Zone (50) eines porösen Trägers enthalten sind, wobei wenigstens die oligofunktionalen Reaktionseinheiten (10) in trockenem Zustand des porösen Trägers räumlich fixiert und nach Benetzung der ersten Zone (50) mit der Testflüssigkeit (58) wenigstens innerhalb der ersten Zone (50) beweglich sind, so dass eine kompetitive Reaktion der oligofunktionalen Reaktionseinheiten (10) mit den Analyten (18) einerseits und den Bindungsbereichen (22) andererseits erfolgen kann, und wobei die Substrate (32) in einer der ersten Zone (50) benachbarten zweiten Zone (52) enthalten und in trockenem Zustand des porösen Trägers in der zweiten Zone (52) fixiert und nach Benetzung der zweiten Zone (52) mit der Testflüssigkeit (58) von der zweiten Zone (52) in die erste Zone (50) beweglich sind.
15. Testsystem nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite Zone (50; 52) mittels einer semipermeablen Membran (54), die ein Übertreten der Enzyme (20) von der ersten Zone (50) in die zweite Zone (52) verhindert und ein Übertreten der Substrate (32) von der zweiten Zone (52) in die erste Zone (50) gestattet, voneinander getrennt sind.
16. Testsystem nach einem der Ansprüche 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Enzyme (20) dauerhaft in der ersten Zone (50) fixiert sind.
17. Testsystem nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zone und die zweite Zone in zwei übereinanderliegenden Schichten (50; 52) des porösen Trägers angeordnet sind.
18. Testsystem nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Zone in wenigstens eine erste Teilzone, welche die Enzyme enthält, und eine zweite Teilzone, welche die Reaktionseinheiten enthält, unterteilt ist.
19. Testsystem nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die erste Teilzone und die zweite Teilzone in zwei übereinanderliegenden Schichten des porösen Trägers angeordnet sind.
20. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsstruktur eine Spezies von mit Bindungsbereichen der Detektionsstruktur gekoppelten, ersten fluoreszenzaktiven Komponenten umfasst.
21. Testsystem nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionseinheiten jeweils mit einer zweiten fluoreszenzaktiven Komponente versehen sind, die in Abhängigkeit von dem Bindungszustand des zweiten Aptamers mit einem Bindungsbereich der Detektionsstruktur mit der ersten fluoreszenzaktiven Komponente, die mit dem Bindungsbereich gekoppelt ist, in optisch detektierbarer Weise wechselwirkt.
22. Testsystem nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die miteinander wechselwirkenden ersten und zweiten fluoreszenzaktiven Komponenten jeweils einen Partner eines FRET-Paares darstellen.
23. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsstruktur eine partikelförmige Direktmarkierung umfasst.
24. Testsystem nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsstruktur eine flächen- und /oder massenbelegungsempfindliche Sensoranordnung umfasst.
25. Testsystem nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoreinheit zu mechanischen Schwingungen anregbar und ihre mechanische Impedanz durch Spektralanalyse der resultierenden mechanischen Schwingungen messbar ist.
26. Testsystem nach einem der Ansprüche 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Sensoranordnung eine Mehrzahl von mit den zweiten Aptameren bindungsfähigen Bindungsbereichen aufweist.
27. Testsystem nach einem der Ansprüche 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, eine Spezies von Mittlereinheiten vorgesehen ist, die jeweils einen mit dem zweiten Aptamer bindungsfähigen Bindungsbereich aufweisen, wobei die Mittlereinheiten in Abhängigkeit von dem Bindungszustand ihrer Bindungsbereiche mit der Sensoreinheit koppelbar sind.
28. Testverfahren zum Nachweis einer Spezies von Analyten (18) in einer Testflüssigkeit (58) unter Detektion eines von einer Detektionsstruktur (20) abhängigen Signals, wobei eine Spezies oligofunktionaler Reaktionseinheiten (10), die jeweils wenigstens ein mit einem Analyten (18) bindungsfähiges, erstes Aptamer (12) und wenigstens ein mit dem ersten Aptamer (12) verknüpftes und mit Bindungsbereichen (22) der Detektionsstruktur (20) bindungsfähiges, zweites Aptamer (14) aufweisen, über Bindungen erster Aptamere (12) mit Analyten (18) und über Bindungen zweiter Aptamere (14) mit Bindungsbereichen (22) der Detektionsstruktur (20) binden, wobei das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) jeder Reaktionseinheit (10) derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des ersten Aptamers (12) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten (18) ein simultanes Binden des zweiten Aptamers (14) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) inhibiert dadurch gekennzeichnet, dass das erste Aptamer (12) und das zweite Aptamer (14) jeder Reaktionseinheit (10) weiter derart miteinander verknüpft sind, dass ein Binden des zweiten Aptamers (14) einer Reaktionseinheit (10) mit einem Bindungsbereich (22) der Detektionsstruktur (20) ein simultanes Binden des ersten Aptamers (12) derselben Reaktionseinheit (10) mit einem Analyten ( 18)inhibiert.
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