KR100346953B1 - 효율적인핵산서열화(sequencing)를위한조성물및방법 - Google Patents

효율적인핵산서열화(sequencing)를위한조성물및방법 Download PDF

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Abstract

본 발명에 개시된 내용은 공지의 염기서열을 갖는 두세트의 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들을 가지고 혼성화하는 것을 기초로 한, 신속하고 매우 효율성이 있는 핵산 서열화을 위한 신규한 방법들과 조성물들에 관한 것이다.
크로모좀들이나 확대되지 않은(non-amplified) RNA를 포함하는, 매우 큰 핵산분자들은 선행하는 클로닝(cloning) 또는 서브클로닝(subclonng)단계들이 없이 서열화될 수 있다.
본 발명의 방법들은 또한, 예를들면, 시그널 비율(signal ratios)에 대한 높은 노이즈(noise)과 어려운 식별력(discrimination), 많은 핵산단편들의 표면에의 부착, 많은 길고 좀더 복잡한 탐침들의 준비와 더 많은 종의 표지(labelling)와 같은 서열화 기술과 연관된 여러가지의 문제점들을 해결한다.

Description

효율적인 핵산 서열화(sequencing)를 위한 조성물 및 방법
본 출원은, 포기(disclaimer) 없이 전체원문과 도면이 인용자료로 여기에 특별히 통합된, 1993년 9월 27일 출원된 미국특허출원 제08/127,420호의 동시 계속 출원인, 1994년 9월 8일에 출원된 미국특허출원 제08/303,058호의 동시 계속 출원이다.
미합중국 정부는, 미합중국 에너지국(Department of Energy)과 아르곤(Argonne) 국립연구소를 대리하는 시카고 대학 사이에 계약번호 W-31-109-ENG-38과 에너지국 인가 LDRD 03235에 준한 본 발명에 있어서의 권리를 인정한다.
발명의 배경
1. 발명의 분야
본 발명은 일반적으로 분자 생물학 분야와 관련된 것이다. 본 발명은, 특히 헥산분자들을 매우 효율적으로 서열화(sequencing)할 수 있게 하는 신규한 방법과 조성물들에 대한 것이다. 본 발명은 클로닝(cloning)이나 서브클로닝(subcloning) 단계들이 없이 크로모좀(chromosome)과 RNA를 포함하는 긴 핵산 분자들을 서열화하는데 적합하다.
2. 관련 선행기술에 대한 기재
핵산 서열화은 오늘날 과학 발달에 있어 필수적인 부분중의 하나이다. 핵산 분자들과 핵산 조각들(segments)의 염기서열(sequence) 즉, 1차 구조의 결정은 특정한 목적 범위를 연구하는 개인적인 프로젝트에 있어 매우 중요하다. 서열화으로부터 얻은 정보는 과학, 의학, 농학 및 생물공학의 전분야에 영향을 미친다. 핵산 서열화은 물론 휴먼 게놈 프로젝트(Human genome project)와 그 밖의 다른 큰 규모의 연구들(undertakings), 예를들면 여러가지의 질병의 원인 규명과 생물체의 기능과 진화에 대한 연구 등 등에 필수적이다.
핵산 서열화의 효용은 분명하다. 예를들면 전체 휴먼 게놈의 서열화을 연구하는 다국적 노력인 휴먼 게놈 프로젝트(HGP)가 여러 센터(center)들에서 진행중이다. 그러나 이 분야에 있어서, 진보는 일반적으로 느리고 비용이 많이 든다. 핵산 서열화은 한개의 뉴클레오티드에 있어 길이에 있어서 다양한 1~500염기쌍의 범위로 DNA 단편들을 분리시키는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gels)로 결정한다. 염기서열의 실제적인 결정, 즉 각각의 A, G, C 및 T 뉴클레오티드들의 순서는2가지 방법으로 얻을 수 있다.
첫째, 특징 뉴클레이오티드에서 DNA 단편을 화학적으로 절단(degrading)하는 맥샘 & 길버트의 방법(맥샘 & 길버트, 1977)의 이용, 또는 둘째로, 상거(sanger)와 그의 동료들에 의해 개시된 디데옥시 사슬 종결(dideoxy chain termination) 서열화 방법(상거 등, 1977) 의 이용이다. 이 두 가지 방법은 시간이 소비되고 힘들다.
더욱 최근에, 전기 영동단계가 없는 핵산 서열화의 다른 방법들이 제안되었다. 이 방법들은 혼성화(Hybridization) 또는 SBH[Drmanac at al., 1991 ; Cantor et al., 1992 ; Drmanac & Crkvenjakov, 미국특허 제5,202,231호)에 의한 서열화라 총괄적으로 불리운다. 이런 방법들 중에 몇개의 발전에 의해 서열화 칩(sequencingchip)들이라 불리우는 새로운 고형 지지체(solid support) 형태의 서열화 기구들이 발생되었다. 보통, SBH의 효용성은 미국특허들이 이 기술들에 대하여 특허를 허여받은 사실에 의하여 증명된다. 그러나 비록 SBH가 핵산을 서열화하는 속도를 증가시키는 능력(potential)를 가지고 있지만, 현재의 SBH 방법들은 모두 아직까지 여러가지 결점들이 존재한다.
SBH는, 보통 포맷(Format) 1과 포맷 2(Cantor et al., 1992)라 불리우는, 2가지 기본적인 방법으로 수행될 수 있다. 포맷 1에서는, 보통 약 길이가 100~1000 뉴클레오티드인 미지의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드들이 지지체(support)나 필터(filter)에 배열되어 미지의 샘플들이 스스로 고정화된다.(Strezoska et al., 1991 ; Drmanac & Crkrenjakov, 미국특허 계5,202,231호). 배열의 복제들은 그 다음에 약 6~8 잔기의 길이를 가진 표지된 탐침들(labeled probes)의 세트를 가지고 혼성화 방법으로 탐문된다. 포맷 2에서는 서열화 칩이 길이 약 6~8 잔기의 공지의 염기서열을 갖는 올리고 뉴클레오티드들의 배열에 의해 형성된다(Southern, Wo 89/10977 ; Khrapko et al., 1991 ; Southern et al., 1992.). 미지의 염기서열을 가진 핵산은 고정화된 올리고들(oligos)과 혼성화될 수 있도록 그 다음에 표지된다.
불행하게도, 이 SBH 포맷들은 모두 몇개의 제한성을, 특히 선행하는 DNA 클로닝 단계의 요구와 같은 가지고 있다. 포맷 1에서는, 여러가지의 핵산 조각들이 서열화되어 고형 표면 지지체에 부착하거나, 또는 길이가 더 긴 탐침들의 큰 세트를 준비해야 하는 것을 포함하는 문제점들을 가지고 있다. 포멧 2에서의 문제점들은, 미지의 서열을 갖는 핵산의 표지(labelling) 일반적으로 생성되는 시그널 비율(signal ratios)에 대한 높은 노이즈(high noise)와 오직 짧은 염기서열이 결정된다는 사실을 수반한다. 포맷 2는 더 나아가 다른 GC 내용물과 함께 탐침들에 필요한 여러가지의 조건들과, 몇개의 타아겟(target)에 접근하는 것을 방지하는 2차 구조의 형성하는 등의 문제점들을 갖고 있다. 따라서, 본 기술은 서열화에 있어서 새로운 공정에 따른 장점들을 갖고 특히 클로닝 및/또는 서브클로닝의 지루한 공정들이 필요없게 된다.
발명의 개요
본 발명은 핵산의 서열화에 있어서 새로운 방법들과 조성물들을 제공함으로써 선행기술이 갖고 있는 여러가지 결점들을 극복하는데 그 목적이 있다. 본 발명의 발명자들에 의해 포맷 3이라 보통 불리우는 신규한 테크닉들이 여기에 개시되었는데, 이것은 포맷 1 및 포맷 2 SBH 방법들보다 현저한 개선점(improvements)들을 보여준다. 본 발명에 의하여 제공된 포맷 3 서열화에서, 핵산 염기서열들은 공지의 염기서열을 갖는 2세트의 작은 올리고 뉴클레이티드 탐침들을 가지고 혼성화하는 방법에 의하여 결정된다. 본 발명의 방법들은, 선행의 클로닝, 서브클로닝 또는 증폭(amplification)이 없이 크로모좀 물질 또는 RNA를 포함하는 매우 큰 핵산분자들에 대하여 높은 선택성이 있는 서열화을 가능하게 한다.
더 나아가 본 발명의 방법들은 많은 수의 탐침들, 더 긴 탐침들의 복합체 제조, 또는 핵산단편의 복합 혼합물의 표지가 필요하지 않다.
본 발명의 방법들에 따라서 핵산의 염기서열을 결정하려면, 핵산의 염기서열을, 탐침의 길이에 있어서 대부분의 염기서열들의 조합들을 커버(cover)할 수 있는, 두 세트의 정해진 길이와 공지된 염기서열을 갖는 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들(oligos)중의 상보적인 염기서열과 혼성화시킴으로써 핵산의 염기서열을 동정한다. 그 다음에 오버랩(overlap)하는 동정된 염기서열의 스트레치들(stretches)을 결정하기 위하여 동정된 염기서열을 분석하고, 그러한 오버래핑(overlapping) 염기서열로부터 완전한 핵산 염기서열을 조합하고 재구성한다.
서열화 방법은, 두 세트의 작은 올리고 (oligo)들중에 있는 상보적인 염기서열들을 가지고 연속적으로 혼성화함으로써 수행된다. 선택적으로, 2 세트의 작은 올리고(oligo)들이 미지의 염기서열들과 동시에 혼성화되는 "사이클링(cycling)"이라 표현되는 방법도 사용된다. "사이클링"이란 용어는, 상보적이 아닌 혼성체들(hybrids)을 "용융(melt)"시키기 위해 온도를 증가시키는 것에서 유래하는 테크닉의 선택성이 있는 부분공정으로서 그러한 사이클링 테크닉들은 PCR과 같은 분자생물학의 다른 분야들에서 보통 이용되고 있으며, 당업자들은 본 발명을 읽게되면 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 매우 길이가 긴 핵산 분자들을 서열화하는데 적용할 수 있다. 실질적인 문제로서 서열화될 핵산 분자들은 보통 단편화되어(fragmented) 조작하기 쉬운, 작거나 또는 중간길이의 핵산 조각들을 제공한다. 여기에서 사용된 핵산 단편이란 용어는 일반적으로 길이에 있어 약 10∼100 염기쌍 사이의 핵산 분자를 의미한다. 본 발명의 가장 바람직한 방법들은 서열화될 핵산 분자들을 처리하여, 10~40염기쌍 정도의 중간 길이의 핵산 단편들을 제공한다.
그러나 본 발명은 작은 핵산 단편들을 완전히 서열화하는 방법이 아니라, 이것이 전체 분자를 이용하든, 또는 단순하게 분자들을 단편화하여 약 4∼1000 염기들의 좀더 작은 조각에 의하든 분자내의 염기서열의 부분들을 결정하는 것을 포함하는 핵산 분자들 자체의 서열화 방법이다.
핵산 분자들의 염기서열은 공지의 염기서열을 갖는 작은 올리고 뉴클레오티드와 혼성화됨으로써 결정된다. "작은 올리고뉴클레오티드 탐침들(small oligonucleotide probes)"에서, "작은"이란 용어는 길이가 10염기쌍 미만의 탐침들, 바람직하게는 4~9염기쌍인 탐침들을 의미한다. 하나의 전형적인 서열화의 구체예에서, 길이가 약 6염기쌍인 탐침들이 특히 유용한 것으로 고려된다.
선택된 탐침의 길이에 대한 염기서열의 모든 조합(combinations)들을 커버하는 올리고 (oligos)들의 세트들의 수는 4F로 표현될 수 있다. 여기에서 F는 탐침의 길이이다. 예를들면, 4-mer에 대하여, 세트는 256 탐침들을 갖고 있고 ; 5-mer는 1024 탐침들 ; 6-mer는 4096의 탐침들 ; 7-mer는 16,384의 탐침들을 갖고 있다. 이러한 길이의 올리고들을 합성하는 것은 당 기술분야에서 매우 통상적인 것이며 자동 합성(automated synthesis)에 의하여 얻어질 수 있다.
본 발명의 방법들에 있어, 첫번째 세트(first set)라 불리우는, 공지의 염기서열을 갖는, 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들의 세트는 고형 지지체(solid support)에 부착된다. 즉, 지지체에 고정화되어 그들은 혼성화반응에 참여할 수 있다. 두번째 세트(the second set)라 불리우는, 공지 염기서열을 갖는, 또 하나의 작은 올리고뉴클레외티드 탐침들의 세트는 용액에 있는 탐침들과 탐지 가능한 수준으로 표지된(labelled) 탐침들이다. 올리고세트들은 같은 길이의 또는 다른 길이의 탐침들을 포함한다.
연속적인 혼성화 과정이란, 미지의 염기서열을 갖는 핵산분자들 또는 단편들이, 시간적으로 독립적으로, 공지의 염기서열을 갖는 다른(distict) 올리고뉴클레오티드 탐침들의 세트와 혼성화되는 것을 뜻한다(그림. 1). 핵산 분자들 또는 단편들(fragments)은 일반적으로 변성화되어, 혼성화 가능케되며, 선택적인 혼성화 조건들하에서 첫째의, 탐침들의 고정화된 세트에 부가되어 상보적인 염기서열들을 갖는 단편들과만 혼성화되도록 하게 한다. 상보적이 아닌 염기서열들을 갖는 단편들은 제거되고. 제2의 표지된 탐침 세트를 용액에서(in solution), 이미 만들어진 단편들과 탐침들의 조합(combination)에 가함(adding)으로써 제2의 선택적인 혼성화가 그 다음에 수행된다. 고정화된 탐침들에 인접하여 혼성화하는 표지된 탐침들은 지지체에 붙어 남아 있게 되어 탐지된다. 그러나, 고정화된 탐침들과 표지된 탐침들 사이에 스페이스(space)가 존재시는 그러하지 아니하다(제1도).
동시 혼성화 공정(Simultaneous hybridization process)이란 미지의 핵산분자들이 공지의 염기서열을 갖는 별개의(distinct) 세트의 올리고 뉴클레오티드와 동시에 접촉(contact)되는 것을 뜻한다. 혼성화는, 선택적인(discriminating) 혼성화 조건에서 일어난다. 상보적이지 않은 염기서열을 갖는 단편들은 그 다음에 "용융되고(melted)" 즉, 온도를 상승시키므로써 제거되고, 혼성화할 수 있는 상보적인 제2의 탐침들을 받아들임으로써 그 다음의 선택적인 혼성화가 수행된다. 고정화된 탐침에 인접하여 혼성화하는 표지된 탐침들은 그 다음에 같은 방법으로 탐지된다.
"상보적인(complementary)" 핵산 염기서열들이란, 표준의 와트슨-크리크(watson-crick)의 상보성 법칙과 그들이 변형된 염기들에 적용하는 변형된 법칙들에 따라서 염기쌍을 형성할 수 있는(base-pairing) 것들이다.
즉, 큰 퓨린들, 또는 작은 피리미딘들은 더욱 작은 피리미딘들과 염기쌍을 이루어 공지된 조합만을 형성한다. 이들은 시토신(cytosine)과 쌍을 이룬 구아닌(guanine)과, DNA의 경우, 티민(Thymine)과 쌍을 이룬 아데닌(adenine), 또는 RNA의 경우, 우라실(Uracil)과 쌍을 이룬 아데닌(A:U)을 포함한다. 변형된 염기들(modified bases)도 이용되고, 또한 소위 통상의 염기(Universial Base)(M. Nicholis et al., 1994)도 이용된다.
여기에서 사용된 "상보적인 염기서열(complementary sequences)"란 용어는, 그들의 전체 길이가 실질적으로 상보적이고 염기의 미스매치(mismatch)가 거의 없는 핵산 염기서열들을 뜻한다. 예를들면, 6개의 염기들로 이루어진 핵산 염기서열이 6개의 위치 중 다섯 부분에서 혼성화하고 단지 하나의 미스매치를 가질 때 "상보적인"이라 부를 수 있다. 본래 "완전하게 상보적인(completely complementary) 핵산 염기서열들은 그들의 전체 길이에 걸쳐 완전하게 상보적이고 염기의 미스매치들(base mismatches)이 전혀없다.
공지의 염기서열을 갖고 있는 올리고(oligos)들을 혼성화하여 핵산 단편들의 부분인 여러개의 염기서열을 각각 동정한 후, 이 염기서열들을 분석하고 오버랩한(overlap) 염기서열들의 스트래치를 동정한다. 예를들면, 다른 염기서열들의 3'-말단과 같은 염기서열들의 5'-말단[5'-end) 부분이 동정된다. 이의 역도 또한 성립한다. 그러면 핵산 분리나 단편의 완전한 염기서열을 묘사할 수 있다. 즉, 이렇게 결정된 오버래핍(overlapping) 염기서열로부터 완전한 염기서열을 재현할 수 있다.
오버래핑 염기서열들을 동정하고 완전한 염기서열을 재현하는 공정은 일반적으로 컴퓨터 분석을 통하여 이루어진다. 예를들면, 만일 표지된 탐침 5'-TTTTTT-3'가 고정화된 탐침 5'-AAAAAA-3'를 함유하는 부위와 혼성화 되면, 핵산 분자내로부터 12-mer 염기서열, 즉 5'-AAAAAATTTTTT-3'가 밝혀진다(SEQ ID NO:1). 즉, 두개의 혼성화된 탐침들의 염기서열은 결합하여 이전에 몰랐던 염기서열을 밝혀준다. 그 다음에 풀어야할 문제는 새로이 결정된 5'-AAAAAATTTTTT-3' 염기서열의 다음에 오는 뉴클레오티드이다(SEQ ID NO:1). 고정화된 탐침 5'-AAAAAT-3'에 대하여, 다음 표지 탐침은 A를 갖는 5'-TTTTTA-3' ; T를 갖는 5'-TTTTTT-3' ; C를 갖는 5'-TTTTC-3' ; G를 갖는 5'-TTTTTG-3'의 4가지 가능성이 있다.
예를들면, 만일 탐침 5'-TTTTTC-3'가 포지티브(positive)이고 그 나머지 3개가 네거티브(negative)이면, 조립된 (assembled) 염기서열은 연장되어 5'-AAAAAATTTTTTC-3'가 된다(SEQ ID NO:2). 그 다음 단계에서, 알고리듬(algorithm)에 의하여 고정화된 탐침 AAAATT을 함유하는 부위에서 포지티브한 표지된 탐침들인 TTTTCA, TTTTCT, TTTTCC 또는 TTTTCG가 결정된다. 이 공정은 모든 포지티브(F+P) 올리고뉴클레오티드 염기서열이 거짓의 포지티브들(false positives)로 밝혀지고 사용될 때까지 반복된다.
따라서, 본 발명은 길이가 긴 핵산 단편들과 분자들을 서열화하는데 매우 효과적인 방법을 제공한다. 여기에서 규정된, 큰 핵산 분자들은 서열화 전에 단편화되는 것이 필요한 분자들이다. 이것들은 일반적으로 길이가 최소한 40∼50염기쌍이며 대개의 경우 이보다 더 길다. 사실, 본 발명의 방법들은 실제적으로 핵산분자들의 길이에 있어 상한선이 없으며, 따라서 인간의 염색체와 같은 완전한 염색체를 포함하고 100염기쌍, 1킬로베이스(kb), 100kb, 1메가베이스(Mb) 및 50Mb 또는 그 이상의 염기서열들을 서열화한다. 이렇게 큰 수는 본 발명의 범위내에서 적절하고 이러한 염기들을 서열화하려면 2세트의 8-mers 또는 9-mers를 필요로 하게 된다 (따라서 F+P % 16 - 18). 서열화되는 핵산은 코스미드(cosmid) DNA 또는 YAC 삽입물(inserts), 현미세부된(microdissected)염색체 띠들(bands), 게놈의 DNA, CDNA와 같은 DNA 이거나, mRNA, rRNA, tRNA 또는 smRNA를 포함하는 RNA이다.
긴 핵산분자의 염기서열을 결정하는 공정은 단순히 분자로부터 F + P 길이의 염기서열을 동정하는 것과 적당한 앨고리즘(algorithm)을 사용하여 염기서열들을 결합하는 것을 포함한다. 실제적으로는 먼저 핵산분자들을 단편화시켜 중간 길이의 핵산 단편들과 같은, 좀더 작은 단편들을 생산하도록 서열화한다. 그 다음에, 상기에서 언급한 것처럼 단편들을 공지의 염기서열을 갖는 두 세트의 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들중의 상보적인 염기서열들과 연속적으로 혼성화하므로써 F+P 길이의 염기서열들을 동정한다. 이와 같이 굉장히 큰 분자들의 핵산 염기서열은 길이 F + P의 오버래핑 염기서열로 부터 재구성할 수 있다. 서열화되는 핵산 그 자체가 중간길이의 단편이거나, 또는 먼저 그러한 길이의 단편을 생성하도록 처리되든지 간에, 두 세트의 공지된 작은 올리고 클레오티드 탐침들과 혼성화하므로써 핵산 단편의 염기서열들을 동정하는 공정이 여기에 개시된 서열화 방법들에 있어 중심이 된다.
이 공정은,
a) 상보적인 염기서열을 갖는 핵산단편들이 효과적으로 탐침들과 혼성화하여, 혼성화된 단편과 혼성화 안된 단편, 또는 "유리된(free)" 염기서열을 갖는 일차복합체들을 형성하게 하는데 효과적인 혼성화 조건들 하에서 부착된(attached) 또는 고정화된(immobilized) 올리고뉴클레오티드 탐침들의 세트 또는 배열을 핵산단편들과 접촉(contacting) 시키고 ;
b) 단편들이 혼성화되어 부착된 탐침과 표지된(labelled) 탐침 모두를 갖는 2차 복합체들을 형성하기 위하여, 혼성화되지 않은 또는 유리 단편 염기서열이 상보적인 염기서열을 갖는 탐침들과 혼성화하는데 효과적인 혼성화 조건들 하에서, 일차 복합체들과 용액상의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 세트를 접촉시키며 ;
c) 2차 복합체로부터 고정화된 탐침에 인접한 혼성화 안된 표지된 탐침들을 제거하고, 이에 의해 단지 인접한 2차 복합체만을 남기고 ;
d) 표지된 탐침내의 표지의 존재를 탐지함으로써 인접한 2차 복합체들을 탐지하며;
e) 혼성화되고 부착되고 표지된 탐침들의 공지의 염기서열들을 결합(combining) 또는 연결(connecting) 하므로써 인접한 2차 복합체 내에 있는 핵산 단편들의 올리고뉴클레오티드 염기서열들을 동정하는,
단계들로 이루어져 있다.
혼성화 단계들 중의 하나 또는 모두를 수행하기 위해 선택된 혼성화 또는 "세척조건들(washing conditions)"은 선택된 특정의 서열화 구체예에 따라 처리될 수 있다. 예를 들면, 모든 혼성화 조건들은 올리고뉴 클레오티드 탐침들이, 상보적인 염기서열, 즉, 여섯위치들 중의 다섯위치에서 혼성화하는 염기서열들과 같은 실질적으로 매치되는(matching) 염기서열들을 갖는 주어진 핵산 단편과 혼성화하도록 만들어질 수 있다.
혼성화 단계들은 요즈음의 서열화 작업에 통상적으로 사용되고 있으므로 단순한 로봇기구(robotic divice)를 이용하여 바람직하게 수행된다.
선택적으로, 혼성화 조건들은, 혼성화하는 올리고뉴클레오티드 탐침들과 단편들만이 완전히 상보적인 염기서열을 갖도록 만들어질 수도 있다. 이러한 좀 더 선택적인 또는 "엄중한(stringent)" 조건들은, 염기서열의 혼성화 공정의 별개의 단계들에 모두 사용되거나 또는 어느 한쪽의 단계에만 사용된다. 이 경우에 있어서, 올리고뉴클레오티드 탐침들은 고정화된 탐침이든 표지된 탐침들이건 간에, 그들이 핵산단편과 완전히 상보적인 염기서열들을 공유하고 있을 때 주어진 핵산 단편과 혼성화하도록 된다.
선택된 혼성화 조건들은 일반적으로 얻어진 데이터를 분석하는데 요구되는 복잡성의 정도를 알려준다. 똑같이, 산출된 데이터를 분석할 수 있는 컴퓨터 프로그램들은 주어진 실혐실에서 사용되어야 하는 혼성화 조건들을 알려준다. 예를들면, 가장 선택적인 공정에서, 모든 혼성화 단계들은, 오직 올리고들과 핵산 단편들이 완전히 상보적인 염기서열들과 혼성화할 수 있게 하는 조건들하에서 수행될 수 있다. 거기에는 미스매치된(mismatched) 염기들이 없을 것이므로, 이 방법은 가장 덜 복잡한 컴퓨터 분석을 수반하고, 이 때문에, 이것이 일반적으로 본 발명을 수행하기에 바람직한 방법이다. 그러나 하나 혹은 모든 혼성화 단계들에 대하여 덜 선택적인 조건들의 이용도 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 하나의 혹은 모든 단계에서의 이용에 적합한 혼성화 조건들은 통상 적정화(optimization) 과정 또는 '파일럿 연구들(pilot studies)'에 의하여 결정될 수 있다. 여러가지 형태의 파일럿 연구들이 주어진 실험실에서 사용을 위한 공정의 적용과 작업공정의 수립에 있어, 핵산 서열화 기술의 전 당업자들에 의하여 통상적으로 수행된다. 예를들면, 온도 ; 각 구성요소의 농도 ; 각 단계에서의 시간 ; 사용되는 완충제들과 그들의 pH 및 이온력(ionic strengh)와 같은 조건들이 다양하고 따라서 최대한 활용된다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 핵산 서열화 방법은, 하나, 둘 또는 3이상의 염기들이 분리되고(seprated) 직접 인접하지 않은 것들과는 구별되는, 직접 인접하고 고정화되고 표지된 탐침들을 포함하는2차 혼성화 복합체들을 만들기 위해 선택적인 단계를 수반한다.
다양한 공정들이, 각각은 단지 직접 인접한 2차 복합체들을 남기는 고정화된 탐침에 인접하여 직접 혼성화되지 않는, 즉 백-투백(back to back)상태로 혼성화되지 않는, 표지된 탐침들을 제거하는데 유용하다.
이러한 선택적인 공정들은, 직접 인접하는 뉴클레오티드들의 스태킹 반응들(stacking interactions)에 의하여 제공되는 안정성의 증가에 의해 직접 인접한 탐침들이 혼성화되어 남아있도록 만든 혼성화 조건들을 갖는, 엄격히 조절된(controlled stringency) 세척 단계들에만 단지 의지한다. 다시, 온도, 농도, 시간, 완충제, pH, 이온력 등과 같이 다양한 세척조건들(washing conditions)을 이용하여, 직접 인접하지 않은 표지된 탐침들의 제거를 적정화한다.
바람직한 구체예에서 직접 인접하고 고정화되고 표지된 탐침들은 연결되지 않은 (non-ligated)탐침들을 제거하는 세척단계들을 수행하기 전에 공유적으로 결합한다. 연결은 수용성 카보디이미드(carbodiimide), 또는 시아노겐 브로마이드(cyanogen bromide)와 같은 화학적 연결제(chemical ligating agent)를 함유하는 용액으로 처리하여 수행한다. 좀더 바람직하게는, 많은 소스(sources)들(e.g. Biolabs)로부터 상업적으로 유용한, T4박테리오파지의 T4DNA 리가아제와 같은 리가아제 효소를 사용할 수 있다. 어쨋든, 공유적으로 연결되고 표지되고 고정화된 탐침들에 영향을 미칠 수 없는 더 엄격한(stringent) 세척조건들에 의하여 직접 인접하지 않은 표지된 탐침들을 제거할 수 있다.
잔존하는 인접한 2차 복합체들은 복합체내에 존재하는 표지된 탐침들로 부터 표지의 위치를 관찰함으로써 알아낼 수 있다. 올리고뉴클레오티드 탐침들은 형광 염료(fluorescent dye)와 같은 화학적으로 감지가능한 표지로 식별하거나, 또는 충분히 변형시켜35S,3H,32P 또는 현재 선호되는33P와 같은 방사능 표시 또는 화학발광 현상공정(chemiluminescent developing procedure)으로 식별가능하다. 탐침들은 또한 비상사성 동위원소로 표시되어 매스 스펙트로메트리(mass spectrometry)로 감지할 수 있다.
본 발명을 실행하기 위하여 고려되는 가장 바람직한 방법은, 핵산 단편들과 혼성화하는 완전히 상보적인 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 탐침들만을 지정하고, 그러한 탐침들이 직접 인접하여 혼성화되어 남아 있도륵 지정하는 조건들하에서 혼성화 단계들을 수행하는 것을 포함한다. 이 방법은 가장 덜 복잡한 컴퓨터 분석을 필요로 한다.
미지의 염기서열을 갖는 핵산 분자가 45~50염기쌍보다 더 길 경우, 일반적으로 그 염기서열을 결정하는 효과적인 방법은, 중간길이의 핵산단편들을 만들기 위한 분자들의 처리와 그 단편으로부터 염기서열을 결정하는 것을 수반한다. 핵산분자는, DNA는 RNA든 간에, 예를 들면, 초음파 처리, 수산화나트륨처리와 같은 물리적 방법에 의한 절단 또는 낮은 압력에 의한 절단, 제한 효소 분해에 의한 절단을 포함하는 여러방법 중의 하나에 의해 단편화될 수 있다.
구체예에서, 예를들면 길이가 약 4∼9염기쌍인 작은 올리고뉴클레오티드 탐침을 수반하는 경우, 길이에 있어, 약 10∼40염기쌍의 핵산 단편들을 생산하는 것을 목적으로 할 수 있다. 보통 길이가 긴 탐침들은 긴 핵산 단편들을 서열화하는데 사용된다. 그리고 그 역도 성립한다. 어떤 바람직한 구체예에서, 사용되는 작은 올리고뉴클레외티드 탐침들은 길이가 약 6염기쌍이고, 서열화되는 핵산 단편들은 보통 길이가 약 20염기쌍이다. 만일 원한다면, 단편들을 크기별로 분리하여 적당한 길이를 가진 것들을 얻을 수 있다. 예를 들면 단편들은 아가로오스 겔(agarose gel)과 같은 겔(gel)에서 공정이 수행되는데 여기에서 대략적으로 원하는 길이로자를 수 있다.
핵산분자들의 염기서열을 결정하는 방법은 또한 다음과 같은 용어들을 사용하여 예시될 수 있다. 먼저 서열화을 할 일정량의 핵산을 무작위적으로 분해하여 길이 T인 핵산단편들의 혼합물을 제공할 수 있다. 길이가 F인 미지의 염기서열을 갖는 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열과, 길이 P이고 공지의 염기서열을 갖는 용액상의 표지된 올리고뉴클레오티드 단편세트를 준비할 수 있다. 여기에서 F + P ≤ T이고, 바람직하게는 T % 3F이다.
효과적인 혼성화 조건하에서, 핵산단편들을 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열과 접촉시켜 길이 F의 혼성화된 상보적인 염기서열과 길이 T-F인 혼성화되지 않은 단편염기서열들의 일차 복합체(prirary complexes)를 형성할 수 있다. 바람직하게는 길이 F인 혼성화된 염기서열은 오직 완전히 상보적인 염기서열을 갖는다.
일차복합체는 그 다음에, 효과적인 혼성화조건하에서 세트의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들 세트와 접촉하여 길이 F의 혼성화된 상보적인 염기서열과 길이 P인 인접하고 혼성화되고 상보적인 염기서열을 갖는 2차 복합체를 형성할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 표지된 탐침들이 완전히 상보적인 염기서열들과 혼성화될 수 있고, 고정화된 탐침에 직접 인접하여 혼성화하는 탐침들만이 혼성화되어 남아있을 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서 인접하고 고정화되고 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 또한 이 단계에서 연결된다.
그 다음에 표지의 존재를 감지함으로써 2차 복합체들을 감지하고 공지의 염기서열을 갖는 혼성화되고 고정화되고 표지된 탐침들을 결합시킴으로써 2차 복합체에서의 핵산 단편들로부터 길이 F + P인 염기서열을 동정할 수 있다. 오버랩하는 길이 F + P인 염기서열들의 스트레치들은 그 다음에 동정되고, 그것에 의하여 결정된 오버래핑 염기서열들로부터 분자의 완전한 핵산염기서열을 재구성하거나 조합할 수 있다.
본 발명의 방법들에 있어서, 최초의 세트의 올리고 뉴클레오티드들은 당업자들에게 알려진 방법에 의해 고형 지지체에 부착, 즉 고정화될 수 있다. 예를들면 부착(atlachment)은 선택가능한 레이저-활성화된 광-탈보호(addressable laser-activated photodeprotection) 방법을 통할 수 있다(Fodor et al., 1991 ; pease et. al.,).
보통 선호되는 방법은, 유리, 나일론 또는 테프론(teflon)으로 된 지지체들을 이용하고, 서턴(Southern) & 마스코스(Maskos)(PCT 특허출원 WO 90/03382, 인용자료에 의해 여기에 합쳐짐)에 의해 기재된 뉴클레오시드 포스포라미다이트(nucleoside phosphoramidite) 또는 뉴클레오시드 하이드로전 포스페이트(uncleoside hydrogen phosphate)등과 같은 시약을 사용하는 포스페이트 군을 통하여 올리고들(oligos)을 부착한다. 또한, 예를들면 아피메트릭스(affymetrix)와 베크만(Beckman)이 시판하는 올리고 뉴클레오티드 배열과 결합하는 지지체를 구입할 수 있다.
고정화된 올리고 뉴클레이티드들은 모든 탐침들 또는 주어진 길이(바람직하게는 약 4~10염기쌍)를 갖는 탐침들의 서브세트(subsets)들로 이루어진 배열을 형성할 수 있고, 더 바람직하게는, 소위 "서열화 칩(sequencing chip)을 형성하도록 배열된 복수의(multiple) 배열을 갖는 고정화된 올리고뉴클레오티드들을 형성할 수 있다.
칩(chip)의 한예는 소수성 단편들(segments)이 특별한 공간지역을 만들도록 사용하는 것이다. 서열화 칩은 mRNA 서열화과 대규모의 게놈 서열화, 특별한 목적을 위한 특정 부분의 서열화, 부분(partial) 서열화, 매핑(mapping)와 같은 여러가지의 응용을 위해 설계될 수 있다. 각각의 응용에서 특정의 칩은 다른 크기의 탐침들과 또는 불완전한 탐침들의 세트를 갖도록 설계될 수 있다.
표본이 되는 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 탐침들의 모든 세트는 길이가 6개인 탐침, 즉, 6-mer가 될 수 있다. 이 경우에 올리고들의 각 세트는 4096의 특정의 탐침들을 함유한다. 첫째 세트 탐침들은 64횡렬과 64종렬로 가장 간편하게 배열된, 마이크로칩(microchip)위에 바람직하게 배열되어 고정된다. 4096 올리고들의 두번째 세트는 감지가능한 수준으로 표지되고 한세트의 특별한 튜브들에게 분배된다. 이 예에서 4096의 칩들은 하나의 큰 배열 또는 여러개의 배열들로 결합된다. 핵산 단편들을 혼성화한 후에 적은 양의 표지된 올리고뉴클레외티드들이 두번째의 혼성화 단계를 위해 각 마이크로 칩에 부가되며 단지 4096 뉴클레오티드를 각각 하나하나가 각 마이크로칩에 부가된다.
더 나아가서의 본 발명의 구체예들은 핵산 서열화에 이용하는 키트들(kits)을 포함한다. 이러한 키트들은 일반적으로, 제2A도, 제2B도 및 제2C도에 나타난 것처럼 공지의 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열이 부착된 고형 지지체로 이루어진다. 여기에서 올리고뉴클레오티드들은 혼성화 반응들에 참여할 수 있고, 한 세트의 컨테이너들(containers)은 공지의 염기서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 용액으로 구성된다. 그림 4에 나타난 것과 같은 배열들도 또한 고려된다. 이것은 핵산 단편들의 혼성화에 부가된 크기를 주는 말단에서 또는 부착방법으로서 통상의 염기의 이용을 묘사한다.
키트들에서, 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침들과 용액내의 올리고뉴클레오티드 탐침들은 길이가 약 4~9염기쌍이고, 바람직한 길이는 약 6여기쌍을 가진 것이다. 올리고들은, 일반적으로 바람직하게는 32P-표지된 탐침들을 가지고 그리고, 좀 더 바람직하게는 33P-표지된 탐침들을 갖는 화학적으로 감지 가능한 또는 방사성의 표지들로 표시될 수 있다. 키트들은 또한 DNA 리가제 효소와 같은 화학적 또는 그밖의 연결제(ligating agent)들로 이루어진다. DNA 단편들의 크기 선택을 위한 기구들(tools)과 길이가 긴 핵산분자들의 절단에 사용되는 약품, 완충제, 96-tip 또는 96-pin 기구들과 같은 다양한 다른 추가적인 조성물과 물질들이 키트들안에 포함될 수 있다. 키트들은 표지된 RNA 탐침들까지 포함하여, 탐침들이 RANase 처리에 의해 제거되고, 서열화 칩들이 재사용될 수 있도록 할수 있다.
제 1 도. 혼성화 공정을 위한 기본 단계들
단계 1 ; 서열화 또는 표지되지 않은 타아겟(target) DNA(T)가 고정된 올리고뉴클레외티드 탐침들의 배열과 특정의 조건들하에서 혼성화된다.
탐침 Fx와 Fy가 있는 부위가 묘사된다. Fx와 Fy에 대한 상보적인 염기서열들은 T의 다른 위치들에 존재한다.
단계 2 ; 표지된 탐침들인, Pi가 (칩당 한개의 탐침) 혼성화되어 배열된다. 묘사된 것은 Fy가 아닌 Fx에 인접하는 T 위의 상보적인 타아겟을 갖는 탐침이다. 단계 3 ; 선택적인 조건들 또는 시약들을 적용함으로써 인접한 탐침들이 없는 복합체들은 선택적으로 용융(melted) 된다. 하나의 특별한 예가 표지된 탐침과 고정된 탐침들의 연결이다. 여기에서 탐침과 표지된 탐침은 백 투 백(back to back) 상태로 혼성화한다. 포지티브 시그날들(positive signals)은 Fx와 Pi 같은, 인접한 탐침들의 경우에서만 감지되고, 하나의 특별한 예로 연결된 탐침들의 경우에 감지된다.
제2A도, 제2B도 및 제2C도는 전형적인 서열화 키트(Kit)의 구성요소들을 나타낸다.
제2A도. 올리고뉴클레외티드들의 배열과 동일한 (또는 다른) 배열들을 갖는 각각의 4P 동일한 섹션들의 배열을 나타내는 서열화 칩들(sequencing chips) 섹션들은 물리적인 장애물들 또는 소수성 스트립들(strips)에 의하여 분리될 수 있다. 4,000~16,000의 올리고칩들이 배열에 존재하는 것이 고려된다.
제2B도는 그 지역에 위치하거나, 합성된 특정의 올리고뉴클레오티드 탐침(4,000~16,000)을 갖는 것들의 4F 부위들(spots)을 갖는 칩(chip) 섹션(section)의 확대이다. 부위들(spots)은 여러개의 미크론들(microns)과 같은 작은 크기일 수 있으며, 섹션의 크기는 약 1~10mm이다.
제2C도는 한세트의 튜브들, 또는 적당한 수의 웰들(wells)(이 경우에는 4Pwells)을 갖는 한개 또는 그 이상의 멀티웰(multiwell) 플레이트들(plates)을 나타낸다. 각각의 웰은 일정양의 특이하게 표지된 올리고뉴클레오티드들을 담고 있다. 만일 표지가 합성동안에 이루어지지 않으면 추가적인 양의 탐침들이 표지되지 않은 채로 저장될 수 있고 ; 이 경우 서열화 키트는 탐침 표지에 필요한 구성요소들을 갖고 있을 것이다.
칩 섹션들을 갖는 튜브들(tubes)/웰들(wells)을 연결하는 선들은 일정량의 표지된 탐침들이 칩 섹션으로 옮겨지는 서열화 공정에서의 단계를 묘사한다. 이동(transferring)은 (한개의 또는 다중채널의) 피페팅(pipetting)에 의하여 이루어지거나 또는 표면장력에 의하여 액체를 이동시키는 핀 배열(pin array)에 의하여 이루어질 수 있다. 이동 기구들(transferring tools)은 또한 서열화 키트들안에 포함될 수 있다.
제3A도, 제3B도와 제3C도. 일정량의 DNA 분자의 무작위 절단에 의하여 생산된 DNA 단편들의 혼성화.
제3A도에서 DNA 단편은 T1은 고정화되고-표지된 탐침들과 고정화되지 않고-표지되지 않은 탐침들 양쪽 모두에 대한 완전한 타아겟들을 갖는 것이다. 제3B도는 DNA 단편 T가 적절하게 절단되지 않은 경우를 나타낸다. 제3C도에는 탐침 P가 혼성화하는 충분한 공간이 있다. 그러나 인접한 염기서열은 그것에 상보적이지 않다. B의 경우와 C의 경우 모두에 있어, 시그날(signal)은 고정화된 탐침 F 분자들의 포화에 따라 감소할 것이다. DNA 단편들과 표지된 탐침들의 동시 혼성화(Simultaneous Hybridization)와 혼성화 공정의 사이클링은 정확하게 인접한혼성화들의 생산을 증가시키게 하는 방법들이다.
제4도. 혼성화를 위한 말단부위에서 또는 링커(linker)으로서 통상의 염기(universal Base)의 이용. 통상의 염기들(M base, Nichols et al., 1994) 또는 4개 염기들 모두는 탐침 합성시 첨가될 수 있다. 이것이 탐침들의 길이를 증가시므로써 탐침들의 수를 증가시킴이 없이 듀플렉스(duplex)의 안정성을 증가시키는 방법이다. 또한 탐침들의 유리말단에 있는 통상의 염기들의 이용은 다른 프레임에서 염기서열이 읽혀질 수 있도록 하는 스페이서를 제공한다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
핵산분자의 염기서열의 결정은, 기초와 응용 생물학 연구(Drmanac & Crkvenjakov. 1990)의 모든 영역에서 매우 유용하다. 본 발명은 핵산 분자들의 분석 및 서열화에 이용되는 새롭고도 효율적인 방법들을 제공한다. 본 발명의 방법은 다른 서열화 테크닉들과 결합하여, 휴먼 게놈 프로젝트(Human Genome Project)에 관한 작업에도 이용될 수 있다.
현재, 혼성화 및 SBH에 의한 두가지의 서열화 방법들이 알려져 있다. 먼저, 포멧 1에서, 길이가 악 100∼2,000 뉴클레오티드들까지 되는 미지의 게놈 DNA들 또는 올리고뉴클레오티드들이 고형 기질(Substrate)위에 배열된다. 이 DNA 들은 보통 6-mers∼8-mers인 한세트의 표지된 탐침들을 가지고 혼성화함으로써 탐문(interrogated)된다. 역의 테크닉인 포멧 2에서 6∼8 뉴클레오티드의 올리고머들이 고형 지지체위에 고정화되어 클론되고 표지된 DNA의 조각들을 연결하도록 한다.
SBH 분석의 한 종류에서는, 최종 염기서열에 도달하기 위하여 많은 단계들이 포함된다. 현재의 SBH 방법들의 특별한 문제들은 효과적이면서 선택성이 있는 혼성화가 어렵고 많은 수의 탐침들을 합성해야 한다는 것이다.
매치(Full match)-미스매치(mismatch) 차별화는 두가지 주요 이유들 때문에 어렵다.
먼저, 10염기보다 더긴 탐침들의 말단 미스매치는 매우 식별력이 없고, 둘째, 긴 DNA 단편을 분석할 때, 생성되는 표지된 DNA 조각들의 복합혼합물은 높은-백그라운드(high background)를 발생시킨다.
본 발명은 많은 수의 탐침들 또는 탐침들 길이의 증가가 없이 효과적이고 선택적인 혼성화를 제공한다. 그리고 또한, 각각의 공지의 SBH 방법의 특별한 단점인, 많은 표지와 클로닝 단계들을 또한 제거한다.
포맷 3 서열화이라 불리우는, 개시된 매우 효율적인 핵산 서열화 방법은 두세트의 알려진 염기서열을 갖는 작은 올리고뉴클레오티드를 가지고 혼성화하는 것에 기초를 두며, 따라서 최소한 염기서열의 두배의 길이가 결정될 수 있다. 이 방법들은 크로모좀을 포함하는 매우 큰 핵산 분자들을 서열화하고, 예를들면, 많은 핵산 단편들의 고정 또는 표지와 같은 SBH가 갖는 여러가지 문제점들을 해결한다. 이것은 또한 RNA와 확대되지 않은 RNA 샘플들을 서열화하는데 이용되므로 매우 효능이 있다.
미국일련(Serial)번호. 08/127,402와 드르마낙(Dramanac)(1994)에서 개시된 것과 같은 본건 발명에 뒤이은, SBH의 또다른 변이(variation)는 위치상의(positional) SBH(PSBH)[Broude et al., 1994)라 기술된다. PSBH는 기본적으로 포맷 2 SBH (공지의 염기서열을 갖는 올리고뉴클레오티드이 고정화되어 이미 표지된 미지의 염기서열을 갖는 핵산들과 혼성화함)의 변형이다. PSBH에서 고정화된 탐침들을 단순한 단일 가닥의 탐침들이기 보다는 단일 가닥의 3' 돌출부위를 갖는 듀플렉스들(duplexes)이다. 비오틴레이티드(Biotinylated) 듀플렉스(duplex) 탐침들은 스트렙타비딘-피복된 자기 구슬(Streptavidin-coated magnetic beads) 위에 고정화되어 일종의 고정화된 탐침을 이용하고, 그 다음에 시퀀싱될 32P-표지된 타겟 핵산들과 함께 섞인다. T4 DNA리가제는 그 다음에 부가되어 혼성화된 타아겟 DNA를 듀플렉스(duplex) 탐침의 더 짧은 말단에 연결시킨다.
그러나 흥이로운 접근을 보여줌에도 불구하고 PSBH(Broude 등에 의해 보고된 것처럼, 1994)는 현존의 SBH 기술에 대하여 의미있는 진보는 보여주지 않는다.
예를들면, 본 발명의 포멧 3 방법론과 다르게 PSBH는 방법의 한 라운드(round)에서 결정될 수 있는 염기서열의 길이를 연장시키지는 않는다. PSBH는 또한 포맷 3에서 요구되지 않는 미지의 타아겟 DNA를 표지해야 하므로 귀찮다. 일반적으로 PSBH는 새로운 게놈 서열화보다는 매핑(mapping) 또는 비교연구들에 쓰인다. 따라서, 비록 서열화의 모든 영역에 적용가능하지만 이것은 가장 큰 게놈을 서열화하는데 사용하는 데 있어 매우 효능있는 도구인 포멧 3과는 매우 다르다.
서열화될 핵산은 먼저 단편화된다. 이것은 예를들면, 제한효소 절단에 의한, 특히 피처랄드(Fitzgerald) 등(1992)에 의하여 개시된 Cvi JI과 함께, 초음파 처리와 같은 물리적 방법에 의한 절단 ; 수산화나트륨처리 등과 같은 방법들에 의하여행해질 수 있다.
만일 원한다면 겔로부터 약 10~40염기쌍의 적당한 길이를 갖는 단편들을 잘라서 얻을 수 있다. 인간의 크로모좀과 같은 원형의 (original) 분자의 완전한 핵산 염기서열은 오버래핑(overlapping) F + P 염기서열의 조립(assemblage) 부분들과 원형의 분자내에 존재하는 F + P 염기서열들을 규정함(defining)으로써 결정할 수 있다. 따라서 이것은 단편 염기서열들을 결정하는 중간 단계를 필요로 하지 않으며, 전체 분자의 염기서열은 묘사된 F+P 염기서열들로부터 구성된다.
다음의 토의를 목적으로, 4개의 염기들이 서열화될 핵산들의 염기서열들을 구성한다는 것이 일반적으로 가정해야 한다.
이것들은 DNA에서의 A,G,C 및 T이고, RNA에서의 A,G,C 및 U이다. 그러나 어떤 구체예에서는, 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들에서의 변형된 염기들을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명을 수행하기 위하여, 일반적으로 먼저, 탐침의 길이에 대하여 염기서열들의 모든 조합들을 커버(cover)할 수 있는 규정된 길이의 짧은 작은 올리고뉴클레오티드 탐침들의 수를 준비해야 한다. 탐침의 길이를 N이라 하며 이 수는 4N(4의 N제곱)으로 표시된다. 예를들면, 6-mer 탐침에 대하여 4096개의 가능한 염기서열들이 존재한다(46=4096).
한 세트의 길이 F(4F)를 갖는 탐침들은, 1mm2또는 1cm2의 범위인, 마이크로칩(microchip) 위에 정사각형(square) 배열로 고정화된다. 이 예에서, 이것들은 64횡렬과 64종렬로 배열될 것이다. 통상 올리고탐침들은 마이크로칩 표면에 부착되거나 또는 고정화되어서 혼성화반응에 참여할 수 있어야 한다. 길이 P인 다른 세트의 올리고들(oligos)도, 4P의 수로, 역시 합성된다. 이 "P세트(set)"에서의 올리고들은 감지가능한 수준으로 표지되고 한세트의 튜브들에게로 분배된다(그림 2A, 그림 2B 및 그림 2C).
4P의 칩들은 큰 배열(또는 적당량 크기를 위해 약 10~100cm2의 여러개의 배열로)로 결합된다. 여기에서 P는 제2의 올리고 세트내에서 올리고뉴클레오티드들의 길이에 부합한다(그림 2A, 그림 2B 및 그림 2C). 다시 적당한 예로서 P가 6으로 선택된다(P=6).
서열화될 핵산들은 미지의 염기서열을 갖는 작은 핵산 단편들이 되도록 단편화된다. T라 불리우는 이 단편들의 평균길이는 F와 P의 결합 길이보다 일반적으로 커야하며 F의 길이의 약 3배가 된다(즉, F+P≤T이고, T%3F).
이 예에서는, 길이가 약 20 염기쌍인 핵산단편들을 생산하는 것을 목적으로 한다. 이 단편들은 상보적인 염기서열들의 혼성화물 용이하게 하는 조건들하에서 변성화되어 큰 배열들에 부착된다.
본 발명의 가장 간단하고 선호되는 형태에서, 만일 핵산 단편에 있는 6개의 연속적인 뉴클레오티드들이 F 올리고뉴클레오티드 탐침의 6 뉴클레오티드들 모두에 상보적이라면 상당한 혼성화의 발생을 가능케하는 혼성화 조건들이 선택된다. 소요시간 및 사용되는 완충제, 및 완충제의 PH와 같은 그러한 혼성화 조건들은, 온도, 여러가지 구성요소들의 농도, 각 단계에서의 통상적인 적정화(optimization) 파일롯 연구들에 의하여 결정된다.
이 단계에서, 각 마이크로칩은 일정한 혼성화된 복합체들을 함유한다. 이것들은, 탐침의 전 염기서열이 단편과 혼성화하는 탐침 : 단편 복합체와 형태로 있다. 그러나 길이가 더긴 단편은 복합체에 대하여 "꼬리(tail)" 또는 "꼬리들(tails)"을 형성하는 약간의 혼성화하지 않은 염기서열들을 갖고 있다. 이 애에서, 상보적인 혼성화된 염기서열들은 길이가 F이고, 혼성화하지 않은 염기서열들은 길이가 T-F이다. 단편의 상보적인 부분은 적당한 말단을 향하여 또는 그 위에 존재하고, 따라서 하나의 긴 혼성화하지 않은 꼬리가 형성된다.
선택적으로, 단편의 상보적인 부분은 반대의 말단을 향하고 있어, 두개의 혼성화하지 않은 꼬리들이 형성된다(제3A도, 제3B도 및 제3C도).
세척후에, 혼성화되지 않은 상보적이지 않은 핵산단편들을 제거한 후에, 세트 P내의 적은 양의 표지된 올리고뉴클레오티드들은 각 마이크로칩에 첨가하여, 탐침 : 단편 복합체들로부터 튀어나온 미지의 염기서열을 갖는 핵산 단편 꼬리들과 혼성화한다. 4P 뉴클레오티드들 중의 각각 한개씩 만이 각 마이크로칩에 첨가된다. 다시, 표지된 탐침의 6개의 뉴클레오티드들 모두가 핵산 단편 꼬리의 6개의 연속적인 뉴클레오리드들과 상보적이라면 상당한 결합이 가능한 혼성조건들을 이용하는 것이 선호되고 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 온도, 농도, 시간, 완충제 등이 적정화된 혼성화 조건들이 파일롯 연구들에 의하여 결정된다.
이 단계에서, 각 마이크로칩은 일정한 "2차의 혼성화된 복합체들"을 함유한다.
이것들은 탐침:단편:탐침 복합체들의 형태이며, 여기에서 각 탐침의 전 염기서열은 단편과 혼성화되고, 단편은 약간의 혼성화되지 않은 염기서열들을 갖는다. 이 2차 혼성화된 복합체들에서 고정화된 탐침과 표지된 탐침은 단편들과 혼성화하여 두개의 탐침들이 직접 인접하거나 "백 · 투 · 백(back to back)" 상태가 된다. 그러나, 단편들이 탐침들의 총길이보다 일반적으로 더 길때에는, 고정화된 탐침과 표지된 탐침은, 한개 또는 그 이상의 염기들에 의하여 분리되어 인접하지 않은 위치로, 단편들에 혼성화된다.
큰 배열들은 그 다음에, 혼성화되지 않은 표지된 탐침들을 제거하는 공정에 의해 처리된다.
바림직한 구체예에서, 이용되는 공정은 혼성화하지 않은 표지된 탐침들을 제거할 뿐만 아니라 인접하지도 않고 혼성화하지도 않은(non-adjacently-hybridized) 표지된 탐침들을 배열로부터 제거한다. 이 공정은 선택성이 있는 조건들을 이용하여 핵산 단편이 2개의 탐침들과 혼성화하지만 탐침들이 인접하여 있지는 않은 2차 혼성화 혼합체로부터 구별되는 인접하고 고정화되고 표지된 탐침들을 포함하는 2차 혼성화 혼합체들을 만들 수 있게 한다. 표지된 탐침과 고정화된 탐침의 결합된 염기서열에 상응하는 단편 염기서열의 섹션을 궁극적으로 묘사할 수 있도록 하는 것이 본 발명의 중요한 측면이다.
고정화되고 인접하고 혼성화된 탐침들이 방치된 동안 배열로부터 비혼성화되고 비-인접-혼성화된 탐침들을 제거하는 방법을 이용한 선택적인 공정은 조절된 세척 공정이다. 인접하고-혼성화된(adjacently-hybridized) 탐침들은 인접한 뉴클레오티들의 스태킹 반응들에 의해 증가되는 그들의 안정성에 기인하는 선택된 조건들에 의하여 영향을 받지 않는다. 그러나 바람직한 구체예에서 큰 배열들을 처리하여 약간의 인접한 탐침들을, 화학적 연결제 또는 좀더 바람직하게는 T4DNA 리가제와 같은 리가제 효소를 함유하는 용액으로 처리함으로써 공유 결합시키는 것이 고려되고 있다(Landegren 등. 1988 : Wu & Wallace 1989).
어쨌든 완전한(complete) 배열은 상기 배열과 결합되어 남아있는 유일한 표지(label)가 길이 "F + P"(즉, 본 발명의 예에서 12 뉴클레오티드들)인 이웃하고 혼성화된 부분을 가진 이중가닥 탐침-단편-탐침 복합체의 형태로 존재하도록 엄격한 세척 조건하에 놓여질 수 있다. 이 두단계의 혼성화 반응을 이용하여 하기와 같은 3~4개의 독립적이고 선택적인 공정들이 고려되기 때문에 큰 차별화가 가능하다.
F염기들 길이의 탐침에 대한 단편 T의 선택적인 혼성화 ;
단편 T에 대한 P 염기들 길이의 탐침의 선택적인 혼성화 ;
P 혼성체들 또는, 인접하지 않은(non-adjacent) F+P 탐침들을 갖는 미스매치된(mismatched) 혼성체들과 비교해 볼 때 풀 매치(full match)(F+T+P) 혼성체의 선택적인 안정도 ;
및 F와 P의 두 말단 염기들의 선택적인 연결.
배열위에 남아있는 표지의 위치를 관찰함으로써 소위 인접하는 2차 복합체들을 감지할 수 있다. 표지의 위치로부터, 단편들의 F+P(즉, 12) 뉴클레오티드 길이의 염기서열들이 고정화되고 표지된 탐침들의, 공지의 염기서열들과 결합하므로써결정된다.
인간의 크로모좀과 같은 원래의 분자의 완전한 핵산염기서열은 이렇게 결정된 오버래핑 F+P 염기서열들로부터 재구성되고 조합될 수 있다.
연결(ligation)이 서열화 공정에서 이용될 때, 최근에 선호되는 것처럼 보통의 올리고뉴클레오티드 칩은 재이용되지 않는다. 발명자는 여러가지의 방법들이 리사이클링에 유용하기 때문에 이것은 제한되지 않을 것이다라고 생각한다. 예를들면 탐침들 사이에 특이하게 절단가능한 결합을 발생시키고 감지후에 결합을 절단한다. 선택적으로, 2번째 탐침인, 탐침 P에 대하여 리보뉴클레오티드들을 이용할 수 있거나 또는 탐침 P에 연결 염기에 대하여 리보뉴클레오티드들을 이용하여 이 탐침들이 그후에 RNAase 또는 우라실-DNA 글리코실레이트(glycosylate) 처리에 의하여 제거될 수 있다(Craig et al., 1989). 고려되는 다른 방법들은, 선택적으로 절단될 수 있는 화학적 연결에 의해 결합들을 형성하는 것이다(Dolinnaya et al., 1988).
이 방법론에 대한 더 나아가서의 변이와 개선책들이, 또한 고려되며 본건 발명의 범위내에 존재한다. 이것은 Hoheisel & Lehrach에 의하여 묘사된 것과 유사한, 방법들의 특이성과 효율성을 증가시키는 변형된 올리고뉴클레오티드들의 이용을 포함한다. PCR 공학에서 사용되는 것처럼 사이클링 혼성화가 또한 이용되어 혼성화신호를 증가시킨다. 이러한 경우에 서로다른 온도를 이용하여 일정한 탐침들을 재혼성화한다. 본 발명은 또한 말단위치에 다른 염기를 갖는 동일한 몰수(equimolar)의 탐침들을 이용하여 리딩 프레임들(reading frames)에서 시푸트들(shifts)을 결정하게 해준다. 예를들면, 동일몰수의 7-mers에 있어 처음의 여섯개의 염기들은 동일하게 정의된 염기서열이고, 마지막 위치에는 선택적으로 A,T,C 또는 G가 올 수 있다.
다음의 예들은 본 발명의 바람직한 구체예들을 설명하기 위하여 포함한 것이다. 이 분야의 당업자들은, 뒤에오는 예들에서 개시된 발명가들에 의해 발견된, 테크닉들이 본 발명의 수행시 잘 작용할, 테크닉들임을 보여준다는 것을 인식하고 이 수행에 바람직한 방법을 구성하는 것이 고려되어야 한다.
그러나, 당업자들은, 본 발명 개시에 비추어 보아, 개시된 특정의 구체예에서 많은 응용이 가능하고, 본 발명의 정신과 범위내에서 유사하거나 비슷한 결과를 얻을 수 있다는 것을 인식해야 할 것이다.
실시예 I
올리고뉴클레오티드들이 결합된 지지체의 제조
올리고뉴클레오티드들, 즉 작은 핵산 조각(segment)들은 자동 올리고뉴클레오티드 합성장치를 사용하며 통상적으로 수행되는 것과 같이 화학적 방법에 의해 올리고뉴클레오티드를 직접 합성하므로써 쉽게 제조될 수 있다.
올리고뉴클레오티드들이 결합된 지지체는 유리(glass), 폴리스티렌 또는 테플론과 같은 적당한 지지체(support)를 사용하는 해당 기술분야의 당업자들에게 공지된 어떠한 방법에 의해서든지 제조될 수 있다. 그 하나의 방법은 표준 합성장치에 의해 합성된 올리고뉴클레오티드들을 정확하게 식별하는 것이다. 고정화(Immobilization)는 부동의 흡착방법을 사용 (Inouye & Hondo, 1990); UV를 사용하거나(Nagata et al., 1985 ; Dahlen et al., 1987 ; Morriey & Collins,1989) 또는 염기가 변형된 DNA의 공유결합에 의하여 (Keller et al., 1988 ; 1989)수행될 수 있다(여기에 모든 인용자료가 통합되어 있다).
적용될 수 있는 또 다른 방법은 링커(linker)로서 강한 비오틴-스트렙타비딘(biotin-streptavidin)의 상호작용을 이용하는 것이다. 예를 들면, 비록 복제 탐침들이지만 스트렙타비딘이 코팅된 자기 비이드(beads)상에 고정되는 비오틴화된 탐침들을 사용하는 방법이 브르드 등 (1994)에 의해 개시되어 있다. 다이날 사(Dynal, oslo)로부터 스트렙타비딘이 코팅된 비이드를 구입할 수 있다. 물론, 이와 같은 결합화학은 스트렙타비딘으로 코팅되는 어떠한 표면에도 적용된다. 비오틴화된 탐침들은 다양한 출처, 예를들면 오페론 테크놀로지(Alameda, CA)사로부터 구입할 수 있다.
또한 넝크 레버러토리스(Naperville, IL)사에서도 사용가능한 적당한 물질을 판매하고 있다. 넝크 레버러토리스사는 코바링크 NH(CovaLink NH)로 불리우는, 마이크로웰 표면에 DNA가 공유결합할 수 있는 방법을 개발하여 왔다. 코바링크 NH는 공유결합의 증진을 위해서 브리지-헤드(bridge-heads)로서 기여하는 이차 아민기(>NH)로 그라프트된 폴리스티렌 표면이다. 코바링크 모듈(Modules)은 넝크 레버러토리스로부터 구입할 수 있다. DNA 분자들은 5'-말단에서 코바링크와 배타적으로 포스포르아미데이트(phosphoramidate) 결합을 하여 1pmol 이상의 DNA를 고정화시킬 수 있다(Rasmussen et al., 1991).
5'-말단에서의 DNA 분자의 공유결합을 위해 코바링크 NH 스트립(strip)을 사용하는 기술이 개시되어 있다(Rasmussen et al., 1991). 이 기술에서는 포스포르아미데이트 결합이 적용된다(Chu et al., 1983). 이는 단지 단일 공유결합만을 사용하는 고정화가 바람직할 때에 유리하다. 폴리스티렌 표면상에 공유결합형으로 그라프트된 2nm 길이의 스폐이서 아암(spacer arm)의 말단에 위치한 코바링크 NH 2차 아미노기에 DNA가 포스포르아미데이트 결합으로 연결된다. 포스포르아미데이트 결합으로 코바링크 NH에 올리고뉴클레오티드를 연결시키기 위해서는, 올리고뉴클레오티드 말단에 5'-말단 포스페이트기가 있어야 한다. 형편에 따라서는, 비오틴이 코바링크에 공유결합한 다음에 탐침을 결합할 때 스트렙타비딘을 이용하는 것이 가능하다.
보다 상세하게는, 상기의 결합방법은 물에 DNA를 용해시키고 (7.5ng/μl) 10분 동안 95℃에서 변성시킨 다음 10분 동안 얼음으로 냉각시키는 과정을 포함한다. 이어서, 얼음처럼 차가운 0.1M의 1-메틸이미다졸, pH 7.0(1-MeIm7)을 최종농도의 10mM 1-MeIm7에 첨가한다. 그 다음에, ssDNA 용액을 얼음에 보관되어 있는 코바링크 NH 스트립(75μl/well)에 분배시킨다.
10mM 1-MeIm7에 용해되어 있는 카르보디이미드 0.2M 1-에탈-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드(EDC)를 새로이 제조한 다음, 웰(well)당 25μl를 첨가한다. 이 스트링을 50℃에서 5시간 동안 항온처리한다. 항온처리후, 먼저 웰을 3회 세척한 다음, 이들을 5분 동안 세척 용액으로 흠뻑 적신 다음(여기에서 세척용액은 0.4N NaOH, 50℃로 가열된 0.25% SDS), 마지막으로 이들을 3회 세척하는 단계로 이루어진 넝크-임뮤노(Nunc-Immuno)세척방법을 사용하여 상기 스트립을 세척한다.
본 발명에 더욱 적당한 방법은, 여기에 참조되어 있는 PCT 특허출원 제 Wo 90/03382 호(Southern & Maskos)에 개시되어 있는 것으로 예측된다. 지지체에 결합된 올리고뉴클레오티드의 제조방법은 지지체에 의해 수반되는 지방족 하이드록실기에 포스페이트기가 공유결합성 포스포디에스테르 결합을 하므로써 뉴클레오시드 3'-시약을 결합시키는 것을 포함한다. 그 다음에 올리고뉴클레오티드는 지지된 뉴클레오시드 상에 합성되며 지지체로 부터 올리고뉴클레오티드가 분해되지 않는 표준상태에서 합성 올리고뉴클레오티드 사슬로부터 보호기들이 제거된다. 적당한 시약으로는 뉴클레오시드 포스포르아미디트와 뉴클레오시드 하이드로젠 포스포레이트가 있다.
보다 상세하게는, 이 방법에 사용하기 위해서 유리 플레이트와 같은 지지체를 90℃에서 크실렌, 글리시드옥시프로필트리메톡시실란 및 미량의 디이소프로필에틸아민의 혼합물과 밤새도록 접촉시키므로써 유도화시킨다. 그 다음에 메탄올, 에테르로 철저하게 세척하고 공기 건조한다. 유도된 지지체를 촉매량의 진한 황산을 함유한 핵사에틸렌글리콜에서 아르곤 하의 80℃에서 밤새도록 교반하면서 가열시켜 알킬하이드록실 유도된 지지체를 얻게 된다. 메탄올 및 에탄올로 세척한 다음, 이 지지체를 진공상태에서 건조하고-20℃의 아르곤하에 보관한다.
올리고뉴클레오티드 합성은 유도된 유리판을 고형 지지체로서 사용하는 표준조건하에서 손으로 수행된다. 최초의 뉴클레오티드는 트리에틸암모늄염의 형태로 사용되는 3'-하이드로젠 포스페이트이다. 이 방법에 의해서 고순도의 올리고뉴클레오티드들이 결합된 지지체를 얻게 된다.
DNA 탐침 배열을 제조하기 위해서 온-칩(on-chip) 방법이 적용될 수 있다. 예를들면, 선택가능한(addressable) 레이저로 활성화된 광-탈보호(photodeprotection)단계가 유리표면상에서 직접 올리고뉴클레오티드들의 화학적 합성에 적용된다는 것이 포더 등(1991)에 의해 개시되어 있다. 또한, 탐침들은 반네스 등 (1991)이 개시한 바와 같이 나일론 지지체상에 고정될 수 있거나 ; 또는 던칸 & 카발리에르(1988)의 방법을 사용하여 테플론에 연결될 수 있다(여기에 모든 인용자료가 통합되어 있다). 장치의 마이크로가공에 사용되는 복합체의 공간적 직접 합성에 적용되는 디뉴클레오티드들의 직사광선(light-directed) 합성이 포더 등 (1991)에 의해 개시되어 있다. 이는 고형 지지체상에서의 화합물의 동시합성에 광선을 직접 사용하는 방법에 의거하고 있다. 마스크를 통하거나, 또는 공간적으로 선택가능한(addressable) 또 다른 수단에 의해 광선 또는 다른 형태의 에너지에 노출되는 패턴은 화학적 커플링에 활성화되는 지지체 영역을 결정하게 된다. 광선에 의한 활성화는 선택된 영역으로부터 광가변성(photolabile) 보호기들을 제거하는 결과로서 일어난다. 탈보호 단계 후, 광가변성 보호기를 갖는 최초 화합물은 전체표면에 노출되지만, 반응은 선행단계에서 광선에 의해 선택된 영역에서만 일어난다. 제2 마스크를 통하여 기질을 조명하여 제2의 보호된 빌딩블럭과의 반응을 위해 또다른 영역을 활성화시킨다. 이들 조명에 사용되는 마스크의 패턴 및 반응물의 서열은 최종 생성물과 이들의 위치를 한정하게 된다. 합성부위의 밀도는 공간적 선택도, 예를들면 빛의 회절에 대한 물리적 한계에 의해서만 한정되기 때문에, 고도의 소형화는 포터(Fodor)방법으로 가능하다. 각각의 화합물은 사용가능하며 그의위치를 정확하게 알게 된다. 따라서, 이러한 방법으로 제조된 올리고 칩(oligo chip)은 SBH에 사용된다.
포더 등 (1991)에 의해 개시된, 광선으로 활성화된 디뉴클레오티드의 형성은 다음과 같다. 5'-니트로베라트릴티미딘은 3'-O-티미딘아세테이트로부터 합성되었다. 염기로 탈보호된 후, 5'-니크로베라트릴 티미딘은 3'-하이드로실기로의 연결에 의해서 아민화된 기질에 결합되었다. 니트로베르트릴 보호기는 500μm 체커보오드(checkerboard) 마스크를 통한 조명에 의해서 제거되었다. 그 다음에 기질을 포스포르아미디트로 활성화된 2'-디옥시시티딘으로 처리하였다. 반응을 형광성으로 수행하기 위해서, 엑소사이클릭 아민에 결합되어 있는 FMOC로 보호된 아미노핵실 링커(linker)로 디옥시시티딘을 변형하였다. EMOC 보호기를 염기로 제거한 후, 기질을 FITC로 처리하므로써 디뉴클레오티드를 포함하는 영역이 형광성으로 분류되었다. 따라서, 이 방법에 의해서 올리고뉴클레오티드들이 결합된 지지체가 합성될 수 있다.
나일론 지지체에 올리고뉴클레오티드를 결합시키기 위해서는, 반네스 등 (1991)에 의해 개시된 바와 같이, 올리고뉴클레오티드들의 5'-아민과 시아누릭클로라이드의 선택적 활성화 및 알킬화에 의해서 나일론 표면을 활성하시키는 것이 다음과 같이 요구된다. 용매로서 사용되는 나일론 1-메틸-2-피롤리돈의 표면상에 아민 반응성 이미데이트 에스테르를 형성하기 위해서 트리에틸옥소늄 테트라플루오로보레이트를 사용하여 나일론 표면을 에틸화시킨다. 이 나일론 표면은 최대한의 가능성을 갖는 표면 영역에 영향을 미치기에는 아직 이르다.
올리고를 결합하도록 광범위한 아민 표면을 제공하는 중합체 코팅을 형성하기 위해서, 활성화된 표면은 폴리(에틸렌 이민)(Mr~10K-70K)과 반응하게 된다. 아민 말단 올리고뉴클레오티드(들)는 오직 아민 말단상에서 과량의 시아누릭클로라이드와 선택적으로 반응하므로써 4,6-디클로로-1,3,5-트리아지닐-올리고뉴클레오티드(들)을 정량적으로 수득하게 된다. 시아누릭 클로라이드 중의 하나의 클로린 성분의 아미노기로의 치환은 남아있는 클로린기들의 반응성을 상당히 감소시키게 된다. 이는 완충수용액(pH 8.3, 4℃, 1주일)에서 장기간 동안 안정화되며 용리 크로마토그래피 또는 한외여과에 의해 쉽게 분리 정제되는 4,6-디클로로-1,3,5-트리아지닐-올리고뉴클레오티드(들)의 가수분해 안정도를 증가시키게 된다.
상기 반응은 뉴클레오티드 부분상에서 명백한 반응이 전혀 없는 아민말단기에 고유한 것이다. PEI로 코팅된 나일론 표면은 시아누릭클로라이드로 활성화된 올리고뉴클레오티드와 반응하다. 고농도의 '포획(capture)' 서열은 표면상에 쉽게 고정화되며 유도화 공정의 최종 단계에서 미반응 아민은 숙신산무수물로 마무리된다.
광발생(light-generated)합성을 이용하여 올리고뉴클레오티드가 결합된 지지체의 특별한 제조방법이 피이스 등(1994, 여기에서 인용자료로 통합된)에 의해 개시되어 있다. 이들은 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침(DNA칩)의 배열을 생성하는 통상의 포토리토그래픽(photolithographic) 기술을 사용하였다. 고밀도이며 소규모 배열의 올리고뉴클레오티드 탐침의 합성에 광선을 직접 사용하는 방법은 광가변성(photolabile) 5'-보호된 N-아실-디옥시뉴클레오시드 포스포르아미디트,표면 링커 케미스트리 및 다방면의 조합 합성단계들을 사용한다. 이러한 방법에 의해서 공간적으로 한정된 256 올리고뉴클레오티드 탐침들의 매트릭스(matrix)가 생성된 다음, 여기에서 언급한 바와 같이 유리한 포맷 3 서열화(sequencing)에 사용된다.
피이스 등 (1994)은 직사광선 올리고뉴클레오티드 합성에 적당한 방법을 개시하고 있다. 이 방법에서는, 광가변성 보호기로 고정화된 고형 지지체의 표면이 포토리토그래픽 마스크를 통하여 조명되며, 조명된 영역에서 반응성 하이드록실기들을 생성하게 된다. 3'O-포스포르아미디트로 활성화된 디옥시뉴클레오시드(5'-하이드록실에서 광가변성기로 보호됨)는 표면에 제공되며 광선에 노출된 부위에서 커플링이 발생한다. 챔핑(capping) 및 산화 후, 기질을 물로 세척한 다음 표면을 제2마스크를 통하여 조명하여 커플링용 부가적 하이드록실기들을 노출시킨다.
제2의 5'-보호된 3'O포스포르아미디트로 활성화된 디옥시뉴클레오시드가 표면에 제공된다. 선택적 광-탈보호 및 커플링 사이클은 바람직한 정도의 생성물이 얻어질 때까지 되풀이된다. 포토리토그래피가 사용되기 때문에, 이 공정은 각각의 부위에서 배열이 공지된, 고밀도 배열의 올리고뉴클레오티드 탐침들을 생성하도록 소규모화될 수 있다.
필수적인 5'0-(α-메틸-6-니트로피페로닐옥시카보닐)-N-아실-2'-디옥시뉴클레오시드 포스포르아미디트(MeNPoc-N-아실-2'-디옥시뉴클레오시드 포스포르아미디트)를 제조하는 합성 경로는, 첫째 단계로서 1-(2-니트로-4,5-메틸렌디옥시페닐)에틸-1-클로로포르메이트와 N-아실-2'-디옥시뉴클레오시드가 반응하여 5'-MeNPoc-N-아실-2'-디옥시뉴클레오시드를 생성하는 것을 포함한다. 둘째 단계에서, 3'-하이드록실은 표준 절차에 따라 2-시아노에틸N,N'-디이소프로필클로로포스포르아미디트와 반응하여 5'-MeNPoc-N-아실-2'-디옥시뉴클레오시드-3'-O-(2-시아노에틸-N-N-디이소프로필)포스포르아미디트를 생성하게 된다. 광보호기는 통상의 포스포르아미디트 합성조건하에서 안정화되며, 수용성 염기로 제거될 수 있다. 이들 시약은 4℃ 아르곤하에서 장기간 보존가능하다.
MeNPoc-dT, MeNPoc-dCibu, MeNPoc-dGPAC및 MeNPoc-dAPAC에 대한 각각의 광분해 반감기는 28초, 31초, 27초 및 18초인 것으로 보고되어 왔다(Pease et al., 1994). 따라서, 리토그래픽 합성에서 MeNPoc 보호기들을 99% 이상 제거하는 것을 보장하기 위해서 4.5분의 조명시간(9×t1/2 MeNPoc-dC)이 추천되고 있다.
적당한 합성 지지체는 진한 NaOH에서의 글리닝(cleaning)에 이어서, 철저한 물세척에 의해 제조된 5.1×7.6cm 유리기질로 이루어진 것이다. 이어서 표면은 95% 에탄올 중의 10%(부피/부피) 비스(2-하이드록시에틸)아미노프로필 트리에톡시실란(Petrarch chemicals, Bristol, PA)용액으로 2시간 동안 유도화되고, 에탄올과 에테르로 철저하게 세척한 다음 40℃의 진공상태에서 건조시키고 100℃에서 15분 동안 가열하였다. 이와 같은 연구를 통하여, 합성 링커(linker)는 유도화된 기질과 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)-핵사에틸옥시-O-시아노에틸 포스포르아미디트의 반응에 의해서 결합된다.
요약하자면, 올리고뉴클레오티드 탐침의 합성을 개시하기 위해서, 적당한 디옥시뉴클레오시드 포스포르아미디트 유도체가 링커를 통하여 합성 지지체에 결합하게 된다. 이어서 포토리토그래픽 마스크의 800×12800μm의 구멍을 통한 조명에 의해서 지지체 영역은 합성을 위해서 활성화된다. 4-,5-,6-,7-,8-,9- 또는 10-mer 서열과 같은 필요한 서열을 생성하기 위해서 부가적 포스포르아미디트 합성 사이클(DMT로 보호된 디옥시뉴클레오시드에 의해서)이 수행될 수 있다. 이어서 포스페이트와 엑스사이클릭 아민 보호기들은 진한 NH4OH에 의해서 4시간 동안 제거되며, 기질은 워터-쟈켓(water-jacketed) 항온 혼성 챔버에서 고정될 수 있다.
물론, 상기한 바와 같은 광선으로 활성화된 칩들 중 하나인 DNA 칩을 제조업자들로부터 쉽게 구입할 수 있다. 이 점에 관해서는, 아피메트릭스(Affymetrix of Santa Clara, CA 95051)와 배크만(Beckman)과 연락하면 된다.
실시예 II
탐침에 사용되는 변형된 올리고뉴클레오티드들
혼성의 특이성 또는 효율성을 증진시키기 위해서 본 발명의 방법을 통하여 변형된 올리고뉴클레오티드들이 사용될 수 있다. 이를 위한 방법은 염기 변체에 의해 중성 뉴클레오티드들을 치환하는 것이다. 예를들면, C5 위치에 할로겐이 있는 피리미딘이 사용될 수 있다. 이는 염기 스태킹(stacking)에 영향을 미치므로써 복제 안정성을 증진시키는 것으로 여겨지고 있다. 2,6-디아미노퓨린도 역시 티미딘과 짝을 이루는 염기내에 제3의 수소결합을 제공하여 위하여 사용될 수 있으며, 그것에 의해서 DNA 복제물이 열적으로 안정하게 된다. 2,6-디아미노퓨린의 사용으로 짧은 올리고머들의 복제 안정성이 상당히 개선되는 것으로 보고되고 있다. 이의 혼입은 프라이머 어니일링(annealing)에 대한 보다 엄격한 조건을 허용하며, 그것에 의해서 복제형성의 특이성을 개선시키고 백그라운드(background) 문제점들 또는 보다 짧은 올리고머들의 사용을 억제시키게 된다.
이들 변형된 뉴클레오티드들의 삼중인산염화의 합성은 호헤이셀 & 레호라츠(1990, 여기에서 인용자료로 통합됨)에 의해 개시되어 있다. 5-클로로-2'-디옥시유리딘 및 2,6-디아미노퓨린-2'-디옥시뉴클레오시드는 시그마사로부터 간단히 구입된다. 인산화반응은 다음과 같이 수행된다 :
아르곤하에서 50mg의 건조 2-NH2-dAdo를 500μl의 건조 트리에틸포스페이트에서 교반하면서 처리한다. 25μl POCl3를 첨가한 다음 이 혼합물을 -20℃에서 항온처리한다. 이어서, 1mmol 피로인산을 0.95ml의 트리-n-부틸아민과 2ml의 메탄올에 용해시킨 다음 회전증발기에서 건조시킨다. 그 다음에, 5ml 피리딘으로부터 2회 증발시켜 건조하며, 두번째 증발 이전에 70μl의 트리-n-부틸아민을 첨가한다. 마지막으로 이를 2ml의 건조 디메틸 포름아미드에 용해시킨다.
-20℃에서 90분 후에 과량의 POCl3를 제거하기 위해서 인산화 혼합물을 증발시킨 다음 디메틸포름아미드 중의 트리-n-부틸암모늄 피로포스페이트를 첨가한다. 실온에서 1.5분 동안 항온처리한다. 이 반응은 5ml의 0.2M 트리에틸암모늄 비카보네이트(pH 7.6)를 첨가하고 4시간 동안 얼음에 보관하므로써 종결된다. 5-Cl-dUrd의 경우, 조건들은 동일하나 50μl의 POCl3를 첨가하지 않고 실온에서 4시간 동안인산화반응이 수행된다.
가수분해반응 후, 혼합물을 증발시키고 pH를 7.5로 맞춘 다음, 1부피의 디에틸에테르로 추출한다. 선형 경사의 0.15M~0.8M 트리에틸암모늄비카보네이트를 사용하는 Q-세파로스 컬럼(2.5×20cm)으로 생성물을 분리한다. 뉴클레오티드들을 동결 상태로 보관하는 것이 장기간에 걸쳐 안정하다.
니콜 등(1994)이 고안한 바와 같이, 구별되지 않는 염기 유사체 또는 보편적인 염기 역시 사용할 수 있다. 이 새로운 유사체인 1-(2'-디옥시-β-D-리보프라노실)-3-니트로피롤(M으로 표시됨)은 유전암호의 퇴화로 인하여 야기되는 문제점을 해결하고자 할 경우 또는 단편 펩타이드 서열 데이타만이 유효할 때 올리고뉴클레오티드 탐침들 및 프라이머들(primers)에 사용되기 위해 생성된다. 이 유사체는 DNA 복제물을 입체적으로 방해하지 않으면서 수소결합 상호작용을 최소화시키는 동안 스태킹(stacking)을 강화시킨다.
M 뉴클레오시드 유사체는 염기 짝지움 특이성에서의 수소결합의 역할을 감소시키기 위해 분자내(intra-) 및 분자간(inter-) 가닥 스태킹 상호작용을 증진시키면서, 헤테로 방향족 고리에 결합된 비양성자성 극성 치환체를 사용하여 스태킹 상호작용을 강화시키도록 고안되었다.
니콜 등 (1994)은 3-니트로피롤-2'-디옥시리보뉴클레오시드가 P-니트로아닐린과 구조적 및 전자적으로 유사하고, 그의 유사체가 공지된 이중가닥 DNA의 삽간물(intercalator)들 중에서 가장 작기 때문에 이를 선호하고 있다.
뉴글레오시드 M의 디메톡시트리틸로 보호된 포스포르아미디트도 역시서열화(sequencing) 및 폴리머라아제 체인 반응(PCR)을 위한 프라이머로서 사용되는 뉴클레오티드들에 혼입하기 위해 이용할 수 있다. 니콜 등 (1994)은 많은 뉴클레오티드들이 프라이며 특이성을 잃지 않으면서 M으로 대체가능함을 보이고 있다.
M의 유일한 성질은 인접한 뉴클레오시드들의 긴 단선(string)들을 대체하고 기능적인 서열화 프라이머들을 생성하는 것이다. 3,6 및 9개의 M 치환체들을 갖는 서열들 모두가 판독가능한 서열화 래더들(ladders)을 제공하는 것으로 보고되어 왔으며, 3개의 상이한 M-함유 프라이머들을 갖는 PCR 모두가 정확한 생성물을 확대시키게 된다(Nichols et al., 1994).
프라이머로서 작용하는 3-니트로피를 함유 올리고뉴클레오티드들의 능력은 복제구조가 상보적인 가닥들로 형성되어야 함을 강하게 제안하고 있다. 올리고뉴클레오티드 쌍 d(5'-C2-T5XT5G2-3')과 d(5'-C2A5YA5G2-3')(여기에서 X 및 Y는 A,C,G,T 또는 M일 수 있다)에 대해서 얻어진 광학온도는 DNA 이중가닥의 단일 가닥으로의 전이에서 관찰되는 정상의 S자형 유형에 적당한 것으로 보고되었다. X · M 염기 쌍(여기에서 X는 A,C,G 또는 T이고 Y는 M이다)을 포함하는 올리고뉴클레오티드들의 Tm 값은 3℃ 범위내에서 모두 떨어지는 것으로 보고되었다(Nichols et al., 1994).
실시예 III
서열화 칩 및 배열(arrays)의 제조
본 실시예는 발명자가 관찰한 서열화 칩의 물리적인 구체예들을 예시하고 있다.
기본 실시예에서는20×20cm의 배열을 제공하도록 조합가능한 3×3mm 크기의 칩을 제조하기 위해서 50마이크론 표면에 결합한 6-mers를 사용하고 있다. 또 다른 실시예에서는 5×5mm 크기의 9-mer 칩을 제조하기 위해서 10×10 마이크론 표면에 결합한 9-mer 올리고뉴클레오티드들을 사용하고 있다. 이러한 4000유니트(units)의 칩들은 30×30cm 배열을 제조하는 데 사용될 수 있다. 제2A도, 제2B도 및 제2C도는 사각배열내에 4,000~16,000의 올리고칩들이 정렬되어 있는 배열의 또 다른 예를 도시하고 있다. 또한 도시된 바와 같이, 플레이트(plate) 또는 튜브집합체가 서열화 키트(kit)의 부분으로서 배열과 일괄포함될 수 있다.
상기 배열은 서로 물리적으로 분리되거나 소수성 표면에 의해서 분리될 수 있다. 소수성 스트립 분리를 이용하기에 가능한 하나의 방법은 이소-그리드 미생물학 시스템(Iso-Grid Microbiology system) (제작사 : QA Laboratories, Toronto, Canada) 기술을 사용하는 것이다.
분석 식품 미생물학에서 약 10년간 사용되어 온 소수성 그리드막 필터(HGMF)는 광범위한 수치의 유일한 친화력과 콜로니(colonies)의 자동계측을 나타낸다.
상업적으로 이용가능한 그리드(grid)는, 1600(40×40) 사각 세포들로 이루어진 검은 소수성 잉크 그리드가 프린트된 사각(60×60cm)의 폴리술폰 중합체(Gelman Tuffryn HT-450, 0.45μ pore size)로 이루어진 , QA 레보러터리사(Toronto, Canada)의 ISO-GRID™진공여과로 HGMF에 박테리아 현탁액을 미리 주입한 다음, 선정된 차별적 또는 선택적 매개수단상에서 항온처리한다.
미생물의 성장은 막상에서 그리드 세포의 공지된 위치 및 크기에 따라 한정되기 때문에, HGMF의 기능은 종래의 플레이트 또는 막 필터보다는 MPN 장치와 더욱 유사하다. 피터킨 등 (1987)은 HGMF 복제기를 사용할 때 게놈 수집물(genomic libraries)을 번식 및 저장하는 데 이 HGMF들을 사용할 수 있다고 보고하였다. 이와 같은 방법은 이소-그리드(ISO-GRID)의 1600 세포들 각각을 복제하며, HGMF의 많은 복제물을 제조할 수 있다(Peterkin et al., 1987).
샤프 등 (1987)도 역시 QA 레보러터리사의 이소-그리드 HGMF와, 자동 HGMF 계측기(MI-100 번역기) 및 RP-100 복제기를 사용하였다. 이들은 많은 미생물 배양을 보존하고 스크리닝(screening)하는 기술을 보고하였다.
피터킨 등은 소수성 그리드막 필터(Peterkin et al., 1989)를 사용하여 DNA 탐침들을 스크리닝하는 방법을 나중에 기술하였다. 이들은 직접 HGMF들 상에서의 효율적인 콜로니 혼성방법을 보고하였다. 이미 HGMF들이 프린트되어 있는 폴리술폰 중합체의 저 결합용량으로 인하여 불충분한 결과들이 얻어졌다. 그러나, 피터킨 등(1989)은, 복제 및 배양된 HGMF를 DNA와 접촉시키기에 앞서 폴리에틸렌이민, 다양이온(polycation)으로 처리하므로써 막표면에 대한 DNA의 결합을 증진시켰다. 비록 이 초기 공정은 세포 DNA 결합방법을 사용하고 본 발명과 상이한 목적을 가지고 있지만, 상기한 방법은 포맷 3 SBH에 쉽게 적용될 수 있다.
유용한 배열들을 신속하게 확인하기 위해서, 피터킨 등(1989)은 다양한 클론(clones)으로부터의 방사능 표지된 플라스미드 DNA를 사용하였으며, 제조된 HGMF들상의 DNA에 대한 그의 특이성을 시험하였다. 이 방법에 의하면, 재조합 플라스미드로부터의 DNA는 쉽게 복제가능한 HGMF 복제물 상에서 콜로니 혼성에 의해서100개의 유기체들에 대해서 신속하게 스크리닝되었다.
소형(2~3mm) 칩을 다루고 수천가지의 반응들을 나란히 수행함으로써 기본적인 두 문제점들을 해결하였다. 본 발명의 해결책은 상응하는 배열에서 칩들 및 탐침들을 보존하는 것이다. 예를들면, 250,000 9-mers를 포함하는 칩들은, 칩들 사이에 1mM 홈이 있는 8×12 포맷(96개의 칩들)에 배열된 8×8mM 플레이트 형태(15μM / 올리고뉴클레오티드, Pease et al., 1994)의 실리콘 웨이퍼(wafer)상에서 합성된다. 다채널(mulfichannel)피펫 또는 핀 배열에 의해서 하나의 칩에 대하여 하나의 탐침을 첨가한다. 4000 6-mers를 모두 기록하기 위해서, 상이한 것들을 사용하거나 또는 한 세트의 칩배열들은 여러 번 재사용하므로써 42 칩 배열들이 사용되어야 한다.
상기의 경우에서, 초기 명명법을 사용하며, F=9 ; P=6 ; 및 F+P=15이다. 칩들은 일반식이 BxNn인 탐침들을 포함할 수 있으며, 여기에서 X는 특정 염기(B)의 수이고 ; n은 비특정 염기의 수이며, X=4~10이고 n=1~4이다. 보다 효율적인 혼성이 이루어지고 지지체 올리고뉴클레오티드들의 내재적 영향을 회피하기 위해서, 특정 염기들이 비특정 염기들로 둘러싸일 수 있으며, 따라서 (N)nBx(N)m(제4도)와 같은 일반식으로 표시된다.
실시예 IV
핵산 단편들의 제조
배열된 핵산들은 cDNAs, 게놈 DNA, 염색체 DNA, 현미해부된 염색체 밴드들, 코스미드(cosmid) 또는 YAC 삽입물 및 어떠한 증식단계도 없는 mRNA를 포함하는RNA와 같은 적당한 근원으로부터 얻어질 수 있다. 예를들면, 샘브루크 등 (1989)은 포유동물 세포들로부터 고분자량의 DNA를 분리하기 위한 세가지 프로토콜(protocol)을 기술하고 있다(p. 9.14~9.23).
핵산들은 예를들면, 샘브루크 등(1989)이 9.24∼9.28에 기술한 바와 같이 제한 효소들을 사용하며, 초음파 및 NaOH 처리에 의해서 자르는 방법들을 포함하는 해당 기술분야의 당업자들에게 공지된 방법에 의해서 분절된다.
스크리퍼 등(1990, 여기에서 인용자료로 통합됨)이 기술한 바와 같이, 저압전단(shearing)도 역시 적당한 방법이다. 이 방법에 따르면, 압력을 조절하기 위해서 DNA 시료들을 저압에서 소형 프랑스식 압력 셀(Cell)을 통과시킨다. 레버(lever) 장치는 셀에 대한 압력을 저압으로 조절시킨다. 이들 연구 결과들은 저압 전단 방법은 음속(sonic) 및 효소적 DNA 분절방법에 택일적으로 유용함을 나타내었다. 적당한 DNA 분절방법의 하나는 피츠게랄드 등(1992)이 기술한, 이 염기 인식 엔도뉴클리아제인 CviJI를 사용하는 것이다. 이들은 무차별의 클로닝(cloning) 및 서열화에 적당한 특정의 크기로 DNA를 신속하게 분절 및 분획하는 데 접근했음을 기술하였다. 이는 또한 본 발명의 서열화 기술에 사용되는 상대적으로 작은 단편의 DNA를 무차별적으로 생성하는 데에 특히 유용하다는 것을 본 발명자는 예측하였다.
제한 엔도뉴클리아제인 CviJI는 일반적으로 무딘 말단을 남겨두기 위해서 인식서열 PuGCPy의 G와 C 사이를 절단시킨다. 이 효소(CviJI**)의 특이성이 변하는 비정형적인 반응조건 하에서, 소분자 pUC19(2688 염기쌍)로부터 유사무차별(quasi-random)분배의 DNA 단편들을 얻게 된다. 피츠게랄드 등(1992)은 이러한 분절방법의 무차별성(randomness)을, 빠른 겔 여과법으로 크기별로 분획하고, 수복됨이 없이, 클로닝 벡터(lacz minus M13)에 직접 연결된 pUC19의 CviJI** 다이제스트(digest)를 사용하여 정량분석하였다.
76 클론의 배열분석은, CviJI**가 PuGCPy 부위뿐 아니라 PyGCPy와 PuGCPu를 제한하며 무차별 분절과 일치하는 속도로 새로운 서열 데이타가 누적됨을 나타내었다.
인용자료에 기재된 바와 같이, 음파파쇄(sonication) 및 아가로스(agarose) 겔 분획법에 비유되는 상기와 같은 방법의 유리한 점들은 다음과 같다 : 보다 소량의 DNA가 요구되고(2~5μg 대신 0.2~0.5μg 요구) : 보다 적은 단계들을 거치게 된다(예비연결(preligation), 말단 수복(end repair), 화학저 추출단계가 없거나, 또는 아가로스겔 전기이동 및 용리액이 필요없다). 이러한 유리한 점들은 포맷 3에 의해서 서열화하기 위한 DNA를 재조할 경우에도 역시 제안된다.
핵산 단편들을 얻거나 제조하는 방법과는 무관하게, 혼성에 사용할 수 있는 단일 가닥의 단편들을 저공하기 위해서 DNA를 변성시키는 것이 중요하다. 이는 DNA 용액을 80~90℃에서 2~5분 동안 항온처리하므로써 이루어진다. 이 용액을 2℃로 신속하게 냉각시켜 DNA 단편들이 칩과 접촉하기 전에 재변성되는 것을 막는다. 실시예 VI에서 상기한 바와 같이, 게놈 DNA로부터 포스폐이트기들을 제거하여야 한다.
실시예 V
표지(label) 탐침들의 제조
올리고뉴클레오티드 탐침들은 해당 기술분야의 당업자들에게 통상적인, 예를들면 응용 바이오시스템을 사용하는 자동합성방법에 의해서 제조될 수 있다. 택일적으로, 탐침들은 다공성 테플론 웨이퍼들을 사용하는 게노시 바이오테크놀로지사(Genosys Biotechnologies Inc.)의 방법에 의해서 제조될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 탐침들은 예를들면, 100∼200μm 또는 100∼400μm 점적을 갖는 배열에 대한 방사성 표지(35S, 32P, 33P 및 바람직하게는 33P) ; 비 방사성 동위원소(Jacobsen et al., 1990) ; 또는 형광단(Brumbaugh et al., 1988)으로 표지(label)될 수 있다.
이와 같은 모든 표지방법들은, 샘브루크 등(1989) 슈베르트 등(1990)이, 무라까미 등(1991) 및 카트 등(1991)이 기술한 바와 같이, 해당 기술분야에서는 통상적인 것들이다.
방사성 표지에 관한 통상적인 방법으로는 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제(T4 Polynucleotide Kinase)를 사용하는 말단표지방법 또는 클레나우(Klenow) 또는 T7 폴리머라아제를 사용하는 높은 활성도 표지방법이 있다. 이들을 다음과 같이 설명하였다.
합성 올리고뉴클레오티드들은 이들의 5' 말단에 포스페이트기 없이 합성되며, 따라서 박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 사용하는 [γ-32P]ATP 또는 [γ-33P]ATP로부터 γ-32P 또는 γ-33P의 전이에 의해서 쉽게 표지된다. 반응이 효율적으로 수행된다면, 이와 같은 탐침들의 고유활성도는 [γ-32P]ATP 또는 [γ-33P]ATP 자체의 고유활성도 만큼 높아질 수 있다. 하기에서 설명되는 반응은 10 pmoles의 올리고뉴클레오티드을 높은 고유활성도로 표지되도록 고안된 것이다. 상이한 양의 올리고뉴클레오티드의 표지는 모든 성분들의 농도를 일정하게 유지시키면서 반응의 규모를 증가 또는 감소시키므로써 쉽게 이루어진다.
1.0μl의 올리고뉴클레오티드(10 pmoles/μl); 2.0μl의 10×박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 키나아게 완충액 : 5.0μl의 [γ-32P]ATP 또는 [γ-33P]ATP(sp. act. 5000ci/mmole : 10mCi/ml 수용액)(10 pmoles); 및 11.4μl의 물을 사용하여 반응혼합물을 제조한다. 잘 혼합된 이 반응 혼합물에 8유니트(~1μl)의 박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 첨가한 다음, 37℃에서 45분 동안 항온처리한다. 박테리오파아지 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제가 비활성화되도록 68℃에서 10분 동안 반응물을 가열한다.
올리고뉴클레오티드로의 32P 또는 33P의 전이 효율성 및 이의 고유활성도가 결정된다. 탐침의 고유활성도가 인정된다면 정제시킨다. 고유활성도가 매우 낮다면, 8유니트의 효소를 부가적으로 첨가하고, 효소를 비활성화시키기 위해 68℃에서 10분 동안 반응물을 가열하기 이전에, 37℃에서 30분 더 항온처리한다.
에탄올에 의한 침전법 ; 세틸피리디늄 브로미드에 의한 침전법 ; 바이오겔(bio-gel) p-60을 통한 크로마토그래피 ; 또는 Sep-Pak C18컬럼 크로마토그래피로 방사성 표지된 올리고뉴클레오티드들을 정제시킨다.
합성 올리고뉴클레오티드에 상보적인 DNA 가닥을 합성하기 위해서 R. Coli.DNA 폴리머라아제 I의 클레나우(Klenow) 단편을 사용하여 보다 높은 고유활성도를 갖는 탐침들을 얻을 수 있다. 짧은 프라이머는, 바람직한 방사성 표지 탐침에 대해서 상보적인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 주형(template)으로 혼성화된다. 이 프라이머는 주형지향(template-directred)법으로 [α-32P]dNTPs 또는 [α-33P]dNTPs를 혼입하기 위해서 E. Coli. DNA 폴리머라아제 I의 클레나우 단편을 사용하여 연장된다. 이 반응 후, 주형 및 생성물을 변성시킨 다음, 변성조건하에서 폴리아크릴아미드겔을 통한 전기이동으로 분리한다. 이 방법으로, 올리고뉴클레오티드 분자당 여러개의 방사성 원자들을 포함하는 올리고뉴클레오티드 탐침들을 얻는 것이 가능하다.
상기 방법을 사용하기 위해서는, 모든 주형가닥들의 합성을 완료시키기에 충분하고 원하는 고유활성도를 얻기에 필요한 [α-32P]dNTPs 또는 [α-33P]dNTPs의 측정량을 마이크로퓨즈(microfuge) 튜브에서 혼합한다. 반응하는 동안 어떠한 단계에서도 dNTPs의 농도는 적어도 1μM이 되어야 한다. 프라이머가 주형에 비하여 3 내지 10배의 물로 존재하도록 적절량의 프라이머 및 주형 DNAs를 튜브에 첨가한다.
이어서, 0.1부피의 10×클레나우 완충액을 첨가하고 잘 혼합한다. 반응물 5μl 당 E. Coli. DNA 폴리머라아제 I의 클레나우 단편 2~4units를 첨가한 다음 혼합하고 4℃에서 2-3시간 동안 항온저리한다. 바람직하다면, 소량 (0.1μl)의 앨리컷(aliquots)을 제거하고 10% 트리클로로아세트산(TCA)으로 침전될 수 있는 방사능의 비율을 측정하므로써 반응의 진행을 모니터할 수 있다.
상기 반응물을 같은 부피의 겔적재(gel-loading)완충액으로 희석하고, 80℃에서 3분동안 가열한 다음 전체 시료를 변성 폴리아크릴아미드겔상에 적재한다. 전기이동에 이어서, 겔을 방사성 자동사진법으로 측정하여 탐침이 국한 배치되게 하고 겔로부터 제거한다.
다양한 형광표지 방법을 다음과 같이 사용할 수 있다. 브룸바우 등(1988)은 형광표지된 프라이머의 합성을 기술하고 있다. C-5에 결합된 12개의 원자들의 일차아민 "링커 아암(linker arm)"을 갖는 디옥시유리딘 유사체가 합성된다. 이 유사체의 합성은 유기금속중간물질을 통한 2'-디옥시유리딘의 유도화로 5'-(메톡시프로페노일)-2'-디옥시유리딘을 생성하는 것으로 이루어진다. 디메톡시트리틸-클로라이드와의 반응으로 상응하는 5'-디메톡시트리틸 첨가생성물을 생성하게 된다. 메틸에스테르는 가수분해 및 활성화된 다음, 적당히 모노아실화된 아킬디아민과 반응한다. 정제 후, 생성된 링커 아암 뉴클레오시드들은 화학적 올리고뉴클레오티드 합성에 적당한 뉴클레오시드 유사체들로 전환된다.
이어서, 변형된 포스포리디트 케미스트리(phosphoridite chemstry)에 의해서 하나 또는 두개의 링커 아암 베이스를 포함하는 올리고뉴클레오티드들이 제조된다. 25μl의 500mM 소듐비가보네이트(pH 9.4)중의 50nmol 링커 아암 올리고뉴클레오티드 용액에 디메틸술폭시드 중의 300mM FITC 20μl를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반한다. 최초 UV흡수 피크에 있는 분획들을 혼합하면서, 20mM 암모늄 아세테이트(pH 6)를 사용하여 1×30cm 세파덱스 G-25컬럼으로 용리전개시키므로써 유리 FITC로부터 올리고뉴클레오티드를 분리한다.
일반적으로 5'-말단에서의 올리고뉴클레오티드의 초기 형광표지는 다음의 두단계를 포함한다. 첫째, 자동 DNA합성 동안 N-보호 아미노알킬포스포르아미디트 유도체를 올리고뉴클레오티드의 5'-말단에 첨가한다. 모든 보호기들을 제거한 후, 적당한 형광염료의 NHS 에스테르가 5'-아미노기와 결합한 다음, 역상 HPLC 또는 PAGE를 사용하여 과량의 염료로부터 표지 올리고뉴클레오티드를 정제한다.
슈베르트 등(1990)은 자동 DNA합성 동안 플루오레세인을 사용하여 표지 올리고뉴클레오티드들을 생성하는 포스포르아미디트 합성을 기술하고 있다. 플로오레세인 메틸에스테르는 DMF중의 KI 및 K2CO3의 존재하에서 17시간 동안 4-클로로(4,4'-디메톡시트리틸)부탄올-1과 알킬화반응하다. 트리틸기를 클로로포름 중의 1% TFA로 제거한 후, 생성물은 비스(디이소프로필아미노)메톡시포스핀으로 표준공정에 따라 아인산화된다. 상기에서 얻어진 플루오레세인 유도체의 인산화반응으로 바람직한 수율의 H-포스포네이트를 얻는다. 생성된 아미디트(건조 아세토니트릴 중의 0.1M 용액)는 β-시아노에틸 포스포르아미디트 케미스트리 및 DNA 합성기를 사용하는 상이한 프라이머들의 자동합성에 사용된다. 지지체트로부터의 분해 및 탈보호는 25% 암모늄수용액으로 실온에서 36시간 동안 수행된다. 초기 생성물은 PAGE로 정제되며, 표지 프라이머는 310mm에서 엷은 녹색의 형광밴드로서 관찰된다. RP18 카트리지(Cartridges)를 사용하는 탈염 및 용리전개에 의해서 바람직한 생성물을 수득하게 된다.
슈베르트(schubert)법에 따른 탐침의 5'-말단의 형광표지는 DNA 합성 동안 마지막 커플링 사이클에서 직접 이루어진다. 커플링 수율은 포스포르아미디트를 사용하는 것 만큼 높다. 스피드 진공을 이용한 얼림 건조법 또는 에탄올 침전법으로 암모니아를 탈보호 및 제거한 후, 형광표지 올리고뉴클레오티드는 포맷 3 SBH에서 DNA 서열화에 직접 사용될 수 있다.
무라까미 등도 역시 형광 표지 올리고뉴클레오티드들의 제조를 기술하고 있다. 이 합성은 폴리머 지지 포스포르아미디트 및 하이드로젠 포스포네이트 법을 근거로 하고 있다. 에틸렌디아민 또는 헥사메틸렌디아민은 한계제(tether)로서 사용된다. 이들은 포스포르아이디트 결합을 통하여 도입되며, CCl4용액에서의 하이드로젠-포스포네이트 중간물의 산화에 의해서 형성된다. 변형된 올리고뉴클레이티드들은 비이드상에서 일차 아민 지향 시약 FITC를 사용하여 표지된다. 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 비드로부터 분해되고, 이어서 RPLC에 의해서 정제된다.
카트 등 (1991)은 탐침을 검출하기 위해서 화학발광(Chemiluminescent)기질(AMPPD)과 양립하여 알칼리성 포스파타아제에 직접 콘쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 탐침들을 사용하는 것을 기술하고 있다. 알칼리성 포스파타아제는 올리고뉴클레오티드의 변형염기와 공유결합할 수 있다. 혼성화 후, 올리고(oligo)는 AMPDD로 배양된다. 알칼리성 포스파타아제 효소는, 들뜸(excitation)이 없이 즉 레이저를 필요로 하지 않고 형광을 내는 혼합물을 수득하기 위해서 AMPDD를 분해한다. 이러한 기술을 이용하면 강한 시그날이 발생한다고 여겨지고 있다.
표지 탐침들은 합성하기 보다는 GENsET를 포함한 여러 판매사들로부터 쉽게구입가능하다.
실시예 VI
포스페이트(phosphate)기의 제거
박테리아의 알칼리성 포스파타아제(BAP)와 송아지 장의 알칼리성 포스파타아제(CIP)는 DNA 및 RNA로부터 5'-포스페이트 잔기를 제거하는 데 촉매작용을 한다. 따라서, 이들은 연결(ligation) 및 부적당한 혼성을 방지하기 위해서 DNA 및/또는 RNA로부터 5' 포스페이트를 제거하는 데 적당하다. 샘브루크 등(1989)이 기술한 바와 같이, 포스페이트의 제거는 게놈 DNA를 절단한 후에 수행되다.
상기 두 알칼리성 포스파타아제 중에서 보다 활성이 큰 것은 BAP이며, 이는 또한 염 및 청정제(detergents)에 대해 훨씬 큰 내성을 갖는다.
따라서 탈인산화 반응의 최종단계에서 BAP를 완전하게 억제하는 것은 어렵다. 프로테이나아제 K는 CIP를 소화하는 데 사용되며, 후속 연결이 효율적으로 이루어지기를 원한다면 이는 완전하게 제거되어야 한다. 5mM EDTA(pH 8.0)의 존재하에서 1시간 동안 65℃(또는 10분 동안 75℃)로 가열시키므로써 CIP를 비활성화시킨 다음, 탈인산화된 DNA를 페놀:클로로포름으로 추출하므로써 정제시킨다.
실시예 VII
두 단계의 혼성화로 서열화 수행
본 발명자가 예측한 서열화 방법의 실행을 본 실시예에서 확실히 예시하고 있다. 첫째, 완전한 칩은 1억개의 염기쌍(인간의 염색체 1개)만큼 복합적인 DNA 혼합물과 혼성화된다. 혼성화를 수행하는 지침은 드르마낙 등(1990) ; 그랍코등(1991) ; 및 브르드 등(1994)이 기술한 인용자료로부터 알 수 있다. 이들은 포맷 3 SBH의 초기단계에서 사용되기에 적당한 혼성화 온도의 범위, 완충제 및 세척단계를 기술하고 있다.
특히 본 발명의 발명자들은 상대적으로 낮은 농도의 타아겟(target) DNA가 제공될 수 있기 때문에, 혼성화반응은 저온(-2~5℃)의 고농도의 염에서 여러시간에 걸쳐 수행된다는 것을 예측하였다. 이를 위해서, SSC 완충제가 소듐 포스페이트 완충제 대신 사용되며(Drmanac et al., 1990), 10℃에서 침전된다. 둘째 단계 때문에 광범위한 세척을 펼요로 하지 않으며(몇분) 혼성 사이클링이 고도의 복합성 DNA 시료들의 서열화에 사용될 때 완전하게 제거될 수 있다. 혼성화 및 세척단계가 표지 탐침들과의 두번째 혼성화 단계와 함께 계속되도록 동일한 완충제가 사용된다.
각각의 배열 즉, 8×8mm 배열(실시예 III)에 대해서 간단한 로보트장치를 사용하여 적당히 세척한 후, 표지 탐침 6-mer를 첨가한다. 42 조작에서 이를 수행하면서 96-팁(tip) 또는 96-핀(pin) 장치가 사용된다. 앞서 과학 인용자료에서 상기된 바와 같이, 다시 일련의 식별 조건이 적용될 수 있다.
특히 본 발명자는 다음 조건들을 예측하고 있다. 첫째, 표지 탐침들을 첨가하고 오직 저온(0∼5℃)에서만 몇분 동안 항온처리(고농도의 올리고뉴클레오티드들이 첨가되기 때문에)한 후, F+P 길이에 따라 온도를 3~10℃로 증가시킨 다음, 세척 완충제를 첨가한다. 이때 사용되는 세척완충제(즉, 100mM염)는 연결(ligation)반응과 양립할 수 있는 것이다. 리가아제(ligase)를 첨가한 후, 연결반응이 신속하게 수행되고(30분 이하) 혼성체들의 완전한 매치(match) 및 비매치(mismatch)가 더욱식별되도록 다시 온도를 15~37℃로 증가시킨다.
폰티어스 & 베르그 (1991, 여기에서 인용자료로 통합됨)가 기술한 바와 같이, 양이온성 청정제(detergent)도 역시 포맷 3SBH에서 사용되는 것으로 예측된다. 이들은 DNA 변성에서 두 양이온성 청정제, 디데실- 및 세틸트리메틸암모늄 브로미드(DATB 및 CTAB)를 사용한다고 기술하고 있다.
DTAB 및 CTAB는 하나의 메틸기가 12-탄소(DATB) 또는 16-탄소(CTAB) 알킬기로 치환된 사차 아민테트라메틸암모늄 브로미드(TMAB)의 변체(variant)들이다. TMAB는 용융 온도의 G-C 함량을 감소시키기 위해서 핵산 변성 실험에서 사용되는 시약인 테트라메틸암모늄이온의 브롬염이다. DTAB 및 CTAB는 SDS의 음전하설페이트가 양전하의 사차아민으로 치환되는 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 구조적으로 유사하다. SDS가 비특이성 결합을 감소시키며 뉴클리아제를 억제시키기 위해 혼성 완충제에 통상적으로 사용되는 반면, 이는 변성속도에 대해서는 크게 영향을 미치지 않는다.
연결방법이 사용될 때, 효소는 표지탐침들과 함께 또는 백그라운드를 감소시키는 적당한 세척단계 후에 첨가될 수 있다.
비록 이전에는 SBH 방법에서 사용하는 것으로 제안되지는 않았지만, 리가아제 기술은 분자 생물학 분야에서는 확립이 잘 되어있다. 예를들면, 후드 등은 리가아제-매개 유전자 검출 테크닉을 기술하였으며(Landegren et al. 1988), 그 방법은 포맷 3 SBH에 쉽게 적용될 수있다. 란데그렌 등은 상보적인 타아겟 DNA 분자에 대한 서로 인접한 두 올리고뉴클레오티드들이 즉시 어니일(anneal)되는 능력을 근거로하여 제공된 DNA 서열 존재에 대한 배열을 기술하고 있다. 접점에 위치한 뉴클레오티드들이 정확하게 염기쌍을 이룬다면, 두 올리고뉴클레오티드들은 DNA 리가아제의 작용에 의해서 공유결합하게 된다. 비록 이전에는 예측되지 않았지만, 이러한 상황은 포맷 3 서열화에서 일어난다. 우 & 월라스도 역시 인접하고 있는 짧은 합성 올리고뉴클레오티드들을 연결시키기 위한 박테리오파아지 T4 DNA 리가아제의 사용을 기술하고 있다. 이들 올리고 연결반응은 50mM 트리스 HCl pH 7.6, 10mM MgCl2, 1mM ATP, 1mM DTT 및 5% PEG에서 수행되었다. T4 DNA 리가아제(1 unit ; Bethesda Research Laboratory)를 첨가하기 이전에 반응물을 5∼10분 동안 100℃로 가열시킨 다음 0℃로 냉각시켰다. 대부분 연결반응은 30℃에서 수행되며 5분 동안 100℃로 가열시키므로써 종결된다.
근접하여 혼성화되거나 또는 연결된 (F+P)길이의 올리고뉴클레오티드들의 식별에 적당한 최종 세척이 수행된다. 이 세척단계는 연결되지 않은 모든 표지탐침들 및 기타 모든 화합물들을 씻어내어 백그라운드를 최대한 감소시키기 위해서 40~60℃에서 몇 분 동안 물에서 수행된다. 공유결합된 표지 올리고뉴클레오티드들 때문에 검출은 간단한다(무리한 저온 및 시간이 포함되지 않는다).
사용되는 표지에 따라서, 칩들의 이미징(imaging)은 상이한 기구들을 사용하여 수행된다. 방사능 표지에 대해서는, 스캐너(scanner)로서 포스포이미저(PhosphorImager) 및 포스포 저장 스크린 기술이 사용될 수 있다(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). 칩들을 카세트에 넣고 인(P) 스크린으로 덮는다. 1~4시간 노출시킨 후, 스크린을 주사(scan)하고, 이미지 파일을 컴퓨터 하드 디스크에 저장한다. 형광표지를 검출하기 위해서, CCD 카메라 및 에피형광(epifulorescent) 또는 콘포콜(confocal) 현미기술이 사용된다. CCD 카메라의 픽셀(pixels)상에 직접 생성된 칩들에 대해서는, 검출은 에거스 등(1994, 여기에서 인용자료로 통합됨)이 기술한 바와 같이 수행될 수 있다.
전하-짝지움 장치(CCD)검출기들은 탐침-기저 배열들에서 표지 타아겟 분자들의 분포를 정량적으로 검출하고 이미지화(image)하는 활성 고형 지지체들로서 기여한다. 이 장치들은 고도의 평행배열, 과민성 검출, 높은 생산고(throughput), 통합된 데이타 습득 및 계산을 수용하는 마이크로일렉트로닉스(microelectronics)의 고유성질들을 이용한다. 에거스 등(1994)은 높은 민감도 및 적용된 직접 커플링으로 인하여 곧바로 정량평가가 되는, 본 발명의 포맷 3 SBH와 같은 탐침-기저 배열로 사용하는 CCDs를 기술하고 있다.
통합 CCD 검출방법은 칩에 대한 분자결합을 검출가능하게 한다. 검출기는 시료를 유일하게 특징지우는 2차원 패턴을 신속하게 나타낸다. CCD-기저 분자검출기의 고유작동에서, 생물학적 탐침들은 CCD의 픽셀상에서 바로 고정되거나, 또는 CCD 표면에 위치한 배치가능한 커버 슬립(slip)에 결합될 수 있다. 이 시료분자들은 방사성 동위원소, 화학적 발광 또는 형광꼬리표로 표지될 수 있다.
CCD-기저 탐침 배열에 시료가 노출되자 마자, 포맷 3의 경우는 시료가 두 상보적 탐침들과 결합한 픽셀 위치에서 광양자 또는 방사성 동위원소 붕괴 생성물이 방출하게 된다. 표지 시료로부터의 하전입자들 또는 방사선이 CCD 게이트(gate)상에서 부수될 때, 실리콘에서 전자 구멍쌍이 생기게 된다. 전자들이 인접한 CCD 게이트들 아래에 포집되고 디스플레이 모듈상에서 연속적으로 판독된다. 각각의 픽셀에서 발생되는 광전자의 갯수는 그러한 부근에서 발생하는 분자결합의 갯수에 직접 비례한다. 결과적으로, 분자결합은 정량적으로 결정될 수 있다(Eggers et al., 1994).
최근에 보고된 바와 같이, 실리콘-기저 CCDs는 넓은 범위의 파장(1∼10000Å)에 걸친 고감도의 장치이기 때문에 주로 고형상태 검출 및 이미징(imaging)센서로서의 유리한 점을 가지고 있다. 실리콘은 가시스펙트럼으로부터 방출된 전자기 방사선과 소프트 X선에 대해서 매우 반응성이 크다. 가시광선의 경우, CCD 게이트 상에 부수되는 단일 광양자는 게이트 아래에서 단일 전자 전하 충전물(packet)로 된다. 단일 소프트 X선 베타 입자(전형적으로 KeV 내지 MeV 범위)는 수만개의 전자들에 대해서 수천 개 발생하게 된다. 높은 민감도 뿐 아니라, 에거스 등(1994)이 기술한 CCDs는, 검출가능한 전하 충전물이 105개 이내의 전자 범위에 걸쳐 있기 때문에 넓은 동적 범위(4∼5등급의 크기)를 제공한다. 검출반응은 넓은 동적 범위에 걸쳐서 선형(linear)을 갖는다.
시료에 근접하여 이미징 배열을 배치함으로써, 포집 효율성은 종래의 CCD 카메라에서 발견된 것들과 같은 랜즈-기저 테크닉에 걸쳐서 적어도 10의 비율로 개선된다. 즉, 시료(에미터)는 검출기(이미징 배열)과 가까이 접촉되며, 이는 렌즈 및 거울과 같은 통상의 이미징 광학물체를 제거하게 된다.
방사성 동위원소가 리포터(reporter) 군으로서 타아겟 분자에 결합될 때, 에너지 입자들이 검출된다. 다양한 에너지의 입자들을 방출하는 여러 리포터 군들은 32P,33P,35S,14C 및 125L을 포함하여, 미세조립검출기들에 의해서 성공적으로 이용되어 왔다. 32P로부터 유래되는 것과 같은 보다 높은 에너지 입자들은 가장 높은 분자검출민감도를 제공하는 반면, 35S로부터 유래되는 것과 같은 보다 좋은 에너지 입자들은 보다 나은 분리를 제공한다. 따라서, 방사성 동위원소 리포터의 선택은 필요에 따라서 조정될 수 있다. 일단 특정의 방사성 동위원소 표지가 선택되면, 에거스 등(1994)에 기술한 바와 같이, 시그날(signal) 대 노이즈(noise)의 비율(SNR)을 계산하므로써 검출을 예상하게 된다.
택일적 발광 검출방법에서는 타아겟 분자에 결합된 형광 또는 화학적 발광 리포터군을 사용한다. 형광표지는 공유결합에 의하거나 상호작용을 통하여 결합될 수 있다. 들뜬 파장에서의 양자효율이 형광시그날 파장에서 보다 몇 등급 낮기 때문에 에티듐 브로미드와 같이 UV(300∼350nm)근처에서 강한 흡착띠를 가지며 가시광선(500-650nm) 영역에서 주 방출띠를 갖는 형광염료가 적용된 CCD 장치에 가장 적당하다.
발광을 검출하는 견지로부터, 폴리실리콘 CCD 게이트는 UV 영역에서 부수적인 광선의 분포를 여과시키는 짜 넣은 용량(built-in capacity)을 갖지만, 형광리포터군에 의해서 발생된 가시발광에는 매우 민감하다. 이와 같이 UV 들뜸에 대한 고유하게 큰 식별력은, 에거스 등(1994)이 제조한 바와 같이, CCDs에 의해서 큰 (100보다 큰) SNRs가 얻어지는 것이 가능하도록 한다.
검출기 상에 고정되는 탐침의 경우, 혼성 매트릭스들은 값싼 SiO2웨이퍼 상에서 생성될 수 있으며, 혼성화 및 건조에 이어서 CCD 표면상에 배치된다. DNA의 혼성화는 값싼 배치가능한 SiO2웨이퍼상에서 수행되므로 이 포맷은 경제적으로 효율적이며, 따라서 보다 값비싼 CCD 검출기를 재사용할 수 있게 된다. 택일적으로, 제공된 탐침 매트릭스를 생성하기 위해서 CCD상에 바로 탐침들이 고정될 수 있다.
SiO2코팅상에 탐침들을 고정시키기 위해서, 에폭시-실란 시약 및 표준 SiO2변형 케미스트리를 적용하면서 균일한 에폭시드층을 필름표면에 결합시킨다. 아민-변형 올리고뉴클레오티드 탐침들은, 애폭시고리로 이차 아민을 형성하므로써 SiO2표면과 결합하게 된다. 생성된 결합은 올리고뉴클레오티드의 3' 염기와 SiO2표면간에 17개의 회전가능한 결합을 제공하게 된다. 완전한 아민 탈보호를 보장하고 커플링 동안 부차적인 구조형성을 최소화하기 위해서, 0.1M KOH에서 반응이 수행되며 37℃에서 6시간 동안 항온처리된다.
일반적으로 포맷 3 SBH에서, 10억개의 포인트 각각에 대해서 시그날들이 기록된다. 모든 배열, 즉 4000 5×5mm을 한 번에 혼성화시킬 펼요는 없으며, 보다 적은 수의 배열을 연속적으로 사용하는 것이 가능하다.
혼성 사이클링은 혼성 시그날을 증가시킬 수 있는 하나의 방법이다. 하나의 사이클에서, 대부분의 고정된 탐침들은 표지 탐침들에 대해서 비상보적인 꼬리서열을 갖는 DNA 단편들과 혼성화된다. 온도를 높이므로써, 이 혼성체들은용융된다(제3도). 다음 사이클에서, 이들 몇몇(~0.1%)은 적당한 DNA 단편과 혼성화되며, 부가적 표지탐침들은 연결된다. 이러한 경우, 탐침 세트가 비배합된 DNA 혼성체의 차별적 용융이 동시에 일어나게 된다.
혼성 사이클에서, 사이클이 시작되기 전에 모든 성분들을 첨가하며, T4의 경우는 37℃에서 첨가하거나 또는 열역학적 리가아제의 경우는 보다 높은 온도에서 첨가한다. 이어서 온도를 15~37℃로 낮추고, 칩을 10분 까지 항온처리한 다음 몇분 동안 온도를 37℃ 또는 그 이상으로 높이고 다시 낮춘다. 사이클은 10회까지 반복가능하다. 사이클링 없이 최적의 고온(10∼50℃)이 사용가능하며 보다 길어진 (1∼3시간) 연결반응이 수행될 수 있다.
여기에서 기술된 방법에 따르면 상대적으로 적은 수의 올리고뉴클레오티드들을 필요로 하기 때문에 올리고뉴클레오티드들의 정확한 점적(spot) 및 표준합성법을 사용하여 복합성 칩을 제조하게 된다. 예를들면, 모든 7-mer 올리고들이 합성된다면(16384 탐침들), 2억 5천 6백만의 14-mers가 결정될 수 있다.
본 발명의 방법의 중요한 변형은 기본 배열당 상이한 표지탐침을 하나 이상 사용하는 것이다. 이는 두 가지 목적에 의해서 수행될 수 있다 ; 각각 따로 혼성된 배열의 수를 감소시키거나 ; 또는 일련의 3×6 또는 3×7과 같은 길어진 올리고시퀀스를 결정하는 멀티플렉싱(multiplexing). 이러한 경우 두개의 표지가 사용된다면, 포지티브 부위는 두 표지의 충분한 시그날을 가져야만 하기 때문에 3개의 연속 올리고뉴클레오티드들의 특이성은 거의 절대적일 수 있다.
부가적인 변형은 y가 1~4인 BxNy를 포함하는 칩을 사용하는 것이다. 이 칩들은 상이한 프레임(frame)에서 서열이 판독되게 한다. 또한 이는 비특이성 말단 위치를 갖는 F와 P 탐침들(즉 말단퇴화의 요소) 또는 적당한 세트의 표지탐침들을 사용하므로써 수행된다. 통상적인 염기들도 역시 한정된 서열의 탐침들을 고형 지지체에 결합시키는 링커(linker)로서 적용될 수 있다. 이는 탐침을 혼성화에 더욱 사용가능하도록 해주며, 보다 안정하게 한다. 탐침이 5개의 염기를 갖는다면, 3개의 보편적 염기들은 링커로서 사용될 수 있다(제4도).
실시예 VIII
데이타 분석
이미지 파일을 DOTS 프로그램과 유사한 이미지 분석 프로그램으로 분석하며(Drmanac et al., 1993), 통계함수, 즉 SCORES 프로그램으로 눈금을 매기고 값을 구한다. 시그날의 분포로부터 최적 한계는 시그날이 +/- 아웃풋(output)으로 변환하는 것으로 절정된다.
검출된 표지의 위치로부터, 단편들로부터의 F+P 뉴클레오티드 서열들은 표지 위치에 상응하는 고정된 표지 탐침들의 공지된 서열들을 결합하므로써 결정된다. 인간 염색체와 같은 원형 분자의 완전한 핵산 서열 또는 서열 부단편(subfragment)들은 컴퓨터에 의해 결정된 겹쳐진 F+P 서열들로부터 조립될 수 있다.
서열 조립공정 동안 혼성 시그날들, 예를들면 스코어(scores)가 +/- 아웃풋으로 변환하는 것을 선택할 수 있다. 이러한 경우, 조립은 매우 높은 스코어를 갖는 F+P 서열, 예를들면 F+P 서열 AAAAAATTTTTT(SEQ ID NO:1)로부터 시작된다. 4가지의 겹쳐짐이 가능한 탐침들인 AAAAATTTTTTA(SEQ ID NO:3), AAAAATTTTTTT(SEQ IDNO:4), AAAAATTTTTTC(SEQ ID NO:5)와 AAAAATTTTTTG(SEQ ID NO:6) 및 맨 처음이 상이한 세가지 탐침들(TAAAAATTTTTT, SEQ ID NO:7 ; CAAAAATTTTTT, SEQ ID NO:8 ; GAAAAATTTTTT, SEQ ID NO:9)의 스코어를 비교하고 세 가지의 결과들은 다음과 같이 규정된다.: (i) 오직 출발 탐침과 네가지의 겹쳐진 탐침들 중의 하나만이 또다른 여섯가지의 탐침들에 비하여 상대적으로 매우 포지티브한 스코어를 가지며, 이러한 경우 AAAAAATTTTTT(SEQ ID NO:1) 서열은 하나의 뉴클레오티드가 오른쪽으로 향하도록 연장된다 ; (ii) 출발탐침을 제외한 어떠한 탐침들도 매우 포지티브한 스코어를 갖지 않고, 조립이 중단된다. 즉, AAAAAATTTTT(SEQ ID NO:10) 서열은 서열화되는 DNA 분자의 말단에 위치한다 ; (iii) 상당히 포지티브한 하나 이상의 겹쳐진 탐침 및/또는 또 다른 세가지 탐침들이 관찰된다 ; 조립은 에러(error) 또는 분기(branching) 때문에 중단된다(Drmanac et al., 1989).
컴퓨터 측정방법에서는 알고리듬(algorithms)을 이용한 컴퓨터 프로그램을 적용한다(참고, Pevsner, 1989 ; Drmanac et al., 1991 ; Labat and Drmanac, 1993 ; 여기에서 인용자료로 각각 통합됨).
F+P 뿐 아니라, F(스페이스 1)P, F(스페이스 2)P, F(스페이스 3)P 또는 F(스페이스 4)P가 결정된다면, 분기 문제점이 있는 상황을 해결하거나 내재하는 에러를 고정하기 위해서 모든 데이타 세트들을 짜맞추는 데에 알고리듬을 사용한다(참고, Drmanac et al., 1989 ; Bains et al., 1988 ; 여기에서 인용자료로 각각 통합됨).
실시예 IX
서열화 칩의 재사용
서열화 공정에서 연결(ligation) 단계가 적용될 때, 통상의 올리고뉴클레오티드 칩은 즉시 재사용될 수 없다. 본 발명자는 다양한 방법에 의해서 이것이 개선될 수 있음을 관찰하였다.
제2의 탐침인 탐침 P에 대한 리보뉴클레오티드들을 적용하여, 이 탐침이 리보뉴클리아제(RNAase) 처리에 의해서 제거될 수 있다. 리보뉴클리아제 처리는 단일 가닥 RNA3' 를 특이적으로 공격하여 피리미딘 잔기를 얻고 인접 뉴클레오티드에 연결된 포스페이트를 분해하는 엔도뉴클아제로서 리보뉴클리아제 A를 이용할 수 있다. 최종 생성물은 피리미딘 3' 포스페이트와 말단 피리미딘 3' 포스페이트를 갖는 올리고뉴클레오티드들이다. 리보뉴클리아제 A는 조인자(cofactor) 및 2가 양이온의 존재하에서 작용한다.
리보뉴클리아제 A를 이용하기 이해서는, 샘브루크 등(1989 ; 여기에서 인용자료로 통합됨)이 기술한 바와 같이, 일반적으로 적당한 리보뉴클리아제 함유 완충제에서 칩을 항온처리하여야 한다. 10 내지 60분 사이에 37℃에서 8×8mm 또는 9×9mm 배열 당 30~50μl의 리보뉴클리아제 함유 완충제를 사용하는 것이 적당하다. 그 다음에 혼성완충제로 세척하여야 한다.
비록 폭넓게 사용할 수 없을지라도, 크라이그 등(1989 ; 여기에서 인용자료로 통합됨)이 기술한 바와 같이, 우라실 염기를 사용할 수도 있다. 연결된 탐침 조합의 분해는 E. Coli 수복효소인 DNA로부터 우라실을 제거하는 우라실-DNA 글리코실라아제로 침지(digestion)하므로써 이루어지며, 재사용가능한 칩을 수득하게 된다.
또한 탐침들 간에 특이적으로 분해가능한 결합이 형성되며 검출 후에 이 결합은 분해된다. 예를들면, 사바로바 등(1991) 및 돌린나야 등(1988) (여기에서 인용자료로 통합됨)이 기술한 바와 같이, 이는 화학적 연결반응에 의해서 수행될 수 있다.
사바로바 등(1991)은 올리고디옥시리보뉴클레오티드들과 축합제인 시아노겐브로미드와의 축합반응을 기술하고 있다. 이들 화학적 연결반응의 한 단계에서, 올리고뉴클레오티드들을 97℃로 가열하고 서서히 0℃로 냉각한 다음, 아세토니트릴 중의 1μl 10M BrCN을 첨가한다.
돌린나야 등(1988)은, DNA 복제물에서 포스포르아미데이트와 피로포스페이트 인터뉴클레오티드 결합을 통합하는 방법을 기술하고 있다. 이들은 또한 커플링제로서 수용성 카르보디이미드(CDI)를 사용하는, DNA의 당 포스페이트 주쇄를 변형시키는 화학적 연결방법을 사용한다. 포스포아미드 결합의 선택적 분해는 95℃에서 5분 동안 15% CH3OCOOH와 접촉하는 것을 수반한다. 피로포스페이트 결합의 선택적 분해는 피리딘-물 혼합물(9:1)과 새로이 정제된 (CF3CO)2O와 접촉하는 것을 수반한다.
본 발명의 조성물 및 방법을 바람직할 실시예로 설명하는 동안, 본 발명의 개념, 사상 및 영역을 벗어남이 없이 여기에 기재된 조성물에 적용되는 변형, 방법 및 그 방법의 일련의 단계들은 해당 기술분야의 당업자들에게 명백해질 것이다. 보다 상세하게는, 동일한 또는 유사한 결과를 얻을 수 있는 한, 화학적으로 관련되고 생리학적으로 관련된 시약을 여기에서 제시한 시약 대신 사용할 수 있다는 것은 명백하다.
해당 기술분야의 당업자들에게 잘 알려진 이와 같은 유사한 치환체들 및 변형물들은 통합된 청구범위로 한정되는 본 발명의 사상, 영역 및 개념을 벗어나지 않는다.
여기에 청구된 모든 물질 및 방법들은 무리한 실험없이도 제조되고 수행될 수 있다.
인용자료
여기에 기재된 상세한 설명을 보충하는 또다른 항목 또는 예시적인 본보기를제공하는 한도까지 인용자료를 하기와 같이 통합한다.
서열목록 (sequence listing)
(1) 일반정보
(i) 출원인 :
이 름 : 아치 디벨럽먼트 코포레이션
스트리트 : 이스트 58 번가 1101
시 : 시카고
주 : 일리노이주
국가 : 미합중국
우편번호 : 60637
전화번호 : (312) 702-1692
팩스번호 : (312) 702-0742
(ii) 발명자 : 드르마낙, 라도제
(iii) 발명의 명칭 : 효율적인 핵산 서열화(sequencing)를 위한 조성물 및 방법
(iv) 서열번호 : 10
(v) 통신주소 :
(A) 주소 : 아놀드, 화이트 & 듀키이
(B) 스트리트 : 피.오.박스 4433
(C) 시 : 휴스턴
(D) 주 : 텍사스
(E) 국가 : 미합중국
(F) 우편번호 : 77210-4433
(vi) 컴퓨터 판독가능형 :
(A) 중간형 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC compatible
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release #1.0, Ver. #1.25
(vii) 현재 출원 데이타 :
(A) 출원번호 :
(B) 출원일 :
(C) 분류 :
(viii) 선행 출원 데이타 :
(A) 출원번호 : USSN 08/303,058
(B) 출원일 : 1994. 9. 8.
(C) 분류 :
(A) 출원번호 : USSN 08/127,420
(B) 출원일 : 1993. 9. 27.
(C) 분류 :
(ix) 대리인/ 에어전트 정보 :
(A) 이름 : 파아커, 데이비드 엘.
(B) 등록번호 : 32,165
(C) 참고번호 : ARCD1469-WPAR
(x) 통신정보 :
(A) 전화 : (512) 418-3000
(B) 팩스 : (512) 474-7577
(2) SEQ ID NO : 1에 대한 정보
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형(Strandedness) : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO: 1 :
AAAAAATTTT TT
(2) SEQ ID NO : 2에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 13염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 2:
AAAAAATTTT TTC
(2) SEQ ID NO : 3에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 3 :
AAAAATTTTT TA
(2) SEQ ID NO : 4에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 4 :
AAAAATTTTT TT
(2) SEQ ID NO : 5에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 5 :
AAAAATTTTT TC
(2) SEQ ID NO : 6에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 6 :
AAAAATTTTT TG
(2) SEQ ID NO : 7에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 :DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 7 :
TAAAAATTTT TT
(2) SEQ ID NO : 8에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 8 :
CAAAAATTTT TT
(2) SEQ ID NO : 9에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 12염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 9 :
GAAAAATTTT TT
(2) SEQ ID NO : 10에 대한 정보 :
(i) 서열특성 :
(A) 길이 : 11염기쌍
(B) 타입 : 핵산
(C) 가닥형 : 단일가닥
(D) 형상 : 선형
(ii) 분자타입 : DNA
(xi) 서열 설명 : SEQ ID NO : 10 :
AAAAAATTTT T

Claims (133)

  1. 하기 (a), (b) 및 (c)를 포함하는 핵산분자의 염기서열을 결정하는 방법: (a) (i) 첫째 세트의 탐침들은 고형 지지체(support)에 부착되어 있고,
    둘째 세트의 탐침들은 용액에서 표지된 탐침들인, 공지의 염기서열을 갖는 두세트의 올리고뉴클레오티드 탐침들로부터의 상보적인 염기서열들과 상기 핵산 분자를 혼성화하고, (ii) 상기 첫째 세트의 탐침들로부터의 혼성화된 올리고뉴클레오티드와 상기 둘째 세트의 탐침들로부터의 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 공유결합하는 것에 의하여, 상기 분자로부터 염기서열들을 동정하는 단계 ;
    (b) (a) 단계에서 동정된 염기서열들로 부터 염기서열의 오버래핑 스트래치들(stretches)을 동정하는 단계 ;
    (c) 상기 동정된 오버래핑 염기서열들로부터 분자의 핵산염기서열을 조립하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼성화는 주기적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 하기 (a),(b),(c) 및 (d)를 포함하는, 핵산분자의 염기서열을 결정하는 방법 ;
    (a) 핵산단편들을 제공하기 위하여 서열화된 핵산분자를 단편화(fragmenting)하는 단계 ;
    (b) (i) 첫째 세트의 탐침들은 고형 지지체에 부착되어 있고,
    둘째 세트의 탐침들은 용액에서 표지된 탐침들인, 공지의 염기서열을 갖는 두세트의 올리고뉴클레오티드 탐침들로부터의 상보적인 염기서열들과 상기 단편들을 혼성화하고,
    (ii) 상기 첫째 세트의 탐침들로부터의 혼성화된 올리고뉴클레오티드와 상기 둘째 세트의 탐침들로부터의 혼성화된 올리고뉴클레오티드를 공유 결합함으로써, 상기 단편들로부터 염기서열들을 동정하는 단계 ;
    (c) (b) 단계에서 동정된 상기 염기서열들로부터 염기서열의 오버래핑 스트래치들을 동정하는 단계 ;
    (d) 상기 동정된 오버래핑 염기서열들로부터 상기 분자의 핵산 염기서열을 조립하는 단계.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단편들은, 공지의 염기서열을 갖는 두 세트의 올리고뉴클레오티드 탐침들로부터의 상보적인 염기서열들과 연속적으로 혼성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 단편들은, 공지의 염기서열을 갖는 두 세트의 올리고뉴클레오티드 탐침들로부터의 상보적인 염기서열들과 동시에 혼성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 핵산 단편들은 10 내지 40 뉴클레오티드의 길이이고, 상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 4 내지 9 뉴클레오티드의 길이인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 상기 단편들로부터의 완전히 상보적인 염기서열들과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제3항이 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 상기 단편들로부터의 직접 인접하는 염기서열들과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 상기 단편들로부터의 완전히 상보적이고 직접 인접하는 염기서열들과 혼성화되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 효소에 의한 연결(enzymatic ligation)에 의해 공유결합됨을 특징으로 하는 방법.
  11. 제3항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드 탐침들은 화학적 연결제를 이용하여 공유결합됨을 특징으로 하는 방법.
  12. 제3항에 있어서,
    (b) 단계는 다음의 단계들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법 :
    (i) 완전히 상보적인 염기서열을 갖는 단편들만이 탐침과 혼성화되게 하여 혼성화되고 유리된(free) 염기서열들을 갖는 단편이 포함된 일차 복합체들을 형성시키는 데 효과적인 혼성화 조건들하에서 상기 첫째 세트의 부착된 올리고뉴클레오티드 탐침들을 상기 핵산 단편들과 접촉시키는 단계 ;
    (ii) 완전히 상보적인 탐침들만이 유리된 단편 염기서열과 혼성화되게 하여, 부착된 탐침과 표지된 탐침에 단편이 혼성화되어 있는 2차 복합체를 형성시키는 효과적인 혼성화조건들하에서, 상기 1차 복합체들을 상기 둘째 세트의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들과 접촉시키는 단계 ;
    (iii) 상기 부착된 탐침과 상기 표지된 탐침이 공유결합하는 단계 ;
    (iv) 상기 2차 복합체로부터, 부착된 탐침에 공유결합하지 않는 표지된 탐침들을 제거하여 공유결합한 2차 복합체들을 형성하는 단계 ;
    (v) 표지의 존재를 감지하므로써 공유결합한 2차 복합체들을 감지하는 단계 ;
    (vi) 혼성화되고 부착되고 표지된 탐침들의 공지의 염기서열들을 연결하므로써 공유결합한 2차 복합체들에 있는 핵산단편들로 부터 염기서열들을 동정하는 단계.
  13. 하기 (a) 내지 (i)를 포함하는, 핵산 서열화 방법 :
    (a) 길이 T인 핵산단편들을 제공하기 위하여, 서열화되는 핵산을 단편화하는 단계 ;
    (b) 길이 F이고 공지의 염기서열을 갖는 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열과, 길이 P이고 공지의 염기서열들을 갖는, 한세트의 표지된 용액상의 올리고뉴클레오티드 탐침들(여기서, F+P≤T)을 준비하는 단계 ;
    (c) 길이가 F인 혼성화되고 완전히 상보적인 염기서열과 길이 T-F인 혼성화되지 않은 단편 염기서열들을 갖는 1차 복합체들을 형성하는데 효과적인 혼성화 조건들하에서 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열과 상기 핵산 단편들을 접촉시키는 단계 ;
    (d) 길이 F인 혼성화된 완전히 상보적인 염기서열들과 길이 P인 직접 인접한 혼성화된 완전히 상보적인 염기서열들을 갖는 2차 복합체들만을 형성하기에 효과적인 혼성화 조건들 하에서, 상기 복합체들과 상기 세트의 표지된 올리로뉴클레오티드 탐침들을 접촉시키는 단계 ;
    (e) 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들과 상기 직접 인접한 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들을 공유결합하는 단계 ;
    (f) 표지의 존재를 감지함으로써 상기 2차 복합체들을 감지하는 단계 ;
    (g) 혼성화된 고정화되고 표지된 탐침들의 공지의 염기서열들을 결합함으로써 상기 2차 복합체에 있는 핵산단편들로부터 길이 F+P인 염기서열들을 동정하는 단계 ;
    (h) 오버랩하는, 길이 F+P인 상기 염기서열들의 스트레치들(stretches)을 결정하는 단계 ;
    (i) 상기 오버래핑 염기서열들로부터 완전한 핵산 염기서열을 조립하는 단계.
  14. 제13항에 있어서,
    길이 T는 길이 F의 3배인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    길이 T는 10 내지 40 뉴클레오티드이고, 길이 F는 4 내지 9 뉴클레오티드이며, 길이 P는 4 내지 9 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    길이 T는 20 뉴클레오티드이고 길이 F는 6 뉴클레오티드이며, 길이 P는 6 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제13항에 있어서,
    상기 직접 인접한 고정화되고 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 효소에 의한 연결에 의해 공유결합됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제13항에 있어서,
    상기 직접 인접한 고정화되고 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 화학적 연결제를 이용하여 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  19. 하기 (a) 내지 (i)를 포함하는, 핵산 서열화 방법 :
    (a) 핵산 단편들을 제공하기 위해, 서열화되는 핵산을 단편화하는 단계 ;
    (b) 완전히 상보적인 염기서열들을 갖는 단편들만을 탐침과 혼성화하게 하여혼성화된 염기서열들과 혼성화되지 않은 염기서열들을 갖는 단편이 포함된 1차 복합체들을 형성하는데 효과적인 혼성화 조건들 하에서, 공지의 염기서열을 갖는 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열과 상기 핵산 단편들을 접촉시키는 단계 ;
    (c)완전히 상보적인 염기서열들을 갖는 탐침들만을 혼성화되지 않은 단편 염기서열과 혼성화하여 고정화된 탐침과 표지된 탐침에 혼성화된 단편을 갖는 2차 복합체들을 형성하도록 하는데 효과적인 혼성화 조건들 하에서, 상기 1차 복합체들을 공지의 염기서열을 갖는 한세트의 표지된 용액상의 올리고뉴클레오티드들과 접촉시키는 단계 ;
    (d) 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 상기 직접 인접한 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들과 공유결합하는 단계 ;
    (e) 상기 2차 복합체들로부터, 고정화된 탐침과 공유결합하지 않은 표지된 탐침들을 제거하여 인접한 2차 복합체들만을 남기는 단계 ;
    (f) 표지의 존재를 감지하므로써 상기 공유결합한 2차 복합체들을 감지하는 단계 ;
    (g) 혼성화된 고정화되고 표지된 탐침들의 공지의 염기서열들을 결합하므로써 상기 공유결합한 2차 복합체들 내에 있는 핵산단편들로 부터 염기서열들을 동정하는 단계 ;
    (h) 오버랩하는 상기 염기서열들의 스트레치들을 결정하는 단계 ;
    (i) 동정된 상기 오버래핑 염기서열들로부터 완전한 핵산 염기서열을 재조립하는 단계.
  20. 제19항에 있어서,
    핵산은 클로닝된 DNA 또는 크로모좀 DNA인 것을 특징으르 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서,
    핵산은 mRNA인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항에 있어서,
    핵산은 제한 효소 분해, 초음파처리, NaOH 처리 또는 저압전단(low pressure shearing)에 의해 단편화되는 것을 특징으로하는 방법.
  23. 제19항에 있어서,
    핵산단편들은 길이가 10 내지 100 뉴클레오티드의 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제19항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 단편들은 길이가 4 내지 9 뉴클레오틴드인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 길이가 6 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제19항에 있어서,
    상기 고정화된 올리고뉴클레오티드들은 유리, 폴리스티렌 또는 테프론으로 된 고형 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제19항에 있어서,
    상기 올리고뉴클레오티드들은 포스포다이에스터 결합을 통해 고형 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제19항에 있어서,
    상기 고정화된 올리고뉴클레오티드들은 광-활성(light-activated) 합성 메카니즘을 통하여 고형 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제19항에 있어서,
    표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 비방사성 동위원소(isotope) 또는 형광 염료(fluorescent dye)로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제19항에 있어서,
    표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 35S, 32P 또는 33P로 표지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제19항에 있어서,
    상기 핵산 단편 또는 상기 을리고뉴클레오티드 탐침들 중의 하나는 변형된 염기 또는 통상의 염기를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제19항에 있어서,
    고정화된 탐침에 공유결합되지 않는 표지된 탐침들은 엄격한 세척 조건들에 의해서 2차 복합체들로부터 제거되는 것을 특징으르 하는 방법.
  33. 제19항에 있어서,
    상기 직접 인접한 탐침들은 화학결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제19항에 있어서,
    상기 직접 인접한 탐침들은 효소에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제19항에 있어서,
    고정화된 올리고뉴클레오티드들의 다수의 (multiple) 배열들은 서열화 칩의형태로 배열되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 하기 (a) 내지 (i)를 포함하는, 핵산 서열화 방법 ;
    (a) 길이가 10 내지 40인 핵산단편들을 제공하기 위해, 서열화되는 핵산을 단편화하는 단계 ;
    (b) 완전하게 상보적인 염기서열만을 갖는 단편들을 탐침에 혼성화하여, 혼성화된 염기서열들과 혼성화되지 않은 염기서열들을 갖는 단편이 포함된 일차 복합체를 형성하도록 하는데 효과적인 혼성화 조건들하에서, 상기 핵산 단편들과 길이가 4 뉴클레오티드와 9 뉴클레오티드 사이인 공지된 염기서열들을 갖는 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열을 접촉시키는 단계 ;
    (c) 완전하게 상보적인 염기서열만을 갖는 표지된 탐침들이 혼성화되지 않은 단편 염기서열과 혼성화되어, 고정화된 탐침과 32P-표지된 또는 33P-표지된 탐침에 혼성화된 단편을 갖는 2차 복합체들을 형성할 수 있게 하는데 효과적인 혼성화 조건들 하에서, 길이가 4 내지 9 뉴클레오티드인 공지의 염기서열을 갖는 한 세트의 32P-표지된 또는 33P-표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들과 상기 복합체들을 접촉시키는 단계 ;
    (d) DNA리가제 효소를 이용하여, 직접 인접한 표지된 탐침들과 고정화된 탐침들을 연결시키므로써 연결된 2차 복합체들을 형성하는 단계 ;
    (e) 2차 복합체들로 부터 연결되지 않은 표지된 탐침들을 제거하는 단계 ;
    (f) 32P 또는 33P 표지의 존재를 감지하므로써 상기 연결된 2차 복합체들을감지하는 단계 ;
    (g) 연결된 탐침들의 공지 염기서열들을 결합시키므로써 상기 연결된 2차 복합체들내의 핵산단편들로부터 염기서열들을 동정하는 단계 ;
    (h) 오버랩하는 상기 염기서열들의 스트레치들을 결정하는 단계 ;
    (i) 상기 오버래핑 염기서열들로부터 완전한 핵산 염기서열을 조립하는 단계.
  37. 혼성화 반응에 참여할 수 있는 공지의 염기서열들을 갖는 올리고뉴클레오티드 탐침들의 배열이 부착된 고형 지지체 칩과 공지의 염기서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 용액을 포함하는 한 세트의 컨테이너(containers)들 및 연결제(ligating agent)로 이루어진 핵산 서열화에 사용되는 키트(Kit).
  38. 제37항에 있어서,
    고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침들의 다수의 칩(chips)들은 서열화 배열의 형태로 배열되는 것을 특징으로 하는 키트.
  39. 제37항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 길이가 4 내지 9 뉴클레오티드 사이인 것을 특징으로 하는 키트.
  40. 제39항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 길이가 6 뉴글레오티드인 것을 특징으로 하는 키트.
  41. 제37항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 유리 폴리스티렌 또는 테프론으로 된 고형지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
  42. 제37항에 있어서.
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 포스포다이에스터 결합을 통하여 고형 지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
  43. 제37항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들은 광-활성화된(light-activated) 합성 메카니즘을 통하여 고형지지체에 부착되는 것을 특징으로 하는 키트.
  44. 제37항에 있어서,
    표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 비 방사성 동위원소 또는 형광염료로 표지되는 것을 특징으로 하는 키트.
  45. 제37항에 있어서,
    올리고뉴클레오티드 탐침들 중의 하나는 변형된 염기 또는 통상의 염기를 함유하는 것을 특징으로 하는 키트.
  46. 제37항에 있어서,
    표지된 올리고뉴클레오티드 탐침들은 35S, 32P 프는 33P로 표지된 것을 특징으로 하는 키트.
  47. 제37항에 있어서,
    상기 연결제(ligating agent)는 화학적 연결제인 것을 특징으로 하는 키트.
  48. 제37항에 있어서,
    연결제는 DNA 리가아제 효소인 것을 특징으로 하는 키트.
  49. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법;
    (a) 목표 핵산(target nucleic acid)을 (i) 목표 핵산 및 고정화된 탐침의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 표지된 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 혼성화 조건하에서 고정화된올리고뉴클레오티드 탐침 세트(a set) 및 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉시키는 단계 ;
    (b) 동일한 목표 핵산 분자에 이웃하여 혼성화되는 고정화된 탐침 및 표지된 탐침을 공유결합적으로 연결시키는 단계;
    (c) 고정차된 탐침에 공유결합적으호 연결된 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 표지를 검출하는 단계;
    (d) 검출된 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열과 그들 각각과 연결된(joined) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열을 연결하는 (connecting) 단계를 포함하는 단계에 의하여 목표 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계.
  50. 제49항에 있어서, 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 세트(set)에는 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침 세트(a set)가 포함되고, 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에는 첫 번째(a first) 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침이 포함되고, 상기 방법은 (a) 단계 및 (b) 단계의 사이에 다음의 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법;
    목표 핵산을 (i) 목표 핵산 및 두 번째 세트의 고정화된 탐침의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 두 번째 표지된 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 조건하에서 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 두 번째 세트(set) 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉시키는 단계로서, 상기 첫 번째 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 다른 서열을 포함하고 있으며, 상기 첫 번째 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 표지는 동일한 것을 특징으로 하는 단계.
  51. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법;
    (a) 목표 핵산을 (i) 목표 핵산 및 고정화된 탐침의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 표지된 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 혼성화 조건하에서, 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침 세트(a set) 및 질량분광기(mass spectroscopy)에 의하여 검출될 수 없는 표지를 가진 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉시키는 단계;
    (b) 동일한 목표 핵산 분자에 이웃하여 혼성화되는 고정화된 탐침 및 표지된 탐침을 공유결합적으로 연결시키는 단계;
    (c) 고정화된 탐침에 공유결합적으로 연결된 표지된 올리고뉴클레오키드 탐침의 표지를 검출하는 단계; 및
    (d) 검출된 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열과 그들 각각과 연결된(joined) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열을 연결하는 (connecting) 단계를 포함하는 단계에 의하여 목표 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계.
  52. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법:
    (a) 목표 핵산을 (i) 목표 핵산 및 고정화된 탐침의 첫 번째 세트의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 첫 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 혼성화 조건하에서 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 첫 번째 세트(a set) 및 첫 번째 표지된 올리고뉴글레오티드 탐침과 접촉시키는 단계;
    (b) 목표 핵산을 (i) 목표 핵산 및 고정화된 탐침의 두 번째 세트의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 혼성화 조건하에서 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 두 번째 세트(set) 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉시키는 단계로서, 상기 첫 번째 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 다른 서열을 포함하고 있으며 상기 첫 번째 및 두 번째 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 표지는 동일한 것을 특징으로 하는 단계;
    (c) 동일한 목표 핵산 분자에 이웃하여 혼성화되는 고정화된 탐침 및 (i) 첫 번째 세트로부터의 표지된 탐침 또는 (ii) 상기 두 번째 세트로부터의 표지된 탐침을 공유결합적으로 연결시키는 단계;
    (c) 상기 첫 번째 또는 두 번째 세트의 고정화된 탐침에 공유결합적으로 연결된 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 표지를 검출하는 단계;
    (d) 상기 검출된 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열과 그들 각각과 연결된(joined) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열을 연결하는 (connecting) 단계를 포함하는 단계에 의하여 목표 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계.
  53. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 인 시튜(in situ) 상태로 검출되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  54. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침 및 표지된 탐침을 공유결합적으로 연결하는 단계에는 상기 탐침을 연결제(ligating agent)와 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 표지된 탐침은 상기 연결제와 동시에 상기 목표 핵산과 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  56. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, (b) 단계 이후이고 (c) 단계이전에 있어서, 고정화된 탐침에 공유결합적으로 연결되지 않은 표지된 탐침은 제거되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  57. 제52항에 있어서, (c) 단계 이후이고 (d) 단계 이전에 있어서, 고정화된 탐침에 공유결합적으로 연결되지 않은 표지된 탐침은 제거되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 고정화된 탐침에 공유결합적으로 연결되지 않은 표지된 탐침은 엄격한 세척 조건(stringent washing conditions) 하에서 제거되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  59. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 고정화된 탐침이 동일한 지지체(support) 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  60. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 고정화된 탐침이 다른 지지체 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  61. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 서열화 칩(sequencing chip)의 형태로 배열된 복수의 배열(array)을 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  62. 제52항에 있어서, 복수의 고정화된 탐침의 첫 번째 세트는 어떤 지지체 상에 고정화되고/또는 복수의 고정화된 탐침의 두 번째가 동일한 지지체 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 고정화된 탐침의 상기 첫 번째 및 두 번째 세트에는 서열화 칩이 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  64. 제52항이 있어서, 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 고정화된 탐침의 상기 첫 번째 세트는 다른 지지체 상에 고정화되고/또는 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 고정화된 탐침의 상기 두 번째 세트는 다른 지지체 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  65. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 한번에 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉되는 순차적인 방식으로 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트와 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 세트는 상기 동일한 표지로 표지되는 것을특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  67. 제65항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 다른 뉴클레오티드 서열을 갖는 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 세트는 다른 표지로 표지되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  68. 제65항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 고정화된 탐침의 상기 세트와 상기 표지된 을리고뉴클레오티드 탐침과 동시에 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  69. 제65항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 먼저 고정화된 탐침:목표 복합체를 형성시키기 위하여 고정화된 탐침의 세트와 먼저 접촉되고, 그 후 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  70. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 (a) 단계에서, 상기 목표 핵산은 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침 세트의 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드와 동시에 접촉되며, 상기 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드는 다르고, 분별가능한(distinguishable) 표지로 표지되고 그들 각각의 표지의 성질에 의하여 확인가능한 다른 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 고정화된 탐침의 세트 및 상기 적어도 두 개 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 동시에 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  72. 제70항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 고정화된 탐침:목표 복합제를 형성시키기 위하여 고정화된 탐침의 상기 세트와 먼저 접촉되고, 그후 상기 적어도 두 개 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  73. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 표지된 올리고뉴클레오티드 세트의 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 동시에 접촉되며, 상기 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 다르고, 분별가능한 표지로 표지되고 그들 각각의 표지의 성질에 의하여 확인가능한 다른 뉴클레오티드 서열을 가지는 것을 특징으로 하고, 상기 (d) 단계에 있어서, 상기 고정화되고 표지된 탐침의 상기 뉴클레오티드 서열은 표지의 성질 및 배열 내에서의 그들의 상대적 위치를 인 시튜(in situ) 상태에서 관찰함으로써 결정되는 것을 특징으르 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서 상기 목표 핵산은 고정화된 탐침 및 상기 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 배열과 동시에 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  75. 제73항에 있어서, 상기 (a) 단계에 있어서, 상기 목표 핵산은 고정화된 탐침:목표 복합체를 형성시키기 위하여 고정화된 탐침의 배열과 먼저 접촉되고, 그 후 상기 적어도 두 개 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  76. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열은 공유결합적으로 연결된 고정화된 탐침 및 표지된 탐침의 중복 조합된(overlapping combined) 뉴클레오티드 서열로부터 조립되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  77. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산의 완전한 뉴클레오티드 서열이 결정되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  78. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산은 맵핑(mapping)되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는방법.
  79. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산은 부분적으로 서열화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  80. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이가 길이 F이고, 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이 P인 것으로서, 상기 F 및 P는 각각 독립적으르 4∼9 뉴틀레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  81. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 및/또는 상기 표지된 탐침은 그들의 말단 위치에 어떤 범용 염기(universal base) 또는 모든 4가지 염기를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  82. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵신은 (a) 단계에 앞서 단편화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 목표 핵산은 제한 효소 분해, 초음파 처리, NaOH 처리 또는 저압 전단(shearing)에 의하여 단편화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 목표 핵산 단편은 길이가 길이 T이고, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이 F이고 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이 P인 것으로서, 상기 T는 10∼100 뉴클레오티드이고, F 및 P는 각각 독립적으로 4∼9 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  85. 제84항에 있어서 상기 T는 10∼40 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  86. 제84항에 있어서, 상기 T는 20 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  87. 제84항에 있어서, 상기 T는 F 보다 3배 긴 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  88. 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, F 및 P는 각각 6 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  89. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이웃하여 혼성화되는 고정화된 탐침 및 표지된 탐침은 효소적 연결(ligation)에 의하여 서로 공유결합적으로 연결되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  90. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화(hybridization)는 주기적(cylces)으로 행해지는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  91. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화 조건은 목표 핵산과 상기 목표의 일부분과 완전하게 상보적인 고정화된 탐침 및 표지된 탐침들 사이에서만 혼성화가 가능하게 하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  92. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 혼성화 조건은 동일한 목표 핵산 분자에 바로 이웃하여 혼성화할 수 있는 고정화된 탐침 및 표지된 탐침들 사이에서만 혼성화가 가능하게 하는 데 효과적인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  93. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산은 클론된 DNA,염색체 DNA 또는 mRNA인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  94. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 공유결합적 부착에 의하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 인산이중 결합(phosphodiester linkage)에 의하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  96. 제94항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 링커(linker)를 통하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  97. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 유리, 폴리스티렌 또는 테플론 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  98. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 방사성 동위원소, 비방사성 동위원소 또는 빛을 발산할 수 있는 부분(moiety)인 것을 특징으로 하는목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  99. 제94항에 있어서, 상기 표지는 형광염료(fluorescent dye)인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  100. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산 고정화된 탐침 또는 표지된 탐침에는 변형된 염기 또는 범용 염기가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  101. 제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 상기 혼성화 후에도 재사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  102. 제101항에 있어서, 상기 표지된 탐침의 올리고뉴클레오티드에는 리보뉴클레오티드가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  103. 제102항에 있어서, 리보뉴클레오티드를 포함하는 상기 공유결합적으로 연결된 표지된 탐침은 RNAse 처리에 의하여 상기 고정화된 탐침으로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  104. 제101항에 있어서, 상기 공유결합적으로 연결된 표지된 탐침에는 우라실 염기가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  105. 제104항에 있어서, 우라실 염기를 포함하는 상기 공유결합적으로 연결된 표지된 탐침은 우라실-DNA 글리코실라제(glycosylase) 처리에 의하여 상기 고정화된 탐침으로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  106. 제101항에 있어서, 상기 표지된 탐침에는 화학적으로 절단할 수 있는 결합이 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  107. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트;
    (a) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트 (b) 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트로서, 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에는 표지를 회수하지 않고 검출할 수 있는 표지가 포함되는 것, 및 (c) 연결제.
  108. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트;
    (a) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트, (b) 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트로서, 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에는 질량분광기(mass spectroscopy)에 의하여 검출할 수 없는 표지가 포함되는 것 및 (c) 연결제.
  109. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트;
    (a) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트, (b) 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트로서, 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 동일한 표지를 가지는 것, 및 (c) 연결제.
  110. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 단일 지지체 상에서 배열되는 것을 특징으로 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 온도의 키트.
  111. 제107항 내지 제109항 증 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 다른 지지체 상에 고정되는 것을 특징으로 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  112. 제110항에 있어서, 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 배열에는 서열 칩의 형태로 배열되는 복수의 배열이 포함되는 것을 특징으로 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  113. 제112항에 있어서, 소수성 절편(segment)이 배열들 사이에 사용되는 것을 특징으로 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  114. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 동일한 표지로 표지되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  115. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 두 개의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 다른 표지로 표지되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  116. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이가 길이 F이고, 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침은 길이 P인 것으로서, 상기 F 및 P는 각각 독립적으로 4∼9 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  117. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침 및/또는 상기 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에는 그들의 말단 위치에 범용 염기 또는 4가지 염기 모두가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  118. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침 및 상기 표지된 올리고뉴클레오티드는 각각 6 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  119. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침은 상기 목표의 길이의 1/3인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  120. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 연결제(ligation agent)는 연결효소(ligating enzyme)인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  121. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 인산 이중 결합(phosphodiester linkage)에 의하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  122. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 링커(linke)에 의하여 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  123. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 유리, 폴리스티렌 또는 테플론 상에 고정화되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  124. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 방사성 동위원소, 비방사성 동위원소 또는 빛을 발산할 수 있는 부분(moiety)인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  125. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서 상기 표지는 형광염료(fluorescent dye)인 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  126. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목표 핵산, 고정화된 탐침 또는 표지된 탐침에는 변형된 염기 또는 범용 염기가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  127. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정화된 탐침은 상기 혼성화 후에도 재사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  128. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지된 탐침의 올리고뉴클레오티드에는 리보뉴클레오티드가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  129. 제107항 내지 제109항 중 어느 한 항에 있어서 상기 표지된 탐침의 올리고뉴클레오티드에는 우라실 염기가 포함되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
  130. 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법;
    (a) 목표 핵산을 (i) 목표 핵산 및 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 상보적 서열 및 (ii) 목표 핵산 및 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 상보적 서열 간의 혼성화(hybridization)를 가능하게 하는데 효과적인 혼성화 조건하에서 지지체 상에 고정화되도록 화학적으로 변형된 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트 및 적어도 하나의 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침과 접촉시키는 단계;
    (b) 동일한 목표 핵산 분자에 이웃하여 혼성화되는 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침 및 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침을 공유결합적으로 연결시키는 단계;
    (c) 표지를 회수함이 없이, 상기 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침에 공유결합적으로 연결된 상기 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 상기 표지를 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 검출된 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열과 그들 각각과 연결된(joined) 고정화된 올리고뉴클레오티드 탐침의 뉴클레오티드 서열을 연결하는 (connecting) 단계를 포함하는 단계에 의하여 목표 핵산의 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계.
  131. 제130항에 있어서, 상기 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침은 스트렙트아비딘 코팅된 비드(streptavidin-coated beads) 상에 고정화되도륵 바이오틴이 결합된(biotinylated) 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 방법.
  132. 다음을 포함하는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트;
    (a) 지지체 상에 고정화가 가능하도록 화학적으로 변형된 첫 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트, (b) 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침의 세트로서, 적어도 하나의 표지된 올리고뉴클레오티드 탐침에는 상기 표지를 회수함이 없이 검출할 수 있는 표지가 포함되는 것, 및 (c) 연결제.
  133. 제132항에 있어서, 상기 적어도 두 개의 표지된 두 번째 올리고뉴클레오티드 탐침은 동일한 표지로 표지되는 것을 특징으로 하는 목표 핵산의 뉴클레오티드 서열을 확인하는 용도의 키트.
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Families Citing this family (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6270961B1 (en) * 1987-04-01 2001-08-07 Hyseq, Inc. Methods and apparatus for DNA sequencing and DNA identification
US5547839A (en) 1989-06-07 1996-08-20 Affymax Technologies N.V. Sequencing of surface immobilized polymers utilizing microflourescence detection
USRE43097E1 (en) 1994-10-13 2012-01-10 Illumina, Inc. Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors
US6974666B1 (en) 1994-10-21 2005-12-13 Appymetric, Inc. Methods of enzymatic discrimination enhancement and surface-bound double-stranded DNA
GB9507238D0 (en) 1995-04-07 1995-05-31 Isis Innovation Detecting dna sequence variations
CA2255599C (en) 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
IL130886A (en) 1997-01-15 2004-02-19 Xzillion Gmbh & Co Kg Nucleic acid sequencing
US6297006B1 (en) 1997-01-16 2001-10-02 Hyseq, Inc. Methods for sequencing repetitive sequences and for determining the order of sequence subfragments
US20020042048A1 (en) * 1997-01-16 2002-04-11 Radoje Drmanac Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6309824B1 (en) 1997-01-16 2001-10-30 Hyseq, Inc. Methods for analyzing a target nucleic acid using immobilized heterogeneous mixtures of oligonucleotide probes
PL335226A1 (en) * 1997-02-21 2000-04-10 Burstein Lab Gene sequencer and related methods
CA2291180A1 (en) 1997-05-23 1998-11-26 Lynx Therapeutics, Inc. System and apparatus for sequential processing of analytes
AU735546B2 (en) * 1997-07-22 2001-07-12 Qiagen Genomics, Inc. Polyethylenimine-based biomolecule arrays
US6365349B1 (en) 1997-07-22 2002-04-02 Qiagen Genomics, Inc. Apparatus and methods for arraying solution onto a solid support
US6365731B1 (en) 1997-08-06 2002-04-02 Ambion, Inc. Stripping nucleic acids with iodine and sodium thiosulfate
WO1999007889A1 (en) * 1997-08-05 1999-02-18 Ambion, Inc. Methods and compositions for stripping nucleic acids
CA2300940A1 (en) * 1997-08-15 1999-02-25 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
US6722395B2 (en) 1998-01-13 2004-04-20 James W. Overbeck Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for analysis of deposited arrays
US6428752B1 (en) 1998-05-14 2002-08-06 Affymetrix, Inc. Cleaning deposit devices that form microarrays and the like
US6269846B1 (en) 1998-01-13 2001-08-07 Genetic Microsystems, Inc. Depositing fluid specimens on substrates, resulting ordered arrays, techniques for deposition of arrays
US6407858B1 (en) 1998-05-14 2002-06-18 Genetic Microsystems, Inc Focusing of microscopes and reading of microarrays
GB9805918D0 (en) * 1998-03-19 1998-05-13 Nycomed Amersham Plc Sequencing by hybridisation
US7095032B2 (en) 1998-03-20 2006-08-22 Montagu Jean I Focusing of microscopes and reading of microarrays
US6294655B1 (en) 1998-04-03 2001-09-25 Hyseq, Inc. Anti-interleukin-1 receptor antagonist antibodies and uses thereof
US6426191B1 (en) 1998-04-03 2002-07-30 Hyseq, Inc. Assays involving an IL-1 receptor antagonist
US6337072B1 (en) 1998-04-03 2002-01-08 Hyseq, Inc. Interleukin-1 receptor antagonist and recombinant production thereof
US6541623B1 (en) 1998-04-03 2003-04-01 Hyseq, Inc. Interleukin—1 receptor antagonist and uses thereof
US6268210B1 (en) 1998-05-27 2001-07-31 Hyseq, Inc. Sandwich arrays of biological compounds
US6387645B1 (en) 1998-07-16 2002-05-14 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6476211B1 (en) 1998-07-16 2002-11-05 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
AU762392B2 (en) 1998-07-16 2003-06-26 Arca Biopharma, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
US6447771B1 (en) 1999-03-19 2002-09-10 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to novel CD39-like polypeptides
NO986133D0 (no) * 1998-12-23 1998-12-23 Preben Lexow FremgangsmÕte for DNA-sekvensering
DE60042775D1 (de) 1999-01-06 2009-10-01 Callida Genomics Inc Verbesserte sequenzierung mittels hybridisierung durch verwendung von sondengemischen
US6899875B1 (en) 1999-01-29 2005-05-31 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6350447B1 (en) 1999-01-29 2002-02-26 Hyseq, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6780977B1 (en) 1999-01-29 2004-08-24 Nuvelo, Inc. Methods and compositions relating to CD39-like polypeptides and nucleic acids
US6335013B1 (en) 1999-03-19 2002-01-01 Hyseq, Inc. Methods and materials relating to CD39-like polypeptides
WO2000056937A2 (en) 1999-03-25 2000-09-28 Hyseq, Inc. Solution-based methods and materials for sequence analysis by hybridization
WO2000075373A2 (en) 1999-05-20 2000-12-14 Illumina, Inc. Combinatorial decoding of random nucleic acid arrays
AU5497100A (en) * 1999-06-19 2001-01-09 Hyseq, Inc. Improved methods of sequence assembly in sequencing by hybridization
JP3668075B2 (ja) * 1999-10-12 2005-07-06 光夫 板倉 遺伝物質シーケンス決定用懸濁系、その懸濁系を用いた遺伝物質シーケンス決定方法およびその懸濁系を用いたＳＮＰｓ高速スコアリング方法
DE19957319A1 (de) * 1999-11-29 2001-05-31 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Dynamische Bestimmung von Analyten
DE19957320A1 (de) * 1999-11-29 2001-05-31 Febit Ferrarius Biotech Gmbh Dynamische Sequenzierung durch Hybridisierung
WO2001059453A2 (en) 2000-02-11 2001-08-16 The Texas A & M University System Biosensor compositions and methods of use
EP1698697A3 (en) 2000-03-24 2006-09-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited SSD-containing protein, process for producing the same and use thereof
US9709559B2 (en) 2000-06-21 2017-07-18 Bioarray Solutions, Ltd. Multianalyte molecular analysis using application-specific random particle arrays
US7262063B2 (en) 2001-06-21 2007-08-28 Bio Array Solutions, Ltd. Directed assembly of functional heterostructures
US6893822B2 (en) * 2001-07-19 2005-05-17 Nanogen Recognomics Gmbh Enzymatic modification of a nucleic acid-synthetic binding unit conjugate
KR20040068122A (ko) 2001-10-15 2004-07-30 바이오어레이 솔루션스 리미티드 공동 검색과 효소-매개된 탐지에 의한 다형성 좌위의 다중분석
DE10393431T5 (de) 2002-10-01 2005-11-17 Nimblegen Systems, Inc., Madison Mikroarrays mit mehreren Oligonukleotiden in einzelnen Array Features
US7526114B2 (en) 2002-11-15 2009-04-28 Bioarray Solutions Ltd. Analysis, secure access to, and transmission of array images
CN103397082B (zh) 2003-02-26 2017-05-31 考利达基因组股份有限公司 通过杂交进行的随机阵列dna分析
EP1606416A2 (en) 2003-03-10 2005-12-21 Casio Computer Co., Ltd. Dna analyzing apparatus, dna sensor, and analyzing method
CA2539824C (en) 2003-09-22 2015-02-03 Xinwen Wang Surface immobilized polyelectrolyte with multiple functional groups capable of covalently bonding to biomolecules
AU2004286252A1 (en) 2003-10-28 2005-05-12 Bioarray Solutions Ltd. Optimization of gene expression analysis using immobilized capture probes
US20050147976A1 (en) * 2003-12-29 2005-07-07 Xing Su Methods for determining nucleotide sequence information
US7848889B2 (en) 2004-08-02 2010-12-07 Bioarray Solutions, Ltd. Automated analysis of multiplexed probe-target interaction patterns: pattern matching and allele identification
AU2006210553A1 (en) 2005-02-01 2006-08-10 Ab Advanced Genetic Analysis Corporation Reagents, methods and libraries for bead-based sequencing
JP5331476B2 (ja) 2005-06-15 2013-10-30 カリダ・ジェノミックス・インコーポレイテッド 遺伝子解析および化学解析用の単分子アレイ
SG10201405158QA (en) 2006-02-24 2014-10-30 Callida Genomics Inc High throughput genome sequencing on dna arrays
US7910302B2 (en) 2006-10-27 2011-03-22 Complete Genomics, Inc. Efficient arrays of amplified polynucleotides
US20090111705A1 (en) 2006-11-09 2009-04-30 Complete Genomics, Inc. Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture
CN101910410A (zh) * 2007-10-23 2010-12-08 斯特拉托斯基因公司 通过间隔进行高通量核酸测序
US8415099B2 (en) 2007-11-05 2013-04-09 Complete Genomics, Inc. Efficient base determination in sequencing reactions
US8298768B2 (en) 2007-11-29 2012-10-30 Complete Genomics, Inc. Efficient shotgun sequencing methods
US8592150B2 (en) 2007-12-05 2013-11-26 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for long fragment read sequencing
WO2009097368A2 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Complete Genomics, Inc. Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions
US20090247425A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 Invitrogen Corporation Compositions and methods for reusing arrays
KR20100025328A (ko) * 2008-08-27 2010-03-09 삼성전자주식회사 이중가닥 영역과 말단 단일가닥 영역을 포함하는 이중가닥 핵산 프로브가 고정된 마이크로어레이를 제조하는 방법
JP5172614B2 (ja) * 2008-11-11 2013-03-27 シャープ株式会社 電気泳動装置およびその構成器具
CN102365367A (zh) 2009-01-29 2012-02-29 斯特拉托斯基因公司 通过展开进行高通量核酸测序和相关方法
US9524369B2 (en) 2009-06-15 2016-12-20 Complete Genomics, Inc. Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data
CN103827313B (zh) * 2011-09-20 2016-06-29 深圳华大基因股份有限公司 膀胱移行细胞癌易感性的相关基因及其预测方法和系统
CA2865541C (en) * 2012-02-27 2019-11-05 Toray Industries, Inc. Nucleic acid detection method
GB201501012D0 (en) * 2015-01-21 2015-03-04 Base4 Innovation Ltd Improved droplet sequencing apparatus and method
RU2587631C1 (ru) * 2015-06-19 2016-06-20 Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор"" (ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор") СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ R(5mC)GY В ЗАДАННОМ ПОЛОЖЕНИИ ПРОТЯЖЕННОЙ ДНК

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202231A (en) * 1987-04-01 1993-04-13 Drmanac Radoje T Method of sequencing of genomes by hybridization of oligonucleotide probes
CA2044616A1 (en) * 1989-10-26 1991-04-27 Roger Y. Tsien Dna sequencing
WO1993005183A1 (en) * 1991-09-09 1993-03-18 Baylor College Of Medicine Method and device for rapid dna or rna sequencing determination by a base addition sequencing scheme
GB9315847D0 (en) * 1993-07-30 1993-09-15 Isis Innovation Tag reagent and assay method

Also Published As

Publication number Publication date
PL313735A1 (en) 1996-07-22
AU8072794A (en) 1995-04-18
CN1128884C (zh) 2003-11-26
AU694146B2 (en) 1998-07-16
CA2172722C (en) 2007-04-24
EP1408122A3 (en) 2004-10-06
DE69433487D1 (de) 2004-02-19
FI961283A0 (fi) 1996-03-20
FI961283A (fi) 1996-05-22
NO961165D0 (no) 1996-03-22
UA48119C2 (uk) 2002-08-15
EP0723598B1 (en) 2004-01-14
CN1136330A (zh) 1996-11-20
NZ275194A (en) 1997-09-22
CA2172722A1 (en) 1995-04-06
DE69433487T2 (de) 2004-11-25
HUT75993A (en) 1997-05-28
CZ90596A3 (en) 1996-10-16
JPH09505729A (ja) 1997-06-10
ATE257861T1 (de) 2004-01-15
HU218597B (hu) 2000-10-28
EP1408122A2 (en) 2004-04-14
BR9407712A (pt) 1997-02-12
HU9600759D0 (en) 1996-05-28
PL180521B1 (pl) 2001-02-28
NO961165L (no) 1996-05-23
WO1995009248A1 (en) 1995-04-06
EP0723598A1 (en) 1996-07-31

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