CZ90596A3 - Composition for effective sequencing of nucleic acid and process for preparing such composition - Google Patents

Description

Původ vynálezu

1. Oblast techniky

Tento vynález se obecně týká oblasti molekulární biologie. Vynález se zvláště týká získání nových metod a kompozic, které umožňují vysoce účinné sekvencování molekul nukleových kyselin. Metody podle tohoto vynálezu jsou vhodné pro sekvencování dlouhých molekul nukleových kysein, včetně chromosomů a RNA, bez klonovacích nebo subklonovacích stupňů.

2. Dosavadní stav techniky

Formy sekvencování nukleové kyseliny jsou integrální součástí dnešního rozvoje védy. Určení sekvence, to znamená prvotní struktury, molekul nukleové kyseliny a segmentů je důležité s ohledem na jednotlivé návrhy zkoumající rozsah zvláštních cílových oblasti. Informace získávané sekvencováním dopadají na védu, medicínu, zemědělství a všechny oblasti biotechologie.

Sekvencování nukleových kyselin je samozřejmě nezbytné pro návrh lidských genomu a jiné podnikání v širokém měřítku, pomocí kterého se dále porozumí vývoji a funkci organizmů a dostane se pohled na příčiny různých chorobných stavů.

*·

Užitek ze sekvencování nukleových kyselin je zřejmý, například Human Genome Project (HGP), vícenárodní úsilí zasvěcené sekvencování celého lidského genomu, prodělává pokrok v různých střediscích. Avšak pokrok v této oblasti je obecně jak pomalý, tak nákladný. Sekvencování nukleové kyseliny se obvykle provádí na polyakrylamidových gelech, které dělí DNA fragmenty v rozmezí od 1 do 500 párů báz.j.

(bp), diferencované v délce jednoho nukleotidu. Skutečné stanovení sekvence, to znamená pořadí jednotlivých nukleotidů A, G, C a T, se může provádět dvěma cestami. První z nich používá Maxam-Gilbertovy metody chemického degradování DNA fragmentu u specifických nukleotidů (Maxam a Gilbert, 1977), druhá cesta je založena na použití sekvenční metody terminace dideoxyřetězce, jak popsal Sanger a společníci (Sanger a kol., 1977). Obě metody jsou časově náročné a pracné.

Nedávno byly navrženy jiné metody sekvencování nukleových kyselin, které nevyužívají stupeň elektroforézy. Tyto metody se mohou suhrnně označit jako sekvencování hybridizaci neboli SBH (= Sequencing by Hybridization) (Drmanac a kol., 1991, Cantor a kol., 1992, Drmanac a Crkvenjakov, US patent č. 5 202 231). Vývoj určitých z těchto metod dosáhl nového tuhého nosiče, který je typem známého sekvencujicího prostředku, zde označovaného jako sekvencujíci čip. Použiti SBH je obecné zřejmé na základě skutečnosti, že na tuto technologii byl udělen US patent. Avšak třebaže SBH má možnost zvýšit rychlost, se kterou se mohou sekvencovat nukleové kyseliny, všechny stávající SBH metody stále trpí několika nevýhodami.

SBH se může provádět dvěma základními cestami, často označovanými jako formát 1 a formát 2 (Cantor a kol., 1992). Ve formátu 1 se oligonukleotidy neznámý sekvence, obecně o délce 100 až 1000 nukleotidů, seskupí na tuhý nosič nebo filtr, takže neznámé vzorky se samy imobilizují (Strezoska a kol., 1991, Drmac a Crvenjakov, US patent ó. 5 202 231). Replikace seskupení se potom podrobně zkoumá hybridižací se soubory značených sond o délce přibližné 6 až 8 zbytků. Ve formátu 2 se sekvencující čip tvoří ze seskupení oligonukleotidů se známými sekvencemi o délce přibližné 6 až 8 zbytků (Southern, WO 89/10977, Khrapko a kol., 1991, Southern a kol., 1992). Nukleové kyseliny z neznámé sekvence se potom značí a nechají hybridovat k imobilizaci oligů.

Na neštěstí oba tyto SBH formáty mají několik omezeni, zvláště požadavek pro předchozí DNA klonovací stupně. Ve formátu 1 jiné významné problémy zahrnují připojení různých zbytků nukleové kyseliny určených k sekvencování, na povrch tuhého nosiče nebo přípravu velkého souboru z delších zkušebních sond. Ve formátu 2 hlavní problémy zahrnují značení nukleových kyselin neznámé sekvence a vysoké poruchy v poměru k signálům, spíše než obecný výsledek a skutečnost, že se mohou stanovit pouze krátké sekvence. Další problémy formátu 2 zahrnují sekundární strukturní formaci, která zabraňuje v přístupu k určitým cílům a rozdílné podmínky, které jsou nezbytné pro zkoušky s rozdílnými GC obsahy. Proto by stav techniky měl jasně přinášet prospěch v novém postupu sekvencování nukleové kyseliny a zvláště by se mél vyhnout zdlouhavým procesům klonování a/nebo subklonování.

Podstata vynálezu

Tento způsob hledá překonání výše uvedených a jiných nevýhod vlastní dosavadnímu stavu techniky tím, že poskytuje nové metody a kompozice pro sekvencování nukleových kyselin. Nové technické postupy zde popsané jsou původci obecné označeny jako formát 3 a představují zřetelné zlepšení proti existujícím SBH metodám formátu 1 a formátu 2. Při sekvencování formátu 3 podle tohoto vynálezu se sekvence nukleové kyseliny stanovují pomocí hybridizace se dvěma soubory malých oligonukleotidových sond ze známých sekvencí. Metody podle tohoto vynálezu dovolují vysoce diskriminační sekvencování mimořádně velkých molekul nukleové kyseliny_; včetně chromosomového materiálu nebo RNA, bez předchozího klonování, subklonování nebo rozšíření. Kromě toho metody podle tohoto vynálezu nevyžadují velký počet sond, komplexní syntézu delších sond nebo značení komplexní směsi segmentů nukleových kyselin.

Ke stanoveni sekvence nukleové kyseliny metodami podle tohoto vynálezu by se měly obecně rozpoznat sekvence z nukleové kyseliny hybridizaci s komplementárními sekvencemi ze dvou souborů malých oligonukleových sond (oligů) definované délky a známé sekvence, které pokryjí většinu kombinací sekvencí pro tuto délku sondy. Potom by se měly analýzovat sekvence identifikované ke stanovení protáhnutí identifikovaných sekvencí, které se překrývají, a rekonstruovat nebo sestavit úplnou sekvenci.nukleové kyseliny z takových překrývájich se sekvencí.

Sekvenční metody se mohou provádět za použití sekvenční hybridizace s komplementárními sekvencemi ze dvou souborů malých oligů. Podle jiného provedení se může použít způsob označený jako cyklování, při kterém se dva soubory malých oligů současně hybridizují s neznámými sekvencemi. Výraz cyklizování se aplikuje jako diskriminační část technického postupu z potom přicházejícího zvyšování teploty k roztavení těch hybridů, které nejsou komplementární. Takoyé cyklizační technické postupy se obecné používají v jiných oblastech molekulární biologie, jako je PCR, a snadno jim porozumí odborník v oboru, pokud bude číst toto zj ištění.

Vynález je použitelný k sekvencování molekul nukleové kyseliny o velmi dlouhém řetězci. Jako praktická věc se uvádí, že molekula nukleové kyseliny určená k sekvencování bude obecně fragmentována, aby poskytla fragmenty nukleové kyseliny o malé nebo střední délce, se kterými se může snadno manipulovat. Výraz fragment nukleové kyseliny, jak se zde používá, nejobecněji znamená fragment molekuly nukleové kyseliny o délce mezi přibližně 10 páry bází (bp) a zhruba 100 bp. Jako nejvýhodnějsi methody podle tohoto vynálezu se pozorují ty metody, ve kterých se zpracuje molekula nukleové kyseliny určená k sekvencování, aby poskytla fragmenty nukleové kyseliny o střední délce, to znamená mezi přibližně 10 páry bází (bp) a zhruba 40 bp. Avšak je zapotřebí zdůraznit, že tímto vynálezem není metoda úplného sekvencování malých fragmentů nukleové kyseliny, ale spíše metoda sekvencování molekul nukleové kyseliny jako takových, která poskytuje určené části sekvence z molekuly, i když toto se provádí za použití celé molekuly, nebo pro zjednodušení, i když toho se dosahuje prvním fragmentováním molekuly na části menši velikosti, od přibližné 4 do zhruba 1000 bází.

WV-.·

Sekvence z molekul nukleové kyseliny se stanovují hybridizaci na malé oligonukleotidové sondy známé sekvence.

V souvislosti s malými oligonukleotidovými sondami výraz malý označuje sodnu o délce méně než 10 bp a výhodně sondy o délce mezi přibližně 4 a zhruba 9 bp. Při jednom příkladném ztělesněni sekvencování, sondy o délce přibližné 6 bp jsou pozorovány jako zvláště vhodné. Pro soubory z oligů k pokrytí všech kombinací sekvencí pro délku zvolené sondy bude jejich počet představován 4^F, kde F znamená délku sondy. Například pro 4-mer by soubor obsahoval 256 sond, pro 5-mer by soubor obsahoval 1024 sond, pro 6-mer by soubor obsahoval 4096 sond, pro 7-mer by soubor obsahoval 16 384 sond a podobně. Syntéza oligů o této délce je velmi běžná záležitost v oboru a může se dosahovat automatizovanou syntézou.

Při způsobech podle tohoto vynálezu jeden soubor malých oligonukleotidových sond známé sekvence, který může být ukončen jako první soubor, bude připojen k tuhému nosiči, to znamená imobilizován na nosiči takovým způsobem, že je dostupný pro účast na hybridizačnich reakcích. Jiným souborem z malých oligonukleotidových sond známé sekvence, který může být ukončen jako druhý soubor, budou sondy, které jsou v roztoku a které jsou značeny detekovatelnou značkovací látkou. Sety oligů mohou zahrnovat sondy o stejné nebo rozdílné délce.

Proces sekvenční hybridizace znamená, že molekuly nukleové kyseliny nebo fragmenty neznámé sekvence mohou být hybridizovány na zřetelné soubory oligonukleotidových sond ze známých sekvencí v odddělených časech (obr. 1). Molekuly nebo fragmenty nukleové kyseliny budou obecné denaturovány, aby se dovolila hybridizace, a přidány k prvnímu, imobilizovanému souboru sond za diskriminujících hybridizačnich podmínek, aby

Ί se zajistilo, že pouze fragmenty s komplementárními sekvencemi hybridizují. Fragmenty s nekomplementárními sekvencemi se odstraní a potom se provede následující kolo diskriminační hybridizace přidáním druhého, značeného souboru sond do roztoku, ke kombinaci fragmentů a sond již vzniklých. Značené sondy, které hybridizují v sousedství k fixované sondě, budou zůstávat připojené k nosiči a mohou se stanovit, co však není případ, kdy je prostor mezi fixovanými a značenými sondami (obr. 1).

Proces simultánní hybridizace znamená, že molekuly nukleové kyseliny s neznámou sekvencí se mohou ve stejné době uvést do styku s distinktnimi soubory oligonukleotidových sond ze známých sekvencí. Hybridizace se bude provádět za diskriminujícich hybridizačních podmínek. Fragmenty s nekomplementárními sekvencemi se potom roztaví, to znamená, že se odstraní zvyšováním teploty, a potom se provede následující kolo diskriminační hybridizace, co dovoluje hybridizovat jakékoli komplementární druhé sondy. Značené sondy, které hybridizují v sousedství k fixované sondě, se potom budou detekovat stejným způsobem.

Sekvence nukleové kyseliny, které jsou komplementární, jsou takové sekvence, které jsou schopné vytvářet páry bází podle normalizovaných Watson-Crickových pravidel komplementarity, a variací těchto pravidel, jak se aplikují na modifikované báze. To znamená, že větší puriny nebo modifikované puriny budou vždy vytvářet páry bází s menšími pyrimidiny, za vzniku pouze známých kombinací. Ty zahrnují standardní páry guanínu párovaného s cytosinem (G:C) a adeninu párovaného buď s thyminem ((A:T), v případě DNA, nebo adeninu párovaného s uracilem (A:U), v případě RNA. Použiti modifikovaných bázi nebo tak zvané univerzální báze (M, Nichols a kol., 1994) je také pozorováno.

Pokud se zde používá výraz komplementární sekvence znamená sekvence nukleové kyseliny, které jsou v podstatě komplementární na své celé délce a mají velmi málo chybného párování. Například sekvence nukleové kyseliny o délce šesti bází může být ukončena komplementárně, pokud se hybridizuje na pěti ze šesti poloh s pouze jediným chybným párováním. Přirozeně sekvence nukleové kyseliny, které jsou zcela komplementární, budou sekvence nukleové kyseliny, které jsou úplně komplementární na své celé délce a nemají žádné chybné párování.

Po identifikaci, hybridizací na oligy známé sekvence, se rozmanité individuální sekvence, které jsou částí fragmentů nukleové kyseliny, potom analýzují ke stanovení protáhnuti sekvencí, které se překrývají. Například se zjistí části sekvencí, ve kterých konec 5' je stejný jako konec 3' jiné sekvence nebo naopak. Úplná sekvence molekuly nebo fragmentu nukleové kyseliny se může potom zobrazit, to znamená, že se může potom rekonstruovat z překrývajících se sekvenci takto stanovených.

Procesy identifikující překrývající se sekvence a rekonstruující úplnou sekvenci se budou obecně dosahovat výpočetní analýzou. Například pokud značená sonda 5'-TTTTTT-3' hybridizuje do skvrny obsahující fixovanou sondu 5'-AAAAAA-3', 12-mer sekvence z molekuly nukleové kyseliny je definována, totiž 5'-AAAAAATTTTTT-3' (SEQ ID ó. 1), to znamená sekvence dvou hybridizovaných sond se kombinují a odhaluji dříve neznámou sekvenci. Další otázkou, která se má zodopvédét je, který nukleotid následuje hned po nově stanovené sekvenci 5'-AAAAAATTTTTT-3' (SEQ ID č. 1). Jsou čtyři možnosti představované fixovanou sondou 5'-AAAAAT-3' a značenými sondami 5'-TTTTTA-3' pro A, 5'-TTTTTT-3' pro T, 5’-TTTTTC-3* pro C a 5'-TTTTTG-3' pro G. Pokud například sonda 5'-TTTTTC-3' je positivní a jiné tři sondy jsou negativní, potom se sestavená sekvence prodlouží na 5'-AAAAAATTTTTTC-3' (SEQ ID č. 2). V následujícím stupni se stanoví algoritmus, z kterého značené sondy TTTTCA, TTTTCT, TTTTCC nebo TTTTCG jsou positivní ve skvrně «obsahující fixovanou sondu AAAATT. Proces se opakuje až všechny positivní (F + P) oligonukleotidové sekvence se použijí nebo definují jako falešná positiva.

Tento vynález tak poskytuje velmi účinnou cestu k sekvencování fragmentů a molekul nukleové kyseliny, které mají dlouhou délku. Velké molekuly nukleové kyseliny, jak jsou zde definovány, jsou takové molekuly, které potřebují být fragmentovány před sekvencováním. Ty obecně budou mít délku přinejmenším přibližně 45 nebo 50 párů bází (bp) a nejčastéji budou delší. Ve skutečnosti metody podle tohoto vynálezu se mohou používat k sekvencování molekul nukleové kyseliny se skutečnou s délkou, která není nadlimitní, takže sekvence přibližně 100 bp, 1 kilobáze (kb), 1 megabáze (Mb) a 50 Mb nebo více se mohou sekvencovat a mezi ně se zahrnují úplné chromosomy, jako lidské chromosomy, které máji délku přibližné 100 Mb. Takový velký počet bude spadat do rozsahu tohoto vynálezu a sekvencování takového počtu bází bude ₍ vyžadovat dva soubory 8-mer nebo 9-mer (takže F + P ~ 16 - 18). Nukleové kyseliny určené k sekvencování mohou být DNA, jako je cDNA, genomická DNA, mikrorozřezané chromosomové pásy, kosmidová DNA nebo YAC inserty, nebo může jít o RNA, včetně mRNA, rRNA, tRNA nebo snRNA.

Proces stanovení sekvence molekuly dlouhé nukleové kyseliny zahrnuje jednoduše identifikující sekvence o délce F + P z molekuly a kombinování sekvencí za použití vhodného algoritmu. Z praktického hlediska, nejpravděpodobněji první fragment molekuly nukleové kyseliny má být sekvencován za vzniku menších fragmentů, stejně jako fragmentů nukleové kyseliny o střední délce. Potom by se měly identifikovat sekvence o délce F + P hybridizováním, například sekvenční hybridizací, fragmenty ke komplementárním sekvencím ze dvou souboru malých oligonukleotidových sond ze známé sekvence, jako jsou popsány výše. Tímto způsobem se úplná sekvence nukleové kyseliny z mimořádně velkých molekul může rekonstruovat z překrývajících se sekvencí o délce F + P.

Pokud nukleové kyselina, která se má sekvencovat, je sama fragmentem o střední délce, nebo je nejprve zprac<'->-ůi<% za vzniku fragmentů takové délky, způsob identifikující sekvence z takových fragmentů nukleové kyseliny hybridizací ke dvěma souborům malých oligonukleotidových sond známé sekvence je v centru sekvenčních metod zde uvedených. Tento proces obecně zahrnuje následující stupně:

a) styk souboru nebo seskupeni z připojených nebo imobilizovaných oligonukleotidových sond s fragmenty nukleové kyseliny za podmínek hybridizace, které jsou účinné pro ponechání fragmentů s komplementární sekvenci hybridizovat dostatečně na sondu, přičemž se vytvoří primární komplexy, ve kterých fragment má jak hybridizované, tak nehybridizované neboli volné sekvence,

b) uvedeni primárních komplexů do styku se souborem značených oligonukleotidových sond v roztoku za podmínek hybridizace, které jsou účinné k ponecháni sond s komplementárními sekvencemi hybridizovat na nehybridizovanou neboli volnou fragmentovou sekvenci, přičemž se vytvoří sekundární komplexy, ve kterých je fragment hybridizován jak k připojené (imobilizované) sondě, tak ke značené sondě,

c) odstraní ze sekundárních komplexů libovolných značených sond, které, nejsou hybridizované v sousedství k připojené sondě, přičemž se odštěpují pouze sousedící sekundární komplexy,

d) detekční stanovení sousedících sekundárních komplexů, detekcí přítomnosti značení ve značených sondách a

e) identifikovaní oligonukleotidových sekvencí z fragmentů nukleové kyseliny v sousedících sekundárních komplexech kombinací nebo připojením známých sekvencí z hybridizovaných připojených a značených sond.

Hybridizace neboli stav promývání, zvolené k provedení bud k jednoho nebo obou hybridizačních stupňů, mohou být prováděny podle zvláštního zvoleného ztělesnění sekvencování. Například oba předpoklady hybridizace mohou být určeny k tomu, aby dovolily oligonukleotidovým sondám hybridizovat na daný fragment nukleové kyseliny, pokud obsahují komplementární sekvence, to znamená v podstatě párované sekvence, jako sekvence, které hybridizují v pěti ze šesti poloh. Hybridizačni stupně by se výhodně měly provádět za použití jednoduchého robotového zařízení, jaké se obvykle používá při nyní prováděných způsobech sekvencování.

Podle jiného provedeni hybridizacní podmínky mohou být určeny k tomu, aby dovolily hybridizovat pouze ty oligonukleotidové sondy a fragmenty, které mají úplně komplementární sekvence. Tyto více diskriminující neboli přísné řízené podmínky se mohou používat pro oba zřetelné stupně sekvenčního hybridizačního procesu nebo pro libovolný samotný stupen. V takovém případě oligonukleotidové sondy, buď imobilizované nebo značené sondy, by pouze byly ponechány hybridizovat na daný fragment nukleové kyseliny, kdy se podílí úplně komplementární sekvence s fragmentem.

Zvolené hybridizační podmínky budou obecně určovat stupeň komplexnosti vyžadovaný k analýze dosažených hodnot. Rovněž počítačové programy vhodné k analýze jakýchkoli generovaných hodnot mohou určovat hybridizační podmínky, které se musí použít v dané laboratoři. Například při nejvíce diskriminujícím procesu, oba hybridizační stupně by se měly provádět za podmínek, které dovolují pouze oligům a fragmentům hybridizovat s úplné komplementárními sekvencemi. Pokud zde nebudou chybně párované báze, tato metoda zahrnuje přinejmenším komplexní počítačové analýzy a z toho důvodu jde nyní o výhodnou metodu pro provádění vynálezu. Avšak použiti méně diskriminujících podmínek pro jeden nebo oba hybridizační stupně také spadá do rozsahu tohoto vynálezu.

Vhodné hybridizační podmínky pro použití buď v jednom nebo v obou stupních se mohou stanovit obvyklým způsobem optimalizačními procedurami nebo poloprovozními studiemi. Různé typy poloprovozních studií běžně provádí odborník v oboru sekvencování nukleové kyseliny zavedenými pracovními způsoby a upravením takových způsobů pro použití v dané laboratoři. Například podmínky, jako je teplota, koncentrace každé z komponent, trváni času v jednotlivých stupních, použité pufry a jejich hodnota pH a ionová síla, se mohou měnit a přitom optimalizovat.

Při výhodným provedeních způsob sekvencování nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu zahrnuje diskriminační stupeň k výběru pro sekundární hybridizační komplexy, které zahrnují bezprostředně sousedící imobilizované a značné sondy, jako odlišené od těch, které bezprostředně nesousedí a jsou odděleny jednou, dvěma nebo větším počtem bází. Různé způsoby jsou dostupné pro odstranění značených sond, které nejsou hybridizovány bezprostředně v sousedství k připojené sondě, to znamená, které nejsou hybridizovány v těsné vzájemné návaznosti, každá z nich zanechá pouze bezprostředně sousedící sekundární komplexy.

Takové diskriminační procesy se mohou spoléhat zřídka samy na promývací stupně z přísného řízení, ve kterém použité hybridizační podmínky jsou určeny tak, že bezprostředně sousedící sondy zůstávají hybridizovány v důsledku zvýšené stability dosahované hromadícími se interakcemi sousedících nukleotidů. Opět podmínky promývání, jako je teplota, koncentrace, doba, pufry, hodnota pH, ionová síla a podobně, se mohou měnit k optimalizaci odstranění značených sond, které bezprostředně nesousedí.

Při výhodném provedení by bezprostředně sousedící imobilizované a značené sondy měly být ligovány, to znamená, že by měly být kovalentně spojeny, před provedením promývacích stupňů, k odstranění libovolných neligovaných sond. Ligace se může dosahovat zpracováním s roztokem, který obsahuje chemické ligační činidlo, jako je například karbodiimid rozpustný ve vodě nebo bromkyan. Výhodněji se může použit ligasový enzym, jako je T₄ DNA ligasa z T₄ bakteriofágu, který je komerčně dostupný z mnoha zdrojů (například Biolabs). V některém případě by potom bylo možné odstranit nebezprostředné sousedící značené sondy za stavu přísně řízeného promývání, který nemá zhoubný vliv na kovalentně připojené značené a fixované sondy.

Zbývající sousedící sekundární komplexy mohou být stanoveny pozorovnáním lokace značení ze značených sond a přítomných v komplexech. Oligonukleotidové sondy mohou být značeny chemicky detekovatelným značením, jako jsou fluorescenční barviva, nebo mohou být příslušně modifikovány chemiluminiscenčním vyvíječím procesem nebo radioaktivně značícími látkami, jako je ³⁵S, ³H, ³²P nebo ³³P, přičemž v současnosti se dává přednost značení ³³P. Sondy mohou být také značeny neradioaktivními isotopy a stanoveny hmotnostní spektrometrií.

V současné dobé nejvýhodnější způsob zjištěný při provádění tohoto vynálezu zahrnuje provádění hybridizačních stupňů za podmínek určených k tomu, aby dovolily pouze takové oligonukleotidové sondy a fragmenty, které mají úplné komplementární sekvence k hybridizaci a které dovolují pouze takové sondy, které jsou vhodné v bezprostředním sousedství ke zbývající hybridizaci. Tato metoda následně vyžaduje přinejmenším počítačovou analýzu.

Kde molekula nukleové kyseliny neznámé sekvence je delší než přibližné 45 nebo 50 párů bázi, jedna účinná metoda pro stanovení jejich sekvencí obecné zahrnuje zpracování molekuly k vytvořeni fragmentů nukleové kyseliny o střední délce a stanoveni sekvencí z fragmentů. Molekula nukleové kyseliny, která je bud DNA nebo RNA, se může fragmentovat libovolnou z možností metod, včetně například střiháním restrikčním enzymovým digerováním, střiháním fyzikálními prostředky, jako například ultrazvukovým zpracováním, zpracováním s hydroxidem sodným nebo střiháním za nízkého tlaku.

Při určitých ztělesněních, například zahrnujících malé oligonukleotidové sondy o délce mezi přibližné 4 a zhruba 9 páry bází, lze pomoci připravovat fragmenty nukleové kyseliny o délce mezi přibližně 10 a zhruba 40 páry bází. Přirozené větší délka sond se bude obecně používat v souvislosti se sekvencováním fragmentu nukleové kyseliny o větší délce a naopak. Při určitých výhodných ztělesněních, použité malé oligonukleotidové sondy budou mít délku přibližně 6 párů bází a fragmenty nukleové kyseliny, určené k sekvencování, budou mít délku přibližné 20 párů bází. Pokud je to žádoucí, fragmenty se mohou dělit podle velikosti k získání fragmentů vhodné délky, například se fragmenty mohou pohybovat na gelu, jako například na agarosovém gelu, a tak se může dojít k excizi přibližně požadované délky.

Způsob pro stanovení sekvence molekuly nukleové kyseliny se může například použít, jak je dále uvedeno. Původně randomizovaný fragment v množství nukleové kyseliny určené k sekvencování poskytne směs fragmentů nukleové kyseliny o délce T. Připraví se seskupení z imobilizovaných oligonukleotidových sond známých sekvencí s délkou F a soubor značených oligonukleotidových sond v roztoku známých sekvencí s délkou P, kde F + P < T a výhodně kde T ~ 3F.

Potom se uvede do styku seskupení imobilizovaných oligonukleotidových sond se směsí fragmentů nukleové kyseliny za hybridizačních podmínek, které jsou účinné pro dosažení tvorby primárních komplexů s hybridizovanými komplementárními sekvencemi o délce F a nehybridizovanými fragmentovými sekvencemi o délce T - F. Výhodně hybridizované sekvence o délce F by měly obsahovat pouze úplně komplementární sekvence.

Primární komplexy se potom mají uvést do styku se souborem značených, oligonukleotidových sond za hybridizaónícb podmínek, ktd»ré dovolují tvorbu sekundárních komplexů s hybridizovanými komplementárními sekvencemi o délce F a sousedícími hybridizovanými komplementárními sekvencemi o délce P. Při výhodném ztělesněni pouze tyto značené sondy s úplně komplementárními sekvencemi by měly dovolit být hybridizovány a pouze takové sondy, které hybridizují v bezprostředním sousedství k zmobilizovaným sondám, by měly mít dovoleno, aby zůstaly hybridizovány. Při nejvýhodnějším ztělesnění sousedící a značené oligonukleotidové soundy by také byly ligovány v tomto stupni.

Dále se má provést detekce sekundárních komplexů, stanovením přítomnosti značených a rozpoznaných sekvencí o délce F + P z fragmentů nukleové kyseliny v sekundárních komplexech, kombinováním známých sekvencí hybridizovaných a značených sond. Protažení sekvencí o délce F + P, které se překrývají, by se potom identifikovalo, co by umožnilo stanovit úplnou sekvenci nukleové kyseliny z molekuly, která byla rekonstruována nebo sestavena z překrývájích se sekvenci.

Pří způsobech podle tohoto vynálezu oligonukleotidy z prvního souboru se mohou připojit k tuhému, to znamená imobilizovanému, nosiči libovolnou z metod, které znají odbornici v oboru. Například připojeni může být provedeno adresovatelnou laserem aktivovanou fotodeprotekcí (Fodor a kol., 1991, Pease a kol., 1994). Obecné výhodná metoda je připojit oligy přes fosfátovou skupinu za použití reakčních činidel, jako je nukleosid fosforamidit nebo nukleosid hydrogenfosforát, jak popisuje Southern a Maskos (PCT patentová přihláška WO 90/03382, která se zde uvádí jako součást dosavadního stavu techniky), a za použiti skleněného, nylonového nebo teflonového nosiče. Jiná výhodná metoda λ spočívá ve světlem generované syntéze, kterou popsal Pease a kol. (1994, uvedeno jako součást dosavadního stavu techniky). Může jít také o nosič vázaný oligonukleotidovými seskupeními, například jako nabízí k prodeji firma Affymetrix a Beckman.

Imobilizované oligonukleotidy se mohou tvořit v seskupení, které zahrnuje všechny sondy a podsoubory sond o dané délce (výhodné přibližně 4 až 10 bází) a výhodněji v násobných seskupeních z imobilizovaných oligonukleotidů uspořádaných za vzniku tak zvaného sekvencujícího čipu”. Příkladem čipu je, pokud se hydrofobní segmenty použijí k vytvoření zřetelných prostorových oblastí. Sekvencující čipy mohou být určeny pro rozdílné aplikace, jako mapování, parciální sekvencování, sekvencování cílových oblastí pro diagnostické účely, mRNA sekvencování a genomové sekvencování ve velkém měřítku. Pro každou aplikaci může být určen zvláštní čip s rozdílnou velikosti sond nebo s neúplným souborem sond.

Při jednom příkladném ztělesnění oba soubory oligonukleotidých sond mají být sondy o délce šesti bází, to znamená 6-mers. V tomto případě každý soubor oligů obsahuje 4096 odlišných sond. První soubor sond je výhodně fixován v seskupení na mikročipu, nejobvykleji uspořádán v 64 řadách a 64 sloupcích. Druhý soubor z 4096 oligů by byl značený detekovatelným označením a dávkován do souboru z odlišných trubic. V tomto případě 4096 čipů by bylo kombinováno ve velkém seskupení nebo v malém seskupení. Po hybridizaci fragmentů nukleové kyseliny, malé množství značených oligonukleotidů se má přidat ke každému mikročipu pro druhý hybridizačni stupeň, přičemž ke každému mikročipu se má přidat pouze jeden každý z 4096 nukleotidů.

Další ztělesnění vynálezu zahrnuje soupravy pro použití při sekvencování nukleové kyseliny. Takové soupravy budou obecně zahrnovat tuhý nosič, který má připojeno seskupení oligonukleotidových sond ze známých sekvencí, jak je znázorněno na obr. 2A, obr. 2B a obr. 2C, kde oligonukleotidy jsou schopny účastnit se hybridizačních reakcí, a soubor ze zásobníků obsahujících roztoky značených oligonukleotidových sond známých sekvencí. Předpokládá se také uspořádání, jako je uvedeno na obr. 4. To zobrazuje použití univerzální báze, bud jako připojená metoda, nebo na konci, aby se dostala dodatková dimenze k hybridizaci fragmentů.

V soupravách připojené oligonukleotidové sondy a sondy v roztoku mohou mit délku od přibližně 4 do zhruba 9 párů bází, přičemž délka okolo 6 párů bází je výhodná. Oligy mohou být značené chemicky detekovatelnými látkami nebo radioaktivním značením, přičemž sondy značené ³²P jsou obecně výhodné a sondy značené ³³P jsou ještě výhodnější. Soupravy mohou také zahrnovat chemicky nebo jinak ligujicí činidla, jako je DNA ligasový enzym. Různé jiné přidané kompozice a materiály mohou být zahrnuty do souprav, jako například do zařízení s 96 čepy nebo 96 hroty, a to pufry, reakční činidla pro řezání délky molekul nukleové kyseliny a prostředky pro výběr velikosti fragmentů DNA. Soupravy mohou rovněž zahrnovat značené RNA sondy, takže sondy se mohou odstranit zpracováním s RNAsou a sekvencující čipy se mohou znovu použít.

Přehled obrázků na výkresech

Obr 1. Základní stupně při hybridizačním procesu

Stupeň 1: Neznačená cílová DNA určená k sekvencování (T) se hybridizuje za diskriminačních podmínek k seskupení připojených oligonukleotidových sond. Jsou znázorněny skvrny se sondou Fy a Fy. Komplementární sekvence pro Fx a Fy jsou v odlišných polohách T.

Stupeň 2: Značené sondy Pi (jedna sonda na čip) se hybridizuje k seskupení. Znázorněna je sonda, která má komplementární cíl na T, který je připojen k Fx, ale ne k Fy.

Stupeň 3: Použitím diskriminačních podmínek nebo reakčních činidel se selektivně roztaví komplexy, které nemají připojeny sondy. Zvláštním příkladem je ligace značené sondy k fixované sondě, kde značená sonda hybridizuje v těsné vzájemné návaznosti s připojenou sondou. Positivní signály se detekují pouze v případě připojených sond, jako Fy a Pi a ve zvláštním příkladě, pouze v případě ligovaných sond.

Obr. 2A, obr. 2B a obr. 2C představují komponenty příkladně sekvencující soupravy.

Obr. 2A: Sekvencující čipy, představující seskupení 4^P identických sekcí, z nichž každá obsahuje identické (nebo rozdílné) seskupení oligonukleotidů. Sekce mohou být odděleny fyzikálními barierami nebo hydrofilním stripováním. Pozoruje se, že v seskupení je 4000 až 16 000 oligočipů.

p

Obr. 2B je zvětšenina čipové sekce obsahující 4 skvrn, každá se zvláštní oligonukleotidovu sondou (4000 až 16 000) syntetizovanou nebo rozšířenou na plochu. Skvrny mohou být malé několik mikrometrů a velikost sekce je přibližné 1 až zhruba 10 mm.

Obr. 2C představuje soubor zkumavek nebo desky s jednou nebo několika multijamkami, s vhodný počtem jamek (v tomto případě 4^P jamek). Každá jamka obsahuje určené množství specificky značeného oligonukleotidů. J^alší množství sond může být uloženo v neznačené formě, pokud značení nebylo provedeno během syntézy. V tomto případě sekvencující souprava bude obsahovat nezbytné složky pro značení sond. Čáry, kterými jsou spojeny zkumavky nebo jamky s čipovými sekcemi, znázorňují stupeň v sekvenčním postupu, kdy se množství značených sond přenáší do čipové sekce. Přenášení se může provádět pipetováním (jeden nebo větší počet kanálků.! nebo seskupením čepů, které přenáší kapalinu vlivem povrchového napětí. Přenosový prostředek může být také zahrnut do sekvencující soupravy.

Obr. 3A, obr. 3B a obr. 3C: Hybridizace DNA fragmentů připravených ramdomovým řezáním z DNA molekuly

Na obr. 3A DNA fragment T-j_ je jako takový, pokud obsahuje úplné cíle jak pro fixované, tak nefixovaně značené sondy.

Obr. 3B představuje případ, kdy DNA fragment T není zřejmé rozřezán.

Na obr. 3C je dostatečný prostor pro sondu P k hybridizaci, ale připojená sekvence není komplementární. Jak v případě B, tak v případě C, signál bude redukován v důsledku nasycení molekul z připojené sondy F. Současná hybridizace s DNA fragmenty a značenými sondami a cyklizace hybridizačniho procesu jsou některými možnými cestami ke zvýšení výtěžku korigovaných přilehlých hybridizaci.

Obr. 4: Použití univerzální báze jako spojovníku nebo v koncové poloze pro hybridizaci

Při syntéze sondy se může přidat univerzální báze (M base, Nichols a kol., 1994) nebo všechny čtyři báze. To je cesta ke zvýšení délky sond a £ak stabilitě duplexů, bez zvýšení počtu sond. Také použití univerzální báze na volném konci sond poskytuje prostor, který dovoluje, aby se sekvence četla v různých rámečcích.

Podrobný popis výhodných provedení

Stanovení sekvencí molekul nukleové kyseliny má důležité použití ve všech oblastech základního a aplikovaného biologického výzkumu (Drmanac a Crkvenjakov, 1990). Tento vynález poskytuje nové a účinné metody pro použití při sekvencování a analýze molekul nukleové kyseliny. Tuto metodologii je zamýšleno používat, ve spojení s jinými sekvenčními technickými způsoby, pro práce na Human Genome Project (HGP).

V současnosti jsou známy dvé metody sekvencování hybridizaci, SBH. Při první metodé se formát 1, neznámé genomické DNAs nebo oligonukleotidy o délce až do přibližně 100 až 2000 nukleotidů, uspořádají na tuhém substrátu. Tyto DNAs se potom podrobně zkoumají hybridizaci se souborem značených sond, které jsou obvykle 6- až 8-mers. Při inverzní technice se Formát 2, oligomery o 6 až 8 nukleotidech, imobilizuji na tuhém nosiči a nechají teplotně hybridizovat na kusy klonované a značené DNA.

U libovolného typu z těchto SBH analýz se musí zahrnout řada stupňů, za účelem dosažení v definitivní sekvenci. Zvláštní problémy současných SBH metod tvoří problémy spojené se syntézou velkého počtu sond a s obtížemi účinné diskriminativní hybridizace. Plná diskriminace při párováni - chybném párování je obtížná v důsledku dvou hlavních příčin. Především koncové chybné párováni sond delších než 10 bází je velmi nediskriminativní a za druhé komplexní směs značených DNA segmentů, která je výsledkem, pokud se analýzuje dlouhý DNA segment, vytváří vysoké pozadí.

Tento vynález také poskytuje účinnou diskriminativní hybridizaci bez velkého poctu sond nebo sond o zvýšené délce, a také eliminuje mnoho značících a klonujících stupňů, které jsou zvláště nevýhodné u každé ze známých SBH metod. Objevené vysoce účinné metody sekvencování nukleové kyseliny, označené jako formát 3 sekvencování, jsou založeny na hybridizaci s dvěma soubory malých oligonukleotidových sond známých sekvencí a tak alespoň zdvojují délku sekvence, která se má stanovit. Tyto metody dovolují, aby byly sekvencovány mimořádně velké molekuly nukleové kyseliny, včetně chromosomů, a řeší různé jiné SBH problémy, jako například připojení nebo značení řady fragmentů nukleové kyseliny. Vynález je mimořádně silný a může být také použit k sekvencování vzorků RNA a rovněž nerozšířené RNA.

Sekvence podle tohoto vynálezu, jak je uvedena v USSN 08/127 402 a v publikaci Drmanaca /1994/, jako jiná variace SBH, je popsána mezní polohovou SBH (PSBH) (Broude a kol., 1994). PSBH je v podstatě varianta formátu 2 SBH (ve které oligonukleotidy známých sekvenci jsou imobilizovány a použity k hybridizaci k nukleovým kyselinám neznámé sekvence, které byly předtím značeny). V PSBH, imobilizované sondy, spíše než tvořené jednoduchou, jednou vinutou sondou, jsou duplexy, které obsahují jednou vinuté 3' převisy. Biotinylované duplexní sondy jsou imobilizovány na magnetických kuličkách potažených streptavidinem, k vytvoření typu imobilizované sondy, a potom smíchány s ³²P-značenými cílovými nukleovými kyselinami, které se mají sekvencovat. T4 DNA ligáza se potom připojí k ligátu libovolně hybridizované cílové DNA, ke kratšímu konci duplexové sondy.

Avšak navdory representujícímu a zajímavému chování, PSBH (jak uvádí Broude a kol., 1994) neodráží významnou výhodu předóící existující SBH technologii. Například na rozdíl od metodologie formátu 3 podle tohoto vynálezu, PSBH neprodlužuje délku sekvence, která se může stavovít v jednom okruhu metody. PSBH také podporuje obtížný požadavek pro značení neznámé cílové DNA, co není požadováno pro formát 3.

Z obecného hlediska, PSBH je navržena pro použití v porovnávacích studiích nebo při mapování spíše než v de novo genomovém sekvencování. Tím se významně liší do formátu 3, který, třebaže je široce aplikovatelný pro všechny oblasti sekvencování, je velmi silným prostředkemn pro použití při sekvencování rovnéž největších genomů.

Nukleové kyseliny určené k sekvencování se mohou nejprve fragmentovat. Toho se může dosáhnout libovolným prostředkem, například řezáním digescí restrikčním enzymem, zvláště s CviJI, jak popsal Fitzgerald a kol. /1992/, stříháním fyzikálním prostředkem, jako působením ultrazvuku, zpracováním s hydroxidem sodným a podobně. Pokud je to žádoucí, fragmenty o příslušné délce, jako mezi přibližně 10 a 40 páry bázi, se mohou řezat z gelu. Úplná sekvence nukleové kyseliny z původní molekuly, jako lidského chromosomu, by se měla stanovit definujícími F + P sekvencemi přítomnými v původní molekule a sestavením dílů z překrývajících se F + P sekvenci. To nevyžaduje proto mezistupeň stanovení fragmentových sekvencí, spíše se sekvence z celé molekuly konstruují ze zobrazených F + P sekvencí.

K účelům následující diskuze se obecně předpokládá, že čtyři báze vytváří sekvence nukleových kyselin, které se mají sekvencovat. Těmi jsou A, G, C a T pro DNA a A, G, C a U pro RNA. Avšak v určitých provedeních muže být výhodné použít , modifikovaných bází v malých oligonukleotidových sondách.

K provedení tohoto vynálezu by se měl obecné nejprve připravit určitý počet malých oligonukleotidových sond o definované délce, který pokrývají všechny kombinace sekvencí pro danou délku sondy. Tento počet je represenU-ván 4ⁿ (4 umocněno na N), kde délka sondy je vyjádřena symbolem N. Například je 4096 možných sekvencí pro sondu 6-mer (4^δ = 4096) .

Jedno provedeni takových sond o délce F (4^F) by mělo být fixováno ve čtvercovém seskupení na mikročip, které může být v rozmezí od 1 mm² do 1 cm². V přítomném případě by bylo upořádáno 64 řad a 64 sloupců. Přirozeně by bylo zapotřebí zajistit, aby oligo sondy byly připojeny nebo jinak imobilizovány k povrchu mikročipu tak, aby byly schopné účastnit se při hybridizačnich reakcích. Jiný soubor oligů o délce P, 4^P v počtu, by se mohl také syntetizovat. Oligy v tomto souboru P by byly rozděleny do souborů nebo zkumavek (obr. 2A, obr. 2B a obr. 2C).

4^P těchto čipů by se měly kombinovat ve velkém seskupení (nebo několika seskupeních, o přibližné velikosti 10 až 100 cm² pro obvyklou velikost), kde P odpovídá délce oligonukleotidů v druhém oligomerním souboru (obr. 2A, obr.

2B a obr. 2C). Znovu se jako obvyklý příklad uvádí P zvolené, aby bylo šest (P = 6).

Nukleové kyseliny určené k sekvencování by se měly fragmentovat, aby se dostaly malé fragmenty nukleové kyseliny z neznámé sekvence. Průměrná délka těchto fragmentů, zakončených T, by obecně měla být větší než je součet délky F a P a může být přibližně trojnásobkem délky F (to znamená F + P < T a T ~ 3F). V přítomném případě by to mělo pomoci vyprodukovat fragmenty nukleové kyseliny o délce přibližně 20 párů bází. Tyto fragmenty by se měly denaturovat a přidat k většímu seskupení za podmínek, které usnadní hybridizací komplementárních sekvencí.

Při nejjednodušší a v současné době výhodné formě vynálezu by se hybridizační podmínky měly zvolit tak, aby dovolovaly provádět jednoduchou hybridizaci jen pokud 6 sekvenčních nukleotidů ve fragmentu nukleové kyseliny je komplenentárních ke všem 6 nukleotidům z F oligonukleotidové sekvence. Takové hybridizační podmínky se dají stanovit obvyklou optimalizační poloprovozní studií, při které se optimalizují podmínky, jako je teplota, koncentrace různých složek, délka času jednotlivých stupňů a použitý pufr, včetně hodnoty pH pufru.

V tomto stupni by každý mikročip měl obsahovat určité hybridizační komplexy. Ty by měly být ve formě komplexů sonda:fragment, ve kterých celá sekvence sondy je hybridizována na fragment, ale kde fragment, který je dlouhý, má určité nehybridizované sekvence, které vytváří ocas nebo ocasy ke komplexu. V tomto případě komplementární hybridizované sekvence by měly délku F a nehybridizované sekvence by měly celkovou délku T - F. Komplementární část fragmentu může být na vhodném konci nebo směrem ke vhodnému konci, takže se vytvoří jediný delší nehyridizovaný ocas. Při jiném provedení komplementární část fragmentu může být směrem k opačnému konci, takže se vytvoří dva nehybridizované ocasy (obr. 3A, obr. 3B a obr. 3C).

Po promytí vedoucím k odstranění nekomplementárních fragmentů nukleové kyseliny, které nejsou hybridizovány, se může přidat malé množství značených oligonukleotidů v souboru P ke každému mikročipu pro hybridizaci k ocasům fragmentu nukleové kyseliny z neznámé sekvence, které vystupují z komplexů sonda:fragment. Pouze jeden z každého 4^P nukleotidu by se měl přidat ke každému mikročipu. Znovu je v současné době výhodné použit hybridizační podmínky, kL· ř by dovolily významné spojení, aby se vyskytovalo pouze pokud všech 6 nukleotidů ze značené sondy je komplementárních k 6 sekvenčním nukleotidům z ocasu fragmentu nukleové kyseliny. Hybridizační podmínky by mély být stanoveny poloprovozní studií, jak je popsáno výše, při které se optimalizují podmínky, jako je teplota, koncentrace, čas, pufry a podobně.

V tomto stupni by každý mikročip potom obsahoval určité sekundární hybridizační komplexy. Ty by mély být ve formě komplexů sonda:fragment:sonda, ve kterých celá sekvence každé sondy je hybridizována k fragmentu a kde fragment má podobně určité nehybridizované sekvence. V těchto sekundárních hybridizovaných komplexech imobilizovaná sonda a značená sonda mohou být hybridizovány k fragmentu, takže dvé sondy bezprostředné sousedí nebo jsou v těsné vzájemné návaznosti. Avšak je dáno, že fragmenty jsou obecně delší než součet délek sond a imobilizovaná sonda a značená sonda mohou být hybridizovány k fragmentu v nesousedících polohách, odděleny jednou nebo větším počtem bází.

Velké seskupení by potom mělo být zpracováno způsobem vedoucím k odstranění nehybridizovaných značených sond. Při výhodném provedení použitý způsob by mohl odstranit nejen nehybridizované značené sondy, ale také nesousedící hydridizované značené sondy ze seskupení. Způsob by mohl využívat diskriminující podmínky, které by dovolily, aby tyto sekundární hybridizační komplexy, jež zahrnují sousedící imobilizované a značené sondy, byly diskriminující z téchto sekundárních hybridizačních komplexů, ve kterých fragment nukleové kyseliny je hybridizován k dvěma sondám, ale kde sondy nesousedí. To je důležitý aspekt tohoto vynálezu v tom, že dovoluje konečné zobrazení sekce z fragmentu sekce odpovídajícího kombinovaným sekvencím imobilizované sondy a značené sondy.

Diskriminační způsob použitý k odstranění nehybridizovaných a nesousedících hybridizovaných sond ze seskupení může znovu být řízen promývacím procesem, zatímco nechává připojené sousedící hybridizované sondy. Sousedící hybridizované sondy by nebyly postiženy zvolenými podmínkami na základě jejich zvyšující se stability v důsledku nahromadění se reakcí sousedících nukleotidů. Avšak při výhodném provedení je pozorováno, že se má zpracovat velké seskupení, kde libovolné sousedící sondy mají být kovalentné spojeny, například zpracováním s roztokem obsahujícím chemické ligační činidlo nebo výhodněji ligasu, enzym, jako T₄ DNA ligasu (Landegren a kol., 1983, Wu a Wallace, 1989).

Při jiné eventualitě, úplné seskupení se má podrobit přísně řízenému promývání, tak že pouze značení vlevo spojené se seskupením má být ve formé dvojitě vinutých komplexů sonda:fragment:sonda s připojenými hybridizovanými částmi o délce F + P (to znamená 12 nukleotidů v přítomném případě). Za použiti této dvoustupňové hybridizační reakce je možná velmi vysoká diskriminace, protože se berou v úvahu tři nebo čtyři nezávisle diskriminační procesy: diskriminační hybridizace fragmentu T k F bázím dlouhé sondy, diskriminační hybridizace P bází dlouhé sondy k fragmentu T, diskriminační stabilita plné párovaného (F + T + P) hybridu, v porovnání k p’* hybridům nebo rovněž k chybné párovaným hybridům obsahujícím nesousedicí F + P sondy, a diskriminativní ligace dvou koncových bází F a P.

Potom by se měly zjistit tak zvané sousedící sekundární komplexy pozorováním lokace zbývajícího značení na seskupení. Z polohy značeného F + P (například 12) nuklc- F du se mají stanovit dlouhé sekvence z fragmentu kombinováním známých sekvenci z imobilizovaných a značených sond. Úplné sekvence nukleové kyseliny z původní molekuly, jako lidského chromosomu, by se potom mély rekonstruovat nebo sestavit z překrývajících se F + P sekvenci tak stanovených.

Pokud se použije ligace při sekvenčním procesu, jak je v současné době výhodný, potom se běžný oligonukleotidový čip nemůže znovu použít. Původce pozoruje, že to nebude omezením, protože pro recyklování jsou dostupné různé metody. Například se může připravit specificky štépitelná vazba mezi sondami a potom štěpit vazba po detekci. Podle jiného provedení se mohou použit ribonukleotidy pro druhou sondu, sondu P, nebo se může použít ribonukleotid pro spojující bázi v sondě P, takže tato sonda se může následně odstranit zpracováním s RNAasou nebo uracil-DNA glykosylátem (Craig a kol., 1989). Jinými sledovanými metodami se dá dosáhnout vazeb chemickou ligací, která může být selektivně odříznuta (Dolinnaya a kol., 1983).

Dalši změny a zlepšeni této sekvenční metodologie jsou také pozorovány a spadají do rozsahu tohoto vynálezu. To zahrnuje použití modifikovaných oligonukleotidů ke zvýšení specifičnosti a účinnosti metod, podobné jako popsal Hoheisel a Lehrach /1990/. Cyklizační hybridizace se mohou také používat k zesílení, hybridizačního signálu, jak se používá při PCR technologii. V těchto případech se použije cyklů s rozdílnými teplotami k rehybridizaci určitých sond. Vynález také slouží ke stanovení posunu ve čtecích rámečcích za použití ekvimolárních množství sond, které mají rozdílnou bázi v koncové poloze. Například se používá ekvimolárních 7-mers, ve kterých prvních šest bází je stejně definovaná sekvence a poslední poloha může být A, T, C nebo G při alternativních možnostech.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady jsou zahrnuty pro doložení výhodných provedení tohoto vynálezu. Odborník v oboru by měl vzít v úvahu, že technické postupy uvedené v příkladech, které následují, představuji technické postupy nalezené původcem, které fungují dobře při provedení vynálezu, a tak mohou být oceněny při vytvoření výhodných způsobů pro praxi. Avšak odborník v oboru by ve světle tohoto zjištění uznal, že se může provést řada zvláštních ztělesnění, která jsou objevena, a stále se dosahuje stejných nebo podobných výsledků, aniž by se vybočilo z ducha a rozsahu tohoto vynálezu.

Příklad I

Příprava oligonukleotidů vázaných na nosič

Oligonukleotidy, to znamená malé segmenty nukleové kyseliny, se mohou snadno připravit například přímou syntézou oligonukleotidů chemickými prostředky, jako jsou obecně v praxi používné automatizované syntetizátory oligonukleotidů.

Oligonukleotidy vázané na nosič se mohou připravit libovolnou metodou známou odborníkovi v oboru za použití vhodného nosiče, jako je sklo, polystyren nebo teflon. Jednou strategií je přesně zjistit oligonukleotidy syntetizované normálními syntetizátory. Imobilizace se může dosáhnout za použití pasivní adsorpce (Inouye a Hondo, 1990), za použití ultrafialového záření (Nagata a kol., 1985, Dahlen a kol 1987, Morriey a Collins, 1939) nebo kovalentním vázáním báze modifikované DNA (Keller a kol., 1988, 1989), přičemž všechny literární dokazy se uvádějí jako součást dosavadního stavu techniky.

Jiná strategie, která se může použit, spočívá v použití silné interakce biotin - streptavidin jako spojovníku. Například Broude a kol. /1994/ popisuje použití biotinylovaných sond, i když tyto jsou duplexovými sondami, které jsou imobilizovány na magnetických kuličkách povlečených streptavidinem. Kuličky povlečené streptavidinem se mohou zakoupit od firmy Dynal, Oslo (Norsko). Samozřejmě, toto stejné chemické vázání je použitelné k povlékání libovolného povrchu se streptavidinem. Biotinylované sondy se mohou zakoupit z různých zdrojů, jako například od Operon Technologies (Alameda, CA, USA).

Nunc Laboratories (Naperville, IL, USA) také prodává vhodný materiál, který se může použít. Nunc Laboratories vyvinuly způsob, při kterém se DNA může kovalentně vázat k povrchu mikrojamek označovaných jako CovaLink NH. CovaLink NH je polystyrénový povrch naroubovaný sekundárními aminoskupinami (>NH), které slouží jako most - hlava pro další kovalentní kondenzaci. CovaLink Modules se může zakoupit od firmy Nunc Laboratories. Molekuly DNA se mohou vázat na CovaLink výlučné na konci 5' fosforamidátovou vazbou, co dovoluje imobilizaci více než 1 pmol DNA (Rasmussen a kol., 1991).

Použití pásků CovaLink NH pro kovalentní vázání DNA molekul na konci 5' je popsáno (Rasmussen a kol., 1991). Při této technologii se používá fosforamidátová vazba (Chu a kol., 1983). To je příznivé, protože imobilizace využívající pouze jediné kovalentní vazby je výhodná. Fosforamidátová vazba připojuje DNA k CovaLink NH sekundárním aminoskupinám, které jsou umístěny na konci prostorových ramen kovalentně naroubovaných na polystyrénový povrch přes 2 nm dlouhé prostorové rameno. K vázání oligonukleotidů ke CovaLink NH přes fosforamidovou vazbu, oligonukleotidový konec musí obsahovat 5' koncovou fosfátovou skupinu. Patrně je pro biotin rovněž možné, aby byl kovalentně vázán ke CovaLink a potom k streptavidinu použitému k vázání sond.

Přesněji uvedeno, vázací metoda zahrnuje rozpuštění DNA ve vodě (7,5 ng/μΐ) a denaturování za teploty 95 °C béhem 10 minut a poté chlazení ledem po dobu 10 minut. Ledově chladný 0,1 M 1-methylimidazol, hodnota pH 7,0 (1-Melm₇), se potom přidává do konečné koncentrace 10 mM 1-Melm₇. Poté se ss DNA roztok nadávkuje na CovaLink NH pásky (75 μΐ/jamka) při umístění v ledu.

Čerstvé se připraví karbodiimid, 0,2 M l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)karbodiimid (EDC), který se rozpustí v 10 mM l-Melm? a vnese v množství 25 μΐ do jamky. Pásky se inkubují za teploty 50 °C po dobu 5 hodin. Po inkubaci se pásky promyjí za použití například Nunc-Immuno Wash, přičemž nejprve se jamky promývají třikrát, potom se namočí promývacím roztokem na dobu 5 minut a nakonec se třikrát promývají (zde je promývacím roztokem 0,4N roztok hydroxidu sodného, 0,25% SDS zahřátý na teplotu 50 °C).

Bylo pozorováno, že další vhodná metoda pro použití podle tohoto vynálezu je popsána v PCT patentové přihlášce WO 90/03382 (Southern a Maskos), která se uvádí jako součást dosavadního stavu techniky. Tato metoda přípravy oligonukleotidu vázaného k nosiči zahrnuje připojení nukleotidovél3'-reakcního činidla přes fosfátovou skupinu kovalentní fosfodiesterovou vazbou k alifatickým hydroxyskupinám neseným nosičem. Oligonukleotid se potom syntetizuje na nosičovém nukleotidu a chránící skupiny se odstraní ze syntetického oligonukleotidového řetězce za obvyklých podmínek, které neodštěpí oligonukleotid od nosiče. Vhodná reakční činidla zahrnují nukleosid fosforamidit a nukleosid hydrogenfosforát.

K použití této metody se podrobněji uvádí, že se nosič, jako je skleněná deska, derivatizuje stykem se směsí xylenu, glycidoxypropyltrimethoxysilanu a stopy diisopropylethylaminu za teploty 90 °C přes noc. Vše se potom promyje důkladně methanolem a etherem a vysuší na vzduchu. Derivatizovaný nosič se potom zahřívá za míchání s hexaethylenglykolem obsahujícím katalytické množství koncentrované kyseliny sírové přes noc pod argonovou atmosférou za teploty 80 °C, čímž se dostane alkylhydroxyderivatizovaný nosič. Po promyti methanolem a etherem se nosič vysuší za sníženého tlaku a skladuje se pod argonovou atmosférou za teploty -20 °C.

Syntéza oligonukleotidů se potom provádí ručně za obvyklých podmínek při použití derivatizované skleněné desky jako tuhého nosiče. Prvním nukleotidem bude 3'-hydrogenfosfát, který se používá ve formé triethylaminové soli. Tato metoda způsobí na nosiči vázání oligonukleotidů o vysoké čistotě. ^%

Pro přípravu seskupení DNA sondy se může použít strategie na čipu. Například adresovatelná laserem aktivovaná fotodeprotekce se může použít při chemické syntéze oligonukleotidů přímo na skleněném nosiči, jak popsal Fodor a kol. /1991/, co se zde zahrnuje do dosavadního stavu techniky. Sondy také mohou být imobilizovány na nylonovém nosiči, jak popsal Van Ness a kol. /1991/, nebo vázány k teflonu za použití metody, kterou vypracoval Duncan a Cavalier /1988/, přičemž všechny tyto literární údaje se zahrnují do dosavadního stavu techniky.

Fodor a kol. /1991/ popisuje světlem řízenou syntézu dinukleotidů, která je použitelná k prostorově řízené syntéze komplexních sloučenin pro použití v mikrovýrobnim zařízení.

To je založeno na metodě, která používá světlo k řízení současné syntézy chemických sloučenin na tuhém nosiči. Vzor pro vystavení světlu nebo jiným formám energie přes masku nebo jiné prostorově adresovatelné zařízení určuje, které oblasti nosiče jsou aktivovány pro chemickou kondenzaci. Aktivace světlem vyplývá z odstranění fotolabilich chránících skupin z vybraných oblastí. Po odstranění chránících skupin se první sloučenině, nesoucí fotolabilní chránící skupinu, vystaví celý povrch, ale reakce probíhá pouze s oblastmi, kterým bylo adresováno světlo v předcházejícím stupni. Substrát se potom osvětluje přes druhou masku, která aktivuje odlišnou oblast pro reakci se sekundárně chráněným stavebním blokem. Vzor použitých masek při těchto osvětleních a sekvence reakčních činidel definují konečné produkty a jejich lokace. S Fodorovou metodou je možný vysoký stupeň miniaturizace, protože hustota syntézních míst se váže pouze k fyzikálním omezením na prostorovou adresovátelnost, to znameftá difrakci světla. Každá sloučenina je přístupná a její poloha je přesně známa. Proto se oligo čip zhotovený tímto způsobem může snadno použít v SBH.

Fodor a kol. /1991/ popisuje světlem aktivovanou tvorbu dinukleotidu takto: 5'-Nitroveratrylthymidin se syntetizuje z 3'-O-thymidinacetátu. Po odstranění chránící skupiny působením báze se 5'-nitroveratrylthymidin připojí k aminátovanému substrátu vazbou k 3'-hydroxyskupině. Nitroveratrylové chránící skupiny se odstraní osvětlováním přes 500-μιη šachovnicovou masku. Substrát se potom zpracuje s 2'-deoxycytidinem aktivovaným fosforamiditem. Proto aby následovala reakce fluorometricky, deoxycytidin se modifikuje s FMOC-chráněným aminohexylovým spojovníkem připojeným k exocyklickému aminu. Po odstranění FMOC chránící skupiny působením báze se oblasti, které obsahují dinukleotid, označí fluorescenčně zpracováním substrátu s FITC. Proto podle této metody se mohou syntetizovat oligonukleotidy vázané na nosič.

K vázání oligonukleotidu na nylonový nosič, jak popisuje Van Ness a kol. /1991/, se vyžaduje aktivace nylonového povrchu pomocí alkylace a selektivní aktivace 5'-aminu oligonukleotidů působením kyanurchloridu takto: Povrch nylonu se ethyluje při použití triethyloxoniumtetrafluorborátu za vzniku s aminem reaktivních imidátesterů na povrchu nylonu, přičemž l-methyl-2-pyrrolidon se použije jako rozpouštědlo. Povrch nylonu se nehladí, aby se dosáhlo co největší plochy povrchu.

Aktivovaný povrch se potom nechá reagovat s poly(ethyleniminem) (M_r ~ 10 K až 70 K) za vzniku polymeru, který je povlečen tak, že poskytuje zvětšený povrch aminu pro připojení oligů. Oligonukleotid nebo oligonukleotidy s aminovým ocasem selektivně reagují s přebytkem kyanurchloridu výlučně na aminovém ocasu, a poskytují 4,6-dichlor-l,3,5-triazinyloligonukleotid nebo 4,6-dichlor-l,3,5-triazinyloligonukleotidy v kvantitativním výtěžku. Náhrada jednoho chlorového zbytku z kyanurchloridu reaktivní aminoskupinou významně omezuje reaktivitu zbýávajících skupin chloru. To způsobuje zvýšenou hydrolytickou stabilitu 4,6-dichlor-l,3,5-triazinyloligonukleotidu nebo 4,6-dichlor-l,3,5-triazinyloligonukleotidú, který je nebo které jsou stabilní po prodloužené časové období v pufrovaných vodných roztocích (hodnota pH 8,3, teplota 4 °C, trvání 1 týden) a snadno se izoluje nebo izolují a čistí elusní chromatografií podle velikosti nebo ultrafiltrací.

Reakce je specifická pro aminový ocas s nezřejmou reakcí na nukleotidových částech. Povrch nylonu povlečený PEI se potom nechá reagovat s oligonukleotidem aktivovaným ' kyanurchloridem. Vysoké koncentrace zachycené sekvence se snadno imobilizuji na povrchu a nezreagované aminy se zachycují anhydridem kyseliny jantarové v konečném stupni derivatizačniho procesu.

Zvláštní cestou pro přípravu oligonukleotidů vázaných na nosič je použití syntézy vyvolané světlem, jak popisuje Pease se společníky (1994, uvádí se zde jako součást dosavadního stavu techniky). Tito autoři využívají současného fotolitografického technického postupu k vytvoření seskupení imobilizovaných oligonukleotidových sond (DNA čipy). Tyto metody, při kterých se používá světlo k přímé syntéze oligonukleotidových sond o vysoké hustotě, jsou založeny na miniaturizovaných seskupeních, použiti fotolabilních 5'-chráněných N-acyldeoxynukleosidových fosforamiditu, chemii spojovníků povrchu a všestranné kombinační strategie syntézy. Tímto způsobem se může vytvořit základní hmota z 256 prostorové definovaných oligonukleotidových sond a potom se může použít při výhodném sekvencování formátu 3, jak je zde popsáno.

Pease a kol. /1994/ předkládají strategii vhodnou pro použití při syntéze oligonukleotidů řízené světlem. Při tčťo metodě se povrch tuhého nosiče modifovaný fotolabilními chránícími skupinami osvětluje přes fotolitografickou masku, čímž se dostanou reaktivní hydroxyskupiny v osvětlené oblasti. Deoxynukleosid aktivovaný 3O-fosforamiditem ( 5'-hydroxyskupina chráněna fotolabilní skupinou) se potom ukáže na povrchu a kondenzace se provede v místech, která jsou vystavena působení světla. Po zachycení a oxidaci se substrát opláchne a povrch se osvětluje přes druhou masku, aby se další hydroxyskupiny vystavily kondenzaci. Na povrchu je přítomen druhý 5'-chráněný deoxynukleosid aktivovaný 3O-fosforamiditem. Selektivní fotodeprotekce a kondenzační cykly se opakují, až se dostane požadovaný soubor produktů. Protože se používá fotolitografie, způsob se může miniaturizovat k vytvoření seskupení oligonukleotidových sond o vysoké hustotě, jejichž sekvence jsou známy v každém místě.

Syntetická cesta pro přípravu nezbytných 5'0-(a-methyl-6-nitropiperonyloxykarbonyl)-N-acyl-2'-deoxynukleosid

- 37 fosforamiditů (MeNPoc-N-acyl-2'-deoxynukleosid fosforamiditů) zahrnuje první stupeň, ve kterém se N-acyl-2'-deoxynukleosid nechá reagovat s l-(2-nitro-4,5-methylendioxyfenyl)ethyl-l-chloroformiátem za vzniku 5'-MeNPoc-N-acyl-2’-deoxynukleosidu. Ve druhém stupni se 3'-hydroxylové reakčni činidlo nechá reagovat s 2-kyanethyl-N,Ν'-diisopropylchlorfosforamiditem za použití normálních postupů, za vzniku 5'-MeNPoc-N-acyl-2'-deoxynukleosid-3'-O-(2-kyanethyl-N,N-diisopropyl)fosforamiditů. Fotochránicí skupina je stabilní za podmínek pro obvyklou syntézu fosforamiditů a může se odstranit vodnou bázi. Tato reakčni činidla se mohou skladovat po dlouhé časové období pod argonovou atmosférou za teploty 4 °C.

Pro MeNPoc-dT, MeNPoc-dC^ibu, MeNPoc-dG^PAC a MeNPoc-dA^PAC jsou uvedeny poločasy fotolýzy 28 s, 31 s, 27 s a 18 s (Pease a kol., 1994). Při litografické syntéze jsou proto doporučeny doby osvětlování 4,5 min (9 x tjy ₂ MeNPoc-dC) k zajištění, že se odstraní více než 99 % MeNPoc chránících skupin.

Vhodným syntetickým nosičem je nosič sestávající ze skleněného substrátu 5,1 x 7,6 cm, připravený vyčištěním koncentrovaným roztokem hydroxidu sodného, s následujícím opláchnutím ve vodě, které je prováděno za odsávání. Povrchy by se potom mély derivatizovat po dobu 2 hodin roztokem, který obsahuje 10 % objemových bis-(2-hydroxyethyl)aminopropyltriethoxysilanu (Petrarch Chemicals, Bristol, PA, USA) v 95% ethanolu, důkladné opláchnout ethanolem a etherem, vysušit za teploty 40 °C při sníženém tlaku a zahřívat na teplotu 100 °C po dobu 15 minut. Při takové studii by syntézní spojník měl být připojen reagujícími derivatizovanými substráty s 4,4'-dimethoxytrityl(DMT)-hexaethoxy-0-kyanethyIfosforamiditem.

Uvedeno v souhrnu, k zahájení syntézy oligonukleotidové sondy by se příslušný deoxynukleosid fosforamiditový derivát měl připojit k syntetickému nosiči přes spojovník. Oblasti nosiče se potom aktivují pro syntézu osvětlováním, například zařízením s fotolitografickou maskou o rozměru 800 x 12 800 i±m. Další cykly syntézy fosforamiditu se mohou provádět (š 4,4'-dimethoxytrityl-chráněnými deoxynukleosidy), k vytvoření libovolné požadované sekvence, jako je některá ze sekvencí 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9- nebo rovněž 10-mer. Po odstraněni fosfátu a exocyklických aminových chránících skupin působením koncentrovaného hydroxidu amonného během 4 hodin se poté substrát může připojit v hybridizační komoře řízené termostaticky, s vytápěným pláštěm, která je připravena k použití.

DNA čip se samozřejmě může snadno zakoupit z komerčních zdrojů, jako jeden z čipů aktivovaných světlem, které jsou popsány výše. V tomto ohledu je možné kontaktovat firmu Affymetrix ze Santa Clara, CA 95051, USA, a firmu Beckman.

Přiklad II

Modifikované oligonukleotidy pro použití v sondách

Modifikované oligonukleotidy se mohou používat při způsobech podle tohoto vynálezu ke zvýšení specifičnosti nebo účinnosti hybridizace. Cestou k dosažení toho je substituce přirozených nukleotidů bázickou modifikací. Například se mohou používat pyrimidiny s atomem halogenu v poloze C5. To se očekává vzhledem ke zlepšení duplexové stability vlivem nahromaděni bází. 2,6-Diaminopurin se může také používat k dosažení třetí vodíkové vazby v tomto páru bází s thyminem, přitom vznikají tepelně stabilizující DNA duplexy. Uvádí se, že použití 2,6-diaminopurinu vede k značnému zlepšení duplexové stability krátkých oligomerů. Je navrženo jeho včlenění, které dovoluje přísněji řízené podmínky pro tepelnou hybridizaci priméru, čímž se zlepšuje specifičnost duplexové formace a potlačují problémy s pozadím nebo použití kratších oligomerů.

·*

Syntézu trifosfátových verzí těchto modifikovaných nukleotidů popisuje Hoheisel a Lehrach (1990, a zde se zahrnuje jako součást dosavadního stavu techniky). Uvedeno v krátkosti, 5-chlor-2'-deoxyuridin a 2,6-diaminopurin 2'-deoxynukleosid se dají zakoupit, například od firmy Sigma. Fosforylace se provádí takto: 50 mg suchého NH₂-dAdo se vnese do 500 μΐ suchého triethylfosfátu za míchání pod argonovou atmosférou. Potom se přidá 25 μΐ oxychloridu fosforečného POC1₃ a směs se inkubuje za teploty -20 °C. Mezitím se 1 mmol kyseliny pyrofosforečné rozpustí v 0,95 ml tri-n-butylaminu a 2 ml methanolu a vysuší na rotační odparce. Poté se provede sušení dvojím odpařením s 5 ml pyridinu, přičemž před druhým odpařením se přidá 70 μΐ tri-n-butylaminu. Nakonec se odparek rozpustí ve 2 ml dimethylformamidu.

Po 90 minutách za teploty -20 °C se fosforylační směs odpaří, k odstranění přebytku oxychloridu fosforečného, a přidá se tri-n-butylamoniumpyrofosfát v dimethylformamidu. Inkubace se provádí za teploty místnosti po dobu 1,5 minuty. Reakce se zastaví přidáním 5 ml 0,2M triethylamoniumhydrogenuhličitanu (hodnota pH 7,6) a vše se udržuje v ledovém prostředí po dobu 4 hodin. Pro 5-Cl-dUrd by podmínky byly identické, ale přidalo by se 50 μΐ oxychloridu fosforečného a fosforylace by se prováděla za teploty místnosti po dobu hodin.

Po hydrolýze se smés odpaří, hodnota pH upraví na

7,5, a vše se extrahuje l objemem diethyletheru. Produkty se oddělí, například ma sloupci Q-Sepharose (2,5 x 20 cm) za použití lineárního gradientu 0,15 až 0,8 M triethylamoniumhydrogenuhličitanu. Látka se skladuje vymražená a nukleotidy jsou stabilní během dlouhého časového období.

Λ

Může se také použit nediskriminující bázický analog nebo univerzální báze, jak popisuje Nichols a kol. /1994/. Tento nový analog, l-(2'-deoxy-0-D-ribofuranosyl)-3-nitropyrrol (označovaný jako M) se připravuje pro použiti v oligonukleotidových sondách a primérech pro vyřešení určených problémů, které vznikají jako výsledek degener, · genetického kódu nebo pokud jsou dostupné toliko hodnoty pro fragmentární peptidové sekvence. Tento analog maximalizuje hromadění, zatímco minimalizuje interakce s vázáním vodíku bez stérického otevřeni DNA duplexu.

M nukleosidový analog je určen k maximalizaci hromadění interakcí za použití aprotických polárních substituentů vázaných k heteroaromatickým kruhům, co zvyšuje intra- a inter-vinuté hromadící interakce ke zmenšení úlohy vázání vodíku ve specifičnosti párů bází. Nichols a kol. /1994/ dává přednost 3-nitropyrrol 2'-deoxyribonukleosidu, protože jeho struktura a elektronické uspořádání se podobá p-nitroanilinu, jehož deriváty patří k nejmenší známým interkalátorům dvojitě vinuté DNA.

Fosforamidit nukleosidu M, chráněný dimethoxytritylem, je také dostupný pro inkorporaci do nukleotidů používaných jako priméry pro sekvencování a reakce polymerasového řetězce (PCR). Nichols a kol. /1994/ ukazuje, že podstatný počet nukleotid se může nahradit M bez ztráty primérové aktivity.

Jedinečná vlastnost M je jeho schopnost nahradit dlouhé řetězce přiléhajících nukleosidů a ještě poskytnout funkční sekvencující priméry. U sekvencí se třemi, šesti a devíti M substitucemi se vždy uvádí, že mají čitelný sekvencující žebřík a PCR se třemi odlišnými priméry obsahujícími M mají vždy za výsledek rozšíření správného produktu (Nichols a kol., 1994).

Schopnost oligonukleotidů obsahujících 3-nitropyrrol fungovat jako priméry silné ukazuje, že duplexová struktura se musí tvořit s komplementárním vinutím. Optické termální profily získané z oligonukleotidových párů d(5'-C₂-T₅XT₅G₂-3') a d(5'-C₂A₅YA₅G₂-3'), kde X a Y mohou být A, C, G, T nebo M, jsou uvedeny jako shodné k normálnímu esovítému vzoru pozorovanému pro DNA tranzici dvojitého na jednoduché vinutí. U hodnot T_m oligonukleotidů obsahujících X.M párů bází, kde X znamená*A, C, G nebo T a Y představuje M, se uvádí, že vždy spadají do rozmezí 3 °C (Nichols a kol., 1994) .

Příklad III

Příprava sekvencujících čipů a seskupení

Tento příklad popisuje fyzikální ztělesnění sekvencujících čipů nalezených původcem.

Základním příkladem je použiti 6-mer připojených k 50(im povrchům, které poskytují čipy o rozměru 3x3 mm, které se mohou kombinovat, aby se dostala seskupení 20 x 20 cm. Jiným příkladem je použití 9-mer oligonukleotidů připojených k 10 χ ΙΟμιη povrchu, k vytvoření 9-mer čipu s rozměry 5x5 mm. 4000 jednotek takových čipů se může použít k vytvoření seskupeni o rozměru 30 x 30 cm. Obr. 2A, obr. 2B a obr. 2C ilustruji ještě jiné příklady seskupení, ve kterých je uspořádáno 4000 až 16 000 oligočipů do čtvercového seskupení. Desky nebo kolekce zkumavek, jak je také nakresleno, mohou být uloženy se seskupením jako část soupravy pro sekvencování.

Seskupení mohou být navzájem dělena fyzikálně nebo hydrofobními povrchy. Jednou možnou cestou k použití hydrofóbního separačního pásku je použití technologie, jako je Iso-Grind Microbiology System, zpracované firmou QA Laboratories, Toronto, Kanada.

Hydrofobní mřížkové membránové filtry (HGMF) se používají v analytické mikrobiologii potravin po dobu přibližně deseti let, kdy se projevuje jedinečná přitažlivost rozšířeného číselného rozmezí a automatického počítání kolonií. Jedním komerčně dostupným mřížkovým filtrem je ISO-GRID™ od firmy QA Laboratories Ltd. (Toronto, Kanada), sestávající ze čtverce (60 x 60 cm) polysulfonového polymeru (Gelman Tuffryn HT-450, velikost pórů 0,45 μ,ιη), na které je natištěna černým hydrofóbním inkoustem mřížka, sestávající z 1600 (40 x 40) čtvercových buněk. HGMF již byl předem naočkován bakteriální suspenzí pomocí vakuové filtrace a inkubován v rozdílném nebo selektivním prostředí, vybraném podle volby.

Protože mikrobiální růst je potvrzen na mřížce buněk známé polohy a velkosti na membráně, HGMF funguje pravděpodobněji na MPN zařízeni než na obvyklé desce nebo membránovém filtru. Peterkin a kol. /1987/ uvádějí, že tyto HGMFs se mohou použít k šíření a skladování genomické sbírky, pokud se použiji s HGMF replikátorem. Jedno takové zařízení replikuje růst z každé z 1600 buněk ISO-GRID a umožňuje získání mnoha kopií ze základní HGMF, které se mají zhotovit (Peterkin a kol., 1987).

Sharpe a kol. /1939/ také používá ISO-GRID HGMF od firmy QA Laboratories Ltd., automatizovaný HGMF počítač (MI-100 Interpreter) a replikátor RP-100. Ty uvádějí technický postup pro udržování a zatřídění mnoha mikrobiologických kultur.

Peterkin a společníci později popsali způsob vyšetřování DNA sond za použití fydrofóbního mřížkového membránového filtru (Peterkin a kol., 1939). Tito autoři uvádějí způsoby pro účinnou kolonovou hybridizaci přímo na HGMFs. Dříve se dosahovaly špatné výsledky v důsledku nízké kapacity DNA vázání polysulfonového polymeru, na kterém jsou HGMFs natištěny. Avšak Pekertin a společníci /1989/ uvádějí, že vázání DNA k povrchu membrány se zlepší zpracováním replikovaného a inkubovaného HGMF s polyethyleniminem, polykationem, před stykem s DNA. Třebaže tyto časné práce používají připojenou celulární DNA, a tvoří odlišný předmět od přítomného vynálezu, popsaná metodologie se může snadno upravit pro formát 3 SBH.

Za účelem rychlé identifikace vhodných sekvencí, Peterkin a kol. /1989/ používají radioaktivně značenou plasmidovou DNA z různých klonů a testují její specifičnost proti DNA na připravených HGMFs. Tímto způsobem DNA z rekombinantních plasmidů se rychle vyšetří kolonovou hybridizací proti 100 organizmům na HGMF replikátech, které mohou být snadno a reprodukovatelně připraveny.

Jsou vyřešeny dva základní problémy. Manipulace s malými čipy (2 až 3 mm) a paralelní provedení tisíců reakci. Řešením podle tohoto vynálezu je udržet čipy a sondy v odpovídajícím seskupení. Například čipy obsahující 250 000 9-mers se syntetizují na silikonovém kotoučku ve formě 8 x 8 mM desek (15 μΜ/oligonukleotid, Pease a kol., 1994),^ uspořádaných do formátu 8 x 12 (96 čipů) s 1 mM drážkou mezi nimi. Sondy se přidají bud multikanálovou pipetou nebo pomocí čepového seskupení, a to jedna sonda na jeden čip. K rýhování všech 4000 6-mers se použije 42 čipových seskupení, buď za použití rozdílných seskupení nebo za několikanásobného opétnovného použití jednoho souboru čipového seskupeni.

Ve výše uvedeném případě, za použití dřívější nomenklatury z tohoto spisu, F = 9, P=6aF+P=15. Čipy mohou mít sondy vzorce BxNn, kde x znamená počet zvláštních bází B a n označuje počet nespecifických bází, takže x = 4 až 10 a η = 1 až 4. K odsažení účinnější hybridizace a vyhnutí se možnému vlivu některých oligonukleotidú na nosiči, zvláštní báze mohou obklopovat nespecifické báze, tak představované vzorcem jako je (N)nBx(N)m (obr. 4).

Přiklad IV

Příprava fragmentů nukleové kyseliny

Nukleová kyselina určená k sekvencováni se může dostat z libovolného vhodného zdroje, jako z cDNAs, genomické DNA, chromosomální DNA, mikrorozřezaných chromosomových pásů, kosmidů nebo YAC insertů, a z RNA, včetně mRNA bez jakýchhokoli rozšiřujících stupňů. Například Sambrook a kol.

/16989/ popisuje tři pracovní postupy pro izolaci DNA o vysoké molekulové hmotnosti ze savčích bunék (p.

9.14-9.23).

Nukleové kyseliny by se potom měl fragmentovat libovolnými metodami známými odborníkovi v oboru včetně například použití restrikčních emzymů jak popisuje na 9.24-9.28 Sambrook a kol. /1939/, za ppužití střihu ultrazvukem a zpracování s hydroxidem sodným.

Střihání nižším tlakem je také vhodné, jak popsal Schriefer a kol. (1990, zahrnuje se jako součást dosavadního stavu techniky). Při této metodě se vzorky DNA vedou malými French-tlakovými buňkami při měnícím se tlaku od nízkého ke střednímu. Pákové zařízení dovoluje řízenou aplikaci od nízkých do středních tlaků na buňku. Výsledky těchto studií ukazují, že nízkotlaké střihání je vhodnou alternativou k ultrazvukovým a enzymatickým DNA fragmentačním metodám.

Zvláště vhodnou cestou pro fragmentování DNA je pozorování, které se má provést za použití dvou bázických rekognikačních endonukleas, CviJI, které popsal Fitzgerald a kol. /1992/. Tito autoři popisují chování při rychlé fragmentaci a fragmentaci DNA ve zvláštních místech, které, se potom pozorují, zda jsou vhodná pro vynucené klonování a sekvencování. Tento původce předvídá, že budou také zvláště vhodná pro vytváření nahodilých, ale relativně malých fragmentů DNA, které budou určeny pro použití při přítomné technologii sekvencování.

Restrikóní endonukleasa CviJi normálně štěpí rekognikaóní sekvenci PuGCPy mezi G a C a zanechává tupé konce. Atypické reakční podmínky, které mění specifičnost s“ tohoto enzymu (CviJI**), mají za výsledek quasi-randomovou distribuci fragmentů DNA z malé molekuly pUC19 (2688 párů bází). Fitzerald a společníci /1992/ kvantitativně ohodnotili nahodilost této fragmentacni strategie, za použití CviJi digerováné z pUC19, kdy jde o velikost fragmentovanou metodou rychlé gelové filtrace a přímou ligací bez konečného opravování k lacZ minus M13 klonujícímu vektoru. Sekvenční analýza 76 klonů vhazuje, že CviJi** působí restrikčně na PyGCPy a PuGCPu, kromě toho k PuGCPy místům, a že nové sekvenční hodnoty jsou nashromážděny v rozsahu shodujícím se s nahodilou fragmentaci.

Jak je uvedeno v literatuře, výhody tohoto chování ve srovnání s působením ultrazvuku a agarosovou gelovou frakcionací spočívají v tom, že je vyžadováno menší množství DNA (0,2 až 0,5 μg na místo 2 až 5 μ.ιη) a je zahrnuto méně stupňů (není zapotřebí, aby se prováděla preligace, konečná oprava, chemická extrakce nebo agarosová gelová elektroforéza a eluce). Tyto výhody jsou také navrženy k použití, pokud se připravuje DNA pro sekvencování formátem 3.

Bez ohledu na způsob, jakým se dostanou nebo připraví fragmenty nukleové kyseliny, je důležité denaturovat DNA, aby se dostaly jednou vinuté kusy dostupné pro hybridizaci. Toho se dosahuje inkubací DNA roztoku za teploty 80 až 90 °C po dobu 2 až 5 minut. Roztok se potom rychle ochladí na teplotu 2 °C, aby se zabránilo renaturaci DNA fragmentů, předtím než se dostanou do styku s čipem. Fosfátové skupiny se musí také odstranit z genomické DNA, jak je popsáno v příkladu VI.

Příklad V

Příprava značených sond

Μ

Oligonukleotidové sondy se mohou připravit automatizovanou syntézou, která je béžnou záležitostí pro odborníka v oboru, například za použití systému označovaného jako Applied Biosystems. Při jiném provedení se sondy mohou připravit za použití metod vypracovaných firmou Genosys Biotechnologies lne., za použití souborů kotoučků z porézního teflonu.

Oligonukleotidové sondy se mohou značit například radioaktivními značkovacími prostředky (³⁵S, ³²P, ³³P, výhodně ²³P) pro seskupení s 100 až 200μπι nebo 100 až 400μιπ skvrnami, neradioaktivními isotopy (Jacobsen a kol., 1990) nebo fluorofory (Brumbaugh a kol., 1988). Všechny takové značící metody jsou běžné v oboru, jak uvádí na příkladech relevantních sekcí Sambrook a kol. /1939/ a jak je popsáno v další literatuře, jako například jak popisuje Schubert a kol. /1990/, Mutrakami a kol. /1991/ a Cate a kol. /1991/, přičemž všechny tyto články jsou jednotlivé uvedeny jako součást dosavadního stavu techniky.

S ohledem na značeni radioaktivními značkovači, obecné způsoby spočívají v koncovém značení za použití T4 polynukleotid kinasy, vysoce specifické aktivity značící látky používající Klenow nebo rovněž T7 polynerasy. Ty se popisují dále.

Syntetické oligonukleotidy se připravují synteticky bez fosfátové skupiny na jejich 5' koncích a jsou proto snadno značeny přenosem t-³²P nebo t-³³P z [t-³²P]ATP nebo [t-³³P]ATP, za použití enzymové bakteriofágové T4 polynukleotidové kinasy. Pokud se reakce provádí účinně, specifická aktivita takových sond může být tak vysoká jako specifická aktivita samotného [t-³²P]ATP nebo [τ-³³ρ]ΑΤΡ. Reakce popsaná dále je určena ke značení 10 pmol oligonukleotidu o vysoce specifické aktivitě. Značení rozdílných množství oligonukleotidu mohou snadno být dosažena zvýšením nebo snížením rozsahu reakce, při udržování koncentrací všech složek na konstantní úrovni.

Reakční směs by se měla vytvořit za použití 1,0 μΐ oligonukleotidu (10 pmol/μΙ), 2,0 μΐ 10 x bakteriofágového T4 polynukleotidového kinasového pufru, 5,0 μΐ [t-³²P]ATP nebo [t-³³P]ATP (specifická aktivita l,85.10”^/mmol.s, 370 kBq/ml ve vodném roztoku) (10 pmol) a 11,4 μΐ vody. 8 jednotek (přibližně 1 μΐ) bakteriofágové T4 polynukleotidové kinasy se přidá k reakční směsi dobře míšené a inkubuje za teploty 37 °c po dobu 45 minut. Reakční směs se zahřívá na teplotu 68 °C po dobu 10 minut k inaktivaci bakteriofágové T4 polynukleotidové kinasy.

Potom se stanoví účinnost přenosu ³²P nebo ³³P na oligonukleotid a jeho specifická aktivita. Pokud specifická aktivita sondy je přijatelná, provede se její vyčištění. Jestliže je specifická aktivita příliš nízká, přidá se dalších 8 jednotek enzymu a inkubuje se za teploty 37 °C dalších 30 minut předtím, než se reakční směs zahřívá na teplotu 68 °C po dobu 10 minut k inaktivaci enzymu.

Čistění radioaktivně značených oligonukleotidu se může dosáhnout srážením ethanolem, srážením cetylpyridiniumbromidem, chromatografii na bio-gelu P-60 nebo chromatografií na koloně naplněné Sep-Pak C₁₃.

Sondy s vyššími specifickými aktivitami se mohou dostat za použiti Klenow fragmentu E. coli. DNA polymerasa

I slouží k syntéze vinutí DNA komplementárně k syntetickému oligonukleotidu. Krátký primér se hybridizuje na oligonukleotidovou matrici, jehož sekvence je komplement k požadované radioaktivně značené sondé. Primér se potom prodlouží za použití Klenow fragmentu E. coli DNA polymerasy I, aby se vpravily [a-³²P]dNTPs nebo [a-³³P]dNTPs do matrice řízeným způsobem. Po reakci se matrice a produkt oddělí denaturací a potom elektroforézou přes polyakrylamidový gel za denaturačních podmínek. S touto metodou je možné vytvářet oligonukleotidové sondy, které obsahují několik radioaktivních atomů na molekulu oligonukleotidu, pokud je to zapotřebí .

Při použití této metody by se měla smíchat ve zkumavce mikrofugy vypočtená množství [a-³²P]dNTPs nebo [a-³³P]dNTPs, nezbytná k odsažení požadované specifické aktivity a dostatečná k tomu, aby dovolily úplnou syntézu všech vinutí matrice. Koncentrace dNTPs by neměly být menší než 1 μπι v libovolném stupni během reakce. Potom se přidá do zkumavky příslušné množství priméru a matricových DNAs, s primérem, který je v trojnásobném až desetinásobném množství proti matrici.

Ke smési se potom má přidat 0,1 objemu 10 x Klenow pufru a vše dobře míchat. 2 až 4 jednotky Klenow fragmentu E. coli DNA polymerasy I se mají potom přidat na 5 μΐ reakcního objemu, míchat a inkubovat za teploty 4 °C po dobu 2 až 3 hodin. Pokud je to žádoucí, průběh reakce se může sledovat odebíráním malých alikvotů (0,1 μΐ) a měřením podílu radioaktivity, kterou lze začít srážet 10% kyselinou trifluoroctovou (TCA).

Reakční směs se má zředit rovným objemem pufru naplněného gelem, zahřívat na teplotu 80 °C po dobu 3 minut a potom se celý vzorek vloží na denaturující polyakrylamidový gel. Po elektroforéze se gel autoradiografuje, co dovoluje, aby sonda byla lokalizována a odstraněna z gelu. Různé metody pro fluorofóbní značení jsou také dostupné, jak je uvedeno dále. Brumbaugh a kol. /1933/ popisují syntézu fluorescenčně značených primérů. Syntetizuje se deoxyuridinový analog s primárním aminem, spojovnikovým ramenem 12 atomů uhlíku připojeným na C-5. Syntéza analogu sestávajícího z derivatizovaného 2'-deoxyuridinu přes organokovové meziprodukty poskytne 5·-(methylpropenoyl)-2'-deoxyuridin. Reakce s dimethoxytritylchloridem vede k přípravě odpovídajícího 5'-dimethoxytritylového aduktu. Methylester se hydrolýzuje, aktivuje a nechá reagovat s příslušné monoacylovaným alkylaminem. Po vyčištění se výsledné nukleosidy opatřené spojovnikovým ramenem konvertují na nukleosidové analogy, vhodné pro chemickou syntézu oligonukleotidů.

Oligonukleotidy se potom připraví tak, že zahrnují jednu nebo dvě báze jako spojovníkové ramena při použití modifikované chemie pro fosforidity. K roztoku 50 nmol spojovníkového ramena, oligonukleotidu ve 25 μ.1 500 mM hydrogenuhličitanu sodného (hodnota pH 9,4) se přidá 20 μ.1 300 mM FITC v dimethylsulfoxidu. Směs se míchá za teploty místnosti po dobu 6 hodin. Oligonukleotid se oddělí od volné FITC eluováním z 1 x 30 cm kolony naplněné Sephadexem G-25 za použití 20 mM octanu amonného (hodnota pH 6), kombinující frakce s prvním pikem absorbujícím ultrafialové záření.

Z obecného hlediska, fluorescenční značení oligonukleotidu na jeho 5'-konci původně zahrnovalo dva stupně. Nejprve se N-chránéný aminoalkylfosforamiditový derivát připojuje k 5'-konci oligonukleotidu během automatizované DNA syntézy. Po odstraněni všech chránících skupin se NHS ester příslušného fluorescenčního barviva kondenzuje na 5'-aminoskupiné přes noc, potom se čisti od značeného oligonukleotidů z přebytku barviva za použití reversní fáze HPLC nebo PAGE.

Schubert a kol. /1990/ popisuje syntézu fosforamiditu, která umožňuje, aby oligonukleotidy značené fluoresceinem byly připravovány béhem automatizované DNA syntézy. Methylester fluoresceinu se alkyluje 4-chlor-(4,4'-dimethyltrityl) -1-butanolem v přítomnosti uhličitanu draselného a jodidu draselného v dimethylformamidu po dobu 17 hodin. Po odstranění tritylové skupiny působení 1% kyseliny trifluoroctové v chloroformu se látka fosfityluje běžnými postupy s bis(diisopropylamino)methoxyfosfinem. Fosforylace výše získaného fluoresceinového derivátu zavede H-fosfonát v příznivých výtěžcích. Výsledný amidit (0,1 M roztok v suchém acetonitrilu) se použije pro automatickou syntézu různých primérů za použití chemie β-kyanethylfosforamiditu a DNA syntetizátoru. Odštěpení od nosiče a odstranění chránící skupiny se provádí pomocí 25% vodného roztoku amoniaku po dobu 36 hodin za teploty místnosti. Surový produkt se čistí PAGE a značený primer je vizualizován jako světle zelený fluorescenční pás při vlnové délce 310 nm. Eluování a odsolení za použití patrony RP 18 poskytne požadovanou látku.

Fluorescenční značení 5'-konce sondy při Schubertově metodě se dosahuje přímo béhem DNA syntézy v posledním kondenzačním cyklu. Výtěžek z kondenzace je tak vysoký, jako se dosahuje u obvyklých fosforamiditů. Po odstranění chránících skupin a odstranění amoniaku lyofilizaci za použití rychle upravovaného vakua nebo srážením ethanolem, se fluorescenčně značené oligonukleotidy mohou přímo použít pro DNA sekvencování ve formátu 3 SBH.

Murakami a kol. také popisuje přípravu oligonukleotidů značených fluoresceinem. Tato syntéza je založena na fosforamiditu neseném polymerním nosičem a hydrogenfosfátové metodě. Ethylendiamin nebo hexamethylendiamin se používají jako možná reakční ^činidla. Mohou se zavádět přes fosforamidátový spojovník, který se vytvoří oxidací hydrogenfosfonátového meziproduktu v chloroformovém roztoku. Modifikované oligonukleotidy se podrobují značení za použití činidla orientujícího primární amin, FITC, na kuličky. Výsledný modifikovaný oligonukleotid se odštěpí z kuliček a následně čistí RPLC.

Kate a kol. /1991/ popisuje použití oligonukleotidových sond přímo konjugovaných k alkalické fosfatase v kombinaci s přímo chemiluminiscenčním substrátem (AMPDD), aby se dovolila detekce sondy. Alkalická fosfatasa se’ může kovalentně kondenzovat k modifikované bázi oligonukleotidu.

Po hybridizaci se oligo má inkubovat s AMPDD. Enzymovaná alkalická fosfatasa rozkládá AMPDD a poskytuje sloučeninu, která způsobuje fluorescenci bez excitace, to znamená, že není zapotřebí laser. Pozoruje se, že za použití takové technologie se může vytvářet silný signál.

Značené sondy se mohou snadno zakoupit z různých komerčních zdrojů, včetně GENgET, spíše než připravovat synteticky.

Příklad VI

Odstranění fosfátových skupin

Jak bakteriální alkalická fosfatasa (BAP), tak telecí intestinální alkalická fosfatasa (CIP) katalýzují odstranění 5'-fosfátových zbytků z DNA a RNA. Jsou proto vhodné pro odstranění 5'-fosfátů z DNA a/nebo RNA, aby se zabránilo ligaci a nevhodné hybridizaci. Odstranění fosfátu, jak popsal Sambrook a kol. /1989/, se má provést po odříznutí nebo jiném odstřižení genomické DNA.

Bakteriální alkalická fosfatasa je aktivnější z obou alkalických fosfatas, ale je také mnohem odolnější k teplu a detergentům. Je proto obtížné inhibovat bakteriální alkalickou fosfatasu úplně na konci defosforylačnich reakcí. Proteinasa K se používá k digesci telecí intestinální alkalické fosfatasy, která se musí úplně odstranit, pokud se má následující ligace provést účinně. Alternativní metoda spočívá v inaktivací telecí intestinální alkalické fosfatasy teplem při teplotě 65 °C béhem 1 hodiny (nebo při teplotě 75 °C béhem 10 minut) v přítomnosti 5 mM EDTA (hodnota pH 8,0) a potom se defosforylovaná DNA čistí extrakcí směsí fenolu a chloroformu.

Příklad VII

Prováděni sekvencování dvoustupňovou hybridizaci

Dále jsou popsány určité příklady provedení metodologie sekvencování, posuzované původcem. Především se má hybridizovat celý čip se směsí DNA jako komplex 100 milionů párů bází (jeden lidský chromosom). Návod k provedení hybridizace se může najít v literatuře, jako uvádí Drmanac a kol. /1990/, Khrapko a kol. /1991/ a Broude a kol. /1994/. Tyto články uvádějí rozmezí hybridizačních teplot, pufry a promývací stupně, které jsou vhodné pro použití při počátečních stupních formátu 3 SBH.

Původce tohoto vynálezu zvláště zpozoroval, že hybridizace se může provádět po několik hodin při vysokých koncentracích solí a za nízkých teplot (od -2 do 5 °C), pro relativné nízkou koncentraci cílové DNA, která se může dosáhnout. Z tohoto důvodu se používá pufr SSC na místo natriumfosfátového pufru (Drmanac a kol., 1990), který sráží při teplotě 10 °C. Promývání nemá být rozsáhlé (několik minut) pro druhý stupeň a může být úplné vynecháno, pokud se hybridizační cyklizace použije pro sekvencování vysoce komplexních DNA vzorků. Stejný pufr se použije pro hybridizační a promývací stupně, aby bylo možno pokračovat druhým hybridizačním stupněm se značenými sondami.

Po vlastním promývání využívajícím jednoduché robotické zařízeni na každé seskupení, například seskupení 8 x 8 mm (příklad III), má se přidat jedna značená sonda, například 6-mer. Má se použít zařízeni s 96 čepy nebo 96 hroty, protože dovoluje 42 operací. Znovu se má použít rozmezí diskriminačních podmínek, jako již dříve bylo popsáno ve vědecké literatuře.

Původce tohoto vynálezu zvláště pozoroval použití dále uvedených podmínek. Předně po přidání značených sond a inkubaci po dobu několika minut pouze při nízké teplotě (0 až 5 °C) (protože se přidává vysoká koncentrace oligonukleotidů) teplota vzroste na 3 až 10 °C, v závislosti na délce F + P, a přidá.se promývací pufr. V této dobé použitý promývací pufr je kompatibilní s libovolnou ligační reakcí (například rozmezí koncentrace soli lOOmM). Po přidání ligasy, teplota vroste znovu na 15 až 37 °C, co dovoluje rychlou ligací (trvá méně než 30 minut) a další diskriminaci plné párovaných a chybně párovaných hybridů.

Použití kationových detergentů je také pozorováno při použití formátu 3 SBH, jak popsal Pontius a Berg (1991, uvádí se jako součást dosavadního stavu techniky). Tito autoři popisují použití dvou jednoduchých kationových detergentů, dodecyltrimethylamoriiumbromidu (DTAB) a cetyltrimethylamoniumbromidu (CTAB) při DNA renaturaci.

DTAB a CTAB jsou varianty kvartérního aminu, kterým je tetramethylamoniumbromid (TMAB), ve kterém jedna z methylových skupin je nahrazena bud alkylovou skupinou s 12 atomy uhlíku (DTAB) nebo alkylovou skupinou se 16 atomy uhlíku (CTAB). TMAB je bromidová sůl tetramethylamoniového ionu. Reakční činidlo použité v renaturačních experimentech s nukleovou kyselinou ke snížení obsahu G-C má sklon ovlivnit teplotu roztavení. DTAB a CTAB mají podobné struktury jako matriumdodecylsulfát (SDS), který nahrazuje negativně nabitý sulfát SDS positivně nabitým kvartérním aminem. I když SDS se obecně používá v hybridizačních pufrech ke snížení nespecifického vázání a inhibici nukleas, nemá velký účinek na rozsah renaturace.

Pokud se používá ligační postup, měl by se enzym přidat se značenými sondami nebo po vlastním promývacím stupni ke snížení pozadí.

I když ligační technologie předtím nebyla navržena pro použití při některé SBH metodě, je dobře zavedena v oblasti molekulární biologie. Například Hood se společníky popsal genovou detekční techniku zprostředkovanou ligasou (Landegren a kol., 1988), jejíž metodologie se může snadno upravit pro použití ve formátu 3 SBH. Landregen a kol. popsal zkoušení na přítomnost daných DNA sekvencí, založenou na schopnosti dvou oligonukleotidů teplotně hybridizovat bezprostřední sousedy, ke každé jiné, na komplementární cílové DNA molekule. Dva oligonukleotidy se potom spoji kovalentně účinkem DNA ligasy, za předpokladu, že nukleotidy ve spojení jsou správné páry bází. Třebaže se to dříve nepozorovalo, tato situace nyní vzniká při sekvencování formátu 3. Wu a Wallace také popisují *» použití bakteriofágové T4 DNA ligasy ke spojení dvou sousedících, krátkých syntetických oligonukleotidů. Jejich, oligo ligační reakce se provádějí v 50 mM Tris HCI, hodnota pH 7,6, 10 mM chloridu hořečnatého, 1 mM ATP, 1 mM DTT a 5% PEG. Ligační reakce se uskutečňuje zahřátím na teplotu 100 °C po dobu 5 až 10 minut, s následujícím ochlazením na teplotu 0 °C před přidáním T4 DNA ligasy (1 jednotka, Bethesda Research Laboratory). Většina ligačních reakcí se provádí za teploty 30 °C a ukončí se zahřátím na teplotu 100 °C po dobu 5 minut.

Potom se provede konečné promytí, vhodné pro diskriminační detekci hybridizovaných sousedících nebo ligovaných oligonukleotidů o délce (F + P). Tento promývací stupeň se provádí ve vodě po dobu několika minut za teploty 40 až 60 °C, k vymyti všech neligovaných značených sond a všech jiných sloučenin, k maximálnímu omezeni pozadí.

V důsledku kovalentně vázaných značených oligonukleotidů je detekce jednoduchá (jestliže není omezujícím faktorem čas a nízká teplota).

V závislosti na použitém značení se zobrazení čipů provádí v různých zařízeních. Pro radioaktivní značeni se může použít technologie stanovení uloženého fosforu a Phosphorlmager jako snímač (Molecular Dynamics, Sunnyvale,

CA, USA). Čipy se vloží do kasety a zakryjí třídicím zařízením využívajícím fosfor. Poté co se vystaví působení na 1 až 4 hodiny, třídicí zařízení se sejme a zaregistrovaný obraz uloží na hard disku počítače. Pro detekci flurescenčního značení se použijí CCD kamery a epifluorencenční nebo konfokální mikroskop. Pro čipy vytvořené přímo ma obrázcích CCD kamery se detekce může provádět jak popsal Eggers a kol.

(1994, uvádí se jako součást dosavadního stavu techniky).

·*»

CCD (detekční zařízení zdvojující náboj) slouží jako aktivní tuhý nosič, který kvantitativně detekuje a zobrazuje distrubuci značených cílových molekul při zkouškách založených na sondě. Tato zařízení používá základní charakteristiky mikroelektroniky, které vyhovují vysoce paralelním zkouškám, ultracitlivý detektor, vysoké prosazení, integrované hodnoty přínosu a přibližný odhad. Egglers a kol., /1994/ popisuje CDDs pro použití při zkouškách na bázi sond, jako je formát 3 SBH podle tohoto vynálezu, které dovolují kvantitativní stanovení v trvání sekund, v důsledku vysoké citlivosti a použití přímé kondenzace.

Integrované CCD detekční chování umožňuje detekci případů molekulárního vázání na čipy. Detektor rychle vytváří dvourozměrný vzor, který jedinečné charakterizuje vzorek. Při zvláštním provozu molekulárního detektoru založeného na CCD, zřetelné biologické sondy jsou imobilizovány přímo na obrázcích CCD nebo mohou být připojeny k volnému krycímu pásu, umístěnému na povrchu CCD. Vzorky molekul se mohou značit radioisotopy, chemiluminiscenčné nebo fluorescenčními cíly.

Po vystavení vzorku zkoušce sondy založené na CCD, fotony nebo radioisotop z rozpadu probíhajícího v produktu jsou emitovány do míst obrázku, které vzorek ohraničují, v případě formátu 3, do dvou komplementárních sond. Naopak páry elektron - díra se vytvářejí v silikonu, kde nabité částice nebo záření ze značeného vzorku dopadá na hradla CCD

Elektrony se potom zachycují pod sousedícími CCD hradly a sekvenčně odčítají na displejovém modulu. Počet fotoelektronů vytvořených na každém obrázku je přímo úměrný počtu případů vázání molekul v takové blízkosti. Proto se Λ vázáni molekul může stanovit kvantitativně (Eggers a kol., 1994) .

Jak bylo nedávno uvedeno, CCDs na bázi silikonu mají prvotní výhodu jako detekce v tuhém stavu a zobrazovací sensory, pro vysokou citlivost zařízení v širokém rozmezí vlnové délky (od 10 do 100 000 nm). Silikon je velmi citlivý ze elektromagmetické záření z viditelného spektra měkkého rentgenového zářeni. Pro viditelné světlo má dopad jediného fotonu na CCD hradlo za výsledek jediný svazek nabitých elektronovů pod hradlem. Jediná částice měkkého rentgenového β-záření (obvykle v rozmezí od keV do MeV) vytváří tisíce až deseti tisíce elektronů. Kromě vysoké citlivosti, CCDs popsané Eggersem a kol. /1994/ nabízejí široce dynamické rozmezí (velikosti 4 nebo 5 řádů), protože detekovatelný nabitý svazek může mít rozsah od několika do 10⁵ elektronů. Detekční odpověď je lineární v širokém dynamickém rozmezí.

Umístěním obrazového seskupení v blízkosti vzorku se účinnost zachycování zlepší o součinitel alespoň 10 nad technické postupy založené na čočkách, jako se nacházejí v běžných CCD kamerách. To znamená, že vzorek (emimor) je v blízkém kontaktu s detektorem (zobrazovací seskupení) a to eliminuje obvyklou zobrazovací optiku, jako jsou čočky a zrcadla.

Pokud jsou připojeny radioisotopy jako hlásiči skupiny k cílovým molekulám, provádí se detekce energetických částic. Několik hlásících skupin, které emitují částice o měnící se energii, je úspěšně používáno s detektory sestavenými z mikrodílů, včetně ³²P, ³³P, ³⁵S, ¹⁴C a ¹²⁵L. Částice o vysoké energii, jako z ³²P, skýtají nejvyšší citlivost detekce molekul, zatímco částice s nižší energií, jako z ³⁵S, poskytují lepší rozlišovací schopnost. Proto volba radioaktivní látky s hlásícími skupinami může být určena na ' zakázku, jak se požaduje. Zvláštní radioaktivní značení se volí tak, že detekční výkon se může být předpovědět na základě výpočtu poměru signál k šumu (SNR), jak popisuje Eggers a kol. /1994/.

Alternativní způsob luminiscenční detekce zahrnuje použití fluorescenčních nebo chemifluorencenčních hlásících skupin připojených k cílovým molekulám. Fluorescenční značky se mohou připojit kovalentné nebo interakcí. Fluorescenční barviva, jako je ethidiumbromid, s intensivními abrospčními pásy v blízké ultrafialové oblasti (300 až 350 nm) a základními emisními pásy ve viditelné oblasti (od 500 do 650 nm), jsou nejvhodnější pro použiti v CCD zařízení, protože množství účinku je několikrát řádově nižší při excitační vlnové délce než při vlnové délce fluorescenčního signálu.

Z hlediska stanovení luminiscence, polysilikonová CCD hradla mají zobrazovací kapacitu k filtru mimo přínos z dopadajícího světla v ultrafialovém rozmezí, jsou však ještě velmi citlivá k viditelnému osvětlení vytvářenému fluorescenčními hlásícími skupinami. Taková značné veliké rozlišování proti ultrafialové excitaci umožňuje dosáhnout velký pomér signálu k šumu (větší než 100) pomocí CCDs, jak je uvedeno Eggersem a kol. /1994/.

Pro imobilizaci sondy na detektoru se mohou připravit hybridizacní matrice na nenákladných kotoučích z oxidu křemičitého, které jsou potom umístěny na povrch CCD, s následující hybridizací a vysušením. Tento postup je ekonomický účinný, protože hybridizace DNA se provádí na co nenákladných kotoučích z oxidu křemičitého pro jedno použití, a tak je dovoleno znovu použít nákladnější CCD detektor. Při jiném provedení se sondy mohou imobilizovat přímo na CCD, k vytvoření předem určené matrice sondy.

K imobilizovaným sondám po povlečení oxidem křemičitým se rovnoměrná vrstva váže k povrchu filmu, za použití epoxysilikonového reakčního činidla a chemie normální modifikace oxidu křemičitého. Oligonukleotidové sondy modifikované aminem se potom vázají na povrch oxidu křemičitého pomoci tvorby sekundárního aminu s epoxidovým kruhem. Výsledná vazba poskytne 17 otáčivých vazeb z dělení mezi 3' bázi oligonukleotidů a povrch oxidu křemičitého.

K zajištěni úplné aminové deprotonizace a minimální tvorby sekundární struktury během kondenzace se reakce provádí v 0,ÍM roztoku hydroxidu draselného a inkubuje se za teploty 37 °C po dobu 6 hodin.

Obecně ve formátu 3 SBH jsou signály zaznamenány na každý bilion bodů. Nemělo by být nutné v této dobé hybidizovat všechna seskupení, například 4000 5x5 mm. Úspěšné použiti menšího počtu seskupení je možné.

Cyklizující hybridizace jsou jednou možnou metodou pro zvýšeni hybridizačního signálu. V jednom cyklu většina pevných sond bude hybridizována s DNA fragmenty s ocasovou sekvencí nekomplementární pro značené sondy. Při zvýšení teploty tyto hybridy budou roztaveny (obr. 3.).

V následujícím cyklu nékteré z nich (přibližně 0,1 %) budou hybridizovány s vhodným DNA fragmentem a další značené sondy budou ligovány. V tomto případě se vyskytne diskriminativní roztavení DNA hybridů s chybným párováním pro obě soupravy sond současně.

Při cyklické hybridizaci se všechny složky přidávají před začátkem cyklizace, při teplotě 37 °C pro T4 nebo při vyšších teplotách pro ligasu stabilní za tepla. Potom se teplota sníží na 15 až 37 °C a čip se inkubuje až 10 minut a poté se teplota zvýší na 37 °C nebo více na dobu několika minut a nato se znovu sníží. Cykly se mohou opakovat až desetkrát. Při jedné variantě se může použít optimální vyšší teplota (10 až 50 °C) bez cyklizace a může se provádět delší ligační reakce (1 až 3 hodiny).

Způsob zde popsaný dovoluje přípravu komplexního čipu za použiti normální syntézy a přesného vzniku skvrn oligonukleotidů, protože je nezbytný relativné malý počet oligonukleotidů. Například pokud se syntetizuje všech 7-mer oligů (16 334 sond), může se stanovit seznam 256 milionů 14-mers.

Jedna důležitá varianta nalezené metody spočívá v použití více než jedné odlišné značené sondy na základní seskupeni. To může být provedeno se dvěma zamýšlenými účely, vícenásobným provedením ke snížení počtu odděleně hybridizovaných seskupeni nebo ke stanovení soupisu rovněž delších oligonukleotidů, jako 3x6 nebo 3 x 7. V tomto případě, pokud se použijí dvé značení, specifičnost 3 po sobé

Z· jdoucích oligonukleotidů může být takřka absolutní, protože positivní místa musí mít dostatek signálů pro obě značení.

Dalši a dodatečná varianta spočívá v použití čipů obsahujících BxNy sond, kde y je číslo do 1 do 4. Tyto čipy dovolují číst sekvence v rozdílných rámečcích. Toho se může dosáhnout za použití vhodných souborů značných sond nebo jak F, tak P sond, které mají stejné nespecifické koncové polohy (to znamená určité prvky koncové degenerace). Univerzální báze se může také používat jako část spojovníku, aby se připojily sondy definované sekvence k tuhému nosiči. To způsobuje, že sonda je snáze dostupná pro hybridizaci a tvoří konstrukt, který je stabilní. Pokud sonda má 5 bází, může se použít například 3 univerzálních bází jako spojovníků (obr.

4) .

Přiklad VIII

Analýza získaných údajů

Zaregistrované obraz se analýzuji programem obrazové analýzy, jako pomocí programu DOTS (Drmanac a kol., 1993) a odstupňují se a ohodnotí statistickými funkcemi včetně například programu SCORES (Drmanac a kol., 1994). Z rozdělení signálů se stanoví mezní citlivost pro transformující signál na výstupu +/-.

Z polohy značených, detekovaných, F + P nukleotidových sekvencí z fragmentů se stanoví kombinací známé sekvence imobilizovaných a značených sond, odpovídajících značeným polohám. Úplná sekvence nukleové kyseliny nebo subfragmenty sekvence původní molekuly, jako lidského chromosomu, se potom sestaví z překrývajících se F + P sekvencí, určených počítačovou dedukcí.

Jednou možností volby je transformovat hybridizační signály, například rýhami, na výstup +/- během způsobu sestavení sekvence. V tomto případě sestava bude začínat s F + P sekvencí s velmi vysokou rýhou, například F +

P sekvencí AAAAAATTTTTT (SEQ ID č. 1). Rýhy všech čtyřech možných překrývajících se sond AAAAATTTTTTA (SEQ ID č. 3), AAAAATTTTTTT (SEQ ID č. 4), AAAAATTTTTTC (SEQ ID Č. 5) a AAAAATTTTTTG (SEQ ID č. 6) a tří dalších sond, které jsou odlišné na začátku (TAAAAATTTTTT, SEQ ID č. 7, CAAAAATTTTTT, SEQ ID č. 8, GAAAAATTTTTT, SEQ ID č. 9) se porovnají a definuji se tři závěry:

i) pouze výchozí sonda a pouze jedna ze čtyř překrývajících se sond má rýhy, které jsou významně positivní vzhledem k jiným šesti sondám, v tomto případě AAAAAATTTTTT (SEQ ID ó. 1) bude protažena o jeden nukleotid napravo, ii) protože žádná sonda kromě výchozí sondy nemá významně positivní rýhu, sestava bude zastavena, například AAAAAATTTTT (SEQ ID č. 10) sekvence je na konci DNA molekuly, která je sekvencována a iii) když se vice než jedna signifikantně positivní sonda nachází mezi překrývajícími a/nebo jinými třemi sondami, sestava se zastaví v důsledku chyby nebo rozvětveni (Drmanac a kol., 1989).

Procesy počítačové dedukce mají používat počítačové programy vyžívající existující algoritmy (viz například Pevzner, 1989, Drmanac a kol., 1991, Labat a Drmanac, 1993, z nichž každý se zde uvádí jako součást dosavadního stavu techniky).

Pokud kromě F + P se stanoví F(prostor 1)P, F(prostor

2)P, F(prostor 3)P nebo F(prostor 4)P, algoritmy se budou používat k párování souborů všech údajů, ke korigování potenciálních chyb nebo k řešení situace, kde jde o problém rozvětvení (viz například Drmanac a kol., 1989, Bains a kol., 1988, z nichž každý se zde uvádí jako součást dosavadního stavu techniky).

Příklad IX

Opětovné použiti sekvencujících čipů

Pokud se v sekvencujícím procesu použije ligace, potom se řádné oligonukleotidové čipy nemohou hned znovu použít. Původce předpokládá, že se to může překonat různými způsoby.

Při jednom způsobu se mohou použít ribonukleotidy pro druhou sondu, sondu P, takže tato sonda se může následně odstranit zpracováním s RNAasou. Při zpracování s RNAasou se může použit RNAasa A, endoribonukleasa, která specificky atakuje jednou vinutou RNA 3' k pyrimidinovým zbytkům a štěpí fosfátovou vazbu k sousedícímu nukleotidu. Konečnými produkty jsou pyrimidin-3'-fosfáty a oligonukleotidy s koncovými pyrimidin-3’-fosfáty. RNAsa A se zpracovává v nepřítomnosti kofaktorů a dvoumocných kationů.

Při použití RNAsy, se čip má obecně inkubovat v libovolném pufru obsahujícím RNAasu, jak popsal Sambrook a kol. (1989, uvádí se zde jako součást dosavadního stavu techniky). Je přiměření použít pufru obsahujícího 30 až 50 μΐ RNAasy na zkoušku 8 x 8 mm nebo 9 x 9 mm za teploty 37 °c po dobu od 10 do 60 minut. Potom se má provést promytí hybridizačním pufrem.

Třebaže to není široce aplikovatelné, má se při zvláštních provedeních použít také uracilová báze, jak popsal Craig a kol. /1989/, co se zde uvádí jako součást dosavadního stavu techniky. Destrukce kombinace ligatované sondy, k získání znovu použitelného čipu, se má dosáhnout digescí s opravným enzymem E. coli, uraci-DNA glykosylasou, čímž se odstraňuje uráčil z RNA.

Má se také vytvářet specificky štépitelná vazba mezi sondami a po detekci se má vazba potom štépit. Například se toho může dosáhnout chemickou ligací, jak popsala Shabarova a kol. /1991/ a Dolinnaya a kol. /1988/, přičemž oba odkazy se zde uvádějí jako zvláštní součást dosavadního stavu techniky.

Shabarova a kol. /1991/ popisuje kondenzaci oligodeoxyribonukleotidů s bromkyanem jako kondenzačním činidlem. V jednom stupni této chemické ligační reakce se oligonukleotidy zahřejí na teplotu 97 °C, pomalu ochladí na teplotu 0 °C a potom se přidá 1 μΐ 10M bromkyanu v acetonitrilu.

Dolinnaya a kol. /1988/ ukazuje jak vpravit fosforamidát a pyrofosfátové internukleotiové vazby do DNA duplexu. Také se používají chemické ligační metody pro modifikaci cukrové fosfátové kostry DNA, s karbodiimidem (CDI) rozpustným ve vodě jako kondenzačním činidlem.

Selektivní štěpeni fosforamidových vazeb zahrnuje styk s 15% kyselinou octovou za teploty 95 °C během doby 5 minut.

náhradní stránka

O o

o

- 66 Selektivní štěpení pyrofosfáto^g yažb# záhradje ‘styk^se š pyridinu a vody v poměru 9:1 a s čAy«tvé~Hs^ti lávaným ^c anhydridem kyseliny fluoroctové.

I když kompozice a metody podle tohoto vynálezu jsou popsány s ohledem na výhodná provedení, odborníkovi v oboru bude zřejmé, že se mohou použít úpravy kompozic, metod a stupňů nebo sekvencí ze stupňů způsobu zde posaného, aniž by se vybočilo z pojetí, smyslu a rozsahu tohoto vynálezu. Uvedeno přesněji, bude zřejmé, že určitá činidla, která jsou ' jak chemicky, tak fyziologicky blízká, mohou nahradit činidla zde popsaná, i když stejné nebo podobné výsledky se budou očekávat. Všechny takové podobné náhrady a modifikace zřejmé odborníkovi v oboru se považují za spadající do ducha, rozsahu a pojetí vynálezu, jak je definován připojenými patentovými nároky. Všechny nárokované předměty a metody se mohou provádět a bez nepřiměřeného experimentování.

Literární odkazy

Uvádějí se následující literární odkazy v rozsahu, který poskytuje podrobnosti k příkladným způsobům nebo jiné detaily doplňující údaje zde uvedené, jako zvláštní součást zahrnutá do dosavadního stavu techniky.

Bains a kol., J. Theor. Biol. 135, 303-307 /1988/,

Broude a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91, 3072-3076 /1994/,

Brumbaugh a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85 5610-5614 /1988/, náhradní stránka

- 67 Cantor a kol., Genomics 13., 1378 /1992/,

Cate a kol., GATA 3(3), 102-106 /1991/,

Chu a kol., Nucleic Acids Res. 11, 6513-6529 /1983/,

Craig a kol., Nucleic Acids Research 17(12), 4605 /1989/,

Λ

Dahlen a kol., Mol. Cell. Probes 1, 159-163 /1937/,

Dolinnaya a kol., Nucleic Acids Research 16(9). 3721-3738 /1988/,

Drmanac a Crkvenjakov, Scientia Yugoslovica, 16, 97 /1990/,

Drmanac a Crkvenjakov, US patent č. 5 202 231,

Drmanac a kol., Genomics 4, 114-128 /1989/,

Drmanac a kol., J. Biomol. Struct. & Dyn. 8, 1035 /1991/,

Drmanac a kol., v Electrophoreses, Supercomputers and the Human Genome, str. 47 až 59, World Scientific Publishing Co., Singapur /1991/,

Drmanac a kol., (a) Proceedings of the 2nd International Conference on Bioinformatics, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., str. 121 až 134 /1993/,

Drmanac a kol., (b) DNA Sequence Determination by

Hybridization: A Stratégy for Efficient Large-Scale

Sequencing, v Science 260, 1649-1652 /1993/, náhradní stránka

- 63 Drmanac, Abstract Book for Genome Mapping and Sequencing, uspořádal Richard Myers, David Porteous a Rober Waterstone, Cold Spring Harbor Laboratories, str. 60 /1994/,

Drmanac a kol., Proceedings of the 3nd International Workshop of Transcribed Sequences, v tisku,

-a»

Drmanac a Cavalier, Analytical Biochemistry 169. 104-108 /1983/,

Eggers a kol., BioTechniques 17(3), 516-524 /1994/,

Fitzgerald a kol., Nucleic Acids Research 20(14), 3753-3762 /1992/,

Fodor a kol., Science 251, 767-768 /1991/,

Hoheisel a Lehrach, FEBS Lett, 274(1,2), 103-106 /1990/,

Inouye a Hondo, J. Clin, Microb. 23, 1469-1472 /1990/,

Jacobsen a kol., Genomics 8, 001-007 /1990/,

Keller a kol., Anal. Biochem. 170, 441-450 /1988/,

Keller a kol., Anal. Biochem. 177, 27-32 /1989/,

Khrapko a kol., J. DNA Sequencing Mapping 1, 375 /1991/,

Labat a Drmanac, Proceedings of the 2nd International

Conference on Bioinformatics, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., str. 555 až náhradní stránka

- 69 565 /1993/,

Landegren a kol., Science 241, 1077-1080 /1983/,

Maxam a Gilbert, Proč. Nati. Acad. Sci. 74, 560 /1977/,

Morriey a Collins, Mol. Cell. Probes 3., 139-207 /1989/, %

Murakami a kol., Nucleic Acids Research 19(15) , 4097-4102 /1991/,

Nagata a kol., FEBS Letters 183, 379-382 /1985/,

Nichols a kol., Nátuře 369, 492 /1994/,

Pease a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 91, 5022-5026 /1994/,

Peterkin a kol., BioTechniques 5(2), 132-134 /1987/,

Peterkin a kol., Food Microbiology 5(2), 231-234 /1989/,

Pontius a Berg, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88, 8237-3241 /1991/,

Rasmussen a kol., Analytical Biochemistry 198, 138-142 /1991/,

Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, USA,

Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 74, 5463 /1977/,

Schriefer a kol., Nucleic Acids Research 18(24), 7455 /1990/, náhradní stránka

- 70 Schubert a kol., Nucleic Acids Research 18(11). 3427 /1990/,

Shabarova a kol., Nucleic Acids Research 19(15). 4247-4251 /1991/,

Sharp a kol., Food Microbiology 6, 261-265 /1989/,

Southern, PCT patentová přihláška WO 89/10977,

Southern a Maskos, PCT patentová přihláška WO 90/03382,

Southern a kol., Genomics 13 , 1008 /1992/,

Strezoska a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 88., 10089 /1991/,

Van Ness a kol., Nucleic Acids Research 19(12) , 3345 /1991/,

Wu a Wallace, Gene 76, 245-254 /1989/.

Seznam sekvencí

1) Obecné informace

i) Přihlašovatel:

Jméno: ARCH DEVELOPMENT CORPORATION Ulice: 1101 East 53th Street Město: Chicago

Stát: Illinois

Země: Spojené státy americké PSČ: 60637

Telefon: (312) 702-1692 Telefax: (312) 702-0741 ii) Původce: Drmanac, Radoje iii) Název vynálezu: Kompozice pro účinné sekvencování nukleové kyseliny a způsob její přípravy iv) Počet sekvencí: 10

v) Adresa pro korespondenci:

a) Adresát: Arnold, White & Durkee

b) Ulice: P. 0. Box 4433

c) Město: Houston

d) Stát: Texas

e) Země: Spojené státy americké

f) PSČ: 77210-4433 vi) Počítačová čtecí forma:

a) Typ media: Floppy disk

b) Počítač: IBM PC kompatibilní

c) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS

d) Software: Patentln Release #1.0, Verze #1.25

- 72 vii) Údaje o současné přihlášce:

a) číslo přihlášky: při podání

b) Datum podání: při podání

c) Zatřídění:

viii) Údaje o prioritních přihláškách:

a) Číslo přihlášky: USSN 08/303 053 *

b) Datum podání: 8. září 1994 (08.09.1994)

c) Zatříděni: neznámé

a) Číslo přihlášky: USSN 08/127 420

b) Datum podání: 27. září 1993 (27.09.1993)

c) Zatřídění: neznámé ix) Informace o zástupci:

a) Jméno: David L. Parker

b) Registrační číslo: 32 165

c) Čislo spisu: ARCD146P—\PAR

x) Telekomunikační informace:

a) Telefon: (512) 418-3000

b) Telefax: (512) 474-7577

2) Informace pro SEQ ID č. 1:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

AAAAAATTTT TT 12

2) Informace pro SEQ ID č. 2:

i) Charakteristiky sekvence: λ

a) Délka: 13 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

AAAAAATTTT TTC 13

2) Informace pro SEQ ID č. 3:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

AAAAATTTTT TA 12

2) Informace pro SEQ ID č. 4:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:

AAAAATTTTT TT 12

2) Informace pro SEQ ID č. 5:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

AAAAATTTTT TC 12

2) Informace pro SEQ ID č. 6:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 6:

AAAAATTTTT TG 12

2) Informace pro SEQ ID č. 7:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bázi

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7:

TAAAAATTTT TT 12

2) Informace pro SEQ ID č. 8:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8:

CAAAAATTTT TT 12

2) Informace pro SEQ ID č. 9:

- 76 i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 12 párů bází

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 9:

CAAAAATTTT TT 12

2) Informace pro SEQ ID č. 10:

i) Charakteristiky sekvence:

a) Délka: 11 párů bázi

b) Typ: nukleová kyselina

c) Řetězec: jednoduchý

d) Topologie: lineární ii) Typ molekuly: DNA xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 10:

AAAAAATTTT T 11 náhradní stránka

Claims (46)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob stanovení sekvence molekuly nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

   a) identifikace sekvencí z molekuly

   i) hybridizaci molekuly na komplementární sekvence oligonukleotidů ze dvou souborů malých oligonukleotidových sond ze známé sekvence, kde první soubor sond je připojen k tuhému nosiči a druhým souborem sond jsou značené sondy v roztoku, a ii) kovalentním vázáním hybridizovaného oligonukleotidu z tohoto prvního souboru sond k hybridizovanému oligonukleotidu z tohoto druhého souboru sond,

   b) identifikace překrývajícího protažení sekvence ze sekvencí identifikovaných ve stupni a) a

   c) sestavení sekvence molekuly nukleové kyseliny z těchto identifikovaných překrývajících sekvencí.
2. 2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že hybridizace se provádí v cyklech.
3. 3. Způsob stanovení sekvence molekuly nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

   a) fragmentace molekuly nukleové kyseliny určené náhradní stránka

   - 78 k sekvencování, za získání střední délky fragmentů nukleové kyseliny,

   b) identifikace sekvencí z těchto fragmentů

   i) hybridizací fragmentů na komplementární sekvence oligonukleotidů ze dvou souborů malých oligonukleotidových sond ze známé sekvence, kde první soubor sond je připojen k tuhému nosiči a druhým souborem sond jsou značené sondy v roztoku, a ii) kovalentním vázáním hybridizovaného oligonukleotidu z tohoto prvního souboru sond k hybridizovanému oligonukleotidů z tohoto druhého souboru sond,

   c) identifikace překrývající protažení sekvence ze sekvenci identifikovaných ve stupni b) a

   d) sestaveni sekvence molekuly nukleové kyseliny z těchto identifikovaných překrývajících sekvencí.
4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že tyto fragmenty jsou postupné hybridizovány na komplementární sekvence ze dvou souborů malých oligonukleotidových sond známé sekvence.
5. 5. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že tyto fragmenty jsou současné hybridizovány na komplementární sekvence ze dvou souborů malých oligonukleotidových sond známé sekvence.
6. 6. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že střední délka fragmentů nukleové kyseliny má délku náhradní stránka

   - 79 od přibližně 10 nukleotidů do zhruba 40 nukleotidů a malé oligonukleotidové sondy mají délku od přibližně 4 nukleotidů do zhruba 9 nukleotidů.
7. 7. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se oligonukleotidové sondy hybridizují na úplně komplementární sekvence z těchto fragmentů.

   Λ
8. 8. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se oligonukleotidové sondy hybridizují na bezprostředně sousedící sekvence z těchto fragmentů.
9. 9. Způsob podle nároku 8,vyznačující se tím, že se oligonukleotidové sondy hybridizují na úplně komplementární a bezprostředně sousedící sekvence z těchto fragmentů.
10. 10. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že oligonukleotidové sondy jsou kovalentné vázány enzymatickou ligací.
11. 11. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že oligonukleotidové sondy jsou kovalentné vázány za použití chemického ligačního činidla.
12. 12. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že stupeň b) zahrnuje stupně

    a) styku prvního souboru malých připojených oligonukleotidových sond s fragmenty nukleové kyseliny o střední délce za hybridizačních podmínek, které jsou účinné k ponecháni pouze těchto fragmentů s úplně komplementární sekvencí k hybridizaci na sondě, náhradní stránka

    - 80 přičemž se vytvoří primární komplexy, ve kterých fragment je hybridizován, a volné sekvence,

    b) uvedení do styku primárních komplexů s tímto druhým souborem malých značených oligonukleotidových sond za hybridizačních podmínek účinných k ponechání pouze těchto sond s úplně komplementárními sekvencemi k hybridizaci na volnou sekvenci fragmentu, přičemž se vytvoří sekundární komplexy, ve kterých fragment je hybridizován na připojenou sondu, a značená sonda,

    c) kovalentního vázání této připojené sondy a této značené sondy,

    d) odstranění z těchto sekundárních komplexů značených sond, které nejsou kovalentně vázány k připojené sondě, přičemž se tvoří kovalentně vázané komplexy,

    e) detekce těchto kovalentně vázaných komplexů, detekcí přítomnosti značení a

    f) identifikace sekvenci z fragmentů nukleové kyseliny v uvedených kovalentně vázaných komplexech, připojením známých sekvencí hybridizovaných připojených a značených sond.
13. 13. Způsob sekvencování nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

    a) fragmentování nukleové kyseliny určené k sekvencování, za poskytnuti fragmetů nukleové kyseliny o délce T,

    b) přípravy seskupeni imobilizovaných oligonukleotidových náhradní stránka

    - 81 sond ze známých sekvencí a o délce F a souboru značených oligonukleotidových sond v roztoku známých sekvecí a o délce P, kde F + Ρ < T,

    c) styku těchto seskupení imobilizovaných oligonukleotidových sond s těmito fragmenty nukleové kyseliny za podmínek hybridizace, dovolujících tvorbu * primárních komplexů s hybridizovanými, úplné komplementárními sekvencemi o délce F a nehybridizo« váných sekvencí fragmentů o délce T - F,

    d) uvedení do styku těchto komplexů s uvedeným souborem značených oligonukleotidových sond za hybridizačních podmínek účinných, k ponechání pouze tvorby sekundárních komplexů s hybridizovanými, úplně komplementárními sekvencemi o délce F a bezprostředně sousedícími hybridizovanými, úplně komplementárními sekvencemi o délce P,

    e) kovalentního vázání uvedených značených oligonukleotidových sond k těmto bezprostředné sousedícím imobilizovaným oligonukleotidovým sondám,

    f) detekce těchto sekundárních komplexů stanovením přítomnosti značení, , g) identifikace sekvencí o délce F + P z fragmentů nukleové kyseliny v těchto druhých komplexech, * kombinováním známých sekvenci z hybridizovaných imobilizovaných a značených sond,

    h) stanovení protažení těchto sekvencí o délce F + P, které překrývají, a náhradní stránka

    - 82 i) sestavení úplné sekvence nukleové kyseliny z těchto překrývajících sekvenci.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že délka T je přibližně třikrát delší než délka

    F.
15. 15. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že délka T je mezi přibližně 10 nukleotidy a zhruba 40 nukleotidy, délka F je přibližně 4 nukleotidy až zhruba 9 nukleotidů a délka P je mezi přibližně 4 nukleotidy a zhruba 9 nukleotidy.
16. 16. Způsob podle nároku 15, vyznačuj ící se t í m, že délka T je přibližně 20 nukleotidů, délka F je přibližně 6 nukleotidů a délka P je přibližně 6 nukleotidů.
17. 17. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t í m, že bezprostředně sousedící imobilizované a značené oligonukleotidové sondy jsou kovalentně vázány enzymatickou ligací.

    13. Způsob podle nároku 13, vyznačuj ící se t i m, že bezprostředně sousedící imobilizované a značené oligonukleotidové sondy jsou kovalentně vázány za použiti chemického ligačniho činidla.
18. 19. Způsob sekvencování nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

    a) fragmentování nukleové kyseliny určené pro náhradní stránka

    - 83 sekvencování, k získání fragmentů nukleové kyseliny o střední délce,

    b) styku seskupení imobilizovaných malých oligonukleotidových sond ze známých sekvencí s fragmenty nukleové kyseliny za hybridizačních podmínek, který dovoluje pouze těmto fragmentům s úplně komplementární sekvencí být hybridizovány na sondu, přičemž se vytváří primární komplexy, kde fragmenty jsou hybridizované, a nehybridizované sekvence,

    c) styku primárních komplexů se souborem značených malých oligonukleotidových sond v roztoku známých sekvencí za hybridizačních podmínek dovolujících, aby pouze tyto sondy s úplně komplementárními sekvencemi byly hybridizovány k nehybridizované sekvenci fragmentu, přičemž se vytváří sekundární komplexy, kde fragment je hybridizován na imobilizovanou sondu, a značená sonda,

    d) kovalentniho vázání uvedených značených oligonukleotidových sond k těmto bezprostředně sousedícím imobilizovaným oligonukleotidovým sondám,

    e) odstranění z uvedených sekundárních komplexů značených sond, které nejsou kovalentně vázány k imobilizované sondě, přičemž se odštěpují pouze vzniklé kovalentně vázané komplexy,

    f) detekce téchto kovalentně vázaných komplexů, stanovením přítomnosti značení,

    g) identifikace sekvencí z fragmentů nukleové kyseliny náhradní stránka

    - 84 v těchto kovalentně vázaných komplexech kombinováním známých sekvenci z hybridizovaných zmobilizovaných a značených sond,

    h) stanovení protaženi těchto sekvenci, které překrývají, a

    i) sestavení úplné sekvence nukleové kyseleny z těchto identifikovaných překrývajících sekvencí.
19. 20. Způsob podle nároku 19,vyznačuj ící se t í m, že nukleová kyselina je klonovaná DNA nebo chromosomální DNA.
20. 21. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že nukleová kyselina je mRNA.
21. 22. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že nukleová kyselina se fragmentuje restřikčním enzymovým digerováním, zpracováním ultrazvukem, zpracováním s roztokem hydroxidu sodného nebo střihem za nízkého tlaku.
22. 23. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že fragmenty nukleové kyseliny mají délku mezi přibližně 10 nukleotidy a zhruba 100 nukleotidy.
23. 24. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že oligonukleotidové sondy mají délku mezi přibližně 4 nukleotidy a zhruba 9 nukleotidy.
24. 25. Způsob podle nároku 24, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy mají délku přibližně 6 nukleotidů.

    náhradní stránka

    - 85
25. 26. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy jsou připojeny ke skleněnému, polystyrénovému nebo teflonovému tuhému nosiči.
26. 27. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že imobilizované oligonukleotidy jsou připojeny k tuhému nosiči přes «.fosfodiesterovou vazbou.
27. 28. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t i m, že imobilizované oligonukleotidy jsou připojeny k tuhému nosiči prostřednictvím syntetického mechanizmu aktivovaného světlem.
28. 29. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že značená oligonukleotidové sonda se značí neradioaktivním isotopem nebo fluorescenčním barvivém.
29. 30. Způsob podle nároku 19,vyznačuj ící se t í m, že značené oligonukleotidové sondy jsou značeny ³⁵S, ³²P nebo ³³P.
30. 31. Způsob podle nároku 19, vyznačující se t í m, že fragment nukleové kyseliny nebo jedna z uvedených oligonukleotidových sond obsahuje modifikovanou bázi nebo univerzální bázi.
31. 32. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t í m, že značené sondy, které nejsou kovalentně vázány k imobilizované sondé, jsou odstraněny ze sekundárních komplexů za přísně řízených podmínek promývání.
32. 33. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící náhradní stránka

    - 86 se t i m, že uvedené bezprostředně sousedící sondy jsou kovalentně vázané.
33. 34. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t i m, že bezprostředně sousedící sondy jsou ligovány enzymaticky.

    A
34. 35. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se t i m, že větší počet seskupení imobilizovaných oligonukleotidů je uspořádán ve formě sekvencujících čipů.
35. 36. Způsob sekvencování nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně

    a) fragmentování nukleové kyseliny určené pro sekvencování, k získání fragmentů nukleové kyseliny o délce od přibližné 10 nukleotidů do zhruba 40 nukleotidů,

    b) styku seskupeni imobilizovaných oligonukleotidových sond se známými sekvencemi o délce mezi přibližně 4 nukleotidy a zhruba 9 nukleotidy s těmito fragmenty nukleové kyseliny za účinných hybridizačních podmínek dovolujících pouze tyto fragmenty s úplně komplementární sekvenci hybridizovat na sondu, přičemž se vytváří primární komplexy, kde fragment je hybridizován, a nehybridizované sekvence,

    c) styku těchto komplexů se souborem ³²P značených nebo ³³P značených oligonukleotidových sond se známými sekvencemi o délce přibližně 4 nukleotidů až zhruba 9 nukleotidů za účinných hybridizačních podmínek, dovolujících pouze tyto značené sondy s úplně náhradní stránka

    - 87 komplementárními sekvencemi hybridizovat na nehybridizovanou sekvenci fragmentu, přičemž se vytváří sekundární komplexy, kde fragment je hybridizován na imobilizovanou sondu, a ³²P značená nebo ³³P značená sonda,

    d) ligace imobilizovaných sond a značených sond, které jsou v bezprostředním sousedství s enzymem DNA ligasa, přičemž se vytváří ligované sekundární komplexy,

    e) odstranění ze sekundárních komplexů libovolných neligovaných značených sond,

    f) detekce těchto ligovaných sekundárních komplexů, stanovením přítomnosti ³²P nebo ³³P značení,

    g) identifikace sekvencí z fragmentů nukleové kyseliny v těchto ligovaných sekundárních komplexech, kombinováním známých sekvencí ligovaných sond,

    h) stanovení protažení téchto sekvencí, které překrývají, a

    g) sestavení úplné sekvence nukleové kyseliny z téchto překrývajících sekvencí.
36. 37. Souprava pro použití při sekvencování nukleové kyseliny, vyznačující se tím, že obsahuje čip na tuhém nosiči, připojený k uspořádání oligonukleotidových sond ze známých sekvencí, přičemž oligonukleotidy jsou schopné účastnit se na hybridizačních reakcích, soubor zásobníků, zahrnující roztoky značených oligonukleotidových náhradní stránka

    - 88 sond ze známých sekvecí, a ligační činidlo.

    33. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že vétší počet čipů imobilizovaných oligonukleotidových sond je uspořádán ve formě sekvencujíciho seskupeni.
37. 39. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy mají délku mezi přibližně 4 nukleotidy a zhruba 9 nukleotidy.
38. 40. Souprava podle nároku 39,vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy mají délku přibližně 6 nukleotidů.
39. 41. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy jsou připojeny ke skleněnému, polystyrénovému nebo teflonovému tuhému nosiči.
40. 42. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy jsou připojeny k tuhému nosiči přes fosfodiesterovou vazbou.
41. 43. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že oligonukleotidové sondy jsou připojeny k tuhému nosiči pomocí syntetického mechanizmu aktivovaného světlem.
42. 44. Souprava podle nároku 37,vyznačuj ící se t i m, že značené oligonukleotidové sondy jsou značeny neradioaktivním isotopem nebo fluorescenčním barvivém.
43. 45. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t í m, že jedna z oligonukleotidových sond obsahuje náhradní stránka modifikovanou nebo univerzální bázi.

    - 89
44. 46. Souprava podle nároku 37, vyznačující se tím, značené oligonukleotidové sondy jsou značeny ³⁵S, ³²P nebo ³³P.
45. 47. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící setím, že ligačním činidlem je chemické ligaójní činidlo
46. 48. Souprava podle nároku 37, vyznačuj ící se t i m, že ligačním činidlem je enzym DNA ligasa.