PL180521B1 - Sposoby i zestawy do identyfikacji sekwencji nukleotydowychw docelowym kwasie nukleinowym PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym z wykorzystaniem procesu hybrydyzacji, znamienny tym, ze obejmuje etapy: (a) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych w warunkach umozliwiajacych skuteczna hybrydyzacje miedzy: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i son- dami immobilizowanymi oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i sonda- mi znakowanymi: (b) wiazanie kowalencyjne sond immobilizowanych i sond znakowanych, które zhybrydyzowaly stycznie z ta sama czasteczka docelowego kwasu nukleinowego; (c) wykrywanie znacznika znakowanych sond oligonukleotydowych, które zwiazaly sie z immobilizowa- nymi sondami, bez odzyskiwania tych znaczników oraz (d) identyfikowanie sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez polaczenie sek- wencji nukleotydowych wykrytych, znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukleotydowymi odpowiednich zwiazanych immobilizowanych sond oligonukleotydowych. 72. Zestaw do identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym, znamienny tym, ze obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej dwie znakowane sondy oligonukleotydowe maja ten sam znacznik i (c) srodek ligujacy. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są sposoby i zestawy do identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym.

Niniejszy wynalazek ogólnie dotyczy dziedziny biologii molekularnej. Konkretnie, wynalazek dostarcza nowych sposobów i zestawów umożliwiających bardzo wydajne sekwencjonowanie cząsteczek kwasu nukleinowego. Sposoby według wynalazku nadają się do sekwencj onowania długich cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym chromosomów i RN A, z pominięciem etapów klonowania czy wklonowywania.

Sekwencjonowanie kwasu nukleinowego stanowi integralną część współczesnego postępu naukowego. Określanie sekwencji, tzn. struktury pierwszorzędowej cząsteczek i segmentów kwasu nukleinowego jest istotne w odniesieniu do poszczególnych projektów badających szeroką gamę poszczególnych obszarów docelowych. Informacja uzyskana z sekwencjonowania wpływa na naukę, medycynę, rolnictwo i wszystkie dziedziny biotechnologii. Oczywiście, sekwencjonowanie kwasu nukleinowego ma niezwykłe znaczenie dla projektu genomu ludzkiego i innych przedsięwzięć na wielką skalę, których celem jest pogłębienie naszej wiedzy o ewolucji i czynnościach organizmów oraz poznanie przyczyn różnych stanów chorobowych.

, Użyteczność sekwencjonowania kwasu nukleinowego jest oczywista, przykładowo w Projekcie Poznania Genomu Człowieka (Humań Genome Project - HGP), międzynarodowego przedsięwzięcia prowadzonego w wielu ośrodkach, poświęconego sekwencjonowaniu całego ludzkiego genomu. Jednakże, postęp w tej dziedzinie jest zarówno powolny jak i kosztowny. Sekwencjonowanie kwasu nukleinowego jest zwykle przeprowadzane na żelu poliakrylamidowym, rozdzielającym fragmenty DNA w zakresie od 1 do 500 bp, różniące się długością o jeden nukleotyd. Dokładne określenie sekwencji tzn. kolejność poszczególnych nukleotydów A, G, C i T, można osiągnąć dwoma sposobami, po pierwsze, metodą Maxama i Gilberta rozkładu chemicznego fragmentu DNA w określonych nukleotydach (Maxam i Gilbert, 1977) lub przy użyciu metody sekwencjonowania, polegającej na przerywaniu syntezy łańcucha didezoksynukleotydami, opisanej przez Sangera i wsp. ((Sanger i in., 1977). Obie metody sączaso- i pracochłonne.

Ostatnio, zaproponowano inne metody sekwencjonowania kwasu nukleinowego, bez etapu elektroforezy, które można objąć wspólną nazwą Sekwencjonowania Przez Hybrydyzaęję albo SBH (Drmanac i in., 1991; Cantor i in., 1992; Drmanac i Crkvenjakov, Patent USA nr 5,202,231). Opracowanie niektórych z tych metod spowodowało powstanie nowych narzędzi do sekwencjonowania na podłożu stałym, znanych jako sekwencjonujące „chipy” (układy scalone). Użyteczność SBH, ogólnie, potwierdza fakt udzielenia patentu USA na tę technologię. Jednakże, mimo iż SBH zawiera potencjał przyspieszenia sekwencjonowania kwasów nukleinowych, wszystkie metody SBH wciąż mają pewne wady.

180 521

SBH może być przeprowadzone dwoma podstawowymi sposobami, określanymi często jako Format 1 i Format 2 (Cantor i in., 1992). W Formacie 1 oligonukleotydy o nieznanej sekwencji, zwykle o długości rzędu 100-1000 nukleotydów, zgromadzone są na podłożu stałym lub filtrze w sposób umożliwiający immobilizację badanej próbki (Strezoska i in., 1991; Drmanac i Crkvenjakov, patent USA nr 5,202,231). Repliki podłoża badane są przez hybrydyzację zestawem znakowanych sond o długości około 6 do 8 reszt. W Formacie 2, sekwencjonujący chip utworzony jest z uporządkowanych oligonukleotydów o znanej sekwencji długości rzędu 6 do 8 reszt (Southern, WO 89/10977; Khrapko i in., 1991; Southern i in., 1992). Kwasy nukleinowe o nieznanej sekwencji są znakowane i hybrydyzowane z unieruchomionymi oligonukleotydami.

Niestety, oba formaty SBH mająpewne ograniczenia, w szczególności wymagają poprzedzających etapów klonowania DNA. W Formacie 1, inne znaczące problemy obejmują przyłączanie różnych fragmentów kwasu nukleinowego, który ma być sekwencjonowany, do powierzchni podłoża stałego lub przygotowanie wielkiego zestawu dłuższych sond. W Formacie 2, główne problemy obejmują znakowanie kwasów nukleinowych o nieznanej sekwencji, powstający wysoki stosunek tła do sygnału oraz fakt, że można określić wyłącznie krótkie sekwencje. Dalsze problemy w Formacie 2 obejmują tworzenie się struktur drugorzędowych, które uniemożliwiają dostęp do pewnych miejsc docelowych oraz różne warunki niezbędne dla sond o różnej zawartości GC. Zatem niewątpliwa byłaby korzyść z nowej procedury sekwencjonowania kwasu nukleinowego, w szczególności procedury pozwalającej uniknąć żmudnego procesu klonowania i/lub wklonowywania.

Niniejszy wynalazek poszukuje możliwości przezwyciężenia tych i innych wad obciążających dotychczasowy stan wiedzy przez dostarczenie nowych metod i zestawów do sekwencjonowania kwasów nukleinowych. Opisane tu nowe techniki określone zostały ogólnie jako Format 3 i przedstawiają znaczący postęp w porównaniu z istniejącymi metodami SBH Formatu 1 i 2. Podczas sekwencjonowania Formatem 3, według wynalazku, sekwencje kwasu neukleinowego określane są przez hybrydyzację z dwoma zestawami krótkich sond oligonukleotydowych o znanych sekwencjach. Sposoby, według wynalazku, umożliwiają sekwencjonowanie o wysokiej rozdzielczości niezwykle dużych cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym materiału chromosomalnego i RNA, bez uprzedniego klonowania, wklonowywania czy amplifikacji. Ponadto, niniejszy wynalazek nie wymaga znacznej liczby sond, kompleksowej syntezy dłuższych sond czy znakowania kompleksowej mieszaniny segmentów kwasu nukleinowego.

W celu określenia sekwencji kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, ogólnie, identyfikuje się sekwencje kwasu nukleinowego przez hybrydyzację z sekwencjami komplementarnymi z dwóch zestawów krótkich sond oligonukleotydowych (oligo) o określonej długości i znanej sekwencji, pokrywających większość kombinacji sekwencji dla sond o tej długości. Następnie analizuje się zidentyfikowane sekwencje w celu określenia nakładających się ciągów w identyfikowanych sekwencjach i odtwarza lub kojarzy kompletną sekwencję kwasu nukleinowego z tych nakładających się sekwencji.

Sposoby sekwencjonowania mogą być przeprowadzone przy użyciu kolejnego hybrydyzowania z sekwencjami komplementarnymi z dwóch zestawów krótkich oligonukleotydów. Alternatywnie, zastosować można tryb określany jako „cykliczny”, w którym dwa zestawy krótkich oligonukleotydów hybrydyzuje się równocześnie z nieznanymi sekwencjami. Określenie „cykliczny” dotyczy rozdzielczej części techniki i pochodzi od zwiększania temperatury w celu „roztopienia” tych hybryd, które nie są komplementarne. Podobne cykliczne techniki stosuje się powszechnie w innych dziedzinach biologii molekularnej, jak PCR, i będą one zrozumiałe dla specjalistów po zapoznaniu się z niniejszym ujawnieniem.

Sposób według wynalazku obejmuje etapy:

(a) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i sondami immobilizowanymi oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i sondami znakowanymi:

180 521 (b) wiązanie kowalencyjne sond immobilizowanych i sond znakowanych, które zhybrydyzowały stycznie z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

(c) wykrywanie znacznika znakowanych sond oligonukleotydowych, które związały się z immobilizowanymi sondami, bez odzyskiwania tych znaczników oraz (d) identyfikowanie sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych, znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukłeotydowymi odpowiednich związanych immobilizowanych sond oligonukleotydowych.

W zakres wynalazku wchodzi również sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w badanym kwasie nukleinowym, który stanowi modyfikację powyższej metody i obejmuje następujące etapy:

(a) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z pierwszym zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i z pierwszą znakowaną sondą oligonukleotydową w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami z pierwszego zestawu oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i pierwszą znakowaną sondą oligonukleotydową;

(b) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z drugim zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i drugą znakowaną sondą oligonukleotydową w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami z drugiego zestawu oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i drugą znakowaną sondą oligonukleotydową, przy czym pierwsze i drugie znakowane sondy oligonukleotydowe obejmują różne sekwencje nukleotydowe, natomiast znaczniki pierwszej i drugiej znakowanej sondy oligonukleotydowej są takie same;

(c) wykrywanie immobilizowanych sond z pierwszego zestawu, które zhybrydyzowały z docelowym kwasem nukleinowym bezpośrednio stycznie z pierwszą znakowaną sondą i wykrywanie immobilizowanych sond z drugiego zestawu, które zhybrydyzowały z docelowym kwasem nukleinowym bezpośrednio stycznie z drugą znakowaną sondą przez poddanie tych sond warunkom, w których zachodzi kowalencyjne wiązanie bezpośrednio stycznych ze sobą immobilizowanych i znakowanych sond, a następnie przez wykrywanie znaczników znakowanych sond, które związały się kowalencyjnie i (d) identyfikowanie sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukłeotydowymi związanych z nimi odpowiednich immobilizowanych sond oligonukleotydowych.

Jeszce inne modyfikacje według wynalazku obejmują sposoby z następującymi etapami:

A) (a) kontaktowania docelowego kwasu nukleinowego z jedną lub więcej immobilizowanąsondąoligonukleotydowąi zjednąlub więcej znakowaną sondą oligonukleotydową, w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i znakowanymi sondami oligonukleotydowymi:

(b) kowalencyjnego wiązania immobilizowanych sond i znakowanych sond, które są stycznie zhybrydyzowane z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

(c) wykrywania znaczników znakowanych sond oligonukleotydowych, które są związane z immobilizowanymi sondami, bez odzyskiwania tych znaczników i (d) identyfikowania sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych, znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukłeotydowymi odpowiednich związanych z nimi immobilizowanych sond oligonukleotydowych; i

B) (a) kontaktowania docelowego kwasu nukleinowego z zestawem pierwszej sondy (pierwszych sond) chemicznie modyfikowanej (ych) w celu umożliwienia jej immobilizacji na nośni

180 521 ku i z co najmniej jedną znakowaną drugą sondą nukleotydową, w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i pierwszymi sondami oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i znakowaną(ymi) drugą(imi) sondą(ami);

(b) kowalencyjnego wiązania pierwszej sondy (pierwszych sond) i znakowanej drugiej sondy (drugich sond), które są stycznie zhybrydyzowane z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

(c) wykrywania znaczników znakowanej drugiej(ich) sondy (sond) oligonukleotydowej(ych), które są związane kowalencyjnie z pierwszą sondą (sondami) bez odzyskiwania tych znaczników i (d) identyfikowania co najmniej jednej sekwencji nukleotydowej w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytej(ych), znakowanej(ych) sondzie (sondach) oligonukleotydowej(ych) z sekwencjami nukleotydowymi odpowiedniej(nich) związanej(ych) z nimi immobilizowanej(ych) sondy (sond) oligonukleotydowej(ych).

Wynalazek można zastosować do sekwencjonowania cząsteczek kwasu nukleinowego o znacznej długości. Z praktycznego punktu widzenia, cząsteczka kwasu nukleinowego, która ma być sekwencjonowana, powinna być podzielona na krótkie lub średnie fragmenty kwasu nukleinowego, którymi łatwo się manipuluje. Określenie „fragment kwasu nukleinowego” w znaczeniu tu użytym najogólniej oznacza cząsteczkę kwasu nukleinowego o długości od około 10 par zasad (bp) do około 100 bp. Za najkorzystniejsze sposoby, według wynalazku, uważa się takie, w których cząsteczka kwasu nukleinowego, która ma być sekwencjonowana, poddawana jest działaniu powodującemu powstanie fragmentów kwasu nukleinowego o długości pośredniej, tzn. od około 10 bp do około 40 bp. Jednakże, należy podkreślić, że niniejszy wynalazek nie jest sposobem kompletnego sekwencjonowania krótkich fragmentów kwasu nukleinowego, a przeciwnie, jest sposobem sekwencjonowania cząsteczek kwasu nukleinowegoperse, co obejmuje określenie części sekwencji w cząsteczce - niezależnie czy wykonuje się to przy użyciu kompletnej cząsteczki czy, dla ułatwienia, przy użyciu cząsteczki uprzednio pociętej na krótsze fragmenty o długości od około 4 do około 1000 zasad.

Sekwencje cząsteczek kwasu nukleinowego określane są przez hybrydyzację krótkich sond oligonukleotydowych o znanej sekwencji. W odniesieniu do określenia „krótkie sondy oligonukleotydowe” określenie „krótkie” oznacza sondy o długości mniejszej niż 10 bp, zaś najkorzystniej sondy o długości od około 4 bp do około 9 bp. W jednym z przykładowych wykonań sondy o długości około 6 bp rozważane sąjako szczególnie użyteczne. Dla zestawów oligonukleotydów pokrywających wszystkie kombinacje sekwencji dla danej długości sondy, ich liczba wyraża się przez 4^F, gdzie F oznacza długość sondy. Przykładowo, dla 4-meru zestaw zawiera 256 sond; dla 5-meru zestaw zawiera 1024 sondy; dla 6-meru 4096 sond; 7-meru 16384 sond itd. Synteza oligonukleotydów o tej długości jest rutynowa w tej dziedzinie wiedzy i może być przeprowadzona w sposób zautomatyzowany.

W sposobach, według wynalazku, jeden zestaw krótkich sond oligonukleotydowych o znanej sekwencji, który może być określony jako zestaw pierwszy, powinien być umocowany na podłożu stałym, tzn. immobilizowany na podłożu w sposób umożliwiający im wejście w reakcję hybrydyzacji. Inny zestaw krótkich sond oligonukleotydowych o znanej sekwencji, który może być określony jako zestaw drugi, stanowi sondy znajdujące się w roztworze i wyznakowane możliwym do wykrycia znacznikiem. Zestaw oligonukleotydów może obejmować sondy o tej samej lub różnej długości.

Proces kolejnej hybrydyzacji oznacza, że cząsteczki kwasu nukleinowego, lub fragmenty, o nieznanej sekwencji mogą być hybrydyzowane z oddzielnymi zestawami sond oligonukleotydowych o znanych sekwencj ach w różnych momentach (fig. 1). Cząsteczki kwasu nukleinowego albo ich fragmenty powinny być zdenaturowane, umożliwiając hybrydyzację, i dodane do pierwszego, immobilizowanego, zestawu sond w warunkach hybrydyzacji umożliwiających rozróżnienie, tak by hybrydyzowały tylko fragmenty o sekwencjach komplementarnych. Fragmenty o sekwencjach niekomplementamych są usuwane, zaś kolejna runda hybrydyzacji rozdzielczej

180 521 jest przeprowadzana przez dodanie drugiego, znakowanego zestawu sond, w roztworze, do już utworzonej kombinacji fragmentów i sond. Znakowane sondy, które hybrydyzują stycznie do unieruchomionej sondy pozostająprzyłączone do podłoża i mogąbyć wykryte, co nie ma miejsca, gdy istnieje przestrzeń pomiędzy sondą umocowaną i znakowaną (fig. 1).

Proces hybrydyzacji równoczesnej oznacza, że cząsteczki kwasu nukleinowego o nieznanej sekwencji mogą być skontaktowane z osobnymi zestawami sond oligonukleotydowych o znanych sekwencjach w tym samym czasie. Hybrydyzacja zachodzi w warunkach hybrydyzacji umożliwiających rozróżnienie. Fragmenty o sekwencjach niekomplementamych są następnie „roztapiane” tzn. usuwane przez zwiększanie temperatury, po czym przeprowadzana jest kolejna runda hybrydyzacji rozdzielczej umożliwiając hybrydyzację każdej z sond komplementarnych. Znakowane sondy hybrydyzujące stycznie do sondy umocowanej mogąbyć wykryte w podobny sposób.

Sekwencje kwasu nukleinowego, które są „komplementarne”, są to te, które są zdolne do parowania zasad zgodnie ze standardowymi regułami komplementamości Watsona-Cricka oraz odmianami tych reguł, dotyczącymi zmodyfikowanych zasad. Oznacza to, że większe puryny lub zmodyfikowane puryny zawsze tworzą pary z mniejszymi pirymidynami tworząc wyłącznie znane kombinacje. Obejmuje to standardowe pary guaniny sparowanej z cytozyną(G:C) i adeniny sparowanej z tyminą(A:T) w przypadku DNA i adeniny sparowanej zuracylem (A:U) wprzypadku RNA. Rozważane jest również zastosowanie zasad zmodyfikowanych czy też zastosowanie tzw. Zasady Uniwersalnej (M, Nichols i in., 1994).

W znaczeniu tu użytym określenie „sekwencje komplementarne” oznaczają sekwencje kwasu nukleinowego o zasadniczej komplementamości na całej długości, które mająbardzo niewiele błędnych zasad. Przykładowo, sekwencje kwasu nukleinowego o długości sześciu zasad mogąbyć określone jako komplementarne, gdy hybrydyzują w pięciu spośród sześciu pozycji z tylko jedną błędną zasadą. Naturalnie, sekwencje kwasu nukleinowego, które są „całkowicie komplementarne” oznaczają sekwencje kwasu nukleinowego, które są całkowicie komplementarne na całej długości i nie posiadają błędnych zasad.

Po identyfikacji, przez hybrydyzację z oligonukleotydami o znanej sekwencji, różne pojedyncze sekwencje, stanowiące część fragmentów kwasu nukleinowego są analizowane w celu identyfikacji ciągów nakładających się sekwencji. Przykładowo, identyfikowane są części sekwencji, w których koniec 5'jest identyczny z końcem 3' innej sekwencji albo vice versa. Określona może być kompletna sekwencja cząsteczki kwasu nukleinowego albo fragmentu, tzn. być zrekonstruowana z określonych w ten sposób nakładających się sekwencji.

Proces identyfikowania nakładających się sekwencji i rekonstrukcję kompletnej sekwencji można zwykle przeprowadzić przez analizę komputerową. Przykładowo, jeżeli znakowana sonda 5'-TTTTTT-3' hybrydyzuje z pólkiem zawierającym przytwierdzoną sondę 5'-AAAAAA-3', określona zostaje sekwencja 12-meru, konkretnie, 5'- AAAAAATTTTTT-3' (Identyfikator Sekw. Nr 1), tzn. sekwencja dwóch zhybrydyzowanych sond jest łączona ujawniając uprzednio nieznaną sekwencję. Następnym pytanie, na które należy odpowiedzieć jest: jaki nukleotyd następuje po nowo określonej sekwencji 5'-ΑΑΑΑΑΑΊΤΓΤΤΤ-3' (Identyfikator Sekw. Nr 1). Istnieją cztery możliwości reprezentowane przez przytwierdzoną sondę 5-AAAAAT-3' i znakowane sondy 5'-TTTTTA-3' dla A; 5'-TTTTTT-3' dla T; 5'-TTTTTC-3' dla C i 5'-TTTTTG-3' dla G. Jeżeli, przykładowo, sonda 5-TTTTTC-3' jest pozytywna, zaś pozostałe trzy negatywne, wtedy połączona sekwencja jest rozszerzana do 5'-AAAAAATTTTTTC-3' (Identyfikat Sekw. Nr 2). W następnym etapie algorytm określa, która ze znakowanych sond TTTTCA, TTTTCT, TTTTCC czy TTTTCG jest pozytywna dla pólka zawierającego przytwierdzoną sondę AAAATT. Proces jest powtarzany, dopóki wszystkie pozytywne (F + P) sekwencje oligonukleotydowe nie zostaną zastosowane lub określone jako negatywne.

Niniejszy wynalazek dostarcza więc bardzo wydajnej drogi sekwencjonowania fragmentów kwasu nukleinowego i cząsteczek o znaczej długości. Wielkie cząsteczki kwasu nukleinowego, jak tu zdefiniowano, są to cząsteczki, które wymagają podzielenia przed sekwencjonowaniem. Są one na ogół o długości około 45 do 50 par zasad (bp), zaś zwykle dłuższe. W rzeczywistości, sposób według

180 521 wynalazku może być zastosowany do sekwencjonowania cząsteczek kwasu nukleinowego bez ograniczenia długości, tak że mogą być sekwencjonowane sekwencje o długości 100 bp, 1000 bp (Ikb), 100 kb, 1000 kb (1 Mb) i 50 Mb lub więcej, włącznie z całymi chromosomami, takimi jak chromosomy ludzkie, które są wielkości rzędu 100 Mb. Tak wielka liczba znajduje się w zakresie niniejszego wynalazku, zaś sekwencjonowanie takiej liczby zasad wymaga dwóch zestawów 8-merów lub 9-merów (tak, że F+P ~16-18). Kwasy nukleinowe, które mogą być sekwencjonowane, obejmują DNA, jak cDNA, DNA genomowy, wycięte mikrotechnikami prążki chromosomalne, DNA kosmidowy czy wstawki YAC albo RNA, w tym mRNA, rRNA, tRNA czy snRNA.

Proces określania sekwencji długich cząsteczek kwasu nukleinowego obejmuje proste identyfikowanie sekwencji o długości F+P z cząsteczki i łączenie sekwencji przy użyciu odpowiedniego algorytmu. Z praktycznego punktu widzenia, należałoby uprzednio podzielić cząsteczkę kwasu nukleinowego, która ma być sekwencjonowana, na mniejsze fragmenty, takie jak fragmenty kwasu nukleinowego o długości pośredniej. Należy następnie identyfikować przez hybrydyzację, np. kolejną hybrydyzację, sekwencje o długości F+P, fragmenty z dwóch zestawów krótkich sond oligonukleotydowych o znanej sekwencji, stanowiące sekwencję komplementarną, jak to opisano powyżej. W ten sposób, może być odtworzona z nakładających się sekwencji F+P kompletna sekwencja kwasu nukleinowego niezwykle wielkich cząsteczek.

Niezależnie, czy kwas nukleinowy, który ma być sekwencjonowany, jest cząsteczką o pośredniej długości czy jest przednio poddany działaniu powodującemu wytworzenie fragmentów o takiej długości, proces identyfikacji sekwencji tych fragmentów kwasów nukleinowych przez hybrydyzację z dwoma zestawami krótkich sond oligonukleotydowych o znanej sekwencji jest kluczowy dla ujawnionych tu sposobów sekwencjonowania. Proces ten, ogólnie, obejmuje następujące etapy:

(a) doprowadzenie do kontaktu fragmentów kwasu nukleinowego z zestawem lub uporządkowanym szykiem przytwierdzonych lub immobilizowanych sond oligonukleotydowych w warunkach hybrydyzacji umożliwiających fragmentom o sekwencjach komplementarnych wydajną hybrydyzację z sondą, tworząc w ten sposób kompleksy pierwotne, w których fragment posiada zarówno sekwencje zhybrydyzowane jak i niezhybrydyzowane albo „wolne”;

(b) doprowadzenie do kontaktu kompleksów pierwotnych z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych w roztworze, w warunkach umożliwiających hybrydyzację, umożliwiających sondom o sekwencjach komplementarnych hybrydyzację z niezhybrydyzowanym albo wolnym fragmentem sekwencji, tworząc w ten sposób kompleksy wtórne, w których fragment hybrydyzuje zarówno z sondąprzytwierdzoną(immobilizowaną), jak i z sondąznakowaną;

(c) usuwanie z kompleksów wtórnych wszelkich znakowanych sond, które nie zhybrydyzowały-stycznie do sondy przytwierdzonej (immobilizowanej), pozostawiając w ten sposób wyłącznie styczne wtórne kompleksy;

(d) wykrywanie stycznych kompleksów wtórnych przez wykrywanie obecności znacznika w znakowanej sondzie; oraz (e) identyfikowanie sekwencji oligonukleotydowej we fragmencie kwasu nukleinowego w stycznych kompleksach wtórnych przez łączenie znanych sekwencji zhybrydyzowanej przytwierdzonej i znakowanej sondy.

„Warunki płukania’ albo hybrydyzacji wybrane do przeprowadzenia jednego lub obu etapów hybrydyzacji mogą być modyfikowane w zależności od konkretnego wykonania sekwencjonowania. Przykładowo, warunki obu hybrydyzacji można zaprojektować tak, by umożliwić sondom oligonukleotydowym hybrydyzację z danym fragmentem kwasu nukleinowego, jeżeli zawiera on sekwencje komplementarne tzn. sekwencje zasadniczo zgodne, czyli sekwencje hybrydyzujące w pięciu spośród sześciu pozycji. Etapy hybrydyzacji, korzystnie, powinny być przeprowadzone przy użyciu prostych urządzeń automatycznych jakie sąrutynowo stosowane w obecnych procedurach sekwencjonowania.

Alternatywnie, warunki hybrydyzacji można zaprojektować tak by umożliwić hybrydyzację sond oligonukleotydowych z fragmentami, które mająsekwencję całkowicie komplementarną. Takie bardziej rozróżniające czy „surowe” warunki można zastosować do obydwu osobnych etapów

180 521 procesu hybrydyzacji kolejnej albo do pojedynczego etapu. W takich przypadkach, sondom oligonukleotydowym, immobilizowanym bądź znakowanym, umożliwia się hybrydyzację z danym fragmentem kwasu nukleinowego, gdy posiadają całkowicie komplementarne sekwencje z tym fragmentem.

Wybrane warunki hybrydyzacji będą, ogólnie, określały stopień złożoności wymaganej do analizy uzyskanych danych. Podobnie, dostępne programy komputerowe do analizy jakichkolwiek uzyskanych danych mogą określać warunki hybrydyzacji, które muszą być zastosowane w danym laboratorium. Przykładowo, w najbardziej rozdzielającym procesie oba etapy hybrydyzacji powinny być przeprowadzone w warunkach umożliwiających hybrydyzację wyłącznie oligonukleotydów i fragmentów o całkowicie komplementarnych sekwencjach. Ponieważ, nie powinno być błędnych zasad, sposób ten angażuje najmniej złożoną analizę komputerową i, z tego powodu, jest obecnie najkorzystniejszym sposobem wykonania wynalazku. Jednakże, zastosowanie mniej rozdzielających warunków dla jednego lub obu etapów hybrydyzacji również mieści się w zakresie niniejszego wynalazku.

Odpowiednie warunki hybrydyzacji do zastosowania w jednym bądź obu etapach mogą być rutynowo określone w procesie optymalizacji albo „badaniach pilotowych”. Różne rodzaje badań pilotowych są rutynowo przeprowadzane przez specjalistów w dziedzinie sekwencjonowania w celu określenia procedur roboczych oraz adaptacji procedur do zastosowania w danym laboratorium. Przykładowo, warunki takie jak temperatura, stężenie każdego ze składników, długość trwania etapów, zastosowane bufory i ich pH i siła jonowa mogą się zmieniać i w ten sposób mogą być optymalizowane.

W korzystnym wykonaniu, sposób sekwencjonowania kwasu nukleinowego obejmuje etap rozdzielczy, mający na celu wybranie wtórnych kompleksów hybrydyzacyjnych, zawierających sondy, unieruchomioną i znakowaną, przylegające stycznie zaś nie takich, które nie są styczne i są rozdzielone jedną, dwiema lub większą ilością zasad. Dostępnych jest wiele procesów służących usuwaniu znakowanych sond, które nie zhybrydyzowały w bezpośredniej styczności z sondą przytwierdzoną, tzn. nie zhybrydyzowały koniec do końca, z których każdy pozostawia wtórne kompleksy styczne bezpośrednio.

Takie procesy rozdzielcze mogą polegać wyłącznie na etapach płukania o kontrolowanej surowości, gdzie użyte warunki hybrydyzacji zaprojektowano tak, by sondy przylegające stycznie pozostały zhybrydyzowane na skutek zwiększonej stabilności uzyskanej przez oddziaływanie pomiędzy stykającymi się nukleotydami. Ponownie, warunki płukania jak temperatura, stężenie, czas, bufory, pH, siła jonowa i podobne mogą być zmieniane w celu optymalizacji usuwania znakowanych sond, które nie są bezpośrednio styczne. W korzystnym wykonaniu, bezpośrednio styczne sondy, immobilizowana i znakowana, mogą być ligowane, tzn. łączone kowalencyjne, przed wykonaniem etapu płukania w celu usunięcia sond nie ligowanych. Ligację można uzyskać przez działanie roztworem, zawierającym czynnik ligujący chemicznie, jak np. rozpuszczalny w wodzie karbodiimid czy bromek cyjanu. Korzystniej, może być zastosowany enzym - ligaza, jak np. ligaza DNA T₄ z bakteriofagą T₄, dostępna w handlu z wielu źródeł (np. Biolabs). W każdym przypadku, należy usunąć sondę, nie przylegające stycznie przez bardziej surowe warunki płukania, które nie wpłyną na połączone kowalencyjnie znakowane i umocowane sondy.

Pozostające styczne kompleksy wtórne mogą być wykryte przez obserwowanie położenia znacznika sond znakowanych obecnych w kompleksach. Sondy oligonukleotydowe mogą być znakowane znacznikiem wykrywalnym chemicznie, jak barwniki fluorescencyjne, albo znacznikiem odpowiednio zmodyfikowanym, aby można było go wykryć w procesie wywoływania chemiluminescencyjnego albo znacznikiem radioaktywnym jak ³⁵S, ³H, ³²P albo ³³P, korzystnie ³³P. Sondy mogą być również znakowane izotopem niepromieniotwórczym i wykrywane techniką spektrometrii mas.

Obecnie, najkorzystniejsza rozważana metoda do zastosowania w praktyce niniejszego wynalazku obejmuje przeprowadzenie etapów hybrydyzacji w warunkach umożliwiających hybrydyzację wyłącznie sondom oligonukleotydowym i fragmentom, posiadającym całkowicie

180 521 komplementarne sekwencje i umożliwiających pozostawienie w stanie zhybrydyzowanym wyłącznie tym sondom, które przylegają stycznie. Ten sposób wymaga następnie najmniej skomplikowanej analizy komputerowej.

Gdy cząsteczka kwasu nukleinowego o nieznanej sekwencji jest dłuższa niż około 45 czy 50 bp, efektywny sposób określenia jej sekwencji, ogólnie, obejmuje obróbkę tej cząsteczki w celu wytworzenia fragmentów kwasu nukleinowego o pośredniej długości i określanie sekwencji tych fragmentów. Cząsteczka kwasu nukleinowego zarówno DNA jak i RN A, może być podzielona na fragmenty jedną z licznych metod, przykładowo, przez cięcie enzymem restrykcyjnym, rozrywanie metodami fizycznymi jak działanie ultradźwiękami, działanie NaOH lub rozrywanie niskim ciśnieniem.

W szczególnych wykonaniach np. z użyciem krótkich sond oligonukleotydowych o długości od około 4 bp do około 9 bp, można wytworzyć fragmenty kwasu nukleinowego o długości od około 10 bp do około 40 bp. Oczywiście, sondy dłuższe będą, zwykle używane do sekwencjonowania dłuższych fragmentów kwasu nukleinowego i vice versa. W pewnych korzystnych wykonaniach zastosowane krótkie sondy oligonukleotydowe będą miały długość około 6 bp, zaś fragmenty kwasu nukleinowego, który ma być sekwencjonowany będą długości rzędu 20 bp. Jeżeli to konieczne, fragmenty mogą być rozdzielone pod względem wielkości w celu uzyskania fragmentów o odpowiedniej długości, np. fragmenty mogą być poddane elektroforezie na żelu, np. agarozowym, po czym fragmenty o odpowiedniej wielkości mogą być wycięte.

Sposób określania sekwencji cząsteczki kwasu nukleinowego może być również zilustrowany następująco. Początkowo, można losowo porozrywać pewną ilość kwasu nukleinowego, który ma być sekwencjonowany, dostarczając mieszaniny fragmentów kwasu nukleinowego o długości T. Przygotowuje się zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych o znanych sekwencjach i długości F i zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w roztworze, o znanych sekwencjach i długości P, gdzie F+P < T, przy czym korzystnie T~3F.

Następnie kontaktuje się uszeregowanie immobilizowane sondy oligonukleotydowe z mieszaniną fragmentów kwasu nukleinowego w warunkach hybrydyzacji skutecznych dla tworzenia kompleksów pierwotnych ze zhybrydyzowanymi sekwencjami komplementarnymi o długości F i niezhybrydyzowanymi sekwencjami fragmentu o długości T-F. Korzystnie, hybrydyzowane sekwencje o długości F powinny zawierać tylko sekwencje całkowicie komplementarne.

Kompleksy pierwotne mogą być następnie kontaktowane z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych w warunkach hybrydyzacji skutecznych dla tworzenia kompleksów wtórnych ze zhybrydyzowanymi, komplementarnymi sekwencjami o długości F i stycznymi zhybrydyzowanymi sekwencjami komplementarnymi o długości P. W korzystnym wykonaniu, wyłącznie te znakowane sondy, które mają całkowicie komplementarną sekwencję będą mogły hybrydyzować i wyłącznie te sondy, które zhybrydyzowały bezpośrednio stycznie do immobilizowanej sondy, będą mogły pozostać zhybrydyzowane. W najkorzystniejszym wykonaniu, styczne sondy oligonukleotydowe, immobilizowana i znakowana, będą również poddawane ligacji na tym etapie.

Następnie wykrywa się kompleksy wtórne przez wykrywanie obecności znacznika i identyfikację sekwencji o długości F+P z fragmentu kwasu nukleinowego w kompleksach wtórnych przez połączenie znanych sekwencji zhybrydyzowanych sond: immobilizowanej i znakowanej. Następnie identyfikowane będą ciągi sekwencji F+P, które się nakładają umożliwiając w ten sposób rekonstrukcję lub połączenie kompletnej sekwencji cząsteczki, z sekwencji nakładających się.

W sposobach według wynalazku, oligonukleotydy pierwszego zestawu mogą być przyłączone do podłoża stałego, tzn. immobilizowane, którąkolwiek ze znanych metod. Przykładowo, wiązanie może nastąpić dzięki kierowanej aktywowanej laserem fotodeprotekcji (Fodor i in., 1991; Pease i in., 1994). Jednąz ogólnie korzystnych metod jest przyłączanie oligonukleotydów przez grupę fosforanową przy użyciu takich odczynników jak fosforoamidyn lub wodorofosforan nukleozydu, jak to opisali Southern i Maskos (zgłoszenie PCT WO 90/03382), i zastosowanie szkła, nylonu lub teflonu jako podłoża. Innym korzystnym sposobem jest synteza

180 521 wywołana światłem opisana przez Pease i in., (1994; załączone tu jako odnośnik). Można również nabyć uszeregowane oligonukleotydy związane z podłożem, przykładowo, oferowane przez Affymetrix i Beckman.

Immobilizowane oligonukleotydy mogą być uporządkowane w szereg, zawierający wszystkie sondy i podzestawy sond o danej długości (korzystnie od około 4 do 10 zasad), bardziej korzystnie w wiele szeregów immobilizowanych oligonukleotydów zorganizowanych w postaci tzw. sekwencjonującego chipu”, jednym z przykładów takiego układu jest taki, w którym stosuje się hydrofobowe segmenty w celu wytworzenia osobnych regionów przestrzennych. Sekwencjonujące chipy mogą być projektowane dla różnych zastosowań jak mapowanie, częściowe sekwencjonowanie, sekwencjonowanie regionów docelowych dla celów diagnostycznych, sekwencjonowanie mRNA i sekwencjonowanie genomu na wielką skalę. Dla każdego z zastosowań może zostać zaproj ektowany specyficzny chip z sondami o różnej długości albo z niekompletnym zestawem sond.

W jednym przykładowym wykonaniu, oba zestawy sond oligonukleotydowych stanowią sondy o długości sześciu zasad, tzn. 6-mery. Wobec tego, każdy zestaw zawiera 4096 różnych sond. Pierwszy zestaw sond jest korzystnie przytwierdzony w uszeregowany sposób na mikrochipie, najdogodniej zorganizowanym w postaci 64 rzędów i 64 kolumn. Drugi zestaw 4096 oligonukleotydów był znakowany znacznikiem możliwym do wykrycia i rozporcjowany do osobnych probówek. W tym przykładzie 4096 chipów zostało połączonych w jeden wielki układ lub kilka układów. Po hybrydyzacji fragmentów kwasu nukleinowego, do każdego mikrochipu dodano nieco znakowanych oligonukleotydów, w celu wykonania drugiego etapu hybrydyzacji, przy czym do każdego z układów dodano tylko jednego spośród 4096 oligonukleotydów.

W zakres wynalazku wchodzą też zestawy do identyfikacji sekwencji kwasu nukleinowego i nukleotydów w docelowym kwasie nukleinowym.

Zestaw według wynalazku obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej dwie znakowane sondy oligonukleotydowe mają ten sam znacznik i (c) środek ligujący.

Modyfikacja tego zestawu obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej jedna, znakowana sonda ma znacznik, który można wykryć bez odszczepiania go oraz (c) środek ligujący.

W innej modyfikacji zestaw znakowanych sond (b) zawiera co najmniej jedną znakowaną sondę ze znacznikiem, którego nie można wykryć metodą spektormetrii mas.

Korzystnie, w zestawach według wynalazku immobilizowane sondy oligonukleotydowe są uszeregowane na jednym stałym podłożu, a jeszcze korzystniej zbiór immobilizowanych sond oligonukleotydowych obejmuje wiele szeregów ułożonych w formie „chipu” (układu scalonego) sekwencji.

W takich zestawach korzystnie między szeregami stosuje się hydrofobowe segmenty.

Zestawy takie obejmują podłoże z umocowanymi sondami oligonukleotydowymi o znanych sekwencjach, jak to pokazano na fig. 2 A, fig. 2B i fig. 2C, w których oligonukleotydy zdolne są do wzięcia udziału w reakcji hybrydyzacji, oraz zestaw pojemników, zawierających roztwory znakowanych sond oligonukleotydowych o znanych sekwencjach. Rozważane jest również użycie uporządkowania jak na fig. 4. Ilustruje to zastosowanie Zasady Uniwersalnej jako sposobu przytwierdzenia bądź jako zakończenia w celu zostawienia przestrzeni hybrydyzującym fragmentom.

W zestawach, sondy oligonukleotydowe przytwierdzone oraz znajdujące się w roztworze mogą mieć długość od około 4 bp do około 9 bp, przy czym korzystne sąsondy o długości około 6 bp. Oligonukleotydy mogą być znakowane znacznikami możliwymi do wykrycia chemiczriie bądź radioaktywnymi, przy czym najkorzystniejsze jest znakowanie ³²P, zaś jeszcze korzystniejsze znakowanie ³³P. Zestawy mogą również zawierać czynnik ligujący chemicznie lub inny jak np. enzym ligaza DNA. Do zestawu mogą być włączone różne dodatkowe kompozycje i materiały, jak np. urządzenia 96-końcówkowe czy 96 igłowe, bufory, odczynniki do cięcia długich cząsteczek kwasy nukleinowego oraz narzędzia do selekcjonowania fragmentów DNA pod

180 521 kątem wielkości. Zestaw może również zawierać znakowane sondy RNA, tak by sondy mogły być usuwane przez trawienie RNAzą zaś chip mógł być ponownie użyty.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Figura 1. Podstawowe etapy w procesie hybrydyzacji.

Etap 1: Nieznakowany docelowy DNA, który ma być sekwencjonowany (T) hybrydyzowany jest w warunkach rozróżniających z uporządkowanymi przytwierdzonymi sondami oligonukleotydowymi. Narysowane są pólka z sondą Fx i Fy. Sekwencje komplementarne do Fx i Fy znajdują się w różnych położeniach T.

Etap 2: Znakowane sondy Pi, (jedna sonda na każdy z układów) hybrydyzowane są z uporządkowanymi oligonukleotydami. Przedstawiona jest sonda, która ma komplementarny cel na T, przylegający do Fx, ale nie do Fy.

Etap 3: Przez zastosowanie odczynników lub warunków rozróżniających kompleksy bez przylegających sond są selektywnie roztapiane. Szczególny przykład stanowi ligacja znakowanej sondy z sondą przytwierdzoną, gdy znakowana sonda hybrydyzuje „koniec do końca” z sondą przytwierdzoną. Sygnały pozytywne wykrywane są wyłącznie w przypadku sond stykających się, jak Fx i Pi oraz w szczególnym przykładzie, tylko w przykładzie sond ligowanych.

Figura 2A, fig. 2B i fig. 2C przedstawiają składniki przykładowego zestawu do sekwencjonowania.

Figura 2A. Sekwencjonujące chipy stanowią matrycę 4^P identycznych przedziałów, z których każdy zawiera identyczne (łub różne) uporządkowania oligonukleotydów. Przedziały mogą być oddzielone barierami fizycznymi lub hydrofobowymi paskami. Rozważane jest uporządkowanie od 4000 do 16000 oligochipów.

Figura 2B przedstawia powiększenie przedziału chipu, zawierającego 4^F pólek, każde z pojedynczą sondą (4000-16000) syntetyzowaną lub nałożoną na tę powierzchnię. Pólka mogą być wielkości kilku mikrometrów, zaś wielkość przedziału wynosi od 1 mm do 10 mm.

Figura 2C przedstawia zestaw probówek, lub jedną lub wiele płytek wielostudzienkowych o odpowiedniej liczbie studzienek (w tym przypadku 4^P studzienek). Każda studzienka zawiera pewną ilość znakowanego swoistego oligonukleotydu. Dodatkowe ilości sond mogą być przechowywane w postaci nieznakowanej, o ile znakowanie nie odbywa się podczas syntezy; w tym przypadku zestaw do sekwencjonowania musi zawierać odczynniki niezbędne do znakowania sondy. Linie łączące probówki/studzienki z przedziałami chipu pokazują etap procesu sekwencjonowania, podczas którego pewna ilość znakowanej sondy jest przenoszona do przedziału chipu. Przeniesienie może być wykonane przez pipetowanie (jedno- lub wielokanałowe) albo przez igłowe przenoszenie płynu spowodowane napięciem powierzchniowym. Narzędzia służące przenoszeniu też mogą wchodzić w skład zestawu do sekwencjonowania.

Figura 3A, fig. 3B i fig. 3C. Hybrydyzacja fragmentów DNA wytworzonych przez cięcie losowe pewnej ilości cząsteczki DNA. Na fig. 3A przedstawiono fragment DNA Tl, zawierający kompletne cele dla sondy przytwierdzonej jak i dla nie przytwierdzonej sondy znakowanej. Fig, 3B pokazuje przypadek, gdzie fragment DNA oznaczony jako T nie jest odpowiednio przecięty. Na fig. 3C, jest wystarczająco dużo miejsca do hybrydyzacji z sondąP, ale przylegająca sekwencja nie jest do niej komplementarna. W przypadkach B i C sygnał będzie osłabiony z powodu nasycenia cząsteczkami przytwierdzonej sondy F. Równoczesna hybrydyzacja z fragmentami DNA i sondami znakowanymi oraz cyklizacja procesu hybrydyzacji stanowi możliwą drogę zwiększenia efektu poprawnej hybrydyzacji stycznej.

Figura 4. Zastosowanie Zasady Uniwersalnej jako łącznika albo w pozycji końcowej do hybrydyzacji. Zasady uniwersalne (zasady M, Nichols i in., 1994) albo wszystkie cztery zasady mogą zostać dodane w trakcie syntezy sondy. Jest to sposób zwiększenia długości sond i w ten sposób ich stabilności bez zwiększania ich liczby. Zastosowanie zasad uniwersalnych na wolnym końcu sond zapewnia przestrzeń umożliwiającą odczytywanie sekwencji w różnych ramkach.

180 521

SZCZEGÓŁOWY OPIS NAJKORZYSTNIEJSZYCH WYKONAŃ

Określanie sekwencji cząsteczek kwasu nukleinowego jest istotną czynnością we wszystkich dziedzinach badań biologicznych - podstawowych i stosowanych (Drmanac i Crkvenjakov, 1990). Niniejszy wynalazek dostarcza nowych i efektywnych sposobów zastosowania sekwencjonowania i analizy cząsteczek kwasu nukleinowego. Jednym z zamierzonych zastosowań tej metodologii jest zastosowanie, w połączeniu z innymi technikami sekwencjonowania, w Projekcie Poznania Genomu Człowieka (HGP).

Obecnie, znane są dwa sposoby sekwencjonowania przez hybrydyzację (SBH). W pierwszym, Formacie 1, nieznane genomowe DNA albo oligonukleotydy długości rzędu 100-2000 nukleotydów rozmieszczone są na podłożu stałym. DNA te są badane przez hybrydyzację z zestawem znakowanych sond, które są ogólnie, 6- do 8-merami. W technice odwrotnej, Formacie 2, oligomery długości 6 do 8 nukleotydów są unieruchomione na podłożu stałym i poddane hybrydyzacji z fragmentami klonowanego i znakowanego DNA.

W obu typach analizy SBH koniecznych jest wiele etapów, aby uzyskać ostateczną sekwencję. Szczególnymi problemami obecnych metod SBH są problemy związane z syntezą olbrzymiej liczby sond i problemy efektywnej hybrydyzacji rozróżniającej. Pełne rozróżnienie pomiędzy zgodnościąa niezgodnościąjest trudne z dwóch zasadniczych powodów. Po pierwsze, końcowa niezgodność sond dłuższych niż 10 zasad jest bardzo trudna do rozróżnienia, i po drugie, złożona mieszanina znakowanych segmentów DNA powstała podczas analizy długich fragmentów DNA powoduje silne tło.

Niniejszy wynalazek zapewnia efektywną hybrydyzację różnicującą bez wielkiej liczby sond lub sond o znacznej długości, jak również eliminuje wiele etapów znakowania i klonowania, które są szczególnymi wadami obu znanych metod SBH. Sposoby niezwykle efektywnego sekwencjonowania kwasu nukleinowego według wynalazku, nazwane sekwencjonowaniem wg. Formatu 3, opierają się na hybrydyzacji z dwoma zestawami krótkich sond oligonukleotydowych o znanych sekwencjach, i stąd przynajmniej podwajają długość sekwencji możliwej do określenia. Sposoby te umożliwiająsekwencjonowanie niezwykle długich cząsteczek kwasu nukleinowego, w tym chromosomów, i rozwiązują różne inne problemy związane z SBH jak, przykładowo, umocowanie czy znakowanie wielu fragmentów kwasu nukleinowego. Wynalazek jest niezwykle wydajny i pozwala również sekwencjonować RNA, a nawet nie amplifikowane próbki RNA.

W zgłoszeniu patentowym USA nr 08/127,402 oraz w publikacji Drmanaca (1994) opisana została inna odmiana SBH nazwana pozycyjnym SBH (PSBH) (Broude i in., 1994). PSBH jest w zasadzie odmianąFormatu 2 SBH (w którym oligonukleotydy o znanych sekwencjach są unieruchomione i zastosowane do hybrydyzacji z kwasami nukleinowymi o nieznanej sekwencji, a które zostały uprzednio wyznakowane). W PSBH, immobilizowane sondy, są dupleksami, zamiast prostymi, jednoniciowymi sondami, zawierającymi jednoniciowe lepkie fragmenty na końcach 3'. Biotynowane dwuniciowe sondy sąunieruchomione na perełkach magnetycznych opłaszczonych streptawidyną, tworząc rodzaj immobilizowanej sondy, po czym są mieszane ze znakowanym ³²P docelowym kwasem nukleinowym, który ma być sekwencjonowany. Następnie dodawana jest ligaza DNA T4 w celu ligacji wszelkiego niezhybrydyzowanego docelowego DNA z krótszym końcem dwuniciowej sondy.

Jednakże, mimo że stanowi ciekawe podejście, PSBH (wg. relacji Broude i in., 1994) nie przedstawia znaczącego postępu w stosunku do istniejącej technologii SBH. Przykładowo, w przeciwieństwie do metodologii Formatu 3, będącego przedmiotem niniejszego wynalazku, PSBH nie wydłuża sekwencji możliwej do określenia w jednym cyklu metody. PSBH utrzymuje również pewne kłopotliwe wymagania dotyczące znakowania nieznanych docelowych DŃA, co nie jest wymagane w Formacie 3. Ogólnie, PSBH jest postulowany do zastosowań w porównawczych badania lub w mapowaniu, a nie w sekwencjonowaniu genomu de novo. Tym różni się diametralnie od Formatu 3, który, jakkolwiek, znajdując szerokie zastosowanie we wszystkich dziedzinach sekwencjonowania, jest niezwykle silnym narzędziem do zastosowania w sekwencjonowaniu największych genomów.

180 521

Kwasy nukleinowe, które mają być sekwencjonowane, mogą być najpierw pofragmentowane. Może to być osiągnięte dowolnym sposobem, w tym cięcie przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, szczególnie przy użyciu Cvi JI jak to opisano przez Fitzgerald i in., (1992); rozrywanie metodami fizycznymi jak działanie ultradźwiękami; działanie NaOH itp. W razie potrzeby, fragmenty o odpowiedniej długości, takie jak od około 10 bp do około 40 bp mogą być wycięte z żelu. Kompletna sekwencja kwasu nukleinowego oryginalnej cząsteczki, jak ludzki chromosom, zostanie określona przez określenie sekwencji F+P obecnych w oryginalnej cząsteczce i połączenie części nakładających się sekwencji F+P. Nie wymaga to zatem pośrednich etapów oznaczania sekwencji fragmentu, przeciwnie, całą cząsteczka jest konstruowana z określonych sekwencji F+P.

Dla celów poniższej dyskusji, zakłada się, że sekwencję kwasu nukleinowego, który ma być sekwencjonowany, tworzy cztery zasady. Są to A, G, C i T dla DNA i A, G, C i U dla RNA. Jednakże, może być korzystne w niektórych wykonania zastosowanie zmodyfikowanych zasad w krótkich sondach oligonukleotydowych. Aby przeprowadzić wynalazek, należy najpierw wytworzyć krótkie sondy oligonukleotydowe w liczbie pokrywającej wszystkie kombinacje sekwencji dla danej długości sondy. Liczba ta jest przedstawiona przez 4^N (4 do potęgi N), gdzie długość sondy oznaczono jako N.· Przykładowo, istnieje 4096 możliwych sekwencji sondy będącej 6-merem (4⁶=4096).

Jeden zestaw takich sond o długości F (4^F) jest umocowany na kwadratowej matrycy na mikrochipie - w zakresie wielkości od 1 mm² lub 1 cm². W niniejszym przykładzie, zostaną one uszeregowane w 64 rzędy po 64 kolumny. Oczywiście, należy się upewnić, czy sondy oligonukleotydowe zostały umocowane, czy w inny sposób unieruchomione, na powierzchni mikrochipu w sposób umożliwiający im wejście w reakcję hybrydyzacji. Zsyntetyzowany będzie również drugi zestaw oligonukleotydów o długości P, w liczbie 4^P. Oligonukleotydy tego „zestawu P” zostaną wyznakowane możliwym do wykrycia znacznikiem i rozporcjowane do zestawu probówek (fig. 2A, fig. 2B i fig. 2C).

4^P chipów zostanie połączonych w duży układ (lub wiele układów wielkości rzędu 10-100 cm², w wygodnym wymiarze); gdzie P odpowiada długości oligonukleotydów w drugim zestawie oligomerów (fig. 2A, fig. 2B i fig. 2C). Ponownie, jako wygodny przykład, wybrano P równe 6 (P=6).

Kwasy nukleinowe, które mająbyć sekwencjonowane, dzieli się na małe fragmenty kwasu nukleinowego o nieznanej sekwencji. Średnia długość tych fragmentów, nazwanych T, powinna ogólnie być większa od połączonej długości F i P, i może stanowić trzykrotną długość F (tj. F+P< T oraz T ~ 3F). W niniejszym przykładzie, należy uzyskać fragmenty kwasu nukleinowego o długości około 20 par zasad. Fragmenty te będą denaturowane i nałożone na duże matryce w warunkach wspomagających hybrydyzację sekwencji komplementarnych.

W najprostszej i korzystnej postaci wynalazku, wybrano warunki hybrydyzacji umożliwiające znaczącą hybrydyzację jedynie wówczas, gdy 6 kolejnych nukleotydów we fragmencie kwasu nukleinowego będzie komplementarnych do wszystkich sześciu nukleotydów sondy F. Takie warunki hybrydyzacji zostaną określone w rutynowych, pilotowych doświadczeniach optymalizujących warunki, takie jak temperatura, stężenie różnych składników, długość czasu etapów oraz zastosowane bufory, w tym pH buforów. Na tym etapie każdy z mikrochipów powinien zawierać jakieś zhybrydyzowane kompleksy. Będą one w postaci kompleksów sonda:fragment, w których cała sekwencja sondy jest zhybrydyzowana z fragmentem, ale w których fragment, będąc dłuższym, ma trochę niezhybrydyzowanych sekwencji tworzących „ogon” lub „ogony” kompleksu. W tym przykładzie zhybrydyzowane sekwencje komplementarne będą miały długość F, zaś sekwencje niezhybrydyzowane będą miały długość T-F. Komplementarna część fragmentu może się znajdować na odpowiednim końcu lub w jego pobliżu tak, że tworzy się pojedynczy niezhybrydyzowany ogon. Alternatywnie, cześć komplementarna fragmentu może znajdować się w pobliżu przeciwnego końca, tak, że tworzą się dwa niezhybrydyzowane ogony (fig. 3A, fig. 3B i fig. 3C).

180 521

Po opłukaniu w celu usunięcia niekomplementamych fragmentów kwasu nukleinowego, które niezhybrydyzowały, do każdego układu scalonego dodawana jest niewielka ilość znakowanego oligonukleotydu z zestawu P do hybrydyzacji z ogonem fragmentu kwasu nukleinowego o nieznanej sekwencji, wystającym z kompleksu sonda:fragment. Jedynie jeden spośród 4^P oligonukleotydów zostanie dodany do pojedynczego mikrochipu. Korzystne jest zastosowanie do hybrydyzacji warunków umożliwiających wydajną hybrydyzację jedynie, gdy 6 nukleotydów znakowanej sondy jest komplementarnych do sześciu kolejnych nukleotydów ogona kwasu nukleinowego. Warunki hybrydyzacji mogąbyć określone w badaniach pilotowych, jak to opisano powyżej, w których optymalizowane są takie cechy jak temperatura, stężenia, czas, bufory itp. Na tym etapie każdy z mikrochipów zawiera „wtórne kompleksy hybrydyzacyjne”. Znajdują się one w postaci kompleksów sonda:fragment, w których cała sekwencja każdej z sond jest zhybrydyzowana z fragmentem oraz prawdopodobnie fragment zawiera nieco niezhybrydyzowanych sekwencji. W takich wtórnych kompleksach hybrydyzacyjnych unieruchomiona sonda i sonda znakowana mogąhybrydyzować z fragmentem w taki sposób, że stykają się bezpośrednio „koniec do końca”. Jednakże, uwzględniając, że fragmenty generalnie będą dłuższe niż suma długości sond, sonda unieruchomiona i sonda znakowana mogą hybrydyzować z fragmentem w pozycjach niestycznych, rozdzielone jedną lub większą liczbą zasad.

Następnie duże układy poddawane są procesowi usuwającemu niezhybrydyzowane znakowane sondy. W korzystnym wykonaniu, użyty proces powinien usuwać z układu nie tylko niezhybrydyzowane znakowane sondy, ale również znakowane sondy zhybrydyzowane niestycznie. Proces powinien wykorzystywać warunki rozróżniające, umożliwiające odróżnienie wtórnych kompleksów, zawierających styczne sondy unieruchomione i znakowane od kompleksów wtórnych, w których fragment kwasu nukleinowego zhybrydyzował z dwiema sondami, które nie są styczne. Jest to ważny aspekt wynalazku, ponieważ umożliwia ostateczne określenie odcinka fragmentu sekwencji odpowiadającego połączonym sekwencjom sondy unieruchomionej i sondy znakowanej.

Zastosowany proces rozróżniania, mający na celu usunięcie sond niezhybrydyzowanych i zhybrydyzowanych niestycznie przy pozostawieniu sond zhybrydyzowanych stycznie może być kontrolowanym procesem płukania. Wybrane warunki powinny pozostawić zhybrydyzowane stycznie sondy nienaruszone z powodu ich zwiększonej stabilności spowodowanej reakcją stykających się nukleotydów. Jednakże, w korzystnym wykonaniu rozważa się obróbkę dużych układów prowadzącą do kowalencyjnego połączenia sond stycznych, np. przez działanie roztworem, zawierającym czynnik ligujący chemicznie albo, bardziej korzystnie, enzym ligazę, jaknp. ligaza DNA T₄ (Landegren i in., 1988; Wu i Wallace, 1989).

W każdym przypadku, cała matryca powinna być poddana surowemu płukaniu tak, że jedyny znacznik pozostawiony na matrycy znajduje się w postaci dwuniciowego kompleksu sonda-fragment-sonda ze stycznymi zhybrydyzowanymi częściami o długości F+P (tj. 12-nukleotydowymi w niniejszym przykładzie). Przy użyciu dwuetapowej reakcji hybrydyzacji, możliwe jest bardzo ostre różnicowanie, ponieważ działają trzy lub cztery niezależne procesy rozróżniające: hybrydyzacja rozróżniająca fragmentu T z sondą o długości F zasad; hybrydyzacja rozróżniająca sondy o długości P zasad z fragmentem o długości T; rozróżniająca stabilność w pełni zgodnych (F+T+P) hybryd w porównaniu z hybrydami P lub w porównaniu z niezgodnymi hybrydami, zawierającymi niestyczne sondy F+P oraz rozróżniająca ligacja dwóch końcowych zasad F i P.

Tak zwane „styczne wtórne kompleksy” można wykrywać przez obserwację położenia znacznika pozostającego na matrycy. Z położenia znacznika, mogąbyć określone sekwencje o długości F+P (np. 12) nukleotydów przez skojarzenie znanych sekwencji sondy unieruchomionej i znakowanej. Kompletna sekwencja kwasu nukleinowego oryginalnej cząsteczki, takiej jak chromosom człowieka, może zostać zrekonstruowana lub skojarzona z nakładających się sekwencji F+P określonych w powyższy sposób.

Jeżeli podczas procesu sekwencjonowania stosuje się ligację, co jest korzystne, zwykły oligonukleotydowy chip nie może zostać powtórnie użyty. Uważa się, że nie będzie to czynnikiem ograniczającym, ponieważ dostępnych jest wiele metod reutylizacji. Przykładowo, można

180 521 wytworzyć specyficznie rozszczepialne wiązanie pomiędzy sondami i przecinać je po wykryciu. Alternatywnie, można zastosować rybonukleotyd dla drugiej sondy, P, lub użyć rybonukleotydu jako zasady łączącej w sondzie, tak, że sonda może zostać usunięta przez działanie RNAzy lub glikozylację uracylo-DNA. (Craig i in., 1989). Innymi rozważanymi metodami jest tworzenie wiązań przez ligację chemiczną, które można wybiórczo ciąć (Dolinnaya i in., 1988).

Rozważane są również dalsze odmiany i ulepszenia wchodzące w zakres niniejszego wynalazku. Obejmuje to zastosowanie zmodyfikowanych oligonukleotydów w celu zwiększenia swoistości albo wydajności sposobów, podobnie jak opisali Hoheisel i Lehrach (1990). Hybrydyzacje cykliczne również mogą być zastosowane w celu wzmocnienia sygnału hybrydyzacji, jak to jest stosowane w technologii PCR. W tych przypadkach, można zastosować cykle o różnych temperaturach w celu ponownej hybrydyzacji pewnych sond. Wynalazek pozwala również na określenie przesunięcia w ramkach odczytu przez zastosowanie równomolowych ilości sond, które zawierająróżne zasady w pozycjach końcowych. Przykładowo, zastosowanie równomolowych 7-merów, w których pierwsze sześć zasad ma tę samą określoną sekwencję, zaś w ostatniej pozycji może być A, T, C albo G.

Następujące poniżej przykłady załączono w celu zademonstrowania korzystnych wykonań wynalazku. Specjaliści powinni zauważyć, że wynalezione techniki według wynalazku przedstawione w przykładach dobrze sprawdzają się w praktyce, a więc należy je uważać za korzystne sposoby jego wykonania. Jednakże, dla specjalisty oczywiste będzie, że w świetle niniejszego ujawnienia możliwe jest dokonanie wielu zmian w konkretnych opisanych tu wykonaniach, z uzyskaniem identycznych lub podobnych wyników, bez wykraczania poza istotę i zakres wynalazku.

Przykład I

WYTWORZENIE OLIGONUKLEOTYDÓW ZWIĄZANYCH Z PODŁOŻEM

Oligonukleotydy, tzn. krótkie segmenty kwasu nukleinowego mogą być łatwo wytworzone przez, przykładowo, bezpośrednią syntezę chemiczną oligonukleotydów, jak się to rutynowo wykonuje przy użyciu urządzeń do syntezy oligonukleotydów.

Oligonukleotydy związane z podłożem mogą być wytworzone przez specjalistów każdą ze znanych metod, z użyciem odpowiedniego podłoża jak np. szkła, polistyrenu czy teflonu. Jedną ze strategii jest precyzyjne nakroplenie oligonukleotydów syntetyzowanych przy użyciu standardowego urządzenia do syntezy. Unieruchomienie może być uzyskane przez adsorpcję pasywną (Inouye i Hondo, 1990); przy użyciu światła UV (Nagata i in., 19985; Dahlen i in., 1987; Morriey i Collins, 1989) lub przez wiązanie kowalencyjne DNA o zmodyfikowanych zasadach (Keller i in., 1988; 1989); które to załączono tu jako odnośniki.

Inną zastosowaną strategiąmoże być zastosowanie silnego wiązania biotyny ze streptawidyną jako łącznika. Przykładowo, Broude i in., (1984) opisuje zastosowanie biotynowanych sond, jakkolwiek są to sondy dwuniciowe, unieruchomionych na perełkach magnetycznych opłaszczonych streptawidyną. Perełki opłaszczone streptawidynąmogąbyć zakupione w Dynal, Oslo. Oczywiście, ta sama chemia łączenia jest możliwa do zastosowania w opłaszczaniu każdej powierzchni streptawidyną. Biotynowane sondy mogą być zakupione z wielu źródeł, jak np. Peron Technologie (Alameda, CA).

Nunc Laboratories (Napperville, IL) sprzedają również odpowiedni materiał, możliwy do zastosowania. Nunc Laboratories opracowały metodę kowalencyjnego wiązania DNA z powierzchnią mikrostudzienek, zwaną CovaLinkNH. CovaLinkNHjestpowierzchniąpolistyrenową, na której są zaszczepione drugorzędowe grupy aminowe (>NH) służące jako pomosty do dalszego wiązania kowalencyjnego. Moduły CovaLink mogą zostać zakupione w Nunc Laboratories. Cząsteczki DNA mogą być wiązane z CovaLink wyłącznie końcami 5' przy użyciu wiązania fosforamidynowego umożliwiając związanie ponad 1 pmola DNA (Rasmussen i in., 1991).

Zastosowanie pasków CovaLink NH do kowalencyjnego wiązania cząsteczek DNA końcem 5' zostało opisane (Rasmussen i in., 1991). W technologii tej zastosowano wiązanie fosforamidynowe (Chu i i., 1983). Jest to zaleta, ponieważ zastosowanie pojedynczego wiązania kowalencyjnego jest korzystne. Wiązania fosforamidynowe wiążąDNA z drugorzędowymi gru

180 521 parni aminowymi CovaLink NH znajdującymi się na końcach ramion łączników przyłączonych do powierzchni polistyrenu przez łącznik długości 2 nm. Aby połączyć oligonukleotyd z CovaLink NH przez wiązanie fosforamidynowe na końcu 5' oligonukleotydu musi się znajdować grupa fosforanowa. Jest, prawdopodobnie, możliwe również kowalencyjne związanie biotyny z CovaLink, a następnie zastosowanie streptawidyny do związania sond.

Bardziej szczegółowo, sposób wiązania obejmuje rozpuszczenie DNA o wodzie (7,5 ng/μΐ) i denaturację przez 10 minut w temp. 95°C, a następnie schłodzenie przez 10 min na lodzie. Następnie dodawany jest schłodzony lodem 0,1 M 1-metyloimidazol, pH 7,0 (1-Melm₇), do stężenia końcowego 10 mM (1-Melm₇). Roztwór jednoniciowego DNA nakrapla się na paski CovaLink NH (75 μΐ/studzienkę) na lodzie.

Świeżo wytworzony karbodiimid, 0,2 M l-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)-karbodiimid (EDC), rozpuszczony w 10 mM 1 -Melm₇, dodaje się w ilości 25 μΐ na studzienkę. Paski inkubowane są przez 5 godzin w temperaturze 50°C. Po inkubacji paski płucze się przez użyciu np. Nunc-Immuno Wash, początkowo trzykrotnie, po czym paski zanurza się w roztworze płuczącym przez 5 minut, a na koniec płucze się trzykrotnie (płyn płuczący składa się z 0,4 N NaOH, 0,25% SDS, podgrzane do 50°C).

Uważa się, że dalszą odpowiednią metodą do zastosowania w niniejszym wynalazku jest metoda opisana w zgłoszeniu PCT WO 90/03382 (Southern i Maskos), załączona tu jako odnośnik. Ten sposób przygotowania oligonukleotydów związanych z podłożem obejmuje przyłączenie odczynnika nukleozydowego końca 3' przez grupę fosforanową fosfodiestrowym wiązaniem kowalencyjnym do alifatycznych grup hydroksylowych znajdujących się na podłożu. Oligonukleotyd syntetyzuje się na zakotwiczonym nukleozydzie, po czym grupy ochronne usuwa się z syntetycznego łańcucha oligonukleotydowego w standardowych warunkach, które nie odcinają oligonukleodytu od podłoża. Odpowiednie odczynniki obejmują fosforamidym i wodorofosforan nukleozydu.

Bardziej szczegółowo, aby zastosować tę metodę, podłoże jak np. płyta szklana, derywatyzuje się jest mieszaniną ksylenu, glicydoksypropylotrimetoksysilanu i śladową ilością diizopropyloetylenaminy w temp. 90°C przez noc. Następnie płucze się je metanolem, eterem i suszy na powietrzu. Derywatyzowane podłoże następnie podgrzewa się w glikolu heksaetylenowym, mieszając, z dodatkiem katalitycznej ilości stężonego kwasu siarkowego, przez noc w atmosferze argonu, w temp. 80°C, aby uzyskać powierzchnie z grupami alkilohydroksylowymi. Po płukaniu metanolem i eterem, podłoże suszy się pod próżniąi przechowuje się w argonie w temp. -20°C.

Następnie przeprowadza się syntezę oligonukleotydu w warunkach standardowych używając trawionej płyty szklanej jako podłoża stałego. Pierwszym nukleotydem będzie 3' wodorofosforan, zastosowany w postaci soli trietyloamoniowej. Sposobem tym uzyskuje się oligonukleotydy o znacznej czystości związane z podłożem.

Można zastosować strategię wykonania matrycy sond DNA na chipie. Przykładowo, do syntezy oligonukleotydów bezpośrednio na powierzchni szklanej można zastosować kierowaną wywoływaną laserem fotodeprotekcję, jak to opisali Fodor i in., (1991). Sondy mogą być również unieruchomione na podłożu nylonowym, jak to opisali Van Ness i in., (1991) albo na teflonie przy użyciu metody Duncana i Cavaliera (1988).

Fodor i in. (1991) opisują kierowaną światłem syntezę dinukleotydów, która jest możliwa do zastosowania w kierowanej przestrzennie syntezie związków złożonych do zastosowania w wytwarzaniu urządzeń w skali mikro. Opiera się to na sposobie używającym światła do kierowania równoczesną syntezą związków chemicznych na podłożu stałym. Wzorzec ekspozycji na światło albo innąpostać energii poprzez maskę, albo w inny kierowany sposób, określa, które rejony podłoża są aktywowane do syntezy chemicznej. Aktywacja światłem spowodowana jest usuwaniem fotolabilnych grup ochronnych z wybranych obszarów. Po deprotekcji, pierwszy związek posiadający fotolabilną grupę ochronną eksponowany jest na całąpowierzchnię, ale reakcja zachodzi tylko z regionami pobudzanymi światłem w poprzedzającym etapie. Substrat jest następnie oświetlany przez drugą maskę, aktywującą inne regiony do reakcji z kolejnym elementem budowy. Wzorzec masek zastosowanych do oświetlania i sekwencja odczynników określają

180 521 produkt końcowy i jego położenie. Przy użyciu metody Fodora, możliwy jest wysoki stopień miniaturyzacji, ponieważ gęstość miejsc syntezy jest związana wyłącznie z ograniczeniami fizycznymi kierowania przestrzennego, np. dyfrakcją światła. Każdy ze związków jest dostępny oraz znane jest jego precyzyjne położenie. Stąd, oligochip, wykonany tą metodą może być zastosowany z SBH.

Fodor i in., (1991) opisują aktywowane światłem wytwarzanie dinukleotydów w następujący sposób. 5'-nitroweratrylotymidynę wytworzono z octanu 3'-O-tymidyny. Po deprotekcji zasadą, 5-nitroweratrylotymidynę przyłączono do podłoża aminowanego przez połączenie z grupą 3'-hydroksylową. Nitroweratrylowe grupy ochronne usunięto przez oświetlenie przez maskę szachownicy o boku 500 pm. Podłoże traktowano następnie 2'-dezoksycytydyną aktywowaną fosforamidynem. W celu badania reakcji fluorometrycznie, dezoksycytydynę modyfikowano aminoheksylowym łącznikiem chronionym FMOC, związanym z aminą egzocykliczną. Po usunięciu grup ochronnych FMOC zasadą, regiony zawierające dinukleotyd znakowano fluorescencyjnie przez działanie na podłoże FITC. Tak więc, stosując tę metodę mogą być syntetyzowane związane z podłożem oligonukleotydy.

Aby związać oligonukleotyd z podłożem nylonowym, jak to opisali przez Van Ness i in., (1991), powierzchnia nylonu wymaga aktywacji przez alkilację i wybiórczą aktywację 5'-aminy oligonukleotydów przy użyciu chlorku cyjanurowego, w poniższy sposób. Powierzchnię nylonową etyluje się tetrafluoroboranem trietylooksoniowym w celu wytworzenia estrów imidanowych zdolnych do reakcji z aminą na powierzchni nylonu. Jako rozpuszczalnika użyto l-metylo-2-pirolidonu. Powierzchnia nylonu jest niepolerowana, co daje możliwie największe pole powierzchni.

Aktywowanąpowierzchnię poddaje się następnie reakcji z poli(etylenoiminą) (M_r~10 K-70 K) w celu wytworzenia powłoki polimeru zapewniającej rozwiniętą powierzchnię aminową do przyłączenia oligonukleotydów. Oligonukleotyd(y) z przyłączoną aminą wybiórczo reagują z nadmiarem chlorku cyjanurowego, wyłącznie w miejscu przyłączenia aminy, powodując powstanie 4,6-dichloro-l,3,5-triazynylo-oligonukleotydu(w) w sposób ilościowy. Podstawienie jednej grupy chlorkowej w chlorku cyjanurowym przez grupę aminową znacznie zmniejsza reaktywność pozostałych grup chlorkowych. Powoduje to zwiększoną stabilność hydrolityczną 4,6-dichloro-l,3,5-triazynylo-oligonukleotydu(w), które są stabilne przez dłuższy czas w buforowych roztworach wodnych (pH 8,3,4°C, 1 tydzień) i sąłatwe do izolacji i oczyszczania przez chromatografię czy ultrafiltrację.

Reakcja jest swoista dla grupy aminowej i nie wpływa na cząsteczkę oligonukleotydu. Powierzchnia nylonowa pokryta PEI, poddawana jest reakcji z oligonukleotydami aktywowanymi chlorkiem cyjanurowym. Na powierzchni uzyskiwane są wysokie stężenia sekwencji „wychwyconej”, zaś nieprzereagowane aminy wiązane są bezwodnikiem bursztynowym w końcowym etapie procesu.

Jednym ze szczególnych sposobów wytwarzania oligonukleotydów związanych z powierzchniąjest wykorzystanie syntezy wywołanej światłem opisanej przez Pease i in., (1994, zamieszczone tu jako odnośnik). Autorzy zastosowali współczesną technikę fotolitograficzną w celu stworzenia matryc unieruchomionych sond oligonukleotydowych (chipów DNA). Sposoby te, w których światło jest stosowane do kierowania syntezą sond oligonukleotydowych w miniaturowych matrycach o wysokiej gęstości, wykorzystująfotolabilne, chronione na końcu 5' fosforamidy N-acylodezoksynukleozydów, chemizm łączników powierzchniowych i wszechstronne strategie syntezy kombinatoryjnej. Możliwe jest w ten sposób wytworzenie matrycy 256 zdefiniowanych przestrzennie sond oligonukleotydowych i wykorzystanie jej w korzystnym sekwencjonowaniu w Formacie 3, jak to opisano.

Pease i in., (1994) zaprezentowali strategię odpowiedniądo zastosowania w syntezie oligonukleotydów kierowanej światłem. W metodzie tej, powierzchnia podłoża stałego zmodyfikowana fotolabilnymi grupami ochronnymi oświetlana jest przez maskę fotolitograficzną dając w miejscach oświetlonych reaktywne grupy hydroksylowe. Nukleozydy aktywowane 3'-O-fosforamidynem (z grupą hydroksylową w pozycji 5'chronionągrupąfotolabilną) eksponuje się na

180 521 powierzchni, gdzie zachodzi wiązanie w miejscach uprzednio eksponowanych na światło. Po reakcji blokowania i utlenienia, podłoże spłukuje się, zaś powierzchnię oświetla się przez kolejną maskę w celu eksponowania kolejnych grup hydroksylowych do wiązania. Kolejny nukleozyd aktywowany 3'-O-fosforamidynem, z grupą hydroksylową w pozycji 5' chronioną grupą fotolabilną eksponowany jest na powierzchnię. Cykle wybiórczej fotodeprotekcji i sprzęgania powtarzane są dopóty, dopóki nie zostanie uzyskany pożądany zestaw produktów. Ponieważ zastosowana została fotolitografia, proces może być miniaturyzowany w celu wytworzenia matryc sond oligonukleotydowych o dużej gęstości, których sekwencja znana jest w każdym z miejsc.

Szlak syntezy mający na celu wytworzenie niezbędnych fosforamidynów 5'O-(a-metylo-6-nitropiperonylooksykarbonylo)-N-acylo-2'-dezoksynukleozydu(fosforamidynów MeNPoc-N-acylo-2'-dezoksynukleozydu) obejmuje, w pierwszym etapie, reakcję N-acylo-2'-dezoksynukleozydu z 1 -(2-nitro-4,5-metylenodioksyfenylo)etylo-1 -chloromrówczanem, z wytworzeniem 5'-MeNPoc-N-acylo-2'-dezoksynukleozydu. W drugim etapie, grupa 3'-hydroksylowa reaguje z N,bf-diizopropylochlorofosforamidynem 2-cyjanoetylu, przy użyciu standardowego procesu, w którym powstają 5'-MeNPoc-N-acylo-2'-dezoksynukleozydo-3'-O-(2-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)fosforamidyny. Grupa fotoochronna jest stabilna w standardowych warunkach reakcji syntezy fosforamidynu i może zostać usunięta przy użyciu wodnego roztworu zasady. Odczynnik ten może być przechowywany przez dłuższy czas pod argonem w 4°C.

Opisano czas połowicznej fotolizy wynoszący 28 sek, 31 sek, 27 sek i 18 sek dla, odpowiednio, MeNPoc-dT, MeNPoc-dC^ibu, MeNPoc-dG^PAC i MeNPoc-dA^PAC (Pease i in., 1994). W syntezie litograficznej poleca się więc okresy oświetlania długości 4,5 minuty (9xt_1/2MeNPoc-dC) zapewniające >99% usunięcie grup ochronnych MeNPoc.

Odpowiednim podłożem syntetycznym może być podłoże szklane o wymiarach 5,1x7,6 cm, oczyszczone stężonym NaOH i dokładnie spłukane wodą. Powierzchnia powinna być poddana przez 2 godziny działaniu 10% roztworu (obj.) bis(2-hydroksyetylo)aminopropylotrietoksysilanu (Petrarach Chemicals, Bristol, PA) w 95% etanolu, spłukana dokładnie etanolem i eterem, wysuszona pod próżnią w 40° C i ogrzewana w 100°C przez 15 minut. W badaniach tych, łącznik do syntezy powinien być umocowany przez reakcję derywatyzowanego podłoża z fosforamidynem 4,4'-dimetoksytrytylo-(DMT)-heksoetyloksy-O-cyjanoetyłu.

Podsumowując, w celu zapoczątkowania syntezy sondy oligonukleotydowej odpowiednia pochodna fosforamidynu dezoksynukleozydu powinna być przymocowana do syntetycznego podłoża poprzez łącznik. Rejony podłoża aktywowane są do syntezy przez oświetlenie przez otwory maski fotolitograficznej wielkości np. 800x12800 pm. Można przeprowadzić dodatkowe cykle syntezy fosforamidynu (z użyciem dezoksynukleozydów chronionych DMT) w celu wytworzenia dowolnej pożądanej sekwencji, jak np. każda sekwencja 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, a nawet 10-meru. Po usunięciu ochronnych grup fosforanowych czy egzocyklicznych aminowych, przy użyciu stężonego NH₄OH przez 4 godziny, podłoże może być zamontowane w kontrolowanej termostatycznie komorze hybrydyzacyjnej z płaszczem wodnym, gotowej do użycia.

Oczywiście, możliwe jest łatwe nabycie w handlu chipu DNA, takiego jak jeden z opisanych powyżej układów aktywowanych światłem. W takim przypadku można się skontaktować z firmą Afiymetrix w Santa Clara, CA 95051 oraz firmą Beckman.

Przykład Π

MODYFIKOWANE OLIGONUKLEOTYDY DO ZASTOSOWANIA W SONDACH

W celu zwiększenia swoistości albo efektywności hybrydyzacji, w procesach według niniejszego wynalazku można zastosować modyfikowane oligonukleotydy. W tym celu zamiast naturalnych nukleotydów stosuje się modyfikację zasad. Przykładowo, można zastosować pirymidyny z chlorowcem w pozycji C5. Uważa się, że poprawia to stabilność dupleksu przez wpływ na oddziaływanie ze sobą zasad. Może być również zastosowana 2,6-diaminopuryna, która powoduje powstanie trzeciego wiązania wodorowego w parowaniu jej z tyminą, stabilizując termicznie dupleks DNA. Zastosowanie 2,6-diaminopuryny prowadzi, jak to jest opisywane, do znacznego polepszenia stabilności dupleksu krótkich oligomerów. Jej wprowadzenie proponowane jest w celu umożliwienia stosowania bardziej surowych warunków anilingu, poprawiając

180 521 w ten sposób swoistość tworzenia dupleksu i zmniejszając problem tła lub zastosowania krótkich oligomerów.

Synteza trifosforanów tych zmodyfikowanych nukleotydów jest opisana przez Hoheisela i Lehracha (1990, załączone tu jako odnośnik). 5-chloro-2'-dezoksyurydyna i 2'-dezoksynukleozyd 2,6-diaminopurynowy zostały zakupione, przykładowo z firmy Sigma. Fosforylację przeprowadzono w niżej opisany sposób: 50 mg suchego 2-NH₂-dAdo dodano do 500 μΐ suchego fosforanu trietylu mieszając pod argonem. Dodano 25 μΐ POC1₃ i inkubowano mieszaninę w -20°C. 1 mmol kwasu pirofosforowego rozpuszczono w 0,95 ml tri-n-butylaminy i 2 ml metanolu i wysuszono w wyparce obrotowej. Następnie wysuszono przez dwukrotne odparowanie z 5 ml pirydyny dodając również przed drugim razem 70 μΐ tri-n-butylaminy. Na koniec rozpuszczono go w 2 ml bezwodnego dimetyloformamidu.

Po 90 minutach w -20°C, mieszaninę fosforylującą odparowano w celu usunięcia nadmiaru POC1₃ i dodano pirofosforanu tri-n-butyloamonowego w dimetyloformamidzie. Inkubowano przez 1,5 minuty w temp, pokojowej. Reakcję zatrzymano przez dodanie 5 ml 0,2 M wodorowęglanu trietyloamonowego (pH 7,6) i trzymano na lodzie przez 4 godziny. Dla 5-Cl-dUrd warunki są takie same, ale należy dodać 50 μΐ POC1₃ i przeprowadzić fosforylację w temperaturze pokojowej przez 4 godziny.

Po hydrolizie, mieszaninę odparowano, pH doprowadzono do 7,5, i ekstrahowano 1 objętością eteru dietylowego. Rozdzielenie produktów przeprowadzono na kolumnie Q-Sepharose (2,5x20 cm) przy użyciu liniowego gradientu wodorowęglanu trietyloamonowego od 0,15 M do 0,8 M. Przechowywane w postaci zamrożonej nukleotydy są stabilne przez dłuższy czas.

Można również zastosować niedyskryminujące analogi zasad, albo zasady uniwersalne, jak to opisali Nichols i in., (1994). Ten nowy analog, l-(2'-dezoksy-P-D-rybofuranozylo)-3-nitropirol (nazwany M), wytworzono do zastosowania w sondach oligonukleotydowych i starterach do rozwiązywania problemów powstających w wyniku degeneracji kodu genetycznego, albo gdy dostępna jest tylko fragmentaryczna sekwencja peptydowa. Analog ten maksymalizuje oddziaływanie między nukleotydami minimalizując oddziaływanie przez wiązanie wodorowe bez sterycznego zakłócania dupleksu DNA.

Analog nukleozydowy M opracowano w celu maksymalizacji oddziaływań typu „stacking” przy użyciu aprotonowych podstawników polarnych związanych z pierścieniami heeteroaromatycznymi, zwiększających wewnątrz- i międzyniciowe oddziaływania typu „stacking”, aby zmniejszyć rolę wiązań wodorowych w swoistości parowania zasad. Według Nicholsa i in., (1994) korzystny jest 3-nitropirolo 2'-dezoksyrybonukleozyd z powoduj ego strukturalnego i elektronowego podobieństwa do p-nitroaniliny, której pochodne należą do najmniejszych znanych interkalatorów dwuniciowego DNA.

Chroniony dimetoksytrytylem fosforamidyn nukleozydu M jest również dostępny do wbudowywania do nukleotydów stosowanych jako startery do sekwencjonowania i reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Nicols i in., wykazali, że znaczna liczba nukleotydów może być zastąpiona bez utraty swoistości startera.

Unikalną właściwością M jest zdolność do zastępowania długich ciągów nukleozydów i zapewniania mimo to funkcjonalnych starterów. Sekwencje z trzema, sześcioma i dziewięcioma podstawieniami M dają jak doniesiono, możliwe do odczytania drabinki sekwencji, zaś PCR z trzema różnymi starterami zawierającymi M dawała amplifikację prawidłowego produktu (Nichols i in., 1994).

Zdolność oligonukleotydów zawierających 3-nitropirol do działania jako startery stanowczo wskazuje, że struktura dupleksu musi się tworzyć z komplementarnych nici. Optyczne profile termiczne uzyskane dla par oligonukleotydów d(5'-C₂-T₅XT₅G₂-3^/) i d(5'-C₂A₅YA₅G₂-3'). (Gdzie X i Y oznaczają A, C, G, T albo M) mają jak doniesiono, normalny sigmoidalny wzorzec obserwowany przy przejściu DNA dwuniciowego w jednoniciowy. Wartości T_m oligonukleotydów zawierających pary zasad X M (gdzie X oznacza A, C, G albo T zaś Y oznacza M) zawierały się, jak doniesiono, w zakresie 3°C (Nichols i in., 1994).

180 521

Przykład ΠΙ

WYTWARZANIE SEKWENCJONUJĄCYCH CHIPÓW I MATRYC

Niniejszy przykład opisuje fizyczne wykonania sekwencjonujących chipów.

Podstawowy przykład stosuje 6-mery związane z 50 pm powierzchniami dając chip o wymiarach 3x3 mm, który może być łączony dając matrycę o wymiarach 20x20 cm. limy przykład stosuje oligonukleotydy 9-merowe przyłączone do powierzchni o wymiarach 10x10 pm tworząc 9-merowy chip o wymiarach 5x5 mm. 4000jednostek takiego układu można użyć do wykonania matrycy 30x30 cm. Fig. 2A, fig. 2B i fig. 2C przedstawiająjeszcze inny przykład matrycy, w której 4000 do 16000 układów zostało zorganizowanych w kwadratową matrycę. Płytka albo zbiór probówek, jak to również pokazano, może być zapakowany wraz z matrycą jako część zestawu do sekwencjonowania.

Matryce mogą być oddzielone od siebie fizycznie lub powierzchniami hydrofobowymi. Jednąz możliwości wykorzystania oddzielania paskami hydrofobowymi jest zastosowanie technologii jak np. Iso-Grid Microbiology System wytwarzanej przez QA Laboratories, Toronto, Canada.

Filtry membranowe z hydrofobową siatką (HGMF) stosuje się w analitycznej mikrobiologii żywności od około dziesięciu lat, gdzie wykazały swe unikalne zalety w rozszerzaniu zakresu możliwości i automatycznego zliczania kolonii. Jednąz dostępnych w handlu siatek jest ISOGRID z QA™ Laboratories LTD. (Toronto, Canada), która jest kwadratem (60x60 cm) polimeru polisulfonowego (Gelman Tuffiyn HT-450, wielkość porów 0,45p), na którym nadrukowano czarnym hydrofobowym barwnikiem siatkę składającą się z 1600 (40x40) kwadratowych komórek. Na HGMF uprzednio wysiewano zawiesinę bakterii przez filtrację pod ciśnieniem i inkubowano na wybranych podłożach różnicujących albo wybiórczych.

Ponieważ wzrost bakterii ograniczony był do komórek siatki o znanym położeniu i wielkości na błonie, HGMF działa bardziej jak urządzenie MPN niż jak konwencjonalna płyta czy filtr membranowy. Peterkin i in., donoszą, że HGMF mogą być użyte do propagacji i przechowywania bibliotek genomowych, jeżeli użyto replikatora HGMF. Jeden z instrumentów replikował wzrost każdej z 1600 komórek ISO-GRID umożliwiając wykonanie wielu kopii HGMF wyjściowego. (Peterkin i in., 1987).

Sharpe i in. (1989) również stosowali ISO-GRID HGMF z QA Laboratories i automatyczny licznik HGMF (MI-100 Interpreter) oraz replikator RP-100. Opisują oni technikę hodowli i przeglądania hodowli bakteryjnych.

Paterkin i in., opisali ostatnio sposób przeglądania sond DNA przy użyciu filtrów membranowych z hydrofobową siatką (Peterkin i in., 1989). Autorzy opisują metody wydajnej hybrydyzacji z koloniami bezpośrednio na HGMF. Uprzednio, uzyskiwano niezadowalające wyniki z powodu słabego wiązania się DNA z polimerem polisulfonowym, na którym wydrukowano HGMF. Jednakże Peterkin i in., (1989) donoszą, że wiązanie z powierzchnią błony poprawiono przez działanie na replikowaną! inkubowanąHGMF polietylenoiminą, polikationem uprzednio poddanym kontaktowi z DNA. Jakkolwiek ta wczesna praca stosowała wiązanie DNA komórkowego i miała różne cele w stosunku do niniejszego wynalazku, opisana metodologia może być łatwo zaadaptowana do Formatu 3 SBH.

W celu szybkiej identyfikacji użytecznych sekwencji, Peterkin i in., (1989) stosowali znakowany radioaktywnie plazmidowy DNA z różnych klonów i badali jego swoistość w stosunku do DNA na przygotowanych HGMF. W ten sposób DNA z plazmidów rekombinowanych był szybko przeglądany przez hybrydyzację kolonii w stosunku do 100 organizmów na replikatach HGMF, które mogą być łatwo i powtarzalnie przygotowane.

Dwa główne problemy wymagają rozwiązania. Manipulacja małymi (2-3 mm) chipami oraz równoczesne wykonanie tysięcy reakcji. Rozwiązaniem według wynalazku jest trzymanie układów i sond w odpowiadających sobie matrycach. W jednym z przykładów, chipy zawierające 250000 9-merów syntetyzowano na płytce krzemowej w postaci płytek 8x8 mM (15 μΜ/oligonukleotyd, Pease, i in., 1994) uformowane w matrycę 8x 12 (96 układów) z 1 mM rowkiem pomiędzy nimi. Sondy dodawano bądź pipetą wielokanałową bądź matrycą igłową, jedna sonda na układ.

180 521

Aby uzyskać 4000 6-merów zastosowano 42 matryce chipów, stosując różne, bądź stosując ten sam zestaw matryc kilkakrotnie.

W powyższym przypadku, stosuj ąc wcześniej sząnomenklaturę zgłoszenia, F=9; P=6; oraz F+P=l 5. Chipy mogąposiadać sondy o wzorze BxNn, gdzie x oznacza liczbę wymienionych zasad B, zaś n oznacza liczbę nie wymienionych zasad, tak, że x=4 do 10, zaś n= 1 do 4. Aby uzyskać bardziej wydajną hybrydyzację oraz uniknąć możliwego wpływu jakiegokolwiek z oligonukleotydów z podłoża, wymienione zasady mogą być otoczone przez niewymienione zasady, a więc przedstawia to wzór (N)nBx(N)m (fig. 4).

Przykład IV

WYTWORZENIE FRAGMENTÓW KWASU NUKLEINOWEGO

Sekwencje kwasu nukleinowego, który ma być sekwencjonowany, mogą być uzyskane z różnych źródeł jak cDNA, DNA genomowy, DNA chromosomałny, prążki chromosomalne wycięte mikrometodami, kosmidy albo wstawki YAC oraz RNA, a tym mRNA bez jakiegokolwiek etapu amplifikacji. Przykładowo, Sambrook i in., (1989) opisują trzy protokoły izolacji wielkocząsteczkowego DNA z komórek ssaczych.

Kwasy nukleinowe poddawane były fragmentacji jakąkolwiek ze znanych metod w tym przez zastosowanie enzymów restrykcyjnych jak to opisali 9,24-9,28 Sambrook i in., (1989), rozrywanie ultradźwiękami i działanie NaOH.

Odpowiednie jest również rozrywanie pod ciśnieniem jak to opisali Schriefer i in. W sposobie tym próbki DNA przepuszczane są przez małą prasę francuską z różnym ciśnieniem, od niskiego do pośredniego. Dźwignia umożliwia kontrolowane zastosowanie niskiego do pośredniego ciśnienia na komórkę. Wyniki tego badania pokazują, że rozrywanie niskim ciśnieniem jest użyteczną alternatywą dla metod fragmentacji w stosunku do sonikacji i enzymatycznego trawienia.

Jedną ze szczególnie korzystnych dróg fragmentacji DNA jest sposób stosujący rozpoznającądwie zasady endonukleazę Cvi JI, opisana przez Fitzgeralda i in., (1992). Autorzy opisali podejście polegające na gwałtownej fragmentacji i frakcjonowaniu DNA w szczególnym rozmiarze, ponieważ jest ono uważane za odpowiednie do klonowania typu „shot gun” czy sekwencjonowania. Autor przewiduje, że mogą być one bardzo odpowiednie do wytwarzania losowych ale względnie krótkich, fragmentów DNA do zastosowań technologii sekwencjonowania.

Endonukleaza restrykcyjna Cvi Ji normalnie tnie rozpoznawaną sekwencję PuGCPy pomiędzy G i C pozostawiając tępe końce. Nietypowe warunki reakcji, które zmienią swoistość enzymu (Cvi Ji**) powodują pseudolosowe rozmieszczenie fragmentów DNA w krótkiej cząsteczce pUC19 (2688 par zasad). Fitzgerald i in., (1992) określili ilościowo losowość tej strategii fragmentacji, przy użyciu trawienia pUC 19 przez Cvi JI** i rozdziale przez frakcjonowanie wielkości przez gwałtowną filtrację na żelu oraz bezpośrednią ligację bez naprawy końców do wektora do klonowania Ml 3 lacZ(-). Analiza sekwencji 76 klonów wykazała, że Cvi JI** rozpoznaje oprócz miejsc PuGCPy również PyGCPy i PuGCPu, oraz że dane nowej sekwencji są gromadzone w stopniu zgodnym z losową fragmentacją.

Jak to opisano w literaturze, zalety tego podejścia w porównaniu z sonikacjąi frakcjonowaniem na żelu obejmują: mniejszą niezbędną ilość DNA (0,2-0,5 pg zamiast 2-5 pg) oraz stosowanie mniej licznych etapów (nie jest wymagana preligacja, naprawa końców, ekstrakcja chemiczna czy elektroforeza na żelu agarozowym i elucja). Zalety te również są istotne podczas przygotowania DNA do sekwencjonowania Formatem 3.

Niezależnie od sposobu, w jaki uzyskane zostaną fragmenty kwasu nukleinowego, ważne jest by zdenaturować DNA powodując powstanie pojedynczych nici możliwych do hybrydyzacji. Uzyskuje się to przez inkubację roztworu DNA przez 2-5 minut w 80-90°C. Roztwór jest następnie szybko schładzany do 2°C, aby zapobiec renaturacji fragmentów DNA zanim wejdą w kontakt z układem scalonym. Grupy fosforanowe muszą być również usunięte z genomowego DNA jak to opisano w przykładzie VI.

180 521

Przykład V

WYTWARZANIE ZNAKOWANYCH SOND

Sondy oligonukleotydowe mogą być wytworzone rutynowo przez syntezę automatyczną przykładowo, przy użyciu układu Applied Biosystems. Alternatywnie, sondy mogą być wytworzone przez użyciu metod Genosys Biotechnologies Inc. przy użyciu zestawu porowatych warstw Teflonu.

Oligonukleotydy mogą być znakowane, przykładowo, znacznikiem radioaktywnym (³⁵S, ³²P, ³³P zaś najkorzystniej ³³P) dla matryc z półkami 100-200 pm albo 100-400 μτη; izotopami niepromieniotwórczymi (Jackobsen i in., 1990) albo fluoroforami (Brumbaugh i in., 1988). Wszystkie te sposoby znakowania są rutyną w tej dziedzinie techniki, jak o tym świadczą odpowiednie rozdziały w Sambrook i in., (1989) oraz inne odnośniki jak Schubert i in., (1990), Murakami i in., (1991) oraz Cate i in., (1991).

W odniesieniu do znakowania radioaktywnego, powszechnąmetodąjest znakowanie końców przy użyciu kinazy polinukleotydowej T4 albo znakowanie w wysokiej aktywności właściwej przy użyciu fragmentu Klenowa albo nawet polimerazy T7. Opisane są one poniżej.

Oligonukleotydy syntetyczne wytwarzane sąbez grupy fosforanowej na ich końcu 5' i stąd mogą być łatwo znakowane przez przeniesienie γ-³²Ρ czy γ-³³Ρ z [γ-³²Ρ]ΑΤΡ albo [γ-³³Ρ]ΑΤΡ przy użyciu enzymu kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4. Jeżeli reakcja przeprowadzana jest wydajnie, aktywność właściwa takich sond może być tak wysoka jak aktywność samych [γ-³²Ρ] ATP albo [γ-³³Ρ] ATP. Reakcja opisana poniżej opracowana jest do wyznakowania 10 pmoli oligonukleotydu z wysoką aktywnością właściwą. Znakowanie różnych ilości oligonukleotydu może być łatwo uzyskane przez zwiększanie lub zmniejszanie rozmiarów reakcji utrzymując stałe stężenia składników.

Mieszanina reakcyjna może być wytworzona przy użyciu 1,0 pl oligonukleotydu (10 pmoli/pl); 2,0 pl 10x buforu kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4; 5,0 pl [γ-³²Ρ]ΑΤΡ albo [γ -³³P] ATP (aktywność właściwa 5000 Ci/mol; roztwór wodny 10 mCi/ml) (10 pmoli) oraz 11,4 pl wody. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się osiem (8) jednostek (~1 pl) kinazy polinukleotydowej bakteriofaga T4, dobrze miesza i inkubuje przez 45 minut w 37°C. Mieszaninę reakcyjną ogrzewa się przez 10 minut do temp. 68°C w celu inaktywacji enzymu.

Następnie oznacza się efektywność transferu ³²P albo ³³P na oligonukleotyd oraz jego aktywność właściwą Jeżeli aktywność właściwa sondy jest odpowiednia, sondę oczyszcza się. Jeżeli aktywność właściwa jest zbyt niska, dodaje się dodatkowe 8 jednostek enzymu i inkubuje przez kolejne 30 minut w 37°C, po czym podgrzewa do 68°C przez 10 minut, aby inakty wować enzym.

Oczyszczanie znakowanego radioaktywnie oligonukleotydu można wykonać przez precypitację etanolem, precypitację bromkiem cetylopirydyniowym albo przez chromatografię na kolumnie Sep-Pak C₁₈.

Sondy o wysokich aktywnościach właściwych mogą być uzyskane przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA z E. coli, syntetyzując nić DNA komplementarną do syntetycznego oligonukleotydu. Krótki starter hybrydyzuje się z matrycą ołigonukleotydową której sekwencja jest komplementarna do żądanej sondy oligonukleotydowej. Starter jest następnie wydłużany przy użyciu fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli wbudowując [a-³²P]dNTP albo [a-³³P]dNTP w sposób zależny od matrycy. Po reakcji produkt i matryca rozdzielane sąprzez denaturację, a następnie elektroforezę na żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących. Metodą tą można wytworzyć sondy oligonukleotydowe zawierające kilka atomów radioaktywnych na cząsteczkę oligonukleotydu.

Stosując tą metodę można zmieszać w probówce obliczoną ilość [a-³²P]dNTP albb [a-³³P]dNTP potrzebną do uzyskania pożądanej aktywności właściwej i wystarczającej do kompletnej syntezy wszystkich nici matrycy. Stężenia dNTP nie powinny być na żadnym etapie syntezy mniejsze niż 1 μΜ. Następnie dodaje się do probówki odpowiednią ilość startera i DNA matrycowych, przy czym stężenie molowe startera powinno trzy- do dziesięciokrotnie przewyższać stężenie molowe matrycy.

180 521

Następnie dodaje się 0,1 objętości 10x bufora Klenowa i dobrze miesza. Następnie dodaje się na 5 pl obj ętości mieszaniny reakcyjnej 2-4 jednostki fragmentu Klenowa polimerazy I DNA E. coli, miesza, i inkubuje przez 2-3 godziny w 4°C. W razie potrzeby, przebieg reakcji może być monitorowany przez pobieranie małych (0,1 pl) porcji i mierzenie ilości radioaktywności, która precypituje pod wpływem 10% kwasu trój chlorooctowego (TCA).

Następnie reakcję rozcieńcza się równą objętościąbuforu do nakładania na żel, podgrzewa do 80°C przez 3 minuty i nakłada całą próbkę na denaturujący żel poliakrylamidowy. Po elektroforezie, żel poddaj e się autoradiografii, lokalizuje próbkę na żelu i pobiera. Możliwe są również różne metody znakowania fluoroforowego. Brombaugh i in., (1988) opisuje syntezę starterów znakowanych fluorescencyjnie. Syntetyzowany jest analog dezoksyurydyny z „ramieniem łączącym” amin pierwszorzędowych zbudowanym z 12 atomów przyłączonym do C-5. Synteza analogu obejmuje przeprowadzenie 2'-dezoksyurydyny przez przejściowe związki metaloorganiczne do 5'-(metylo-propenolo)-2'-dezoksyurydyny. Reakcja z chlorkiem dimetoksytiytylu wytwarza odpowiednie ugrupowanie 5'-dimetoksytrytylowe. Ester metylowy jest hydrolizowany, aktywowany i poddany reakcji z odpowiedniąmonoacylowanąalkilodiaminą. Po oczyszczaniu powstałe nukleozydy ramienia łączącego przekształcane są w analogi nukleozydów odpowiednie do chemicznej syntezy oligonukleotydów.

Następnie wytwarza się oligonukleotydy zawierające jedną lub dwie zasady ramienia łączącego. Do roztworu 50 nmoli nukleotydów ramienia łączącego w 25 μΐ 500 mM wodorowęglanu sodu (pH 9,4) dodaje się 20 pl 300 mM FITC w DMSO. Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 6 godzin. Oligonukleotyd oddzielany jest od wolnego FITC przez elucję z kolumny z Sephadex'u G-25 (1x30 cm) przy użyciu 20 mM octanu amonu (pH 6,0) łącząc frakcje pierwszego szczytu absorbcji UV.

Ogólnie, znakowanie fluorescencyjne oligonukleotydów na końcu 5' obejmuje początkowo dwa etapy. Najpierw, podczas automatycznej syntezy oligonukleotydów do ich końca 5' dodaje się N-chronioną aminoalkilową pochodną fosforamidynu. Po usunięciu wszystkich grup ochronnych, ester NHS odpowiedniego barwnika fluorescencyjnego sprzęgany jest z grupą aminową końca 5', przez noc, po czym znakowany oligonukleotyd oczyszczany jest z nadmiaru barwnika przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami albo PAGE.

Schubert i in., (1990) opisali syntezę fosforamidynu umożliwiającą wytwarzanie oligonukleotydów znakowanych fluoresceiną podczas automatycznej syntezy DNA. Ester metylowy fluoresceiny jest alkilowany przy użyciu 4-chloro(4,4'-dimetoksytrytylo)-butanolu-l w obecności K₂CO₃ i KI w DMF przez 17 godzin, Po usunięciu grupy trytylowej przy użyciu 1% TFA w chloroformie, produkt jest fosfitylowany standardową procedurą z użyciem bis(diizopropyloamino)metoksyfosfmy. Fosforylacja wyżej opisanej pochodnej fluoresceiny prowadzi do powstania fosfonianu-H w dopuszczalnych ilościach. Powstały amidyn (0,1 M roztwór w suchym acetonitrylu) używany jest do automatycznej syntezy różnych starterów przy użyciu chemii β-cyjanoetylofosforamidynu i urządzenia do syntezy DNA. Odcięcie od podłoża i usunięcie grup ochronnych przeprowadza się z użyciem 25% wodnego amoniaku przez 36 godzin w temperaturze pokojowej. Surowy produkt oczyszcza się przez PAGE, zaś znakowany starter widoczny jest przy 310 nm jako blado-zielony fluorescencyjny prążek. Elucja i odsalanie przy użyciu wkładu RP 18 daj e pożądany produkt.

Znakowanie fluorescencyjne końca 5' sondy w metodzie Schuberta jest uzyskiwane bezpośrednio podczas syntezy DNA w ostatnim cyklu sprzęgania. Efekt sprzęgania jest równie duży jak z normalnymi fosforamidynami. Po usunięciu grup ochronnych i amoniaku przez liofilizację w wirówce próżniowej albo precypitacji etanolem znakowane fluorescencyjnie oligonukleotydy mogą być bezpośrednio użyte do sekwencjonowania DNA w Formacie 3 SBH.

Murakami i in., również opisująwytworzenie znakowanych fluorescencyjnie oligonukleotydów. Synteza ta opiera się na fosforamidynie na podłożu polimerowym i wodorofosfonianie. Jako łącznika używa się etylenodiaminy albo heksametylenodiaminy. Są one wprowadzane poprzez wiązanie fosforamidynowe, które zostało wytworzone przez utlenianie przejściowego wodorofosfonianu w roztworze CC1₄. Modyfikowane oligonukleotydy podawane są znakowaniu przy

180 521 użyciu odczynnika skierowanego na aminę pierwszorzędową, FITC, na podłożu z perełek. Powstały modyfikowany oligonukleotyd odcinany jest od perełek i oczyszczany przez HPLC.

Cate i in., (1991) opisują zastosowanie sond oligonukleotydowych bezpośrednio sprzężonych z fosfatazą alkaliczną w połączeniu z bezpośrednio chemiluminescencyjnym podłożem (AMPPD) w celu umożliwienia wykrycia sondy. Fosfataza alkaliczna może być kowalencyjnie wiązana z modyfikowaną zasadą oligonukleotydu. Po hybrydyzacji, oligonukleotyd może być inkubowany z AMPPD. Fosfataza alkaliczna rozkłada AMPPD tworząc związek powodujący fluorescencję bez pobudzenia tzn. nie jest konieczny laser. Uważa się, że tątechnologiąmoże być uzyskany silny sygnał.

Znakowane sondy, zamiast wytwarzania, mogą być łatwo zakupione z wielu źródeł np. w GENSET.

Przykład VI

USUWANIE GRUP FOSFORANOWYCH

Zarówno bakteryjna fosfataza alkaliczna (BAP) jak i cielęca jelitowa fosfataza alkaliczna (CIP) katalizująusuwanie 5'-końcowych grup fosforanowych z DNA i RNA. Są więc odpowiednie do usuwania 5'-końcowych fosforanów z DNA i/lub RNA w celu zapobieżenia ligacji nieodpowiedniej hybrydyzacji. Usuwanie fosforanów, jak opisane przez Sambrooka i in., (1989), może być wykonane po cięciu czy innym rozrywaniu genomowego DNA.

BAP jest bardziej aktywna spośród obu fosfataz alkalicznych, ale jest również daleko bardziej odporna na ogrzewanie i detergenty. Stąd, jest znacznie trudniejsze całkowite zahamowanie BAP pod koniec reakcji de fosforylacji. Do trawienia CIP, która musi być całkowicie usunięta jeżeli następująca ligacja ma zachodzić wydajnie, stosuje się proteinazę K. Alternatywną metodą jest inaktywacja CIP przez ogrzewanie do 65°C przez 1 godzinę (albo 75°C przez 10 minut) w obecności 5 mM EDTA (pH 8,0), a następnie oczyszczenie defosforylowanego DNA przez ekstrakcje mieszaniną fenoh.chlorofonn.

Przykład VII

PRZEPROWADZENIE SEKWENCJONOWANIA DWUETAPOWĄ HYBRYDYZACJĄ

Niżej opisane zostały szczególne przykłady opisujące wykonanie sekwencjonowania metodologią zamierzoną przez wynalazców. Najpierw cały chip jest hybrydyzowany z mieszaniną DNA złożoną ze 100 milionów bp (ludzki chromosom). Wskazówki do przeprowadzenia hybrydyzacji można znaleźć w publikacji Drmanac i in., (1990); Khrapko i in., (1991) oraz Broude i in., (1994). Publikacje te informują o zakresie temperatur hybrydyzacji, buforach i etapach płukania odpowiednich do stosowania w początkowych etapach SBH Formatu 3.

Szczególnym zamierzeniem wynalazców było przeprowadzenie hybrydyzacji w ciągu kilku godzin przy wysokim stężeniu soli i w niskiej temperaturze (-2°C do 5°Ć) z powodu względnie niskiego stężenia docelowego DNA. Z tej przyczyny stosuje się bufor SSC zamiast buforu fosforanu sodu (Drmanac i in., 1990), który precypituje w 10°C. Płukania nie muszą być intensywne (kilkuminutowe) z powodu drugiego etapu, i mogą być wyeliminowane, gdy stosuje się hybrydyzację cykliczną do sekwencjonowania bardzo złożonych próbek DNA. Ten sam bufor jest stosowany do hybrydyzacji i etapów płukania podczas etapu drugiej hybrydyzacji ze znakowanymi sondami.

Po odpowiednim płukaniu przy użyciu prostego robota, na każdą matrycę, np. 8x8 mm (przykład III) nakładana jest jedna znakowana sonda, np. 6-mer. Można to przeprowadzić w 42 operacjach, stosując urządzenie 96-końcówkowe lub 96-igłowe. Ponownie, zastosowany być może szeroki zakres warunków rozróżniających, jak to uprzednio opisano w literaturze naukowej.

Szczególnie rozważano zastosowanie następujących warunków. Po pierwsze, po dodaniu znakowanych sond i kilkuminutowej inkubacji (z powodu wysokiego stężenia dodanych oligonukleotydów) w niskiej temperaturze (0-5°C) temperaturę podnosi się do 3-10°C, zależnie od długości F+P i dodaje się buforu płuczącego. W tym momencie bufor płuczący jest kompatybilny z buforem do ligacji (np. 100 mM stężenie soli). Po dodaniu ligazy temperaturę podnosi się do 15-37°C w celu umożliwienia szybkiej ligacji (poniżej 30 minut) i dalszej dyskryminacji w pełni zgodnych i niezgodnych hybryd.

180 521

Rozważa się również zastosowanie detergentów kationowych rozważane w SBH Formatu 3, jak to opisali Pontius i Berg (1991, załączone tu jako odnośnik). Autorzy opisali zastosowanie dwóch prostych detergentów kationowych, bromku dodecylo- i cetylotrimetyloamonoamoniowego (DTAB i CTAB) w renaturacji DNA.

DTAB i CTAB są odmianami aminy czwartorzędowej bromku tetrametyloamoniowego (TMAB), w którym jedna z grup metylowych została podstawiona przez grupę alkilową o 12 (DTAB) lub 16 atomach węgla (CTAB). TMAB jest solą bromkową jonu tetrametyloamoniowego, odczynnika używanego w doświadczeniach nad renaturacją kwasu nukleinowego do obniżania wpływu zawartości G-C na temperaturę topnienia. DTAB i CTAB sąpodobne pod względem budowy do dodecylosiarczanu sodu (SDS) z zamianą ujemnie naładowanego siarczanu w SDS na dodatnio naładowaną aminę czwartorzędową. Podczas, gdy SDS jest powszechnie stosowany w buforach hybrydyzacyjnych w celu zmniejszenia wiązania niespecyficznego i zahamowania nukleaz, nie ma on dużego wpływu na stopień renaturacji.

Enzym w procesie ligacji, może być dodany wraz ze znakowanymi sondami albo, w celu zmniejszenia tła, po etapie płukania.

Aczkolwiek technologii ligacji nie proponowano w żadnym ze sposobów SBH, jest ona dobrze ugruntowana w dziedzinie biologii molekularnej. Przykładowo, Hood i współpracownicy opisali technikę wykrywania genu metodą opartą na ligazie (Landegren i in., 1988), której metodologia może być łatwo zastosowana w SBH Formatu 3. Ledergren i in., opisujątest obecności danej sekwencji DNA oparty na zdolności dwóch oligonukleotydów do bezpośrednio stycznej hybrydyzacji na komplementarnej docelowej cząsteczce DNA. Dwa oligonukleotydy łączą się wtedy kowalencyjnie przez działanie ligazy DNA, pod warunkiem, że nukleotydy na styku są prawidłowo sparowane. Aczkolwiek sytuacji takiej nie brano pod uwagę, wystąpiła ona w sekwencjonowaniu w Formacie 3. Wu i Wallace również opisali zastosowanie ligazy DNA bakteriofaga T4 w celu połączenia dwóch stycznych, krótkich, syntetycznych oligonukleotydów. Reakcję ligacji oligonukleotydów przeprowadzono w 50 mM Tris-HCl o pH 7,6,10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT i 5% PEG. Reakcję ligacji podgrzano do 100°C przez 5-10 minut, a następnie schłodzono do 0°C przed dodaniem ligazy DNA T4 (1 jednostka; Bethesda Research Laboratory). Większość reakcji ligacji przeprowadzona została w 30°C i przerwana przez podgrzanie do 100°C przez 5 minut.

Następnie przeprowadza się płukanie końcowe odpowiednie dla rozróżniającego wykrycia zhybrydyzowanych stycznie lub ligowanych oligonukleotydów o długości (F+P). Ten etap płukania prowadzi się w wodzie przez kilka minut w temperaturze 40-60°C w celu odpłukania niezligowanej znakowanej sondy i innych składników, aby zminimalizować tło. Z powodu znakowanych oligonukleotydów związanych kowalencyjnie wykrywanie jest ułatwione (nie ma ograniczeń dotyczących czasu i niskiej temperatury).

Zależnie od zastosowanego znacznika, wizualizację chipów przeprowadza się, stosując różne urządzenia. Dla znaczników radioaktywnych może być zastosowana technologia fosforowego ekranu gromadzącego oraz Phosphorlmager jak również skaner (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). Chip umieszczony jest w kasecie i przykrywany ekranem fosforowym. Po 1-4 godzin ekspozycji, ekran jest skanowany zaś obraz gromadzony na twardym dysku komputera. Do wykrywania znaczników fluorescencyjnych stosowane są kamery CCD oraz mikroskopia epifluorescencyjna albo konfokalna. W przypadku chipów wytworzonych bezpośrednio na elementach optycznych kamery CCD wykrywanie może się odbywać jak to opisano przez Eggersa i in., (1994, załączone tu jako odnośnik).

Detektory CCD (Charge coupled device) służąjako aktywna podstawa wykrywająca ilościowo i obrazująca rozmieszczenie cząsteczek docelowych w testach opartych na sondach. Urządzenia te stosują charakterystykę właściwą mikroelektronice co umożliwia równoległe badanie, niezwykle czułe wykrywanie, znaczną przepustowość, zintegrowane zbieranie danych i obróbkę komputerową. Eggers i in., (1994) opisuje CCD do zastosowania w testach opartych na sondach, jaknp. SBH Formatu 3, według niniejszego wynalazku, umożliwiające ilościową analizę w ciągu sekund z powodu wysokiej czułości i zastosowanemu bezpośredniemu sprzężeniu.

180 521

Podejście oparte na zintegrowanym wykrywaniu przy użyciu CCD umożliwia wykrywanie zjawiska wiązania molekularnego na układzie scalonym. Detektor błyskawicznie tworzy dwuwymiarową matrycę, która charakteryzuje próbkę w unikalny sposób. W specyficznych zastosowaniach detektora molekularnego opartego na CCD, różne sondy biologiczne unieruchamiane są bezpośrednio na elementach optycznych CCD albo mogą być przyłączane na jednorazowych szkiełkach mikroskopowych umieszczanych na powierzchni CCD. Cząsteczki próbki mogą być znakowane radioizotopami, albo znacznikami chemiluminescencyjnymi albo fluorescencyjnymi.

Po ekspozycji próbki na matrycę sond opartych na CCD, fotony lub produkty rozpadu radioizotopów emitowane sąna tym elemencie optycznym, na którym została związana próbka, w przypadku Formatu 3, do dwóch komplementarnych sond. Następnie, jeżeli gdy naładowane cząstki lub promieniowanie ze znakowanej próbki znajdzie się w bramkach CCD, w krzemie powstająpary dziur elektronowych. Elektrony sągromadzone na przylegającej bramce CCD i kolejno odbierane na ekranie. Liczba wytworzonych fotoelektronów na każdym elemencie obrazu jest bezpośrednio proporcjonalna do liczby zaistniałych w pobliżu wiązań molekularnych. Następnie, wiązanie molekularne może być określone ilościowo (Eggers i in., 1994).

Jak ostatnio doniesiono, CCD oparte na krzemie posiadają zalety jako stałofazowe czujniki i detektory, głownie z powodu znacznej czułości urządzeń w szerokim zakresie długości fal (od 0,1 do 1000 nm). Krzem również dobrze odpowiada na promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie od widma widzialnego do miękkich promieni X. W zakresie światła widzialnego obecność pojedynczego fotonu na bramce CCD powoduje pojedynczy pakiet elektronów poniżej bramki. Pojedynczna cząsteczka beta miękkiego promieniowania X (zwykle w zakresie od KeV do MeV) powoduje od tysięcy do dziesiątków tysięcy elektronów. Dodatkowo, oprócz wysokiej czułości CCD opisane przez Eggersa i in., (1994) oferują szeroki zakres dynamiczny (4 do 5 rzędów wielkości) ponieważ możliwy do wykrycia pakiet elektronów zawiera się w zakresie od pojedynczych do 10⁵elektronów. Odpowiedź jest liniowa w szerokim zakresie dynamicznym

Przez umieszczenie matrycy obrazującej w pobliżu próbki, efektywność zbierania polepsza się co najmniej 10-krotnie w stosunku do techniki opartej na.soczewkach, jak ma to miejsce w konwencjonalnych kamerach CCD. Oznacza to, że próbka (emiter jest w bliskim kontakcie z detektorem (macierzą obrazującą), a to elimuje konwencjonalną optykę jak soczewki czy lustra.

Gdy do cząsteczek docelowych przyłączone są, jako grupy reporterowe, radioizotopy, wykrywane są cząsteczki energetyczne. W zastosowaniach z detektorami wykonanymi w skali mikro użyto z powodzeniem kilku grup reporterowych emitujących cząstki o różnej energii. Obejmująone ³²P, ³³P, ^3:>S, ¹⁴C i ¹²⁵L Wyższa energia cząsteczki, jak np. z ³²P, zapewnia najwyższą czułość detekcji molekularnej, podczas gdy cząsteczki o niższej energii jak np. ³⁵S zapewniają lepszą rozdzielczość. Stąd, wybór reportera radioizotopowego może być dobierana do wymagań. Gdy zostanie wybrany pewien znacznik radioizotopowy, wydajność wykrywania może być określona przez obliczenie stosunku sygnału do tła (SNR) jak to opisano przez Eggersa i in., (1994).

Alternatywny proces detekcji luminescencyjnej obejmuje zastosowanie grup reporterowych chemiluminescencyjnych albo fluorescencyjnych przyłączonych do cząsteczek docelowych. Znaczniki fluorescencyjne mogą być przyłączane kowalencyjnie albo przez oddziaływanie. Barwniki fluorescencyjne jak np. bromek etydyny z intensywnym pasmem absorbcji w zakresie bliskiego UV (300-350 nm) i głównym pasmem emisji w zakresie widzialnym (500-650 nm) są najodpowiedniejsze dla urządzeń CCD ponieważ efektywność kwantowa jest o kilka rzędów wielkości niższa przy długościach fal pobudzających niż przy długościach fal sygnału fluorescencyjnego. ’

Z perspektywy wykrywania luminescencji krzemowe bramki CCD posiadają wbudowaną możliwość filtrowania wpływu przypadkowego światła w zakresie UV, ale są bardzo wrażliwe na widzialną luminescencję powodowaną fluorescencyjnymi grupami reporterowymi. To charakterystyczne rozróżnianie w stosunku do UV umożliwia olbrzymi SNR (wyższy niż 100) osiągany przez CCD wykonane jak to opisano w załączonej publikacji (Eggers i in., (1994).

180 521

Do unieruchamiania sond na detektorze, matryce hybrydyzacyjne mogą być wytwarzane na niedrogich płatkach SiO₂, które następnie umieszcza się na powierzchni CCD, po hybrydyzacji i wysuszeniu. Ten format jest wydajny ekonomicznie ponieważ hybrydyzacja DNA przeprowadzana jest na niedrogich jednorazowych płatkach SiO₂, umożliwiając w ten sposób ponowne zastosowanie bardziej drogiego detektora CCD. Alternatywnie, sondy mogą być unieruchamiane bezpośrednio na CCD tworząc dedykowaną matrycę sond.

W celu unieruchomienia sond pod powierzchnią powłoki SiO₂, jednorodną warstwę epoksydową łączy się z warstwąpowierzchniową, używając odczynnika epoksy-krzemionkowego i standardowego chemii modyfikującej SiO₂. Sondy oligonukleotydowe modyfikowane aminą wiązane są z powierzchnią SiO₂ poprzez tworzenie amin drugorzędowych z pierścieniem epoksydowym. Powstałe połączenie zapewnia 17 obracalnych wiązań odstępu pomiędzy zasadą końca 3' oligonukleotydu i powierzchnią SiO₂. W celu zapewnienia całkowitej deprotonacji aminy oraz by zminimalizować tworzenie się struktur drugorzędowych podczas sprzęgania, reakcję przeprowadza się w 0,1 Μ KOH i inkubuje się w 37°C przez 6 godzin.

W SBH Formatu 3, ogólnie, sygnały zbierane są z każdego z miliarda punktów. Może nie być konieczne hybrydyzowanie wszystkich matryc, np. 4000 5x5 mm, w tym samy czasie i możliwe jest stopniowe korzystanie z mniejszej liczby matryc.

Hybrydyzacje cykliczne są metodą umożliwiającą wzmocnienie sygnału. W jednym cyklu, większość przytwierdzonej sondy zhybrydyzuje z fragmentami DNA z sekwencjami ogona niekomplementamymi do sondy znakowanej. Przez podwyższenie temperatury, hybrydy te zostaną roztopione (fig. 3). W następnym cyklu, niektóre z nich (~0,1 %) zhybrydyzująz odpowiednim fragmentem DNA i dodatkowe wyznakowane sondy zostaną poddane ligacji. W tym przypadku, nastąpi topienie rozróżniające stapianie hybryd DNA z niezgodnościami dla, równocześnie, obu sond.

W hybrydyzacji cyklicznej, wszystkie składniki dodawane sąprzed rozpoczęciem cyklizacji w 37°C dla T4, albo w wyższych temperaturach dla ligazy termostabilnej. Następnie temperatura jest obniżana do 15-37°C i chipów jest inkubowany przez 10 minut, a następnie temperatura podwyższana jest do 37°C lub więcej na parę minut, a następnie ponownie obniżana. Cykle powtarzane są do 10 razy. W jednej z odmian, optymalna wysoka temperatura (10-50°C) może być zastosowana bez cyklizacji i może być wykonana dłuższa reakcja ligacji (1-3 godziny).

Opisana tu procedura umożliwia kompletne wytwarzanie chipu w oparciu o standardową syntezę i precyzyjne nakładanie oligonukleotydów, ponieważ wymagana jest stosunkowo niewielka liczba oligonukleotydów. Przykładowo, jeżeli zostanązsyntetyzowane wszystkie 7-mery (16384 sondy) może zostać określona lista 256 milionów 14-merów.

Ważną odmianą wynalazku jest zastosowanie więcej niż jednej odmianie znaczonej sondy na podstawową matrycę. Może to zostać wykonane z dwóch przyczyn: zwielokrotnienia w celu zmniejszenia liczby hybrydyzowanych osobno matryc albo w celu określenia jeszcze dłuższych sekwencji oligonukleotydowych jak 3x6 albo 3x7. W takim przypadku jeżeli zastosowane zostaną dwa znaczniki, swoistość trzech kolejnych oligonukleotydów może być niemalże całkowita ponieważ miejsca pozytywne muszą mieć wystarczającą ilość sygnału dla obu znaczników.

Dalsząi dodatkowąodmianąjest zastosowanie chipów zawierających BxNy sond, gdzie y zawiera się w zakresie od 1 do 4. Układy te zapewniają możliwość odczytywania sekwencji w różnych ramkach. Może to być również osiągnięte przez zastosowanie odpowiedniego zestawu znakowanych sond albo obie sondy F i P mogą posiadać pewne nieswoistej pozycje końcowe (tzn. pewne elementy końcowej degeneracji). Mogą być również użyte zasady uniwersalne jako część łącznika do połączenia sond o zdefiniowanej sekwencji z podłożem stałym. Czyni to sondę bardziej dostępną hybrydyzacji i powoduje większą stabilność konstruktu. Jeżeli sonda jest 5-merem, można np. zastosować zasady uniwersalne jak łącznik (fig. 4).

Przykład VIII

ANALIZA UZYSKANYCH DANYCH

Pliki obrazu są analizowane programem do analizy obrazu, jak np. DOTS (Drmanac i in., 1993) oraz skalowane i badane przez włączone funkcje statystyczne np. programem SCORES

180 521 (Drmanac i in., 1994). Z rozmieszczenia sygnałów określany jest optymalny próg do przekształcenia sygnału w wynik +/-.

Z położenia wykrytej sondy, mogą być oznaczone sekwencje F+P fragmentów, przez połączenie znanych sekwencji sondy unieruchomionej i znakowanej, odpowiadających wyznakowanemu położeniu. Kompletna sekwencja kwasu nukleinowego albo fragmentów sekwencji oryginalnej cząsteczki, jak np. ludzkiego chromosomu, może być skojarzona z nakładających się sekwencji F+P przez dedukcję.

Jedną z ewentualności jest przekształcenie sygnałów hybrydyzacji np. wartości, w wynik +/- podczas procesu kojarzenia sekwencji. W tym przypadku, kojarzenie zaczyna się od sekwencji F+P o bardzo dużej wartości, przykładowo sekwencja F+P AAAAAATTTTTT (Identyfikator Sekw. nr 1). Wartości wszystkich czterech prawdopodobnych nakładających się sond: AAAAATTTTTTA (Identyfikator Sekw. nr 3), AAAAATTTTTTT (Identyfikator Sekw. nr 4), AAAAATTTTTTC (Identyfikator Sekw. nr 5) i AAAAATTTTTTG (Idenyfikator Sekw. nr 6) oraz trzech dodatkowych sond różniących się na początku (ΤΑΑΑΑΑΤΊΤΤΊΤ, Identyfikator Sekw. nr 7; CAAAAATTTTTT, Identyfikator Sekw; nr 8; GAAAAATTTTTT, Identyfikator Sekw. nr 9) są porównywane i definiowane są trzy wnioski: (i) wyłącznie sonda wyjściowa oraz jedna z czterech nakładających się sond uzyskały wartość różniącą się znacznie od pozostałych sześciu, w tym wypadku sekwencja AAAAAATTTTTT (Identyfikator Sekw. nr 1) będzie rozszerzać się w prawo; (ii) żadna sonda, z wyjątkiem sondy wyjściowej nie uzyskała znaczącej wartości pozytywnej, kojarzenie należy zakończyć, np. sekwencja AAAAAATTTTTT (Identyfikator Sekw. nr 1) znajduje się na końcu cząsteczki DNA, która jest sekwencjonowana; (iii) istnieje więcej niż jedna pozytywna sonda wśród sond nakładających się i/lub inne trzy sondy zostały znalezione; kojarzenie jest zatrzymywane z powodu błędu rozgałęziania (Drmanac i in., 1989).

Proces dedukcji komputerowej używa programów komputerowych stosujących istniejące algorytmy (patrz, np. Pevzner, 1989; Drmanac i in., 1991; Labat i Drmanac, 1993; wszystkie załączone tu jako odnośniki).

Jeżeli, dodatkowo do sekwencji F+P stwierdzone zostanąF(ł odstęp)P, F(2 odstępy)P, F(3 odstępy)P i F(4 odstępy)P, zostaną zastosowane algorytmy do połączenia wszystkich zestawów danych w celu korekcji możliwego błędu albo rozwiązania sytuacji, gdy istnieje problem rozgałęziania (patrz, np. Drmanac i in., 1989; Bains i in., 1988; załączone tu jako odnośniki).

Przykład IX

PONOWNE UŻYCIE SEKWENCJONUJĄCYCH CHIPÓW

Jeżeli w procesie sekwencjonowania stosowana jest ligacja, zwykły oligonukleotydowy układ scalony nie może być natychmiast użyty. Wynalazca uważa, że może to być przezwyciężone kilkoma sposobami.

Jako drugiej sondy, sondy P, można użyć rybonukleotydu, a więc może być ona usunięta przez działanie RN Azą. działanie RN Azą może wykorzystywać RNAzę A, rybonukleazę, która swoiście atakuje reszty pirymidynowe jednoniciowego RNA z końca 3' i przecina wiązania fosforanowe przylegającego nukleotydu. Produktami końcowymi są 3' fosforany pirymidyny i oligonukleotydy z końcowym 3' fosforanem pirymidyny. RNAza A pracuje pod nieobecność kofaktorów i kationów dwuwartościowych.

Wykorzystując RNAzę, ogólnie, inkubuje się chip w odpowiednim buforze zawierającym RNAzę, jak to opisano w Sambrook i in., (1989; załączone tu jako odnośnik). Odpowiednie jest zastosowanie 30-50 μΐ buforu zawierającego RNAzę na matrycę 8x8 mm albo 9x9 mm w 37°C przez 10 i 60 minut. Następnie płucze się buforem hybiydyzacyjnym.

Jakkolwiek nie stosowane szeroko, możliwe jest użycie, w specyficznych wykonaniach, zasady uracylowej, jak to opisano w Craig i in., (1989), załączone tu jako odnośnik. Zniszczenie połączenia ligowanych sond, w celu odzyskania chipu, można byłoby osiągnąć przez trawienie enzymem naprawczym E. coli, glikozylaząuracylo-DNA, która usuwa uracyl z DNA.

Można również wytworzyć swoiście cięte wiązanie pomiędzy sondami i przecinać to wiązanie po wykryciu. Przykładowo, może to być wykonane przez ligację chemiczną opisaną przez Shabarowa i in., (1991) oraz Dolinnaya i in., (1988), załączone tu jako odnośniki.

Schabarowa i in., (1991) opisująkondensację oligodezoksyrybonukleotydów z bromkiem cyjanu jako czynnikiem kondensującym. W jednoetapowej reakcji ligacji, oligonukleotydy podgrzewane są do 97°C, powoli schładzane do 0°C po czym dodawany jest 1 μΐ 10 M BrCN w acetonitrylu.

Dolinnaya i in., (1988) pokazuje, w jaki sposób wprowadzić do dupleksów DNA międzyniciowe wiązanie fosforamidynowe i pirofosforanowe. Używająrównież metod ligacji chemicznej do modyfikacji zrębu DNA z fosforanów cukrów, przy użyciu rozpuszczalnego w wodzie karbodiimidu (CDI) jako czynnika sprzęgającego. Selektywne cięcie wiązań fosfoamidynowych obejmuje inkubację z 15% CH₃COOH przez 15 minut w 95°C. Selektywne cięcie wiązania pirofosforanowego obejmuje inkubację w mieszaninie pirydyny i wody (9:1) i świeżo destylowanym (CF₃CO)₂O.

180 521

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE:

(i) ZGŁASZAJĄCY:

NAZWA: ARCH DEVELOPMENT CORPORATION

ULICA: 1101 East 58th Street

MIASTO: Chicago

STAN: Illinois

KRAJ: Stany Zjednoczone Ameryki

KOD POCZTOWY: 60637

Nr TELEFONU: (312) 702-1692

Nr TELEFAKSU: (312) 702-0741 (ii) WYNALAZCA: Drmanac, Radoje (iii) TYTUŁ WYNALAZKU: Sposoby i Kompozycje do wydajnego Sekwencjonowania Kwasu Nukleinowego (iv) LICZBA SEKWENCJI: 10 (v) ADRES DO KORESPONDENCJI:

(A) ADRESAT: Arnold, White & Durkee (B) ULICA: P.O. Box 4433 (C) MIASTO: Houston (D) STAN: TX (E) KRAJ: USA (F) KOD: 77210-4433 (vi) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) RODZAJ NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln wyd. # 1.0, wer. #1.25 (vii) DANE DOTYCZĄCE OBECNEGO ZG1OSZENIA:

(A) NUMER ZGłOSZENIA:

(B) DATA ZGłOSZENIA:

(C) KLASYFIKACJA:

(viii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGłOSZENIA:

(A) NUMER ZGłOSZENIA: USSN 08/303,058 (B) DATA ZGłOSZENIA: 8 września 1994 (08.09.94) (C) KLASYFIKACJA: Nieznana (viii) DANE DOTYCZĄCE POPRZEDNIEGO ZGłOSZENIA:

(A) NUMER ZGłOSZENIA: USSN 08/127,420 (B) DATA ZGłOSZENIA: 27 wiześnia 1993 (27.09.93) (C) KLASYFIKACJA: Nieznana (ix) INFORMACJA O RZECZNIKU:

(A) NAZWISKO: Parker, David L.

(B) NUMER REJESTRACYJNY: 32,165 (C) NUMER SPRAWY: ARCD146P—\PAR (x) INFORMACJA DOTYCZĄCA TELEKOMUNIKACJI:

(A) TELEFON: (512) 418-3000 (B) TELEFAX: (512) 474-7577 (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DłUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza

180 521 (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 1: AAAAAATTTTTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 13 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 2: AAAAAATTTTTTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 3:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 3: AAAAATTTTTTA (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 4: AAAAATTTTTTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 5: AAAAATTTTTTC (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 6: AAAAATTTTTTG (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 7:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad

180 521 (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 7: TAAAAATTTTTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 8: CAAAAATTTTTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW. Nr 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 9: GAAAAATTTTTT (2) INFORMACJA DLA IDENTYFIKATORA SEKW Nr 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 12 par zasad (B) RODZAJ: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPLOGIA: liniowa (ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: DNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. Nr 10:

aaaaaatttttt

180 521

Literatura

Następujące pozycje dostarczające przykładowych szczegółów dotyczących procedury i innych szczegółów uzupełniających w odniesieniu do procesów przedstawionych w opisie, są włączone do opisu jako pozycje powoływane.

Bains et al., 1988, J. Theor. Biol., 135:303-307.

Broude et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:3072-3076.

Brumbaugh et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85:5610-5614.

Cantor et al., 1992, Genomics, 13,1378.

Cate etal.,VW., GATA, 8(3) :102-106.

Chu et al., 1983, Nucleic Acids Res., 11:6513-6529.

Craig et aZ.,1989, Nucleic Acids Research, 17(12):4605.

Dahlen et al., 1987, Mol. Celi. Probes 1:159-168.

Dolinnaya et al.,\9^, Nucleic Acids Research, 16(9):3721-3738.

Drmanac & Crkvenjakov, 1990, Scientia Yugoslavica, 16, 97.

Drmanac & Crkvenjakov, U.S. Patent 5,202,231.

Drmanac et al., 1989, Genomics, 4:114-128.

Drmanac et al., 1991, J. Biomol. Struct. & Dyn., 8:1085.

Drmanac et al., 1991, In „Electrophoreses, Supercomputers and the Humań Genome”, pp 47-59, World Scientific Publishing Co., Singapore.

Drmanac et al., 1993, Proceedings of 2nd International Conference on Bioinformatics, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., pp. 121-134.

Drmanac, 1994, Abstract Book for Genome Mapping and Seąuencing; arranged by Richard Myers, David Porteous and Robert Waterstone, Cold Spring Harbor Laboratories, p. 60.

Drmanac et al., 1994, Proceedings of the 3rd International Workshop of Transcribed Sequences, In Press.

Duncan & Cavalier, 1988, Analytical Biochemistry, 169:104-108.

Eggers et al., 1994, BioTechniques, 17(3):516-524.

Fitzgerald et al., 1992, Nucleic Acids Research, 20(14):3753-62.

Fodor et al., 1991, Science, 251:767-768.

Hoheisel Lehrach, 1990, FEBS Lett., 274(1,2):103-106.

Inouye & Hondo, 1990, J. Clin. Microb., 28:1469-1472.

Jacobsen et al., 1990, Genomics, 8:001-007.

Keller et al., 1988, Anal. Biochem., 170:441-450.

Keller et al., 1989, Anal. Biochem., 177:27-32.

Khrapko et al., 1991, J. DNA Sequencing Mapping, 1, 375.

Labat and Drmanac, 1993, Proceeding of 2nd International Conference on Bioinformations, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., pp. 555-565.

Landegren et al., 1988, Science, 241:1077-1080.

Maxam & Gilbert, 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560.

Marriey & Collins, 1989, Mol. Celi. Probes 3:189-207.

Murakami et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19(15):4097-4102.

Nagataeta/., 1985, FEBS Letters, 183:379-382.

Nichols et al., 1994, Naturę, 369:492.

Pease etal., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., 91:5022-5026.

Peterkin et al., 1987, BioTechniques 5(2):132-134.

Peterkin et al., 1989, Food Microbiology 5(2):281-284.

Pontius & Berg, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:8237-8241.

Rasmussen et al., 1991, Analytical Biochemistry, 198:138-142.

Sambrook etal., 1989, Molecular cloning: A laboratory manuał. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, ΝΎ.

Sanger, et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463.

180 521

Schriefer et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18(24):7455.

Schubert et al., 1990, Nucleic Acids Research, 18(11):3427.

Shabarova et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19(15):4247-4251.

Sharp et al., 1989 Food Microbiology, 6:261-265.

Southern, PCT Patent Application WO 89/10977.

Southern & Maskos, PCT Patent Application WO 90/03382.

Southern et al., 1992, Genomics, 13, 1008.

Strezoska et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., 88,10089.

Van Ness et al., 1991, Nucleic Acids Research, 19(12):3345.

Wu & Wallace, 1989 Gene, 76:245-254.

Zeremski and Crkvenjakow, 1993, DNA Sequence Determination by Hybridization:a Strategy for Efficient Large-Scale Seąuencing, Science, 260:1649-1652.

180 521

FIG. 1A

FIG.1B

T mT

FIG.1C

180 521

-10 cm

FIG. 2A

FIG. 2B

Ϊ80 521

FIG. 2C

180 521

FIG. 3A

FIG. 3B

FIG. 3C

180 521 (Ν)η

(N)m

PROBE

SONDA

SOLID SUPPORT

STAŁE PODŁOŻE

FIG. 4

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 6,00 zł.

Claims (83)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym z wykorzystaniem procesu hybrydyzacji, znamienny tym, że obejmuje etapy:

   (a) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i sondami immobilizowanymi oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i sondami znakowanymi:

   (b) wiązanie kowalencyjne sond immobilizowanych i sond znakowanych, które zhybrydyzowały stycznie z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

   (c) wykrywanie znacznika znakowanych sond oligonukleotydowych, które związały się z immobilizowanymi sondami, bez odzyskiwania tych znaczników oraz (d) identyfikowanie sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych, znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukleotydowymi odpowiednich związanych immobilizowanych sond oligonukleotydowych.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wymienione znaczniki wykrywa się in situ.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po etapie (b) a przed etapem (c) znakowane sondy, które nie zostały kowalencyjnie związane z immobilizowaną sondą, usuwa się.
4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że znakowane sondy, które nie zostały kowalencyjnie związane z immobilizowaną sondą usuwa się w ostrych warunkach przemywania.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wszystkie immobilizowane sondy są immobilizowane na tym samym podłożu.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowane sondy o różnych sekwencjach nukleotydowych są immobilizowane na różnych podłożach.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że układ („array”) immobilizowanych sond oligonukleotydowych obejmuje wiele szeregów ułożonych w formie sekwencjonującego „chipu” (układu scalonego).
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleotydowy kontaktuje się z zestawem znakowanych sond oligonukleotydowych kolejno, z jedną znakowaną sondą w danym czasie.
9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a) znakowane sondy oligonukleotydowe w zestawie, który ma różne sekwencje nukleotydowe, są znakowane takim samym znacznikiem.
10. 10. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się równocześnie z zestawem sond immobilizowanych i ze znakowaną sondą oligonukleotydową.
11. 11. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się najpierw z zestawem sond immobilizowanych z wytworzeniem kompleksu immobilizowana sonda: kwas docelowy, a następnie ze znakowaną sondą oligonukleotydową.
12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się równocześnie z co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi z zestawu znakowanych sond oligonukleotydowych, przy czym te co najmniej dwie znakowane sondy oligonukleotydowe sąznakowane różnymi, odróżnialnymi znacznikami i mająróżne sekwencje nukleotydowe, które można zidentyfikować przez własności ich odpowiednich znaczników.

    180 521
13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się równocześnie z zestawem sond immobilizowanych i wymienionymi co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi.
14. 14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się najpierw z zestawem sond immobilizowanych z wytworzeniem kompleksów immobilizowana sonda: kwas docelowy, a następnie z wymienionymi co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi.
15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się równocześnie z co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi z zestawu znakowanych sond oligonukleotydowych, przy czym to co najmniej dwie znakowane sondy oligonukleotydowe są znakowane różnymi, odróżnialnymi znacznikami i mają różne sekwencje nukleotydowe, które można zidentyfikować przez własności ich odpowiednich znaczników, a w etapie (d) sekwencje nukleotydowe sond immobilizowanych i sond znakowanych określa się przez obserwowanie in situ własności znaczników i ich względnych pozycji w obrębie układu („array”).
16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się równocześnie z szeregiem immobilizowanych sond i co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że w etapie (a) docelowy kwas nukleinowy kontaktuje się najpierw z szeregiem immobilizowanych sond z wytworzeniem kompleksów sonda: docelowy kwas i następnie z co najmniej dwiema znakowanymi sondami oligonukleotydowymi.
18. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego zestawia się z nachodzących na siebie połączonych sekwencji nukleotydowych kowalencyjnie związanych sond immobilizowanych i sond znakowanych.
19. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oznacza się kompletną sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego. .
20. 20. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mapuje się docelowy kwas nukleinowy.
21. 21. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy sekwencjonuje się częściowo.
22. 22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed etapem (a) docelowy kwas nukleinowy poddaj e się fragmentacji.
23. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy poddaje się fragmentacji przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, przez obróbkę ultradźwiękami, przez traktowanie NaOH lub ścinanie pod niskim ciśnieniem.
24. 24. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że fragmenty docelowego kwasu nukleinowego mają długość T, immobilizowane sondy oligonukleotydowe mają długość F, a znakowane sondy oligonukleotydowe mają długość P, przy czym T jest w zakresie 10-100 nukleotydów, a każdy z F i P niezależnie jest w zakresie 4-9 nukleotydów.
25. 2 5. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że T jest w zakresie 10-40 nukleotydów.
26. 26. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że T ma długość około 20 nukleotydów.
27. 27. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że T jest około 3 razy dłuższy niż F.
28. 28. Sposób według zastrz. 24, znamienny tym, że każdy z F i P ma długość 6 nukleotydów.
29. 29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stycznie zhybrydyzowane sondy immobilizowane i sondy znakowane wiąże się ze sobą kowalencyjnie przez enzymatyczną ligację.
30. 30. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że hybrydyzację prowadzi się w cyklach.
31. 31. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że warunki hybrydyzacji umożliwiają skuteczną hybrydyzację między docelowymi kwasami nukleinowymi i tylko tymi immobilizowanymi sondami i znakowanymi sondami, które są całkowicie komplementarne z częścią kwasu docelowego.
32. 32. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że warunki hybrydyzacji umożliwiają skuteczną hybrydyzację tylko między tymi immobilizowanymi sondami i znakowanymi sondami,

    180 521 które są zdolne do hybrydyzacji bezpośrednio stycznie z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego.
33. 33. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelowym kwasem nukleinowym jest sklonowany DNA, chromosomalny DNA lub mRNA.
34. 34. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowane sondy oligonukleotydowe są immobilizowane przez kowalencyjne przyłączenie.
35. 35. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane przez wiązanie fosfodiestrowe.
36. 36. Sposób według zastrz. 34, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane przy użyciu łącznika.
37. 37. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane na szkle, polistyrenie lub politetrafluoroetylenie.
38. 38. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że znacznik jest radioaktywnym izotopem, nieradioaktywnym izotopem lub ugrupowaniem zdolnym do emitowania światła.
39. 39. Sposób według zastrz. 3 8, znamienny tym, że znacznikiem jest barwnik fluorescencyjny.
40. 40. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy, immobilizowana sonda lub znakowana sonda obejmują zmodyfikowaną zasadę lub uniwersalną zasadę.
41. 41. Sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym z wykorzystaniem procesu hybrydyzacji, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z pierwszym zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i z pierwszą znakowaną sondą oligonukleotydową w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami z pierwszego zestawu oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i pierwszą znakowaną sondą oligonukleotydową;

    (b) doprowadzenie do kontaktu docelowego kwasu nukleinowego z drugim zestawem immobilizowanych sond oligonukleotydowych i drugą znakowaną sondą oligonukleotydową w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami z drugiego zestawu oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i drugą znakowaną sondą oligonukleotydową, przy czym pierwsze i drugie znakowane sondy oligonukleotydowe obejmują różne sekwencje nukleotydowe, natomiast znaczniki pierwszej i drugiej znakowanej sondy oligonukleotydowej są takie same;

    (c) wykrywanie immobilizowanych sond z pierwszego zestawu, które zhybrydyzowały z docelowym kwasem nukleinowym bezpośrednio stycznie z pierwszą znakowaną sondą i wykrywanie immobilizowanych sond z drugiego zestawu, które zhybrydyzowały z docelowym kwasem nukleinowym bezpośrednio stycznie z drugą znakowaną sondą przez poddanie tych sond warunkom, w których zachodzi kowalencyjne wiązanie bezpośrednio stycznych ze sobą immobilizowanych i znakowanych sond, a następnie przez wykrywanie znaczników znakowanych sond, które związały się kowalencyjnie i (d) identyfikowanie sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukleotydowymi związanych z nimi odpowiednich immobilizowanych sond oligonukleotydowych.
42. 42. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że w etapie (c) znakowane sondy, które nie zostały kowalencyjnie związane z immobilizowaną sondą, usuwa się.
43. 43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że znakowane sondy, które nie zostały kowalencyjnie związane z immobilizowaną sondą usuwa się w ostrych warunkach przemywania.
44. 44. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że wszystkie immobilizowane sondy pierwszego zestawu są immobilizowane na podłożu i/lub wszystkie immobilizowane sondy drugiego zestawu są immobilizowane na tym samym podłożu.

    180 521
45. 45. Sposób według zastrz. 44, znamienny tym, że pierwszy i drugi zestaw immobilizowanych sond stanowi sekwencjonujący chip.
46. 46. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że immobilizowane sondy pierwszego zestawu o różnych sekwencjach nukleotydowych są immobilizowane na różnych podłożach i/lub immobilizowane sondy drugiego zestawu o różnych sekwencjach nukleotydowych sąimmobilizowane na różnych podłożach.
47. 47. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego zestawia się z nachodzących na siebie połączonych sekwencji nukleotydowych kowalencyjnie związanych sond immobilizowanych i sond znakowanych.
48. 48. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że oznacza się kompletną sekwencję nukleotydową docelowego kwasu nukleinowego.
49. 49. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że mapuje się docelowy kwas nukleinowy.
50. 50. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy sekwencjonuje się częściowo.
51. 51. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że przed etapem (a) docelowy kwas nukleinowy poddaje się fragmentacji.
52. 52. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy poddaje się fragmentacji przez trawienie enzymami restrykcyjnymi, przez obróbkę ultradźwiękami, przez traktowanie NaOH lub ścinanie pod niskim ciśnieniem.
53. 53. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że fragmenty docelowego kwasu nukleinowego mają długość T, immobilizowane sondy oligonukleotydowe mają długość F, a znakowane sondy oligonukleotydowe mają długość P, przy czym T jest w zakresie 10-100 nukleotydów, a każdy z F i P niezależnie jest w zakresie 4-9 nukleotydów.
54. 54. Sposób według zastrz. 51, znamienny tym, że T jest w zakresie 10-40 nukleotydów.
55. 55. Sposób według zastrz. 54, znamienny tym, że T ma długość około 20 nukleotydów.
56. 56. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że T jest około 3 razy dłuższy niż F.
57. 57. Sposób według zastrz. 53, znamienny tym, że każdy z F i P ma długość 6 nukleotydów.
58. 58. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że stycznie zhybrydyzowane sondy immobilizowane i sondy znakowane wiąże się ze sobą kowalencyjnie przez enzymatyczną ligację.
59. 59. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że hybrydyzację prowadzi się w cyklach.
60. 60. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że warunki hybrydyzacji umożliwiająskutecznąhybrydyzację między docelowymi kwasami nukleinowymi i tylko tymi immobilizowanymi sondami i znakowanymi sondami, które są całkowicie komplementarne z częścią kwasu docelowego.
61. 61. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że warunki hybrydyzacji umożliwiają skuteczną hybrydyzację tylko między tymi immobilizowanymi sondami i znakowanymi sondami, które są zdolne do hybrydyzacji bezpośrednio stycznie z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego.
62. 62. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że docelowym kwasem nukleinowym jest sklonowany DNA, chromosomałny DNA lub mRNA.
63. 63. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że immobilizowane sondy oligonukleotydowe są immobilizowane przez kowalencyjne przyłączenie.
64. 64. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane przez wiązanie fosfodiestrowe.
65. 65. Sposób według zastrz. 63, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane przy użyciu łącznika.
66. 66. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że immobilizowane sondy są immobilizowane na szkle, polistyrenie lub politetrafluoroetylenie.
67. 67. Sposób wćdług zastrz. 41, znamienny tym, że znacznik jest radioaktywnym izotopem, nieradioaktywnym izotopem lub ugrupowaniem zdolnym do emitowania światła.
68. 68. Sposób według zastrz. 67, znamienny tym, że znacznikiem jest barwnik fluorescencyjny.

    180 521
69. 69. Sposób według zastrz. 41, znamienny tym, że docelowy kwas nukleinowy, immobilizowana sonda lub znakowana sonda obejmujązmodyfikowaną zasadę lub uniwersalną zasadę.
70. 70. Sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym z wykorzystaniem procesu hybrydyzacji, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) kontaktowania docelowego kwasu nukleinowego z jedną lub więcej immobilizowaną sondą oligonukleotydową i z jedną lub więcej znakowaną sondą oligonukleotydową, w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i immobilizowanymi sondami oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i znakowanymi sondami oligonukleotydowymi:

    (b) kowalencyjnego wiązania immobilizowanych sond i znakowanych sond, które są stycznie zhybrydyzowane z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

    (c) wykrywania znaczników znakowanych sond oligonukleotydowych, które są związane z immobilizowanymi sondami, bez odzyskiwania tych znaczników i (d) identyfikowania sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytych, znakowanych sond oligonukleotydowych z sekwencjami nukleotydowymi odpowiednich związanych immobilizowanych sond oligonukleotydowych.
71. 71. Sposób identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym z wykorzystaniem procesu hybrydyzacji, znamienny tym, że obejmuje etapy:

    (a) kontaktowania docelowego kwasu nukleinowego z zestawem pierwszej sondy (pierwszych sond) chemicznie modyfikowanej (ych) w celu umożliwienia jej immobilizacji na nośniku i z co najmniej jedną znakowaną drugą sondą nukleotydową, w warunkach umożliwiających skuteczną hybrydyzację między: (i) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i pierwszymi sondami oraz (ii) komplementarnymi sekwencjami docelowego kwasu nukleinowego i znakowaną(ymi) drugą(imi) sondą(ami);

    (b) kowalencyjnego wiązania pierwszej sondy (pierwszych sond) i znakowanej drugiej sondy (drugich sond), które są stycznie zhybrydyzowane z tą samą cząsteczką docelowego kwasu nukleinowego;

    (c) wykrywania znacznika znakowanej drugiej(ich) sondy (sond) oligonukleotydowej(ych), które są związane kowalencyjnie z pierwszą sondą (sondami) bez odzyskiwania tych znaczników i (d) identyfikowania co najmniej jednej sekwencji nukleotydowej w docelowym kwasie nukleinowym przez połączenie sekwencji nukleotydowych wykrytej(ych), znakowanej(ych) sondzie (sondach) oligonukleotydowej(ych) z sekwencjami nukleotydowymi odpowiedniej(nich) związanej(ych) znimi immobilizowanej(ych) sondy (sond) oligonukleotydowej(ych).
72. 72. Zestaw do identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym, znamienny tym, że obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej dwie znakowane sondy oligonukleotydowe mają ten sam znacznik i (c) środek ligujący.
73. 73. Zestaw według zastrz. 72, znamienny tym, że wymienione immobilizowane sondy oligonukleotydowe są uszeregowane na jednym stałym podłożu.
74. 74. Zestaw według zastrz. 73, znamienny tym, że zbiór immobilizowanych sond oligonukleotydowych obejmuje wiele szeregów ułożonych w formie „chipu” (układu scalonego) sekwencji.
75. 75. Zestaw według zastrz. 74, znamienny tym, że między szeregami znajdująsię hydrofobowe segmenty.
76. 76. Zestaw do identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym, znamienny tym, że obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej jedna, znakowana sonda ma znacznik, który można wykryć bez odszczepiania go oraz (c) środek ligujący.
77. 77. Zestaw według zastrz. 76, znamienny tym, że wymienione immobilizowane sondy oligonukleotydowe są uszeregowane na jednym stałym podłożu.

    180 521
78. 78. Zestaw według zastrz. 77, znamienny tym, że zbiór immobilizowanych sond oligonukleotydowych obejmuje wiele szeregów ułożonych w formie „chipu” (układu scalonego) sekwencji.
79. 79. Zestaw według zastrz. 78, znamienny tym, że między szeregami znajdująsię hydrofobowe segmenty.
80. 80. Zestaw do identyfikacji sekwencji nukleotydowych w docelowym kwasie nukleinowym, znamienny tym, że obejmuje (a) zestaw immobilizowanych sond oligonukleotydowych, (b) zestaw znakowanych sond oligonukleotydowych, w którym co najmniej jedna, znakowana sonda ma znacznik, którego nie można wykryć metodą spektrometrii mas i (c) środek ligujący.
81. 81. Zestaw według zastrz. 80, znamienny tym, że wymienione immobilizowane sondy oligonukleotydowe są uszeregowane na jednym stałym podłożu.
82. 82. Zestaw według zastrz. 81, znamienny tym, że zbiór immobilizowanych sond oligonukleotydowych obejmuje wiele szeregów ułożonych w formie „chipu” (układu scalonego) sekwencji.
83. 83. Zestaw według zastrz. 82, znamienny tym, że między szeregami znajdująsię hydrofobowe segmenty.

    ♦ * *