DE102005056639A1

DE102005056639A1 - Verfahren, Vorrichtung und Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe

Info

Publication number: DE102005056639A1
Application number: DE200510056639
Authority: DE
Inventors: Christoph Dr. Gauer; Wolfgang Dr. Mann
Original assignee: Advalytix AG
Current assignee: Advalytix AG
Priority date: 2005-11-28
Filing date: 2005-11-28
Publication date: 2007-06-06
Also published as: WO2007059839A1; WO2007059839A9

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe, bei dem ein Träger mit wenigstens einem Reaktionszentrum bereitgestellt wird, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind, nachzuweisende Makromoleküle der Probe markiert werden, die Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum derart in Kontakt gebracht wird, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte der gebundenen Makromoleküle mit den nachweisenden Makromolekülen stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen nachzuweisenden Makromolekülen mit einer Sorte der gebundenen Makromoleküle möglich ist, ungebundenes Probenmaterial entfernt wird und das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben-Makromolekülen geprüft wird. Die Erfindung betrifft weiterhin eine Vorrichtung und ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe und ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung.

In der Diagnostik möchte man häufig einige wenige Parameter einer flüssigen Probe bestimmen. Typische Zahlen liegen meist zwischen 2 und 10 solcher Parameter. Untersucht werden zum Beispiel die Anwesenheit oder Beschaffenheit von in einer Probenflüssigkeit enthaltenen Makromolekülen wie zum Beispiel bestimmter Nukleinsäuresequenzen, Antikörpern, Antigenen, Proteinen, etc.. Beispielsweise werden alle Proben in Blutbanken auf die Anwesenheit des HIV- und HCV-Virus geprüft. Vielfach werden PCR(Polymerasekettenreaktion)-gestützte Verfahren verwendet, die in der Regel in getrennten Reaktionen für die unterschiedlichen Teilsequenzen des HIV-Virus durchgeführt werden.

Es ist wünschenswert, wenn die Zahl der notwendigen Pipettierschritte und damit die Kosten, sowie der Verbrauch von Reagenzien und Probenmaterial verringert werden. Letzteres ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn nur wenig Probenmaterial, zum Beispiel bei Blutproben von Säuglingen, vorliegt. Daher wurde vorgeschlagen, derartige Untersuchungsassays zu parallelisieren, das heißt zu "multiplexen", um mehrere Untersuchungen parallel durchführen zu können.

Aus EP 373 203 B1 oder DE 101 03 954 B4 sind Verfahren und Vorrichtungen bekannt, wie man zum Beispiel Nukleinsäureassays multiplexen kann. Dabei werden unterschiedliche Oligonukleotide auf Festkörperoberflächen in Form einer Matrix aufgebracht (zum Beispiel "gespottet") und dort so gebunden, dass sie sich unter den Hybridisierungsbedingungen nicht ablösen können. Die so gebundenen Oligonukleotide bilden "Sonden", die in nicht überlappenden Zellen, sogenannten Spots, angeordnet sind, die typischerweise Durchmesser von 50 bis 250 μm aufweisen. Eine Vielzahl von Spots in einer Matrix wird als Mikroarray bezeichnet.

Bringt man eine Probenflüssigkeit, die fluoreszenzmarkierte Nukleinsäuresequenzen enthält, unter Hybridisierungsbedingungen auf die Festkörperoberfläche, so können die unbekannten und markierten Nukleinsäuresequenzen in der Probe mit den Oligonukleotiden der Spots hybridisieren. Wird im Anschluss die Probenflüssigkeit unter stringenten Bedingungen von der Festkörperoberfläche abgewaschen, bleiben nur diejenigen Nukleinsäuresequenzen der Probe auf dem Festkörper zurück, die spezifisch an entsprechende Sondenoligonukleotide gebunden sind. Durch ortsaufgelöstes Messen der Fluoreszenz lässt sich nun feststellen, an welchen Spots Nukleinsäuresequenzen der Probe gebunden wurden. Da die als Sonden gespotteten Oligonukleotide bekannt sind, lassen sich so Rückschlüsse auf die in der Probe enthaltenen Nukleinsäuresequenzen ziehen. Derartige Arrays werden zum Beispiel in der Diagnostik oder der Forschung zur Genexpressionsanalyse (Gene Expression Profiling) oder CGH (Comparative Genomic Hybridization) eingesetzt.

Bei derartigen Verfahren ist es notwendig, die Fehlerraten beim Herstellen der Arrays, insbesondere beim Aufbringen der Sondenmoleküle, sehr gering zu halten. In konventionellen Mikroarrays definiert sich die Qualität des Produkts geradezu nach dem Grad der Einzigartigkeit der Sequenz in einem Spot. Es ist das Ziel, möglichst nur eine Population (100% ohne Fehler) einer Sequenz pro Spot zu erreichen. Insbesondere bei in-situ Ver fahren zur Herstellung solcher Mikroarrays ist die Fehlerrate von ausschlaggebender Bedeutung. Auch Anbieter von Kontakt- oder Nicht-Kontaktprintern, die als Alternative zum in-situ Verfahren zum Einsatz kommen, werben für ihre Produkte damit, dass es bei der Herstellung der Mikroarrays nicht zur "Verschleppung von Material" von einem Spot zum anderen kommt, wodurch ebenfalls dokumentiert wird, dass bei konventionellen Mikroarrays gerade der Nicht-Vermischung große Bedeutung beigemessen werden muss. Es ist dementsprechend ein aufwändiger und kostenintensiver Spottingprozess mit hoher Genauigkeit notwendig, der insbesondere auch an die Qualitätskontrolle hohe Anforderungen stellt. Zudem sind die Spotmorphologien von Spots unterschiedlicher Makromoleküle abhängig von der Molekülsorte selbst, so dass die Durchmesser der Spots solcher gespotteten Mikroarrays immer ein wenig schwanken können, wodurch zum Beispiel die Auswertung mit Hilfe automatischer Bilderkennung problematisch werden kann.

Schließlich ist für das Auslesen derartiger Mikroarrays mit Spots, die sich durch die aufgebrachten Makromoleküle unterscheiden, ein Scanner notwendig, der die entsprechende Ortsauflösung bietet.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe anzugeben, die ein Multiplexen von Assays auf einfache und kostengünstige Weise ermöglichen.

Diese Aufgabe wird mit einem Untersuchungsverfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1, einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 21 bzw. einem Kit mit den Merkmalen des Anspruchs 32 gelöst. Unteransprüche sind auf bevorzugte Ausführungsformen gerichtet. Ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ist Gegenstand des Anspruches 31

Bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren wird ein Träger mit wenigstens einem Reaktionszentrum bereitgestellt, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (im folgenden auch "Sondenmoleküle" oder "Sonden-Makromoleküle") gebunden sind. Dazu werden zum Beispiel die als Sondenmoleküle einzusetzenden Makromoleküle vor dem Aufbringen auf das Reaktionszentrum abgemischt. An einem Reaktionszentrum ist die Anordnung der unterschiedlichen Sonden-Makromoleküle unerheblich und daher vorzugsweise statistisch verteilt. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also zumindest ein Reaktionszentrum eingesetzt, an dem unterschiedliche nachzuweisende Makromoleküle (im folgenden auch "Probenmoleküle" oder "Proben-Makromoleküle") spezifisch binden können.

In der zu untersuchenden Probe werden nachzuweisende Makromoleküle (Probenmoleküle) markiert. Das wenigstens eine Reaktionszentrum wird vollständig mit der Probenlösung derart in Kontakt gebracht, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte Sondenmoleküle mit Probenmolekülen stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen Probenmolekülen mit einer Sorte der Sondenmoleküle möglich ist.

Nach Abwarten einer typischen Reaktionszeit wird ungebundenes Probenmaterial zum Beispiel durch einen Waschschritt entfernt. Schließlich wird das Vorhandensein von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Probenmoleküle geprüft. Eine ortsaufgelöste Auswertung der Ergebnisse ist für ein Reaktionszentrum nicht nötig, so dass einfach das Gesamtergebnis für das jeweilige Reaktionszentrum, das zum Beispiel durch eine integrale Auswertung der Fluoreszenz erhalten werden kann, verwendet werden kann.

Die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle der Probe kann vor oder nach dem Inkontaktbringen der Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum erfolgen. Die Markierung kann aber auch nach dem Entfernen des ungebundenen Probenmaterials vorgenommen werden.

Wenn die Markierung derart vorgenommen wird, dass sie für wenigstens eine Sorte nachzuweisender Probenmoleküle spezifisch ist, kann in jedem Fall nachgewiesen werden, ob entsprechende nachzuweisende Probenmoleküle spezifisch an dem Reaktionszentrum gebunden wurden.

Mit einem Reaktionszentrum auf einer Festkörperoberfläche können somit bei Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahren zwei oder mehrere Makromolekülsorten zum Beispiel unterschiedlicher Organismen nachgewiesen werden, abhängig davon, welche nachzuweisenden Makromoleküle in der Probe markiert und zur Reaktion gebracht werden.

Im Vergleich zu bekannten Verfahren, bei denen Mikroarrays eingesetzt werden, bei denen je Spot nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, ist der Aufwand beim Spotten zur Herstellung des Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erheblich reduziert und die Anzahl der notwendigen Pipettierschritte sehr viel kleiner.

Bei konventionellen Mikroarrays erhält man je Spot nur die Information einer Sequenz. Die Spots müssen daher zahlreich und möglichst dicht angeordnet und in Folge dessen sehr klein sein, um auch mit einer kleinen Probenflüssigkeitsmenge ausreichend Informationen zu bekommen. Da bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit einem Reaktionszentrum mehrere Informationen erhalten werden können, benötigt man nur ein oder einige wenige Reaktionszentren, jedenfalls weniger als bei einem konventionellen Mikroarray aus Spots. Die Reaktionszentren müssen daher nicht so klein sein wie bei herkömmlichen Mikroarrays und können daher von wenigen Mikrometern bis zu mehreren Millimetern, zum Beispiel 2 Millimetern, Durchmesser aufweisen.

Da die Sondenmoleküle nicht wie bei bekannten Mikroarrays in räumlich getrennten Spots vorliegen, ergibt sich außerdem der Vorteil, dass zum Kontakt der Probenmoleküle mit den Sondenmolekülen nur minimale Wegstrecken zurückgelegt werden müssen. Für diffusionslimitierte Reaktionen bringt das einen erheblichen Zeitvorteil. Besonders vorteilhaft ist dies zum Beispiel bei der Diskriminierung von Allelen oder allgemein zur Diskriminierung von "Perfect Match" und "Mismatch" der spezifisch miteinander reagierenden Makromoleküle, weil die erste Bindung in der Regel zwar schnell geht, ein Gleichgewicht sich aber erst nach längerer Zeitdauer einstellt, da erst durch einen Diffusionsprozess die Entfernung zwischen den einzelnen Spots überwunden werden muss.

Bei einem konventionellen Mikroarray, bei dem an den Spots jeweils nur eine Sorte von Makromolekülen vorhanden ist, "sehen" die Probenmoleküle der Probenflüssigkeit an unterschiedlichen Spots eine andere Sorte von Sondenmolekülen. Die Umgebung der Reaktion ist also auf jeden Fall unterschiedlich. Es ist jedoch nicht ausgeschlossen, dass die Umgebung selbst zum Beispiel eine Hybridisierung zwischen Sondenmolekülen und Probenmolekülen maßgeblich beeinflusst. Beim erfindungsgemäßen Verfahren, bei dem Reaktionszentren eingesetzt werden, an denen die Sondenmoleküle abgemischt wurden, kann man dagegen von einer gleichmäßigen Verteilung der Moleküle an einem Reaktionszentrum ausgehen. Unterschiedliche Probenmoleküle sehen dementsprechend beim erfindungsgemäßen Verfahren auch dieselbe Umgebung, so dass ein Einfluss der Umgebung auf die Reaktion wegfällt. Auch Gradienten, die auftreten können, weil die Probenlösung die Oberfläche zum Beispiel von links nach rechts benetzt und eine gewisse Zeit dazu braucht, können nicht vorkommen. Die Sondenmoleküle sind statistisch verteilt und die Chance für ein Probenmolekül, die richtige Sequenz zu finden, ist dementsprechend im Durchschnitt höher.

Bei der Herstellung eines Trägers zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die unterschiedlichen Sorten von Makromolekülen, die die Sondenmoleküle bilden sollen, vor dem Aufbringen zum Beispiel abgemischt. Das Mischungsverhältnis der wenigstens zwei Sorten unterschiedlicher Makromoleküle eines Reaktionszentrums kann zum Beispiel in vergleichenden Vorversuchen derart festgelegt werden, dass das Signal-Rausch-Verhältnis für die in der Probe erwartete Zusammensetzung optimal ist. In der Regel entspricht dies einer Gleichverteilung der wenigstens zwei verschiedenen Sorten Makromoleküle an dem Reaktionszentrum. Abhängig von individuellen Reaktionsverhalten der einzelnen Komponenten können aber auch andere Mischungsverhältnisse optimal sein.

Insbesondere bei Assays, bei denen mit hoher Sicherheit die Anwesenheit einer bestimmten biologischen Sequenz (zum Beispiel eine Sequenz eines bestimmten Organismus) nachgewiesen werden soll, umfassen die wenigstens zwei Sorten von gebundenen Makromolekülen in dem wenigstens einen Reaktionszentrum wenigstens zwei unterschiedliche Teile dieser biologischen Sequenz. Ein Reaktionszentrum enthält dann dementsprechend zumindest zwei unterschiedliche Teilsequenzen, die spezifisch mit korrespondierenden Teilsequenzen der einen nachzuweisenden biologischen Sequenz reagieren können. Auf diese Weise ist eine sehr sichere Feststellung des Vorhandenseins der nachzuweisenden Sequenz in der Probe möglich.

"Sequenz" bezeichnet dabei zum Beispiel eine Abfolge von Aminosäuren oder Nukleinsäurebausteinen (zum Beispiel RNA, DNA oder PNA).

Bei einer anderen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens umfassen die wenigstens zwei Sorten von an einem Reaktionszentrum gebundenen Makromoleküle Reaktionspartner für wenigstens zwei unterschiedliche Sorten von Probenmolekülen, zum Beispiel biologischer Sequenzen, die zu unterschiedlichen Organismen gehören. Je nachdem, welche Probenmoleküle in der zu untersuchenden Probe markiert werden, können diese unterschiedlichen Organismen in der Probe nachgewiesen werden.

Der Begriff Organismus wird für die Zwecke des vorliegenden Textes in weiten Sinne verstanden und soll zum Beispiel auch Viren, Bakterien, Sporen etc. umfassen.

Als unterschiedlich bzw. verschieden werden für die Zwecke des vorliegenden Textes nicht-homologe oder homologe Sequenzen angesehen, solange sie nicht identisch sind, auch wenn sie die gleiche Wirkung bzw. Funktion haben. Insbesondere ist das Verfahren auch bei SNP-Sequenzen (Single-Nucleotide-Polymorphism) anwendbar, bei denen es sich um einfache Polymorphismen handelt, bei denen sich homologe Sequenzen nur durch eine Base unterscheiden.

Bevorzugt kommen als unterschiedliche Makromoleküle bzw. unterschiedliche Sorten von Makromolekülen jedoch solche Makromoleküle zum Einsatz, deren Ähnlichkeit geringer als 90%, bevorzugter geringer als 70%, besonders bevorzugt geringer als 40% und ganz besonders bevorzugt geringer als 10% ist.

Wenn nur ein Organismus in der Probe nachgewiesen werden soll, so wird eine Markierung nur für solche nachzuweisenden Makromoleküle der Probe vorgenommen, die zu diesem Organismus gehören. Dabei kann es sich zum Beispiel um Teilsequenzen einer Sequenz dieses Organismus handeln.

Soll andererseits die Anwesenheit mehrerer unterschiedlicher Makromoleküle zum Beispiel unterschiedlicher Organismen getrennt aber gleichzeitig nachgewiesen werden, so wird eine Markierung für wenigstens zwei Sorten von nachzuweisenden Makromolekülen in der Probe vorgenommen, wobei sich die Markierungen unterscheiden.

Die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle kann zum Beispiel radioaktiv oder elektrochemisch sein. Besonders einfach und vorteilhaft ist die Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung, wobei zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum gebundenen Makromoleküle am Ende des erfindungsgemäßen Verfahrens die Fluoreszenz untersucht wird.

Sollen unterschiedliche Makromoleküle in einer Probe nachgewiesen werden, kann das Fluoreszenzsignal wellenlängenselektiv ausgewertet werden. Aus dem Signal bei unterschiedlichen Wellenlängen kann auf das Vorhandensein entsprechend markierter Makromoleküle in der Probe geschlossen werden.

Bei einer anderen Verfahrensführung wird die Fluoreszenz bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen ausgewertet, um eine Diskriminierung unterschiedlich markierter Makromoleküle in der Probe zu ermöglichen.

Insbesondere bei der Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen ist es vorteilhaft, wenn weniger als 10, vorzugsweise weniger als 5 unterschiedlich markierte Bestandteile vorliegen, um eine sichere Diskriminierung der Signale der unterschiedlichen Markierungen zu gewährleisten.

Andererseits ist es vorteilhaft, wenn bei Einsatz von unterschiedlichen Sorten von Sondenmolekülen an einem Reaktionszentrum die Sondenmoleküle derart ausgewählt sind, dass maximal 10, vorzugsweise maximal 7, und besonders vorzugsweise maximal 5 unterschiedliche Bestandteile der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können. Auf diese Weise verringert sich die Anforderung an die Genauigkeit der Auswertemethode, da nur eine geringe Anzahl unterschiedlich markierter Probenmoleküle diskriminiert werden muss.

Die Markierung wird derart spezifisch gewählt, dass nur nachzuweisende Makromoleküle markiert werden und kann nach dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf dem Träger geschehen. Das Material zur Markierung kann dann zum Beispiel an dem Reaktionszentrum selbst vorliegen, zum Beispiel in getrockneter Form. Ebenso kann eine entsprechende Markierung auch erst nach dem Entfernen ungebundenen Probenmateriales von dem Träger geschehen.

Schließlich ist eine Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle in der Probe auch vor deren Inkontaktbringen mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum auf dem Träger möglich.

Eine noch weiter gehende Parallelisierung zur weiteren Erhöhung der Anzahl von Sorten unterschiedlicher nachzuweisender Makromoleküle kann erreicht werden, wenn mehrere Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden auf einem Träger eingesetzt werden, die vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnet sind.

Bei einer besonderen Ausführungsform findet die Markierung der Probenmoleküle durch eine Amplifikationsreaktion, insbesondere durch PCR (Polymerasekettenreaktion) mit zum Beispiel fluoreszenzmarkierten Primern statt. Nur die mit den verwendeten Primern amplifizierbaren Sequenzen werden so spezifisch markiert. Die markierten Primer zur Erzeugung von PCR-Produkten können zum Beispiel in getrockneter Form an den Reaktionszentren selbst vorliegen. Wird bei solchen Ausgestaltungen des Verfahrens ein PCR-Puffer eingesetzt, mit dem auch die anschließende Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sondenmolekülen des wenigstens einen Reaktionszentrums durchgeführt werden kann, sind keine weiteren Pipettierschritte mehr notwendig.

Bei dem für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Träger kann es sich zum Beispiel um eine Mikrotiterplatte handeln, deren einzelne Kavitäten als entsprechende Reaktionszentren eingesetzt werden, wobei eine einzelne Kavität mit einem entsprechenden Sondengemisch, das heißt mit wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmolekülen, beschichtet ist.

Bei einer bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens wird ein im Wesentlichen planarer Träger eingesetzt, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Wird als Probenlösung zum Beispiel eine wässrige Lösung verwendet, so kann das Reaktionszentrum im Vergleich zu seiner Umgebung hydrophil gewählt werden. Das Reaktionszentrum kann dabei dem hydrophilen Bereich entsprechen oder in ihm enthalten sein. So lässt es sich erreichen, dass die Probenflüssigkeit sich in Form eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Tropfens auf dem hydrophilen Bereich hält ohne in die hydrophobe Umgebung des Reaktionszentrums abzufließen. Auf diese Weise ist eine einfache Lokalisierung der Probenflüssigkeit am Reaktionszentrum möglich und es kann ein planarer Träger, zum Beispiel ein kostengünstiges Quarz- oder Glasplättchen, eingesetzt werden. Eine hydrophobe Umgebung lässt sich zum Beispiel durch Silanisierung erhalten.

Im Falle einer arrayförmigen Anordnung können Gruppen von Reaktionszentren von einem Bereich umfasst sein, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Derartige Bereiche können ihrerseits wieder in einem Array angeordnet sein. Besonders vorteilhaft ist es, wenn einzelne Reaktionszentren von eigenen Bereichen mit unterschiedlichen Benetzungseigenschaften umgeben sind, wodurch eine besonders gute Lokalisierung und die Verwendung sehr geringer Materialmengen möglich ist.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn das wenigstens eine Reaktionszentrum von zwei konzentrischen, vorzugsweise runden Bereichen umgeben ist, wobei der innere Bereich andere Benetzungseigenschaften als der Bereich des Reaktionszentrums und als der äußere Bereich hat. So kann zum Beispiel der innere konzentrische Bereich im Vergleich zum Reaktionszentrum hydrophob sein und so den beschriebenen Lokalisierungseffekt für eine wässrige Flüssigkeit in Form eines Tropfens zur Verfügung stellen. Analog kann der äußere konzentrische Bereich dazu dienen und geeignete Benetzungseigenschaften aufweisen, einen Ölfilm auf dem Probenflüssigkeitstropfen so zu positionieren, dass er die Probenflüssigkeit während der Reaktion abdeckt und eine Verdampfung verhindert. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn kleine Probenvolumina verwendet werden, bei der auch geringe Verdampfungsmengen zu einer Verfälschung des Reaktionsergebnisses führen. Bei der beschriebenen Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens unter Verwendung eines abdeckenden Ölfilms können Volumina von zum Beispiel 0,1 μl bis 10 μl Probenflüssigkeit untersucht werden, wobei das entsprechende Volumen des Öltropfens zum Beispiel um einen Faktor 2 bis 5 größer gewählt wird.

Die Verhinderung der Verdampfung während der Reaktion ist insbesondere dann günstig, wenn eine PCR-Reaktion durchgeführt wird, die das Durchfahren eines entsprechenden Temperaturprofils erfordert.

Im Falle einer arrayförmigen Anordnung kann auch jedes Reaktionszentrum von einem individuellen konzentrischen Bereich anderer Benetzungseigenschaften umgeben sein, um die Probenflüssigkeit an jedem Reaktionszentrum zu halten, und das Array im Ganzen von einem Bereich entsprechend angepasster Benetzungseigenschaften umgeben sein, der einen gemeinsamen Öltropfen auf dem Array hält, der die einzelnen Probenlösungstropfen gemeinsam abdeckt.

Um eine optimale Verteilung der Probenflüssigkeit auf dem Reaktionszentrum zu gewährleisten, können zusätzlich Schallwellen, insbesondere Oberflächenschallwellen, in Richtung des auf dem Reaktionszentrum befindlichen Probenflüssigkeitsvolumens geschickt werden. Oberflächenschallwellen können zum Beispiel mit Hilfe eines Interdigitaltransducers auf einen piezoelektrischen Chip erzeugt werden, wie es in DE 101 03 954 B4 beschrieben ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders zur Untersuchung von Nukleinsäuresequenzen. Ebenso können andere spezifische Reaktionen, beispielsweise Antigen-Antikörperbindungen untersucht werden, wo bei sich entweder die Antigene oder die Antikörper als bekannte Makromoleküle in gebundener Phase an dem Reaktionszentrum befinden. Analog können auch Proteinreaktionen untersucht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere für Hybridisierungsreaktionen.

Das Verfahren eignet sich auch zur Durchführung von beadbasierten Assays. Beads bezeichnen Mikrokügelchen eines Durchmessers von einigen 100 Nanometern bis zu einigen Mikrometern, auf die wenigstens ein Reaktionsausgangsstoff aufbeschichtet ist. Konventionelle beadbasierte Verfahren sind zum Beispiel durch Luminex^® oder von Quantum Dot Corporation bekannt. Beads können zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Beispiel mit unterschiedlichen Oligonukleotiden, Antigenen, Antikörpern oder zum Beispiel Proteinen beschichtet und auf das Reaktionszentrum aufgebracht werden. Zur Unterscheidung der Beads können unterschiedliche Größen, Massen, Farbkodierungen und anderes eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich auch für vergleichende Hybridisierungsreaktionen zwischen zu untersuchenden Proben und Referenzproben, wie sie für die CGH (Comparative Genomic Hybridization) oder die Genexpressionsanalyse üblich sind.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist einen Träger auf, auf dem wenigstens ein Reaktionszentrum angeordnet ist, an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind. Die Makromoleküle der wenigstens zwei Sorten haben dabei innerhalb eines Reaktionszentrums keine vorbestimmte Anordnung.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann auf dem Träger ein einzelnes Reaktionszentrum oder mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays ange ordnete Reaktionszentren mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden aufweisen.

Bei dem Träger kann es sich zum Beispiel um eine Mikrotiterplatte oder um einen im Wesentlichen planaren Träger handeln, wobei im letztgenannten Fall das wenigstens eine Reaktionszentrum von einem Bereich auf dem Träger umfasst sein kann, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung hat. Der planare Träger kann zum Beispiel ein Glas- oder Quarzplättchen oder ein Festkörperchip sein.

Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung mit einem im wesentlichen planaren Träger weist um das wenigstens eine Reaktionszentrum zwei konzentrische, vorzugsweise runde Bereiche auf, wobei der innere konzentrische Bereich andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum und als der äußere Bereich hat.

Im Falle einer arrayförmigen Anordnung der Reaktionszentren kann auch vorgesehen sein, dass die Benetzungseigenschaften derart gewählt sind, dass Probenlösungstropfen individuell an den einzelnen Reaktionszentren gehalten werden und ein abdeckender Ölfilm oberhalb des gesamten Arrays gehalten wird. Dazu sind zur Verwendung von zum Beispiel wässrigen Probenlösungen die Reaktionszentren von individuellen hydrophoben Bereichen umgeben und das gesamte Array von einem Bereich, der zur Lokalisierung eines Öltropfens auf dem gesamten Array dient.

Eine Weiterbildung der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist eine Einrichtung zur Erzeugung von Schallwellen, insbesondere von Oberflächenschallwellen auf, mit deren Hilfe eine optimale Verteilung und/oder Durchmischung der Probenflüssigkeit an einem Reaktionszentrum erreicht werden kann. Eine solche Einrichtung umfasst zum Beispiel einen Interdigitaltransducer auf einer piezoelektrischen Oberfläche, wie er in DE 101 03 954 B4 beschrieben ist. Die Abstrahlrichtung des Interdigitaltransducers ist dabei derart gewählt, dass sie in Richtung eines Reaktionszentrumsliegt, so dass Probenflüssigkeit, die sich auf diesem Reaktionszentrum befindet mit Hilfe der Oberflächenschallwellen, die mit diesem Interdigitaltransducer erzeugt werden, in Bewegung versetzt werden kann.

Ausführungsformen der Vorrichtung, die den für das erfindungsgemäße Verfahren geschilderten Ausgestaltungen analog entsprechen, sind ebenfalls umfasst, ohne dass sie notwendigerweise für die Vorrichtung noch einmal gesondert erläutert werden.

Die Wirkungen und Vorteile der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der beschriebenen und anderer besonderer Ausführungsformen ergeben sich in analoger Weise aus den oben bereits für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebenen Ausgestaltungen und die dort für das erfindungsgemäße Verfahren und seine Ausgestaltungen erläuterten Effekte und Vorteile.

Wie bereits bei dem erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahren beschrieben, kann die Markierung der nachzuweisenden Makromoleküle in der Probenflüssigkeit auch nach dem Aufbringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum geschehen. Eine besonders praktische Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist dazu an dem Reaktionszentrum nicht nur die wenigstens zwei Sorten bekannter Makromoleküle als gebundene Sondenmoleküle auf, sondern zusätzlich Material zur Markierung wenigstens einer Sorte nachzuweisender Probenmoleküle. Beim Aufbringen der Probenflüssigkeit auf das Reaktionszentrum findet dann nicht nur die Reaktion zwischen den Probenmolekülen und den Sondenmolekülen statt, sondern gleichzeitig auch die Markierung der nachzuweisenden Proben-Makromoleküle in der Probe.

Vorzugsweise ist das Material zur Markierung (das zum Beispiel markierte Primer zur Erzeugung von PCR-Produkten umfassen kann) an dem wenigstens einen Reaktionszentrum unspezifisch gebunden, zum Beispiel getrocknet. Beim Aufbringen der Probenflüssigkeit löst sich das unspezifisch gebundene Material und steht für eine Markierung zur Verfügung.

Die Probenlösung wird auf ein solches Reaktionszentrum aufgebracht und löst die unspezifisch gebundenen Fluorophore auf, die dann mit den Teilsequenzen in der Probenlösung reagieren können, um diese zu markieren. Derartig vorbereitete Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Makromoleküle in einer Probenlösung bereitgestellt werden.

Die Auswahl besonderer Materialien zur Markierung, deren Effekte und Vorteile wurden bereits oben mit Bezug zu Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens erläutert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt zumindest ein Reaktionszentrum zum Einsatz, auf dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen als Sondenmoleküle gebunden sind. Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden die potenziellen Sondenmoleküle vor dem Aufbringen auf die Festkörperoberfläche des Trägers zum Beispiel abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum aufgespottet. Somit entsteht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Probenmoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Kit zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens, das eine erfindungsgemäße Vorrichtung und ein Markierungsmaterial, vorzugsweise in Form einer Markierungslösung, aufweist, das geeignet ist, wenigstens eine vorbestimmte Sorte von nachzuweisenden Proben-Makromolekülen zu markieren, die mit einer Sorte von Sondenmolekülen an dem wenigstens einen Reaktionszentrum der Vorrichtung spezifisch reagieren können.

Das Material zur Markierung kann insbesondere markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) und ggf. die für die PCR notwendigen Puffer und Nukleotide umfassen. Schließlich kann das Material zur Markierung auch bereits die für die PCR notwendige Polymerase umfassen.

Die Vorteile und Effekte eines solchen erfindungsgemäßen Kits und seiner in den Unteransprüchen definierten speziellen Ausführungsformen ergeben sich aus den oben beschriebenen Vorteilen und Effekten des erfindungsgemäßen Untersuchungsverfahrens und seiner besonderen Ausgestaltungen bzw. der erfindungsgemäßen Vorrichtung und ihrer bevorzugten Ausführungsformen.

Ausführungsformen des Kits, die den für das erfindungsgemäße Verfahren geschilderten Ausgestaltungen bzw. den für die erfindungsgemäße Vorrichtung geschilderten Ausführungsformen analog entsprechen, sind ebenfalls umfasst, ohne dass sie notwendigerweise für das Kit noch einmal gesondert erläutert werden.

Die Erfindung wird anhand besonderer Ausgestaltungen unter Bezugnahme auf die anliegenden Figuren im Detail erläutert, die in schematischer Darstellung erfindungsgemäße Verfahrensführungen und Vorrichtungen darstellen. Dabei zeigt
1 ein Beispiel eines Reaktionszentrums,
2 ein Array mehrerer Reaktionszentren,
3 eine Schemadarstellung eines erfindungsgemäßen Reaktionsverfahrens,
4 eine Schemadarstellung eines anderen erfindungsgemäßen Reaktionsverfahrens,
5 eine Draufsicht auf ein Detail einer erfindungsgemäßen Vorrichtung,
6 einen Schnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung gemäß der Linie VI-VI in 5,
7 einen Versuchsaufbau für vergleichende Experimente, und
8 die dabei gemessenen Fluoreszenzsignale.
1 beschreibt ein Reaktionszentrum 10, an dem Sondenmoleküle A1, A2, A3, B1, B2 und B3 aufgebracht wurden. Typische Durchmesser solcher Reaktionszentren 10 liegen zwischen 50 μm und einigen Millimetern. A1, A2, A3, B1, B2 und B3 stehen hier beispielhaft für Makromoleküle, die mit entsprechenden Molekülen in einer Probenlösung reagieren können. In der schematischen Darstellung der 1 sind von jeder gebundenen Makromolekülsorte nur zwei dargestellt. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Anzahl in der Regel selbstverständ lich viel größer. Die Makromoleküle A1, A2, A3, B1, B2, B3, sind an dem Reaktionszentrum 10 regellos angeordnet.
Zur Herstellung einer solchen Anordnung werden die potenziellen Sondenmoleküle vor dem Aufbringen auf die Festkörperoberfläche des Trägers abgemischt und dann als ein Reaktionszentrum aufgespottet. Somit entsteht ein Reaktionszentrum, an dem unterschiedliche Probenmoleküle einer Probenflüssigkeit spezifisch binden können.
Die typische Länge der verwendeten Makromoleküle liegt zwischen 15 und 100 Basenpaaren. Es können auch längere PCR-Produkte oder zum Beispiel Klone, Antigene oder Antikörper als Sondenmoleküle verwendet werden.
Mehrere solcher Reaktionszentren, die entweder gleichartige oder auch unterschiedliche Sondenmoleküle enthalten können, können auch in Form einer Matrix auf einer Festkörperoberfläche aufgebracht werden und so ein Array aus Reaktionszentren bilden. Eine solche Anordnung ist Gegenstand der schematischen 2, in der beispielhaft zwei der dargestellten Reaktionszentren mit den Bezugsziffern 10, 12 bezeichnet sind. Auf der Festkörperoberfläche 14 können sich mehr als die dargestellte Anzahl an Reaktionszentren in Form einer Matrix befinden, was durch die Punktlinien 13 angedeutet sein soll.
Mit den beschriebenen Anordnungen können wie folgt Makromoleküle in einer Probenlösung untersucht werden. Es wird zunächst ein Beispiel dargestellt, bei dem die Anwesenheit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz eines Organismus in einer Probenflüssigkeit untersucht werden soll.
3 zeigt in schematischer Darstellung ein Reaktionsverfahren für Assays, in denen mit hoher Sicherheit die Anwesenheit eines bestimmten Organismus festgestellt werden soll. In der Probe sei ein Organismus a mit den Teilsequenzen a1, a2 und a3 vorhanden. Ein typisches Beispiel ist das HIV-Virus, dessen Nachweis über mehrere virusspezifische Sequenzen erfolgt. Die Teilsequenzen werden mit einem Fluorophor f1 markiert. Dazu wird eine PCR (Polymerasekettenreaktion) mit markierten Primern durchgeführt, bei der nur die Teilsequenzen a1, a2, a3 amplifiziert werden.
Das Reaktionszentrum 10 enthält in dem gezeigten Beispiel Teilsequenzen A1, A2, A3 bzw. B1, B2, die spezifisch mit Teilsequenzen der Organismen a bzw. b reagieren könnten.
Wird eine Probenlösung mit den fluoreszenzmarkierten Teilsequenzen a1, a2, a3 mit dem gesamten Reaktionszentrum 10 in Verbindung gebracht, können die Sequenzen A1 und a1 bzw. A2 und a2 bzw. A3 und a3 paarweise hybridisieren. Nach einem stringenten Waschschritt der Festkörperoberfläche, auf dem sich das Reaktionszentrum 10 befindet, kann die Fluoreszenz der Fluorophore, die an Teilsequenzen a1, a2 und a3 gebunden sind, die spezifisch an den Sequenzen des Reaktionszentrums 10 gebunden sind, nachgewiesen werden, indem die Fluoreszenz ausgewertet wird. In einem solchen Fall ist eine Fluoreszenzfarbe ausreichend, um den Assay durchzuführen.
Soll überprüft werden, ob die Probenlösung einen Organismus b enthält, werden dessen Teilsequenzen b1 und b2 zum Beispiel über PCR fluoreszenzmarkiert, wobei nur die Teilsequenzen b1 und b2 amplifiziert werden, und die Probenlösung mit dem Reaktionszentrum 10 in Kontakt gebracht. Die Sequenzen B1 und b1 bzw. B2 und b2 können dann paarweise hybri disieren. Die Auswertung erfolgt dann wie oben für den Nachweis des Organismus a beschrieben.
Ein Reaktionszentrum ist also ausreichend, um sowohl den Organismus a als auch den Organismus b nachweisen zu können, abhängig davon, welche Sequenzen in der Probe markiert werden.
Das Verfahren kann auch für mehr als zwei unterschiedlichen Organismen a, b, c, ... durchgeführt werden, wobei auf dem Reaktionszentrum 10 korrespondierende Teilsequenzen A1, A2, A3, ..., B1, B2, B3, ..., C1, C2, C3, ... vorgesehen sind.
Um die Anwesenheit mehrerer Sequenzen getrennt aber gleichzeitig nachweisen zu können, wird ein Verfahren verwendet, wie es mit Bezug zu 4 erläutert wird. Beispielsweise Teilsequenzen a1, a2 einer ersten Sequenz a werden mit einem ersten Fluorophor f1 und Teilsequenzen b1, b2 einer zweiten Sequenz werden mit einem zweiten Fluorophor f2 markiert. In dem Fall, der in 4 dargestellt ist, sind zwei verschiedene Organismen a und b mit den Teilsequenzen a1, a2 und b1, b2 in der Probenflüssigkeit vorhanden. Wird eine solche Probenflüssigkeit mit dem Reaktionszentrum 10 in Kontakt gebracht, so reagieren die Teilsequenzen a1 und A1, die Teilsequenzen a2 und A2, die Teilsequenzen b1 und B1 bzw. die Teilsequenzen b2 und B2. Nach einem stringenten Waschschritt im Anschluss an die Reaktion verbleiben Fluorophore f1 und f2 solcher Teilsequenzen, die an Sondenmolekülen des Reaktionszentrums 10 spezifisch gebunden wurden. Durch eine Zweifarbenfluoreszenzmessung werden die beiden Organismen getrennt nachgewiesen. Die Zweifarbenfluoreszenzmessung wird entweder durch eine wellenlängenselektive Auswertung des Fluoreszenzsignals oder durch eine Fluoreszenzmessung mit unterschiedlichen Anregungswellenlängen vorgenommen.
Die mit Bezug zur 3 und 4 beschriebenen Verfahren können auch kombiniert werden, um die Sicherheit des Nachweises weiter zu erhöhen.
Eine zusätzliche Erhöhung der Anzahl der parallel durchzuführenden Reaktionen kann erreicht werden, wenn mehrere unterschiedlich bestückte Reaktionszentren in Form einer Matrix angeordnet und ausgewertet werden, wie sie in 2 gezeigt ist.
Um die spezifische Markierung einzelner Sequenzen bzw. Teilsequenzen in der Probenlösung zu erreichen, wird zum Beispiel eine Polymerasekettenreaktion mit entsprechend markierten Primern durchgeführt, wobei zum Beispiel ein Puffer eingesetzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sondenmolekülen des wenigstens einen Reaktionszentrums 10 durchgeführt werden kann.
Das Material zur Markierung kann der Probenlösung entweder zugeführt werden oder bereits in ihr enthalten sein. Die Markierung kann vor der Reaktion durchgeführt werden, indem ein spezifisches Markierungsverfahren angewendet wird, bei dem nur die interessierenden Probenmoleküle markiert werden. Andererseits ist es auch möglich, die Markierung erst nach der Reaktion bzw. nach dem Entfernen ungebundenen Prabenmateriales vorzunehmen.
Bei einer anderen Verfahrensführung ist das Material zur Markierung an dem Reaktionszentrum 10 vorhanden, zum Beispiel in getrockneter Form. So ist es zum Beispiel möglich entsprechend vorbereitete Untersuchungsvorrichtungen zur Verfügung zu stellen, die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum sowohl die Teilsequenzen A1, A2, A3, ..., B1, B2, B3, ... zur spezifischen Reaktion mit den zu untersuchenden Teilsequenzen der Probenlösung enthalten, als auch die benötigten Fluoreszenzmarkierungsstoffe. Es kann sich dabei zum Beispiel um markierte Primer für PCR handeln. Die Probenlösung wird auf ein solches Reaktionszentrum aufgebracht und löst die unspezifisch gebundenen Fluorophore auf, die dann mit den Teilsequenzen in der Probenlösung reagieren können, um diese zu markieren. Derartig vorbereitete Vorrichtungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sind einfach zu handhaben und können als fertiges Untersuchungsmittel für ausgewählte Makromoleküle in einer Probenlösung bereitgestellt werden.
5 zeigt die Draufsicht auf ein Reaktionszentrum einer abgewandelten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Das Reaktionszentrum 10 ist hier von einem konzentrischen Bereich 16 umgeben, der im Vergleich zum Reaktionszentrum 10 hydrophob ist. Dies lässt sich zum Beispiel durch eine Silanisierung des Bereiches 16 erreichen. Der hydrophobe Bereich 16 ist von einem weiteren konzentrischen Bereich 18 umgeben, der solche Benetzungseigenschaften aufweist, dass er zur Lokalisierung eines durch seine Oberflächenspannung zusammengehaltenen Öltropfens dienen kann, also zum Beispiel entsprechend lipophil ist. Die Festkörperoberfläche, zum Beispiel ein Glasplättchen, ist mit 20 bezeichnet.
6 zeigt einen Schnitt durch ein solches Reaktionszentrum entlang der Linie VI-VI, wie sie in 5 angedeutet ist. Außerdem ist ein Tropfen 22 von Probenlösung dargestellt, der von einem Ölfilm 24 bedeckt wird.
Die Probenlösung 22 wird durch ihre Oberflächenspannung zusammengehalten und verlässt den im Vergleich zum hydrophoben Bereich 16 hydrophilen Bereich des Reaktionszentrums 10 ohne äußere Krafteinwirkung nicht, wodurch sie am Reaktionszentrum 10 lokalisiert ist. Zum Schutz gegen Verdampfung ist oberhalb des Probenlösungstropfens 22 ein Öltropfen 24 aufgebracht, der den Bereich 18 aufgrund seiner Oberflächenspannung nicht verlässt. Insbesondere bei Verwendung von kleinen Probenvolumina von 0,1 μl bis 10 μl ist die Verwendung eines solchen Öltropfens 24 vorteilhaft um ein Verdampfen zu verhindern.
Die Geometrie kann auch so gewählt sein, dass der Öltropfen mehrere Reaktionszentren und die darauf befindlichen Probenlösungstropfen abdeckt.
Eine zusätzliche Durchmischung der Probenlösung auf der Oberfläche des Trägers kann erreicht werden, wenn Oberflächenschallwellen in Richtung des Reaktionszentrums geschickt werden, die zum Beispiel mit Hilfe eines Interdigitaltransducers auf der Trägeroberfläche erzeugt werden, dessen Abstrahlrichtung auf das Reaktionszentrum gerichtet ist. Gegebenenfalls kann dazu das Trägermaterial piezoelektrisch ausgewählt oder beschichtet werden.
Vergleichende Experimente
Im Folgenden wird ein Experiment beschrieben, um die Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu nicht-erfindungsgemäßen Verfahren aufzuzeigen. Das Experiment dient dem Nachweis von Probenmolekülen in einem Medium, die mit ausgewählten Sondenmolekülen reagieren können. Bei dem zu untersuchenden Medium handelt es sich bei dem gezeigten Beispiel um den Überstand von Chondrozyten aus einer Zellkultur. Geprüft werden soll, ob sich in diesem Medium Analyten befinden, die speziell mit den Antikörpern MMP10 und MMP13 reagieren können.
Um einen Vergleich durchführen zu können, wurden auf drei Bereiche (siehe 7a, b bzw. c) eines Trägers ("Slide") drei unterschiedliche Versuchreihen präpariert. In einem Bereich wurde nur der Antikörper MMP10 eingesetzt, in einem zweiten Bereich nur der Antikörper MMP13. Auf Vergleichspunkten kann zum Beispiel eine Verdünnungslösung PBS in reiner Form aufgebracht werden um die Korrektheit der Messapparatur zu prüfen.
Für den dritten Bereich wurden die Antikörper MMP10 und MMP13 erfindungsgemäß abgemischt und die so hergestellte Abmischung verwendet.
Die Antikörper, die in einer Konzentration von 1 mg/ml vorlagen, wurden 1:1, 1:2 bzw. 1:4 verdünnt. Dazu wurde ein Spottingpuffer (SP) verwendet, der PBS pH 7,4 umfasst. Die so verdünnten Antikörperlösungen werden in einem Array auf das Slide aufgebracht, wobei sich die genannten Verdünnungen der Antikörperlösungen wie in 7 in vertikaler Richtung angegeben ändern. Die Antikörperlösungen werden zum Beispiel auf das Slide aufpipettiert oder aufgespottet.
Das Slide wurde bei Raumtemperatur über Nacht in einer feuchten Kammer inkubiert, so dass die Antikörperlösungen nicht eingetrocknet sind. Anschließend wurde das Slide außerhalb der feuchten Kammer für 30 Minuten getrocknet.
In einem nächsten Schritt wurde das zu untersuchende Medium aufgebracht. Zunächst wurde dazu das Slide in einer Waschstation mit einem Waschpuffer (WP) rehydriert. Der Waschpuffer umfasste 0,1% Tween 20 in PBS pH 7,4. Anschließend wurde das Slide trockenzentrifugiert. Von dem Medium, das untersucht werden sollte (Überstand von Chondrozyten aus einer Zellkultur) wurde eine Verdünnungsreihe 1:2, 1:5, 1:10, 1:20 präpa riert. Als Verdünnungspuffer (VP) wurde 1,5% BSA, 2,5% Low Fat Milchpulver, 0,1% Tween 20 in PBS pH 7,4 verwendet. Je 1 μl wurde in einer Anordnung auf das Slide aufgebracht, die in horizontaler Richtung in 7 angegeben ist. Mit "neg" ist ein Punkt bezeichnet, in den der Verdünnungspuffer in reiner Form aufgebracht wurde. Die Inkubation erfolgte für 45 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Anschließend wurde das Slide in einer Waschstation mit dem Waschpuffer WP gewaschen und dann trockenzentrifugiert.
Im nächsten Schritt muss die Fluoreszenzmarkierung vorgenommen werden. Dazu können Fluoreszenzmarkierungsstoffe eingesetzt werden, die spezifisch entweder an dem Analyten binden, der mit dem Antikörper MMP10 reagiert, oder an den Analyten binden, der mit dem Antikörper MMP13 reagiert. In dem Bereich a des in 7 gezeigten Slides würde dann nur der Fluoreszenzstoff nachgewiesen werden können, der dem Analyten entspricht, der an den Antikörper MMP10 gebunden hat, im Bereich b der 7 würde nur der Fluoreszenzfarbstoff nachgewiesen werden können, der an den Analyten bindet, der mit dem Antikörper MMP13 reagiert, während in dem Bereich c die beiden Fluoreszenzfarbstoffe nachgewiesen werden könnten.
Der Analyt, der mit dem Antikörper MMP13 reagiert, wird zum Beispiel mit einem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 ("grün") markiert, während der Analyt, der mit dem Antikörper MMP10 reagiert, mit einem Fluoreszenzfarbstoff Cy5 ("rot") markiert wird.
Alternativ kann zur Markierung wie folgt vorgegangen werden. Zunächst werden Detektionsantikörper (Biotin-Anti-MMP10 (1 μg/ml, Verdünnung in dem Verdünnungspuffer VP)) aufgebracht. Ein solcher Detektionsantikörper kann nur an solchen Bindungsstellen binden, an denen ein Analyt gebunden ist, der mit einem Antikörper MMP10 reagiert hat. Diejenigen Bindungsstellen, bei denen ein Analyt mit einem Antikörper MMP13 reagiert hat, bleiben von diesem Detektionsantikörper frei. An das Biotin kann jetzt ein Farbstoff Streptavidin-Cy5 zur Markierung aufgebracht werden. Die Inkubation für diese Markierungsreaktionen erfolgt in je 1 μl für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur. Jetzt kann in noch zu beschreibender Weise der Nachweis des Vorhandenseins bzw. des Nicht-Vorhandenseins des Farbstoffes Cy5 mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse an dem Reaktionszentrum vorgenommen werden.
In einem zweiten Durchgang wird Biotin-Anti-MMP13 (1 μg/ ml, Verdünnung in dem Verdünnungspuffer VP) aufgebracht. Dieser Detektionsantikörper bindet nur mit solchen Bindungsstellen, an denen ein Analyt vorhanden ist, der an einem Antikörper MMP13 gebunden ist. An diesem Biotin kann ein Farbstoff Streptavidin-Cy3 angelagert werden, wobei die Inkubation wiederum in 1 μl für 30 Minuten in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur vorgenommen wird. An den Bindungsstellen, die den Antikörpern MMP13 entsprechen, liegt dann dementsprechend der Farbstoff Cy3 vor, der in noch zu beschreibender Weise mit Hilfe der Fluoreszenzanalyse des Reaktionszentrums nachgewiesen werden kann.
Der Nachweis erfolgt in den beschriebenen Fällen mit einem kommerziellen Laserscanner bei einer Anregungswellenlänge, wobei das erzeugte Spektrum wellenlängenselektiv ausgewertet wird. In einer photographischen Aufnahme des Slides ergibt sich dabei eine Farbaufteilung derart, dass der in 7 mit a bezeichnete Bereich rote Punkte aufweist, der mit b bezeichnete Bereich grüne Punkte und der mit c bezeichnete Bereich gelbe bzw. braune Punkte. Im Bereich a, in dem nur der Antikörper MMP10 als Sonde verwendet wurde, ist nur der Farbstoff Cy5 nachweis bar, während im Bereich b nur der Farbstoff Cy3 nachweisbar ist. In dem Bereich c sind beide Farbstoffe nachzuweisen, so dass sich in der photographischen Aufnahme der 7 eine Mischung zeigt.
8 zeigt die entsprechenden Fluoreszenzsignale. Aufgetragen ist dabei die Intensität des Fluoreszenzsignales in beliebigen Einheiten gegen den Ort auf dem Slide. Die Teilfiguren 8a, 8b, 8c entsprechen den Bereichen a, b bzw. c des Slides, das in 7 gezeigt ist. Die Messkurve A wurde mit einem Kantenfilter vorgenommen, das derart ausgewählt ist, dass im Wesentlichen der Farbstoff Cy5 nachgewiesen wird, während die Kurve B mit einem Kantenfilter aufgenommen wurde, das im Wesentlichen die Detektion des Farbstoffes Cy3 erlaubt. In den Bereichen a und b wurde nur jeweils ein Farbstoff nachgewiesen. Im Bereich c zeigt sich, dass bei den abgemischten Reaktionszentren jeweils beide Farbstoffe nachgewiesen werden können. Das geschilderte vergleichende Experiment zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren ergibt, dass in dem verwendeten Medium Analyten sowohl für den Antikörper MMP10 als auch für den Antikörper MMP13 vorliegen.
Wesentlich ist zudem, dass ein einzelnes Reaktionszentrum, wie zum Beispiel das in 7c mit 11 bezeichnete Reaktionszentrum, zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ausreicht. Die größere Anzahl Reaktionszentren, die auf dem Slide in 7 sichtbar ist, dient nur der Darstellung des Verfahrens im Vergleich mit anderen Methoden. Außerdem ist aus den Verdünnungsreihen aus der abnehmenden Leuchtintensität, die in 7 mit steigender Verdünnung erkennbar ist, auf einen fehlerfreien Versuchsablauf zurückschließbar, so dass die Sicherheit des Versuchsergebnisses erhöht wird.
Um die Frage zu beantworten, ob in dem zu untersuchenden Medium Analyten, die mit dem Antikörper MMP10 reagieren, und Analyten, die mit dem Antikörper MMP13 reagieren, vorhanden sind, sind bei dem nicht erfindungsgemäßen Verfahren zwei Experimente (die in den Bereichen a und b des Slides der 7 durchgeführt wurden) mit einer entsprechenden Anzahl Spots notwendig. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren, in dem die Antikörper MMP10 und MMP13 in abgemischter Form vorliegen, reicht ein Experiment bzw. Reaktionszentrum.
Die im vorliegenden Text beschriebenen Ausgestaltungen beziehen sich darauf, dass mit Hilfe von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum vorliegenden mehreren Sorten von Sondenmolekülen das Vorhandensein von bestimmten Probenmolekülen in einer Probenlösung bzw. deren Reaktionsverhalten untersucht werden soll. Andere Verfahrensführungen sehen vor, dass die zu untersuchenden Makromoleküle in abgemischter Form auf das Reaktionszentrum aufgebracht werden und mit einer Lösung in Kontakt gebracht werden, die bekannte Makromoleküle enthält, um Information über die an dem Reaktionszentrum gebundenen Makromoleküle zu erhalten.

10, 11, 12: Reaktionszentren
13: Fortsetzungslinien
14: Reaktionsarray
16: hydrophober Bereich
18: hydrophiler Bereich
20: Festkörperoberfläche
22: Probenflüssigkeitstropfen
24: Ölbedeckung

Claims

Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe mit folgenden Schritten: – Bereitstellen eines Trägers (20) mit wenigstens einem Reaktionszentrum (10, 12), an dem wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (A1, A2, A3, B1, B2, B3) als Sondenmoleküle gebunden sind, – Markieren nachzuweisender, komplementärer Proben-Makromoleküle (a1, a2, b1, b2) der Probe (22), – In-Kontakt-Bringen der Probe mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) derart, dass eine Reaktion zwischen wenigstens einer Sorte der gebundenen Sonden-Makromoleküle (A1, A2, A3, B1, B2, B3) mit den nachzuweisenden Proben-Makromolekülen (a1, a2, b1, b2) stattfinden kann, wenn eine spezifische Reaktion zwischen nachzuweisenden Proben-Makromolekülen mit einer Sorte der gebundenen Sonden-Makromoleküle möglich ist, – Entfernen von ungebundenem Probenmaterial, und – Prüfen des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum spezifisch gebundenen Proben-Makromolekülen.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 1, bei dem die wenigstens zwei Sorten von gebundnen Sonden-Makromolekülen wenigstens zwei unterschiedliche Teile einer biologischen Sequenz eines Organismus (a) oder unterschiedliche Sequenzen eines Organismus umfassen.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem die wenigstens zwei Sorten von gebundenen Sonden-Makromolekülen wenigstens zwei Reaktionspartner für wenigstens zwei unterschiedliche Sorten von Proben-Makromolekülen umfassen.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 3, bei dem die wenigstens zwei unterschiedlichen Sorten von Proben-Makromolekülen biologische Sequenzen umfassen, die zu unterschiedlichen Organismen (a, b) gehören.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Markierung nur für solche nachzuweisende Makromoleküle der Probe vorgenommen wird, die zu demselben Organismus gehören.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die Markierung für wenigstens zwei Sorten von nachzuweisenden Makromolekülen in der Probe vorgenommen wird, die zu unterschiedlichen Organismen (a, b) gehören, wobei die Makromoleküle unterschiedlicher Organismen mit unterschiedlichen Markierungen (f1, f2) versehen werden.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem als Markierung Fluoreszenzmarkierung verwendet wird und zur Prüfung des Vorhandenseins von an dem wenigstens einen Reaktionszentrum nach der Reaktion gebundenen Proben-Makromolekülen die Fluoreszenz untersucht wird.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 7, bei dem zur Unterscheidung verschiedener Makromoleküle der Probe mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen das Fluoreszenzsignal wellenlängenselektiv ausgewertet wird.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 7 oder 8, bei dem die Fluoreszenz bei unterschiedlichen Anregungswellenlängen ausgewertet wird.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem weniger als zehn, vorzugsweise weniger als fünf unterschiedlich markierte Bestandteile in der Probe vorgesehen werden.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die Markierung der Makromoleküle der Probe auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) nach dem Entfernen ungebundenen Probenmaterials erfolgt.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem mehrere, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordnete, Reaktionszentren (10, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von gebundenen Makromolekülen als Sonden auf einem Träger (20) eingesetzt werden.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem zur Markierung der Probenmoleküle eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) mit entsprechend markierten Primern eingesetzt wird.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 13, bei dem für die PCR ein Puffer eingesetzt wird, mit dem auch die Reaktion zur spezifischen Bindung an den Sondenmolekülen des wenigstens einen Reaktionszentrums (10, 12) durchgeführt werden kann.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 14, bei dem ein im wesentlichen planarer Träger (20) eingesetzt wird, wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung (16) hat.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach Anspruch 15, bei dem das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von zwei konzentrischen Bereichen (16, 18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 16, insbesondere nach einem der Ansprüche 13 bis 16, bei dem die Probenflüssigkeit (22) während der Reaktion mit Öl (24) bedeckt wird.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem Schallwellen, vorzugsweise Oberflächenschallwellen, in Richtung der Probenflüssigkeit geschickt werden, nachdem die Probenflüssigkeit mit dem wenigstens einen Reaktionszentrum in Kontakt gebracht worden ist.
Verfahren zur Untersuchung von Makromolekülen in einer Probe nach einem der Ansprüche 1 bis 18, bei dem die zu untersuchenden Makromoleküle in der Probe und/oder die auf dem wenigstens einen Reaktionszentrum vorhandenen Sondenmoleküle Nukleinsäuresequenzen oder Antigene oder Antikörper oder Proteine umfassen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem an einem Reaktionszentrum (10, 12) unterschiedliche Sorten von Sondenmolekülen vorhanden sind, die derart ausgewählt sind, dass nachzuweisende Makromoleküle von maximal zehn, vorzugsweise maximal sieben, besonders vorzugsweise maximal fünf Bestandteilen der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können.
Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20, mit – einem Träger (20) und – wenigstens einem auf dem Träger (20) angeordneten Reaktionszentrum (10, 12) mit wenigstens zwei Sorten von bekannten Makromolekülen (A1, A2, A3, B1, B2, B3), die ohne vorbestimmte räumliche Anordnung an dem Reaktionszentrum als Sondenmoleküle gebunden sind.
Vorrichtung nach Anspruch 21 mit mehreren, vorzugsweise in Form eines Arrays angeordneten, Reaktionszentren (10, 12) mit jeweils wenigstens zwei Sorten von Makromolekülen als Sonden.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 oder 22 mit einem im wesentlichen planaren Träger (20), wobei das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von einem Bereich auf dem Träger umfasst ist, der andere Benetzungseigenschaften als seine Umgebung (16) hat.
Vorrichtung nach Anspruch 23, bei der das wenigstens eine Reaktionszentrum (10) von zwei konzentrischen Bereichen (16, 18) umgeben ist, wobei der innere konzentrische Bereich (16) andere Benetzungseigenschaften als das Reaktionszentrum (10) und als der äußere konzentrische Bereich (18) hat.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 24, bei der an einem Reaktionszentrum (10, 12) unterschiedliche Sorten von Sondenmolekülen vorhanden sind, die derart ausgewählt sind, dass nachzuweisende Makromoleküle von maximal zehn, vorzugsweise maximal sieben, besonders vorzugsweise maximal fünf unterschiedlichen Bestandteilen der Probenflüssigkeit mit Sondenmolekülen des Reaktionszentrums spezifisch reagieren können.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 25 mit einer Einrichtung zur Erzeugung von Schallwellen mit einer Abstrahlrichtung in Richtung des wenigstens einen Reaktionszentrums, vorzugsweise wenigstens eines Interdigitaltransducers zur Erzeugung von Oberflächenschallwellen.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26, bei der sich an dem wenigstens einen Reaktionszentrum (10, 12) zu jeder dort vorhandenen Sorte von Sondenmolekülen Material zur Markierung wenigstens einer Sorte nachzuweisender Probenmoleküle befindet, vor zugsweise unspezifisch gebunden ist, die mit der jeweiligen Sorte von Sondenmolekülen spezifisch reagieren können.
Vorrichtung nach Anspruch 27, bei der das Material zur Markierung fluoreszierend ist.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 oder 28, bei der das Material zur Markierung von nachzuweisenden Proben-Makromolekülen derart ausgewählt ist, dass die Probenmoleküle eines Organismus dasselbe Auswertesignal ergeben.
Vorrichtung nach einem der Ansprüche 27 bis 29, bei der das Material zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 21 bis 30, bei dem – eine Mischung von wenigstens zwei Sorten unterschiedlicher Makromoleküle hergestellt wird und – auf einen Träger (20) aufgespottet wird.
Kit zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 20, mit – einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 21 bis 26 und – einem Markierungsmaterial, vorzugsweise in einer Markierungslösung, das geeignet ist, wenigstens eine vorbestimmte Sorte von nachzuweisenden Makromolekülen (a1, a2, b1, b2) zu markieren, die mit einer Sorte von Sondenmolekülen (A1, A2, A3, B1, B2, B3) an dem wenigstens einen Reaktionszentrum der Vorrichtung spezifisch reagieren können.
Kit nach Anspruch 32, bei dem das Markierungsmaterial fluoreszierend ist.
Kit nach einem der Ansprüche 32 oder 33, bei dem das Material zur Markierung von nachzuweisenden Makromolekülen derart ausgewählt ist, dass die Probenmoleküle eines Organismus dasselbe Auswertesignal ergeben.
Kit nach einem der Ansprüche 32 bis 34, bei dem das Material zur Markierung markierte Primer für eine oder mehrere PCR (Polymerasekettenreaktion(en)) umfasst.