DE10393431T5 - Mikroarrays mit mehreren Oligonukleotiden in einzelnen Array Features - Google Patents

Mikroarrays mit mehreren Oligonukleotiden in einzelnen Array Features Download PDF

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Abstract

Mikroarray, umfassend eine Vielzahl von Features, jede der Features einzelsträngige Oligonukleotide umfassend, wenigstens einige der Features Oligonukleotide von mehr als einer Sequenz innerhalb derselben Feature umfassend.

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Einführung von DNA Mikroarray-Technologie ermöglicht den Aufbau eines Arrays von hunderttausenden DNA-Sequenzen auf einer sehr kleinen Fläche, wie z.B. der Größe eines Mikroskopierträgers. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 6 375 903 und US-Patent Nr. 5 143 854, die hiermit durch Verweis in vollem Umfang inkorporiert werden. Die Offenbarung von Patent Nr. 6 375 903 ermöglicht die Herstellung sogenannter maskenfreier Array-Synthesizer (MAS) Instrumente in denen Licht dazu verwendet wird um DNA-Sequenzen zu synthetisieren, wobei die Lichtausrichtung mit Hilfe einer digitalen Mikrospiegeleinrichtung (DMD) durchgeführt wird. Bei der Verwendung eines MAS-Instruments befindet sich die Auswahl der DNA-Sequenzen, die im Mikroarray konstruiert werden sollen unter Software-Kontrolle, so dass individuell angepasste Arrays auf Anfrage hergestellt werden können. Im Allgemeinen erlaubt die Verwendung von MAS-basierter DNA-Mikroarray-Synthesetechnologie die parallele Herstellung von über 800 000 einmaligen Oligonukleotiden auf einer sehr kleinen Fläche auf einem Standard Mikroskopierträger. Die Mikroarrays werden normalerweise unter Verwendung von Licht zur Lenkung der Addition einzelner Nukleotide an die in Herstellung begriffenen Oligonukleotide an spezifischen Orten in einem Array synthetisiert, wobei diese Orte Features genannt werden. Üblicherweise besteht das Ziel darin viele identische Oligonukleotide zu synthetisieren, wobei jedes die gleiche Nukleotidsequenz besitzt, in jeder Feature des Arrays, d.h. dass zahlreiche Sonden in jeder Feature existieren, aber dass alle diese Sonden die gleiche Nukleotidsequenz besitzen. Bei bestimmten Anwendungen wäre es vorteilhaft, Oligonukleotide mit verschiedenen Sequenzen innerhalb einer Feature des Arrays zu haben, und dazu in der Lage zu sein, das Verhältnis und die Richtung (5'-3', oder 3'-5') dieser Oligonukleotide zu kontrollieren.
  • KURZE ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung wird zusammengefasst als ein Verfahren zur Synthese eines Mikroarrays mit Oligonukleotiden mit verschiedenen Sequenzen innerhalb einer Feature des Arrays. Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein Verfahren zur Synthese eines Mikroarrays zum Kontrollieren des Verhältnisses und der Richtung (5'-3', oder 3'-5') der Oligonukleotide. Die vorliegende Erfindung umfasst ausserdem Mikroarrays, die entsprechend dem offenbarten Verfahren hergestellt wurden.
  • Das Verfahren greift auf die gängigen Techniken der Mikroarray-Synthese zurück, aber limitiert die Dauer mit der ausgewählte Featurebereiche auf dem Array initial belichtet werden, so dass nur ein berechneter Anteil der Verbindungen, die die bindende Schicht des Arrays darstellen entschützt werden. Die Verbindungen, die initial entschützt wurden werden mit einer nicht-photosensitiven Schutzgruppe, wie z.B. Dimethoxy-trityl, gecappt, um ihre Mitwirkung bei der Synthese der ersten Gruppe von DNA-Strängen, die auf dem Array aufgebaut werden, zu verhindern. Sobald die erste Gruppe von DNA-Strängen synthetisiert worden ist, kann die ursprünglich entschützte Gruppe weiter bearbeitet werden um eine zweite Gruppe von DNA-Strängen in demselben Featurebereich aufzubauen wie der ersten Gruppe von DNA-Strängen. Dasselbe Konzept kann außerdem angewendet werden um weitere Gruppen von DNA-Strängen aufzubauen, um Featurebereiche bereitzustellen, die mehr als zwei verschiedene Gruppen von DNA-Strängen enthalten. Die DNA-Stränge können 5' nach 3' oder 3' nach 5' konstruiert werden, abhängig allein von der Orientierung der photolabilen konjugierten Nukleoside, die in dem Prozess verwendet werden.
  • Weitere Gegenstände, Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung und den Zeichnungen ersichtlich.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER VERSCHIEDENEN ANSICHTEN DER ZEICHNUNGEN
  • 1 bis 4 sind schematische Illustrationen des Prozesses der Mikroarray-Synthese, umfassend zwei Oligonukleotide, die im selben Featurebereich synthetisiert wurden.
  • 5 ist eine Illustration eins Typs von Assay, der zum ersten Mal, dank der Tatsache, ermöglicht wird, dass das Mikroarray zwei Oligonukleotide in jeder Feature hat.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Synthese eines Mikroarrays mit einer Anzahl von Features und in welchem ein oder mehr Features mehrere Sonden mit verschiedenen Sequenzen in sich haben können zur Verfügung. Das Verfahren beschäftigt sich damit, dass zwei oder mehr Sonden oder Oligonukleotide in einer einzigen Feature des Mikroarrays konstruiert werden können, und stellt ferner ein Verfahren zur Verfügung um das Verhältnis der relativen Anzahlen der beiden Sonden in der Feature zu kontrollieren. Das Verfahren erlaubt ferner die Kontrolle der Richtung (5'-3', oder 3'-5') dieser Oligonukleotide, so dass jedes der beiden Oligonukleotide in einer einzelnen Feature in der gleichen Richtung verlaufen kann oder dass sie in gegenläufigen Richtungen verlaufen können.
  • Es ist ein Vorteil der hier beschriebenen Verfahren, dass sie auf Techniken zurückgreifen, die bei der Mikroarray-Synthese geläufig sind aber Modifikationen dieser Methoden einsetzen, um neue Produkte zu erhalten. Beispielsweise greift das Verfahren zurück auf den jetzt gut verstandenen Prozess der Verwendung von Licht gelenkter Entschützung um Bereiche auf dem Mikroarray für einen Entschützungsschritt auszuwählen, aber limitiert die Dauer, mit der ausgewählte Featurebereiche auf dem Array initial belichtet werden, so dass nicht ganze Features entschützt werden sondern nur ein kalkulierter Anteil der Fläche von jeder Feature. Der Bereich des Arrays, der auf diese Weise entschützt wurde wird dann mit einer nicht-photosensitiven Schutzgruppe gecappt um die Mitwirkung dieser Bereiche bei der Synthese der ersten Gruppe von Oligonukleotiden die auf dieser Feature des Arrays aufgebaut werden zu verhindern. Sobald die erste Gruppe von Oligonukleotiden synthetisiert wurde, kann die ursprünglich entschützte und dann gecappte Region wieder entcapped werden. Das kann dadurch er reicht werden, dass die Schutzkappe säure- oder basenlabil gemacht wird und Säure oder Base dem Mikroarray zugeführt wird, um die gecappten Bereiche zu entcappen. Dann, nach der Wiederherstellung eines geeigneten pH-Werts, kann der Nukleotidadditionsprozess neu gestartet werden, um eine zweite Gruppe von Oligonukleotiden in demselben Featurebereich wie der ersten Gruppe von Oligonukleotiden zu synthetisieren. Dasselbe Konzept kann auch eingesetzt werden, um zusätzliche Gruppen von DNA-Strängen aufzubauen, um auf diese Weise Featurebereiche bereitzustellen, die mehr als zwei verschiedene Gruppen von DNA-Strängen enthalten.
  • Zum Zwecke dieser Erfindung wird der Term Feature für einen Bereich auf dem Array verwendet, der bei Stand der Technik Mikroarrays dazu gedacht war dieselbe Nukleotidsonde oder -sonden innerhalb seines Bereichs zu tragen. In der Vergangenheit hatten Mikroarrays Features, bei denen die Feature nur Sonden oder Oligonukleotide derselben Nukleotidsequenz enthielt. Dieses ist das erste bekannte Beispiel bei dem vorgeschlagen oder ermöglicht wird, Sonden mit zwei oder mehr verschiedenen Sequenzen in derselben Feature eines Mikroarrays unterzubringen. Im Sinne dieser Erfindung bedeutet Feature daher ein Teil des Mikroarrays, in dem zwei oder mehr Sonden in derselben generellen physikalischen Region des Mikroarrays synthetisiert werden, einer Region, die sich vorzugsweise unterscheidet von der Region in der andere Sonden konstruiert werden.
  • Die Termini Sonde und Oligonukleotide werden hier in austauschbarer Weise verwendet um die einzelsträngigen DNA(oder RNA)-Moleküle zu bezeichnen, die auf dem Mikroarray synthetisiert werden.
  • Wiederum, das Verfahren mit dem die Konstruktion der mehrfachen Sonden in einzelnen Features ermöglicht wird, ist eine elegante und relativ simple Modifikation der existierenden Mikroarray-Syntheseverfahren. Zuerst wird auf dem aktivierten Substrat ein Licht-gelenkter Entschützungsschritt durchgeführt, der in seiner zeitlichen Dauer limitiert ist. Die Zeit wird so gewählt, dass sie ein ausgewählter Anteil, wie z.B. ½, der Zeit ist, die als notwendig gefunden wurde, um den gesamten Bereich der Feature zu entschützen. Wir haben ermittelt dass, wenn ½ der minimalen Belichtungszeit die notwendig ist um den gesamten Featurebereich zu entschützen verwendet wird, ungefähr die Hälfte des Flächenbereichs von jeder Feature entschützt wird. Dieses Konzept ist illustriert im Schema der 1. In 1 ist das präparierte Substrat 10 mit reaktiven Gruppen wie Silanen mit reaktiven Hydroxylgruppen, beschichtet, an die photolabile Schutzgruppen "P" gekoppelt wurden. Die Schicht mit photolabilen Schutzgruppen wird von der Referenzzahl 12 bezeichnet. Dieser Teil des Mikroarrays soll zwei Features umfassen, hier mit 14 und 16 bezeichnet. Licht, bezeichnet mit 18, wird auf das gesamte Array geschienen, für eine ausreichende Zeitdauer um ungefähr die Hälfte der photolabilen Schutzgruppen "P" zu entschützen. Die entschützten Bereiche der Features werden dann mit einer Schutzgruppe, die nicht durch die Synthese der verbleibenden Sonden gestört wird gecappt, wie z.B. durch Addition der säurelabilen Schutzgruppe, die in 2 mit "B" bezeichnet ist. Demnach ist an dieser Stelle ungefähr die Hälfte der Fläche jeder Feature mit einer photolabilen Schutzgruppe geschützt während die andere Hälfte durch eine säurelabile Schutzgruppe geschützt wird. Dann wird ein Licht-gelenkter Entschützungsschritt bis zur Sättigung durchgeführt, so dass die verbleibenden photolabilen Schutzgruppen vollständig vom Mikroarraybereich entfernt werden. Darauffolgend wird ein im Übrigen konventioneller Sondensyntheseprozess in allen Bereichen, die nicht mit säurelabilen Schutzgruppen gecappt sind bis zum Abschluss durchgeführt. Dies ist in 3 illustriert wo zur Veranschauung eine drei Nukleotide Sonden Gruppe TAA in Fea ture 14 synthetisiert wurde, während eine Gruppe von Sonden der Sequenz GAC in Feature 16 synthetisiert wurde. Die drei Nukleotide sind nur illustrativ da in der eigentlichen Praxis natürlich die Sonden viel länger sind, typischerweise ungefähr 25 Nukleotide lang, obwohl sie auch bis zu einer Länge von 100 Nukleotiden mit ausreichender Genauigkeit konstruiert werden können. Nachdem die Synthese der ersten Gruppe von Oligonukleotidsonden fertig ist, werden die synthetisierten Sonden mit einem Capping-Agens gecappt, das weder licht- noch säurelabil ist. Dann wird eine Säure dazu verwendet um die säurelabilen Schutzgruppen "B" vom Substrat zu entfernen und die Flächen des Mikroarrays freizulegen an denen noch keine Sonden synthetisiert wurden. Dann wird in exakt derselben Art und Weise wie vorher eine weitere Gruppe von Sonden auf dem Mikroarray synthetisiert, außer dass die Sequenzen der synthetisierten Sonden nun anders sein können. Einfach, zum Zwecke der Veranschaulichung, wurde im trivialen Beispiel in den Illustrationen in 4, eine zweite Sonde der Sequenz CAT in Feature 14 konstruiert während eine zweite Sondengruppe der Sequenz CAG in Feature 16 konstruiert wurde. In der eigentlichen Praxis erwies sich die Synthese von zwei Sondengruppen in jeder Feature mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens als praktikabel und leicht ausführbar. Die relativen Mengen der ersten und zweiten Sondengruppe können sogar adjustiert werden, indem einfach die Dauer des partiellen Licht-gelenkten Entschützungsschritts am Anfang des Prozesses modifiziert wird.
  • Es ist zu beachten dass die Richtung der Sondensynthese allein von der Natur der verwendeten Nukleotide abhängt. Wenn Nukleotide zu den entstehenden Sondengruppen hinzugefügt werden, tratgen die addierten Nukleotide bereits eine photolabile Schutzgruppe. Die Richtung der Sondensynthese, d.h. ob die Sonden von 3' nach 5' oder 5' nach 3' synthetisiert werden wird allein dadurch festgelegt, ob die addierten Nukleotide photolabile Schutzgruppe an ihrem 3'- oder 5'-Ende tragen. Da Nukleotide mit geeigneten photolabilen Schutzgruppen, inklusive NPPOC, dass das bevorzugte Reagenz zur Verwendung hier ist, erhältlich sind, mit dem NPPOC entweder am 3'- oder am 5'-Ende der Nukleotide, ist es leicht möglich die Sonden in jeder gewählten Orientierung zu synthetisieren. Tatsächlich muss die Richtung von einer Sondengruppe in einer gegebenen Feature nicht mit der Richtung in der anderen Sondengruppe in derselben Feature übereinstimmen. Wir haben Mikroarrays hergestellt, in denen 3'- nach 5'- und 5'- nach 3'-Sonden in demselben Featurebereich des Mikroarrays synthetisiert wurden.
  • Es wird anerkannt dass viele verschiedene Verbindungen als Bindungsverbindungen oder Schutzgruppen während der Synthese von Mikroarrays verwendet werden können. Obwohl unten Bezug auf spezifische Verbindungen genommen wird, die während des Syntheseprozesses verwendet werden, würde ein Fachmann anerkennen, dass andere Bindungsverbindungen und Schutzgruppen auch zur Durchführung der gegenwärtigen Erfindung verwendet werden könnten. Die Beispiele unten dienen lediglich zur Diskussion einer Ausführungsform der gegenwärtigen Erfindung und sind in keiner Weise dazu gedacht den Geltungsbereich der Erfindung einzuschränken.
  • Die vorliegende Erfindung ermöglicht es zwei oder mehr verschiedene Oligonukleotide auf einem einzelnen Featurebereich aufzubauen. Um zwei Oligonukleotide pro Featurebereich herzustellen wird eine Schicht einer Base die mit einer photosensitiven Schutzgruppe assoziiert ist, wie z.B. NPPOC geschützten Basen, an die Arrayoberfläche gekoppelt. Die Base wird dann partiell mit einer angemessenen Lichtquelle entschützt. Die Größe der Lichtdosis auf dem Array wird den Effekt haben, nur einen Prozentsatz der photosensitiven Schutzgruppen vom Featurebereich zu entfernen, und auf diese Weise das Verhältnis der verschiedenen synthetisierten Oligonukleo tide zu kontrollieren. Wenn der erwünschte Prozentsatz der ursprünglichen Base entfernt wurde wird eine zweite Base die eine Schutzgruppe trägt die nicht sensitiv gegenüber Licht ist, wie z.B. das säurelabile Di-methoxy-trityl (DMT), an die freien Hydroxyle der Oberfläche des entschützten Teils des Featurebereiches gekoppelt. Nach der Kopplung werden die verbliebenen photosensitiven Schutzgruppen entfernt indem der Featurebereich mit weiterem Licht aus der Lichtquelle beschienen wird. Die Hydroxylgruppen die durch die zweite Lichtdosis befreit werden (und demnach nicht mit DMT geschützt sind) sind dann frei um zur Licht-gelenkten Synthese von DNA-Sonden in der normalen Art und Weise verwendet zu werden. In Abwesenheit von jeglichen hochsauren Verbindungen wie z.B. Trichloressigsäure (TCA), werden die DMT-geschützten Stellen innerhalb jeder Feature unberührt sein und für spätere Verwendung beim Aufbau einer zweiten Gruppe von DNA-Strängen zur Verfügung stehen.
  • Nachdem die erste Gruppe von DNA-Strängen synthetisiert worden ist wird die DNA mit einer Cappingmischung, wie z.B. Essigsäureanhydrid und Tetrahydrofuran, gecappt, um weiteren Strangaufbau zu verhindern, und dann wird die Synthese der zweiten Gruppe von DNA-Strängen begonnen. Zuerst wird die DMT-Schutzgruppe von der ursprünglich entschützten Gruppe entfernt indem sie einer Verbindung ausgesetzt wird die wirksam bei der Entfernung von DMT ist, wie z.B. der hochaciden Verbindung TCA. Sobald das DMT entfernt wurde, wird die zweite Gruppe von DNA-Strängen auf die normale Art und Weise synthetisiert. Nach dem Abschluss wird das Array in eine Entschützungslösung platziert um die Basenschutzgruppen und die Cap auf der ersten Gruppe von DNA-Strängen zu entfernen, womit sich ein Array mit zwei verschiedenen Oligonukleotidsträngen pro Feature ergibt.
  • Es ist vorgesehen dass sogar mehr als zwei Spezies von Sonden auf einer gemeinsamen Feature des Mikroarrays konstruiert werden können. Um die Anzahl der verschiedenen Oligonukleotide die sich in einer Feature befinden zu erhöhen können zahlreiche Runden von partieller Entschützung mit Licht, vermischt mit der Kopplung von verschiedenen Typen von Schutzgruppen eingesetzt werden. Jede dieser Schutzgruppen muss unabhängig von der Oberfläche entfernt werden können. Nach der Entfernung von jedem Typ von Gruppe, werden DNA-Stränge an diesen Orten aufgebaut. Zum Beispiel kann nach der Entschützung von 33 % der Stellen mit Licht, eine DMT-Gruppe als Schutzgruppe verwendet werden. Nach der Entschützung von weiteren 33 % der Stellen mit Licht kann eine baselabile FMOC-Gruppe als zweite Schutzverbindung hinzugefügt werden. Die verbleibenden Gruppen können dann mit Licht entfernt werden und eine erste Gruppe von DNA-Strängen kann aufgebaut und gecappt werden. TCA kann dann verwendet werden um die DMT-Gruppe zu entfernen, um damit zu ermöglichen eine zweite Gruppe von DNA-Strängen aufzubauen und zu cappen. Schließlich kann FMOC mit Hilfe einer schwachen Base entfernt werden, um dadurch zu ermöglichen eine dritte Gruppe von DNA-Strängen aufzubauen und zu cappen.
  • Es ist vorgesehen, dass andere Typen von Schutzgruppen ebenfalls verwendet werden können, um damit die Anwendung verschiedener chemischer Behandlungen oder verschiedener Lichtwellenlängen zu ermöglichen. Die Richtung der synthetischen DNA kann auch kontrolliert werden, indem entweder 5'-Amidite oder 3'-Amidite für die Synthese eines gegebenen Stranges verwendet werden. Es ist auch möglich 5'- und 3'-Amidite innerhalb eines Stranges zu mischen. Es können Mikroarrays konstruiert werden bei denen alle Features mehr als eine Sonde in sich tragen oder das Mikroarray kann manche Features mit einer einzelnen Sonde und manche Features mit mehreren Sonden in sich tragen. Diese Technik ermöglicht es dass Mikroarray hochgradig auf bestimmte, einzigartige Applikationen anzupassen.
  • Das Vermögen Mikroarrays mit mehr als einem Oligonukleotid in einer Feature herzustellen erweitert den Umfang von Analysen die mit Mikroarrays durchgeführt werden können. Zum Beispiel ist eine interessante Applikation die durch diesen Ansatz ermöglicht wird das Design von Mikroarrays, die dazu gedacht sind Studien von Transkript-Spleißing bei der Expression eukaryotischer Gene zu ermöglichen. Es wird z.B. angenommen, dass die Anzahl der Gene im humanen Genom möglicherweise nicht ausreicht um alle Proteine im humanen Körper zu erklären, und dass intermediäres mRNA-Spleißing einen Teil der Proteinvielfalt erklären kann. Dieses Phänomen lässt sich mit konventionellen Mikroarrays nur schwierig untersuchen. In 5 ist ein Verfahren illustriert, wie Mikroarrays mit zwei Sonden in einer Feature verwendet werden können um mRNA-Spleißing zu untersuchen. Die beiden Sonden die in diesem illustrativen Feature konstruiert wurden sind dazu designed, zu detektieren ob eine kovalente Verbindung zwischen zwei Exons eines Gens in einer gegebenen Messenger-RNA-Probe besteht, d.h. zu sehen ob eine mRNA in einer Zelle oder einem Gewebe existiert, die beide Exons enthält. Eine der Gruppe von Sonden in der Feature ist designed komplementär zu der mRNA eines bestimmten ersten Ziel-Exons des untersuchten Gens zu sein. Die mRNA wird an das Mikroarray hybridisiert und die mRNA-Spezies hybridisiert nur dann an die erste Gruppe von Sonden wenn das Ziel-Exon in der mRNA-Spezies enthalten ist. Dieses ist bei Schritt 20 in 5 illustriert. Die mRNA bindet nur an die Sonde des ersten Exons da die Sonden für das zweite Exon in umgekehrtem Sinn wie die Sonden des ersten Exons vorliegen. Dann wird reverse Transkriptase verwendet um das Sondenoligonukleotid zu verlängern, wobei die gebundene mRNA als Templat verwendet wird, wie bei 22 in 5 illustriert. Das erste Exon wird kovalent verlängert so dass es ein längeres Stück von DNA mit komplementärer Sequenz zur mRNA, wie eine cDNA, ist. Die mRNA wird dann vom Mikroarray entfernt, z.B. unter Verwendung von RNase H um die mRNA zu verdauen, so dass nur die verlängerte Sonde übrig bleibt. Dann wird ein weiterer Hybridisierungsschritt durchgeführt, und, wie bei 24 in 5 gezeigt, das entfernte Ende der verlängerten ersten Sonde wird an die zweite Sonde nur dann hybridisieren wenn die zweite Sondengruppe komplementär zum entfernten Ende der verlängerten ersten Sonde ist. Die zweite Sondengruppe ist demnach designed komplementär zu der DNA (nicht der mRNA) eines anderen Ziel-Exons des untersuchten Gens zu sein. Dann wird eine DNA Verlängerungsreaktio durchgeführt, mit einer DNA-Polymerase, wie z.B. DNA-Polymerase I, um Nukleotide an den einzelsträngigen Teil des Komplexes zu addieren wobei am Terminus der zweiten Sonde begonnen wird. Die DNA-Verlängerungsreaktion wird nur dann stattfinden wenn die Hybridisierung an die zweite Gruppe von Sonden stattgefunden hat. Durch Inkorporation von fluoreszenzmarkierten Nukleotiden während des DNA-Verlängerungsschrittes, bei 26 in 5 gezeigt, kann der vollendete DNA-Doppelstrang fluoreszent oder durch jede andere bequeme Maßnahme detektierbar gemacht werden. Wenn das Mikroarray ausgelesen wird werden nur Features, die mRNA gebunden haben die Sequenzen enthielten die komplementär zu beiden DNA-Proben in dieser Feature waren fluoreszieren. Mit einem Satz von verschiedenen Features, die dazu designed sind die zahlreichen Exons eines Gens zu testen kann das gesamte Gen-Spleißmuster in einer Zelle oder einem Gewebe ermittelt werden. Auf diese Weise kann ermittelt werden welche Exons durch gemeinsame Transkripte in gegebenen Zellen verknüpft sind, und Informationen über Gen-Spleißing kann unter Verwendung von Mikroarrays aufgedeckt werden.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1
  • Unter Verwendung der Verfahren die oben beschrieben wurden und einem maskenfreien Array-Synthesizer-Instrument wurden zwei Oligonukleotide in demselben Featurebereich synthetisiert, wobei das Verfahren der vorliegenden Erfindung eingesetzt wurde, und das Verhältnis von einem Oligonukleotid zum anderen horizontal über das Array variiert wurde. Das Array wurde dann mit zwei Oligonukleotiden hybridisiert, die komplementär zu den Array-Oligonukleotiden waren. Eins dieser Oligonukleotide war mit Cy3 markiert, das andere mit Cy5. Der resultierende Scan des an die Testproben hybridisierten Mikroarrays ergab, dass das Cy3 Oligo eine zunehmende Oberflächendichte von links nach rechts besitzt, während das Cy5 Oligo in Bezug auf Dichte von rechts nach links zunimmt. Das Ergebnis war in der Fluoreszenzaufnahme leicht zu erkennen.
  • Beispiel 2
  • Es wurde ein Array designed das sechs 10 × 10 Feature-Sektionen besitzt, mit verschiedenen Oligonukleotiden die an gemeinsamen Features des Arrays synthetisiert wurden. Es wurden drei verschiedene Oligonukleotide in allen möglichen Permutationen mit jedem der anderen Oligonukleotide auf dem Array kombiniert. Testproben bekannter Sequenz wurden dann an das derart hergestellte Mikroarray hybridisiert. Jede Probe hybridisierte nur an den spezifischen Bereich an dem Sonden die komplementär zu dieser Probe sind synthetisiert worden waren.
  • Zusammenfassung
  • Die vorliegende Erfindung ist ein Verfahren zur Synthese von Mikroarrays, bei denen verschiedene Oligonucleotide innerhalb eines Featurebereichs des Arrays vorliegen. Das Verfahren verwendet die bei Mikroarray-Synthesen gebräuchlichen Techniken, aber schränkt die Dauer, in der die ausgewählten Featurebereiche auf dem Array initial belichtet werden, so dass nur ein berechneter Anteil der Verbindungen, die die bindende Schicht des Arrays darstellen entschützt werden. Die Verbindungen, die initial entschützt wurden werden mit einer nicht-photosensitiven Schutzgruppe, wie z.B. Di-methoxy-trityl, gecappt, um ihre Mitwirkung bei der Synthese der ersten Gruppe von DNA-Strängen, die auf dem Array aufgebaut werden, zu verhindern. Sobald die erste Gruppe von DNA-Strängen synthetisiert worden ist, kann die ursprünglich entschützte Gruppe weiter bearbeitet werden um eine zweite Gruppe von DNA-Strängen in demselben Featurebereich aufzubauen wie der ersten Gruppe von DNA-Strängen. Die vorliegende Erfindung schließt auch Mikroarrays ein, die unter Verwendung der Methode hergestellt sind.

Claims (12)

  1. Mikroarray, umfassend eine Vielzahl von Features, jede der Features einzelsträngige Oligonukleotide umfassend, wenigstens einige der Features Oligonukleotide von mehr als einer Sequenz innerhalb derselben Feature umfassend.
  2. Mikroarray nach Anspruch 1, wobei jede Feature Oligonukleotide von zwei verschiedenen Sequenzen umfasst.
  3. Mikroarray nach Anspruch 1, wobei sowohl wenigstens einige der Oligonukleotide im Mikroarray 3' nach 5' orientiert sind als auch wenigstens einige andere Oligonukleotide 5' nach 3' orientiert sind.
  4. Mikroarray nach Anspruch 1, wobei die beiden Oligonukleotide in einer einzelnen Feature jeweils designed sind an verschiedene Exons desselben eukaryotischen Gens zu hybridisieren.
  5. Mikroarray nach Anspruch 1, wobei die beiden Sonden jeweils etwa 50% der Sonden in der Feature ausmachen.
  6. Verfahren zur Synthese verschiedener Oligonukleotide in demselben Featurebereich, umfassend die Schritte: Bereitstellen eines Substrats zur Herstellung eines Mikroarrays, das Substrat mit photolabilen Schutzgruppen auf seiner Oberfläche ausgestattet, das Mikroarray mit wenigstens einem Featurebereich ausgestattet; Belichten des Featurebereichs mit einer Lichtquelle für ein Zeitintervall das geeignet ist um die photolabile Schutzgruppe nur von einem Teil des Featurebereichs abzuspalten; Kopplung einer zweiten Schutzgruppe an den ungeschützten Bereich der Feature, wobei die zweite Schutzgruppe nicht photolabil ist; Belichten des Featurebereichs mit einer Lichtquelle für eine Zeitdauer um die verbliebenen photolabilen Schutzgruppen von dem Featurebereich zu entfernen und einen ungeschützten Bereich auf der Feature übrig zu lassen; Aufbau einer ersten Gruppe von Oligonukleotiden im ungeschützten Bereich der Feature; Capping der ersten Gruppe von Oligonukleotiden mit einer Capping-Verbindung die nicht photolabil ist; Entfernung der zweiten Schutzgruppe vom Featurebereich so dass ein ungeschützter Bereich der Feature übrig bleibt; Aufbau einer zweiten Gruppe von Oligonukleotiden im ungeschützten Bereich der Feature.
  7. Das Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Anteil des Featurebereichs in dem der erste Belichtungsschritt durchgeführt wird ungefähr 50% des Featurebereichs beträgt, so dass jedes der Oligonukleotide etwa 50% der Oligonukleotide in der Feature darstellt.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Anteil des Featurebereichs in dem der erste Belichtungsschritt durchgeführt wird ungefähr 33% des Featurebereichs ausmacht, so dass eins der Oligonukleotide ungefähr 33% der Oligonukleotide in der Feature ausmacht.
  9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die zweite Schutzgruppe säurelabil ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zweite Schutzgruppe Di-methoxy-trityl ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Capping-Mischung Acetanhydrid und Tetrahydrofuran ist.
  12. Verfahren zur Verwendung eines Mikroarrays zur Analyse des Spleißings eines mRNA-Transkripts eines Gens das mehr als ein Exon besitzt, umfassend die folgenden Schritte: Bereitstellen eines Mikroarrays mit wenigstens einer Feature mit zwei Oligonukleotiden in der Feature, einem ersten Oligonukleotid das komplementär zu der mRNA ist in einem Abschnitt der mRNA die einem Exon entspricht und einem zweiten Oligonukleotid dessen Sequenz der mRNA in einem Abschnitt entspricht der einem anderen Exon entspricht; Hybridisieren des Mikroarrays an die mRNA, so dass mRNA, wenn vorhanden, an das Nukleotid, das komplementär zur mRNA ist binden wird; Verlängerung des ersten Oligonukleotids unter Verwendung der gebundenen mRNA als Templat; Entfernung der gebundenen mRNA; Hybridisierung des verlängerten ersten Oligonukleotids an das zweite Oligonukleotid; und Verlängern des zweiten Oligonukleotids gegen das erste Oligonukleotid unter Verwendung von markierten Nukleotiden so dass die Feature detektiert werden kann wenn Hybridisierung stattfindet.
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