UA48119C2 - Спосіб визначення послідовності молекули нуклеїнової кислоти (варіанти) та набір для використання при визначенні послідовності нуклеїнової кислоти - Google Patents

Abstract

У даному винаході викладені новітні способи і сполуки для швидкого і високоефективного створення послідовності нуклеїнової кислоти на основі гібридизації двома наборами невеликих проб олігонуклеотидів з відомими послідовностями. Надзвичайно великі молекули нуклеїнових кислот, включаючи хромосоми і нерозширені РНК, можна організовувати в послідовності без попереднього клонування і субклонування. Способи, відповідно до цього винаходу, можуть також дозволити вирішити різні існуючі проблеми, пов’язані з технологією створення послідовностей, такі, як, наприклад, низьке значення відношення сигнал-шум і складність вибірковості, прикріплення багатьох фрагментів нуклеїнової кислоти до поверхні, приготування багатьох більш довгих або більш складних проб і нанесення міток на більшу кількість речовин.

Description

Опис винаходу

Настоящая заявка является частичньм продолжением одновременно рассматриваемой заявки на патент 9 США 08/303.058, поданной 8 сентября 1994г.; которая является частичньмм продолжением заявки на патент

США 08/127.420, поданной 27 сентября 1993г.: весь текст и чертежи их специально включень! сюда как ссьілка без дискламации. Правительство США имеет право на настоящее изобретение согласно гранту Министерства знергетики ОКО 03235 и договору номер МУ-31-109-ЕМО-38 между Министерством знергетики США и Чикагским университетом, представляющим Национальную лабораторию Аргонн.

Настоящее изобретение в общем относится к области молекулярной биологии. В частности, изобретение предусматриваєет создание новьїх способов и соединений, позволяющих в вьісшей степени зффективное образование последовательностей молекул нуклейновой кислоть. Способь согласно зтому изобретению пригодньї для организации последовательности длинньіїх молекул нуклеиновьїх кислот, включая хромосомь и

РНК, с процессами клонирования и субклонирования. 19 В настоящее время образование последовательности нуклеиновьїх кислот составляет неотьемлемую часть научного прогресса. Определение последовательности, т.е. первичной структурь, молекул и сегментов нуклеийновьх кислот важно в отношений отдельньїх проектов, исследующих цельй диапазон конкретньх прикладньїх областей. Информация об организации последовательности, влияет на науку, медицину, сельское хозяйство и на все области биотехнологиий. Создание последовательности нуклеиновьїх кислот, конечно, жизненно важно для исследований по геному человека и для других крупномасштабньїх начинаний, цель которьїх - продвинуть наше понимание зволюции и функции организмов и помочь в пониманиий причин различньїх заболеваний.

Полезность организации последовательности нуклеийновьїх кислот очевидна. Например, Проект генома человека (ПГУ), многонациональное начинание, посвященное созданию последовательности всего генома с 22 деловека, осуществляется в различньїх центрах. Однако прогресс в зтой области в основном и медленен и Го) дорогостоящ. Организация последовательности нуклеийновьх кислот обьчно определяется на гелях полиакриламида, которье разделяют фрагменть! ДНК в диапазоне 1-500 базовьїх пар с различием по длине на один нуклеотид. Реальное определение последовательности, т.е. порядок отдельньїх нуклеотидов А, С, Си Т, можно достигнуть двумя способами. Во-первьїх, используя метод Максама и Гилберта химического о 30 расщепления фрагмента ДНК у конкретньїх нуклеотидов (Максам и Гилберт, 1977), |З1), или, во-вторьх, «- используя метод создания последовательности окончанием цепочки дидеокси, описанньій Сангером и коллегами (Сангер и др. 1977), (41|.Оба метода трудоемки и занимают много времени. --

Недавно бьлли предложень! другие способь! создания последовательности нуклеиновьїх кислот, в которьіх не о используется зтап злектрофореза, и зти способьі можно в общем назвать создание последовательности 3о гибридизацией или СПГ (Дрманач и др., 1991, (131; Кантор и др., 1992, (4); Дрманач и Черквеняков, патент США З 5.202.231), (111.

Развитие некоторьх из зтих методов вьізвало появление новьїх инструментов создания последовательности типа твердой основьі, известньїх как чипьі создания последовательности. О полезности СПГ в основном « свидетельствует тот факт, что по зтой технологии бьіли вьіданьї патенть! США. Однако - хотя СПГ потенциально З 40 может повьсить скорость, с которой можно образовьшвать последовательности нуклеийновьїх кислот, все с существующие методь! СПГ имет несколько недостатков.

Із» СПГ можно проводить двумя основньмми способами, которье часто назьвают "формат 1" и "формат 2" (Кантор и др., 1992), (4). В формате 1 олигонуклеотидьі неизвестной последовательности обьічно около 100-1000 нуклеотидов в длину, вьістраиваются на твердой основе или фильтре, так что сами неизвестнье 45 образцьі связьіваются (нейтрализуются) (Стречоска и др., 1991, (51); Дрманач и Черквеняков, патент США шк 5.202.231), (1). Реплики ряда затем "опрашиваются" гибридизацией наборами меченньїх проб длиной о приблизительно 6-8 радикалов. В Формате 2 чип образования последовательности образуется из набора олигонуклеотидов с известньми последовательностями с длиной приблизительно 6-8 радикалов (Сазерн, УМО - 89/10977), |48); Храпхо и др., 1991, (28); Сазерн и др., 1992), 491. -к 70 Нуклеиновне кислоть! неизвестной последовательности затем мечутся и им позволяют гибридизироваться к связанньм олиго. с К сожалению, оба зти формата СПГ имеют о несколько ограничений, в частности, требование предшествующих зтапов клонирования ДНК. В формате 1 к числу других значительньїх проблем относится прикрепление разньїх частей нуклейновой кислотьі, которую нужно организовать в последовательность, к твердой поверхности опорьії или приготовление большого набора более длинньїх проб. В формате 2 к числу

ГФ) основньіїх проблем относятся метки нуклейновьїх кислот неизвестном последовательности, обьічно вьісокое получающееся отношение сигнал-шум и то, чти можно определить только короткий последовательности. о Еще одна проблема в формате 2 зто образование вторичной структурьі, которая предотвращает доступ к некоторьим целям, и разнье условия, необходимье для проб с различньм содержанием С. Позтому зта 60 технология очевидньм образом вьиграет от создания новой процедурь! для организации последовательности нуклеиновьїх кислот и, в частности, такой процедурьі, которая позволяет избегать утомительнье процессь клонирования или/и субклонирования.

Настоящее изобретение создано для преодоления зтих и других недостатков, присущих предьідущим разработкам, путем создания новьїх способов и соединений для образования последовательности нуклеиновьсмх 62 кислот. Новейшие методьі, описаннье здесь, обьічно назьшались изобретателями "форматом З" и они представляют собой заметное улучшение по сравнению с существующими методами СПГ формат 1 и формат 2.

В Формате З образования последовательности, обеспечиваемье зтим изобретением, последовательности нуклеиновьх кислот определяются посредством гибридизации с двумя наборами небольших проб Олигонуклеотидов с известньми последовательностями. Способ согласно изобретению позволяет получать вьісоко избирательную последовательность чрезвьічайно больших молекул нуклейновой кислоть!І, включая хромосомньій материал или РНК, без предварительного клонирования, субклонирования или усилении. Кроме того, настоящие способь! не требуют наличия большого количества проб, комплексного синтеза более длинньх проб или мечения сложной смеси сегментов нуклеийноной кислоть. 70 Для того, чтобьі определить последовательность нуклейновой кислоть! согласие способам зтого изобретения, в основном находятся последовательности от нуклейиновой кислоть! путем гибридизации с дополняющими последовательностями от двух наборов небольших проб олигонуклеотидов (олиго) с определенной длиной и известной последовательностью, которйе включают в себя большинство комбинаций последовательностей для зтой длинь! пробьі. Затем анализируются найденнье последовательности для /5 определения перекрьивающихся протяженностей найденньїх последовательностей и реконструируется или собираеєтся полная последовательность нуклейновой кислотьі из таких перекрьивающихся последовательностей.

Способьї образования последовательности можно вьполнять с использованием последовательной гибридизации с дополнительньмми последовательностями из двух наборов небольших олиго. В качестве 2о альтернативьі, можно применять способ, описьіваемьй как "проведение цикла (чередование)", когда два набора небольших олиго гибридизируются одновременно с неизвестньіми последовательностями. Термин "проведение цикла" употребляется, поскольку избирательная часть метода возникает из последующего повьішения температурь! для "расплавления" тех гибридов, которне некомплементарньі. Такие методь! проведения цикла обьічно применяются в других областях молекулярной биологии, таких, как РСК, и их легко поймут специалисть с оре при чтений зтого описания.

Зто изобретение применимо для образования последовательности молекул нуклейновой кислоть! очень і) большой длинь. На практике, молекула нуклеийновой кислотьії, последовательность которой нужно образовать, в основном разделяєется на фрагментьіь для получения фрагментов нуклейновой кислотьі малой или промежуточной длинь, которьми легко манипулировать. б зо Понятие фрагмент нуклейновой кислотьї, как он здесь используется, обьічнее всего означает молекулу нуклеийновой кислотьії длиной приблизительно от 10 базовьх пар (бп) до 100бп. Считается, что самье -- предпочтительньюе способь зто те, в которьїх молекула нуклейновой кислотьі, последовательность которой с ди нужно организовать, обрабатьівается для получения фрагментов нуклеийновой кислоть! промежуточной длинь, т.е. приблизительно от 10бп до 40бп. Однако следует подчеркнуть, что настоящее изобретение зто не способ со з5 полного образования последовательности небольших фрагментов нуклейновой кислоть!, скорее зто способ «г образования последовательности молекул нуклейиновой кислоть! как таковой, что предполагает определение частей последовательности изнутри молекульі - будь то осуществление с использованием целой молекуль, или, для простотьі, достигается начальньм фрагментированием молекульй на участки меньшего размера приблизительно от 4 до 1000 баз. «

Последовательности из молекул нуклеиновой кислотьї определяются путем гибридизации к небольшим в с пробам олигонуклеотидов с о известной последовательностью. Когда сговорят о "небольших пробах олигонуклеотидов", термин "небольшие" означаєт пробьї с длиной менее 10бп и предпочтительно пробь! длиной ;» около 4бп и около 9бп. Б одном примере образования последовательности особенно пригодньіми считаются пробьї длиной около ббп. Для наборов олиго, включающих в себя все комбинации последовательностей для

Вьібранной длинь! пробьв их число будет представлено как 4Е,, где ЕР зто длина пробьі. Например, для 4-мера ї5» набор будет содержать 256 проб; для 5-мера набор будет содержать 1024 проб; для б-мера - 4096 проб; для 7- мера - 16384 проб, и т.д. Синтез олиго такой длиньі является вполне рутинньм в технике и его можно со осуществлять автоматизированньїм синтезом. - В способах согласно зтому изобретению один набор небольших проб олигонуклеотидов с известной 5р последовательностью, которьій можно назвать первьім набором, будет прикрепляться к твердой основе, т.е. - связьшваться (нейтрализоваться) на зтой основе таким образом, что он может участвовать в реакциях

Ге гибридизации. Другой набор небольших проб олигонуклеотидов с известной последовательностью, которьй можно назвать вторьім набором, зто пробьї, находящиеся в растворе и меченнье обнаруживаемой меткой.

Наборь олиго могут содержать пробьі одинаковой длинь или разньх длин. 5Б Процесс последовательной гибридизации означаєт, что молекульі нуклеиновой кислотьії или фрагменть! с неизвестной последовательностью можно гмбриднзировать к определенньім наборам проб олигонуклеотидов с (Ф, известньми последовательностями в отдельнье периодьй времени (фиг.1). Молекульь или фрагменть ка нуклеиновой кислотьі в основном будут денатурированьі, позволяя гибридизацию, и будут добавляться к первому, связанному набору проб при условиях избирательной гибридизации с обеспечением того, что бо Гибридизируются только фрагменть ос дополняющими последовательностями. Фрагменть! с некомплементарньми последовательностями удаляются и затем проводится следующий цикл избирательной гибридизации путем добавления второго, меченного, набора проб в раствор к уже образованной комбинации фрагментов и проб. Меченнье пробьі, которне гибридизируются рядом с фиксированной пробой, останутся прикрепленньми к основе и могут бьїть обнаруженьі, чего не происходит, когда имеется промежуток между 65 фиксированньїми и меченньіми пробами (фиг.1).

Процесс одновременной гибридизации оозначаєт, что молекульь нуклейновой кислотьі неизвестной последовательности могут контактировать с определенньми наборами проб олигонуклеотидов с известньми последовательностями одновременно.

Гибридизация происходит при условиях избирательной гибридизации. Затем фрагменть! с Некомплементарньми (не дополняющими) последовательностями "расплавляются", т.е. удаляются при повьішений температурьі, и затем проводится следующий зтап избирательной гибридизации, позволяющий гибридизироваться любьм вторьм дополнительньм пробам. Затем меченнье пробь), которье гибрндизировались рядом с фиксированной пробой, обнаруживаются таким же образом.

Последовательности нуклейиновой кислотьї, являющиеся "дополляющими (комплементарньіми)", зто те, 7/0 Которье способньі к спариванию без согласно стандартньм правилам комплементарности Уотсона-Крика й вариантам зтих правил, насколько они применимь! к модифицированньм базам. Зто значит, что большие пуриньї или модифицированнье пуриньі всегда будут спариваться по базе с меньшими пиримидинами с образованием только известньїх комбинаций. К ним относятся стандартньй парис гуанина, спаренньй с цитозином (0:С), и аденин, спаренньій либо с тимином (А:Т), в случае ДНК, либо с урацилом (А:)), в случаєе 7/5 РНК. Таюке рассматривается использование модифицированньх баз или так назьіваемой "универсальной базь (основь)" (М.Николе и др, 1994), ІЗ5БІ.

МИспользуемьій здесь отермин "дополняющие (комплементарнье) последовательности означаєт последовательности нуклеиновой кислоть, которье в принципе являются дополняющими по всей своей длине и имеют очень мало несовпадений баз. Например, последовательности нуклеиновой кислоть! с б-ю базами по 2о длине можно назвать дополняющими, если они гибридизируются в пяти их шести положений только с одним несовпадением. Естественно, последовательности нуклейновой кислотьІ, которне являются "полностью дополняющими" зто те последовательности нуклеийновой кислоть!, которне являются полностью дополляющими по всей своей длине и не имеют несовпадений баз.

После идентификации путем гибридизации к олиго с известньіми последовательностями разньїх отдельньх с о последовательностей, составляющие часть фрагментов нуклейновой кислоть, затем зти отдельнье о последовательности анализируются для нахождения перекривающихся протяженностей последовательностей.

Например, участки последовательностей, в которьїх конец 5 тот же самьй, что и коней 3 другом последовательности или наоборот, идентифицируются. Полная последовательность молекульі или фрагмента нуклеийновой кислоть! затем может оконтуриваться, т.е. она может реконструироваться из определенньїх таким б образом перекриівающихся последовательностей.

Процессьї нахождения перекрьвающихся последовательностей и реконструирсвания полной - последовательности обьічно определяются вьічислительньмм анализом. Например, если меченная проба «- 5-ТТТТТТ-3 гибридизируется к месту, содержащему фиксированную пробу 5-АААдДАДА-3, определяется 12-мерная последовательность изнутри молекуль! нуклейновой кислотьї, а именно 5-ААААААТТТТТТ-3" (поел. со з5 МД. М.1), т.е. последовательность двух гибридизированньх проб комбинируется, чтобьі обнаружить ранее «г неизвестную последовательность. Следующий вопрос, на которьій нужно ответить, зто какой нуклеотид идет следующим после только что определенной последовательности 5'-ААААААТТТТТТ-3" (поел, ид. М.1). Имеется четьіре возможности, представленньіе фиксированной пробои 5-АДАААТ-3' и меченньіми пробами 5-ТТТТТА-3' для А: 5-ТТТТТТ-3 для Т; 5-ТТТТТО-3 для С; и 5-ТТТТТО-3 для (с. Если, например, проба 5-ТТТТТО-3 « положительна. а другие три оотрицательнь, то собранньй последовательность расширяется до в с 5-ААААААТТТТТТО-3 (поел. ид. М.2). На следующем зтапе алгоритм определяет, какие из меченньїх проб

ТТТТСА, ТТТТСТ, ТТТТСС или ТТТТСО положительнь в месте, содержащем фиксированную пробу ААААТТ. ;» Зтот процесс повторяется пока все положительнье (Б-Р) последовательности олигонуклеотидов не используются или не будут определеньї как ложно положительньє.

Таким образом, зто изобретение создает очень зффективньй способ организовьівать последовательность ї5» фрагментов и молекул нуклейиновой кислотьі большой длинь». Как здесь определено, большие молекуль! нуклейновой кислоти зто такие молекули, которье нужно разделять на фрагментьй до создания бо последовательности. Их длина обьічно составляет, как минимум, приблизительно 45 или 50 базовьїх пар (БП), а - чаще всего и больше. Фактически, способь! согласно изобретению можно использовать, чтобьї организовьівать 5р последовательность молекул нуклейновой кислоть! практически без верхнего предела длиньі, так что можно - образовьвать последовательности около 100бп, 1 килобазь (кб), 100кб, 1 Мегабазь! (Мб) и 50 Мб и более, до

Ге полньїх хромосом, включительно, таких, как хромосомь! человека, имеющие в длину около 100М6б. Такое большое количество вполне находится в рамках настоящего изобретения, и образование последовательности такого количества баз потребует 2 набора 8-меров или 9-меров (так что ЕР приблизительно равно 16-18). в Подлежащие образованию последовательности нуклеийновье кислоть! могут бьть ДНК, например, сДдНК, геномная ДНК микрораочлененнье хромосомнье полосьі, космиднье ДНК или вставки МАС, или могут бьїть (Ф) РНК, включая тРНК, гРНК, ІРНК или зпРНК. ка Процесс определение последовательности длинной молекуль! нуклейиновой кислоть! предполагает просто нахождение последовательностей с длиной Б-Р из молекульй и комбинирование последовательностей с бо Мспользованием подходящего алгоритма. На практике, сначала скорее всего разделяют на фрагменть молекулу нуклеиновом кислотьі, последовательность которой нужно сформировать, для получения меньших фрагментов, таких, как фрагментьї нуклейновой кислотьі с промежуточной длиной. Затем находятся последовательности с длиной ЕР. гибридизацией, например, последовательной гибридизацией фрагментов к дополняющим последовательностям из 2-х наборов небольших проб олигонуклеотидов с известном 65 последовательностью, как описано вьіше. Таким образом, можно реконструировать полную последовательность нуклеийновой кислоть! чрезвьічайно больших молекул из перекриівающихся последовательностей с длиной ЕР.

Независимо от того, является ли нуклейновая кислота, последовательность которой нужно организовать, сама фрагментом с промежуточной длиной или ее вначале обработали, чтобьї получить фрагменть! с такой длиной, процесс нахождения последовательностей из таких фрагментов нуклеиновьїх кислот путем гибридизации двух наборов небольших проб олигонуклеотидов с известной последовательностью является основньІїмМ для описьіваемьїх здесь методов образования последовательности. Зтот процесс обьічно включаєт в себя следующие зтапь!: а) приведение набора или ряда прикрепленньх или связанньйх (нейтрализованньх) проб олигонуклеотидов в контакт с фрагментами нуклеийновом кислоть в условиях гибридизации; зффективньх для того, чтобь! позволить 7/0 Фрагментам с дополняющей последовательностью достаточно гибридизироваться к пробе, что образует первичнье комплексь, где фрагмент имеет как гибридизированньюе, так и негибридизированнье, или "свободнье", последовательности; б) приведение первичньїх комплексов в контакт с набором меченньїх проб олигонуклеотидов в растворе в условиях гибридизации, зффективньїх для того, чтобьі позволить пробам с дополняющими /5 последовательностями гибридизироваться к негибридизнрованной или свободной последовательности фрагмента, что образует вторичнье комплексьії, где фрагмент гибридизирован и у прикрепленной (связанной) пробе и к меченной пробе; в) удаление из вторичньїх комплексов любьїх меченньїх проб, которье не бьіли гибридизировань! рядом с прикрепленной пробе, что оставляет только соседние вторичнье комплексь; г) обнаружение соседних вторичньїх комплексов путем обнаружения наличия метки в меченной пробе; и д) нахождение последовательностей олигонуклеотидов из фрагментов нуклейновой кислоть! в соседних вторичньїх комплексах путем комбинирования или соединения известньїх последовательностей гибридизированньмх и меченньмх проб.

Гибридизация или "условия промьїівки", вьібраннье для проведения одного или двух зтапов гибридизации, с ов может осуществляться согласно конкретному вьібранному примеру образования последовательности.

Например, оба условия гибридизации могут бьіть организовань! так, чтобьї позволить пробам олигонуклеотида о гибриднзироваться к данному фрагменту нуклейновой кислоть, когда они содержат дополняющие последовательности, например, в принципе совпадающие последовательности, например, такие последовательности, которье огибридизируются у 5-ти ии 6б-ти положений. Предпочтительно зтапь б зо гибридизации проводят, используя простое робототехническое устройство, которое обьічно применяется в существующих процедурах образования последовательностей. --

В качестве альтернативь, условия гибридизации могут бьїть организовань так, чтобьі позволить «- гибридизацию только тем пробам и фрагментам олигонуклеотидов, которне имеют полностью дополняющие последовательности. Зти более избирательнье или "строгие" условия можно использовать для обоих со з5 Оотдельньх зтапов процесса последовательной гибридизации или только для каждого одного зтапа. В таких «г случаях пробьї олигонуклеотидов, будь то связаннье или меченнье пробьі, смогут гибридизировать только к данному фрагменту нуклеийновом кислотьї, если они имеют ообщие полностью дополняющие последовательности с фрагментом.

Вьібраннье условия гибридизации в основном диктуют степень сложности, требуемую для анализа « полученньїх данньх. В равной степени, компьютернье программь), имеющиеся для анализа любьх в с сформированньїх данньїх, могут диктовать условия гибридизации, которье нужно применять в данной

Й лаборатории. Например, в самом избирательном процессе оба зтапа гибридизации будут проводиться в ит условиях, позволяющих гибридизировать только олиго и фрагментьь с полностью дополняющими последовательностями. Поскольку несовпадающих баз не будет, зтот способ подразумеваєт найменее сложньй вьічислительньій анализ и по зтой причине зто в настоящее время предпочтительньм способ применения ї5» изобретения на практике. Однако применение менее избирательньїх условий для одного или обоих зтапов- гибридизации также входит ь рамки зтого изобретения. со Подходящие условия гибридизации для применения на одном из зтапов или на обоих могут обьічно - определяться процедурами оптимизации или первьми и-г серии исследований. Разнье видьї первьх исследований обьічно проводятся специалистами по организации последовательностей нуклеиновьх кислот - при установлений рабочих процедур и адаптации процедурьї для данной лаборатории. Например, такие

Ге условия, как температура; концентрации каждого из компонентов; продолжительность времени зтапов; применяемье буферь и их рН и прочность на ионь! могут меняться и тем самь!м оптимизироваться.

В предпочтительньсх примерах осуществления способ образования последовательности нуклеийновой

Б КИислотьІ согласно зтому изобретению включает в себя вьіборочньім зтап для отбора вторичньїх комплексов гибридизации, которне содержат непосредственно соседствующие связаннье и меченнье пробнь, в отличие от

Ф) тех, которне не являются непосредственно соседними и разделеньї одной, двумя или несколькими базами. ка МИмеется много разньїх процессов для удаления меченньїх проб, которье не гибридизировались непосредственно рядом с прикрепленной пробой, т.е. не гибридизировались задними сторонами, каждьм из бо /Которьх оставляет только непосредственно соседние вторичнье комплексь.

Такие избирательнье процессь! могут основьіваться исключительно на зтапах промьівки с контролируемой строгостью, где применяемье условия гибридизации организовань! так, что непосредственно соседние пробь! остаются гибридизированньмми благодаря повьішенной стабильности, создаваемой взаимодействиями между наборами соседних нуклеотидов. Опять же, такие условия промьїівки, как температура, концентрация, время, 65 буферьї, рН прочность на ионь! м т.п. можно менять, чтобьї оптимизировать удаление меченньх проб, которье не являются непосредственно соседнимим.

В предпочтительньх примерах осуществления изобретения непосредственно соседние связаннье и меченнье пробь! будут связань), т.е. обьеединень! ковалентной связью до вьіполнения зтапов промьівки для удаления любьїх не образовавших связи проб. Образование связей может достигаться путем обработки раствором, содержащим химическое связующее вещество, например, растворимьй в воде карбодиимид или цианоген бромид. Предпочтительно можно использовать фермент лигазь, такой, как лигаза Т4 ДНК из бактериофага 14, которьій промьішленно поставляется многими фирмами (например, Віоіабз). В любом случає, затем можно будет удалить не непосредственно соседние меченнье пробьії посредством более строгих условий промьівки, которье не могут воздействовать на ковалентне соединеннье меченнье и фиксированньсе пробь. 70 Остающиеся соседние вторичнье комплексь! будут обнаруживаться наблюдением за нахождением метки из меченньїх проб, присутствующих внутри комплексов.

Пробьї олигонуклеотидов могут метиться химически обнаруживаемой меткой, такой как флюоресцентнь!мм красителями, или адекватно модифицированньми для их обнаружения процедурами хемилюминесцентного проявления. или радисактивньмми метками, такими, как 355, Зн, З2р или ЗЗр, хотя сейчас предпочтителен ЗЗр. 7/5 Пробь могут таюке метиться нерадисактивньми изотопами и обнаруживаться масс-спектрометрией.

В настоящее время найболее предпочтительньй рассматриваемьй способ осуществления на практике зтого изобретения предполагает осуществление зтапов гибридизации в условиях, предназначенньх для того, чтобь позволить гибридизировать только тем пробам и фрагментам олигонуклеотидов, которне имеют полностью дополняющие последовательности и позволить оставаться гибридизированньми только непосредственна соседним пробам. Зтот способ вследствие зтого требует найменее сложного вьічислительного анализа.

Если молекула нуклейновой кислоть! с неизвестной последовательностью длинее, чем около 45 или 50бп, один зффективньйй способ определения ее последовательности обьічно предполагает обработку молекуль! для формирований фрагментов нуклейиновой кислотьї! промежуточной длиньі и определение последовательностей из фрагментов. Молекула нуклеийновой кислоть!, будь то ДНК или РНК, может бьіть разделена на фрагменть сч ов пюбьм из многочисленньо;. способов, включая, например, разрезанием ограничительньм ферментньм вьвариванием, сдвигом (скальшанием) физическими средствами, такими, как сверхзвуковая, обработка, і) обработкой Маон или сдвигом при низком давлений.

В некоторьїх примерах осуществления изобретения, например, при наличии небольших проб олигонуклеотидов длиной приблизительно от 4бп до 9бп можно иметь целью получить фрагменть нуклейновой (зу

Зо КИСлОТтЬ длиной приблизительна от 10бп до 40бп.

Естественно, более длиннье пробьї в основном будут использоваться в сочетаний с образованием - последовательности более длинньїх фрагментов нуклейновой кислотьі и о наоборот. В некоторьх ("п предпочтительньїх примерах осуществления используемье небольшие пробь! олигонуклеотидов будут иметь длину около ббп, а фрагменть! нуклейновой кислотьії, последовательность которьїх нужно организовать, будут со з5 Мметь длину в основном около 20бн. При желаниий фрагменть! можно разделять по размерам, чтобь! получить «г фрагмента соответствующей длиньі, например, фрагмента могут обрабатьмшваться на геле, таком, как гель агарозьі, и фрагменть! приблизительно желаемой длинь! могут отрезаться.

Способ определение последовательности молекуль! нуклейновой кислот можно, также пояснить на примере используя следующие условия. Вначале произвольно фрагментируется некоторое количество нуклейновой « КислотьІ, последовательность которой нужно образовать для получения смеси фрагментов нуклейновой в с кислотьі длиной Т. Приготовляется ряд связанньїх проб олигонуклеотидов с известньіми последовательностями и длиной Е и набор меченньх проб олигонуклеотидов в растворе с известньіми последовательностями и длиной з Р, где Е ж Р - Т, предпочтительно когда Т приблизительно разно ЗЕ.

Затем ряд связанньїх проб олигонуклеотидов приводится в контакт со смесью фрагментов нуклеийновой кислот в условиях гибридизации, зффективньх для того, чтобьі позволите формирование первичньх ї5» комплексов с гибридизированньіми, дополляющими последовательностями длиной Е и негибридизированньми последовательностями фрагментов длиной Т-Р. Предпочтительно гибридизированнье последовательности со длиной Е будут содержать только полностью дополняющие последовательности. - Затем первичнье комплексь! приводятся в контакт с набором меченньїх проб олигонуклеотидов в условиях Гибридизации, зффективньх для того, чтобь позволить образование вторичньїх комплексов с - гибридизированньми, дополляющими последовательностями длиной Е и соседними гибридизированньми,

Ге дополняющими последовательностями длиной Р. В предпочтительньїх примерах осуществления изобретения только меченньм пробам с полностью дополняющими последовательностями будет позволено гибрнднзировать. И только тем пробам, которье гибридизируют непосредственно рядом со связанной пробой, ов будет позволено оставаться гибридизированньми. В самьх предпочтительньїх примерах на зтом зтапе соседние связаннье и меченнье пробьї олигонуклеотидов будут также образовьівать связи. (Ф, Затем обнаруживаются вторичнье комплексьі путем обнаружения наличия метки и идентифицируются ка последовательности длиной ЕР из фрагментов нуклеийновой кислотьі ко вторичньїх комплексах путем комбинирования известньїх последовательностей гибридизированньїх связанньїх и меченньїх проб. Затем бо перекривающиеся протяженности последовательностей длиньі ГР будут идентифицироваться, что позволяет реконструировать или собирать полную последовательность нуклейновом кислотьі из определенньх перекрьівающихся последовательностей.

В способах согласно зтому изобретению олигонуклеотидьі первого набора могут прикрепляться к твердой основе, т.е. связьіваться (нейтрализовьмваться) любьм из методов, известньїх специалистам. Например - б5 прикрепление может производиться посредством адресуемой приводимой в действие лазером

Фотодепротекции (Фодор и др. 1991221; Пиз и др., 1994,І36)Ї). Один в общем случає предпочтительньїй способ зти прикрепление олиго через фосфатную группу с использованием таких реагентов, как нуклеозид фосфорамидит или нуклеозид водород фосфорат, как описано Сазерном и Маскосом (заявки РСТ

М/090/03382),І(48) с использованием основ из стекла, нейлона или тефлона.

Другой предпочтительньій способ зто метод генерированного светом синтеза, описанньій Пизом и др. (1994)І36)Ї. Можно также купить связаннье с основой рядьі олигонуклеотидов, например, такие, которье продаются фирмами АПутеггіх и ВесКтап.

Связаннье олигонуклеотидь! могут образовьіваться в ряд, содержащий все проби или подмножества проб с данной длиной (предпочтительна приблизительно 4-10 баз), и более предпочтнтельно во множество рядов) /о связаннье олигонуклеотидов, расположеннье с образованием так назьваємого 'чипа создание последовательности". Один пример чипа зто когда гидрофобнье сегментьї используются для создания отдельньїх пространственньїх участков. Чипьї создания последовательности можно сконструировать для разньїх областей применения, таких, как планирование, частичное создание последовательности, создание последовательности намеченньїх участков для целей диагностики, создание последовательности тРНК и /5 создание широкомасштабной последовательности генома. Для каждой области применения можно сконструировать конкретньїйй чип с пробами разньїх размеров или с неполньім набором проб.

В одном примере осуществления изобретения обоими наборами проб олигонуклеотидов будут пробь длиной в 6 баз, т.е. б-мерьі. В зтом случає каждьй набор олиго содержит 4096 отдельньїх проб. Пробь! первого набора предпочтительно фиксировань! в ряду на микрочипе, наиболее удобно при размещении в 64 ряда и 64 2о столбца. Второй набор из 4096 олиго будет метиться обнаруживаємой меткой и распределяться на набор отдельньїхх трубочек. В зтом примере 4096 чипов будут комбинироваться в большой ряд или в несколько рядов.

После гибридизации фрагментов нуклеийновой кислотьї небольшое количество меченньїх олигонуклеотидов будет добавляться к каждому микрочипу для второго зтапа гибридизации и только один из каждьїх 4096 нуклеотидов будет добавляться к каждому микрочипу. с

К числу других обьектов зтого изобретения оотносятся наборь материалов для создания последовательностей нуклеийновьїх кислот. В основном такие наборьі включают в себя твердую основу, и і) которой прикреплен ряд проб олигонуклеотидов с известньіми последовательностями, как показано на фиг.2А, фиг2В и фиг.2С, где олигонуклеотидь! способньі участвовать в реакциях гибридизации, и набор емкостей, содержащих растворьї меченньх проб олигонуклеотидов с о известньми последовательностями. б зо Рассматриваются таюке такие схемьї, как те, которне представлень на фиг.4. Она описьввает использование "муниверсальной базь", либо как способа прикрепления или у конечного положения, чтобь! придать новое - измерение гибридизации фрагментов. «-

В зтих наборах материалов прикрепленнье пробьї олигонуклеотидов и пробь! в растворе могут иметь длину приблизительно 4-9бп, причем предпочтительнь! пробь! длиной около ббп. Олиго могут бьіть меченьі химически со з5 обнаруживаемьми или радисактивньми метками, причем в общем случае предпочтительнь! пробьі, меченнье «г 3З2р, и еще более предпочтительна пробью меченнье ЗЗр. Наборьї материалов могут также включать в себя химическое или другое связующее вещество, такое, как фермент лигазьі ДНК. В состав наборов материалов могут включаться разнье другие соединения и материаль), такие, как устройства с 96 кончиками или 96 штьірьками, буферьї, реагентьї для разрезания длинньїх молекул нуклейиновой кислотьі и инструменть! для « вьібора размеров фрагментов ДНК. Наборьї материалов могут таюке включать меченнье пробьі РНК, так что ств) с пробьї можно удалять обработкой РНКазь и повторно используемьми чипами создания последовательности.

На чертежах проиллюстрировано настоящее изобретение. ;» На Фиг.1 показаньь основнье зтапьі процесса гибридизации. Зтап 1: Немеченная целевая ДНК- последовательность котором нужно образовать (Т), гибридизируется в избирательньх условиях к ряду прикрепленньїх проб олигонуклеотидов. Описань! места с пробой Ех и Ру. Дополляющие последовательности їх для Ех и Бу находятся на разньїх положениях Т. Зтап 2: Меченнье пробьі, Рі (одна проба на чип) гибридизируются к ряду. Описана проба, имеющая дополняющую цель на Т, которая соседствует с Ех, но не с со Ру. Зтап 3: Путем применения избирательньх условийи или реагентов селективно расплавляются комплексь! без - соседних проб. Конкретньій пример зто образование связи меченной пробьі А фиксированной пробой, когда Меченная проба гибридизирует "задней стороной к задней стороне" с прикрепленной пробой. Положительньсе - сигналь" обнаруживаются только в случає соседних проб, таких, как Ех и РІ, и в конкретном примере только в

Ге случаеє образовавших связи проб.

На Фиг.2А, Фиг.2В и Фиг.2С представленьі компоненть! примерного набора материалов для образования последовательностей.

Фиг.2А. Чипь создания последовательности, представляющие собой ряд 4 " тождественньїх секций каждая из которьїх содержит тождественнье (или разнье) рядь! олигонуклеотидов. Секции могут разделяться о физическими барьерами или гидрофобньїми полосками. Считается, что в ряду имеется 4000-16000 олигочипов. іме) Фиг2В - зто вид в увеличении секции чипа, содержащей 4" участков, каждьй с конкретной пробой олигонуклеотида (4000-16000), синтезированной или установленной в зтой месте. Участки могут бьіть размером 60 всего в несколько микрон, а размер секции приблизительно 1-10мм.

Фиг.2С- представляет набор трубочек или одну или несколько пластин с множеством карманов с соответствующим числом карманов (в зтом случае 4" карманов). Каждьм карман содержит некоторое количество конкретно меченного олигонуклеотида.

Дополнительное количество проб можно хранить немеченньми, если меченме не производится во время б5 синтеза; в зтом случае набор материалов для создания последовательности будет содержать необходимье компонента для мечения проб. Линии, соединяющие трубочки/кармань! и секциями чипа, описьївают зтап в процедуре организации последовательности, когда некоторое количестве меченной пробь! переносится в секцию чипа. Перенос может осуществляться пипеткой (простой или многоканальной) или рядом штьірьков (шпилек), переносящих жидкость посредством поверхностного натяжения. Инструменть! для переноса также Могут включаться в набор материалов.

ФнгоЗА, Фнг,ЗВ и ФнгоЗС. Гибридизация фрагментов ДНК, полученньїх произвольньм разрезанием некоторого количества молекульї ДНК. На Фиг.ЗА фрагмент Т1 ДНК такой, что содержит полнье цели для фиксированньїх и нефиксированньїх меченньїх проб. Фиг. ЗР представляет случай, когда фрагмент Т ДНК неправильно разрезан. НА Фиг.3С имеется достаточно места для гибридизации пробьі Р но соседняя /о последовательность не комплементарна ей. МИ в случае В, и в случае С сигнал будет уменьшен из-за насьшщений молекул прикрепленной пробьі ГЕ. Одновременная гибридизация фрагментами ДНК и меченньіми пробами и циклическое проведение процесса гибридизации зто некоторне возможнье способь! увеличения вьхода правильньїх соседних гибридизаций.

Фиг.4. Использование "универсальной базь" как средства связи или в конечним положение для гибридизации. Универсальньсе базь (М-база, Николо и др. 1994, |З4) или все 4 базьї можно добавлять в синтезе пробьм. Зто один из способов увеличения длиньі проб и, таким образом, стабильности дуплексов без увеличений количества проб. Кроме того, использование универсальньїх баз на свободном конце проб создает прокладку, которая позволяет прочитьівать последовательность в другом кадре (фрейме).

Определение последовательностей молекул нуклеийновьїх кислот находит важное использование во всех фундаментальньх и прикладньйх биологических исследований (Дрманач и Черквеняков, 1990, |101).Настоящее изобретение создаєет новьіе и зффективнье способь! для создания последовательностей и анализа молекул нуклеийновой кислотьії. Одно из намечаемьїх использований зтой методологии, в сочетаний с другими способами образований последовательностей, зто использование в работе над Проектом генома человека (ПГУ).

В настоящее время известньі 2 метода создания проследовательности гибридизацией (СПГ). В первом, сч формат 1, неизвестнье геномньіе ДНК или олигонуклеотидьі длиной до 100-200 вьістрайваются на твердой подложке. Затем зти ДНК "опрашиваются" гибридизацией набором меченньх проб, которье обьічно 6-8-мерьі. В і) обратном методе, Формат 2, олигомерь в 6-й нуклеотидов связьіваются (нейтрализуются) на твердой основе, и им позволяют отжигаться до частей клонированной и меченой ДНК.

В любом из 2-х видов анализа СПГ нужно включать много зтапов, чтобьі прийти к определенной ду зо последовательности. Конкретнье проблеми, связаннье с существующими методами СПГ зто те, которне ассоциируются с синтезов большого числа проб и с трудностями зффективней избирательной гибридизации. -

Полное распознавание совпадения-несовпадения затруднено по двум основньм причинам. Во-первьх, «- конечное несовпадение проб длиннее чем10 баз очень неизбирательно, и во-вторьїх сложная смесь печенньх сегментов ДНК, которая получаєется при анализе длинньїх фрагментов ДНК, генерирует вьісокий фон. со

Настоящее изобретение обеспечиваєет зффективную избирательную гибридизации без большого числа проб «г или проб с увеличенной длинной и также исключает многие из зтапов нанесения меток и клонирования, которьіе являются конкретньіми недостататками каждого из известньїх методов СПГ. Описьіваемье в вьісшей степени зффективнье способь! создания последовательности нуклеийновой кислотьІ, назьваемье созданием последовательности в формате 3, основаньь на гибридизации с двумя наборами небольших проб « олигонуклеотидов с известньіми последовательностями, и таким образом можно определять, как минимум, в в с два раза большую длину последовательности. Зти способь!ї позволяют организовьшвать последовательность чрезвьмчайно больших молекул нуклейновой кислотьії, включая хромосомьі, и решать разнье другие проблемь! ;» СПГ, такие, как. например, прикрепление или мечение многих фрагментов нуклеийновом кислоть!. Изобретение имеет чрезвьчайно большую потенцию. т.к. его можно также использовать дли создания последовательности

РНКи даже неувеличенньх образцов РНК. їх После настоящего изобретения, как описано в заявке США 08/127.402 и у Дрманача (1994), (17), бьіл представлен другой вариант СПГ, названньій позиционньм СПГ (ПСПГ) (Бруд и др., 1994), (2). ПСПГ по сути со является вариантом СПГ формата 2 (в котором олигонуклеотидь! известньїх последовательностей связьіваются - (нейтрализуются) н используются для гибридизации к нуклеийновьім кислотам неизвестной последовательности, Которне предварительно метились). В ПСПГ связанньсе пробь, не будучи простьмми. односкрученньіми пробами, - зто дуплексьі - содержащие односкрученньге 3' свесьі. Биотинилированнье дуплекснье пробь! связьіваются на

Ге покрьїтьїх стрептавидином магнитньїх шариках с образованием некоторого вида связанной пробь и затем перемешиваются с З2р-меченньми целевьіми нуклейновьіми кислотами, последовательность которьїх нужно создать. 5Б Затем добавляется лигаза Т: ДНК для связьівания любой гибридизированой целевой ДНК к более короткому концу дуплексной пробні. (Ф) Однако, хотя зто представляет собой интересньій подход, ПСПГ (как оно излагаєтся Брудом и др., 1994), |21, ка не отражает значительного улучшения по сравнению с существующей технологией СПГ. Например, в отличие от методологии формата З зтого изобретения, ПСПГ не удлиняет длиньі! последовательности, которую можно бо определить за один цикл способа. В ПСПГ также поддерживается обременительное требование нанесений меток на нейзвестную целевую ДНК, чего не требуется в формате 3. В общем, ПСПГ предлагаєется для использования в сравнительньїх исследованиях или вв опланирований, а не в новом созданий последовательности генома. Таким образом, зто значительно отличается от формата З, которьй, хотя и широко применим во всех областях создания последовательностей, является очень мощньм инструментом для 65 образования последовательностей даже самьїх крупньїх геномов.

Нуклеиновье кислотьі, последовательность которьїх нужно организовать, можно сначала разделить на фрагменть. Зтого можно достигнуть любьіми способами, включая, например, разрезание ограничительньі!м ферментньм вьвариванием, особенно с См І, как описано Фицджералдом и др. (1992)Ц21); сдвигом физическими средствами, такими, как ультразвуковая обработка; обработкой МаоН и т.п. При желаний

Фрагменть! соответствующей длинь), например, приблизительно 10-40бп, могут внірезаться из геля. Полная последовательность нуклеиновой кислотьї первоначальной молекульі, такой, как хромосома человека, будет определяться путем определения последовательностей ЕР, присутствующих в начальной молекуле, и сборки частей перекривающихся последовательностей ЕР.

Позтому зто не требует промежуточного зтапа определения последовательностей фрагмента, скорее 7/0 последовательность всей молекуль! сконструируется из оконтуренньїх последовательностей ЕР.

Для цели следующего обсуждения в общем случає будет приниматься, что 4 базьі составляют последовательности нуклеиновьїх кислот, которне нужно организовать. Зто А, З, Си ТдляДНКИА, С, Си для РНК. Однако может бьть ополезньм в некоторьїх примерах осуществления использовать модифицированнье базьі в небольших пробах олигонуклеотидов. Чтобь! вьіполнить зто изобретение, сначала 7/5 обьічно готовится ряд небольших проб олигонуклеотидов определенной длиньі, которьій включают в себя все комбинации последовательностей для зтой длиньі пробьі. Зто число представляется 4 М (4 в степени М), где длина пробьї обозначена М. Например, имеются 4096 возможньїх последовательностей для б-мерной пробь 46- 4096).

Один набор таких проб длиной Е (47) будет фиксироваться в квадратном расположение на микрочипе, которьй может бьть в диапазоне от 1мм? до 1см-. В настоящем примере они будут расположень! в 64 ряда и 64 столбца. Естественно, обеспечиваеєтся, чтобьі пробьі олиго бьли прикрепленьй или иначе связань! с поверхностью микрочипа, так чтобьі! могли участвовать в реакциях гибридизации. Другой набор олиго с длиной

Р, числом 4" будет тоже синтезирован. Олиго в зтом наборе "Р" будут метиться обнаруживаемой меткой и будут распределяться по набору трубочек (фиг. 2А, фиг.2В и фиг.2С). с 4Р из чипов будут комбинироваться в большой ряд (или несколько рядов приблизительно 10-100см г дляїд (У удобньїх размеров); где Р соответствует длине олигонуклеотидов во втором наборе олигомера (Фиг.28 иФиг.2С). Снова, в качестве удобного примера, Р вьібирается как 6 (Р-6

Нуклеиновне кислоть!ї, последовательности которьїх нужно организовать, будут разделяться на фрагменть! с получением меньших фрагментов нуклеийновьїх кислот с неизвестном последовательностью. Средняя длина Ф зтих фрагментов, нарьіваемая Т обьчно должна бьїть больше, чем обьединенная длина Е и Р и может «- приблизительно в три раза больше длинь Е (т.е. ЕР 2 - Т и Т приблизительно равно ЗЕ). В настоящее примере целью будет получение фрагментов нуклейиновой кислотьії длиной приблизительно 30 базовьх пар. Зти -- фрагменть! будут денатурированьь и добавляться к большим рядам в условиях, которье облегчают (се) гибридизацию дополняющих последовательностей.

В самой простой и предпочтительной в настоящее время форме изобретения будут вьібираться условия ч гибридизации, которье позволят произойти значительной гибридизации только если б последовательньх нуклеотидов в фрагменте нуклейновой кислотьї являются дополняющими для всех б нуклеотидов Е пробь олигонуклеотида. Такие условия гибридизации будут определяться обьічньми начальньми исследованиями « дю оптимизации, в которье определяются такие условия как температура концентраций разньїх компонентов, -о длительность зтапов и используемье буферьї, включая рН буфера. с На зтой стадии каждьй микрочип содержит определеннье гибридизированнье комплексьї. Они будут в виде :з» пробьі: комплексьі фрагмента, в которьїх вся последовательность пробь! гибридизирована к фрагменту, но в которьїх фрагмент, будучи более длинньм, имеет некоторье негибридизированнье последовательности, образующие "хвост" или "хвость" комплекса. В зтом опримере дополняющие гибридизированнье їз 15 последовательности будут длиной РЕ, а негибридизированнье последовательности будут иметь общую длину

Т-Е. (ее) Дополняющая часть фрагмента может располагаться у соответствующего конца или по направлению к нему, - так что можно образовать один более длинньій негибридизированньй хвост. В качестве альтернативь,, дополняющая часть фрагмента может располагаться по направлению к противоположному концу, так что - 70 образуются 2 негибрилизированньмх хвоста (фиг.ЗА, фиг.ЗВ и фиг.3С). с После промьівки с целью удаления недополняющих фрагментов нуклейновой кислоть!І, которье не гибридизировали, небольшое количество меченньїх олигонуклеотидов в наборе Р добавляется к каждому микрочипу для гибридизации к хвостам фрагмента нуклейиновой кислоть! неизвестной последовательности, которье вьдаются из пробь: комплекса фрагмента. Только один из каждого из 4 нуклеотидов будет 59 добавляться к каждому микрочипу. Сейчас предпочтительно использовать условия гибридизации, которье

ГФ) позволяют иметь место значительному образованию связей только, если все б нуклеотидов меченной пробь 7 являются дополняющими для б последовательньх нуклеотидов хвоста фрагмента нуклеийновой кислоть.

Условия гибридизации определяются описанньми вьше начальньми исследованиями, в которьх оптимизируются такие злементь, как температура, концентрация, время, буферьи т.п. бо На зтом озтапе каждьй о микрочип будет содержать определеннье "вторичнье гибридизированнье комплексь!". Они будут в форме проба: фрагмент: комплексь! пробьі, в которой вся последовательность каждой пробьї гибридизирована к фрагменту и в которой фрагмент, вероятно, имеет некоторне негибридизированнье последовательности. В зтих вторичньїх гибридизированньїх комплексах связанная проба и меченая проба могут бьіть гибридизировань к фрагменту, так что две пробьї являются непосредственна соседними или расположень 65 друг к другу задними сторонами.

Однако, учитьвая то, что фрагментьі будут в общем случае более длинньіми, Чем сумма длин проб, связанная проба и меченная проба могут гибридизировать к фрагменту в не соседних положениях, отделенньх одной или несколькими базами.

Затем большие рядь! обрабатьшваются посредством, процесса для удаления негибридизированньх меченньїх проб. В предпочтительньїх примерах осуществления используемьй процесс удалит из ряда не только негибридизированнье меченнье пробьі, но и не соседние гибридизированнье меченнье пробь. В процессе используются избирательне условия, чтобьі позволить зтим вторичньм комплексам гибридизации, которье содержат соседние связаннье и меченнье пробь, дискриминироваться из тех вторичньїх комплексов 7/0 Гибридизации, в которьїх фрагмент нуклейновой кислоть! гибридизирован к 2-м пробам, но зти пробь не соседние. Зто является важньїм аспектом изобретений в ток смьгсле, что зто позволит конечное оконтуривание секции последовательности фрагмента, соответствующей комбинированной последовательности связанной пробьї и меченной пробьї.

Процесс избирательности, используемьм для удаления негибридизированньх и не соседних 7/5 Гибридизированньїх проб из ряда при оставлений соседних гибридизированньїх проб прикрепленньіми может бьіть снова контролируемь!м процессом промьівки. Соседние гибридизированнье пробьї не будут подвергаться влиянию вьібранньїх условий из-за своей повьішенной стабильности благодаря реакциям между наборами (слоями) соседних нуклеотидов. Однако в предпочтительньїх примерах осуществления будут обрабатьваться крупньюе рядь, тек что любье соседние пробьй будут ковалентно связаньь например, путем наработки 2о раствором, содержащим химическое связующее вещество или, более предпочтительно, фрагмент лигазь, такой как лигаза Т4 ДНК (Ландегрен и др. 1988, ІЗОЇ): Ву и Уоллас, 1989, І|521).

В любом случає, полньйй ряд будет подвергаться строгому промьіванию, так что единственная оставшаяся метка, связанная с рядом, будет в виде двойньїх скрученньїх комплексов проба-фрагмент-проба соседними гибридизированньіми частями с длиной ЕР (т.е. 12 нуклеотидов и данном примере). С использованием зтом сч ов двухзтапной реакции гибридизации возможна очень вьсокая избирательность, потому что в расчет принимаются З или 4 независимьїх избирательньхх процесса: избирательная гибридизации фрагмента Т к пробе і) длиной Е баз; избирательная гибридизация пробьі длиной Р баз к фрагменту Т; избирательная стабильность полного совпадения (Е-ТР) гибрида по сравнению с Р гибридами или даже несовпадающими гибридами, содержащими не соседствующие пробьі ЕР; и избирательное образование связей 2-х конечньїх баз Р и Р. б зо Затем обнаруживаются так назьіваемье соседние вторичнье комплекса путем наблюдения местоположения остающейся метки на ряде. С положения метки можно определить последовательность длиной ЕР (например - 12) нуклеотидов путем комбинирования известньїх последовательностей связанньїх (нейтрализованньх) и «- меченньїх проб. Затем можно реконструировать или собрать полную последовательность нуклейновой кислоти первоначальной молекуль, такой как хромосома человека, из определенньїх таким образом перекривающихся со последовательностей Е-Р. «Е

Если образование связей )используется в процессе создания последовательности, как сейчас предпочтительно, то обьічньй чип олигонуклеотидов нельзя использовать повторно. Изобретатель считает, что зто не будет ограничивать, т.к. имеются разнье методьй утилизации. Например, можно сформировать специфически легко расщепляющуюся связь между пробами и затем расщепить связь после обнаружения. «

В качестве альтернативь, можно использовать рибонуклеотидиьі для второй пробь), пробь Р, или в с использовать рибонуклеотид для соединения базьі в пробе Р, так что зту пробу можно затем удалить

Й обработкой РНКазой или урацил-ДНК гликосилатом (Крейг и др.,1989), (17). Другие рассматриваємьсе способь а можно установить связи путем химического образования связей, которье можно, селективно обрубить (Долинньїй и др., 1988), (91.

Другие варианть! и улучшения зтой методологии создания последовательности также рассматриваются и ї5» входят в рамки зтого изобретения. Сюда относится использование модифицированньїх олигонуклеотидов для повьішения специфичности или зффективности способов, аналогичное описанному Хоханзелем и Лерахом со (1990), (23). Можно применять и гибридизации с проведением циклов для увеличения сигнала гибридизации, как - зто используется в технологии РЕКС. В зтих случаях будут использоваться цикль! с разньіми температурами для повторения гибридизации некоторьїх проб. Изобретение предусматривает таюке определение сдвигов в кадрах - считьявания с использованиегм равномолярньх количеств проб, которье имеют разную базу у коцевого

Ге положения. Например, используя равномолярнье 7-мерь, в которьїх первье б баз зто та же самая определенная последовательность, а последние положения могут бьїть А, Т, С или С альтернативе.

Включаются следующие примерьї для демонстрации предпочтительньх примеров осуществления в МЗзобретения. Специалисть! должнь! понимать, что описьіваемье в следующих примерах методь! представляют собой методь, открьїітье изобретателем для нормального функционирования при практическом использований (Ф, изобретения, и таким образом их можно считать составляющими предпочтительнье режимь! такого ка практического использования.

Однако специалистьі должнь! понять в свете зтого описания, что можно сделать много изменений в бо Конкретньїх примерах осуществления, которвіе здесь описань), и все же получить похожий или аналогичньй результат, не отходя от духа и обьема изобретения.

ПРИМЕР 1

ПРИГОТОВЛЕНИЄЕ СВЯЗАННЬЇХ С ОСНОВОЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

Олнгонуклеотидьі, те. небольшие сегментьі нуклеиновой кислотьі, можно легко приготовить, например, б5 путем прямого синтеза олигонуклеотида химическими средствами, как обьічно происходит на практике с использованием автоматизированного синтезатора олигонуклеотидов.

Связаннье, с основой нуклеотидьі могут готовиться любьм из способов, известньмм специалистам, с использованием любой пригодной основьї, такой, как стекло, полистирен или тефлон. Одна стратегия состоит в точном нахождениий места олигонуклеотидов, синтезированньїх стандартньми синтезаторами. Связьвание (нейтрализацию) можно достичь пассивной адсорбцией (Инуйе и Хондо, 1990), (24); использованием УФ света (Нагата н др., 1985, |24); Дален и др., 1987, ІВ); Морри и Киллинс, 1989), ІЗ2), или образованием ковалентной связи базовой модифицированной ДНК (Келлер и др., 1988261; 1989, І271.

Можно применять другую стратегию - использовать в качестве образователя связи сильное взаймодействие бойотин - стрептавидин. 70 Например, Бруд м др., 1991, І), описьівают использование биотинилированнь| проб, хотя зто дуплекснье пробьї, которье связаньі на покрьїітьїх стрептавидином магнитньїх шарикам. Покрьїтье стретавидином шарики можно купить в фирме Бупаї, Осло. Конечно, зта же химия образования связей применима к покрьітию любой поверхности стрептавидином Биотинилированнье пробьї можно купить в газньїх фирмах, например, в Орегоп

Тесппоіодієз (Аламеда, Калифорния). 15 Фирма Мипс І арогаюгієз (Нейпервилл, Иллинойс) также продает подходящий к использованию материал.

Мипс І арогайїгіеєз разработала метод, посредством которого ДНК можно ковалентно связать с поверхностью микро-карманами, назьіваемой СомаїЇ пк МН. Сомаї ІК МН зто поверхность из полистирена, к которой привить вторичнье амино-групггь! (МН), которье служат предмостньмми позициями для образования дальнейших ковалетньїх связей. Модули Сомаї ІпК можно закупить в Мипс І арогагіез. Молекуль! ДНК могу бьїть связань с 2о бСомацпкК исключительно у 5-конца посредством связи фосфорамидата, что позволяет связьвание (нейтрализацию) более чем 1 пмоля ДНК (Расмуссен и др., 1991), 401.

Использование полосок СомаїЇ (ПК МН для ковалентного связьівания молекул ДНК у 5'-конца бьіло описано (Расмуссен и др., 1991), (401. В зтой технологий используется связь фосфорамидата (Чу и др.,1983) (6).Уто полезно, так как предпочтительна связьивание (нейтрализация) с использованием только одной ковалентной с ов святи). Связьфосфорамидата связьшвает ДНК со вторичньми амино-группами Сомацпк МН, которье о расположень у конца плеч прокладки, ковалентно привитьїх на поверхность полистирена через плечо прокладки длиной 2 нм.

Чтобьі связать олигонуклеотид с Сома! пк МН через связь фосфорамидата, окончание олигонуклеотида должно иметь 5-конец фосфатную группу. Вероятно, даже можно ковалентно СомаїЇ ІпК и затем использовать Ге! зо сСтрептавидин для связьвания проб.

Более конкретно, способ образования связи включаєт в себя растворение ДНК в воде (7,5нг/мкл) и -- денатурирование в течение 10 мин при 957С и охлаждение на Льве в течений 10 мин. «- 0,1 М 1-метилимидазол с температурой льда, рН 7,0 (1-МеІт7) затем доавляется к конечной концентрации т М 1-Ме!т?7. Затем раствор зз ДНКнаносится на полоски Сомаї ІпК (/5мкл/карман), стоящие на льду. со

Карбодиимид 0,2 М 1-зтил-3-(3- диметиламинопропил) карбодиимид (ЕСС), растворенньїм в 10 тМ 1-Меїт?7, «Е освежаєется и 25мкл добавляется на карман. Полоски вьідерживаются в термостате 5 часов при 507. После вьідержки полоски промьваются с использованием, например Мипс-Іттипо УУази; сначала полоски промьіваются З раза, затем они промакиваются промьівающим раствором в течений 5 мин и наконец они проміваются З раза (причем промьівающий раствор зто 0,4 М Ммаон, 0,2596 ЗО5, нагретого до 507С). «

Считается,что еще один пригодньій метод для использованиея с зтим изобретением описан в заявке М/С в с 90/03382 (Сазерн и Маскос), (48). Зтот способ приготовления олигонуклеотида, связанного с основой, предполагает прикрепление нуклеозида З'-реагента Через фосфотную группу ковалентной связью сложного ;» двойного зфира фосфора к алифатическим гидроксильньім группам, несомь!м основой. Затем олигонуклеотид синтезируется на поддерживаемом нуклеозиде и защдищающие группь! удаляются из цепочки синтетического олигонуклеотида в стандартньх условиях, которне не отщепляют олигонуклеотида от основь. К числу ї5» пригодньїх реагентов относятся нуклеозид фосфорамидит и нуклеозид водород фосфорат.

Более конкретне, чтобь! использовать зтот метод, основа, например стеклянная пластина, дериватизируется со при контакте со смесью ксилена, глицилоксипропилтриметоксилана и мальм количеством - диизопропилотиламина при 90"С в течение полусуток. Затем она тщательно промьівается метанолом, зфиром и Вьісушивается на воздухе. - Затем дериватизированная основа, нагревается перемешиванием в гексазтиленгликоле, содержащем

Ге каталитическое количество концентрированной серной кислотьі, в течение полусуток в атмосфере аргона при 80"С с получением алкил гидроксил дериватизированной основьі. После промьшвания метанолом и зфиром основа вьісушивается в вакууме и хранится в аргоне при -2070. 5Б Затем синтез олигонуклеотида производится вручную в стандартньїх условиях с использованием дериватизированной стеклянной пластинки в качестве твердой основьі. Первьій нуклеотид будет 3'-водород (Ф, фосфат, используемьм в виде соли тризтиламмония. Зтот метод приводит к получению связанньїх с основой ка олигонуклеотидов вьІсокКой чистоть.

Можно применять стратегию "на чипе" для приготовления рядов проб ДНК. Например, адресуемую бо приводимую в действие лазером фотолепротекцию можно использовать в химическом синтезе олигонуклеотидов прямо на стекляной поверхности, как описано Фодором и др., (1991), І22).Пробь! также можно связать (нейтрализовать) на нейлоновьїх основах, как описано Ван Нессом и др. (1991), (51); или связать с тефлоном с использованием метода Данкена и Кавальера (1988), (191.

Фодор и др. (1991), (22)| описьвают направляемьй светом синтез динуклеотидов, которьій применим к 65 пространственно направленному синтезу сложньх соединений для применения в микро-производстве устройств. Он основан на методе. Использующем свет для направления одновременного синтеза химических соединений на твердой основе. Структура воздействия света или других видов знергии через маску или другими пространственно адресуемьми средствами определяет то, какие области основьі активизируются для создания химической связи.

Активизация светом поисходит из удаления фотолабильньх защитньїх групп из вьібранньїх участков. После депротекции (снятия защить) первое соединениєе, содержащее фотолабильную защищающую группу, подвергается воздействию по всей поверхности, однако реакция происходит только с участками, на которье попал свет на предьідущем зтапе. Затем подложка освещается через вторую маску, которая активизирует другую область для реакции со вторьім защищенньім стандартньм блоком. Структура масок, используемьсх в /о таком освещений, и последоватольность реагентов определяют конечнье продуктьі и их размещение. При методе Фодора возможна вьісокая степень миниатюризации, потому что плотность мест синтеза связана только физическими ограничениями на пространственную адресуемость, т.е. дифракцией света. Каждое соединение доступно и его положение точно известно. Позтому олиго--ип, получаемьй таким образом, можно легко использовать в СПГ.

Фодор и др.(1991), (22| описьвают акутивизированное светом образование динуклеотидоа следующим образом.5-Нитровератрил тими дин синтезировался из 3'-0-тимидин ацетата. После депротекции с базой 5--нитровератрил тимидин прикреплялся к аминированной подложке через связь с 3Зі-гидроксильной группой.

Защищающие группьї нитровертрила удалялись освещением через 500мкм маску типа шахматной доски. Затем подложка обрабатьівалась активизированньм фосфорамидитом 2'-диоксицидином. Чтобьї отслеживать реакцию 2о флуорометрически, деоксицитидин модифицировался образователем связи, защищенньм ЕМОС аминогексилом, прикрепленньм к зксоциклическому амину. После удаления ЕМОС-защищающей группь! с базой области, которне содержали динуклеотид бьіли флюоресцентно мечень! обработкой подложки РІТС.

Позтому, следуя зтому методу, можно синтезировать связаннье с основой олигонуклеотидь!.

Образование связи олигонуклеотида с нейлоновой основой, как описано Ван Нессом и др. (1991), (511 сч об требует активации нейлоновой поверхности через алкилацию и селективную активацию 5'-амина олигонуклеотидов цианур-хлоридом следующим образом. Нейлоновая поверхность озтилируется с і) использованием тризтилоксоний тетрафторобората с образованием амин-реактивньїх имидат-сложньїх зфиров на поверхности нейлона и 1-метил-2-пирролилон используется как растворитель. Поверхность нейлона не полируется, чтобь! била максимально возможная площадь поверхности. б зо Затем активизированная поверхность реагирует с поли(зтиленимин) (Мг приблизительно 10К-70ОК) с образованием полимерного покрьїтия, которое создает расширенную поверхность амина для прикрепления - олиго. Олнгонуклеотид(ьі) с оаминньм хвостом селективно реагирует с избьтком цианур-хлорида, "де исключительно в аминном хвосте, давая 4,6б-дихлоро-1,3,5--триазинил-олигонуклеотид(ьі) в количественном вьїходе. Смещение одной хлорной средьі цианур-хлорида амино-группой значительно уменьшает реактивность со

Зз5 остающихся групп хлора. Зто приводит ко 0 повьішенной гидролитической стабильности «г 4,6-дихлоро-1,3,5-триазинил-олигонуклеотида (олигонуклеотидов), которьій стабилен значительнье периодь! времени в содержащих буфер водньх растворах (рН 8,3,4 градуса С, 1 неделя) и легко изолируется и считаєтся хроматографией размерного злюирования или ультрафильтрацией.

Зта реакция специфична для аминного хвоста без очевидной реакции на нуклеотидньїх средах. Затем « покрьтая РЕ! поверхность нейлона реагирует с активизированньм цианур-хлоридом олигонуклеотидом. в с Вьісокие концентрации "захватьвающей" последовательности легко связьшваются вна поверхности и непрореагировавшие аминь! покриіваются сукциновьім ангидридом на конечном зтапе процесса дериватизации. ;» Один конкретньій способ приготовления олигонуклеотидов, связанньїх с основой, заключается в использований генерируемого светом синтеза, описанного Пизом и др. (1994), (Зб). Зти авторьї использовали

Ссуществующие методь! фотолитографии для формирования рядов связанньїх проб олигонуклеотидов (чипов ї5» ДНК). Зти методь), в которьїх свет используется, чтобьі направлять синтез проб олигонуклеотидов в миниатюризованньїх рядах вьісокой плотности, используют фотолабильньюе 5'-защищеннье М-ацил-деокси со нуклеозид фосфорамидить, химию поверхностного создателя связей и универсальнье стратегии - комбинаторного синтеза. Матрица их 256 пространственно определенньх проб олигонуклеотидов может Фформироваться таким образом и затем использоваться в удобной организации последовательности в формате - З, как здесь описано.

Ге) Пиз и др. (1994), ІЗ6)Ї представили стратегию, пригодную для использования в направляемом светом синтезе олигонуклеотидов. В зтом способе поверхности твердой опорь, модифицированная фотолабильньми защищающими группами, освещаєется через фотолитографическую маску, давая реактивнье гидроксильнье дв Группьі в освещенньх участках. Затем З'о-фосфорамидит-активизированньїй деоксинуклеозил (защищенньй как 5"-гидроксил фотолабильной группой) подается на поверхность и связи образуются на местах, на которье (Ф, воздействовал свет. Вслед за покритием окислением подложка промьіваєтся и поверхность освещается через ка 2-ю маску для воздействия на дополнительнье гидроксильнье группьії для образования связей. Второй 5-защищенньй, 3'О-фосфорамидит-активизированньїй деоксинуклеозид наносится на поверхность. Селективная бо фотодепротекция и цикль! образования связей повторяются пока не получаєтся желаемьй набор продуктов.

Поскольку применяется фотолитография, процесс можно миниатюризовать для формирования рядов с вьІісокКой плотностью проб олигонуклеотидов- последовательность которьїх известна в каждом месте.

Путь синтеза для приготовления необходимьсх 50-(альфа-метил-б6-нитропиперонилоксикарбонил)-М-Мм/ЬКк-2-деоксинуклеозид. фосфорамидитов 65 (МемРос-М-ацил- 2'-деоксинуклеозид фосфорамидитов) предполагает на первом зтапе наличие

М-ацил-2'-деоксинуклеозида, которьій реагирует с 1-(2-нитро-4,5-метилендиоксифенил)-зтил-1- хлороформатом с получением 5-МемМРос-М-ацил-2'-деоксинуклеозида. На втором зтапе 3З-гидроксил реагирует с 2-цианозтил

М,М'-диизопропилхлорофосфорамидитом с о использованием стандартньїх процедур со получением 5-МемРос-М-ацил-2'-деоксинуклеозид -3'-0--2-дцианозтил-М-М-диизопропил)фосфорамидитов. Светозащищающая группа стабильна в обьічньїх условиях синтеза фосфорамидита и может удаляться водной базой. Зти реагенть! можно длительно хранить в аргоне при 45000.

Сообщалось о периодах полупроведения фотолиза 28 с, 31 с, 27 с и 18 с для МеМРос-ат, МемМмРос-дс Би,

МемРос-ас РАС, МемМРос-дАРАЄ соответственно (Пиз и др., 1994), З6Ї. Позтому в литографическом синтезе рекомендуется время освещения 4,5мин (9 х НП/2МемМРос-4сС) для обеспечения »9996 удаления МемРос 70 защищающих групп.

Пригодная синтетическая основа зто состоит из 5,1 Х 7,бсм стеклянной подложки, приготовленной путем чистки в концентрированной МаонН, за чем следует исчерпьівающее полоскание в воде. Затем поверхности дериватизируются 2 часа раствором 1095 (обьем/обьем) бис(2-гидроксизтил) аминопропилтризтоксилана (фирма Реїгагспй Спетісаів, Бристол, Пенсильвания) в 9595 зтанола, промьмшваются тщательно зтанолом и 75 зфиром, вьісушиваются в вакууме при 407С и нагреваются при 100"С в течение 15мин. В таких исследованиях образователь связи синтеза прикрепляется реакцией дериватизированньїх подложек с 4,4" -диметокситритил (ОМТ)-гексазтилокси-О-цианозтил фосфорамидитом.

Резюмируя, чтобьії инициировать синтез пробь! олигонуклеотида, подходящая производная деоксинуклеозид фосфорамидита прикрепляется к синтетической основе через образователь связи. Затем области основь активизируются для синтеза освещением Через, например, отверстия 800 х 12800мкм фотолитографической маски. Могут проводиться дополнительнье цикльї синтеза фосфорамидита (с ОМт-защищенньми деоксинуклеозидами) для формирования любой требуемой последовательности, такой как любая 4-,5-,6-,7-,8-,9- или даже 10-мерная последовательность. После удаления фосфата и зкзоциклических амин-защдищающих групп концентрированной МНАОН в течение 4 часов подложку можно установить в термостатически С контролируемую камеру гибридизации с водяной рубашкой, готовую к работе. о

Конечно, можно легко приобрести чип ДНК, такой как один из описанньїх вьіше активизируемьх светом чипов, из промьішленного источника. В зтом отношений можно связаться с фирмами АПутеїгіх из Сантьі-Кларь,

Калифорния 95051, и ВесКтап.

ПРИМЕР Ії (22)

МОДИФИЦИРОВАННЬЄЕЄ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЬ! ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПРОБАХ

Модифицированнье олигонуклеотидь! могут использоваться во всех процедурах зтого изобретения для -- повьішения специфичности или зффективности гибридизации. Способ достижения зтого - замена природньх «- нуклеотидов модификацией базьі. Например, можно использовать пиримидинь! с галогеном у положения С5.

Считается, что зто улучшает стабильность дуплекса путем влияния на установку базьі слоями. Можно также со применять 2,6-диаминопурин для приданий -3-ей связи галогена в его базовом спариваниий с тимином, что «І термически стабилизирует ДНК-дуплексьі Сообщалось, что использование 2,6-диаминопурина приводит к значительному улучшению стабильности дуплекса коротких олигомеров.

Его включение, как предлагается, предоставляет более строгие условия отжига инициирующего вещества, « тем самьм улучшая специфичность образования дуплекса и подавляя фоновье проблемь или исключая использование более коротких олигомеров. - с Синтез вариантов трифосфата зтих модифицированньїх нуклеотидов описан Хохайзелем и Лерахом (1990), а (23). 5-хлоро-2-деоксиуридин и 2,6-диаминопурин 2'-деоксинуклеозид приобретаются, например, в фирме "» Зідта. Фосфорилирование вьіполняется следующие образом: 50мг сухого 2-МН о-дАдо принимается в 500мкл сухого тризтил фосфата при перемешиваний в аргоне. Добавляется 25мкл РОСІ 3 и смесь вьідерживаєтся у термостате при -20"Сб. Тем временем іммоль пирофосфорной кислотьі растворяется в 0,95мл т. три-п-бутиламина и 2мл метанола и вьісушивается во вращающимся испарителе. Затем она вьісушивается со испарением дваждь из 5мл пиридина, причем перед вторьім разом также добавляется 7Омкл три-п-бутиламина.

Наконец, зто растворяется в 2мл сухого диметил формамида. - Спустя 9Омин при -207"С смесь фосфорилирования испаряется для удаление избьітка РОСІ з : добавляется ши 20 три-п-бутиламмоний пирофосфат в диметил формамиде. Вьідерживание проводится в течение 1,5мин при комнатном температуре. Реакция останавливается путем добавления 5мл 0,2М тризтиламмоний бикарбоната іЧе) (рН 7,6) и смесь держится на льду 4 часа. Для 5-СІ-д4Ога условия будут тождественньі, но добавляется 5Омкл

РОСІзЗ и фосфолирование проводится при комнатной температуре в течение 4 часов.

После гидролиза смесь испаряетеся, рН устанавливается на 7,5, и зкстрагируется 1 обьемом дизтил зфира. Разделение продуктов производится например, на (2,5х20см) О-Зерпагозе колонне с использованием линейного градиента 0,15М к 0,8М тризтиламмоний бикарбонату. При хранениий замороженньіми нуклеотидь! о стабильньї длительноег время. Можно также использовать неизбирательньй аналог базьії или универсальную іме) базу, как она сконструирована Николсом и др. (1994), ІЗБІ. Зтот НОВІЙ аналог, 1-(2'-деокси-бета-О-рибофураносил)-3З-нитропиррол (обозначаемьй М) бьіл сформирован для использования в 60 пробах олигонуклеотидов и инициирующих веществах для решения проблем проектирования, которье возникают в результате вьірождения генетического кодьі, или когда имеются только даннье по фрагментарной последовательности пептидов. Зтот аналог повьшает укладку слоями и одновременно минимизирует взаймодействия с образованием водородньїх связей, не разрушая пространственно дуплекс ДНК. Аналог М нуклеозида бьл сконструирован чтобьі максимально увеличить взаймодействия при укладке слоями с 65 использованием апротических полярньїх заместителей, связанньїх с гетероароматическими кольцами, повьішая внутри- и вне-прядевье взаймодействия при укладке, чтобьі уменьшить роль водородньїх связей в специфичности базового спаривания. о Николс и др. (1994), |З5)| опредпочитают З-нитропиррол 2'-деоксирибонуклеозид из-за его структурной и злектронной схожести с р-нитроанилином, чьи производнье относятся Кк самьм мальм известньм пропласткам двойной свитой ДНК. Диметокситритил-зашищенньй фосфорамидит нуклеозида М таюже может включаться в нуклеозидь, используемье как инициирующие вещества дли образования последовательности и цепной реакции полимеразь (РСК). Николс и др. (1994), ІЗ5І показали, что значительное количество нуклеотидов могут заменяться М без потери специфичности инициирующего вещества. Уникальной свойство М -зто его способность заметать длиннье звенья смежньх нуклеозидов и все же давать функциональнье инициирующие вещества для образования 7/0 последовательностей. Как сообщалось, все последовательности с 3, б и 9 замещениями М дают читаемье "лестницьі" образования последовательностей, и все РКС с 3З-мя разньіми содержащими М инициирующими веществами привели к расширению правильного продукта (Николе и др., 1994), ІЗ5І.

Способность содержащих З-нитропиррол олигонуклеотидов функционировать в качестве инициирующих веществ уверенно показьівает, что дуплексная структура должна образовьіваться с дополляющими прядями. 7/5 Оптические теплове профили, полученнье для пар олигонуклеотидов 4(5-С 2-Т5ХТІвО2-3) и а(5-СоАвБУАв(оо-3) (где Х и М могут бьіть А, С, б, Т или М), как сообщалось, подходят под обьІчньй сигмоидальньій рисунок, наблюдаемьй для перехода от двойной к одной пряди (нити) ДНК. Значения Тт олигонуклеотидов, содержащих базовне парьі Х"М ( где Х бьло А, С, о или Т и У бьіло М), как сообщалось, все попадают в диапазон 3"С (Николс и др.т 1094), ІЗ5І.

ПРИМЕР ЇЇ

ПРИГОТОВЛЕНИЄ ОБРАЗУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЧИПОВ И РЯДОВ

Зтот пример описьшвает физические вариантьї осуществления образующих последовательности чипов, рассматриваемьїх изобретателем.

Основной пример зто использование б-меров, прикрепленньїх к поверхностями к 50 микрон для получения с об чипа с размерами З х Змм, которьій можно комбинировать с получением рядь 20 х 20см. Другом пример зто использование 9-мерньїх олигонуклеотидов, прикрепленньїх к поверхности в 10 х 10 микрон для создания і) 9-мерного чипа с размерами 5 х 5мм. 4000 единиц таких чипов можно использовать для создания ряда 30 х

ЗОсм. На фиг2А, фиг2В и фиг.2С показан еще один пример ряда, в котором 4000-16000 олигочипов расположень по квадрату. Пластина или набор трубочек, как таюке указано, можно упаковать с зтим рядом как ду зо часть набора материалов для создания последовательностей.

Рядь! можно отделить физически друг от друга или с помощью гидрофобньїх поверхностна. Один возможньй (87 способ использовать разделение гидрофобной полоской - зто применить такую технологию, как Іво-сгій п

МісгоріоіІоду Зузіет, вьіпускаемую фирмой ОА І абогайгіез, Торонто, Канада.

Гидрофобнье сеточнье мембраннье фильтрьї (НОМЕ) использовались в аналитической микробиологийи со з5 пищевьх продуктов уже около десятилетия, где они уникально привлекательнь! тем, что имеют расширенньй «г числовой диапазон и автоматизированньій подсчет колоний. Одна промьшленно поставляемая сетка зто

ІБО-СКІЮ(ТМ) от фирмьї ОА І арогаюгіез Це. (Торонто, Канада), которая состоит из квадрата (60 х босм) полисульфонного полимера (Сеітап Тийгуп НТ-450, размер пор 0,45мю), на которое отпечатана краской черная гидрофобная сетка, состоящая из 1600 (40 х 40) квадратньїх ячеек. НОМЕ бьіл предварительно модифицирован « добавкой бактериальньхх суспензий вакуумной фильтрацией и вьідерживался на дифференциальной или в с селективной среде по вьібору.

Поскольку рост микробов ограничен ячейками сетки с известньім положением и размером мембраньі), НОМЕ ;» функционирует более как аппарат МРМ, чем обьічная пластина или мембранньій фильтр. Петеркин и др. (1987),

ІЗ7Ї сообщили, что зти НОМЕ можно использовать для распространения и хранение геномньїх библиотек при

Мспользований с репликатором НОМЕР. Один такой инструмент реплицирует рост от каждой из 1600 ячеек їх ІЗО-ОКІР и позволяем сделать много копий образцового НОМЕ (Петеркин и др., 1987), ІЗ7).

Шарп и др. (1989), І(46Ї также применяли ІЗО-СКІО НОМЕ от ОА І арогаюгіез и автоматизированньїй счетчик со НОМЕ (МІ-100 Іпіегргебег) и репликатор КР-100. Они сообщили о методе поддержания и сортировки многих - культур микробов.

Петеркин и его коллеги после описали способ сортировки проб ДНК с использованием гидрофобного - сеточно-мембранного фильтра (Петеркин и др., 1989), ІЗ8І.

Ге) Зти авторьї сообщили о способах зффективной гибридизации колоний прямо на НОМЕР. Раньше плохие результатьі получались из-за низкой связующей ДНК способности полисульфонного полимера, на котором печатаются НОМЕР. Однако Петеркин и др. (1989), ЗВ сообщили, что связьивание ДНК с поверхностью ов Ммембрань улучшилось при обработке реплицированньх и вьідержанньх в термостате НОМЕ полизтиленимином, поликатионом, до контакта с ДНК. Хотя в зтой ранней работе использовалось ячеистое (Ф, прикрепление ДНК и цель бьіла отличной от цели зтого изобретения, описанную методологию можно легко ка адаптировать для формата З СПГ.

Для того, чтобьї бьістро идентифицировать полезнье последовательности, Петеркин и др. (1989), |З8І бо Мспользовали радио-меченную плазмидную ДНК из разньх клонов и испьтьвали ее специфичность относительно ДНК на приготовленньїх НОМЕ. Таким образом, ДНК из рекомбинантньїх плазмидов бьстро сортировалась гибридизацией колоний относительно 100 организмов на репликатах НОМЕР, которье можно легко и воспроизводимо приготовить.

Нужно решить две основнье проблеми. Манипулирование с мальми (2-3мм чипами и параллельное 65 Вьіполнение тьісяч реакций. Решение, которое предлагает зто изобретение, состоит в том, чтобь! содержать чипьї и пробьї в соответствующих рядах в одном примере чипьї, содержащие 250000 9-меров синтезируются на кремниевой подложке в форме пластин 8 х 8тМ (15мкМ/олигонуклеотид, Пиз и др., 1994), І|З6) вністроенньх в формате 8 х 12 (96 чипов) с желобком между ними в 1 тМ. Пробьї добавляются либо многоканальной пипеткой, либо рядом штьірьков, по одной пробе на 1 чип. Для расчета всех 4000 б-меров нужно применять 42 ряда чипов,

Мли используя разнье рядь, или повторно используя один набор рядов чипов несколько раз.

В указанном случає, при использований ранней номенклатурь! зтой заявки, Е-9; Р-8; ЕнР-15,

Чипьі могут иметь пробьї с формулой ВхМп. где х зто число специфицированньїх баз В; а п зто число неспецифицированньіх баз, так что х-4-10 и п-1-4. Чтобьії достичь более зффективной гибридизации и избежать потенциального влияния любьх олигонуклеотидов основьі, специфицированнье базьї можно окружить 7/0 неспецифицированньми базами, что представляется такой формулой как (М)пВхХ(М)т (фиг.4).

ПРИМЕР мМ

ПРИГОТОВЛЕНИЄ ФРАГМЕНТОВ НУКЛЕЙНОВОЙ КИСЛОТЬ

Нуклеиновне кислотьї, последовательности которьїх нужно создать, можно получить из любого подходящего источника, такого, как СДНК, геномная ДНК, хромосомная ДНК, микрорассеченнье хромосомньй полось, 7/5 Космидньсе или УАС вставки и РНК, включая тРНК без каких-либо зтапов расширения. Например, Сзморук и др. (1989), (41) описьвшают З протокола для изолирования ДНК с вьісоким молекулярньм весом от клеток млекопитающих (стр.9.14-9.23).

Затем нуклеийновье кислоть! фрагментируются любьм из способов, известньїх специалистам, включая- например, использование ограничительньїх ферментов, как описано на стр.9.24-9.28 у Сзмбрука и др. (1989), 20. ІА, сдвиг ультразвуком и обработку Маон.

Сдвиг при низком давлениий также уместен, как описано Шрифером и др. (1990), (43). В зтом способе образцьі ДНК пропускаются через небольшой французский датчик давления с набором давлений от малого до промежуточного. Рьїмажное устройство позволяет производить контролируемое приложение от малого до промежуточного давления к злементу. Результатьь зтих исследований указьвшают, что сдвиг при малом с г5 давлений зто полезная альтернатива звуковьїх и ферментньїх методов фрагментации ДНК.

Один особенно подходящий способ для разделения ДНК на фрагментьї, как считается, зто тот, где і) используются две зндонуклеазь! с распознаванием базь, СміІ)І, описанньій Фицджералдом и др. (1992), (211. Зти авторьі описали подход для бьістрой фрагментации и фракционирования ДНК на конкретнье размерь, которье они считали пригодньми для "дробового" клонирования и создания последовательностей. Настоящий б зо Мзобретатель предусматриваєт, что зто будет таюке особенно пригодно для генерирования произвольньх, но относительно небольших фрагментов ДНК для использования в настоящей технологии образования связей. -

Ограничительная зндонуклеаза См)! обьічно расщепляет распознавательную последовательность РОССРУ «- между С и С с оставлением тупьїх концов. Нетипичнье условия реакции, которне меняют специфичность зтого фермента (Смі)1"), дают квази-произвольное распределение фрагментов ДНК из мальїх молекул РОС19 (2688 со базовьїх пар). Фицджералд и др. (1992) количественно оценили произвольность зтой стратегий «Е фрагментирования с использованием См" продукта вьіваривания рисСт19, которьій бьіл фракционирован по размерам способом бьістрой гелевой фильтрации и непосредственно связан, без ремонта концов, вектором клонирования Іас2 тіпиз М13. Анализ последовательности 76 клонов показал, что СМ" ограничивает РУССРУ и РишСРиу в дополнение к местам РисшСРу и что новье даннье У последовательность накапливаются со « скоростью, согласующейся с проивольной фрагментацией. в с Как сообщается в литературе, преимущества зтого подхода по сравнению фракционированием соникацией (звуком) и агарозньім гелем включают в себя: требуются меньшее количество ДНК (0,2-0,5мкг вместо 2-5МКГ); и ;» имеется меньше зтапов (не нужно предварительного связьівания, ремонта концов, химической зкстракции или злектрофореза агарозного геля и злюирования). Предлагается, что зти преимущества также будут полезньі при приготовлений ДНК для создания последовательностей по формату 3. ї5» Независимо от того, как получаются или готовятся фрагменть! нуклейновой кислотьї, важно денатурировать

ДНК, чтобьї получить для гибридизации одно-завитье кусочки. Зто достигается вьідерживанием раствора ДНК в со течение 2-5 минут при 80-90". Затем раствор бьістро охлаждают до 2"С для предотвращения повторной - натурации Фрагментов ДНК до того, как они контактируют с чипом. Фосфатнье группь! тоже нужно удалить из геномной ДНК, как описано в примере МІ. - ПРИМЕР м

Ге ПРИГОТОВЛЕНИЄ МЕЧЕННЬХ ПРОБ

Пробьї олигонуклеотидов можно готовить автоматизированньм синтезом, что является рутинньім для специалистов, например, с использованием системь! Арріїей Віозузіетв. В качестве альтернативь!), пробь дв Можно приготовить используя методь! Віогесппоіодіеєз Іпс. с помощью слоев пористьх подложек тефлона.

Пробьі олигонуклеотидов можно метить, например, радиоактивньми метками (ЗБр, 32р, ЗЗр и

Ф) предпочтительно ЗЗр) для рядов с участками 100-200мкм или 100-400мкм; нерадисактивньми изотопами ка (Якобсен и др., 1990), 25); или флуорофорами (Брамбо и др.,1988), ІЗ). Все такие способьї нанесения меток являются обьічньми в технике, как показано в соответствующих разделах у Сзмбрука и др. (1989), (411 и в во другой литературе, например, у Шуберта и др., (1990), І44); Мураками и др. (1991), ІЗ3Ї и Кейта и др. (1991), ІбІ.

В отношений радио-мечения обьічнье способь! зто мечение концов с использованием Т4 полинуклеотидной киназьі или нанесение меток с вьісокой специфической активностью с использованием Кленов или даже 17 полимеразь. Зто описьівается следующим образом.

Синтетические олигонуклеотидь! синтезируются без фосфатной группьі у своих окончаниях 5 и позтому б5 легко метятся переносом гамма-32р или гамма-З3Зр из (гамма-32р) дтр или (гамма-ЗЗ)дтр с использованием фермент бактериофаг Т4 нолинуклеотид киназь Если реакция проводится зффективно, специфическая активность таких проб может бьіть такой вьісокой, кап специфическая активность самих (гамма -32р) дтр ИЛИ (гамма-3Зр)дтр. Описанная ниже реакция предназначена метить 10 пмолей олигонуклеотида до вьІсокой специфической активности. Нанесение меток на разнье количества олигонуклеотида можно легко достичь путем увеличения или уменьшения размера реакции при поддержаний постоянньми концентрации всех компонентов.

Реакционная смесь будет создаваться с использованием 1,0мкл олнгонуклеотида (10 нмолей/мкл); 2,0мкл 10Хх бактериофаг Т4 полинуклеотид киназного буфера; 5,0мкл (гамма-32р)дтр или (гамма-ЗЗр)дтр (пр. акт.

БО0ОСі/ммоль; 1ОтсСі/мл в водном растворе) (10 пмолей): и 11,4мкл водь 8 единиц (около мкл) бактериофаг Т4 7/0 полинуклеотидной киназь! добавляется к реакционной смеси, хорошо перемешивается и вьідерживаєтся 45 минут при 37"С. Реакционная смесь нагреваєтся в течение 10 минут при 68"С для инактивации бактериофаг Т4 полмнуклеотидной киназь.

Затем определяется зффективность переноса З2р или ЗЗр к олигонуклеотиду и его специфическая активность. Если специфическая активность пробьї приемлема, она очищается. Если специфическая активность /5 бЛИШКОМ низка, добавляются еще 8 единиц фермента и вьідерживаются еще 30 минут при 37"С до нагревания реакционной смеси в течение 10 минут при 68"С для инактивации фермента.

Очистка радио-меченньїх олигонуклеотидов может достигаться путем осаждения с зтанолом; осаждением с цетилпиридиний бромидом; хроматографией через био-гель Р-60; или хроматографией на колонне Зер-Рак

С18.

Пробьі с более вьісокими специфическими активностями можно получить, используя фрагмент Кленова

Е.соїЇ. ДНК полимеразь! І для синтезирования пряди ДНК дополняюще к синтетическому олигонуклеотиду.

Короткое инициирующее вещество гибридизирует к шаблону олигонуклеотида, чья последовательность является дополнением желаемой радио-меченной пробьі. Затем инициирующее вещество расширяется с использованием фрагмента Кленова Е.соїЇ ДНК полимеразьй | для включения (альфа-32р)ааМтТР или сч ов (гамма-ЗЗр)аМмтР. в направляемой шаблоном манере. После реакции шаблон и продукт разделяются денатурированием, за чем следует злектрофорез через полиакриламидньій гель в условиях денатурации. С і) зтим способом при желаний можно формировать пробьй олигонуклеотидов, содержащие несколько радисактивньїх атомов на молекулу олигонуклеотида.

Чтобьі использовать зтот метод, нужно смешать в трубе микрофуги рассчитаннье количества ду зо (альфа-32Р)аМтР или (альфа-33Р)аМТР, необходимье для достижения желаемой специфической активности и достаточнье для получения полного синтеза всех прядей шаблона. Концентрация 2МТР не должна бьть - меньше 1імкМ на любом зтапе в ходе реакции. Затек в трубу добавляются соответствующие количества «- инициирующего вещества и шаблона ДНК, причем инициирующее вещество в молярном отношений в 3-10 раз превьішает шаблон. со

Затем добавляется 0,1 обьема 10 х буфера Кленова и хорошо перемешивается. Затем добавляются 2-4 «Е единицьі фрагмента Кленова Е.соЇ ДНК полимеразьй | на Змкл реакционного обьема, перемешаваеєтся и вьідерживаеєется 2-3 часа при 4"С.

При желаний, течение реакции можно отслеживать путем удаления небольших (0,1мкл) кратньїх и измерения доли радисактивности, которая стала способна осаждаться, 1095 трихлороуксусной кислотой (ТСА). «

Реакционная смесь разжижаєется равньм обьемом наполняющего гелем буфера, нагреваєтся до 80"С в з с течение З минут и затем вся проба загружается на денатурирующий полиакриламидньій гель. После

Й злектрофореза гель авторадиографируется, что позволяет найти пробу и удалить ее из геля. Имеются также и?» следующие разнье способьі флуорофобного нанесения меток. Брамбо и др. (1988), |З), описьівают синтез флуоресцентно меченньх инициирующих веществ. Аналог деоксиуридина с первичньм аминовьм "плечом образователя связи" из 12 атомов, прикрепленньій у С-5, синтезируется. Синтез аналога состоит из ї5» дериватизации 2'-деоксиуридина через органометаллические промежуточнье вещества с получением 5'метил пропеноил)-2-деоксиуридина. Реакция с диметокситритил-хлоридом дает соответствующий привод со 5-диметокситритил, Сложньій зфир метила гидролизуется, активизируется и реагирует с соответствующим - образом моноацилирозанньм алкил диамином. После очистки результирующие нуклеозидьі плеча Образователя связи преобразуются в аналоги нуклеозида, способнье для химического синтеза - олигонуклеотида.

Ге Затем получаются олигонуклеотидь!, которье содержат одну или 2 базьі с плечом образователя связи с использованием модифицированной химии фосфоридитов. В раствор 5Онмолей олигонуклеотиде с плечом образоватоля связи в 25мкмл бикарбоната натрия 500тМ (рн 9,4) добавляются 20мкл РІТС 300 тМ в диметил вв Ссульфоксиде. Смесь перемешиваєтся при комнатной температуре 6 часов. Олигонуклеотид отделяется от свободного РІТС путем злюированин из колонньі Зерпадех 0-25 1 х ЗОсм с 20уУМ ацетата аммония (рН 6) с (Ф, комбинированием фракций в первом пике УФ-поглощения. ка В общем случае, флуоресцентное нанесение меток на олигонуклеотид у его 5'і-конца в начале предполагало 2 зтапа. Сначала М-защищенная производная аминоалкил фосфорамидита добавляєется к 5-концу бо олигонуклеотида во время автоматизированного синтеза ДНК. После удаления всех задищающих групп сложньій зфир МН соответствующего флуоресцентного красителя соединяется с 5'-амино-группой за полсуток, за чем следует очистка меченного олигонуклеотида от избьтка красителя с использованием обратной фазьї

НРІС или РАСЕ.

Шуберт и др. (1990) |44), описали синтез, фосфорамидита, которьій позволяет получать олигонуклеотидьі, 65 Меченнье флуоресцеийном во время автоматизированного синтеза ДНК. Метил-сложньій зфир флуоресцеина алкилируется 4-хлоро(4,4"-диметокситритил) бутанолом-1 в присутствиий К»СО» и КІ в ОМЕ в течение 17 часов.

После удаления группь! тритила 195 ТЕАв в хлороформе продукт фосфитилируется стандартньмми процедурами посредством бис (диизопропиламино)метоксифосфина. Фосфорилирование указанной полученной производной флуоресцеина приводит к достаточному вьіїходу Н-фосфоната. Получающийся амидит (раствор 0,1М в сухом ацетонитриле) используется для автоматизированного синтеза разньїх инициирующих веществ с использованием бета-цианозтил фосфорамидитной химии и синтезатора ДНК- Отщепление от основь и депротекция осуществляются с помощью 2595 водного раствора аммиака в течение 36 часов при комнатной температуре. Необработанньй продукт очищается посредством РАСЕ, и меченное инициирующее вещество видимо как бледно-зеленая флуоресцентная полоса на З1Онм. Злюирование и обессолевание с 7/0 Мспользованием патронов КР 18 дает желаемьй продукт.

Флуоресцентное мечение 5-конца пробь! в методе Шуберта непосредственно достигается во время синтеза

ДНК в последнем цикле образования связей,

Вьход связей так же вьісок, как и с оббіІчньми фосфорамитидами. После депротекции и удаления аммиака путем лиофилизирования с использованием скоростного вакуума или осаждения зтанолом меченнье 7/5 флуоресцентно олигонуклеотидьі могут прямо применяться для образования последовательностей ДНК в формате З СПГ.

Мураками и др.ІЗЗ| также описьівали приготовление меченньїх флуоресцеийном олнгонуклеотидов. Зтот синтез основан на ометоде поддерживаеємого полимером фосфорамитида и Фосфоната водорода.

Зтилендиамин или гексаметилендиамин используется как привязь. Они вводятся через Фосфорамидатную 2о связь, которая бьіла образована окислением водород-фосфонатного промежуточного вещества в растворе

СС. Модифицированнье олигонуклеотидьі подвергаются мечению ос использованием первичного амин-ориентируюшегс реагента, РІТС, на шариках. Получающийся модифицированньй олигонуклеотид отщепляется от шариков и затем очищается КЕРІ С.

Кейт и др. (1991), І5)| описьивают использование проб олигонуклеотидов, непосредственно сопряженньх с сч г апкалин фосфатазой в комбинации с прямой хемилюминесцентной подложкой (АМРРО), чтобь! позволить обнаружение проб. Фосфатазу алкалина можно ковалентне соединить с модифицированной базой і) олигонуклеотида. После гибридизации олиго вьідерживаєтся в термостате с АМРОЮ. Фермент алкалин фосфатазьі разбивает АМРОО с получением соединения, которое дает флуоресценцию без возбуждения, т.е. лазер не нужен. Считается, что сильньій сигнал может формироваться с использованием такой технологии. б зо Меченнье пробьї можно свободно приобрести в разньїх промьішленньїх источниках, включая СЕМЗз2ЕТ, а не синтезировать. -

ПРИМЕР МІ «-

УДАЛЕНИЕ ФОСФАТНЬХ ГРУПП

Как алкалин фосфатаза бактерий (ВАР), так и кишечная алкалин фосфатаза телят (СІР) катализируют со зв удаление радикалов 5-фосфата из ДНУ и РНК. Позтому они уместньі для удаления 5 фосфатов мз ДНК или/и «Е

РНК для предотвращения образования связей и неправильной гибридизации. Удаление фосфатов, как оно описано Сзмбруком и др. (1989), (41), осуществляется после разрезки или иного сдвига геномной ДНК.

ВАР более активен из 2-х алкалин фосфатаз, но он также намного более стоек к нагреву и чистящим веществам. Позтому трудно замедлить ВАР полностью у конца реакций дефосфорилирования. Протеиназа К « 0 применяется для вьіваривания СІР, которьій должен бьіть полностью удален, если последующие связи должнь в с зффективно работать. Альтернативньй метод зтг инактивация СІР нагреванием до 65"С в течение 1 часа (или 75"С в течение 10 минут) в присутствий 5тМ ЕОТА (рН 8,0) с последующей очисткой дефосфорилированномй ;» ДНК зкстрагированием с фенол: хлороформом.

ПРИМЕР МІЇ

ПРОВЕДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПУТЕМ ДВУХЗТАПНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ ї5» Ниже следуют некоторье о примерь для описания вьіполнения методологиий образования последовательностей, рассматриваемой изобретателем. Сначала, весь чип гибридизируется смесью ДНК со сложностью 100 миллионов бп (1 хромосома человека). Руководство по проведению гибридизации можно найти - в статьях, таких как Дрманач и др. (1990), (18); Храпко и др. (1991), (28) и Бруд и др. (1994), |2). В зтих Сстатьях указаньї диапазоньі температур гибридизации, буфери и зтапь! промьівки, которьіе пригоднь! для - использования на начальном зтапе формата З СПГ.

Ге Данньій изобретатель в особенности рассматривает проведение гибридизации в течение до нескольких часов при вьісоких концентрациям соли и при низкой температуре (от -2 до 5"С из-за относительно малой концентрации получаемой целевой ДНК. Для зтой цели применяєется буфер З5С вместо буфера фосфата дв Натрия (Дрманач и др., 1990), (18) которьім осаждается при 107С.

Промьївка не обязательно должна бьіть зкстеноивной (несколько минут) из-за второго зтапа и может бьть (Ф, полностью исключена, если проведение циклов гибридизации используется для создания последовательности ка в вьісшей степени сложньїх образцов ДНК. Зтот же буфер используется для зтапов гибридизации и промьівки, чтобьї можно бьіло продолжать второй зтап гибридизации с меченньіми пробами. 60 После должной промьіївки с использованием простого робототехнического устройства на каждом ряде, например, ряде 8 х мм (пример ІІ), добавляется одна меченная проба, например, б-мер. Используется 96-кончиковое или 96-штьірьковое устройство, вьіполняя зто за 42 операции. Снова используется диапазон избирательньх условий, как ранее описьівалось в научной литературе.

Данньім изобретатель в особенности рассматривает использование следующих условий. Сначала, после 65 добавления меченньх проб и вьідержки только в течение нескольких минут (из-за вьісокой концентрации добавленньїх олигонуклеотидов) при никой температуре (0-5"С) температура повьішаєтся до 3-107С в зависимости от длиньі ЕР и добавляется промьівающий буфер. В зто время используемьій промьівающий буфер совместим с любой реакцией образования связей (например, в диапазоне концентрации соли 100 тМ).

После добавления лигазьі! температура снова повьішаєтся до 15-37"7С, чтобьі! позволить бьістрому образованию связей (менее ЗОмин) и дальнейшему избиранию гибридов с полньім совпадением и несовпадениями.

Мспользование катионньїх чистящих (моющих) веществ также рассматривается для использования в формате З СПГ, как описано Понтиусом и Бергом (1991), ІЗ2). Зти авторьї описьвают использование двух простьїх катионньїх чистящих веществ, дедецил- и цетилтриметиламмоний бромида (ОТАВ и СТАВ) в повторной натурации ДНК. 70 ОТАВ и СТАВ зто вариантьі! четвертичного аминтетраметиламмоний бромида (ТМАВ), в котором одна из групп метила замещена либо 12-углеродной (ОТАВ), либо 16-углеродной (СТАВ) алкильной группой. ТМАВ зто соль бромида иона тетраметиламмония, реагент, применяемьй в зкспериментах по повторному натурированию нуклеийновьїх кислот для уменьшения сдвига содержания 5-С температурьі расплавлений. ОТАВ и СТАВ аналогичньї по структуре натрий додецил сульфату (505) с замещением отрицательно заряженного сульфата 7/5 ЗОЗ положительно заряженньїм четвертичньм амином. Хотя ЗОЗ обьічно применяется в буферах гибридизации для уменьшения неспецифическоги образования связей и для замедления нуклеаз, он не сильно влияет на скорость повторного натурирования.

При проведений процесса образования связей можно добавить фермент в меченнье пробь или после зтапа должной промьівки для снижения фона.

Хотя ее ранее не предлагали для использования с каким-либо методом СПГ, технология лигазь! хорошо установлена в области молекулярной биологии. Например. Худ и коллеги описали метод обнаружения гена посредством лигазьі (Ландегрен и др., 1988), ЗО методологию которого можно легко приспособить для использования в формате З СПГ. Ландегрен описьівает анализ присутствия данньїх последовательностей ДНК на основе способности 2-х олигонуклеотидов отжигаться непосредственна рядом друг с другом на с дополняющей целевой молекуле ДНК.

Затем 2 олигонуклеотида соединяются ковалентно под действием ДНК лигазь! при условийи, что нуклеотидь! і) у места соединения правильно спареньі базами. Хотя зто ранее не рассматривалось, зта ситуация теперь возникает в образований последовательности в формате 3.

Ву и Уоллас также описьівают использование бактериофаг Т4 ДНЕ лигазь! для соединения двух соседних Ге!

Зо Коротких синтетических олигонуклеотидов. Их реакции образований связи олиго проводились в 50тМ Тгіз НСІ рН 7,6, 10 тм Мосі», 1тМ АТР, 1тптМ ОТ и 595 РЕОС.Реакции образования связи проводились при нагреваний - до 100"С в течение 5-10 мин, за чем следовало охлаждение до 0"С до добавления Т4 ДНК лигазь (1 единица; «-

ВеїШезда Кезеагсп Іарогаїогу). Большинство реакций образования связей проводились при З0"С и заканчивались нагреванием до 100"С в течение бмин. со

Затем проводится конечная промьівка, пригодная для избирательного обнаружения гибрилизированньх «г соседних, или образовавших связь, олигонуклеотидов о длиной (ЕР). Зтот зтап промьівки проводится в воде в течение нескольких минут при 40-60"С для вьімьівания всех необразовавших связи меченньіх проб и всех других соединений, чтобьії максимально уменьшить фон. Благодаря ковалентне связанньм меченньм олигонуклеотидам обнаружение упрощается (с ним не связаньії ограничения по времени и низкой температуре). «

В зависимости от используемой метки получение изображений чинов производится на разньїх аппаратах. пт) с Для радисактивньїх меток можно использовать технологию хранения фосфора с зкраном и РПозрпогітадег в качестве сканера (фирма Моїіесшаг ЮОупатісв, Саннивейл, Калифорния). Чипьі помешаются в кассету и ;» накрьваются фосфористьм зкраном. После 1-4 часов воздействия зкран сканируется и файл изображения хранится на твердом диске компьютера.

Для обнаружения флуоресцентньх меток используются камерь с ПЗС и зпифлуоресцентная или ї5» конфокальная микроскопия. Для чипов, сформированньїх прямо ни злементах изображения камерь с ПЗС обнаружение может проводиться, как описано Зггерсом и др., (1994), 201. со Детекторьі с приборами с зарядовой связью (ПЗС) служат в качестве активньїх твердьїх основ, которье - количественно обнаруживают и формируют изображение распределения меченньх целевьх молекул в 5о анализах на основьі проб. В зтих устройствах используются присущие микрозлектронике характеристики, - которье сочетают в вьісшей степени параллельнье анализьі, сверхчувствительное обнаружение, вьісокую

Ге) производительность (пропускную способность) интегральньй сбор данньїх и вьічисление. Зггерс и др. (1994) описьівают применение ПЗС для основанньїх на пробах анализов, таких, как формат З СПГ настоящего изобретения, которье позволяют количественную оценку с точностью до секунд благодаря вьІсокой Чувствительности и применяемой прямой связи.

Подход интегрального обнаружения с ПЗС позволяет проводить обнаружение собьтий образования (Ф, молекулярньїх связей на чипах. Детектор бьстро формирует двумерную картину, которая уникально ка характеризует образец. В конкретной работе молекулярного детектора на базе ПЗС отдельнье биологические пробьї связьіваются (нейтрализуются) непосредственно на злементах изображения ПЗС и могут прикрепляться бо Кк одноразовой полоске-крьішке, помещенной на поверхность ПЗС. Молекульй образца можно метить радисизотопом, хемилюмминесцентньми или флуоресцентньіми ярльками.

После воздействия на образец ряда проб на основе ПЗС Фотоньі или продукта затухании радисизотопа испускаются у местоположений злементов изображения, где образец образовал связи, в случае формата 2, с двумя дополляющими пробами. 65 В свою очередь, парь! злектрон-дьірка генерируются в кремниий, когда заряженнье частицьї или излучение от меченньїх образцов падают на управляющие злектродьії ПЗС. Затем злектроньї собираются под соседними управляющими злектродами ПЗС и последовательно считьшаются на модуле дисплея. Количество фотозлектронов, генерируемое у каждого злемента изображения, прямо пропорционально количеству молекулярньїх собьтий образования связей в такой ближайшей области. Следовательно, образование Молекулярньйх связей можно определять количественно (Зігтерс и др.. 1994), |201.

Как недавно сообщалось, ПЗС на базе кремния имеют преймущества как полупроводниковье датчики обнаружения и формирования изображений, прежде всего благодаря вьісокой чувствительности устройств в широком диапазоне длин волн (от 1 до 10000 ангстрем). Кремний очень чувствителен к злектромагнитному излучению от видимого спектра до мягких рентгеновских лучей. Для видимого света один фотон, падающий на 7/0 управляющий злектрод ПЗС, приводит к появлению одного заряженного злектроном пакета под злектродом.

Одна бета-частица мягкого рентгеновского излучения (обьічно в диапазоне КзаВ до МзВ) генерирует от тьісяч до десятков тьісяч злектронов. В добавок к вьісокой чувствительности, ПЗС, описаннье Зггерсом и др. (1994), |201 предоставляют широкий динамический диапазон (4-5 порядков величиньі), поскольку обнаружаемьй пакет заряда может включать от нескольких до 102 злектронов. Характеристика обнаружения является линейной в 75 широком динамическом диапазоне.

Путем размещений создающего изображениий ряда вблизи от образца зффективности сбора улучшается, как минимум, в 10 раз по сравнений с методами на основе линзь, такими, какие применяются в обьічньїх камерах на

ПЗС. То есть образец (змиттер) находится в близком контакте с детектором (матрицей формирования изображения) и зто исключает обьічную оптику формирования изображений, такую, как линзь и зеркала.

Когда радисизотопьї прикрепленьі! кап сособщающие группь! к целевьім молекулам, знергетические частиць обнаруживаются. Несколько сообщающих групп, которье излучают частицьі с разной знергией, успешно использовались с микро-изготовленньми детекторами, такие как З2р, ЗЗр, 355, 14с, 125І. Частицьі с более вьісокой знергией, такие как от З2р, обеспечивают самум вьсокую чувствительность молекулярного обнаружения, тогда как частиць! с более низкой знергией, такие как от 355, обеспечивают лучшеє разрешениє. су Позтому, вьібор сосообщающего радисоизотопа может бьіть сделан по желанию. Когда конкретная радиоизотопная метка вьібрана, характеристики обнаружения можно предсказать путем расчета отношения сигнал-шум, как і) описано Зітерсом и др. (1994), (201.

Альтернативная процедура люминесцентного обнаружения предполагает использование флуоресцентньх или хемилюминесцентньїх сособщающих групп, прикрепленньїх к целевьім молекулам. Флуоресцентнье метки (Ф

Можно прикреплять ковалентне или через взаймодействиє. Флуоресцентнье красители, такие, как бромид зтидия с сильньмми полосами поглощения в диапазоне ближнего УФ (300-350нм) и основньїми полосами -- излучения в видимом диапазоне (500-650нм) найболее пригодньі! дли используемьїх устройств с ПЗС, поскольку че квантовая зффективность на несколько порядков величиньі! ниже на длине волнь! возбуждения, чем на длине волньї флоуресцентного сигнала. со

С точки зрения обнаружения люминесценции, многокремниевье управляющие злектродь! (схемь)) ПЗС «І имеют "встроенную" способность отфильтровьшать вклад падающего света в УФ-дианазоне, но они очень чувствительньї к видимой люминесценции, генерируемой флуоресцентньіми сособщающими группами.

Такая присущая большая избирательность относительно УФ-возбуждения позволяем достигать вьісокКих « отношений сигнал-шум (более 100) с помощью ПЗС, как указьівалось в статье Зггерса и др. (1994), (201.

Для связьіваний проб на детекторе можно получить матриць! гибридизации на недорогих подложках из - с ЗІО», которне затем помешаюі на поверхность ПЗГ после гибридизации и сушки. Зтот формат зкономически ц зффективен, т.п. гибридизация ДНК проводится на недорогих одноразовьїх подложкам из 5105, что позволяет "» повторно использовать более дорогой детектор на ПЗС. В качестве альтернативь), пробь! можно связьівать прямо на ПЗС с созданием специализированной матриць проб.

Чтобь связать пробь на покрьїтии ЗІО», однородньйй зпоксидньй слой связьіївается с поверхностью пленки с «» использованием зпоксидно-силанового реагента и стандартной химии о модификации 510». Затем амин-модифицированньсе пробь! олигонуклеотидов связьнваются с поверхностью 5ІО 5 посредством вторичного со образования аминов с зпоксидньмм кольцом. Получающаяся связь создает 17 способньїх вращаться связей - разделения между 3 базой олигонуклеотида и поверхностью 5ІО ». Чтобьї обеспечить полную депротонацию аминов и минимизировать образование вторичной структурьї во время создания связи, реакцию проводят в - О,1М КОН и вьідерживают при 37"7С 6 часов. (Че) В формате З СПГ вообще сигнальй считаются на каждую из миллиарда точек. Будет необходимо гибридизировать все рядь, например, 4000 5 х 5мм за 1 раз и возможна последующее использование меньшего числа рядов.

Гибридизации с проведением циклов зто один возможньій способ увеличения сигнала гибридизации. За 1

Цикл большинство фиксированньх проб сгибридизируют с о фрагментами ДНК с о хвостовьми о последовательностями, некомплементарньмми для меченньїх проб. При увеличении температурь! зти гибридь! ко будут расплавляться (фиг.3). За следующий цикл некоторье из них (около 0,195) гибридизируются с соответствующим фрагментом ДНК и дополнительнье меченнье пробь образуют связи. В зтом случає, бо происходит избирательное плавление гибридов ДНК с несовпадениями одновременно для обоих наборов проб.

В гибридизации с проведением циклов все компоненть! добавляются до начала циклов при 37"С для Т4 или при более вьісокой температуре для термостабильной лигазьі. Затем температура снижается до 15-377С и чип вьідерживается до 10 минут, а потом температура повьішается до 37"С или вьіше в течение нескольких минут, и потом снова уменьшается. Цикль! можно повторять до 10 раз. В одном варианте оптимальную более вьісокую 65 температуру (10-507С) можно использовать без циклов и можно провести более длинную реакции- образования связей (1-3 часа).

Описанная здесь процедура позволяет изготовлять сложнье чипь! с использованием стандартного синтеза и точного определения мест олигонуклеотидов, потому что нужно относительно небольшое количество олигонуклеотидов. Например, если все 7-мернье олиго синтезированьі (16384 пробь), можно определить списки 256 миллиона 14-меров.

Один важньй вариант изобретенного способа заключается в применений более чем 1 по-разному меченную пробу на базовьім ряд. Зто можно вьіполнить имея в виду 2 цели; мультиплексирование для снижения числа отдельно гибридизированньїх рядов; или определение списка еще более длинньїх олиго-последовательностей, таких, как З х б или З х 7. В зтом случає, если используются 2 метки, специфичность З последовательньх 7/0 олигонуклеидов может бьіть почти абсолютной, потому что положительнье места должнь! иметь достаточное количество сигналов обоих меток.

Еще один дополнительньй вариант - использовать чипьії, содержащие пробь! ВхМу, где у составляет от 1 до 4. Зти чипьі позволяют считьївать последовательности в разньїх кадрах. Зтого можно также достигнуть путем использования соответствующих наборов меченньх проб или обе пробьі Б и Р могут иметь некоторье /5 неспецифицированнье концевье позиции (т.е. некоторьій злемент с оконечньім вьірождением). Можно также использовать универсальнье базьі как часть образователя связи для соединения проб с определенной последовательностью с твердой основой. Зто делает пробу более готовой к гибридизации и делает строение более стабильньм. Если проба имеет 5 баз, можно, например, использовать З универсальнье базь! как образователь связи (фиг.4).

ПРИМЕР МІ

АНАЛИЗ ПОЛУЧЕННЬХ ДАННЬМХ

Файль! с изображениями анализируются программой анализа изображений, такой, как программа 0ОТ5 (Дрманач и др., 1993), (15,16) и шкалируются и оцениваются включенньми статистическими функциями, например, в программу ЗСОКЕБ5 (Дрманач и др., 1994), (17Ї. Из распределения сигналов определяется сч 2г5 Ооптимальньм порог для преобразования сигнала в т/- вьіход.

Из положения обнаруженной метки определяется Б-Р последовательности нуклеотидов из фрагментов і) путем комбинирования известньїх последовательностей связанньх и меченньїх проб, соответствующих меченньм позициям. Полная последовательность нуклейновой кислотьі или подфрагменть последовательности первоначальной молекуль, такой, как хромосома человека, затем собираются из б зо перекрьивающихся последовательностей ЕтР, определенньх вьічислительнь/м вьічитанием.

Один вариант состоит в преобразованиий сигналов гибридизации, например меток, в ж/- вьіїход во время - процесса сборки последовательности. В зтом случае сборка начинаєется с последовательности ЕР с очень «- большим счетом, например, с ЕР последовательности ААААААТТТТТТ (посл. ид. М.1). Счета всех 4-х возможньїх перекрьивающихся проб ААДААДАТТТТТТА (посл. ид. М.3), АААААТТТТТТТ (посл. ид. М.4), со

АААААТТТТТТС (посл. ид. М.5) и АААААТТТТТТО (посл. ид. М.6) и З дополнительньсе пробь, которье отличнь в «Е начале (ТАААААТТТТТТ, посл. ид. М.7; СААДАААТТТТТТ, посл. ид. М. 8; САААААТТТТТТ, посл. ид. М.9) сравниваются и определяются З результата: (1) только начальная проба и только 1 из 4-х перекривающихся проб имеют счета, которне значительно положительньії по отношений к другим Є пробам, в зтом случае последовательность АААААААТТТТТТ (посл. ид. М.1) будет продлена на 1 нуклеотид вправо; (2) ни одна проба, « 70 за исключением начальной пробьі, имеет значительно положительньй счет, сборка остановится, например, в с последовательность ААААААТТТТТ (посл. ид. М.10) находится на конце молекуль! ДНК, последовательность которой создается, (3) обнаружена более чем 1 значительно положительная проба среди перекрьівшихся или/и ;» других 3-х проб; сборка останавливаєтся из-за ошибки или разветвления (Дрманач и др., 1989), (121.

Процессьї внічислительного вьічитания используют компьютернье программь! с применением существующих алгоритмов (см., например, Певзнер, 19895; Дрманач и др., 1991, (141; Лабат и Дрманач, 1993, (291). їх Если, вдобавок к ЕР, ЕК(пространство ТР, Е(пространство 2)Р, К(пространство З)Р или К(пространство Р определяются, алгоритмь! будут использоваться, чтобьії совместить все наборьі данньїх для корректировки со потенциальньїх ошибок или для разрешения ситуации, когда имеется проблема разветвления (см., например, - Дрманач и др., 1989, (121: Бейнс и др., 1988, (11).

ПРИМЕР ІХ

- ПОВТОРНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЧИПОВ СОЗДАНИЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Ге Если образование связей используется в процессе создания последовательности, то обьічньй чип олигонуклеотидов нельзя сразу же повторно использовать. Изобретатель рассматриваєет, что зто можно решить разньіми способами. 5Б Можно использовать рибонуклеотидь! для второй пробь, пробь Р, так что зту пробу можно затем удалить обработкой РНКазой. В обработке РНКазой может использоваться РНКаза А, зндорибонуклеаза, которая

Ф) специфически разьедаеєт одно-свитую РНК 3 до радикалов пиримидина и расщепляет связь фосфата до ка соседнего нуклеотида. Конечньми продуктами являются пиримидин З фосфать и олигонуклеотидь! с оконечньіми пиримидин 3" фосфатами. РНкКаза А работаеєт в отсутствиий адьюнктов и двухвалентньїх катионов. во Чтобьї использовать РНКазу, обьічно вбідерживают чин в любом пригодном содержащем РНкКазу буфере, как описано Сзмбруком и др., (1989), (41). Уместно использовать 30-50мкл содержащего РНКазу буфера на 8 х вмм или 9 х Умм матриць при 37"С от 10 до 60 минут. Затем промьівают буфером гибридизации.

Хотя зто не применяется широко, можно также использовать базу урацила, как описали Крейг и др.(1989),

Ї/Ї, в конкретньїх примерах осуществления. Разрушение комбинации связанной пробь! для получения повторно 65 Мспользуемого чипа можно достичь вьівариванием ремонтньм ферментом Е.соїІ, ураци-ДНК гликосилазой, которая удаляет урацил из ДНК.

Можно также сформировать специфично расщепляемую связь между пробами и затем расщепить связь после обнаружения. Например, зтого можно достичь химическим образованием связи, как описано Шабаровой и др. (1991), (45); и Долинной и др. (1988), 91.

Шабарова и др. (1991), (45) описьівают конденсацию олигодеоксирибо нуклеотидов цианоген бромидом как конденсирующим веществом. В их однозтапной химической реакции образования связи олигонуклеотидь! нагреваются до 97"С, медленно охлаждаются до 0"С, затем добавляется мкл 10 М ВІгСМ в ацетонитриле.

Долинная и др. (1988), (З) показьівают как включать межнуклеотиднье связи фосфорамидата и пирофосфата в дуплексь ДНК. Они также используют метод образования химической связи для модификации /о бзахаро-фосфатнего основания ДНК с растворимьм в воде карбодиимидом (СОЇ) как связующим веществом.

Селективное расщепление фосфоамидньїх связей предполагаєт контакт с 1596 СНЗСООН в течение 5 мин при 95"С. Селективное расщепление, связи пирофосфата предполагает контакт со смесью пиридин-вода (9:11) и с только что дистиллированньїм (СЕ3СО)20.

Хотя соединения и способь! согласно зтому, изобретению бьіли описаньії в терминах предпочтительньх /5 примеров его осуществления, для специалистов будет очевидно, что можно изменить соединение, способь и зтапьі или последовательность зтапов описанного здесь способа, не отходя от замьісла, духа и обьема изобретения. Более конкретно очевидно, что некоторье вещества, которье связаньії химически и физиологически, могут заменяться описанньіми здесь веществами, и будут получень! те же самье или похожие результатьі. Все такие аналогичнье заменители и модификации, очевиднье для специалистов, считаются 2о находящимися в духе, рамках и замьсле изобретении, определяемого прилагаемой формулой изобретения.

Все заявленное, вещества и способь, могут получаться и вьіполняться без ненужного зкспериментирования.

ССЬІЛКИ

1. Ваїппз еї а!., 1988, .). ТНеог. Віої., 135:303-307. 2. Вгоцде еї аї., 1994, Ргос. Маї). Асад. 5сі. ОБА, 91:3072-3076. сч

З. Вгитврацон еї аї!., 1988, Ргос. Маї!. Асад. Зсі. О.5.А., 85:5610-5614. 4. Сапог еї аі., 1992, Сепотісв, 13, 1378. (8) 5. Саге еї аї., 1991, САТА, 8(3): 102-106. 6. Спи ега!., 1983, Мисієїс Асіаз Кез., 11:6513-6529. 7. Ста|д еї аї!., 1989, МисіеЇс Асідз Кезеагси, 17(12): 4605. Ге! зо 8. Банпіеп еї а!., 1987, Мої. СеїІ. Ргорез 1:159-168. 9. Бо|Іппауа еї аї., 1988, МисіеЇс Асідз Кезеагсп, 16(9):3721-3738. - 10. Огтапас 5 СтКмепіаком, 1990, Зсіепіа Мидозіаміса, 16, 97. «- 11. Огтапас 5 СтКмепіаком, О.5. Райфепі 5,202,231. 12. Огтапас еї а!., 1989, Сепотісв, 4:114-128. со 13. Огтапас еї а!., 1991, 9. Віотої. еігисі. 5 Буп., 8:1085. «Е 14. Оптапас еї аї., 1991, Іп "ЕІесігорпогезез, Зурегсотриіег апа (Ше Нитап Сепоте", рр 47-59, Мопа

Зсіепійіс РибіїзпІпо Со., Зіпдароге. 15. ЮОгтапас еї аї!., 1993а, Ргосеедіпдз ої 2па Іпіегпайопа! Сопіегепсе оп ВіоІпіогтайсв, ЗирегсотршиНпа, апа Сотріех Сепоте Апаїузів, Могід Зсіепініс РибіЇзпІпд Со./ рр. 121-134. « 16. Огтапас, ей а! 199365, ОМА Зедиепсе Ое(егптіпайоп Бу НурбгідІлайоп: а Зігаїеду ог ЕПісіепі ств) с Ї агде-Зсаіе Зедпепсіпо, Зсіепсе, 260:1649-1652. . 17. Оптапас, 1994, Арвігасі ВоокК Тог Сепоте Марріпуд апа бедиепсіпу; агтапдей ру Кіснага Муегз, Юамій и?» Рогпіеоиз апа Кобегі У/а(егвіопе, Соїд Зргіпд Нагбог І арогайогіев, р.б0О. 18. Огтапас еї аї!., 1994, Ргосееадіпоз ої пе Зга Іпіегпайопа! УУогкеПор ої Тгапзсгібед Зедцепсезв, Іп Ргезв. 19. Оипсап 8 СамаПег, 1988, Апа|усаї! Віоспетівігу, 169:104-108, їх 20. Еддегз сі аї!., 1994, ВіоТесппідцев, 17(3):516-524. 21. ЕНгодегаїа еї аї., 1992, Мисіеїс Асідз Кезеагсі, 20(14):3753-62. бо 22. Еодог еї аї., 1991, Зсіепсе, 251:767-768. - 23. Нопегїзеї! 8. І епгасіп, 1990, РЕВЗ І ей. 274(1,2):103-106. 24. Іпоцуе 5 Нопадо, 1990, У. СІп.Місгоб., 28:1469-1472. - 25. дасорзгеп еї а!., 1990, Сепотісв, 8:001-007.

Ге) 26. КеїЇег еї а!., 1988, Апа!. Віоспет., 170:441-450. 27. Кеїег еї а!., 1989, Апа!. Віоспет., 177:27-32. 28. Кпгарко еї аї., 1991, 3. ОМА Зедшпепсіпд Марріпа, 1, 375. 29. араї апа Огтапас, 1993, Ргосеедіпдз ої 2па Іпіегпайопа! Сопієгепсе оп ВіоІпіогтайЙопв,

ЗиГрегсотршипо, апа , Сотріех Сепоте Апаїузів, МУопіа ЗсіепінНІс РибіІзпІпад Со., рр. 555-565. (Ф) З0. І апдедгеп еї а. 1988, Зсіепсе, 241:1077-1080. ка 31. Махат « СПрегі, 1977, Ргос. Маї!. Асай. 5сі., 74, 560. 32. Могпіеу 5 СоїПпв, 1989, Мої. СеїЇ. Ргорез 3:189-207. во 33. Мигакаті еї аї., 1991, МисіеїЇс Асідз Кезеагсий, 19(15):4097-4102. 34. Мадаїа еї аї!., 1985, РЕВ5 І еЦегв, 183:379-382. 35. Місноїзг єї аї., 1994, Майшге, 369:492. 36. Реавзе еї аї., 1994 Ргос. Маї!. Асад. 5сі., 91:5022-5026. 37. Ревбегкіп еї а/ї., 1987, ВіоТесппідцез 5(2):132-134. 65 38. Ребегккіп еї а!., 1989, Роса Місгоріоіоду 5(2):281-284. 39. РопЦиз 8: Вего, 1991, Ргос. Май. Асад. 5сі. Ш.5.А., 88:8237-8241.

40. Казтигзвзеп еї а/!., 1991, АпауїІса! Віоспетівігу, 198:138-142. 41. ЗатбргооК еї аї.,, 1989, МоіІесшаг сіопіпд: А Іарогаїгу тапиа). СоЇй Зргіпд Нагрог Іарогайюогу. Соїа

Зргіпд Нагбог, МУ. 42. Заподег, еї аі., 1977, Ргос. Маїй). Асай. Зсі., 74, 5463, 43. 5спгієтег еї а!., 1990, МисіеїЇс Асідз Кезеагси, 18(24):7455. 44. 5спи,Ббегі еї аї., 1990, МисіеЇс Асіаз Кезеагсий, 18(11):3427. 45. Зпарагома еї аї., 1991, МисівЇс Асіаз Кезеагсп, 19(15):4247-4251. 46. Зпагр еї аї., 1989 Роса Містгоріоіоду, 6:261-265. 70 47. зоцшйпет, РСТ Раїйепі Арріїсайоп УУО 89/10977. 48. оцет 4 Мазковз, РСТ Раїйепі Арріїсайоп УУО 90/03382. 49. оцет еї аї., 1992, Сбепотісв, 13, 1008. 50, БігеговзкКа еї аї., 1991, Ргос. Маї!. Асад. 5сі., 88, 10089. 51. Мап Мезгз еї аї., 1991, МисівЇс Асіаз Кезеагсі, 19(12):3345. 52. Ми 5 УМаїІасе, 1989 Сепе, 16:245-254.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:1: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО:1: с

ААААААТТТТ ТТ

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:2: і) () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 13 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота Ге! зо (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная -- (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА «- (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО:2:

ААААААТТТТ ТТС со

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:3: «г () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕННОСТЬ: единичная « (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная в с (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА

Й (хі) ОПИСАНИЄ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО:3: и? АААААТТТТТ ТА

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:4: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований їх (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕННОСТЬ: единичная со (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная - (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХХ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮ МО4: - АААААТТТТТ ТТ

Ге ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:3: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕННОСТЬ: единичная

Ф) (0) ТОПОЛОГИЯ: линейная ка (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХХ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І МО:5: 60 ААААААТТТТ ТС

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:6: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота 65 (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная

(І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХХ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО:6:

ААААААТТТТ ТО

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:7: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕПНОСТЬ: единичная 70 (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИПМОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХЇ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІЮО МО:7:

ТАААААТТТТ ТТ

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:8: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХХ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО І МО:8:

САААААТТТТ ТТ

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО:9: () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: с (А) ДЛИНА: 12 пар оснований (В) ТИП: нуклеиновая кислота і) (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА б зо (ХХ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: 5ЕО ІО МО:9:

САААДААТТТТ ТТ -

ИНФОРМАЦИЯ ДЛЯ 5ЕО ІО МО: 10: «- () ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: (А) ДЛИНА: 11 пар оснований со (В) ТИП: нуклеиновая кислота «Е (С) ЦЕННОСТЬ: единичная (6) ТОПОЛОГИЯ: линейная (І) ТИП МОЛЕУКУЛЬ!: ОМА (ХЇ) ОПИСАНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ: ЗЕО І МО:10: «

ААААААТТІТ Т в с з»

Claims (41)

Формула винаходу

1. Способ определения последовательности молекульї нуклейновой кислотьі, отличающийся тем, что їз проводят гибридизацию молекульй с комплементарньми последовательностями олигонуклеотидов из двух наборов мальх олигонуклеотидньїх зондов известной последовательности, причем первьй набор зондов бо прикреплен к твердой подложке, а второй набор зондов представляет собой меченье зондьі, находящиеся в - растворе, создают ковалентнье связи между гибридизированньм олигонуклеотидом из указанного первого набора зондов и гибридизированньім олигонуклеотидом из указанного второго набора зондов, идентифицируют - ковалентно связаннье участки последовательности и определяют последовательность молекуль! нуклейновой Ге кислоть! с использованием указанньїх идентифицированньх участков.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанную гибридизацию осуществляют циклами.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что предварительно проводят фрагментацию молекуль! нуклейновой КиИслотьі с получением фрагментов нуклеийновой кислоть! промежуточной длинь.

4. Способ по п. З, отличающийся тем, что полученнье фрагменть! последовательно гибридизируют с (Ф) комплементарньми последовательностями из указанньїх двух наборов мальх олигонуклеотидньїх зондов ГІ известной последовательности.

5. Способ по п. З, отличающийся тем, что полученнье фрагментьь одновременно гибридизируют с бо КХомплементарньми последовательностями из двух наборов мальх олигонуклеотидньїх зондов известной последовательности.

6. Способ по п. 3, отличающийся тем, что получают фрагменть! молекульі нуклейновой кислотьі, длина которьїх составляет от примерно 10 до примерно 40 нуклеотидов, при зтом используют малье олигонуклеотидньсе зондь, длина которьїх составляет примерно от 4 до 9 нуклеотидов. 65

7. Способ по п. З, отличающийся тем, что проводят гибридизацию указанньїх олигонуклеотидньїх зондов с полностью комплементарньми последовательностями указанньїх фрагментов.

8. Способ по п. 3, отличающийся тем, что проводят гибридизацию олигонуклеотидньїх зондов с непосредственно соседними последовательностями указанньїх фрагментов.

9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что проводят гибридизацию олигонуклеотидньїх зондов с полностью Комплементарньми и непосредственно соседними последовательностями указанньх фрагментов.

10. Способ по п. З, отличающийся тем, что используют олигонуклеотиднье зондьі, ковалентно связаннье ферментной связью.

11. Способ по п. З, отличающийся тем, что используют олигонуклеотиднье зондьі, ковалентно связаннье посредством химического лигирующего агента. 70

12. Способ по п. 3, отличающийся тем, что при гибридизации проводят контактирование указанного первого набора мальх прикрепленньїх олигонуклеотидньїх зондов с указанньми фрагментами нуклеийновой кислоть промежуточной длиньі в условиях, позволяющих только таким фрагментам с полностью комплиментарной последовательностью гибридизоваться с зондом с образованием первичньїх комплексов, в которьїх фрагмент имеет гибридизированнье и свободнье последовательности, проводят контактирование указанньїх первичньх /5 Комплексов с указанньм вторьм набором мальх меченньїх олигонуклеотидньїх зондов в условиях, позволяющих только таким зондам с полностью комплиментарньми последовательностями гибридизоваться со свободной последовательностью фрагмента с образованием вторичньїх комплексов, в которьїх фрагмент гибридизирован с прикрепленньім зондом и меченньім зондом, образуют ковалентную связь между указанньм прикрепленньїм зондом и указанньім меченньім зондом, удаляют из указанньїх вторичньїх комплексов меченньх Зондов, не связанньїх ковалентно с прикрепленньім зондом, с образованием ковалентно связанньїх комплексов, идентифицируют ковалентно связаннье комплексьій путем обнаружения наличия метки, определяют последовательности фрагментов нуклейиновой кислоть! в указанньїх ковалентно связанньїх комплексах путем соединения известньїх последовательностей гибридизированньїх прикрепленньїх и меченьх зондов.

13. Способ определения последовательности молекульь нуклейиновой кислотьі, отличающийся тем, что с г проводят фрагментацию молекуль нуклеийновой кислоть! с получением фрагментов длиной Т, приготавливают ряд иммобилизированньїх олигонуклеотидньїх зондов с известньми последовательностями и с длиной Е и о набора меченньїх олигонуклеотидньїх зондов в растворе с известньми последовательностями и с длиной Р, причем ЕЕ ї- Р '« Т, производят контактирование указанного ряда иммобилизированньїх олигонуклеотидньмх зондов с указанньми фрагментами нуклейновой кислотьі в условиях гибридизации, позволяющих б зо образовьшваться первичньм комплексам с о гибридизированньми, полностью комплиментарньми последовательностями фрагментов с длиной Е и с негибридизированньмми последовательностями фрагментов -- с одлиной Т - РЕ, производят контактирование указанньх комплексов с указанньм набором меченньх «- олигонуклеотидьїх зондов в условиях гибридизации, позволяющих образовьшваться только вторичньм комплексам с гибридизированньми, полностью комплиментарньми последовательностями с длиной Е и с со з5 Непосредственно соседними гибридизированньмми, полностью комплиментарньми последовательностями с «г длиной Р, образуют ковалентную связь между указанньми меченньми олигонуклеотидньіми зондами и указанньіми непосредственно соседними иммобилизированньми олигонуклеотидньіми пробами, обнаруживают указаннье вторичнье комплексьі по присутствию метки, идентифицируют последовательности с длиной БЕР фрагментов молекульь нуклеийновой кислотьі в указанньїх комплексах путем обьединения /известньх « последовательностей гибридизированньїх иммобилизированньх и меченьх зондов, определяют в с перекрьвающиеся участки указанньїх последовательностей с длиной Б-Р с последующим определением полной последовательности молекуль! нуклеийновой кислоть. ;»

14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что длина Т примерно в три раза больше длинь! РЕ.

15. Способ по п. 13, отличающийся тем, что длина Т составляет примерно от 10 до 100 нуклеотидов, длина Е составляет примерно от 4 до 9 нуклеотидов, а длина Р составляет примерно от 4 до 9 нуклеотидов. їх

16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что длина Т составляет примерно 20 нуклеотидов, длина ЕЕ составляет примерно 6 нуклеотидов, а длина Р составляет примерно 6 нуклеотидов. бо

17. Способ по п. 13, отличающийся тем, что ковалентное связьівание между непосредственно соседними - иммобилизированньїми и меченньіми олигонуклеотидньіми зондами осуществляют ферментной связью.

18. Способ по п. 13, отличающийся тем, что ковалентную связь между непосредственно соседними - иммобилизированньми и меченньми олигонуклеотидьмми зондами образовьвшают с использованием Ге химического лигирующего агента.

19. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют нуклейиновую кислоту, представляющую собой клонированную ДНК или хромосомную ДНК. 5Б

20. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют нуклейиновую кислоту, представляющую собой МРНК. Ф)

21. Способ по п. 13, отличающийся тем, что фрагментирование молекуль! нуклеийновой кислоть! проводят ка гидролизом рестриктазой, ультразвуковой обработкой, обработкой гидроксидом натрия или гидродинамическим фрагментированием при низком давлений. 60

22. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют иммобилизированнье олигонуклеотидь, прикрепленньсе к стеклянной, полистирольной или тефлоновой твердой подложке.

23. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют иммобилизированнье олигонуклеотидь, прикрепленнье к твердой подложке посредством фосфодизстерной связи.

24. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют иммобилизированнье олигонуклеотидь, 65 прикрепленньєе к твердой подложке посредством светоактивируемого механизма.

25. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют меченнье меченье нерадисактивнь!м изотопом или флуоресцентньім красителем олигонуклеотидньсе зондь.

26. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют меченнье изотопами 3955,32Р или ЗЗр олигонуклеотидньсе зондь.

27. Способ по п. 13, отличающийся тем, что указанньій фрагмент молекуль! нуклеийновой кислоть! или один из олигонуклеотидньїх зондов содержат модифицированную или универсальную основу.

28. Способ по п. 13, отличающийся тем, что меченье зондь, не связаннье ковалентно с иммобилизированньм зондом, удаляют из вторичньїх комплексов промьівкой в строгих условиях.

29. Способ по п. 13, отличающийся тем, что используют множество рядов иммобилизированньх 70 олигонуклеотидов, расположенньїх в виде задающего последовательность чипа.

30. Набор для использования при определениий последовательности молекульі нуклеийновой кислоть, отличающийся тем, что он содержит чип с твердой подложкой, имеющий прикрепленньй комплект олигонуклеотидньїх зондов известньїх последовательностей, причем указаннье олигонуклеотидь! способнь принимать участие в реакциях гибридизации, а также набор контейнеров с растворами меченньх 75 олигонуклеотидньїх зондов известньїх последовательностей и лигирующий агент.

31. Набор по п. 30, отличающийся тем, что используемое множество чипов иммобилизированньх олигонуклеотидов установлено в виде ранжированного ряда.

32. Набор по п. ЗО, отличающийся тем, что используемье олигонуклеотиднье зондьії имеют в длину примерно от 4 до 9 нуклеотидов.

33. Набор по п. 32, отличающийся тем, что используемье олигонуклеотиднье зондьії имеют в длину примерно 6 нуклеотидов.

34. Набор по п. 30, отличающийся тем, что используемье олигонуклеотиднье зондьі прикреплень! к стеклянной, полистирольной или тефлоновой твердой подложке.

З5. Набор по п. 30, отличающийся тем, что олигонуклеотиднье зондьі прикрепленьі к твердой подложке су посредством фосфодизстерной связи. о

36. Набор по п. 30, отличающийся тем, что олигонуклеотидньіе зондьі прикреплень! к твердой подложке посредством светоактивируемого механизма.

37. Набор по п. 30, отличающийся тем, что олигонуклеотиднье зондьі меченьі! нерадисактивнь!м изотопом или флуоресцентньїм красителем. Ге»!

38. Набор по п. 30, отличающийся тем, что один из используемьх олигонуклеотидов содержит модифицированную или универсальную основу. --

39. Набор по п. 30, отличающийся тем, что олигонуклеотиднье зондь мечень изотопами 9255, З2Р или ЗЗр, «-

40. Набор по п. 30, отличающийся тем, что в качестве лигирующего агента использован химически со лигирующий агент.

41. Набор по п. 30, отличающийся тем, что в качестве лигирующего агента использован фермент лигазь! чЕ

ДНК.

- . а т» (ее) - - 70 (Че) ко бо б5