HU218597B - Eljárások és készítmények hatékony nukleinsav-szekvenáláshoz - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya új eljárások és készítmények gyors és igen hatékonynukleinsavszekvenáláshoz, melyek ismert szekvenciájú, kisméretűoligonukleotidpróbák két sorozatával végzett hibridizáción alapulnak.A találmány szerinti eljárások és készítmények alkalmazásávalszélsőségesen nagy méretű nukleinsavmolekulák (beleértve akromoszómákat és az amplifikálatlan RNS-eket) szekvenálhatók anélkül,hogy előzetes klónozásra vagy szubklónozásra lenne szükség. Atalálmány szerinti eljárások a szekvenálási technikákkal kapcsolatoskülönböző problémákat, mint például a nagy zaj/jel aránnyal, abonyolult megkülönböztetéssel, a sok nukleinsavfragment egy felületheztörténő kapcsolásával, a nagyszámú, hosszú vagy összetett próbákelőállításával és a többfajta fragment jelölésével összefüggőnehézségeket oldanak meg. ŕ

Description

A találmány tárgya a molekuláris biológia területébe tartozik. Közelebbről, a találmány tárgya új eljárások és készítmények, amelyek a nukleinsavmolekulák igen hatékony szekvenálását teszik lehetővé. A találmány szerinti eljárások hosszú nukleinsavmolekulák (beleértve a kromoszómákat és az RNS-eket) klónozási és szubklónozási lépések nélküli szekvenálásához hasznosak.

A nukleinsavszekvenálás napjainkban a tudományos fejlődés nélkülözhetetlen részét képezi. A nukleinsavmolekulák és -szegmentek szekvenciájának, azaz primer szerkezetének meghatározása lényeges a különböző célterületeket vizsgáló egyes projektek szempontjából. A szekvenálásból származó információk hatással vannak a tudományra, gyógyszerészeire, mezőgazdaságra és a biotechnológia valamennyi területére. A nukleinsavszekvenálás természetesen alapvető jelentőségű a Humán Genom Projektben és más, nagyszabású vállalkozásokban, melyek célja az evolúció és az organizmusok működésének jobb megértése, valamint a különböző betegségek okainak felderítése.

A nukleinsavszekvenálás haszna nyilvánvaló, például a Humán Genom Projektben (HGP), amely a teljes humán genom szekvenálására irányuló nemzetközi vállalkozás, és amely több központban működik. A fejlődés ezen a területen azonban egyaránt lassú és költséges. A nukleinsavszekvenálást rendszerint poliakrilamidgéleken végzik, amellyel 1-500 bázispár tartományba eső, egymástól egy nukleotiddal különböző hosszúságú DNS-ffagmentek választhatók el. A szekvencia, azaz az egyes A, G, C és T nukleotidok sorrendjének tényleges meghatározása két módszerrel valósítható meg. Az egyik a DNS-ffagment Maxam-Gilbertféle, specifikus nukleotidoknál történő kémiai lebontása (Maxam és Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 560, 1977), a másik pedig a didezoxi láncterminációs szekvenálási eljárás, melyet Sanger és munkatársai írtak le (Sanger és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463,1977). Mindkét eljárás idő- és munkaigényes.

Az utóbbi időkben egyéb nukleinsavszekvenálási eljárásokat írtak le, melyekben nem alkalmaznak elektroforézises lépést. Ezeket az eljárásokat összefoglaló névvel „hibridizációval végzett szekvenálásnak” (SBH; Sequencing By Hibridization) nevezhetjük (Drmanac és munkatársai, J. Biomol. Struct. & Dyn., 8, 1085, 1991; Cantor és munkatársai, Genomics, 13, 1378, 1992; Drmanac és Crkvenjakov, 5,202,231 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Ezen eljárások némelyikének kifejlesztése új, szilárd, hordozó típusú szekvenálóeszközök kialakítását tette lehetővé, melyek „szekvenálócsipek” néven ismertek. Az SBH-eljárások alkalmazhatóságát általánosan az e technikára megadott egyesült államokbeli szabadalmak bizonyítják. Annak ellenére, hogy az SBH alkalmas a nukleinsavszekvenálás sebességének fokozására, valamennyi jelenlegi SBH-eljárás több hátránnyal rendelkezik.

A hibridizációval végzett szekvenálás két alapvető módon végezhető, melyeket gyakran 1. és 2. változatnak (Formát 1 és Formát 2) neveznek (Cantor és munkatársai, Genomics, 13, 1378,1992). Az 1. változatban ismeretlen szekvenciájú, általában 100-1000 nukleotid hosszúságú oligonukleotidokat szilárd hordozón vagy filteren rendeznek el oly módon, hogy maguk az ismeretlen minták rögzítettek legyenek (Strezoska és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 88, 10089, 1991; Drmanac és Crkvenjakov, 5,202,231 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). A sorba rendezett minta másolatait körülbelül 6-8 gyökből álló jelöltpróbákkal végzett hibridizációval vizsgálják. A 2. változatban körülbelül 6-8 gyökből álló, ismert szekvenciájú oligonukleotidok sorozatából szekvenálócsipeket készítenek (Southern, WO 89/10977 számú PCT szabadalmi bejelentés; Khrapko és munkatársai, J. DNA Sequencing Mapping, 1,375, 1991; Southern és munkatársai, Genomics, 13,1008, 1992). Az ismeretlen szekvenciájú nukleinsavakat ezután megjelölik, és a rögzített oligonukleotidokhoz hibridizálják.

A fenti két SBH-változatnak sajnos több korlátja van, melyek közül a legfontosabb, hogy előzetes DNSklónozási lépésekre van szükség. Az 1. változatban jelentős problémát okoz a szekvenálni kívánt különböző nukleinsavszakaszok szilárd felületű hordozóhoz történő kapcsolása, valamint a hosszabb próbák nagy sorozatának kialakítása. A 2. változatban a fő probléma az ismeretlen szekvenciával rendelkező nukleinsavak jelölése, az általában kapott nagy zaj/jel arány, valamint az a tény, hogy csak rövid szekvenciák szekvenálhatók. A 2. változat további problémái közé tartozik a másodlagos szerkezet kialakulása - ami gyakran megakadályozza az egyes célszekvenciák hozzáférhetőségét -, valamint azok a különböző feltételek, amelyek a különféle GC-tartalmú próbákhoz szükségesek. Ilyenformán, előnyös lenne egy új nukleinsavszekvenálási eljárás, különösen olyan, amellyel elkerülhetők az unalmas klónozási és/vagy szubklónozási lépések.

Találmányunkkal az eddigi technikák fenti és egyéb hátrányait kívánjuk kiküszöbölni oly módon, hogy a nukleinsavak szekvenálásához új eljárásokat és készítményeket bocsátunk rendelkezésre. Az általunk leírt új technikát általánosan 3. változatnak (Formát 3) nevezzük, amely az 1. és 2. SBH-változathoz képest lényeges fejlesztésekkel rendelkezik. A találmány szerinti 3. szekvenálási változatban a nukleinsavszekvenciákat ismert szekvenciájú, kisméretű oligonukleotidpróbák két sorozatával végzett hibridizációval határozzuk meg. A találmány szerinti eljárások igen nagy méretű nukleinsavmolekulák (beleértve a kromoszomális anyagot vagy az RNS-t) megkülönböztető szekvenálását teszik lehetővé anélkül, hogy előzetes klórozásra, szubklónozásra vagy amplifikációra lenne szükség. Ezenkívül a találmány szerinti eljárásokhoz nincs szükség nagy mennyiségű próbára, hosszú próbák komplex szintézisére, illetve a nukleinsavszegmentek komplex elegyének jelölésére.

Egy nukleinsav szekvenciájának találmányunk szerinti eljárással történő meghatározásához általában meghatározott hosszúságú és ismert szekvenciájú, kisméretű oligonukleotidpróbákból álló két sorozatból származó komplementer szekvenciákkal (melyek lefedik a szekvenciák adott hosszúságú próbának megfelelő leg2

HU 218 597 Β több kombinációját) végzett hibridizálással a nukleinsavból szekvenciákat azonosítunk. Ezek után az azonosított szekvenciákat átfedő szakaszaik meghatározása érdekében vizsgáljuk, és az ilyen átfedő szekvenciákból rekonstruáljuk, illetve összeállítjuk a teljes nukleinsavszekvenciát.

A szekvenálási eljárásokat a kisméretű oligonukleotidpróbák közül származó komplementer szekvenciák egymás utáni hibridizációjával valósíthatjuk meg. Más módon, alkalmazhatunk egy „ciklikusnak” nevezett módszert is, melynek során a kisméretű oligonukleotidpróbák két sorozatát egyidejűleg hibridizáljuk az ismeretlen szekvenciákkal. A hibridizálás után a hőmérsékletet olyan mértékben növeljük, ami „felolvasztja” a nem komplementer hibrideket. Az ilyen ciklusos technikákat a molekuláris biológia egyéb területein (mint például a PCR-ban) általánosan alkalmazzák, és találmányunk leírása alapján a szakemberek számára könnyen érthető lesz.

A találmány szerinti eljárások és készítmények nagyon hosszú nukleinsavmolekulák szekvenálásához alkalmazhatók. Gyakorlati okokból a szekvenálni kívánt nukleinsavmolekulát kis vagy közepes hosszúságú nukleinsavfragmentekre daraboljuk, melyek könnyebben kezelhetők. A „nukleinsavfragment” kifejezés, ahogy itt használjuk, leggyakrabban körülbelül 10 bázispártól (bp) körülbelül 100 bp-ig terjedő hosszúságú nukleinsavmolekulát jelent. A találmány szerinti legelőnyösebb eljárások azok, amelyekben a szekvenálni kívánt nukleinsavmolekulát úgy kezeljük, hogy közepes hosszúságú, azaz körülbelül 10-40 bp-os nukleinsavffagmenteket kapjunk. Hangsúlyoznunk kell azonban, hogy a találmányunk szerinti eljárás nem a kis nukleinsavfragmentek teljes szekvenálására vonatkozik, hanem nukleinsavmolekulák szekvenálására, melynek során a molekulán belüli szekvencia részleteit határozzuk meg (akár a teljes molekulát alkalmazva, akár - az egyszerűség kedvéért - a molekulát először kisebb méretű, körülbelül 4-1000 bázisból álló szakaszokra fragmentálva).

A nukleinsavmolekulákból származó szekvenciákat ismert szekvenciájú, kisméretű oligonukleotidpróbákhoz történő hibridizálással határozzuk meg. A „kisméretű oligonukleotidpróbák” kifejezésben a kis méret 10 bpnál rövidebb, előnyösen körülbelül 4 bp és körülbelül 9 bp hosszúságot jelent. Az egyik példaként szolgáló szekvenálási módban a körülbelül 6 bp-os próbákat tartjuk különösen hasznosnak. A kiválasztott próba hosszúságának megfelelő szekvenciák valamennyi kombinációját lefedő oligonukleotidpróbák sorozataiban a próbák száma 4¹⁷, ahol F jelentése a próba hosszúsága. Például, egy 4-mer esetében a sorozatnak 256 próbából; 5-mer esetében 1024 próbából, 6-mer esetében 4096 próbából, 7-mer esetében 16 384 próbából kell állnia stb. Az ilyen hosszúságú oligonukleotidpróbák szintézise jól ismert és automatizált szintézissel megvalósítható.

A találmány szerinti eljárásokban az ismert szekvenciájú, kisméretű oligonukleotidpróbák egyik sorozatát (melyet első sorozatnak nevezhetünk) szilárd hordozóhoz kapcsoljuk, azaz a hordozón úgy rögzítjük az oligonukleotidokat, hogy azok a hibridizációs reakciókban részt vehessenek. Az ismert szekvenciájú, kisméretű oligonukleotidpróbák egy másik sorozatát (melyet második sorozatnak nevezhetünk) kimutatható jelölőanyaggal jelölt, oldatban lévő próbaként alkalmazzuk. Az oligonukleotidpróbák sorozatai azonos vagy különböző hosszúságú próbákból állhatnak.

Az egymás utáni hibridizációs eljárás azt jelenti, hogy az ismeretlen szekvenciájú nukleinsavmolekulákat vagy -fragmenteket különböző időpontokban hibridizáljuk az ismert szekvenciájú oligonukleotidpróbák meghatározott sorozataihoz (1. ábra). A nukleinsavmolekulákat vagy -fragmenteket általában denaturáljuk, lehetővé téve a hibridizációt, és szelektív hibridizációs körülmények között (melyek biztosítják, hogy csak a komplementer szekvenciájú ffagmentek hibridizálódjanak) az első rögzített próbasorozathoz adjuk. A nem komplementer szekvenciákkal rendelkező fragmenteket eltávolítjuk, majd a már kialakult fragmentpróbakombinációkhoz a második, jelöltpróba-sorozat (oldatban) hozzáadásával elvégezzük a következő megkülönböztető hibridizálást. A rögzített próba mellé közvetlenül hibridizáló jelölt próbák a hordozóhoz kapcsolódva maradnak, és detektálhatok, míg ha a rögzített és jelölt próbák nem közvetlenül egymás mellett helyezkednek el, nem mutathatók ki (1. ábra).

Az egyidejű hibridizációs eljárás azt jelenti, hogy az ismeretlen szekvenciájú nukleinsavmolekulákat az ismert szekvenciájú oligonukleotidpróbák különböző sorozataival egyszerre hozzuk érintkezésbe. A hibridizációt szelektív hibridizációs feltételek mellett végezzük. A nem komplementer szekvenciájú fragmenteket később „felolvasztjuk”, vagyis a hőmérséklet növelésével eltávolítjuk, majd elvégezzük a következő szelektív hibridizálást, amely a második sorozatban lévő próbák hibridizációját teszi lehetővé. A rögzített próba mellé közvetlenül hibridizálódó jelölt próbák azonos módszerrel detektálhatok.

A „komplementer” nukleinsav-szekvenciák olyan szekvenciák, amelyek a Watson-Crick bázispárosodási törvénynek vagy e törvény módosított bázisokra alkalmazott változatának megfelelő bázispárosodásra képesek. Eszerint a nagyobb méretű purinok vagy módosított purinok mindig a kisebb méretű pirimidinekkel párosodnak ismert kombinációkban - a guanin citozinnal (G: C), az adenin timinnel (A: T, a DNS esetében), illetve uracillal (A:U, az RNS esetében). Módosított bázisok, illetve az úgynevezett univerzális bázis (M bázis; Nichols és munkatársai, Natúré, 369, 492, 1994) szintén alkalmazható.

Ahogy itt használjuk, a „komplementer szekvenciák” kifejezés olyan nukleinsav-szekvenciákat jelent, amelyek teljes hosszukban lényegében komplementerek, és nagyon kevés mismatch-et (hibás bázispárosodást) tartalmaznak. Például a hat bázisból álló nukleinsav-szekvenciák komplementernek mondhatók, ha egyetlen hibás bázispárosodás mellett hatból öt helyen hibridizálódnak. A „tökéletesen komplementer” nukleinsav-szekvenciák természetesen teljes hosszukban komplementerek, hibás bázispárosodás nélkül.

HU 218 597 Β

A nukleinsavfragmentek részeit képező egyes különböző szekvenciák (ismert szekvenciájú oligonukleotidpróbákhoz való hibridizációjuk alapján végzett) azonosítása után ezeket a szekvenciákat az átfedő szekvenciaszakaszok azonosítása érdekében vizsgáljuk. Például olyan szekvenciaszakaszokat azonosítunk, amelyekben az 5’-vég megegyezik egy másik szekvencia 3’-végével, vagy fordítva. Ezek után a nukleinsavmolekula vagy -fragment teljes szekvenciája felvázolható, vagyis az így meghatározott átfedő szekvenciákból rekonstruálható.

Az átfedő szekvenciák azonosítását és a teljes szekvencia rekonstruálását általában számítógépes analízissel végezzük. Például ha egy 5’-TTTTTT-3’ próba az 5’-AAAAAA-3’ rögzített próbát tartalmazó helyhez hibridizál, egy 12-mer szekvencia határozható meg, nevezetesen az 5’-AAAAAATTTTTT-3’ (1. számú szekvencia), vagyis a két hibridizálódott próba egy korábban ismeretlen szekvenciát adva kombinálódik. A következő megválaszolandó kérdés, hogy melyik nukleotid követi az újonnan meghatározott 5’-AAAAAATTTTTT-3’ szekvenciát (1. számú szekvencia). Négy lehetőség van, melyeket az 5’-AAAAAT-3’ rögzített próba, valamint az 5’-TTTTTA-3’ jelölt próba (az adeninre), az 5’-TTTTTT-3’ jelölt próba (a timinre), az 5’-TTTTTG-3’ jelölt próba (a guaninra) és az 5’TTTTTC-3’ jelölt próba (a citozinra) képvisel. Ha például az 5’-TTTTTC-3’ próba pozitív és a többi három negatív, úgy az összeállított szekvencia 5’-AAAAAATTTTTTC-3’ szekvenciára egészül ki (2. számú szekvencia). A következő lépésben algoritmus határozza meg, hogy a TTTTCA, TTTTCT, TTTTCC és TTTTCG jelölt próbák közül melyik pozitív az AAAATT rögzített próbát tartalmazó helyen. Az eljárást addig ismételjük, amíg valamennyi pozitív (F+P) oligonukleotidpróbát fel nem használjuk vagy hamis pozitív próbaként nem azonosítjuk.

A találmány hosszú nukleinsavmolekulák vagy -fragmentek nagyon hatékony szekvenálási módját bocsátja rendelkezésre. A nagy nukleinsavmolekulákon olyan molekulákat értünk, amelyeket a szekvenálás előtt fragmentálni kell. Ezek a molekulák általában körülbelül 45-50 bp hosszúságúak, gyakran még hosszabbak. A találmány szerinti eljárások gyakorlatilag felső hosszúsági határ nélkül alkalmazhatók, így például 100 bp, 1 kilobázispár (kb), 100 kb, 1 megabázispár (Mb) vagy 50 Mb hosszúságú vagy hosszabb szekvenciák szekvenálhatók, akár teljes kromoszómák is, például humán kromoszómák, melyek hosszúsága körülbelül 100 Mb. Ilyen hosszú molekulák szekvenálásához 8-merek vagy 9-merek két sorozatára van szükség (hogy F+P összege 16-18 legyen). Az eljárással szekvenálható nukleinsav lehet DNS, például cDNS, genomiális DNS, kivágott kromoszómasávok, kozmid DNS- vagy YAC-inszertek, valamint lehet RNS, például mRNS, rRNS, tRNS vagy snRNS.

Egy hosszú nukleinsavmolekula szekvenciájának meghatározási eljárása során a molekulából F + P hosszúságú szekvenciákat azonosítunk, és a szekvenciákat megfelelő algoritmus alkalmazásával összeállítjuk.

A szekvenálni kívánt nukleinsavat leggyakrabban rövidebb szakaszokra fragmentáljuk, például közepes hosszúságú nukleinsavfragmentekre, majd hibridizálással (például a fragmentek ismert szekvenciájú, rövid oligonukleotidpróbák két sorozatából származó komplementer szekvenciákhoz való, fentebb leírt, egymás utáni hibridizálásával) F+P hosszúságú fragmenteket azonosítunk. Ezen a módon az F+P hosszúságú átfedő szekvenciák alapján igen nagy molekulák teljes nukleinsavszekvenciája rekonstruálható.

Függetlenül attól, hogy a szekvenálni kívánt nukleinsav önmagában is közepes hosszúságú fragment, vagy először olyan kezelésnek kell alávetni, amely ilyen hosszúságú fragmenteket eredményez, a találmány szerinti szekvenálási eljárásokat illetően kulcsfontosságú az a folyamat, amelyben az említett nukleinsavfragmentekből - ismert szekvenciával rendelkező, kisméretű oligonukleotidpróbák két sorozatához való hibridizálással megfelelő szekvenciákat azonosítunk.

Ez a folyamat az alábbi lépésekből áll:

(a) a kapcsolt vagy rögzített oligonukleotidpróbák sorozatát érintkezésbe hozzuk a nukleinsavfragmentekkel, olyan hibridizációs feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik, hogy a komplementer szekvenciával rendelkező fragmentek hibridizálódjanak egy próbához, miáltal primer komplexek alakulnak ki, melyekben a fragment hibridizált és hibridizálatlan (vagy „szabad”) szekvenciákkal egyaránt rendelkezik;

(b) a primer komplexeket oldatban érintkezésbe hozzuk a jelölt oligonukleotidpróbák sorozatával, olyan hibridizációs feltételek mellett, amelyek lehetővé teszik, hogy a komplementer szekvenciákkal rendelkező próbák hibridizálatlan vagy szabad fragment szekvenciával hibridizálódjanak, miáltal másodlagos komplexeket alakítunk ki, melyekben a fragment kapcsolt (rögzített), illetve jelölt próbához egyaránt hibridizált;

(c) a másodlagos komplexekből eltávolítunk minden olyan jelölt próbát, amelyek nem hibridizálódtak szomszédosán egy rögzített próba mellé, s így csak a szomszédos másodlagos komplexeket hagyjuk meg;

(d) ajelölt próbában a jelölőanyag kimutatásával detektáljuk a szomszédos másodlagos komplexeket; és (e) a hibridizált rögzített és jelölt próbák ismert szekvenciáinak összeállításával vagy összeillesztésével a másodlagos komplexekben lévő nukleinsavfragmentekből oligonukleotidszekvenciákat azonosítunk.

Az egyik vagy mindkét hibridizációs lépéshez kiválasztott hibridizációs vagy „mosási feltételek” a kiválasztott szekvenálási módszertől függnek. Például mindkétfajta hibridizációs feltételt úgy tervezhetjük meg, hogy az oligonukleotidpróbák egy adott nukleinsavfragmenthez hibridizálódjanak, amennyiben komplementer szekvenciákat, vagyis alapvetően helyes bázispárosodású szekvenciákat tartalmaznak, például olyanokat, amelyek hat hely közül ötnél hibridizálódnak. A hibridizációs lé4

HU 218 597 Β pések előnyösen a jelenlegi szekvenálási eljárásokban megszokott, egyszerű automata készülék alkalmazásával végezhetők.

Más módon, a hibridizációs feltételeket úgy szabhatjuk meg, hogy csak azon oligonukleotidpróbák, illetve -fragmentek hibridizációját segítsék elő, amelyek tökéletesen komplementer szekvenciákkal rendelkeznek. Ezek a jobban megkülönböztető vagy „szigorú” feltételek alkalmazhatók egymás utáni hibridizációs folyamat különböző lépéseihez, illetve bármelyik lépéshez önmagában. Ilyen esetekben az oligonukleotidpróbák (függetlenül attól, hogy rögzített vagy jelölt próbák) egy adott nukleinsavfragmenthez történő hibridizációja csak akkor valósul meg, ha a próba, illetve a fragment tökéletesen komplementer szekvenciákkal rendelkezik.

A kiválasztott hibridizációs feltételek általában megszabják a kapott adatok analizálásához szükséges komplexitás mértékét. Hasonlóan a kapott adatok analizálásához rendelkezésre álló számítógépes programok megszabhatják az adott esetben alkalmazandó hibridizációs feltételeket. Például a legnagyobb szelektivitású eljárásban mindkét hibridizációs lépést olyan feltételek mellett végezzük, amelyek csak a tökéletesen komplementer oligonukleotidpróbák, illetve -fragmentek hibridizációját teszik lehetővé. Mivel ebben az esetben nem lesznek hibás párosodású bázisok, ez az eljárás igényli a legkevésbé komplex számítógépes analízist, és ezáltal a találmány gyakorlati megvalósításához jelenleg ez az előnyben részesített módszer. Az egyik vagy mindkét hibridizációs lépéshez kevésbé szelektív feltételek alkalmazása szintén a találmány tárgykörébe tartozik.

Az egyik vagy mindkét lépésben való alkalmazáshoz megfelelő hibridizációs feltételeket optimalizálási eljárásokkal vagy próbavizsgálatokkal könnyen meghatározhatjuk. A próbavizsgálatok különböző típusait a nukleinsavszekvenálásban járatos szakemberek egyszerűen elvégezhetik. Variálható például a hőmérséklet, az egyes komponensek koncentrációja, a lépések időtartama, az alkalmazott pufferek és azok pH-ja, valamint ionerőssége.

Az előnyös megvalósítási módokban a találmány szerinti nukleinsavszekvenálási eljárás magában foglal egy szelektív lépést, mellyel kiválaszthatók a másodlagos hibridizációs komplexek, melyek közvetlenül szomszédos, rögzített és jelölt próbákat tartalmaznak, eltérően a nem közvetlenül szomszédos (egy, két vagy több bázis által elválasztott) próbákat tartalmazóktól. A rögzített próbához nem közvetlenül szomszédosán hibridizált jelölt próbák eltávolításához számos eljárás alkalmazható, melyek mindegyike csak a közvetlenül szomszédos másodlagos komplexeket hagyja meg.

Az ilyen megkülönböztető eljárások alapulhatnak kizárólag a kontrollált feltételek mellett végzett mosási lépéseken, amelyekben olyan hibridizációs feltételeket választunk, hogy a közvetlenül szomszédos próbák a szomszédos nukleotidok kölcsönhatásai következtében hibridizált állapotban maradjanak. Még egyszer megemlítjük, hogy a nem közvetlenül szomszédos jelölt próbák optimális eltávolításához módosíthatjuk a mosási feltételeket, mint például a hőmérsékletet, koncentrációt, időt, az alkalmazott puffereket, pH-t, ionerősséget és hasonlókat.

Az előnyös megvalósítási módokban a közvetlenül szomszédos, rögzített és jelölt próbákat ligáljuk, azaz kovalensen összekapcsoljuk, majd a nem ligálódott próbák eltávolítása érdekében mosási lépéseket hajtunk végre. A ligálás kémiai ligálószert (például vízoldékony karbodiimidet vagy cián-bromidot) tartalmazó oldattal végzett kezeléssel valósítható meg. Előnyösebben ligáz enzimet, mint például T₄ bakteriofágból származó T₄ DNS-ligázt alkalmazhatunk, amely számos forrásból (például Biolabs) beszerezhető. Mindkét esetben el kell tudnunk távolítani a nem közvetlenül szomszédos jelölt próbákat, amihez olyan, szigorúbb mosási feltételeket alkalmazunk, amelyek nem befolyásolják a kovalensen kapcsolt jelölt és rögzített próbákat.

A megmaradó szomszédos másodlagos komplexek a bennük lévő jelölt próbák jelölőanyaga elhelyezkedésének megfigyelésével detektálhatok. Az oligonukleotidpróbák kémiailag kimutatható jelölőanyaggal, például fluoreszcens festékekkel vagy megfelelően módosított, kemilumineszcens előhívási eljárással kimutatható jelölőanyagokkal, valamint radioaktív jelölőanyagokkal - mint például ³⁵S-, ³H-, ³²P- vagy ³³P-izotóppal (melyek közül jelenleg a ³³P-izotópot részesítjük előnyben) - jelölhetők. A próbák nem radioaktív izotópokkal is jelölhetők, melyek tömegspektrometriával mutathatók ki.

A találmány gyakorlati megvalósításához jelenleg legelőnyösebb eljárásban a hibridizációs lépést olyan feltételek mellett végezzük, amelyek csak a tökéletesen komplementer szekvenciákkal rendelkező oligonukleotidpróbák és -fragmentek hibridizációját teszik lehetővé, illetve amelyek csak a közvetlenül szomszédos próbákat hagyják hibridizált állapotban. Ez az eljárás igényli a későbbiekben a legkevésbé komplex számítógépes analízist.

Amennyiben az ismeretlen szekvenciájú nukleinsavmolekula hosszabb, mint 45-50 bp, szekvenciája meghatározásának egyik hatékony eljárása szerint a molekulát úgy kezeltük, hogy közepes hosszúságú nukleinsavfragmenteket alakítsunk ki, és ezekből a ffagmentekből származó szekvenciákat határozunk meg. A nukleinsavmolekula (DNS vagy RNS) a számos rendelkezésre álló módszer bármelyikével fragmentálható, például restrikciós enzimes emésztéssel, fizikai módszerekkel (például ultrahangos kezeléssel), nátrium-hidroxidos kezeléssel, valamint alacsony nyomással végzett hasítással.

Bizonyos megvalósítási módokban, amelyekben például körülbelül 4 bp és körülbelül 9 bp közötti hosszúságú oligonukleotidpróbákat alkalmazunk, körülbelül 10-40 bp hosszúságú nukleinsavffagmentek kialakítását célozhatjuk meg. A hosszabb nukleinsavfragmentek szekvenálásához természetesen általában hosszabb próbákat alkalmazunk, és fordítva. Bizonyos előnyös megvalósítási módokban az alkalmazott kisméretű oligonukleotidpróbák körülbelül 6 bp hosszúságúak, a szekvenálni kívánt nukleinsavfragmentek pedig általában körülbelül 20 bp hosszúak. Kívánt esetben a ffagmen5 ί

HU 218 597 Β tek - a megfelelő hosszúságúak kinyerése érdekében méret szerint elkülöníthetők, például gélen (agarózgélen) futtathatók, és a hozzávetőleg kívánt hosszúságúak kivághatok a gélből.

Egy nukleinsavmolekula szekvenciájának meghatározási eljárását az alábbiak szerint is jellemezhetjük. Először a szekvenálni kívánt nukleinsav adott mennyiségét véletlenszerűen fragmentáljuk, hogy T hosszúságú nukleinsavfragmentek elegyét kapjuk. Ezután ismert szekvenciájú és F hosszúságú, rögzített oligonukleotidpróbák sorozatát, valamint ismert szekvenciájú, P hosszúságú jelölt oligonukleotidpróbák sorozatát (oldatban) kell kialakítani (F+P<T, és előnyösen T=körülbelül 3F).

Ezután a rögzített oligonukleotidpróbák sorozatát érintkezésbe hozzuk a nukleinsavfragmentek elegyével, olyan körülmények között, amelyek a hibridizált, F hosszúságú komplementer szekvenciákból és a (T-F) hosszúságú, hibridizálatlan fragmentszekvenciákból álló primer komplexek kialakulását teszik lehetővé. Az F hosszúságú hibridizált szekvenciák előnyösen kizárólag tökéletesen komplementer szekvenciákat tartalmaznak.

A primer komplexeket ezután jelölt oligonukleotidpróbák sorozatával hozzuk érintkezésbe, olyan hibridizációs feltételek mellett, amelyek a hibridizált, F hosszúságú komplementer szekvenciákkal és a szomszédos helyzetben hibridizálódott, P hosszúságú komplementer szekvenciákkal másodlagos komplexek kialakulását teszik lehetővé. Az előnyben részesített megvalósítási módokban csak a tökéletesen komplementer szekvenciákkal rendelkező jelölt próbák hibridizációját engedjük meg, és csak azokat a próbákat hagyjuk hibridizált állapotban, amelyek egy rögzített próbához közvetlenül szomszédosán hibridizálódtak. A legelőnyösebb megvalósítási módokban a szomszédos rögzített és jelölt próbákat is ebben a stádiumban ligáljuk össze.

Ezután a jelölőanyag kimutatásával detektáljuk a másodlagos komplexeket, és a hibridizált, rögzített és jelölt próbák ismert szekvenciáinak összeállításával a másodlagos komplexekben lévő nukleinsavfragmentekből F+P hosszúságú szekvenciákat azonosítunk. Ezután az F+P hosszúságú szekvenciák átfedő szakaszait kell azonosítani, s a meghatározott átfedő szekvenciákból rekonstruálhatjuk, illetve összeállíthatjuk a molekula teljes nukleinsavszekvenciáját.

A találmány szerinti eljárásokban az első sorozatba tartozó oligonukleotidokat bármely ismert módszer alkalmazásával hozzákapcsolhatjuk, azaz rögzíthetjük a szilárd hordozóhoz. A kapcsolást végezhetjük például irányítható, lézer aktiválta védőcsoport-eltávolítással (Fodor és munkatársai, Science, 251, 767-768, 1991; Pease és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 91, 5022-5026, 1994). Az egyik előnyös eljárás szerint az oligonukleotidpróbákat olyan reagensek alkalmazásával, mint a nukleozid-foszfor-amidit vagy nukleozidhidrogén-foszforát, foszfátcsoportjukon keresztül üveg-, nejlon- vagy teflonhordozókhoz kapcsoljuk (lásd Southern és Maskos, WO 90/03382 számú PCT szabadalmi bejelentés; melyet itt hivatkozásul említünk). Egy másik előnyös eljárás a Pease és munkatársai által leírt, fény által irányított szintézis (Pease és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sei., 91, 5022-5026, 1994; melyet itt hivatkozásul említünk). Vásárolhatók hordozóhoz kötött oligonukleotidsorozatok is, mint például amelyeket az Affymetrix és a Beckman kínál.

A rögzített próbák olyan sorozattá alakíthatók, amely egy adott hosszúságban (előnyösen 4-10 bázis) valamennyi próbát (vagy a próbák részhalmazát) tartalmazza. A rögzített oligonukleotidokból előnyösebben összetett sorozatokat alakíthatunk ki, melyeket úgynevezett „szekvenálócsip”-eknek nevezünk. Ilyen csipre példa, amikor hidrofób szegmenteket alkalmazunk különálló térbeli területek kialakításához. A szekvenálócsipek különböző alkalmazási területekhez alakíthatók ki, mint például térképezéshez, részleges szekvenáláshoz, megcélzott régiók szekvenálásához (diagnosztikai célokra), mRNS-szekvenáláshoz, valamint nagy méretekben végzett genomszekvenáláshoz. Minden egyes alkalmazáshoz különböző méretű próbákat vagy a próbák nem teljes sorozatát tartalmazó specifikus csip tervezhető.

Az egyik példaként szolgáló megvalósítási módban az oligonukleotidpróbák mindkét sorozatában hat bázisból álló próbákat (azaz 6-mereket) alkalmazunk. Ebben az esetben valamennyi sorozat 4096 különböző próbából áll. Az első próbasorozatot előnyösen 64 sorban és 64 oszlopban elrendezett módon egy mikrocsipen rögzítjük. A második, 4096 oligonukleotidpróbából álló sorozatot detektálható jelölőanyaggal jelöljük, és különálló csövek alkotta sorozatba osztjuk szét. Ebben a példában 4096 csip egy nagy tömbben vagy több tömbben egyesíthető. A nukleinsavfragmentek hibridizálása után a második hibridizációs lépéshez a jelölt oligonukleotidok kis mennyiségét adjuk egyes mikrocsipekhez - mindegyik mikrocsiphez a 4096 nukleotid mindegyikéből csupán egyet kell hozzáadni.

A találmány további tárgya nukleinsavszekvenáláshoz alkalmazható készletek, melyek általában ismert szekvenciájú oligonukleotidpróbák sorozatát tartalmazó szilárd hordozóból (lásd 2A., 2B. és 2C. ábra) (mely oligonukleotidok hibridizációs reakcióra képesek); valamint ismert szekvenciájú, jelölt oligonukleotidpróbák oldatait tartalmazó tartályok sorozatából áll. A találmány tárgyát képezik az olyan elrendezések, mint amilyen a 4. ábrán látható. Ezen az ábrán az univerzális bázis kapcsolási módszerként vagy a terminálison való alkalmazását mutatjuk be, ami a fragmentek hibridizációjához megnövelt méretet biztosít.

A készletekben a rögzített és az oldatban lévő oligonukleotidpróbák mérete körülbelül 4-9 bp, előnyösen 6 bp. Az oligonukleotidpróbák kémiailag detektálhatok vagy radioaktív jelölőanyagokkal jelölhetők; általában a ³²P-izotóppal jelölt próbák az előnyösek, még előnyösebbek a ³³P-izotóppal jelöltek. A készletek tartalmazhatnak kémiai vagy egyéb ligálószert, például DNS ligáz enzimet. A készletekben számos további készítmény és anyag is alkalmazható, például 96 hegyű vagy 96 tűs eszközök, pufferek, a hosszú nukleinsavmolekulák hasításához való reagensek, valamint a

HU 218 597 Β

DNS-fragmentek méret szerinti szelektálásához alkalmas eszközök. A készletek ezenkívül tartalmazhatnak jelölt RNS-próbákat is, hogy a próbákat RN-ázos kezeléssel el lehessen távolítani, és a szekvenáló csipeket újra lehessen alkalmazni.

Az ábrák rövid leírása

Az 1. ábrán a hibridizálási folyamat alapvető lépéseit mutatjuk be. 1. lépés: a szekvenálni kívánt, jelöletlen cél-DNS-t (T) szelektív feltételek mellett rögzített oligonukleotidpróbák sorozatához hibridizáljuk. Jelöltük az Fx és Fy próbát tartalmazó helyeket. Az Fx és Fy próbával komplementer szekvenciák a T cél-DNS különböző helyein találhatók. 2. lépés: a jelölt próbákat (Pi; csipenként egy próba) a sorozathoz hibridizáljuk. Feltüntettünk egy Pj próbát, amelynek a T cél-DNS-en egy komplementer célszekvenciája van. Ez a próba szomszédos Fx-szel, Fy-nal azonban nem. 3. lépés: szelektív feltételek vagy reagensek alkalmazásával szelektíven „felolvasztjuk” a szomszédos próbákkal nem rendelkező komplexeket. Egy konkrét példa: amikor egy jelölt próba közvetlenül egy rögzített próbával határos helyzetben hibridizálódik a szekvenálni kívánt cél-DNS-hez, a jelölt próbát a rögzített próbához ligáljuk. Pozitív jeleket csak a szomszédos próbák esetében detektálunk, mint az Fx és Pi esetében, és példánknál maradva, csak a ligáit próbák esetében.

A 2A„ 2B. és 2C. ábrán egy példaként szolgáló szekvenálókészlet komponenseit mutatjuk be.

A 2A. ábrán szekvenálócsipet mutatunk be, amely 4^P darab azonos méretű rekeszből áll, mely rekeszek azonos (vagy különböző) oligonukleotidsorozatokat tartalmaznak. A rekeszek fizikai korlátokkal vagy hidrofób sávokkal különíthetők el egymástól. A sorozatban 4000-16 000 oligocsip található.

A 2B. ábrán a csip egy rekeszének nagyítása látható. A rekesz 4^F foltot tartalmaz, melyek mindegyike az adott helyen szintetizált vagy odacseppentett egy bizonyos oligonukleotidpróbából (4000-16 000) áll. A foltok néhány mikron nagyságúak, míg a rekeszek körülbelül 1-10 mm-esek.

A 2C. ábrán csősorozatot, illetve egy vagy több többüregű lemezt mutatunk be, amely megfelelő számú (esetünkben 4^P darab) üreget tartalmaz. Valamennyi üregben bizonyos mennyiségű, specifikusan jelölt oligonukleotid található. További próbákat tárolhatunk jelöletlenül, ha a jelölést nem a szintézis során végezzük; ebben az esetben a szekvenálókészlet a próba jelöléséhez szükséges komponenseket is tartalmazza. A csöveket/üregeket a szekvenálócsip rekeszeivel összekötő vonalak a szekvenálás egyik lépését ábrázolják, amikor a jelölt próba bizonyos mennyiségét átvisszük egy adott rekeszbe. Az átvitel megoldható pipettázással vagy a felületi feszültség kihasználásával átvivőfésűvel. Az átvitelhez való eszközök szintén a szekvenálókészlet részét képezhetik.

A 3A., 3B. és 3C. ábrán bizonyos mennyiségű DNS-molekula random hasításával előállított DNS-fragmentek hibridizációját mutatjuk be. A 3A. ábrán a T, DNS-fragment mind a rögzített, mind a rögzítetlen, jelölt próba számára komplett célszekvenciákat tartalmaz. A 3B. ábrán azt az esetet mutatjuk be, amikor a T DNS-fragment nem megfelelő módon van hasítva. A 3C. ábrán a P próbának elegendő helye van a hibridizációhoz, de a szomszédos szekvencia nem komplementer vele. Mind a B, mind a C esetben a rögzített F próba molekuláinak telítettsége miatt csökkent jelet kapunk. A pontos szomszédos (egymással határos) hibridizációk hozama fokozásának lehetséges módjai a DNSfragmentek és ajelölt próbák egyidejű hibridizációja, illetve a hibridizációs folyamat ciklusos ismétlése.

A 4. ábrán az univerzális bázis linkerként vagy terminális bázisként hibridizációhoz való alkalmazását mutatjuk be. A próba szintéziséhez az univerzális bázisokat (M bázis; Nichols és munkatársai, Natúré, 369, 492,1994) vagy mind a négy bázist alkalmazhatjuk. Ezzel a módszerrel növelhető a próbák hosszúsága, s ezáltal a duplexek stabilitása is fokozható anélkül, hogy a próbák számát növelnénk. Ha a próbák szabad végén univerzális bázisokat alkalmazunk, olyan spacert kapunk, amely lehetővé teszi, hogy a szekvencia leolvasása más leolvasási keretben történjen.

A nukleinsavmolekulák szekvenciájának meghatározása az alap- és alkalmazott biológiai kutatások valamennyi területén alapvető jelentőségű (Drmanac és Crkvenjakov, Scientia Yugoslavica, 16, 97, 1990). Jelen találmány tárgya új és hatékony eljárások nukleinsavmolekulák szekvenálásában és analizálásában való alkalmazáshoz. A találmány szerinti eljárás egyik megcélzott alkalmazási területe (más szekvenálási technikákkal együtt) a Humán Genom Projektben (HGP) való felhasználás.

Jelenleg a hibridizálással végzett szekvenálás (SBH) két eljárása ismert. Az elsőben (Formát 1) maximálisan 100-2000 nukleotid hosszúságú ismeretlen genomiális DNS-eket vagy oligonukleotidokat rendeznek el szilárd szubsztráton. Ezeket a DNS-eket később jelölt próbák (melyek általában 6-8-merek) sorozatával végzett hibridizációval vizsgálják. A fordított eljárásban (Formát 2) 8-8 nukleotidból álló oligomereket rögzítenek a szilárd hordozón, majd ezeket klónozott és jelölt DNS-szakaszokhoz hibridizálják.

Az SBH-analízis mindkét típusában sok lépést kell elvégezni ahhoz, hogy pontosan meghatározott szekvenciához jussunk. A jelenlegi SBH-módszerek legjelentősebb problémái a nagy mennyiségű próba szintézisével, illetve a hatékony szelektív hibridizálás nehézségeivel kapcsolatosak. A teljes párosodás-hibás párosodás megkülönböztetés két fő ok miatt bonyolult. Elsőként, a 10 bázisnál hosszabb próbák végén lévő hibás párosodások kevéssé megkülönböztető hatásúak; másodszor, egy hosszú DNS-fragment analizálásakor a jelölt DNS-szegmentek komplex elegye nagy háttérjelet hoz létre.

Találmányunkban olyan hatékony szelektív hibridizációs eljárást írunk le, amelyhez nincs szükség nagyszámú próbára vagy hosszú próbákra, és amely kiküszöböli a sok jelölési és klónozási lépést, melyek az ismert SBH-módszerek jellemző hátrányai. Az általunk leírt, igen hatékony nukleinsavszekvenálási eljárások, melyeket Formát 3-nak nevezünk, két kisméretű, is7

HU 218 597 Β mert szekvenciájú oligonukleotidpróba-sorozat hibridizációján alapulnak, miáltal legalább a próbák szekvenciájának kétszerese határozható meg. Ezek az eljárások igen nagy méretű nukleinsavmolekulák (beleértve a kromoszómákat is) szekvenálását teszik lehetővé, és kiküszöbölik az egyéb SBH-módszerek problémáit, például a nagyszámú nukleinsavfragment kapcsolását és jelölését. A találmány szerinti eljárások különösen hatékonyak, mivel RNS, sőt, amplifikálatlan RNS-minták szekvenálásához is alkalmazhatók.

Találmányunk után (lásd 08/127,402 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés és Drmanac: Abstract Book fór Genome Mapping and Sequencing, Richard Myers, Dávid Porteous és Róbert Waterstone átdolgozásában, Cold Spring Harbor Laboratories, 60. oldal, 1994) az SBH egy másik változatát is leírták, melyet pozicionális SBH-nak (PSBH) neveztek el (Broude és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3072-3073, 1994). A PSBH-eljárás lényegében a 2. SBH-változat Formát 2; melyben az ismert szekvenciájú oligonukleotidokat rögzítik, és előzetesen jelölt, ismeretlen szekvenciával rendelkező nukleinsavak hibridizálásához alkalmazzák) egy további változata. A PSBH-eljárásban a rögzített próbák nem egyszálúak, hanem duplexek, melyek egyszálú 3’ túlnyúló végeket tartalmaznak. A biotinilált duplex próbákat sztreptavidinnel bevont mágneses gyöngyökön rögzítik, ami sajátos típusú rögzített próbát eredményez, majd ezeket a szekvenálni kívánt, ³²P-izotóppal jelölt cél-nukleinsavval elegyítik. Az elegyhez ezután T₄ DNS-ligázt adnak, hogy a hibridizálódott cél-DNS-eket a duplex próba rövidebb végéhez ligálják.

Annak ellenére, hogy a PSBH egy érdekes módszer (Broude és munkatársai, lásd fentebb), nem mutat jelentős előnyöket a korábbi SBH-technikákkal szemben. Például a jelen találmány szerinti 3. változattól (Formát 3) eltérően, a PSBH-eljárásban egy „menetben” nem növelhető a meghatározható szekvencia hosszúsága. A PSBH-eljárásban továbbra is szükség van az ismeretlen cél-DNS munkaigényes jelölésére, ami a Formát 3 esetében szükségtelen. A PSBH-módszert általában összehasonlító vizsgálatokhoz vagy térképezéshez ajánlják, és nem de novo genomszekvenáláshoz. Ennek megfelelően lényegesen eltér a Formát 3 változattól, amely (annak ellenére, hogy valamennyi szekvenálási területen alkalmazható) a legnagyobb genomok szekvenálásának is hatékony módszere.

A találmány szerinti eljárásban a szekvenálni kívánt nukleinsavak ffagmentálására lehet szükség. Ezt például restrikciós enzimes emésztéssel (különösen CviJI enzimmel, lásd Fitzgerald és munkatársai, Nucleic Acids Research, 20(14), 3753-3762, 1992); fizikai módszerekkel, például ultrahangos kezeléssel végzett hasítással;, illetve nátrium-hidroxidos kezeléssel és hasonló módszerekkel valósíthatjuk meg. Kívánt esetben géllemezből megfelelő hosszúságú (például körülbelül 10-40 bp hosszú) fragmenteket vághatunk ki. Az eredeti molekula (például humán kromoszóma) teljes nukleinsavszekvenciája az eredeti molekulában megtalálható F+P szekvenciák meghatározásával és az átfedő

F+P szekvenciák részleteinek összeállításával határozható meg. Következésképpen, nincs szükség a ffagmentszekvenciák meghatározására, mert a teljes molekula szekvenciáját a felvázolt F+P szekvenciákból állítjuk össze.

Általánosan feltételezzük, hogy a szekvenálni kívánt nukleinsavak szekvenciáját négy bázis építi fel. A DNS esetében ezek az adenin (A), guanin (G), citozin (C) és timin (T), míg az RNS esetében A, G, C és uracil (U). Bizonyos megvalósítási módokban azonban a kisméretű oligonukleotidpróbákban előnyös lehet módosított bázisokat alkalmazni. A találmány gyakorlati megvalósításához általában először bizonyos mennyiségű kisméretű, meghatározott hosszúságú oligonukleotidpróbát kell készíteni, melyek a próba adott hosszúságában a szekvenciák valamennyi lehetséges kombinációját lefedik. Ez a mennyiség 4^N-nel fejezhető ki, ahol N jelentése a próba hosszúsága. Például egy 6-mer próba esetében 4096 lehetséges szekvencia létezik (4⁶=4096).

Az F hosszúságú próbák egy sorozatát (4^F) egy mikrocsipen négyzetes elrendezésben kell rögzíteni, ami történhet 1 mm²-en vagy 1 cm²-en. Esetünkben a próbákat 64 sorban és 64 oszlopban rendezzük el. Természetesen meg kell bizonyosodnunk arról, hogy az oligonukleotidpróbák hozzákapcsolódtak-e a mikrocsip felületéhez, mert csak így tudnak részt venni a hibridizációs reakciókban. Egy másik sorozat oligonukleotidpróbát is szintetizálunk, mely sorozat 4^P számú, P hosszúságú oligonukleotidpróbából áll. Az e „P sorozatban” lévő oligonukleotidpróbákat detektálható jelölőanyaggal jelöljük, és csövek sorozatába osztjuk szét (2A„ 2B. és 2C. ábra).

Egy nagy (vagy több, hozzávetőleg 10-100 cm²-es) tömbben 4^P számú csipet rendezhetünk el (a P a második oligomersorozatban lévő oligonukleotidok hosszának felel meg) (2A., 2B. és 2C. ábra). Megfelelő példaként P értékét hatnak választjuk.

A szekvenálni kívánt nukleinsavat ismeretlen szekvenciájú, rövidebb nukleinsavfragmentekre hasíthatjuk. E fragmentek átlagos hosszúsága (T) általában nagyobb, mint F és P összege, és a T hosszúság körülbelül az F hosszúság háromszorosával egyenlő (F+P<T; T=körülbelül 3F). Esetünkben hozzávetőleg 20 bázispárból álló nukleinsavfragmenteket alakítunk ki. Ezeket a fragmenteket denaturáljuk és a nagy tömbökhöz adjuk, olyan feltételek mellett, amelyek elősegítik a komplementer szekvenciák hibridizációját.

A találmány legegyszerűbb és jelenleg előnyben részesített megvalósítási módjában a hibridizálási feltételeket úgy választjuk meg, hogy csak akkor játszódjon le jelentős mértékű hibridizáció, ha egy nukleinsavban hat egymást követő nukleotid teljes mértékben komplementer egy F oligonukleotidpróba hat nukleotidjával. Az ilyen hibridizációs feltételek próbavizsgálatokkal határozhatók meg, melyekben a hőmérsékletet, a különböző komponensek koncentrációját, az egyes lépések időtartamát, az alkalmazott puffereket, valamint a puffer pH-ját variáljuk.

Ennél a pontnál valamennyi mikrocsip tartalmazhat bizonyos hibridizált komplexeket. Ezek lehetnek pró8

HU 218 597 Β bafragment komplexek, melyekben a próba teljes szekvenciája hibridizálódott a fragmenthez, de amelyekben a fragment, mivel hosszabb, rendelkezik hibridizálatlan szekvenciákkal, melyek „farkat” vagy „farkakat” képeznek. E példában a komplementer, hibridizálódott szekvenciák hossza F, míg a hibridizálatlan szekvenciák hossza (T-F). Ha a fragment komplementer szakasza a megfelelő végen (vagy annak irányában) helyezkedik el, egyetlen hosszabb, hibridizálatlan farok képződik, míg ha a fragment komplementer szakasza az ellenkező vég irányában található, két hibridizálatlan farok alakul ki (3A., 3B. és 3C. ábra).

A nem hibridizált, nem komplementer nukleinsavfragmentek eltávolítása érdekében végzett mosás után valamennyi mikrocsiphez a P sorozatban lévő jelölt oligonukleotidok egy kis mennyiségét adjuk, hogy ezek az oligonukleotidok hibridizálódjanak az ismeretlen szekvencia próbafragment komplexekből kinyúló nukleinsav farkához. Az egyes mikrocsipekhez a 4^P nukleotid mindegyikéből csupán egyet adunk. Jelenleg előnyösen olyan hibridizációs feltételeket alkalmazunk, amelyek csak akkor teszik lehetővé a jelentős mértékű hibridizációt, ha egy jelölt próba mind a hat nukleotidja komplementer egy nukleinsavfragment-farok hat egymást követő nukleotidjával. A hibridizációs feltételeket a fentebb leírt próbavizsgálatokkal határozzuk meg, melyekben a hőmérsékletet, koncentrációt, időt, puffereket és hasonlókat variáljuk.

Ennél a pontnál valamennyi mikrocsip tartalmazhat bizonyos „másodlagosan hibridizálódott komplexeket”. Ezek lehetnek próbafragmentkomplexek, melyekben minden egyes próba teljes szekvenciája hibridizálódott a fragmenthez, és amelyekben a fragment valószínűleg rendelkezik valamilyen hosszúságú hibridizálatlan szekvenciával. Ezekben a másodlagos hibridizált komplexekben a rögzített próba és a jelölt próba úgy hibridizálódik a fragmenthez, hogy a két próba közvetlenül határos legyen egymással. Mivel a fragmentek általában hosszabbak, mint a próbák hosszúságának összege, a rögzített próba és a jelölt próba nem határos elhelyezkedésben, egy vagy több báziskülönbséggel is hibridizálódhat a fragmenthez.

A nagy tömböket ezután a hibridizálatlan jelölt próbák eltávolításához alkalmas eljárással kezeljük. Az előnyös megvalósítási módokban az alkalmazott eljárás nemcsak a hibridizálatlan jelölt próbákat távolítja el a tömbről, hanem az egymással nem határos helyzetben hibridizálódott jelölt próbákat is. Az eljárásban szelektív körülményeket alkalmazunk, hogy elkülönítsük az egymással határos helyzetben hibridizálódott rögzített és jelölt próbákat tartalmazó másodlagos hibridizációs komplexeket azoktól a másodlagos komplexektől, amelyekben a nukleinsavfragment két, egymással nem határos próbához hibridizálódott. Ez a találmány lényeges sajátossága, amennyiben lehetővé teszi a fragment (rögzített próba és jelölt próba egymás mellé helyezett szekvenciájának megfelelő) szakaszának végső leírását.

A hibridizálatlan és az egymással nem határos elhelyezkedésben hibridizálódott próbák tömbtől való eltávolításához alkalmazott szelektív eljárásként (amely az egymással határos elhelyezkedésben hibridizálódott próbák kapcsolódását nem befolyásolja) kontrollált mosási eljárást alkalmazhatunk. A szomszédos elhelyezkedésben hibridizálódott próbákat a kiválasztott körülmények nem befolyásolják, mivel ezek a próbák a szomszédos nukleotidok összekapcsolódása miatt fokozott stabilitásúak. Az előnyös megvalósítási módokban azonban a nagy tömböket úgy kezeljük, hogy valamennyi szomszédos próba kovalensen kapcsolódjon, amit úgy érhetünk el, hogy a tömböket kémiai ligálóágenssel, vagy előnyösebben, ligáz enzimmel, például T₄ DNS-ligázzal kezeljük (Landegren és munkatársai, Science, 241, 1077-1080,1988; Wu és Wallace, Gene, 76, 245-254, 1989).

Bármely kezelési módot választjuk, a teljes tömböt szigorú feltételek mellett mosásnak vetjük alá, hogy a tömbhöz kapcsolódva csak azok a kétszálú próbafragment-próba komplexek maradjanak, amelyek F+P (esetünkben 12 nukleotid) hosszúságú, szomszédos elhelyezkedésben hibridizálódott szakaszokat tartalmaznak. E kétlépéses hibridizációs reakció alkalmazásával hatékony szétválasztás érhető el, mivel három vagy négy szelektív folyamatot, kell figyelembe venni: a T fragment F bázis hosszúságú próbához való szelektív hibridizációját; a P bázis hosszúságú próba T fragmenthez való szelektív hibridizációját; a teljes bázispárosodású (F+T+P) hibrid P hibridekhez vagy még inkább, a nem szomszédos F+P próbákat tartalmazó, hibás bázispárosodású hibridekhez viszonyított szelektív stabilitását; valamint az F és P két végén lévő bázisok szelektív ligálását.

Ezek után a tömbön maradt jelölőanyag elhelyezkedésének megfigyelésével kimutathatók az úgynevezett szomszédos másodlagos komplexek. A jelölőanyag elhelyezkedése alapján a fragment F+P (példánkban 12) nukleotid hosszúságú szekvenciái határozhatók meg, oly módon, hogy egyesítjük a rögzített és jelölt próbák ismert szekvenciáit. Ezután a meghatározott F+P átfedő szekvenciákból rekonstruálhatjuk, illetve összeállíthatjuk az eredeti molekula, például egy humán kromoszóma teljes nukleinsavszekvenciáját.

Ha a szekvenálási eljárásban ligálást alkalmazunk (amit jelenleg előnyben részesítünk), a szokásos oligonukleotidcsipek nem használhatók fel újra. Úgy tartjuk, hogy ez nem jelent akadályt, mivel az újrafelhasználásra számos módszer áll rendelkezésre. Például a próbák között specifikusan hasítható kötést alakíthatunk ki, melyet a detektálás után elhasítunk. Más lehetőség szerint a második (P) próbaként ribonukleotidokat (vagy a P próbában a kapcsoló bázisként ribonukleotidot) alkalmazhatunk, miáltal az ilyen próbák RN-ázzal vagy uracil-DNS-glikozilát kezeléssel eltávolíthatók (Craig és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 17(12), 4605, 1989). Egyéb módszerként kémiai ligálással olyan kötéseket alakíthatók ki, amelyek szelektíven hasíthatok (Dolinnaya és munkatársai, Nucleic Acids Research, 16(9), 3721-3738,1988).

A találmány szerinti szekvenálási technika további változatai és javításai szintén a találmány tárgykörébe tartoznak. Ezek közé tartozik a módosított oligonukleo9

HU 218 597 Β tidok alkalmazása, melyekkel fokozható az eljárások specifitása és hatékonysága, hasonlóan a Hoheisel és Lehrach által leírtakhoz (FEBS Lett., 274(1,2), 103-106, 1990). A hibridizációs jel fokozása érdekében ciklikus hibridizációt is alkalmazhatunk, hasonlóan a PCR-technikában alkalmazotthoz. Ezekben az esetekben bizonyos próbák visszahibridizálásához különböző hőmérsékleteket alkalmazhatunk. A találmány egy további tárgyaként eljárást írunk le a leolvasási keret eltolódásainak meghatározásához, melynek során olyan próbák ekvimoláris mennyiségeit alkalmazzuk, amelyek végükön különböző bázisokat tartalmaznak [például ekvimoláris 7-mereket alkalmazhatunk, melyek első hat bázisa megegyezik, s csak az utolsó bázisban különböznek (A, T, C vagy G)].

A következő példákat a találmány előnyös megvalósítási módjainak bemutatása érdekében újuk le. A példákban leírt, általunk felfedezett technikák a találmány gyakorlati megvalósításában jól alkalmazhatók, következésképpen annak előnyös módjainak tartjuk. A találmány leírása alapján a szakemberek számára nyilvánvaló lesz, hogy a specifikus megvalósítási módokban sok változtatás végezhető, melyekkel hasonló eredmény érhető el, anélkül hogy eltérnénk a találmány tárgykörétől.

1. példa

Hordozóhoz kötött oligonukleotidok előállítása

Az oligonukleotidok (rövid nukleinsavszegmentek) könnyen előállíthatók, például kémiai módszerekkel végzett közvetlen oligonukleotidszintézissel, amit általában automata oligonukleotidszintetizáló berendezésben végzünk.

A hordozóhoz kötött oligonukleotidok az ismert módszerek bármelyikével előállíthatók, amihez bármilyen megfelelő hordozót alkalmazhatunk, például üveget, polisztirolt vagy teflont. Az egyik módszer szerint a standard szintetizálóberendezésekben szintetizált oligonukleotidokat pontosan a megfelelő helyre cseppentjük. A rögzítés (immobilizálás) passzív adszorpcióval (Inouye és Hondo, J. Clin. Microb., 28, 1469-1472, 1990); UV fény alkalmazásával (Nagata és munkatársai, FEBS Letters, 183, 379-382, 1985; Dahlen és munkatársai, Mól. Cell. Probes, 1, 159-168, 1987; Morriey és Collins, Mól. Cell. Probes, 3, 189-207, 1989) vagy a módosított bázist tartalmazó DNS kovalens kötésével (Keller és munkatársai, Anal. Biochem., 170, 441-450, 1988; Anal. Biochem., 177, 27-32,1989) végezhető (a felsorolt források mindegyikét hivatkozásul említjük).

Egy másik alkalmas módszer szerint linkerként erős biotin-sztreptavidin kölcsönhatást alkalmazhatunk. Broude és munkatársai (lásd fentebb) például biotinilált próbák alkalmazását írják le, bár ezek a próbák duplexek, melyeket sztreptavidinnel bevont mágneses golyókon rögzítenek. A sztreptavidinnel bevont golyók a Dynaltól (Oslo, Norvégia) szerezhetők be. Természetesen ez a kapcsolási módszer bármilyen felület sztreptavidinnel való bevonásához alkalmazható. A biotinilált próbák különböző forrásokból, például az Operon Technologiestől (Alameda, CA) szerezhetők be.

A Nunc Laboratories (Naperville, IL) is forgalmaz megfelelő anyagokat, amelyek esetünkben felhasználhatók. A Nunc Laboratories kifejlesztett egy olyan eljárást, amellyel a DNS mikroüregű felülethez (CovaLink NH) kovalensen köthető. A CovaLink NH szekunder aminocsoportokkal (>NH) ellátott polisztirolfelület, melyben az aminocsoportok a kovalens kapcsoláshoz kötőhelyként szolgálnak. A CovaLink Modulok a Nunc Laboratoriestől szerezhetők be. A DNS-molekulák kizárólag 5’-végüknél, foszfor-amidát kötéssel kapcsolhatók a CovaLinkhez, ami több mint 1 pmol DNS rögzítését teszi lehetővé (Rasmussen és munkatársai, Analytical Biochemistry, 198, 138-142,1991).

A CovaLink NH csíkok DNS-molekulák (5’végüknél) kovalens kötéséhez való alkalmazását Rasmussen és munkatársai írták le (lásd fentebb). Ebben az eljárásban foszfor-amidát kötést alkalmaznak (Chu és munkatársai, Nucleic Acids Rés., 11, 6513-6529, 1983). Ez a technika azért hasznos, mivel csak az egyszeres kovalens kötéssel létrejött rögzítés az előnyös. A foszfor-amidát kötés a DNS-t a CovaLink NH szekunder, aminocsoportjaihoz kapcsolja, mely aminocsoportok a polisztirolfelülethez kovalensen kapcsolt 2 nm hosszúságú távtartó (spacer) karok végein helyezkednek el. Ahhoz, hogy a CovaLink NHhoz egy oligonukleotidot foszfor-amidát kötéssel kapcsolhassunk, az oligonukleotidnak 5’-végén foszfátcsoportot kell tartalmaznia. A CovaLinkhez való kapcsoláshoz talán a biotin alkalmasabb, s a próbák kötéséhez sztreptavidin alkalmazható.

Részletesebben: a kapcsolási eljárás során DNS-t vízben oldunk (7,5 ng/μΐ), 10 percig 95 °C-on denaturáljuk, majd jégen 10 percig hűtjük. Az elegyhez 0,1 M jéghideg 1-metil-imidazolt (1-Melm₇; pH=7,0) adunk, hogy az 1-Melm₇ végkoncentrációja 10 mM legyen. Ezután a jégen tartott CovaLink NH csíkokra ssDNSoldatot adagolunk (75 μΐ/üreg).

Üregenként 25 μΐ mennyiségben frissen készített, 10 mM 1-Melm₇ oldatban feloldott 0,2 M l-etil-3-(3dimetil-amino-propil)-karbodiimidet (EDC) adunk. A csíkokat 5 órán keresztül 50 °C-on inkubáljuk, majd például Nunc-Immuno Wash alkalmazásával mossuk; az üregeket először háromszor mossuk, majd 5 percig mosóoldatban áztatjuk, végül ismét háromszor mossuk (a mosóoldat összetétele: 0,4 N NaOH, 0,25% SDS; 50 °C-ra melegítve).

A találmányban alkalmazható másik alkalmas eljárás a Southern és Maskos által leírt módszer (WO 90/03382 számú PCT szabadalmi bejelentés; melyet itt hivatkozásul említünk). A hordozóhoz kötött oligonukleotidok előállításának ezen eljárása során egy nukleozid 3’-reagenst kovalens foszfodiészter. kötéssel a hordozó alifás hidroxilcsoportjaihoz kapcsolunk. Az oligonukleotidot ezután a hordozóhoz kapcsolt nukleozidon szintetizáljuk, és a védőcsoportokat standard körülmények között (melyek nem okozzák az oligonukleotid hordozóról történő lehasadását) eltávolítjuk a szintetikus oligonukleotidláncról. A megfelelő reagensek közé tartozik a nukleozid-foszforamidit és a nukleozid-hidrogén-foszforát.

HU 218 597 Β

Az említett eljárás alkalmazásához egy hordozót, például üveglapot xilol, glicidoxi-propil-trimetoxi-szilán és nyomnyi diizopropil-etil-amin elegyével 90 °C-on egy éjszakán át kezelünk, majd metanollal és éterrel alapos mosást végzünk, és levegőn szárítjuk. A kezelt hordozót argonatmoszféra alatt, katalitikus mennyiségű koncentrált kénsavat tartalmazó hexaetilén-glikolban 80 °C-on egy éjszakán át, keverés közben melegítjük, miáltal alkilhidroxil-csoportokat tartalmazó hordozót kapunk. Metanollal és éterrel végzett mosás után a hordozót vákuum alatt szárítjuk, és argon alatt -20 °C-on tartjuk.

Az oligonukleotidszintézist standard körülmények között, szilárd hordozóként a kezelt üveglapot alkalmazva végezzük. Az első nukleotid 3’-hidrogén-foszfát, melyet trietil-ammóniumsó formájában alkalmazunk. Ezzel a módszerrel nagy tisztaságú, hordozóhoz kötött oligonukleotidokat kapunk.

A DNS-próbasorozatok előállításához „on-csip” módszert alkalmazhatunk. Például az oligonukleotidok közvetlenül üvegfelületen történő kémiai szintéziséhez irányítható, lézer aktiválta, fény hatására bekövetkező védőcsoport-eltávolítást alkalmazhatunk (lásd Fodor és munkatársai, Science, 251, 767-768, 1991; melyet itt hivatkozásul említünk). A próbákat nejlonhordozókon is rögzíthetjük (lásd Van Ness és munkatársai, Nucleic Acids Research, 19(12), 3345, 1991), illetve Duncan és Cavalier eljárásának (Analytical Biochemistry, 169, 104-108, 1988) alkalmazásával teflonhoz kapcsolhatjuk (a fenti forrásokat itt hivatkozásul említjük).

Fodor és munkatársai (lásd fentebb) dinukleotidok fény irányította szintézisét írták le, amely komplex vegyületek térbelileg irányított szintéziséhez alkalmazható. Ezen eljárás során a vegyületek szilárd hordozón történő egyidejű szintézisének irányításához fényt alkalmaznak. A fény vagy más energiaforma sablonon keresztül átjutó (vagy más, térbelileg irányítható) mintázata határozza meg, hogy a hordozó mely területe aktiválódik a kémiai kapcsoláshoz. A fény hatására bekövetkező aktiválás a fénybomlékony védőcsoportok kiválasztott területekről történő eltávolításából ered. A védőcsoportok eltávolítása után egy fénybomlékony védőcsoportot tartalmazó első vegyületet adunk a teljes felülethez, de reakció csak azokkal a területekkel jön létre, amelyeket az előző lépésben fénnyel kezeltünk. A szubsztrátot ezután egy másik sablonon keresztül világítjuk meg, miáltal egy második védett építőegységgel való reakcióhoz egy másik területet aktiválunk. A végtermékeket és elhelyezkedésüket a megvilágításhoz alkalmazott sablonok, valamint a reaktánsok szekvenciája határozza meg. A Fodor-eljárással nagyfokú miniatürizálás valósítható meg, mivel a szintetizálási helyek sűrűségét csak fizikai tényező, azaz a fényelhajlás korlátozza. Valamennyi vegyület hozzáférhető, és elhelyezkedésük pontosan ismert. Az így előállított oligonukleotidcsip felhasználható az SBH-technikában.

Fodor és munkatársai (lásd fentebb) a dinukleotidok fény aktiválta kialakítását az alábbiak szerint írták le. 3’-O-timidin-acetátból 5’-nitro-veratril-timidint szintetizáltak. A védőcsoport bázissal végzett eltávolítása után az 5’-nitro-veratril-timidint 3’-hidroxilcsoporton keresztül aminált szubsztráthoz kapcsolták. A nitro-veratril védőcsoportokat 500 μιη-es sakktábla-mintázatú sablonon keresztüli megvilágítással távolították el. A szubsztrátot ezután foszfor-amidittel aktivált 2’-dezoxi-citidinnel kezelték. A reakció fluorometrikus nyomon követése érdekében a dezoxi-citidint gyűrűn kívüli aminocsoporthoz kapcsolt, FMOC csoporttal védett amino-hexil linkerrel módosították. Az FMOC védőcsoport bázissal végzett eltávolítása után a dinukleotidot tartalmazó részeket (a szubsztrát FITC-vel végzett kezelésével) fluoreszcens jelölésnek vetették alá. E módszert követve hordozóhoz kötött oligonukleotidok szintetizálhatók.

Az oligonukleotidok nejlonhordozóhoz való kapcsolásához (amit Van Ness és munkatársai írtak le, lásd fentebb) a nejlonfelületet alkilezéssel és az oligonukleotidok 5’-aminocsoportjának cianur-kloriddal végzett szelektív aktiválásával aktiválni kell. Ehhez a nejlon felszínét trietil-oxónium-tetrafluor-boráttal etiláljuk, hogy a nejlon felületén amin-reaktív imidát-észtereket alakítsunk ki. Oldószerként l-metil-2-pirrolidont alkalmazunk. A nejlonfelületet nyersen hagyjuk, hogy a lehető legnagyobb felületet érjük el.

Az aktivált felületet poli(etilén-iminnel) (M=körülbelül 10-70 kD) reagáltatjuk, hogy polimer burkolatot hozzunk létre, amely az oligonukleotidpróbák kapcsolódásához megnövelt, aminocsoportokkal rendelkező felületet biztosít. Az aminfarkakat tartalmazó oligonukleotidok (kizárólag az amincsoportot tartalmazó végeken) szelektíven reagálnak a feleslegben lévő cianurkloriddal, miáltal kvantitatív kitermeléssel 4,6-diklór1,3,5-triazinil-oligonukleotidokat kapunk. A cianurklorid egy klórgyökének aminocsoport által történő áthelyeződése jelentősen csökkenti a megmaradt klórgyökök reaktivitását. Ez a 4,6-diklór-l,3,5-triazinil-oligonukleotidok fokozott hidrolitikus stabilitását eredményezi. Ezek a vegyületek puffereit vizes oldatokban hosszú ideig stabilak (pH=8,3; 4 °C; 1 hét), és méretkizárásos kromatográfiával vagy utrafiltrációval könnyen izolálhatok és tisztíthatok.

A reakció az aminfarokra specifikus, és a nukleotidgyökökre nem gyakorol látható hatást. A PEI-vel bevont nejlonfelületet ezután a cianur-kloriddal aktivált oligonukleotiddal reagáltatjuk. A „befogó” szekvenciát nagy koncentrációban rögzítjük a felületen, és a reagálatlan aminokat végső lépésként borostyánkősav-anhidriddel fedjük be (cap).

A hordozóhoz kötött oligonukleotidok előállításának egyik sajátos módja a Pease és munkatársai által leírt fénnyel szabályozott szintézis alkalmazása (Pease és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., 91, 5022-5026, 1994; melyet itt hivatkozásul említünk). Az említett szerzők a rögzített oligonukleotidpróbák sorozatainak (DNS-csipek) kialakításához az elteqedt fotolitográfiás technikákat alkalmazták. Ezekben az eljárásokban, ahol a miniatürizált, sorozatokban nagy sűrűségben elrendezett oligonukleotidpróbák szintézisének irányításához fényt használnak, fénybomlékony, 5’-védett Nacil-dezoxinukleozid-foszfor-amiditeket, felületi linkereket és általános kombinatoriális szintézises stratégiát

HU 218 597 Β alkalmaznak. Ezen a módon 256 térbelileg meghatározott oligonukleotidpróbából képezhető mátrix, amely a találmányunkban leírt, előnyös Formát 3 szekvenálásban alkalmazható.

Pease és munkatársai fénnyel szabályozott oligonukleotidszintézisben alkalmazható eljárást írtak le. Ebben az eljárásban egy fénybomlékony védőcsoportokkal módosított szilárd hordozó felületét fotolitográfiás sablonon keresztül megvilágítanak, ami a megvilágított területeken reaktív hidroxilcsoportokat eredményez. Ezután a felületre 3’-O-foszfor-amidittel aktivált dezoxinukleozidot adnak (melynek 5’-hidroxilcsoportja fénybomlékony csoporttal védett), és a kapcsolódás azokon a helyeken történik meg, amelyeket fény ért. A lefedés és oxidáció után a szubsztrátot leöblítik, és a felületet egy másik sablonon keresztül megvilágítják, hogy további hidroxilcsoportok váljanak szabaddá a kapcsoláshoz, majd egy második 5’-védett, 3’-O-foszfor-amidittel aktivált dezoxinukleotidot adnak a felülethez. A fénnyel történő szelektív védőcsoport-eltávolítást és a kapcsolási ciklusokat addig ismétlik, mig a termékek kívánt sorozata alakul ki. A fotolitográfia alkalmazása miatt az eljárás nagy sűrűségben elrendezett oligonukleotidpróba-sorozatok kialakítása érdekében miniatürizálható, melyek szekvenciája minden helyen ismert.

A szükséges 5’-O-(alfa-metil-6-nitro-piperonil-oxikarbonil)-N-acil-2’-dezoxinukleozid-foszfor-amiditek (MeNPoc-N-acil-2’-dezoxinukleozid-foszfor-amiditek) előállítása során első lépésként N-acil-2’-dezoxinukleozidot 1 -(2-nitro-4,5-metilén-dioxi-fenil)-etil-1 -kloroformáttal reagáltatunk, miáltal 5’-MeNPoc-N-acil-2’-dezoxinukleozid képződik. Második lépésként a 3’-hidroxilcsoportot standard eljárásokkal 2-ciano-etil-N,N’-diizopropil-klór-foszfor-amidittel reagáltatjuk, miáltal 5’MeNPoc-N-acil-2 ’-dezoxinukleozid-3 ’-O-(2-ciano-etilN,N-diizopropil)-foszfor-amiditeket kapunk. A fényvédő csoport az átlagos foszfor-amidit színtézises körülmények között stabil, és vizes bázissal eltávolítható. Ezek a reagensek 4 °C-on argongáz alatt hosszú ideig tárolhatók.

A MeNPoc-dT, MeNPoc-dCi^bu, MeNPoc-dG^PAC, illetve MeNPoc-dA^PAC esetében 28 másodperces, 31 másodperces, 27 másodperces, illetve 18 másodperces fotolízises felezési időről számoltak be (Pease és munkatársai, lásd fentebb). A litográfiás szintézisben 4,5 perces megvilágítási időt (9xt_1/2 MeNPoc-dC) javasolnak, ami a MeNPoc védőcsoport 99%-nál nagyobb mértékű eltávolítását eredményezi.

Az egyik alkalmas szintetikus hordozó 5,1 cm χ 7,6 cm-es üvegszubsztrátból áll, melyet koncentrált NaOH-oldatban mostunk, majd vízben alaposan átöblítettünk. A felületeket ezután 95%-os etanolban készített 10 V/V%-os bisz(2-hidroxi-etil)-amino-propil-trietoxi-szilán-oldattal kezeljük („derivatizáljuk”), majd etanollal és éterrel alaposan átöblítjük, 40 °C-on in vacuo megszárítjuk, majd 15 percig 100 °C-on hevítjük. A szubsztrátot 4,4’-dimetoxi-(trifenil-metil)-hexaetiloxi-O-ciano-etil-foszfor-amidittel [(DMT)-hexaetil-oxiO-ciano-etil-foszforamidit] reagáltatva színtézises linkért kapcsolhatunk hozzá.

Összefoglalásul egy oligonukleotidpróba szintézisének beindításához a megfelelő dezoxinukleozid-foszfor-amidit-származékot egy linkeren keresztül hozzákapcsoljuk a szintetikus hordozóhoz. A hordozó egyes területeit ezután egy fotolitográfiai sablon például 800 μιη χ 12 800 μιη nagyságú résein keresztül megvilágítással aktiváljuk a szintézishez. A további foszfor-amidit-szintézises ciklusokat DMT-vel védett dezoxinukleozidokkal végezzük, s bármilyen kívánt szekvencia kialakítható, például bármilyen 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9vagy éppen 10-mer szekvencia. A foszfát- és a gyűrűn kívüli amin védőcsoportok koncentrált NH₄OH-oldattal 4 órán keresztül végzett eltávolítása után a szubsztrátot vízköpenyes, hőszabályozott hibridizációs kamrába állítjuk, miután készen áll a felhasználásra.

Természetesen DNS-csipek kereskedelmi úton is beszerezhetők (Affymetrix, Santa Clara, CA 95051; és Beckman), mint például az általunk leírt, fénnyel aktivált csípek.

2. példa

Módosított oligonukleotidok próbákban való felhasználáshoz

A módosított oligonukleotidok a találmány szerinti eljárásokban a hibridizáció specifitásának vagy hatékonyságának fokozása érdekében alkalmazhatók. Ennek megvalósításának egyik módja a természetes nukleotidok bázisainak szubsztitúcióval történő módosítása. Alkalmazhatunk például olyan pirimidineket, amelyek az 5. szénatomon halogénatomot tartalmaznak. Úgy tartjuk, hogy ez a bázisok közötti másodlagos kölcsönhatások befolyásolásával fokozza a duplex stabilitást. 2,6-diamino-purin is alkalmazható, ami timinnel való bázispárosodáskor egy harmadik hidrogénkötést biztosít, termálisan stabilizálva ezáltal DNS-duplexeket. A 2,6-diamino-purin jelentősen javítja a rövid oligomerek duplex stabilitását. Alkalmazásával szigorúbb feltételek alkalmazhatók a primer hibridizációhoz, ami a duplex képződés specifitásának javítását és a háttéqelekből, illetve a rövidebb oligomerek alkalmazásából adódó problémák mérséklését eredményezi.

E módosított nukleotidok trifoszfát változatainak szintézisét Hoheisel és Lehrach írták le (FEBS Lett., 274(1,2), 103-106, 1990; melyet itt hivatkozásul említünk). Például, a Sigmától 5-klór-2’-dezoxi-uridint és 2,6-diamino-purin-2’-dezoxi-nukleozidot vásárolunk, és a foszforiláláshoz 50 mg vízmentes 2-NH₂-dAdo-t argongáz alatt, keverés közben 500 μΐ vízmentes trietilfoszfátban elegyítünk. Az elegyhez 25 μΐ POCl₃-ot adunk, és az elegyet -20 °C-on inkubáljuk. Eközben 1 mmol pirofoszforsavat 0,95 ml tri(n-butil)-aminban és 2 ml metanolban oldunk, és forgó párologtatón szárítjuk. Ezután az oldatot 5 ml piridinből végzett kétszeri lepárlással (a második lepárlás előtt 70 μΐ tri-(n-butil)amint is adunk az oldathoz) szárítjuk, végül 2 ml vízmentes dimetil-formamidban oldjuk.

-20 °C-on 90 perces inkubálás után a foszforilációs elegyet a felesleges POC1₃ eltávolítása érdekében bepároljuk, és az elegyhez hozzáadjuk a dimetil-formamidban oldott tri(n-butil)-ammónium-pirofoszfátot. Szobahőmér12

HU 218 597 Β sékleten 1,5 percig inkubálást végzünk, majd a reakciót 5 ml 0,2 M trietil-ammónium-bikarbonát (pH=7,6) hozzáadásával leállítjuk, és az elegyet 4 óra hosszat jégen tartjuk. Az 5-Cl-dUrd alkalmazása esetén a feltételek azonosak, de 50 μΐ POCl₃-ot alkalmazunk, és a foszforilációt szobahőmérsékleten 4 óra hosszat végezzük.

Hidrolízis után az elegyet bepároljuk, a pH-t 7,5-re állítjuk, és az elegyet 1 térfogatnyi dietil-éterrel extraháljuk. A termékek elválasztását például 2,5 cmx20 cm-es Q-Sepharose oszlopon, trietil-ammónium-bikarbonát 0,15 M—>0,8 M lineáris gradiensével végezzük. A nukleotidok fagyasztva tárolva hosszú ideig stabilak maradnak.

Alkalmazhatjuk a nem szelektív bázisanalógot vagy univerzális bázist is (Nichols és munkatársai elnevezése szerint; Natúré, 369, 492, 1994). Ezt az új analógot [(1 -2 ’ -dezoxi- β-D-ribofuranozil )-3-nitro-pirrol] (j ele M) a genetikai kód degeneráltságából eredő tervezési problémák megoldása érdekében (illetve az olyan esetekben felmerülő nehézségek áthidalására, amikor csak töredékes peptidszekvencia adatok állnak rendelkezésre) az oligonukleotidpróbákban és primerekben való alkalmazáshoz fejlesztették ki. Ez az analóg maximális mértékben fokozza a másodlagos kölcsönhatásokat, miközben csökkenti a hidrogénkötéseket anélkül, hogy megbontaná a DNS-duplexet.

Az M nukleozid analógot heteroaromás gyűrűkhöz kapcsolt aprotikus poláris szubsztituensek alkalmazásával a szálon belüli és szálak közötti másodlagos kölcsönhatások fokozására alakították ki, hogy a bázispárosodási specifitást illetően csökkentsék a hidrogénkötés szerepét. Nichols és munkatársai (lásd fentebb) a p-nitro-anilinhez (melynek származékai a kétszálú DNS legkisebb ismert interkalátorai közé tartoznak) mutatott szerkezeti és elektromos jellegű hasonlósága miatt a 3-nitro-pirrol2’-dezoxi-ribonukleozidot részesítették előnyben.

Az M nukleozid dimetoxi-trifenil-metil (DMT)-csoporttal védett foszfor-amiditje szintén alkalmas a szekvenáláshoz és polimeráz láncreakcióhoz (PCR) való primerekként alkalmazott nukleozidokba történő beépítéshez. Nichols és munkatársai kimutatták, hogy jelentős számú nukleotid helyettesíthető az M nukleoziddal anélkül, hogy a primer specifitás csökkenne.

Az M nukleozid egyedülálló tulajdonsága azon képessége, hogy egymással szomszédos nukleozidok alkotta hosszú szakaszok helyettesítésére alkalmas, s az így kapott szekvenáló primerek továbbra is működőképesek. Leírták, hogy a három, hat és kilenc M szubsztitúcióval rendelkező szekvenciák egyaránt leolvasható szekvenáló létrát adnak, és a három, különböző M-tartalmú primerrel végzett PCR a helyes termékek amplifikációját eredményezi (Nichols és munkatársai, lásd fentebb).

A 3-nitro-pirrolt tartalmazó oligonukleotidok primerként való működési képessége erőteljesen arra utal, hogy a komplementer szálak között duplex szerkezetnek kell kialakulnia. Nichols és munkatársai leírták, hogy a d(5’-C₂-T₅XT₅G₂-3’) és d(5’-C₂A₅YA₅G₂-3’) oligonukleotidpárokra U (ahol X és Y jelentése A, C, G, T vagy M) kapott optikai hőmérsékleti profilok megegyeznek a kétszálú DNS-egyszálú-DNS átalakulásra kapott normális szigmoid alakzattal. Az X-M bázisbárokat tartalmazó oligonukleotidok (melyekben X jelentése A, C, G vagy T, és Y jelentése M) T_m értéke minden esetben 3 °C-os tartományon belül esett (Nichols és munkatársai, lásd fentebb).

3. példa

Szekvenálócsipek és -tömbök előállítása

Ebben a példában az általunk kialakított szekvenálócsipek gyakorlati megvalósítását írjuk le.

Alappéldaként 50 pm-es felületekhez rögzített 6merek alkalmazását írjuk le, ami 3x3 mm-es csipeket eredményez, melyek egyesítésével 20x20 cm-es tömböt alakíthatunk ki. Egy másik példában 10 χ 10 pm-es felülethez kapcsolva 9-mereket alkalmazunk, miáltal 5x5 mm-es 9-mer csipeket kapunk. 30 x 30 cm-es tömb kialakításához 4000 ilyen csipet alkalmazunk. A 2A., 2B. és 2C. ábrán egy további elrendezést mutatunk be, melyben 4000-16 000 oligocsipet rendezünk el négyzetes rendszerben. A szekvenálókészlet részeként, a szekvenálótömbbel együtt egy lemezt vagy csősorozatot is csomagolhatunk.

A tömbök fizikailag vagy hidrofób felületekkel választhatók el egymástól. A hidrofób sávos elválasztási rendszer egyik lehetséges módjaként a QA Laboratories (Toronto, Kanada.) által gyártott Iso-Grid Microbiology Systemet alkalmazzuk.

A hidrofób rácsmembránfiltereket (HGMF) körülbelül egy évtizede alkalmazzák az élelmiszer-ipari analitikai mikrobiológiában, ahol nagy mennyiségű telep automatizált számlálását teszi lehetővé. Az egyik, kereskedelemben beszerezhető rács a QA Laboratories Ltd. (Toronto, Kanada.) ISO-GRID™ elnevezésű rácsa, amely poliszulfon polimer négyzetből áll (60 x 60 cm; Gelman Tuffryn HT-450, 0,45 pm pórusméret), melyre fekete hidrofób tintarácsot nyomtattak, amely 1600 (40x40) négyzetes cellát tartalmaz, A HGMF-filtereket vákuumszűréssel baktériumszuszpenzióval beoltották, és a kiválasztott differenciális vagy szelektív tápközegen inkubálták.

Mivel a mikrobiális növekedés a membránon ismert helyzetű és méretű rácscellákra korlátozódik, a HGMF sokkal inkább MPN apparátusként működik, mint hagyományos lemezként vagy membránfilterként. Peterkin és munkatársai (BioTechniques, 5(2), 132-134, 1987) leírták, hogy ezek a HGMF-filterek HGMF-replikátor készülékben alkalmazva felhasználhatók genomkönyvtárak szaporításához és tárolásához. Az egyik ilyen készülék, az ISO-GRID mind az 1600 cellájában megfigyelhető növekedésről másolatot készít, és az eredeti HGMF sok másolatának kialakítását teszi lehetővé (Peterkin és munkatársai, lásd fentebb).

Sharp és munkatársai (Food Microbiology, 6, 261-265, 1989) vizsgálataikhoz szintén ISO-GRID HGMF-filtert (QA Laboratories), automata HGMFszámlálót (MI-100 Interpreter) és RP-100 Replicatort alkalmaztak. Sok mikrobiális tenyészet fenntartásának és screenelésének technikáját írták le.

Peterkin és munkatársai később leírtak egy eljárást DNS-próbák screenelésére, amelyhez hidrofób rács13

HU 218 597 Β membránfiltert alkalmaztak (Peterkin és munkatársai, Food Microbiology, 5(2), 281-284, 1989), valamint közvetlenül a HGMF-filtereken végezhető telephibridizációs eljárásokat írtak le. Korábban a poliszulfon polimer (melyre a HGMF-eket nyomtatják) alacsony DNS-kötési képessége miatt csak szerény eredményeket kaptak. Peterkin és munkatársai (1989) azonban beszámoltak arról, hogy a DNS membránfelülethez való kötődése fokozható, ha a lemásolt és inkubált HGMFfíltert a DNS-sel való érintkezés előtt polietilén-iminnel (egy polikationnal) kezelik. Bár e korábbi munkához celluláris DNS-kapcsolást alkalmaztak, s tárgya különbözött találmányunkétól, a leírt technika könnyen alkalmazható a találmány szerinti Formát 3 SBH-változathoz.

A megfelelő szekvenciák gyors azonosításához Peterkin és munkatársai (1989) különböző kiónokból származó, radioaktívan jelölt plazmid-DNS-t alkalmaztak, és ezek specifitását az elkészített HGMF-filtereken lévő DNS-sel szemben tesztelték. Ezen a módon, könnyen és reprodukálhatóan elkészíthető HGMF-replikákon, 100 organizmussal szemben végzett telephibridizációval rekombináns plazmidokból származó DNS-t tudtak gyorsan screenelni.

Két alapvető problémát kellett megoldanunk. Az egyik a kisméretű (2-3 mm) csípek kezelése, a másik pedig a reakciók ezreinek párhuzamos végrehajtása. A találmányunk által nyújtott megoldás szerint a csipeket és a próbákat a megfelelő tömbökben tartjuk. Az egyik példában szilikonlapon 250 000 darab 9-mert tartalmazó csipet szintetizálunk, 8x8 mM lemezek formájában (15 pm/oligonukleotid, Pease és munkatársai, 1994), amelyeket 8x12 formátumban rendezünk el (96 csip), 1 mM-os különbséggel. A próbákat többcsatornás pipettával vagy fésűvel adjuk a csipekhez, csipenként egy próbát. Mind a 4000 darab 6-mer értékeléséhez 42 csíptömböt kell alkalmazni, függetlenül attól, hogy különböző csipeket használunk vagy a csiptömbök egy sorozatát többször felhasználjuk.

A fenti esetben, a korábban említett nómenklatúra szerint F=9, P=6 és F+P=15. A csípek lehetnek BxNn képletűek, amelyben X jelentése a meghatározott B bázisok száma; n jelentése pedig a meghatározatlan N bázisok száma; x=4-10 és n=l-4. Még hatékonyabb hibridizáció megvalósításához, és a hordozó oligonukleotidok lehetséges befolyásának elkerülése érdekében a meghatározott bázisokat meghatározatlan bázisokkal kell körülvenni, mint ahogy azt például az (N)nB χ (N)m képlet szemlélteti (4. ábra).

4. példa nukleinsavfragmentek előállítása

A szekvenálni kívánt nukleinsavak származhatnak bármely alkalmas forrásból, például cDNS-ből, genomiális DNS-ből, kromoszomális DNS-ből, kivágott kromoszómasávokból, kozmid vagy YAC inszertekből és RNS-ből, beleértve az mRNS-t. Sambrook és munkatársai például három módszert írnak le nagy molekulatömegű DNS emlőssejtekből történő izolálására (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring

Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, p.

9.14-9.23,1989).

A nukleinsavak ezután bármely ismert eljárással fragmentálhatók, például restrikciós enzimek alkalmazásával (Sambrook és munkatársai, 1989, 9.24-9.28), ultrahangos hasítással vagy NaOH-os kezeléssel.

A Schriefer és munkatársai [Nucleic Acids Research, 18(24), 7455,1990; melyet hivatkozásul említünk] által leírt kisnyomású hasítás szintén alkalmas módszer. Eszerint a DNS-mintákat kis-közepes nyomáson kisméretű French-présen engedjük át. A présben egy emelőszerkezet teszi lehetővé a kis-közepes nyomás szabályozott alkalmazását. E vizsgálatok eredményei azt jelzik, hogy a kisnyomású hasítás az ultrahangos és az enzimatikus DNS-ffagmentálási módszerek hasznos alternatívája.

A DNS-ffagmentálás egy különösen alkalmas módja a két bázist felismerő CviJI endonukleáz alkalmazása, melyet Fitzgerald és munkatársai írtak le [Nucleic Acids Research, 20(14), 3753-3762, 1992]. Ez a módszer a DNS adott méretű szakaszokra történő gyors fragmentálását és ffakcionálását teszi lehetővé, ami alkalmas a „shotgun” klónozáshoz és szekvenáláshoz. úgy tartjuk, hogy ez a módszer különösen alkalmas a találmány szerinti szekvenálási technikában alkalmazható random, de viszonylag kis méretű DNS-ffagmentek kialakításához.

A CviJI restrikciós endonukleáz normális esetben a PuGCPy felismerési szekvenciát a G és C között hasítja, tompa végeket kialakítva. A nem szokványos reakciófeltételek, melyek megváltoztatják ezen enzim specifitását (CviJI**), a kisméretű pUC19 molekulából (2688 bázispár) nyert DNS-ffagmentek félig random megoszlását eredményezi. Fitzgerald és munkatársai (lásd fentebb) mennyiségileg értékelték e fragmentációs eljárás véletlenszerűségét, amihez a pUC19 CviJI** emésztményét használták, melyet gyors gélfiltrációs módszerrel méret szerint ffakcionáltak, és végrepair nélkül közvetlenül lacZ mínusz Ml 3 klónozó vektorhoz ligáltak. 76 klón szekvenciaanalízisével kimutatták, hogy a CviJI** a PuGCFy helyeken (Pu=purinbázis; Py=pirimidinbázis) kívül a pYGCPy és PuGCPu helyeken is hasít, és az új szekvenciaadatok a random ffagmentációnak megfelelő arányban gyűltek össze.

E módszer előnyei a hangkezeléssel és az agarózgélfrakcionálással szemben, hogy kisebb mennyiségű DNS-re (2-5 pg helyett 0,2-0,5 pg) és kevesebb lépésre van szükség (nem kell előzetes ligálást, végrepairt, kémiai extrakciót, agarózgél-elektroforézist vagy elúciót végezni). Ezek az előnyök alkalmassá teszik e módszert a Formát 3 szekvenáláshoz való DNS elkészítéséhez.

Függetlenül a nukleinsavfragmentek kinyerésének vagy előállításának módszerétől, lényeges, hogy denaturáljuk a DNS-t, hogy a hibridizációhoz egyszálú fragmenteket kapjunk. Ehhez a DNS-oldatot 2-5 percig 80-90 °C-on inkubáljuk. Ezután az oldatot gyorsan 2 °C-ra hűtjük, hogy megakadályozzuk a DNS-ffagmentek renaturációját, mielőtt érintkezésbe hoznánk a csippel. A genomiális DNS-ről el kell távolítani a foszfátcsoportokat is (lásd 6. példa).

HU 218 597 Β

5. példa

A jelölt próbák előállítása

Az oligonukleotidpróbákat automatizált szintézissel, például Applied Biosystems rendszer alkalmazásával állíthatjuk elő. Más módon, a próbákat a Genosys Biotechnologies Inc. eljárásával is előállíthatjuk, amihez porózus teflonlapok sokaságát alkalmazzuk.

Az oligonukleotidpróbákat a 100-200 pm-es vagy 100-400 μπι-es foltokból álló sorozatok esetében például radioaktív izotópokkal (³⁵S, ³²P ³³P, előnyösen ³³P); nem radioaktív izotópokkal (Jacobsen és munkatársai, Genomics, 8, 1-7, 1990) vagy fluorofórokkal [Brumbaugh és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3072-3076, 1994) jelölhetjük. A jelölési módszerek ismertek; leírásuk megtalálható Sambrook és munkatársai kézikönyvének (lásd fentebb) idevágó fejezeteiben, illetve Schubert és munkatársai, Nucleic Acids Research, 18(11), 3427, 1990; Murakami és munkatársai, Nucleic Acids Research, 19(15), 4097-4102, 1991; Cate és munkatársai, GATA, 8(3), 102-106, 1991; a fentiek mindegyikét hivatkozásul említjük].

A radioaktív jelölést általánosan T4 polinukleotidkináz alkalmazásával végzett végjelöléssel vagy Klenow- vagy még inkább T7 polimeráz alkalmazásával végzett specifikus aktivitási jelöléssel hajtjuk végre. Ezeket az alábbiakban írjuk le.

5'-terminálisukon foszfátcsoportot nem tartalmazó szintetikus oligonukleotidokat szintetizálunk, melyek a gamma-³²P vagy gamma-³³P, T4 bakteriofág polinukleotid kináz enzim alkalmazásával [gamma-³²P] ATPről, illetve [gamma-³³P]ATP-ről történő átvitelével könnyen jelölhetők. Ha a reakciót sikeresen hajtjuk végre, az ilyen próbák specifikus aktivitása ugyanolyan szintű lehet, mint magáé a [gamma-³²P]ATP-é, illetve a [gamma-³³P]ATP-é. A következőkben leírt reakciót egy oligonukleotid 10 pmol-jának nagy specifikus aktivitással történő jelöléséhez szánjuk. Az oligonukleotid különböző mennyiségeinek jelölését a reakció méretének növelésével vagy csökkentésével - miközben valamennyi komponens koncentrációját állandó szinten tartjuk - könnyen megvalósíthatjuk.

1,0 μΐ oligonukleotid (10 pmol/μΐ); 2,0 μΐ 10xT4 bakteriofág polinukleotid kináz puffer; 5,0 μΐ [gamma-³²P]ATP vagy [gamma-³³P]ATP (specifikus aktivitás: 5000 Ci/mmol; 10 mCi/ml vizes oldatban) (10 pmol); és 11,4 μΐ víz hozzáadásával reakcióelegyet készítünk. A jól összekevert reakcióelegyhez 8 egység (körülbelül 1 μΐ) T4 bakteriofág polinukleotid kinázt adunk, az elegyet 45 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd a T4 bakteriofág polinukleotid kináz inaktiválása érdekében 10 percig 68 °C-on melegítjük.

Ezután meghatározzuk a ³²P- vagy ³³P-izotóp oligonukleotidra történő átvitelének hatásosságát és a specifikus aktivitást. Ha a próba specifikus aktivitása megfelelő, tisztítást végzünk. Amennyiben a specifikus aktivitás túl alacsony, további 8 egység enzimet adunk a reakcióelegyhez, és az elegyet 30 percig 37 °C-on inkubáljuk, majd az enzim inaktiválása érdekében 10 percig 68 °C-on melegítjük.

A radioaktívan jelölt oligonukleotidok tisztítását etanolos kicsapással, cetil-piridinium-bromiddal végzett kicsapással, bio-gel P-60 gélen vagy Sep-Pak C₁₈ oszlopon végzett kromatográfiával valósíthatjuk meg.

Nagyobb specifikus aktivitású próbákat alakíthatunk ki az E. coli Klenow-fragmentjének alkalmazásával. A DNS-polimeráz I a szintetikus oligonukleotiddal komplementer DNS-szálat szintetizál. Egy oligonukleotid templáthoz (melynek szekvenciája komplementer a kívánt radioaktívan jelölt próbával) rövid prímért hibridizálunk, és a prímért az E. coli DNS-polimeráz I Klenowfragmentjének alkalmazásával meghosszabbítjuk, hogy templátirányított módon [alfa-³²P]dNTP-k vagy [alfa³³P]dNTP-k épüljenek be. A reakció után a templátot és a terméket denaturálással és denaturáló körülmények között poliakrilamidgélen végzett elektroforézissel elválasztjuk. Ezzel az eljárással olyan oligonukleotidpróbák állíthatók elő, amelyek kívánt esetben molekulánként több radioaktív atomot tartalmaznak.

A fenti eljárás alkalmazásához egy mikrocentrifugáló csőben össze kell keverni a kívánt specifikus aktivitás eléréséhez szükséges [alfa-³²P]dNTP-k vagy [alfa-³³P]dNTP-k kiszámított mennyiségeit, melyek elegendőek valamennyi templátszál teljes szintéziséhez. A dNTP-k koncentrációja a reakció egyik stádiumában sem csökkenhet 1 μΜ alá. A csőbe ezután megfelelő mennyiségű primer és templát DNS-t adunk (a primer moláris mennyisége a templát mennyiségének 3-10szerese kell, hogy legyen).

Az elegyhez ezután 0,1 térfogatnyi 10 χ Klenow-puffert adunk és jól összekeverjük. 5 μΐ reakcióelegy-térfogatra számítva 2-4 egység E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentet adunk, az elegyet alaposan összekeverjük, és 4 °C-on 2-3 óra hosszat inkubáljuk. Kívánt esetben a reakció előrehaladását kis (0,1 μΐ) alikvotok kivételével és 10%-os triklór-ecetsavval (TCA) precipitálhatóvá vált radioaktivitás arányának mérésével ellenőrizhetjük.

A reakcióelegyet azonos térfogatú gélfeltöltő pufferrel hígítjuk, 3 percre 80 °C-ra melegítjük, majd a teljes mintát denaturáló poliakrilamidgélre töltjük. Az elektroforézis után a gélt autoradiográfiával vizsgáljuk, ami lehetővé teszi, hogy a próbát lokalizáljuk a gélen és eltávolítsuk. A fluorofób jelölés különböző módszerei szintén rendelkezésre állnak. Brumbach és munkatársai (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5610-5614,1988) fluoreszcens módon jelölt primerek szintézisét írták le. E szerint egy dezoxiuridin analógot szintetizálunk, amely 5. szénatomján kapcsolódva egy 12 atomos primer amin „linkerkart” tartalmaz. Az analóg szintézise során 2’-dezoxi-uridint szerves fémvegyület intermediereken keresztül 5’-(metilpropenoil)-2’-dezoxi-uridinné alakítunk. A dimetoxi-trifenil-metil-kloriddal való reakció a megfelelő 5’-dimetoxi-trifenil-metil adduktumot eredményezi. A metil-észtert hidrolizáljuk, aktiváljuk, majd megfelelő módon monoacilezett alkil-diaminnal reagáltatjuk. Tisztítás után a kapott linker kar nukleozidokat kémiai oligonukleotidszintézishez alkalmas nukleozidanalógokká alakítjuk.

Ezután módosított foszforidit módszerrel olyan oligonukleotidokat készítünk, amelyek egy vagy két lin15

HU 218 597 Β kér kar bázist tartalmaznak. 50 nmol linker kar oligonukleotid 25 μΐ 500 mM nátrium-bikarbonát-oldatban (pH=9,4) készített oldatához 20 μΐ 300 mM dimetilszulfoxidos FITC oldatot adunk. Az elegyet szobahőmérsékleten hat óra hosszat keverjük. Az oligonukleotidot 1x30 cm-es Sephadex G-25 oszlopon, 20 mM ammónium-acetát-oldattal (pH=6) végzett elúcióval választjuk el a szabad FITC-től, melynek során a frakciókat az első UV-t abszorbeáló csúcsnál egyesítjük.

Egy oligonukleotid 5’-végén történő fluoreszcens jelölése általában két lépésből áll. Először automatizált DNS-szintézis során egy N-védett amino-alkil-foszforamidit-származékot adunk az oligonukleotid 5'-végéhez. Miután valamennyi védőcsoportot eltávolítottuk, az 5’-aminocsoporthoz egyéjszakás reakcióval egy megfelelő fluoreszcens festék NHS-észterét kapcsoljuk, majd ajelölt oligonukleotidot reverz fázisú HPLC- vagy poliakrilamid-gélelektroforézis (PAGE) alkalmazásával megtisztítjuk a felesleges festéktől.

Schubert és munkatársai (lásd fentebb) olyan foszfor-amidit-szintézist írtak le, amely lehetővé teszi, hogy automatizált DNS-szintézis során fluoreszceinnel jelölt oligonukleotidokat lehessen előállítani. Eszerint fluoreszcein-metil-észtert DMF-ben K₂CO₃ és KI jelenlétében 4-klór-(4,4’-dimetoxi-(trifenil-metil))-l-butanollal 17 órán keresztül alkilezünk. A trifenil-metil-csoport kloroformban 1%-os trifluor-ecetsavval (TFA) történő eltávolítása után a terméket standard eljárással bisz-(diizopropil-amino)-metoxi-foszfinnel foszfitiláljuk. A kapott fluoreszceinszármazék foszforilálása jelentős kitermeléssel H-foszfonátot eredményez. A kapott amiditet (vízmentes acetonitrilben 0,1 M) a β-ciano-etil-foszfor-amidites módszer és DNS-szintetizáló berendezés alkalmazásával különböző primerek automatizált szintéziséhez használjuk. A hordozóról történő lehasítást és a védőcsoport eltávolítását szobahőmérsékleten 36 órán át 25%-os vizes ammóniával végzett kezeléssel valósítjuk meg. A nyersterméket poliakrilamidgélelektroforézissel tisztítjuk; a jelölt primer 310 nmnél halványzöld fluoreszcens sávként látható. Elúcióval és RP 18 kazettákkal végzett sótalanítással a kívánt terméket kapjuk.

A Schubert-módszer szerint egy próba 5’-végének fluoreszcens jelölését a DNS-szintézis során, az utolsó kapcsolási ciklusban végezzük. A kapcsolás hozama megegyezik a normális foszfor-amiditekkel végzett kapcsoláséval. A védőcsoport eltávolítása után és az ammónia „speed vac” alkalmazásával, liofílizálással vagy etanolos kicsapással való eltávolítása után a fluoreszcensen jelölt oligonukleotidokat közvetlenül felhasználhatjuk a Formát 3 SBH módszerrel történő DNS-szekvenáláshoz.

Murakami és munkatársai szintén leírták a fluoreszceinnel jelölt oligonukleotidok előállítását. Módszerük polimer hordozóhoz kapcsolt foszfor-amidit és hidrogén-foszfonátos eljárás alkalmazásán alapul. Kapcsolóanyagként etilén-diamint vagy hexametilén-diamint alkalmaznak, melyeket egy hidrogén-foszfonát intermedier CC1₄ oldatban végzett oxidációjával kialakított foszfor-amidit kötéssel építenek be. A módosított oligonukleotidokat primer amin orientáló reagens (FITC) alkalmazásával jelölik a gyöngyökön. A képződött módosított oligonukleotidokat lehasítják a gyöngyökről és

RPLC-vel tisztítják.

Cate és munkatársai [GATA, 8(3), 102-106, 1991] a próba detektálása érdekében alkalikus foszfatázhoz közvetlenül konjugált oligonukleotidpróbák kemilumineszcens szubsztráttal (AMPDD) együttes alkalmazását írták le. Az alkalikus foszfatáz az oligonukleotid egyik módosított bázisához kovalensen köthető. A hibridizáció után az oligonukleotidot AMPDD-vel inkubálják. Az alkalikus foszfatáz felbontja az AMPDD-t, miáltal olyan vegyület keletkezik, amely gerjesztés nélkül is fluoreszcenciát idéz elő, vagyis nincs szükség lézer alkalmazására. Ilyen technika alkalmazásával erős jel generálható.

A jelölt próbák szintézis helyett számos forrásból beszerezhetők; ilyen például a GENsET.

6. példa

A foszfátcsoportok eltávolítása

A bakteriális alkalikus foszfatáz (BAP) és a boqúvékonybél alkalikus foszfatáz (CIP) egyaránt katalizálja az 5’-foszfátcsoportok DNS-ről és RNS-ről történő eltávolítását. Következésképpen, ezek az enzimek alkalmasak az 5’-foszfátcsoportok DNS-ről és/vagy RNS-ről történő eltávolításához, ami megakadályozza a ligálást és a nem megfelelő hibridizációt. A foszfátcsoport eltávolítását a genomiális DNS hasítása vagy más módszerekkel történő nyírása után végezzük (Sambrook és munkatársai, 1989, lásd fentebb).

A két alkalikus foszfatáz közül a BAP az aktívabb, de egyúttal sokkal rezisztensebb a hőre és a detergensekre, ezáltal a defoszforilációs reakciók végén a BAP teljes gátlása nehezen valósítható meg. A CIP (melyet tökéletesen el kell távolítani, ha azt akaijuk, hogy a későbbi ligálások megfelelően működjenek) emésztéséhez proteináz K-t alkalmazunk. A CIP inaktiválásának egy másik módszere szerint az enzimet 5 mM EDTA (pH=8,0) jelenlétében 65 °C-on egy óra hosszat (vagy 75 °C-on 10 percig) melegítjük, majd a defoszforilált DNS-t fenol: kloroform eleggyel végzett extrakcióval tisztítjuk.

7. példa

Szekvenálás kétlépéses hibridizációval

Az alábbiakban a találmány szerinti szekvenálási technika gyakorlati megvalósításának néhány példáját újuk le. Először a teljes csipet DNS (akár 100 millió bázispár nagyságú) elegyével hibridizáljuk. A hibridizáció elvégzéséhez alkalmazható útmutatásokat lásd például Drmanac és munkatársai, 1990; Khrapko és munkatársai, J. DNA Sequencing Mapping, 375, 1991; Broude és munkatársai Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 3072-3076,1994. Ezekben a cikkekben leírják a hibridizáció hőmérséklet-tartományát, a puffereket és a mosási lépéseket, melyek a Formát 3 SBH módszer kezdeti lépéseként alkalmazhatók.

Úgy tartjuk, hogy a hibridizációt a cél-DNS viszonylag alacsony koncentrációja miatt nagy sókoncentráció

HU 218 597 Β mellett, alacsony hőmérsékleten [-2-(+5) °C], több órán keresztül kell végezni. Erre a célra a nátriumfoszfát-puffer (Drmanac és munkatársai, 1990) helyett SSC-puffert alkalmazunk, amely 10 °C-nál precipitál. A második lépés miatt a mosásnak nem kell alaposnak lennie (néhány perc elegendő), sőt, teljesen el is hagyható, ha a nagy komplexitású DNS-minta szekvenálásához ciklusos hibridizációt, alkalmazunk. A hibridizációhoz és a mosáshoz azonos puffért használunk, hogy ajelölt próbákkal folytathassuk a második hibridizációt.

Az egyszerű robotkészülékkel végzett megfelelő mosás után minden egyes tömbhöz (például 8x8 mm-es tömb, 3. példa) egy jelölt próbát (például egy 6-mer-t adunk. Ehhez 96 hegyű vagy 96 csapos berendezést alkalmazhatunk, összesen 42 művelettel. Az eljárás során különböző szelektív feltételek alkalmazhatók, melyek leírása az idevonatkozó tudományos irodalomban megtalálható.

Találmányunkban az alábbi feltételek alkalmazását tartjuk előnyösnek. Először is a jelölt próbák hozzáadása és alacsony hőmérsékleten (0-5 °C) csupán néhány percig (a hozzáadott oligonukleotidok nagy koncentrációja miatt) tartó inkubálás után a hőmérsékletet az F+P hosszúságtól függően 3-10 °C-ra emeljük, és hozzáadjuk a mosópuffert. Olyan mosópuffert alkalmazunk, amely kompatibilis a ligálási reakciókkal (például 100 mM sókoncentráció-tartomány). A ligáz hozzáadása után a gyors ligálás és a teljes, illetve hibás párosodású (mismatch) hibridek jobb megkülönböztetésének elősegítése érdekében a hőmérsékletet 15-37 '’Cra emeljük (30 percnél rövidebb időre).

A Formát 3 SBH technikában kationos detergensek (lásd Pontius és Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 8237-8241, 1991; melyet hivatkozásul említünk) is alkalmazhatók. Az említett szerzők két egyszerű kationos detergens, a dedecil- és cetil-trimetil-ammóniumbromid (DTAB és CTAB) DNS-renaturálásban való alkalmazását írták le.

A DTAB és CTAB a tetrametil-ammónium-bromid (TMAB) nevű kvatemer amin változatai, melyekben az egyik metilcsoportot 12 szénatomos (DTAB), illetve 16 szénatomos alkilcsoport (CTAB) helyettesíti. A TMAB a nukleinsavrenaturációs kísérletekben az olvadáspontnál tapasztalható G-C tartalom asszimetriájának csökkentése érdekében alkalmazott tetrametíl-ammóniumion bromidsója. A DTAB és a CTAB szerkezetileg hasonlít a nátrium-dodecil-szulfáthoz (SDS), azzal a különbséggel, hogy az SDS negatív töltésű szulfátcsoportját pozitív töltésű kvatemer amincsoport helyettesíti. Miközben az SDS-t a nem specifikus kötődés csökkentésére és a nukleázok gátlására hibridizációs pufferként általánosan alkalmazzák, a renaturáció mértékét nem befolyásolja túlságosan.

Ha ligálást alkalmazunk, az enzimet ajelölt próbákkal együtt vagy a megfelelő mosási lépés után adhatjuk, hogy csökkentsük a háttérjel nagyságát.

Bár a ligázos technikát korábban egyik SBH-eljáráshoz sem ajánlották, ez a módszer a molekuláris biológia területén széleskörűen elfogadott. Hood és munkatársai például leírtak egy ligázközvetett génkimutatási technikát (Landegren és munkatársai, Science, 241, 1077-1080, 1988), amelynek módszertana könnyen adaptálható a Formát 3 SBH eljárásban való alkalmazáshoz. Landegren és munkatársai adott DNS-szekvenciák jelenlétének kimutatási eljárását írták le, amely két oligonukleotid azon képességén alapul, hogy egy komplementer cél-DNS-molekulán egymással közvetlenül határos (szomszédos) helyzetben hibridizálódni tudnak. A két oligonukleotid a hibridizáció után (DNS-ligáz hatására) kovalensen kapcsolódik, feltéve hogy az oligonukleotidok érintkezésénél a nukleotidok bázispárosodása helyes. Bár korábban nem említettük, ez a szituáció figyelhető meg a Formát 3 szekvenálásban is. Wu és Wallace két szomszédos, rövid szintetikus oligonukleotid összekapcsolásához T4 bakteriofág ligáz alkalmazását írták le. Oligonukleotidligálási reakcióikat 50 mM Tris-HCl (pH=7,6), 10 mM MgCl₂, 1 mM ATP, 1 mM DTT és 5% PEG elegyében végezték. A ligálási reakcióelegyeket 5-10 percre 100 °C-ra melegítették, majd a T4 DNS-ligáz (1 egység, Bethesda Research Laboratory) hozzáadása előtt 0 °C-ra hütötték. A ligálási reakciókat többnyire 30 °C-on végezték, és 5 percig 100 °C-ra történő melegítéssel állították le.

Ezután a szomszédos helyzetben hibridizálódott vagy ligáit, F+P hosszúságú oligonukleotidok szelektív kimutatásához alkalmas végső mosási lépést végzünk. A mosást a nem ligáit, jelölt próbák mindegyikének, illetve minden más vegyület kimosása és a háttérjel maximális mértékű csökkentése érdekében vízben, 40-60 °C-on néhány percig végezzük. A kovalensen kötött, jelölt oligonukleotidok miatt a kimutatás egyszerűbb (nem függ az időtartamtól és az alacsony hőmérséklettől).

A csípek megjelenítését, az alkalmazott jelölőanyagtól függően, különböző készülékekben végezzük. Radioaktív izotópok esetében fluoreszkáló ernyő (phosphor storage screen) technológiát, és letapogatóként Phospholmagert (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) alkalmazhatunk. A csipeket kazettába helyezzük és fluoreszkáló ernyővel borítjuk be. 1-4 óra elteltével az ernyőt leképezzük, és a megjelenített képfájlt merevlemezen tároljuk. A fluoreszcens jelölőanyagok kimutatásához CCD (töltéscsatolású eszköz) kamerákat és epifluoreszcens vagy konfokális (közös fókuszú) mikroszkópiát alkalmazunk. A közvetlenül a CCD-kamera képeiemén (pixel) képzett csípek esetében a detektálást Eggers és munkatársai [BioTechniques, 17(3), 516-524, 1994] leírása szerint végezzük (melyet hivatkozásul említünk],

A töltéscsatolású eszköz (charge-coupled device; CCD) detektorok aktív szilárd hordozóként szolgálnak, amelyek a próbákon alapuló vizsgálatokban kvantitatívan detektálják és jelenítik meg a jelölt célmolekulák megoszlását. Eggers és munkatársai (lásd fentebb) próbaalapú vizsgálatokhoz (mint például a találmány szerinti Formát 3 SBH eljáráshoz) alkalmazható CCDket írnak le, melyek a nagy érzékenységnek és az alkalmazott közvetlen csatolásnak köszönhetően másodperceken belül kvantitatív értékelést biztosítanak.

Az integrált CCD-detektálás lehetővé teszi a csipeken lejátszódó molekuláris kötődési események kimuta17

HU 218 597 Β tását. A detektor gyorsan kétdimenziós mintázatot képez, amely egyedülállóan jellemzi a mintát. A CCDalapú molekuláris detektor specifikus alkalmazásában különálló biológiai próbákat rögzítünk közvetlenül a CCD képelemén (pixel) vagy egy CCD felületére helyezett fedőlemezen. A mintaként szolgáló molekulákat radioaktív izotóppal, illetve kemilumineszcens vagy fluoreszcens jelölőanyagokkal jelölhetjük.

Amikor a mintát a CCD-alapú próbasorozat hatásának vetjük alá, azokon a képelem (pixel)-helyeken, ahol a minta kötődött (a Formát 3 esetében két komplementer próbához), fotonok vagy radioaktív izotópok emittálódnak. Amikor viszont a töltéssel rendelkező részecskék vagy ajelölt mintából kibocsátott sugárzás beesik a CCD-nyílásokon, a szilikonban elektron-lyuk párok képződnek. Az elektronok ezután közvetlenül a CCDnyílások alatt gyűlnek össze, s egy kijelzőn megjelennek. Az egyes képelemeknél képződött fotoelektronok száma egyenesen arányos az ilyen közelségben bekövetkező molekuláris kötési események számával, így a molekuláris kötődés kvantitatívan meghatározható (Eggers és munkatársai, lásd fentebb).

A szilikonalapú CCD-k előnye a széles hullámhosszúság-tartományt (1-10 000 Angström) felölelő nagy érzékenység. A szilikon nagyon érzékeny a látható tartománytól a lágy röntgensugarakig terjedő elektromágneses sugárzásra. A látható fény esetében a CCDnyílásra eső foton a nyílás alatt egy elektron töltésnyalábot hoz létre. Egyetlen lágy röntgensugár béta-részecske (rendszerint KeV-tól MeV-ig terjedő tartomány) 1000-10 000 elektront képez. A nagy érzékenység mellett az Egger és munkatársai által leírt CCD-k széles dinamikus tartományt (4-5 nagyságrend) ölelnek át, mivel egy detektálható töltésnyaláb néhánytól 10⁵-ig terjedő számú elektronból állhat. A detektálási érzékenység széles dinamikus tartományon belül lineáris.

Ha a leképezőrendszert (detektort) a minta közelébe helyezzük, az összegyűjtési hatékonyság az optikai alapú technikákhoz (például hagyományos CCD-kamerák) képest legalább tízszeresére nő. Eszerint a minta (emitter) szoros kapcsolatban áll a detektorral, s ez kiküszöböli a hagyományos optikák (lencsék és tükrök) alkalmazásának szükségességét.

Amikor riportercsoportokként radioaktív izotópokat kapcsolunk a célmolekulákhoz, nagy energiájú részecskéket detektálunk. A mikrodetektorokkal több, különböző energiájú részecskéket (mint például ³²P, ³³P, ³⁵S, ^l4C, ¹²⁵L) kibocsátó riportercsoportot alkalmaztak sikerrel. A nagyobb energiájú részecskék biztosítják a legnagyobb molekuláris detektálási szenzitivitást, míg az alacsonyabb energiájú részecskék (például a ³⁵S-izotópból származók) jobb felbontást eredményeznek. Ennélfogva a radioaktív izotóp kívánság szerint választható ki. Az adott radioaktív izotóp kiválasztása után a detektálási hatásfok a jel/zaj arány (SNR; signal-to-noise ratio) kiszámításával megjósolható (lásd Eggers és munkatársai, 1994).

Egy másik lumineszcenskimutatási eljárás célmolekulákhoz kapcsolt fluoreszcens vagy kemilumineszcens riportercsoportok alkalmazását foglalja magában.

A fluoreszcens jelölőanyagok kovalensen vagy másodlagos kölcsönhatással kapcsolhatók a molekulához. Az alkalmazott CCD-eszközökhöz azok a fluoreszcens festékek (például etidium-bromid) a legalkalmasabbak, amelyek a közeli UV-tartományban (300-350 nm) intenzív abszorpciós sávokkal rendelkeznek, és a látható tartományban (500-650 nm) fő emissziós sávokat mutatnak, mivel a kvantumhatásfok több nagyságrenddel alacsonyabb a gerjesztési hullámhossznál, mint a fluoreszcens jelhez tartozó hullámhossznál.

A lumineszcencia detektálását illetően, a poliszilikon CCD-nyí lás oknak megvan az a tulajdonságuk, hogy kiszűrjék a UV-tartományba tartozó beeső fényt, miközben nagyon érzékenyek a fluoreszcens riportercsoportok által kibocsátott látható lumineszcenciára. Az UV-gerjesztéssel szembeni szelekció következtében az Eggers és munkatársai (1994) által kialakított CCD-kkel nagy jel/zaj arány (100-nál nagyobb) valósítható meg.

A próba detektoron történő rögzítéséhez olcsó SiO₂ -szeleteken hibridizációs közegeket állítunk elő, amelyeket hibridizáció és szárítás után a CCD felületére helyezünk. Ez a módszer gazdaságos, mivel a DNS hibridizációját olcsó, eldobható SiO₂-szeleteken végezzük, ami lehetővé teszi a drágább CCD detektor újrafelhasználását. Más módon, a próbák rögzíthetők közvetlenül a CCD-n is, miáltal speciális próbamátrixot alakítunk ki.

A próbák SiO₂-bevonaton való rögzítéséhez a filmfelülethez egységes epoxidréteget kapcsolunk, amelyhez epoxi-szilán reagenst és standard SiO₂-módosítást végzünk. Ezután a SiO₂-felülethez - az epoxidgyűrűvel szekunder amint kialakítva - aminocsoporttal módosított oligonukleotidpróbákat kapcsolunk, miáltal a SiO₂-felület és az oligonukleotid 3’-bázisát elválasztó 17, elforgatható kötést tartalmazó kapcsolatot kapunk. A teljes amindeprotonálódás biztosítása és a kapcsolás során a másodlagos szerkezet kialakulásának minializálása érdekében a reakciót 0,1 M KOH-oldatban, 37 °C-on 6 órás inkubálással végezzük.

A Formát 3 SBH eljárásban a jeleket milliárd pontonként értékeljük. Nem szükséges valamennyi tömböt egy időben hibridizálni (például 4000 5x5 mm); kevesebb tömb egymás utáni alkalmazása is lehetséges.

A ciklusos hibridizáció a hibridizációs jel fokozásának egyik lehetséges módszere. Egy ciklusban a legtöbb rögzített próba hibridizál (a jelölt próbákkal nem komplementer farok szekvenciával rendelkező) DNSffagmentekkel. A hőmérséklet növelésével az ilyen hibridek „felolvadnak” (3. ábra). A következő ciklusban néhányuk (körülbelül 0,1%) egy alkalmas DNS-fragmenttel hibridizálódik, és további jelölt próbák ligálódnak hozzájuk. Ebben az esetben a mindkét próbasorozat esetében egyidejűleg hibás bázispárosodású DNShibridek szelektív „felolvadása” következik be.

A ciklusos hibridizációban valamennyi komponenst a reakció megkezdése előtt adjuk össze. A T4 ligáz esetében a ciklust 37 °C-on hőstabil ligáz alkalmazása esetében magasabb hőmérsékleten kezdjük, majd a hőmérsékletet 15-37 °C-ra csökkentjük, a csipet maximum 10 percig inkubáljuk, és a hőmérsékletet né18

HU 218 597 Β hány percre 37 °C-ra vagy magasabbra emeljük, majd ismét csökkentjük. A ciklusokat maximum 10 alkalommal ismételjük. Az egyik változatban ciklusok nélkül egy optimális magasabb hőmérsékletet (10-50 °C) alkalmazhatunk, és hosszabb (1 -3 órás) ligálási reakciót végezhetünk.

A találmány szerinti eljárás standard szintézis alkalmazásával és (mivel viszonylag kevés oligonukleotidra van szükség) az oligonukleotidok pontos elhelyezésével komplex csipelőállítást tesz lehetővé. Például, ha a 7-mer oligonukleotidpróbák mindegyikét szintetizáljuk (16 384 próba), 256 millió 14-mer határozható meg.

A találmány szerinti eljárás egy lényeges változata értelmében az alaptömbben egynél több, különbözőképpen jelölt próbát alkalmazunk. Ennek két célja van: a külön hibridizált sorozatok számának csökkentése érdekében végzett tömbösítés; illetve még hosszabb oligoszekvenciák sorozatának (például 3x6 vagy 3x7) meghatározása. Abban az esetben, ha két jelölőanyagot alkalmazunk, a három egymást követő oligonukleotid specifitása majdnem tökéletes lehet, mivel a pozitív helyeknek mindkét jelölőanyag számára elegendő jellel kell rendelkezniük.

Egy másik változat értelmében B_xN_y próbákat (y jelentése 1-4) tartalmazó csipeket alkalmazunk. Az ilyen csipekben a szekvencia leolvasása különböző leolvasási keretekben történhet. Ez jelölt próbák megfelelő sorozatainak alkalmazásával is megvalósítható, illetve mind az F, mind a P próbák rendelkezhetnek bizonyos meghatározatlan véghelyekkel (azaz valamilyen terminális degeneráltsági elemmel). A meghatározott szekvenciájú próbákat a szilárd hordozóhoz kapcsoló linker részeként univerzális bázisok is alkalmazhatók. Ezáltal a próba könnyebben hibridizálható, és a konstrukció stabilabbá válik. Ha egy próba 5 bázisból áll, linkerként például három univerzális bázis alkalmazható (4. ábra).

8. példa

A kapott adatok analizálása

A leképezési fájlokat leképező analízisprogrammal (mint a DOTS program; Drmanac és munkatársai, Proceedings of 2nd International Conference on Bioinformatics, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., 555-565. oldal, 1993) analizálhatjuk, és például a SCORES programban (Drmanac és munkatársai, Proceedings of the 3rd International Workshop of Transcribed Sequences, 1994, sajtó alatt) található statisztikai függvényekkel értékelhetjük. A jelek megoszlásából a jel +/- outputtá való átalakításához egy optimális küszöböt határozunk meg.

A detektált jelölőanyag helyzete alapján a ffagmentekből származó F+P nukleotidszekvenciák határozhatók meg, oly módon, hogy a jelölt helynek megfelelő rögzített és jelölt próbák ismert szekvenciáit összeillesztjük. Az eredeti molekula (például humán kromoszóma) teljes nukleinsavszekvenciája vagy szakaszai összeállíthatók a számítógépes dedukcióval meghatározott, átfedő F+P szekvenciák alapján.

Az egyik lehetőség szerint a hibridizációs jeleket a szekvencia összeállítása során alakítjuk át +/- outputtá. Ebben az esetben az összeállítást egy nagyon nagy jelű F+P szekvenciával, például az AAAAAATTTTTT (1. számú szekvencia) F+P szekvenciával kezdjük. Mind a négy lehetséges átfedő próba - AAAAATTTTTTA (3. számú szekvencia), AAAAATTTTTTT (4. számú szekvencia), AAAAATTTTTTC (5. számú szekvencia) és AAAAATTTTTTG (6. számú szekvencia) -, valamint három további próba (melyek első bázisukban különböznek: TAAAAATTTTTT, 7. számú szekvencia; CAAAAATTTTTT, 8. számú szekvencia; és GAAAAATTTTTT, 9. számú szekvencia) jeleit összehasonlítva három eredményre juthatunk: (i) csak a kiindulási próba, illetve a négy átfedő próba közül csak egy rendelkezik a másik hat próbához képest jelentősen pozitív jelekkel; ebben az esetben az AAAAAATTTTTT (1. számú szekvencia) szekvenciát toldjuk meg egy nukleotiddal a jobb oldalon: (ii) a kiindulási próba kivételével egyik próba sem mutat jelentősen pozitív jelet; ebben az esetben az összeállítás befejeződött, például az AAAAAATTTTT (10. számú szekvencia) szekvencia helyezkedik el a szekvenált DNS-molekula végén; (iii) az átfedő és/vagy a másik három próba közül egynél több rendelkezik jelentősen pozitív jellel; az összerendezést hiba vagy elágazódás miatt szintén leállítjuk (Drmanac és munkatársai, Genomics, 4, 114-128,1989).

A számítógépes következtetéshez létező algoritmusokat alkalmazó számítógépes programokat alkalmazhatunk (lásd például Pevzner, 1989; Drmanac és munkatársai, in: „Electrophoreses, Supercomputers and the Humán Genome”, World Scientific Publishing Co., Singapore, 47-59. oldal, 1991; Lábát és Drmanac, Proceedings of 2nd International Conference on Bioinformatics, Supercomputing, and Complex Genome Analysis, World Scientific Publishing Co., 555-565. oldal, 1993; mely források mindegyikét hivatkozásul említjük).

Ha az F + P szekvencián kívül F(1 hely)P, F(2 hely)P, F(3 hely)F vagy F(4 hely)P szekvenciákat határozunk meg, az esetleges hibák kijavításához, illetve annak megoldásához, hogy hol található elágazási probléma, algoritmusokat alkalmazunk (lásd például Drmanac és munkatársai, 1991; Bains és munkatársai, J. Theor. Bioi., 135, 303-307, 1988; mely források mindegyikét hivatkozásul említjük).

9. példa

A szekvenálócsipek újrafelhasználása

Ha a szekvenálási eljárásban ligálást alkalmazunk, az átlagos oligonukleotidcsip azonnal nem használható fel újra. Felfedeztük, hogy ez a probléma több módon is kiküszöbölhető.

A második (P) próbaként alkalmazhatunk ribonukletidokat, melyek RN-ázos kezeléssel eltávolíthatók. Az RN-ázos kezeléshez RN-áz A-t (egy endoribonukleáz) alkalmazhatunk, amely az egyszálú RNS-t a pirimidingyököktől 3’-irányban támadja meg, és a foszfátkötéseket a szomszédos nukleotidig hasítja. A kezelés

HU 218 597 Β eredményeként pirimidin-3 '-foszfátokat és terminális pirimidin-3'-foszfátokkal rendelkező oligonukleotidokat kapunk. Az RN-áz A kofaktorok és kétértékű kationok nélkül működik.

Ha RN-ázt alkalmazunk, a csipet rendszerint megfelelő RN-ázt tartalmazó pufferben kell inkubálni (lásd Sambrook és munkatársai, Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). 8x8 mm-es vagy 9x9 mmes tömbhöz 37 °C-on 30-50 pl, RN-ázt tartalmazó pufferrel 10-60 percig végzett inkubálás a megfelelő, s az inkubálás után a hibridizációs pufferrel mosást végezhetünk.

Speciális megvalósítási módokban uracilbázist is alkalmazhatunk, amint azt Craig és munkatársai leírták [Nucleic Acids Research, 17(12), 4605, 1989; melyet itt hivatkozásul említünk], A ligáit próbakombináció - újra felhasználható csip kialakítása érdekében végzett - lebontása az E. coli repair enzimével, az uracilDNS glikozilázzal történő emésztéssel valósítható meg, mely enzim eltávolítja a DNS-ből az uracilt.

A próbák között specifikusan hasítható kötést is kialakíthatunk, melyet a detektálás után elhasítunk. Ezt például kémiai ligálással valósíthatjuk meg [lásd Shabarova és munkatársai, Nucleic Acids Research, 19(115), 4247-4251, 1991; és Dolinnaya és munkatársai, Nucleic Acids Research, 16(9), 3721-3738, 1988] (mindkét forrást hivatkozásul említjük).

Shabarova és munkatársai (lásd fentebb) oligodezoxiribo-nukleotidok (kondenzálószerként cián-bromiddal végzett) kondenzálását írják le. Egylépéses kémiai ligálási reakciójukban az oligonukleotidokat 97 °C-ra melegítik, lassan 0 °C-ra hűtik, majd 10 μΐ 10 M acetonitriles cián-bromid-oldatot adnak hozzá.

Dolinnaya és munkatársai (lásd fentebb) a DNS-duplexekben a nukleotidok közötti foszfor-amidát és pirofoszfát kötések beépítésének módját írják le. A DNS cukor-foszfát vázának módosításához kémiai ligálási eljárást is alkalmaznak, amihez kapcsoló ágensként vízoldékony karbodiimidet (CDI) használnak. A foszfoamid kötés szelektív hasításához a DNS-t 95 °C-on 5 percig 15%-os ecetsavval hozzák érintkezésbe. A pirofoszfát kötés szelektív hasítása során a DNS-t 9:1 arányú piridin:víz eleggyel és frissen desztillált (CF₃CO)₂O-val hozzák érintkezésbe.

Bár a találmány szerinti készítményeket és eljárásokat az előnyben részesített megvalósítási módok értelmében írtuk le, a szakemberek számára nyilvánvaló, hogy a készítmények összetételében, az eljárásokban, annak lépéseiben, illetve a lépések sorrendjében különböző változtatások hajthatók végre anélkül, hogy eltérnénk a találmány tárgykörétől. Közelebbről, a találmányban leírt ágensek bizonyos, kémiailag vagy fiziológiailag rokon ágensekkel helyettesíthetők, miközben hasonló vagy azonos eredmény érhető el. Valamennyi ilyen, a szakemberek számára ismert helyettesítést vagy módosítást a találmány - szabadalmi igénypontok által meghatározott - tárgykörébe tartozónak tekintünk. Az igénypontokban szereplő valamennyi anyag és eljárás további kísérletezés nélkül alkalmazható.

SZEKVENCIALISTA

SZEKVENCIÁK SZÁMA: 10

TUDNIVALÓK AZ 1. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

1. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAAATTTT TT 12

TUDNIVALÓK A 2. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 13 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA : DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

2. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAAATTTT TTC 13

TUDNIVALÓK A 3. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

3. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAATTTTT TA 12

TUDNIVALÓK A 4. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

4. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAATTTTT TT 12

TUDNIVALÓK AZ 5. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS :

5. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAATTTTT TC 12

TUDNIVALÓK A 6. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

HU 218 597 Β

6. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAATTTTT TG 12

TUDNIVALÓK A 7. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

7. SZÁMÚ SZEKVENCIA

TAAAAATTTT TT 12

TUDNIVALÓK A 8. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

8. SZÁMÚ SZEKVENCIA

CAAAAATTTT TT 12

TUDNIVALÓK A 9. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 12 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

9. SZÁMÚ SZEKVENCIA

GAAAAATTTT TT 12

TUDNIVALÓK A 10. SZÁMÚ SZEKVENCIÁHOZ (i) SZEKVENCIAJELLEMZŐK:

(A) HOSSZÚSÁG: 11 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL: egyszálú (D) ALAK: lineáris (ii) MOLEKULA TÍPUSA: DNS (xi) SZEKVENCIALEÍRÁS:

10. SZÁMÚ SZEKVENCIA

AAAAAATTTTT 11

Claims (80)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás nukleotidszekvencia meghatározására valamely cél nukleinsavban, azzal jellemezve, hogy (a) a cél nukleinsavat immobilizált oligonukleotidpróbák egy sorozatával és legalább egy jelölt oligonukleotidpróbával hozzuk érintkezésbe olyan hibridizálációs körülmények között, amelyek lehetővé teszik hibridizáció létrejöttét: (i) a cél nukleinsav és az immobilizált oligonukleotidpróbák komplementer szekvenciái között, valamint (ii) a cél nukleinsav és a jelölt oligonukleotidpróba vagy -próbák komplementer szekvenciái között;

   (b) kovalens kötéssel összekapcsoljuk azokat az immobilizált és jelölt próbákat, amelyek szomszédosán hibridizálódtak ugyanahhoz a cél nukleinsavmolekulához;

   (c) kimutatjuk az immobilizált próbához vagy próbákhoz kovalensen kapcsolt jelölt oligonukleotidpróbák jelzését; és (d) azonosítunk legalább egy nukleotidszekvenciát a cél nukleinsavmolekulában olyan módon, hogy összekötjük a kimutatott jelölt oligonukleotidpróba vagy -próbák nukleotidszekvenciáját a hozzá kapcsolt immobilizált próba nukleotidszekvenciájával.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált oligonukleotidpróbák sorozata az immobilizált oligonukleotidpróbák egy első sorozatát képezi, és a jelölt oligonukleotidpróba egy első jelölt oligonukleotidpróbát képez; és az eljárás továbbá magában foglal az (a) és (b) lépések között egy olyan lépést, amelyben a cél nukleinsavat érintkezésbe hozzuk immobilizált oligonukleotidpróbák egy második sorozatával és egy második jelölt oligonukleotidpróbával olyan hibridizációs körülmények között, amelyek lehetővé teszik a hatékony hibridizáció létrejöttét: (i) a cél nukleinsav és az immobilizált oligonukleotidpróbák második sorozatának komplementer szekvenciái között, valamint (ii) a cél nukleinsav és a második jelölt oligonukleotidpróba komplementer szekvenciái között, ahol az első és második jelölt oligonukleotidpróba szekvenciája különböző és az első és második jelölt oligonukleotidpróbán található jelzés azonos.
3. 3. Az 1. és 2. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett jelöléseket in situ mutatjuk ki.
4. 4. Az 1 -4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próba vagy próbák és a jelölt próba vagy próbák említett kovalens összekapcsolásának lépésében az említett próbákat valamely ligálószerrel hozzuk érintkezésbe.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett jelölt próbát vagy próbákat azonos időpontban hozzuk érintkezésbe a cél nukleinsavval, mint az említett ligálószert.
6. 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (b) lépés után és a (c) lépés előtt azokat a jelölt próbákat, amelyek nincsenek kovelensen kapcsolva egy immobilizált próbához, eltávolítjuk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy azokat ajelölt próbákat, amelyek nincsenek kovalensen kapcsolva egy immobilizált próbához, szigorú mosási körülmények között távolítjuk el.
8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy immobilizált próbák sokasága van immobilizálva azonos szilárd hordozón.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az eltérő nukleotidszekvenciákkal bíró immobilizált próbákat különböző szilárd hordozókon immobilizáljuk.
10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált oligonukleotidpróbák tömbök sokaságát alkotják szekvenálócsip formájában elrendezve.
11. 11. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első sorozat immobilizált próbáinak sokaságát valamely szilárd hordozón immobilizáljuk, és a második sorozat immobilizált próbáinak sokaságát ugyanazon a szilárd hordozón immobilizáljuk.

    HU 218 597 Β
12. 12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próbák első és második sorozatai egy szekvenálócsipet alkotnak.
13. 13. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az első sorozat immobilizált próbáit, amelyek eltérő nukleotidszekvenciákkal bírnak, különböző szilárd hordozókon immobilizáljuk, és/vagy a második készlet immobilizált próbáit, amelyek eltérő nukleotidszekvenciákkal bírnak, különböző szilárd hordozókon immobilizáljuk.
14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat a jelölt oligonukleotidpróbák sorozatával egymás utáni formában hozzuk érintkezésbe egy időben egy jelölt oligonukleotiddal.
15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a sorozat jelölt oligonukleotidpróbái, amelyek eltérő nukleotidszekvenciákkal bírnak, azonos jelöléssel vannak jelölve.
16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a sorozat legalább két oligonukleotidpróbája, amelyek eltérő nukleotidszekvenciákkal bírnak, különböző jelölésekkel van jelölve.
17. 17. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat egyidejűleg hozzuk érintkezésbe az immobilizált próbák sorozatával és ajelölt oligonukleotidpróbával.
18. 18. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat először immobilizált próbák sorozatával hozzuk érintkezésbe, hogy immobilizált próba:cél komplexeket alakítsunk ki, majd ajelölt oligonukleotidpróbával hozzuk érintkezésbe.
19. 19. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat egyidejűleg hozzuk érintkezésbejelölt oligonukleotidpróbák sorozatának legalább két jelölt nukleotid próbájával, ahol az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróba eltérő, megkülönböztethető jelöléssel van jelölve, és eltérő nukleotidszekvenciákkal bír, amelyek azonosíthatók megfelelő jelöléseik tulajdonságai alapján.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat egyidejűleg hozzuk érintkezésbe az immobilizált próbák sorozatával és az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróbával.
21. 21. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat először érintkezésbe hozzuk immobilizált próbák sorozatával, hogy immobilizált próba:cél komplexet alakítsunk ki, majd az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróbával hozzuk érintkezésbe.
22. 22. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat egyidejűleg hozzuk érintkezésbe ajelölt oligonukleotidpróbák sorozatának legalább két jelölt oligonukleotidpróbájával, ahol az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróba eltérő, megkülönböztethető jelöléssel van jelölve, és eltérő nukleotidszekvenciával bír, amelyek azonosíthatók megfelelő jelöléseik tulajdonságai alapján, és a (d) lépésben az immobilizált és jelölt próbák nukleotid szekvenciáit úgy határozzuk meg, hogy megfigyeljük a jelölések in situ tulajdonságait és ezek relatív helyzeteit egy tömbön belül.
23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat egyidejűleg hozzuk érintkezésbe az immobilizált próbák tömbjével és az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróbával.
24. 24. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (a) lépésben a cél nukleinsavat először az immobilizált próbák tömbjével hozzuk érintkezésbe, hogy immobilizált próba:cél komplexet alakítsunk ki, majd az említett legalább két jelölt oligonukleotidpróbával hozzuk érintkezésbe.
25. 25. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav nukleotidszekvenciáját kovalensen kapcsolt, immobilizált és jelölt próbák átfedő kombinált nukleotidszekvenciáiból állítjuk össze.
26. 26. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav teljes nukleinsavszekvenciáját meghatározzuk.
27. 27. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsavat feltérképezzük.
28. 28. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsavon részleges szekvenciaelemzést végzünk.
29. 29. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált oligonukleotidpróbáknak F hossza van, és a jelölt oligonukleotidpróbáknak P hossza van, ahol az F és P hossza egymástól függetlenül 4 és 9 nukleotid között van.
30. 30. Az 1-24. és 29. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett immobilizált oligonukleotidpróba vagy -próbák és/vagy az említett jelölt próba vagy próbák tartalmaznak továbbá egy univerzális bázist, vagy tartalmazzák mind a négy bázist terminális helyzetben.
31. 31. Az 1-24. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav ffagmentálva van az (a) lépés előtt.
32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav restrikciós enzimes emésztéssel, ultrahangos kezeléssel, NaOH-dal végzett kezeléssel vagy kisnyomású nyírással van ffagmentálva.
33. 33. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsavfragmenteknek T hossza van, az immobilizált oligonukleotidpróbáknak F hossza van, és a jelölt oligonukleotidpróbáknak P hossza van, ahol T 10 és 100 nukleotid között, míg F és P egymástól függetlenül 4 és 9 nukleotid között van.
34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy T értéke 10 és 40 nukleotid között van.
35. 35. A 34. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy T értéke mintegy 20 nukleotid.
36. 36. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy T mintegy háromszor hosszabb mint F.
37. 37. A 33-36. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy F és P mindegyike 6 nukleotid.

    HU 218 597 Β
38. 38. Az 1-37. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szomszédosán hibridizált, immobilizált és jelölt próba vagy próbák enzimes ligálással vannak kovalensen kötve egymáshoz.
39. 39. Az 1-38. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizálást ciklusokban végezzük el.
40. 40. Az 1-39. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizálási körülmények csak akkor teszik lehetővé a hibridizálódást a cél nukleinsavak, valamint az immobilizált próbák és jelölt próbák között, ha utóbbiak tökéletesen komplementerek a cél nukleinsavak valamely részletével.
41. 41. Az 1-40. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hibridizálási körülmények csak azon immobilizált próbák és jelölt próbák hibridizálódását teszik lehetővé, amelyek azonos cél nukleinsavmolekulán közvetlenül egymás mellett képesek hibridizálódni.
42. 42. Az 1-41. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav klónozott DNS, kromoszomális DNS vagy mRNS.
43. 43. Az 1-42. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált oligonukleotidpróbákat kovalens rögzítés útján immobilizáljuk.
44. 44. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próbákat foszfodiészter kötés segítségével immobilizáljuk.
45. 45. A 43. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próbákat valamely kapcsolón át immobilizáljuk.
46. 46. Az 1-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próbákat üvegen, polisztirolon vagy teflonon immobilizáljuk.
47. 47. Az 1-46. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelölés valamely radioaktív izotóp, nem radioaktív izotóp vagy olyan rész, amely fény kibocsátására képes.
48. 48. A 47. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelölés valamely fluoreszcens festék.
49. 49. Az 1-48. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a cél nukleinsav, egy immobilizált próba vagy egy jelölt próba valamely módosított bázist vagy univerzális bázist tartalmaz.
50. 50. Az 1-49. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az immobilizált próba újra alkalmazható az említett hibridizálás után.
51. 51. Az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a jelölt próba oligonukleotidjai ribonukleotidokat tartalmaznak.
52. 52. Az 51. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett, ribonukleotidokat tartalmazó, kovalensen kapcsolt jelölt próbát az immobilizált próbától RNS-ázos kezeléssel távolítjuk el.
53. 53. Az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kovalensen kapcsolt jelölt próba tartalmaz egy uracilbázist.
54. 54. Az 53. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett, uracilbázist tartalmazó, kovalensen kapcsolt jelölt próbát az immobilizált próbából uracil-DNS glikozilázos kezeléssel távolítjuk el.
55. 55. Az 50. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett jelölt próba kémiailag hasítható kötést tartalmaz.
56. 56. Készlet nukleotidszekvencia azonosítására valamely cél nukleinsavban, amely tartalmazza (a) immobilizált oligonukleotidpróbák sorozatát;

    (b) jelölt oligonukleotidpróbák sorozatát; és tartalmaz (c) egy ligálószert.
57. 57. Az 56. igénypont szerinti készlet, amelyben az említett immobilizált oligonukleotidpróbák valamely egyedi szilárd hordozón vannak elrendezve.
58. 58. Az 56. vagy 57. igénypont szerinti készlet, amelyben az említett immobilizált oligonukleotidpróbák eltérő szilárd hordozón vannak immobilizálva.
59. 59. Az 57. igénypont szerinti készlet, amelyben az immobilizált oligonukleotidpróbák tömbje szekvenálócsip formájában elrendezett tömbök sokaságát tartalmazza.
60. 60. Az 59. igénypont szerinti készlet, amelyben a tömbök között hidrofób szegmensek vannak alkalmazva.
61. 61. Az 56-60. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben legalább két jelölt oligonukleotidpróba ugyanazzal a jelöléssel van jelölve.
62. 62. Az 56-60. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben legalább két jelölt oligonukleotidpróba eltérő jelöléssel van jelölve.
63. 63. Az 56-62. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az immobilizált oligonukleotidpróbák F hosszúságúak és a jelölt oligonukleotidpróbák P hosszúságúak, ahol az F és P értéke egymástól függetlenül 4 és 9 nukleotid között van.
64. 64. Az 56-63. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az említett immobilizált oligonukleotidpróbák és/vagy az említett jelölt oligonukleotidpróba vagy -próbák tartalmaznak még egy univerzális bázist, vagy tartalmazzák mind a négy bázist terminális helyükön.
65. 65. Az 56-64. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az említett immobilizált oligonukleotidpróbák és az említett jelölt oligonukleotidok egyaránt 6 nukleotidból állnak.
66. 66. Az 56-64. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az említett immobilizált oligonukleotidpróba az említett cél mintegy harmad hosszát képezi.
67. 67. Az 56-66. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a ligálószer valamely ligáló enzim.
68. 68. Az 56-67. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az immobilizált próbák foszfodiészter kapcsolás segítségével vannak immobilizálva.
69. 69. Az 56-67. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az immobilizált próbák valamely kapcsolón keresztül vannak immobilizálva.
70. 70. Az 56-69. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az immobilizált próbák üvegen, polisztirolon vagy teflonon vannak immobilizálva.
71. 71. Az 56-70. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a jelölés valamely radioaktív izotóp, nem radioaktív izotóp vagy olyan rész, amely fény kibocsátására képes.

    HU 218 597 Β
72. 72. Az 56-70. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a jelölés valamely fluoreszcens festék.
73. 73. Az 56-72. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a cél nukleinsav, egy immobilizált próba vagy egy jelölt próba valamely módosított bázist vagy univerzális bázist tartalmaz.
74. 74. Az 56-73. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben az immobilizált próba újra alkalmazható az említett hibridizálás után.
75. 75. Az 56-74. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a jelölt próba oligonukleotidjai ribonukleotidokat tartalmaznak.
76. 76. Az 56-74. igénypontok bármelyike szerinti készlet, amelyben a jelölt próba oligonukleotidjai uracilbázist tartalmaznak.
77. 77. Eljárás nukleotidszekvencia azonosítására valamely cél nukleinsavban, azzal jellemezve, hogy (a) egy cél nukleinsavat érintkezésbe hozunk valamely szilárd hordozón való immobilizálást lehetővé tevő, kémiai módosításon átesett első oligonukleotidpróba vagy -próbák sorozatával és legalább egy jelölt második oligonukleotidpróbával olyan hibridizálási körülmények között, amelyek hatékonyak a hibridizálás lehetővé tételére (i) a cél nukleinsav és az első próbák komplementer szekvenciák között, és (ii) a cél nukleinsav és a jelölt második próba vagy próbák komplementer szekvenciái között;

    (b) az első próbát vagy próbákat és a jelölt második próbát vagy próbákat, amelyek szomszédosán hibridizálnak ugyanahhoz a cél nukleinsavmolekulához, kovalensen összekapcsoljuk;

    (c) kimutatjuk azoknak a jelölt második nukleotidpróbának vagy próbáknak a jelöléseit, amelyek kovalensen kötve vannak az első próbához vagy próbákhoz anélkül, hogy kinyernének az említett jelöléseket; és (d) azonosítunk legalább egy nukleotidszekvenciát a cél nukleotidmolekulában egy olyan lépés segítségével, amelyben a kimutatott jelölt oligonukleotidpróba vagy -próbák nukleotidszekvenciáit egyesítjük a megfelelő összekapcsolt, immobilizált oligonukleotidpróba vagy -próbák nukleotidszekvenciáival.
78. 78. A 77. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett első próba vagy próbák biotinilezve vannak, hogy lehetővé váljék az immobilizálás sterptavidinnel borított gyöngyökön.
79. 79. Készlet nukleotidszekvencia azonosítására valamely cél nukleinsavban, amely tartalmazza (a) valamely szilárd hordozón való immobilizálást lehetővé tevő kémiai módosításon átesett első oligonukleotidpróbák sorozatát;

    (b) jelölt második oligonukleotidpróbák sorozatát, amelyben legalább egy jelölt oligonukleotidpróba olyan jelölést tartalmaz, amelyet a jelölés visszanyerése nélkül ki lehet mutatni; és tartalmaz (c) egy ligálószert.
80. 80. A 79. igénypont szerinti készlet, amelyben legalább két jelölt második oligonukleotidpróba azonos jelöléssel van jelölve.