JP2003527075A

JP2003527075A - ハイブリダイゼーションによる配列分析のための、溶液ベースの方法

Info

Publication number: JP2003527075A
Application number: JP2000606796A
Authority: JP
Inventors: ラドジェドルマナック，
Original assignee: ハイセック，インコーポレーテッド
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-27
Publication date: 2003-09-16
Also published as: US6537755B1; WO2000056937A3; EP1192274A2; CA2366289A1; AU4033500A; US20030143614A1; WO2000056937A2

Abstract

(57)【要約】ハイブリダイゼーションによる配列分析のための、新規な溶液ベースの方法および物質が、装置を含めて提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

本出願は、１９９９年３月２５日に出願された米国特許出願番号第０９／２７
７，３８３号（引用することによって本明細書に組み入れることとする）の一部
継続出願である。

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は一般に、ハイブリダイゼーションによって核酸配列を分析するための
、新規な方法および物質であって、ハイブリダイゼーション反応が溶液環境で起
こるものに関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】

核酸試料における４種のヌクレオチドの配列を決定する速度は、分子生物学、
医薬、バイオテクノロジーのさらなる進歩に対する技術的な障壁の主たるものと
なっている。ゲルでの核酸分子の分離工程を包含する核酸配列決定法は、１９７
８年から使用されている。核酸の配列を決定するための、他の折り紙付きの方法
がハイブリダイゼーションによる配列決定（ＳＢＨ）である。

【０００３】ヌクレオチドの配列（すなわち、試料中のＡ、Ｇ、Ｃ及びＴヌクレオチドの順
序）を決定する旧来の方法は、特定のヌクレオチドでの分解によって、無作為に
終止し差次的にラベルされた核酸断片を調製することによって、または複製して
いる鎖のジデオキシ連鎖停止によって実施される。こうして得られる１乃至５０
０塩基対の範囲にある核酸断片は次いで、ゲルにて分離されてバンドのラダーを
生じるが、ここで隣接する試料は１ヌクレオチド分だけ長さが異なっている。

【０００４】ＳＢＨでは、核酸分子の分離、分解、合成またはイメージングにおいて、単一
塩基の分割を必要としない。長さの短いオリゴヌクレオチドのＫ塩基のミスマッ
チ差別的ハイブリダイゼーションを使用して、構成がＫマーのオリゴヌクレオチ
ドのリストを標的核酸について調べることができる。標的核酸に対する配列は、
スコアリングされたオリゴヌクレオチドを独自に重ね合わせることによって集め
ることができる。

【０００５】ハイブリダイゼーションによる配列決定を成し遂げるために採られうるアプロ
ーチがいくつかある。ＳＢＨフォーマット１と称されるプロセスでは、核酸試料
が整列化（array）され、そしてラベルされたプローブが試料とハイブリダイズ
される。試料核酸の同じセットを有するレプリカ膜を、様々なプローブの並行ス
コアリングのために使用してもよく、および／またはプローブを多重化してもよ
い。核酸試料は、ナイロン膜または好適な支持体上に、整列化およびハイブリダ
イズされうる。各々の膜アレイは、多くの回数におよんで再使用されうる。フォ
ーマット１は特に、多数の試料の回分プロセスに対して効果的である。

【０００６】ＳＢＨフォーマット２では、プローブがそれらのそれぞれの配列に対応する基
質上の位置に整列化されて、ラベルされた核酸試料断片が当該整列化プローブに
ハイブリダイズされる。この場合、断片に関する配列情報を、整列化プローブの
すべてとの同時ハイブリダイゼーション反応にて決定することができる。他の核
酸断片を配列決定するために、同じオリゴヌクレオチドアレイを再使用してもよ
い。アレイは、スポッティングによって、またはプローブのin situ合成によっ
て製造することができる。

【０００７】フォーマット３のＳＢＨでは、２つのセットのプローブが使用される。一の実
施態様において、１のセットは、既知の位置にあるプローブのアレイの形式とな
っており、そして他のラベルされたセットは、複数ウェルのプレートに保存され
うる。この場合、標的核酸がラベルされる必要はない。標的核酸と、１以上のラ
ベルされたプローブが、プローブのアレイセットに付加される。１の付着したプ
ローブと１のラベルされたプローブとの双方が標的核酸上で近接してハイブリダ
イズすると、それらは共有的に連結され、その連結されたプローブの長さの合計
に等しい検出配列が作られる。このプロセスによって、長い核酸断片、例えば完
全な細菌ゲノムの配列を、核酸をさらに小片にサブクローニングすることなく決
定することが可能となる。

【０００８】しかしながら、長い核酸を明確に配列決定するためには、ＳＢＨで長いプロー
ブを使用することが包含される。プローブの長さが増加するにつれ、配列情報を
作製するために必要なプローブの数も増加する。標的の長さが各々２倍増加する
と、プローブの長さは１塩基増加する必要があり、結果として必要とされるプロ
ーブの数が４倍増加することになる（長さがｋのプローブの、可能な全配列の完
全なセットは４^kプローブを含む）。例えば、１００塩基のＤＮＡの配列決定に
は１６，３８４の７マーを必要とし、２００塩基の配列決定には６５，５３６の
８マーを必要とし、４００塩基では２６２，１４４の９マー、８００塩基では１
，０４８，５７６の１０マー、１６００塩基では４，１９４，３０４の１１マー
、３２００塩基では１６，７７７，２１６の１２マー、６４００塩基では６７，
１０８，８６４の１３マー、そして１２，８００塩基では２６８，４３５，４５
６の１４マーを必要とする。

【０００９】限られた数のプローブしか各アレイをベースとするハイブリダイゼーション反
応においてスコアリングされないので、非常に多数のプローブが複数のハイブリ
ダイゼーション反応を行うことが必要とされる。

【００１０】効率を高めてハイブリダイゼーション反応の数を低減するＳＢＨの改善は、長
いポリヌクレオチド片をde novoで配列決定する実際的な能力を大いに増強する
であろう。このような改善はもちろん、再配列決定およびＳＢＨの他の適用をも
向上させるはずである。このように、ハイブリダイゼーションによる配列分析を
実施するための、改善された方法及び物質が希求されている。

【００１１】

【発明の要約】

本発明は、ハイブリダイゼーションによる配列分析（以下、本明細書では「Ｓ
ＢＨ」と称する）を実施するための、装置及びキットを含めた新規の方法及び物
質を提供する。本発明によれば、これらの方法の効率、感度及び精度が、好まし
くは単一のプローブ分子検出と組み合わせられて、ハイブリダイゼーションの全
工程を溶液中で実施することによって向上する。本発明の方法及び物質は好都合
に、プローブを支持体に付着させることなくプローブをより簡単に調製すること
を許容し、多数且つ相異するタイプのプローブの使用を可能とし、固相ハイブリ
ダイゼーションに対する（標的またはプローブ（１または複数）が固形支持体に
結合した場合の）ハイブリダイゼーション及び酵素動態を改善し、そして異なる
レンジの検出装置の使用を許容する。

【００１２】一の態様において、本発明は、標的核酸の配列を検出する方法であって、以下
の工程すなわち、（ａ）標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数
のオリゴヌクレオチドプローブ分子［各プローブ分子は情報領域を含み、少なく
とも２のプローブ分子は異なる情報領域を有する］の、１またはそれ以上の混合
物に、情報領域でミスマッチがあるプローブ分子とよりも平均して多くの、プロ
ーブ分子の情報領域内で標的核酸に完全に相補的なプローブ分子との、プローブ
：標的ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下に接触させ［この際、該標的
核酸は支持体に付着されておらず、プローブ分子は支持体に付着されていない］
、（ｂ）個々のプローブ分子を検出することができる読み取り機を使用して、標
的核酸とハイブリダイズするプローブ分子を検出し、および（ｃ）工程（ａ）に
て標的に接触させられるプローブ分子のうち少なくとも２の情報領域の配列を重
ね合わせることによって、標的核酸の配列を検出する、工程を含む方法を提供す
る。本発明の方法は、少なくとも２の混合物が同時に接触させられ、または別の
態様では少なくとも２の混合物が連続的に接触させられる。本発明の方法には、
その情報領域において別異の少なくとも約１０のプローブ分子、その情報領域に
おいて別異の少なくとも約１００のプローブ分子、その情報領域において別異の
少なくとも約１，０００のプローブ分子、その情報領域において別異の少なくと
も約１０，０００のプローブ分子を含むものを包含する。一の態様において、本
発明の方法は、修飾された塩基を含むプローブ分子を包含する。

【００１３】本発明の複数のプローブ分子は、識別タグに会合してもよく、そして一の態様
においては、複数のプローブ分子が各々、２の識別タグを有している。一の態様
においては、本発明の方法は、各々同じ識別タグに会合している、同じ情報領域
を有する複数のプローブ分子が包含されうる。別の態様において、異なる情報領
域を有する少なくとも２のプローブ分子が、異なる識別タグに会合している。

【００１４】本発明の方法には、プローブ分子がプールに分けられ、各プールは異なる情報
領域を有する少なくとも２のプローブ分子を含み、且つ各プール内の全プローブ
分子が、プールに特有の同じ識別タグに会合しているものである方法が包含され
る。一の態様において、少なくとも１の識別タグはバーコードである。そのバー
コードが、サイズ、形状、電気特性、磁気特性、光学特性、および化学特性より
なる群から選択される特性に基づくものである方法が提供される。あるいは、そ
の識別タグは、修飾された塩基を含むDNAバーコード、分子バーコード、ナノ粒
子バーコードである。一の態様において、そのバーコードは、様々な長さのエレ
メントを含み、各エレメントは設定数のユニット・タグを含む。設定数は例えば
、１、２、３、４、５またはそれ以上に、所望される組み合わせ数やユニット・
タグのタイプによって変化させることができる。

【００１５】別の態様において、本発明の方法は、セパレータ・タグと会合している標的核
酸を包含する。あるいは、プローブ分子がセパレータ・タグと会合してい方法が
提供される。

【００１６】本発明はさらに、前記の検出工程（ｂ）の前に、標的核酸とハイブリダイズす
るプローブ分子が、標的核酸とハイブリダイズしないプローブ分子から分離され
る方法を提供する。一の態様において、標的核酸とハイブリダイズしないプロー
ブ分子が、酵素消化によって除去される。

【００１７】本発明はまた、工程（ｂ）がさらに、同じ情報領域を有するプローブ分子が検
出される回数を計数することを含む方法を提供する。一の態様において、本発明
の方法は、工程（ｂ）においてプローブ分子を検出するために使用される、ナノ
ポアチャンネルを含む読み取り機を包含する。あるいは、本発明の方法は、工程
（ｂ）においてプローブ分子を検出するために、ナノポアチャンネル内またはそ
の周辺の電気的応答のセンシングが使用されることを包含する。一の態様におい
て読み取り機は、工程（ｂ）にて分子バーコードを検出する。

【００１８】本発明はさらに、プローブ分子が、検出工程（ｂ）の実施中にプローブ分子の
５’／３’方向を同定することを許容する１以上のタグに会合している方法を提
供する。他の実施態様において、本発明の方法では、工程（ｂ）において、プロ
ーブ分子（１または複数）の配列が検出される。一の態様において、少なくとも
２のプローブ分子が識別タグに会合しており、そして識別タグも工程（ｂ）にお
いて検出される方法が提供される。

【００１９】本発明はさらに、標的核酸を配列決定する方法であって、以下の工程すなわち
、（ａ）標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数のオリゴヌクレ
オチドプローブ分子の、１またはそれ以上の混合物［各プローブ分子は情報領域
を含み、少なくとも２のプローブ分子は異なる情報領域を有する］に、情報領域
でミスマッチがあるプローブ分子とよりも平均して多くの、プローブ分子の情報
領域内で標的核酸に完全に相補的なプローブ分子との、プローブ：標的ハイブリ
ダイゼーションを生じさせる条件下に接触させ［この際、該標的核酸は支持体に
付着されておらず、プローブ分子は支持体に付着されていない］、（ｂ）プロー
ブ分子の情報領域内で標的に完全に相補的な、近接するプローブ：標的ハイブリ
ッドを形成するプローブ分子を共有結合させ、および（ｃ）共有結合されたプロ
ーブ分子を、個々のプローブ分子を検出することができる読み取り機を用いて検
出する、工程を含む方法を提供する。別の態様において、本発明の方法は、以下
の工程すなわち、（ｄ）工程（ａ）にて標的に接触させられる２のプローブ分子
の情報領域の配列を組み合わせることにより作製される少なくとも２の配列を重
ね合わせることによって、標的核酸の配列を検出する、工程をさらに含むもので
ある。本明細書で使用する場合、「２のプローブ分子の情報領域の配列を組み合
わせる」とは、適切な５’−３’方向に連接するように配列を組み合わせること
を意味する。別の実施態様において、検出工程（ｃ）の前に、共有結合している
プローブ分子が、共有結合していないプローブ分子から分離される方法が提供さ
れる。

【００２０】さらにまた提供されるのは、ポリメラーゼまたはその活性断片を使用して、標
的核酸にハイブリダイズする１またはそれ以上のプローブ分子の端に少なくとも
１のヌクレオチドが付加される方法である。一の態様において、プローブ分子は
特有にラベルされた異なる４のヌクレオチドの混合物と接触される。

【００２１】全ヒトゲノムを含む標的核酸が、プローブ分子と接触させられる方法が提供さ
れる。あるいは、単一のヌクレオチドの多型が検出される方法が検出される。

【００２２】本発明はさらに、プローブ分子の混合物を含むキットを提供し、かかるキット
において、約１００またはそれ以上のプローブ分子が各々、別異の情報領域を有
し、混合物の中の該別異の情報領域の２またはそれ以上の配列は重複している。
一の態様において、そのキットは、同じ情報領域を各々有している、約１０⁵ま
たはそれ未満のプローブ分子を包含している。別の態様において、キットは同じ
情報領域を各々有している、約１０⁴またはそれ未満のプローブ分子を包含して
いる。あるいは、本発明のキットは、各情報領域が、同じ情報領域を有する１０ ⁴ またはそれ以上のプローブ分子によって提示されるものを包含する。さらにま
た提供されるのは、同じ情報領域を有する少なくとも２のプローブ分子が、同じ
識別タグを有しているキットである。

【００２３】一の態様において、プローブ分子の混合物のセットを含むキットが提供され、
かかるキットにおいて、約１００またはそれ以上のプローブ分子が各々、別異の
情報領域を有し、セットの中の該別異の情報領域の２またはそれ以上の配列が重
複している。一の態様において、約１０⁵またはそれ未満のプローブ分子が各々
、同じ情報領域を有している本発明のキットが提供される。別の態様において、
異なる情報領域を有する少なくとも２のプローブ分子が同じプール内にあり、そ
して同じ識別タグを有しているキットが提供される。また、約５０００またはそ
れ以上のプローブ分子が各々、同じ情報領域を有しているキットも提供される。

【００２４】本発明はさらに、様々な検出可能な特性のエレメントの交互配置（alternatin
g arrangement）を含むバーコードであるタグであり、継続的なエレメントがそ
れらの検出可能な特性の少なくとも１つに相異を有しているタグを提供する。一
の態様において、タグ内のエレメントは、様々な検出可能な特性の複合ユニット
タグ（multiple unit tag）を含み、該エレメントは長さが様々なものである。

【００２５】本発明は、標的核酸を配列を分析するための方法であって、以下の工程すなわ
ち、（ａ）標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数のオリゴヌク
レオチドプローブ（複数のプローブ分子を含んでもよい）の混合物［各プローブ
分子は情報領域を含む］に、プローブの情報領域で完全に相補的なプローブ：標
的ハイブリッドと、プローブの情報領域にミスマッチがあるプローブ：標的ハイ
ブリッドとを分別する条件下で（すなわち、情報領域にミスマッチがあるプロー
ブとよりも平均して多くの、プローブの情報領域内で標的核酸に完全に相補的な
プローブとの、プローブ：標的ハイブリダイゼーションを生じさせる条件下に）
接触させ［この際、該標的核酸は支持体に付着されておらず、プローブ分子は支
持体に付着されていない］、（ｂ）好ましくは、個々のプローブ分子を検出する
ことができる読み取り機を使用して、標的核酸とハイブリダイズするプローブの
サブセットを検出し、および（ｃ）工程（ｂ）において検出されたプローブの２
またはそれ以上から、標的核酸の配列を決定する、工程を含む方法を提供する。

【００２６】ハイブリダイゼーションの条件およびプール方法使用によっては（詳細は後述
する）、工程（ｂ）は標的核酸とハイブリダイズするサブセットよりも多くのプ
ローブを検出することを包含しうる。しかしながら、１９９９年１月６日に出願
された米国仮出願連続番号第６０／１１５，２８４号と、これに関連する共有で
係属中の、２０００年１月６日に出願された米国出願連続番号第０９／４７９，
６０８号（これらを引用することにより、本明細書に組み入れることとする）に
て論じられているように、ＳＢＨプロセスおよびアルゴリズムは非常に強力なも
のであり、そして多数の偽陽性プローブを扱うことができる。

【００２７】工程（ｃ）における配列の決定は、例えば、標的核酸に対する被検出プローブ
のいくつか（２もしくはそれ以上、３もしくはそれ以上、または４もしくはそれ
以上）またはすべての配列を実際に重ね合わせることによって、または標的核酸
に対するプローブの被検出セット（核酸試料の一致度に相関して、核酸試料を同
定するためのサインとして役立つかもしれない）を、別の標的核酸に対する被検
出セットと比較することによって行うことができる。

【００２８】工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、プローブの情報領域内にミスマッチがある
プローブ：標的ハイブリッドから、プローブの情報領域内で完全に相補的なプロ
ーブ：標的ハイブリダイゼーションを分離する工程が、任意に実施される。ある
いは、工程（ａ）と工程（ｂ）との間に、プローブの情報領域内において標的に
完全に相補的な隣接するプローブ：標的ハイブリッドを形成する、プローブを共
有結合させる工程が行われ、そして工程（ｂ）において、共有結合されたプロー
ブのサブセットが検出される。

【００２９】プローブは、識別タグと会合していてもよい。プローブの各々は、特有の識別
タグと会合していてもよいし、あるいはプローブが情報的プールに分けられてい
て、各情報的プール内のすべてのプローブは当該情報的プールに特有の識別タグ
と会合している。好ましい識別タグは、ＤＮＡバーコードである。標的核酸また
はプローブは、ハイブリダイズしていない核酸からのプローブ：標的ハイブリッ
ドの分離を助ける、１またはそれ以上のセパレータ・タグと会合していてもよい
。

【００３０】ハイブリダイゼーション工程において使用されるプローブの数は、少なくとも
約１０、少なくとも約１００、少なくとも約１０００、少なくとも約１０⁴、少
なくとも約１０⁵、少なくとも約１０⁶、または少なくとも約１０⁷の異なるプロ
ーブ（それらの情報領域にて別異の、プローブ配列の数を意味する）であるとよ
く、そして潜在的には、最大約１０¹⁰の異なるプローブかさらにそれ以上までの
範囲でありうる。この方法によれば、プローブ分子の混合物は少なくとも２そし
て好ましくはもっと多くのプローブ分子で、各々異なる情報領域を有するものを
含む。

【００３１】検出工程（ｂ）において、陽性プローブはナノポアチャンネルを含む読み取り
機を用いて検出されうる。検出は、プローブ分子がポアを通過するか越える際の
、ナノポアチャンネル内またはその周辺の電気的応答のセンシングを介して行わ
れてもよい。この方法の好ましい実施態様において、ナノポアチャンネルを含む
読み取り機は、各プローブに会合したＤＮＡバーコードを検出するか、またはプ
ローブ自体の配列を検出する。あるいは、単一のプローブ分子を検出することが
できる、当業者に知られた好適な読み取り機のいずれかのものを使用して、陽性
プローブを検出してもよい。

【００３２】本発明の他の態様では、前記のごときハイブリダイゼーション工程を行うため
の手段、そして検出工程を行うための手段を含む装置が提供される。このような
装置は好ましくは、ナノポアチャンネルを含む読み取り機を含むものである。

【００３３】本発明のさらなる態様によれば、１またはそれ以上のキットを形成するプロー
ブのセットが提供され、各セットは異なるプローブの混合物を含むものである。
かかるプローブのセットは、少なくとも約１０、１００、１０００、１０⁴、１
０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、または１０¹⁰の異なるプローブ（それらの
情報領域にて別異の、プローブ配列の数を意味する）を含むとよい。好ましくは
、各情報領域は約１０⁴またはそれ以上のプローブ分子によって提示される（縮
重末端を含んでもよい）。セットに含まれる各プローブは、１またはそれ以上の
識別タグと、任意に１またはそれ以上のセパレータ・タグと会合していてもよい
。セットに含まれる各プローブは、特にキットがＳＢＨにおけるプール方法での
使用を意図するものである場合など、特有の識別タグと会合している必要はない
。

【００３４】本発明によって提供される、改良されたＳＢＨの効率は、極めて多数のプロー
ブを必要とする、配列決定および再配列決定での適用に対してことのほか好都合
である。非常に多数のプローブを必要とする適用の例として、以下のものが挙げ
られる。（１）全ヒトゲノムおよび他の複雑（complex）ゲノムの配列決定また
は再配列決定、（２）ヒトまたは他の複雑細胞中の総ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡの
配列決定または再配列決定、（３）個体ごとのヒトゲノムにおける単一ヌクレオ
チド多型の数千または何兆もの遺伝子型特定、（４）数千の塩基のde novoの配
列決定。潜在的に、これらのタイプの配列分析を実施するために必要とされるで
あろうプローブのすべてを、標的ポリヌクレオチド配列との、溶液ベースのハイ
ブリダイゼーション反応において使用することが可能である。

【００３５】本発明の方法および物質はまた、例えばOuyangら、Science, 278:446-9 (1997
)、Guamieriら、Science, 273:220-3 (1996)に記載された、ＤＮＡ演算（DNA co
mputing）を行うためにも有用である。

【００３６】本発明のさらに多くの態様や利点が、現在のところ好ましい本発明の実施態様
を記載した、本発明の発明の詳細な説明を考慮することで、当業者に明らかにな
るであろう。

【００３７】［発明の詳細な説明］ＳＢＨの主要な３つの工程は、標的ポリヌクレオチドへのプローブのハイブリ
ダイゼーション、（標的核酸に充分に相補的なプローブを含むことが期待される
）陽性の結果の検出、そしてプローブの情報領域の配列を重ね合わせることを包
含しうる、結果からの情報配列分析または組立である。

【００３８】本発明は、全ハイブリダイゼーション工程が溶液環境にて実施されるＳＢＨを
実施するための、新規な方法および装置を含めた物質を提供する。本発明は旧来
のＳＢＨ法に比してＳＢＨの効率、感度および精度における向上をもたらし、そ
して旧来のＳＢＨ法が有用ないかなるタイプの配列解析のためにも使用すること
ができる。この手段には、核酸診断、法医学および遺伝子マッピングにおける、
多くの適用がある。またこれは、遺伝子の選択部分、完全な遺伝子、全ゲノム、
またはゲノムのサブセットにおける単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含めた
多型や変異を発見するために、遺伝的障害またはその他の形質の原因たる変異を
同定するために、核酸断片の同一性を立証するために、感染物質、その特定の株
、またはその変異体（ウイルス、細菌、真菌、および寄生生物を含む）を同定す
るために、法医学的な目的、または親の特定のための試料中の核酸を同定するた
めに、生物多様性を評価するために、そして核酸配列に依存する他のタイプの多
くのデータを作成するためにも使用されうる。例えば、１９９８年７月２３日に
公開された国際公開第ＷＯ９８／３１８３６号パンフレットの実施例１９乃至
２７、および１９９９年２月２８日に公開されたＷＯ９９／０９２１７号パン
フレット（双方とも、引用することにより本明細書に組み入れることとする）を
参照されたい。

【００３９】本発明のＳＢＨ法は、主に以下の点により、旧来のＳＢＨ法と異なっている。
（１）ハイブリダイゼーション反応が、もっぱら溶液中で行われる（すなわち、
プローブ、標的核酸のいずれもが、固体支持体に付着されない）、（２）多数の
プローブの混合物を溶液中で同時に、標的核酸にハイブリダイゼーションさせる
ことができる、そして（３）陽性プローブの検出が、数百または数千の分子でな
く、単一分子のレベルにて行われる（例えば、質量分析法を用いて陽性プローブ
が検出される場合、おそらく１０００プローブのハイブリダイゼーションが検出
可能なシグナルを生じるために必要となるであろうし、あるいはプローブが放射
活性によってラベルされる場合、おそらく１０⁵のプローブのハイブリダイゼー
ションが検出可能なシグナルを生じるために必要となるであろう）。

【００４０】旧来のＳＢＨ法は、当業者が了知している数多くの方法によって実施されうる
、よく開発された技術である。例えば、ハイブリダイゼーションによる配列決定
に関連する技術のバリエーションは以下の文献に記載されており、これらのすべ
てを、引用することにより本明細書に組み入れることとする：１９９３年４月１
３日発行の、Drmanacら、米国特許第５，２０２，２３１号（引用することによ
り本明細書に組み入れることとする）、１９９６年６月１１日発行の、Drmanac
ら、米国特許第５，５２５，４６４号（引用することにより本明細書に組み入
れることとする）、Drmanac、ＰＣＴ特許出願第ＷＯ９５／０９２４８号（引用
することにより本明細書に組み入れることとする）、Drmanacら、Genomics, 4,
114-128 (1989)、Drmanacら、Proceedings of the First Int'l. Conf. Electro
phoresis Supercomputing Human Genome Cantorら編、World Scientific Pub. C
o., Singapore, 47-59 (1991)、Drmanacら、Science, 260, 1649-1652 (1993)、
Lehrachら、Genome Analysis: Genetic and Physical Mapping, 1, 39-81 (1990
), Cold Spring Harbor Laboratory Press、Drmanacら、Nucl. Acids Res., 469
1 (1986)、Stevanovicら、Gene, 79, 139 (1989)、Panuskuら、Mol. Biol. Evol
., 1, 607 (1990)、Nizeticら、Nucl. Acids Res., 19, 182 (1991); Drmanacら
、J. Biomol. Struct. Dyn., 5, 1085 (1991)、Hoheiselら、Mol. Gen., 4, 125
-132 (1991)、Strezoskaら、Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 88, 10089 (1991
)、Drmanacら、Nucl. Acids Res., 19, 5839 (1991)、およびDrmanacら、Int. J
. Genome Res., 1, 59-79 (1992)。

【００４１】旧来のＳＢＨのアプローチ法では、複数のハイブリダイゼーション事象の効率
的な並行スコアリングのために、ラベルされたプローブにハイブリダイズされる
標的試料のアレイを使用する（フォーマット１）か、またはラベルされた標的試
料にハイブリダイズするプローブのアレイを使用する（フォーマット２）かであ
る。一つのアプローチ法では、読み取りまたは検出工程における並行ハイブリダ
イゼーション反応を分離するために役立つビーズの形状にて、固体支持体へ標的
試料またはプローブのいずれかが付着せしめられる。ビーズまたは他のマーカー
を、プローブを同定するためのタグとして使用することができる。プローブがタ
グ付けされていない場合にあっても、質量分析法の技術を使用して、プローブ種
をそれらの質量に基づいて分別することもできる。

【００４２】フォーマット１、２および３のＳＢＨ法は、以下にさらに詳細に説明する。加
えて、１９９９年１月６日出願の「プローブの情報的プールを用いたハイブリダ
イゼーションによる強化された配列決定（Enhanced Sequencing by Hybridizati
on Using Informative Pools of Probes）」という名称の米国仮出願連続番号第
６０／１１５，２８４号と、これに関連する共有で係属中の、２０００年１月６
日に出願された米国出願連続番号第０９／４７９，６０８号（双方とも、引用す
ることにより本明細書に組み入れることとする）に記載されたとおり、情報の損
失を最小限に抑えて情報的プールの形でプローブのセットをスコアリングするこ
とができる。他のタイプのプールを使用してもよい。

【００４３】加うるに、読み取り工程において区別することができないプローブのプーリン
グが可能であり、そして特有のタグを有するプローブを同じハイブリダイゼーシ
ョン反応において多重化することができる。例えば、読み取り工程の際にそれら
の配列のみに基づいて区別することが困難なプローブが情報的プールに類別され
、プローブのいずれか１つが検出されればプール全体が陽性としてスコアリング
される。他の例として、プローブをグループ分けして以下のようにタグ付けする
ことができる。読み取り工程の際にそれらの配列のみに基づいて区別することが
困難なプローブをグループに入れて、グループ内の各々の別異のプローブ分子（
すなわち、その情報領域内で異なる）を当該グループ内で特有な識別タグに付着
させるが、そのタグが異なるグループにて繰り返されてもよい。あるいは、配列
のみに基づいて区別することが容易なプローブをグループに入れることができ、
そしてそのグループ内の各々の別異のプローブ分子が、グループに共通のタグに
付着せしめられる。こうして、非常に類似しているらしい配列を有するタグはそ
れらの異なる識別タグに基づいて区別されるとよく、一方非常に異なるらしい配
列を有するプローブは同じ識別タグを共有しえ、配列のみに基づいて区別される
とよい。このようにして、複数のグループを一緒に組み合わせることができ、そ
れでもなお別異のプローブ分子が互いに区別されることを許容するのである。別
の実施態様において、非常に異なるらしい配列を有するプローブは、まったくタ
グ付けまたはラベルされる必要がなく、配列に基づいて分別される。

【００４４】プローブは別々の反応にてまたはin situで個々に合成することができ、ある
いは、より短いプローブのずっと小さな２のセットの組み合わせを、より長いプ
ローブのずっと大きいセットをスコアリングするために使用するとよい（１０２
４の５マー×１０２４の５マー＝１，０４８，５７６の１０マー）。

【００４５】ＳＢＨを用いて分析または読み取ることができる標的配列の長さ（「読み取り
長さ」）は、プローブの長さと、さらなる情報の利用可能性に依存しうる。例え
ば、既知遺伝子は個体における多型または変異を検出するために配列決定され、
かかる既知の参考配列が、配列分析の助けとなるはずである。ハイブリダイゼー
ション情報がさらなる情報なしに単独で使用される場合、１０マーのプローブに
対する読み取り長さは約８００塩基である。読み取り長さはおおよそ、プローブ
長がさらに１塩基伸長するごとに倍加する（例えば、１１マーのプローブに対す
る読み取り長さは約１６００塩基である）。

【００４６】プローブの長さが増加するにつれ、配列情報を作製するために必要なプローブ
の数も増加する。プローブの長さが各々１塩基増加する（読み取り長さに２倍の
増加をもたらす）と、長さｋのプローブの完全なセットは４^kプローブを含むの
で、必要とされるプローブの数が４倍増加する必要がある。例えば、１００塩基
のＤＮＡの配列決定には１６，３８４の７マーを必要とし、２００塩基の配列決
定には６５，５３６の８マーを必要とし、４００塩基では２６２，１４４の９マ
ー、８００塩基では１，０４８，５７６の１０マー、１６００塩基では４，１９
４，３０４の１１マー、３２００塩基では１６，７７７，２１６の１２マー、６
４００塩基では６７，１０８，８６４の１３マー、そして１２，８００塩基では
２６８，４３５，４５６の１４マーを必要とする。

【００４７】原則的には、極めて多数の充分に長いプローブが使用されるのであれば、ＳＢ
Ｈ法で単一のハイブリダイゼーション反応にてヒトゲノム全体を読み取ることが
できる。これまでに使用可能な、アレイをベースとするか、または支持体をベー
スとするハイブリダイゼーションを包含する方法は、しかしながら、単一アレイ
に付着させることができるプローブの数によって、または一度に使用しうる支持
体の数によって限定されていた。本発明により、極めて多数のプローブを単一の
溶液をベースとした反応にてハイブリダイズさせることが許容される。

【００４８】本発明によれば、非常に多数の異なるプローブからなるオリゴヌクレオチドプ
ローブのセットを、溶液にて、未知の標的ポリヌクレオチドまたは未知の標的ポ
リヌクレオチドの混合物にハイブリダイズさせることが許容される。標的ポリヌ
クレオチドにハイブリダイズするプローブのサブセットが、次いで陰性のプロー
ブから選択されて、個々のオリゴヌクレオチド分子を検出および分別する読み取
り機によって分析される。いずれかの所定の標的配列に対しては、ほとんどのプ
ローブが陰性となるであろう。例えば、２００塩基対の標的核酸を６５，５３６
の８マーを用いて配列決定する場合、わずか約２００のプローブが、陽性として
スコアリングされるだけであろう（単鎖ポリヌクレオチドについて、あるいは二
本鎖ポリヌクレオチドについては４００のプローブが陽性としてスコアリングさ
れるであろう）。このように、検出されねばならない陽性のプローブサブセット
の実際のプローブ数は、元のプローブのセットに比べて比較的少ないのである。

【００４９】本発明によって提供される利点は、１）プローブのプールの調製の簡素化と極
めて多数のプローブの並行したスコアリング、２）溶液における効率的なハイブ
リダイゼーションおよび酵素反応動態、３）ａ）ＰＣＲまたは他の増幅反応なし
のＤＮＡ分析、ｂ）ストリンジェントなハイブリダイゼーションと酵素的または
化学的にミスマッチを排除することによる高い精度、ｃ）プローブが従来のよう
にラベルされると妨げとなるかもしれないバックグラウンドなく（特に情報的プ
ールが使用された場合）非常に多数のプローブのスコアリングを許容する単一分
子での感度である。

【００５０】本発明によって提供される方法には、以下の工程を含む方法すなわち、（ａ）
標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数のプローブ［各プローブ
は情報領域を含む］の混合物に、プローブの情報領域で完全に相補的なプローブ
：標的ハイブリッドと、プローブの情報領域でミスマッチがあるプローブ：標的
ハイブリッドとを分別する条件下（すなわち、情報領域にミスマッチがあるプロ
ーブ分子とよりも平均して多くの、プローブの情報領域内で標的核酸に完全に相
補的なプローブ分子との、プローブ：標的ハイブリダイゼーションを生じさせる
条件下）に接触させ、［この際任意に、標的核酸もプローブ分子も固体支持体に
付着されていない］、（ｂ）標的核酸とハイブリダイズするプローブのサブセッ
トを検出し、プローブの陽性サブセットを分出する工程を任意に包含し、および
（ｃ）例えば、検出されたプローブの重複配列を編集することにより、またはプ
ローブの検出されたサブセットを別の方法で分析することによって、工程（ｂ）
にて検出されるプローブの２またはそれ以上から標的核酸の配列を決定する、方
法が包含される。

【００５１】例えば、標的核酸の配列は、検出されたプローブの「サイン」セットを（そし
て任意に、このプローブセットの配列のいくつかまたはすべてを重ね合わせて集
めることにより）、別の標的核酸に対する検出されたプローブの「サイン」セッ
トのものと比較することによって決定されてよい。種々のアルゴリズムおよびそ
の他の方法が、検出工程から得られたデータを分析するために、当該技術分野で
知られている。例えば、１９９８年７月２３日に公開された国際公開第ＷＯ９
８／３１８３６号（特に、ＷＯ９８／３１８３６の実施例１１乃至１７および
２８乃至２９）ならびに１９９９年２月２８日に公開されたＷＯ９９／０９２
１７（双方とも引用することにより本明細書に組み入れることとする）を参照さ
れたい。プール法が使用される場合のデータ分析を含めた、ＳＢＨにおけるデー
タ分析のためのさらなる方法、ならびに重複するプローブ配列と、「陽性」また
は「陰性」スコアの割当を包む必要がないスコア（連続スコアリング法、再スコ
アリング法、および最高尤度決定法を含む）の統計分析は、１９９９年１月６日
に出願された米国仮出願連続番号第６０／１１５，２８４号、ならびにこれに関
連する共有で係属中の、２０００年１月６日に出願された米国出願連続番号第０
９／４７９，６０８号（双方とも、引用することにより本明細書に組み入れるこ
ととする）に記載されている。

【００５２】工程（ａ）において使用される複数のプローブは、極めて多数の、例えば約１
０⁴、１０⁵、１０⁶、１０⁷、１０⁸、１０⁹、または１０¹⁰のプローブであってよ
い。プローブ分子の混合物は少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少な
くとも１０、少なくとも少なくとも１６、少なくとも３２またはそれ以上のプロ
ーブ分子（各々が、異なる情報領域を有する）を含む。工程（ａ）において、標
的核酸またはプローブのいずれかを、固体支持体に付着させてよいが、工程（ａ
）は好ましくは標的核酸およびすべてのプローブが溶液状態にある場合に（すな
わち、膜またはアレイまたはビーズなどの固定化支持体に付着されずに）行われ
る。プローブは任意に、下記のごとき識別タグまたはセパレータ・タグに付着さ
れる。

【００５３】工程（ｂ）において陽性プローブ（核酸とハイブリダイズするプローブ）は、
ハイブリダイゼーション反応溶液中に残っているうちに検出すればよく、または
陽性プローブを最初に陰性プローブから選出または分出してもよく、これは、会
合されたセパレータ・タグ（１または複数）の使用することにより識別の前に任
意に行ってよい。「陽性プローブの選択」という表題を付けた以下のセクション
に、さらなる詳細を述べる。

【００５４】陽性プローブは、それらのヌクレオチド配列を直接読むことによって、または
単一プローブに会合している特有の識別タグ（複合識別タグを形成しているユニ
ットタグのストリングであってもよい）もしくはプローブの情報的プールに会合
している識別タグを検出することによって間接的に識別されうる。「陽性プロー
ブを検出するために使用される読み取り機」という表題を付けた以下のセクショ
ンに、単一プローブ分子検出をすることができる好適な読み取り機についてのさ
らなる詳細を述べる。

【００５５】好ましい実施態様において、プローブはＤＮＡまたは他のバーコードでラベル
され、そして情報的プールにグループ分けされる。陽性プローブは陰性プローブ
から選択されて、ナノポアチャンネルを含む読み取り機を用いて陽性プローブが
検出される。

【００５６】標的ポリヌクレオチド「標的核酸」または「標的ポリヌクレオチド」は、典型的にはＳＢＨアッセイ
にて配列決定される核酸である、興味の対象たる核酸をいう。潜在的な標的ポリ
ヌクレオチドには、ＤＮＡ演算の一部として使用される核酸を含め、天然に発生
しているかまたは人工的に作出されたＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡおよびｃＤ
ＮＡ）ならびにＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）が包含される。標的核酸は、リボヌ
クレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの混合物から構成されうる
。典型的には、標的核酸はＤＮＡである。標的核酸は二本鎖であることができる
が、好ましくは一本鎖である。標的核酸の「読み取り長さ」は、プローブの長さ
によっていかなるヌクレオチド数であってもよいが、典型的にはおよそ１００、
２００、４００、８００、１６００、３２００、６４００、またはさらにそれ以
上の長さ程度であり、全ヒトゲノムの長さを上限とする。

【００５７】標的核酸は、事実上いかなる供給源からも得ることができ、当該技術分野で知
られた方法を用いて調製することができる。例えば、標的核酸はＰＣＲ法によっ
て、またはプラスミドへとクローニングすることによって（５００から５，００
０塩基対の長さの好都合な標的核酸断片に対して）、または酵母もしくは細菌の
染色体へとクローニングすることによって（１００ｋｂまでの長さの好都合な標
的核酸断片に対して）単離することができる。

【００５８】ＳＢＨアッセイにおいて使用するために望ましい長さによっては、標的核酸は
ＳＢＨアッセイでの使用に先駆けて断片に剪断されてもよい。断片化は、非特異
的エンドヌクレアーゼ消化、制限酵素消化（例えばＣｖｉＪＩによる）、物理
的剪断（例えば超音波による）またはＮａＯＨ処理によって成し遂げることがで
きる。望ましい断片長を得るために、断片をサイズによって分離する（例えばゲ
ル電気泳動による）とよい。標的核酸の断片化によって、試料中の二次構造から
生じるハイブリダイゼーションへの妨害も回避されるかもしれない。ハイブリダ
イゼーション反応において使用される標的核酸断片のサイズは最適に、プローブ
長よりもわずかに長い長さから、プローブ長の２倍までの長さ（例えば１０〜１
００または１０〜４０塩基）の範囲とされる。

【００５９】プローブ「プローブ」は、好ましくはＤＮＡである、核酸の比較的短い断片をいう。プ
ローブは好ましくは、少なくとも１塩基だけ標的ＤＮＡより短く、より好ましく
は２５塩基またはそれ未満の長さであり、より好ましくは２０塩基またはそれ未
満の長さである。当然ながら、プローブの至適な長さは、分析される標的核酸の
長さに依存するものである。約１００またはそれ未満の塩基で構成される標的核
酸に対してはプローブは少なくとも７マーであり、約１００〜２００塩基の標的
に対してはプローブは少なくとも８マーであり、約２００〜４００塩基の標的
核酸に対しては、プローブは少なくとも９マーであり、約４００〜８００塩基の
標的核酸に対しては、プローブは少なくとも１０マーであり、約８００〜１６０
０塩基の標的核酸に対しては、プローブは少なくとも１１マーであり、約１６０
０〜３２００塩基の標的に対しては、プローブは少なくとも１２マーであり、約
３２００〜６４００の標的に対しては、プローブは少なくとも１３マーであり
、そして約６４００〜１２，８００の標的に対しては、プローブは少なくとも１
４マーである。標的核酸の長さがさらに２倍増加するごとに、至適なプローブ長
はさらに１塩基長くなる。当業者であれば、フォーマット３のＳＢＨ適用に対し
ては前記のように線引きしたプローブ長は連結後のものであることを理解するで
あろう。このように、全体として使用する場合に、特定のプローブ長は、フォー
マット１および２様ＳＢＨ適用に対しての実際のプローブの長さをいい、そして
フォーマット３またはフォーマット３様ＳＢＨ適用に対しての連結されたプロー
ブの長さをいう。プローブは通常は一本鎖であるが、適用によっては二本鎖プロ
ーブを用いてもよい。

【００６０】プローブは当該技術分野で知られている標準の化学的手法を使用して調製され
るとよい。前記したプローブの長さ「Ｋ」は、プローブの情報の含量（すなわち
、情報領域または情報的領域）の長さを称し、必ずしもプローブの事実上の物理
的な長さを称するのではない。ＳＢＨに使用されるプローブは、ハイブリダイゼ
ーションの助けになるがプローブの情報含量には寄与しない縮重端部［例えば端
部における１〜３の非特定（Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの混合）塩基または普遍的（例
えばＭ塩基もしくはイノシン）塩基］を含むことが多い。これらの縮重プローブ
混合物におけるミスマッチのハイブリダイゼーション分別は、情報含量の長さの
みを称し、全体の物理的な長さを称するものではない。例えば、ＳＢＨ適用では
ＮｘＢｙＮｚ（Ｎは４つの塩基のいずれかを表し、そして所定混合物中のポリヌ
クレオチドに対して変化し、Ｂは４つの塩基のいずれかを表すが所定混合物中の
ポリヌクレオチドの各々について同じであり、そしてｘ、ｙおよびｚはすべて整
数である）を使用することが多い。この式において、ＮｘおよびＮｚはプローブ
の縮重端部を表し、そしてＢｙはプローブの情報含量（例えば、旧来のＳＢＨに
おいて独自に整列化されたプローブ）を表す。

【００６１】本発明によれば、単一の情報領域は、正確に同じ配列を有する複数のプローブ
分子のみならず、情報領域の外の配列（例えば縮重端部にて異なる複数のプロー
ブ分子によっても表されうる。

【００６２】プローブは単に、天然に発生しているヌクレオチドと本来のホスホジエステル
基本骨格からなっているものでもよいし、またはプローブは検出の特異性を増強
するために修飾またはタグ付けしてもよい。例えば、プローブは７−デアザグア
ノシンなどの１またはそれ以上の修飾された塩基、またはホスホロチオエートな
どの１またはそれ以上の修飾された基本骨格鎖交（interlinkage）で構成される
ものでもよい。唯一の要件は、プローブが標的核酸にハイブリダイズできること
である。本発明の関連して使用することができる多種多様な塩基および基本骨格
鎖交が知られており、当業者にとって明らかなものであろう。例えば、旧来のヌ
クレオチドの約２倍のサイズである修飾された塩基が当該技術分野で知られてい
る。各塩基位置でのユニット（複数）のサイズを増加または減少させる修飾によ
って、各塩基位置でのユニット（単数）を分別するいくつかの読み取り機の能力
をが向上することが期待される。

【００６３】他の変更には、特異性または効率を増大するオリゴヌクレオチドの使用、ハイ
ブリダイゼーションシグナルを高めるための循環式（cycling）ハイブリダイゼ
ーション、例えば、ラベルされたプローブの第１セットに対して至適に選択され
た条件（例えば温度）下でのハイブリダイゼーションサイクル、その後ラベルさ
れたプローブの第２のセットに対して至適に選択された条件下のでハイブリダイ
ゼーションを実施することによるものである。４つのヌクレオチド塩基Ａ、Ｔ、
ＣおよびＧの各々で終結するプローブの混合物（好ましくは等モル量の混合物）
を使用することによって、読み取り枠のシフトを調べることができる。「陽性プ
ローブの選択」という表題を付けたセクションにて後述するとおり、オリゴヌク
レオチドプローブは、検出または分別を強化するために好ましくは識別タグでタ
グ付けされており、そして選択を助けるためにセパレータ・タグで任意にタグ付
けされている。一の実施態様において、情報領域内で別異の配列を有する各プロ
ーブが特有の識別タグでタグ付けされることができるように、そして読み取り／
検出工程の際にこれらの識別タグを用いて陽性プローブが識別できるように、充
分な識別タグが使用される。あるいは、プローブの情報的プールが使用される場
合、各情報的プールに含まれるすべてのプローブが、当該情報的プールに特有の
同じ識別タグであるが他の情報的プールとは異なるものでタグ付けされる。

【００６４】好適な識別タグの例には、ナノビーズ、ナノ粒子、ポリマーまたは分子が包含
され、これらは異なるサイズ、形状、電気特性（例えば導電率）、磁気特性、光
学特性（乳白度）、化学特性または他の特性の、読み取り機の適切なタイプと適
合するものを有しているとよい。適切な読み取り機は、「陽性プローブを検出す
るために使用される読み取り機」という表題を付けたセクションにて後述する。
好ましくは、識別タグは多重化することができ、すなわち、特有の複合識別タグ
の調製を許容するように、それらの特性を変更すること（バーコードでの使用に
よるものを含む）ができる。

【００６５】ナノ粒子は、本発明の方法によって検出することができるいかなるサイズであ
ることもできるが、好ましくは約５００ｎｍ未満、より好ましくは約１から約１
００ｎｍ、そして最も好ましくは約２から約２０ｎｍの範囲にある。一例となる
実施態様において、ナノ粒子は炭素単一壁ナノチューブまたは多壁ナノチューブ
の断片であることができる。

【００６６】ナノチューブは、単一壁ナノチューブについては１〜２ｎｍ、そして多壁ナノ
チューブについては２〜２５ｎｍの間の異なる直径を有してよい。ナノチューブ
はまた、異なる長さに切断されてもよい。これによって、交互の直径を有するエ
レメントを備えたバーコードを製造するためによいシステムが提供される。例え
ば、９のエレメントからでは、異なる３種の直径Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３のナノチュー
ブで、各々のタイプは３の異なる長さ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に切断される。各エ
レメントは、ＤＮＡ合成に類似のプロセスでのカップリングを許容するようにブ
ロックまたは脱ブロックされうるリンカーを用いて両端で修飾されてもよい。Ｎ
のエレメントを含む鎖における、異なる直径のエレメントのカップリングに、多
くの異なる交互の順序がある。例えば、４のエレメントの鎖に対しては、順序と
して、Ｄ１−Ｄ２−Ｄｌ−Ｄ２−プローブまたはＤ２−Ｄ１−Ｄ２−Ｄ１−プ
ローブ、Ｄ１−Ｄ３−Ｄ１−Ｄ３−プローブ、Ｄ２−Ｄ３−Ｄ２−Ｄ３−プロー
ブＤ１−Ｄ２−Ｄ３−Ｄ１、およびその他多くの３ｘ２ｅｘｐ３が包含され、そ
れぞれの順序について、３ｅｘｐ４の異なるバーコードを製造することができる
。

【００６７】単一分子検出をすることができるラベルの一例となる実施態様は、Schultzら
、Proc. Nat'l Acad. Sci., 97:996-1001 (2000)（引用することにより、本明細
書に組み入れることとする）に記載のように、光学的リポーターとしてプラスモ
ン−共鳴粒子（ＰＲＰ）を使用することである。ＰＲＰは、典型的には４０〜１
００ｎｍの直径を有する金属ナノ粒子であり、金属の導電電子の集合共鳴（すな
わち、表面プラスモン共鳴）のために、顕著な効率で弾性的に光を散乱するもの
である。ナノ粒子に関わるプラスモン共鳴の振幅（magnitude）、ピーク波長、
およびスペクトル帯域幅は、粒子サイズ、形状、および材料組成、さらには局所
環境に依存する。調製の際にこれらのパラメータの影響を与えることにより、ス
ペクトルの可視領域の何処かに散乱ピークを有するＰＲＰを形成することができ
る。状のＰＲＰの場合には、ピーク散乱波長および散乱効率の双方が、半径が大
きくなるほどに増大し、これにより異なる色のラベルを製造するための手段が提
供される。例えば、調製の際に球の最終半径を調整することによって、ピーク散
乱波長が標的波長の数ナノメータ内にある銀球の集団を再現性をもって調製する
ことができる。ＰＲＰはナノのサイズでもかなり明るいので、単一分子での検出
のための指標となることができ、すなわち視野の中の結合したＰＲＰの存在が単
一の結合事象を示唆することができるのである。

【００６８】一連の連続的または非連続的ユニットタグを一緒に連結して、「バーコード」
例えば「分子バーコード」または「ナノ粒子バーコード」を形成することができ
る。別異の分子または粒子のセットを、様々な組み合わせにて連結または架橋し
たとしてもかまわず、例えば８のまったく別異の分子の組み合わせで、５１２の
３エレメントの鎖、または３２，７６８の５エレメントの鎖を形成することがで
きる。しかしながら、バーコードは好ましくは分岐を含まない鎖である。

【００６９】バーコードの組み合わせは、複合ユニットタグを各々含む様々な長さのエレメ
ントへと、ユニットタグをさらにグループ分けすることによって作製することも
できる。一の態様において本発明は、様々な検出可能特性のエレメントの交互配
置を含む、バーコードタグを提供する。バーコードは好ましくは、連続的エレメ
ントが同じ検出特性を有しないように調製される。別の態様において、バーコー
ドタグは様々な検出可能特性の複合ユニットタグを含むエレメントを包含しえ、
そしてエレメントもまた様々の長さとされうる。例えば、小（Ｓ）および大（Ｌ
）ユニットタグを用いるバイナリーコードでは、ユニットタグは（２ユニットタ
グの）短いエレメントおよび（４ユニットタグの）長いエレメントへ以下のとお
りにグループ分けすることができる。ＳＳ小短エレメントＳＳＳＳ小長エレメントＬＬ大短エレメントＬＬＬＬ大長エレメント２×２⁴の組み合わせを形成するようにこれらのエレメントを用いたバイナリー
コードは、８から１６のユニットタグの長さで変動するはずであり、以下のよう
に出現するかもしれない。ＳＳ−ＬＬ−ＳＳＳＳ−ＬＬＬＬ−ＳＳＳＳ−ＬＬ−ＳＳＳＳ−ＬＬ−ＳＳ−ＬＬＬＬＬＬ−ＳＳＳＳ−ＬＬＬＬ−ＳＳＳＳ異なるタイプの３のユニットタグと、異なる長さの３のエレメントが使用され
れば、３×２^n-1×３ⁿ（ｎはバーコードのエレメントの数である）の組み合わせ
がある。この「交互」バーコードアプローチの利点は、バーコードを作り上げる
エレメントを加えるために必要な工程が少なくてすむために、プローブおよびバ
ーコードの組み合わせ合成が簡素化されることである。

【００７０】好ましい識別タグは、プローブの一端または両端に存在することができる「Ｄ
ＮＡバーコード」である。例えば、バイナリーデジタルバーコードは、「１」を
表すイノシンなどの中性塩基と、「０」を表す塩基の非存在（すなわち、ホスホ
ジエステル基本骨格単独）とを用いることによって形成することができる。この
バイナリーシステムによって可能ならしめられる別異の識別タグの数は、２^N（
Ｎはバーコードにおける桁（digit）の数である）である。あるいは、ＤＮＡバ
ーコードは、各々の位置で複数のシグナルをもたらすべく人工的な塩基が使用さ
れる場合、バイナリーシステムに限定されることはない。例えば、基の数を低減
させた小さな修飾塩基を用いて「１」を示すことができ、そして、イノシンまた
はさらなる基を持つイノシンなどのより大きい塩基が「２」を示すことができ、
これによって各々の位置で３のオプションが提供されるのである。分子が読み取
り機によって区別されうる限りにおいて、異なるサイズの分子を使用することに
よって各塩基の位置における４またはそれ以上のオプションを提供することがで
きる。例えば、従来のヌクレオチドのサイズの約２倍である修飾塩基が当該技術
分野で知られている。各塩基の位置でのユニットのサイズを増加または低減する
修飾は、各々の塩基の位置でユニットを分別するいくつかの読み取り機の能力を
向上させることが期待される。ＤＮＡバーコードを用いる利点は、より簡易なプ
ローブの合成と検出、ならびに得られる情報のより簡易な処理にある。

【００７１】同様に、「分子バーコード」における組み合わせは、異なるサイズ、形状、電
気特性、磁気特性または互いに分別されることができる他の特性の分子（ヌクレ
オチド以外）を連続的に繋げることによって可能ならしめられる。プローブ分子
の分子バーコードの一端は、任意にオリゴヌクレオチドプローブ分子の方向を示
す共通のタグ（すなわち、方向マーカー）を有している。

【００７２】識別タグでプローブの両端をタグ付けすることによって、読み取りの際のプロ
ーブの５’／３’方向を識別することが許容されうる。加えて、フォーマット３
様の方法において、短い方のプローブの小さい方の２のセットの組み合わせが使
用される場合（これは（より短い２のプローブを一緒に繋げることによって）長
い方のプローブのもっと大きい方の１のセットを使用することと同等である）、
さらに有用なタグの組み合わせが作製される（すなわち、新しい「二重」タグが
作製される）。

【００７３】ビットに基づく、あるいは「バーコード」ラベリングシステムによって、数千
のオリゴヌクレオチドの特異的ラベリングを提供することができる。ビーズまた
は「バーコード」は、磁気、光学または現在使用されているＣＤまたはディスク
ドライブメディアに酷似した導電タイプのメディアで製造できる。これらのミク
ロバーコードは、１０〜５０ｎｍ辺りから２００ｎｍを超えないまでの長さの円
柱として合成されよう。製造プロセス、スパッタリングには、半導体産業に共通
の技術が使用されよう。スパッタリングプロセスは、表面上にほぼ如何なる物質
の層でも、非常に精確な制御された厚みにて堆積させるのに利用することができ
る。異なる２種の物質の交互の層を作製してバーコードを作出し、その後円柱に
切断することができる。これらの物質の層は、区別することが可能なタイプ、す
なわち光学的検出の場合は透明と不透明、または導電性による検出の場合は導電
性と絶縁性などといったものとされよう。

【００７４】ある条件下では、単一分子のレベルで、蛍光色素が検出されることも可能であ
る。複数の蛍光色素が現在あって、フローサイトメトリーで一般的に使用されて
いる。これらの蛍光マーカーを、ビーズの樹脂に共有結合させて、区別可能なビ
ーズラベルを作製することができる。

【００７５】複数の蛍光分子充填剤、異なる材料、表面組織（texture）、表面パターン等
を有するミクロスフェアを、識別タグとして使用することができる。プローブは
、オリゴヌクレオチド合成の際にオリゴヌクレオチドプローブに共有結合せしめ
られよう。蛍光物質を充填したミクロスフェアは、現在のところMolecular Prob
es, Inc.およびその他の会社より入手可能である。２０ｎｍの直径程度に小さい
ポリスチレンビーズのミクロスフェアが、現在のところ入手可能である。

【００７６】スペクトル吸収も使用されうる。検出のための可能な方法論は、異なるスペク
トルの光を吸収および通過させる、異なる物質をビーズポリマーに混合すること
とされよう。ビーズの異なる各タイプは、ビーズに多スペクトルの光を通してど
のスペクトルが吸収されるかを検出することによって検出されることができる。

【００７７】所定の長さの可能なプローブすべての完全なセット（４^N（Ｎは長さである）
）またはこの完全なセットのサブセットが、ハイブリダイゼーション工程におい
て使用されうる。多数のプローブが少数の反応にて合成されうる。例えば、可能
なすべての１０マーの完全なセット（約１００万のプローブ）が、以下のとおり
に合成されうる。１０００の５マー（各々、１０桁のＤＮＡバーコードに特有に
会合される）は、１０００の反応で合成されて混合される。混合物は１０００の
アリコートに分けられ、次いでこれらにつき１０００の反応を行い、その際にプ
ローブの情報の長さがさらに５ヌクレオチドだけ伸長され、そして１０桁のバー
コードがさらに１０桁だけ伸長されて、わずか２０００のみの反応にて特有にタ
グ付けされた１００万の１０マーが形成される。

【００７８】少数の反応にてオリゴヌクレオチドの混合物を作るために、そして各々異なる
配列を特有のタグでタグ付けされるようにするために、塩基およびタグユニット
の組み合わせ付加を実施しなければならない。すべての６マー（４０９６）を６
×４の反応にて製造する例を挙げる。最初のセットの４の反応で、異なる４の識
別タグが、４のヌクレオチドの各々に対してカップリングされる。これらのユニ
ットタグは、異なる４のモノマーか、または、例えばこれら４の反応にて２のセ
ットで予製または合成される異なる２のモノマーの４のダイマーであってよい。
４の反応からの産物は混合され、そして４の反応の第２のセットでおよそ等モル
となるように分割される。これらの反応の各々において、ヌクレオチドの１つが
カップリングされてダイマーを形成し、そしてタグの特有なユニットがタグの前
のユニットに連結される。４の反応の１つにおける結果は、Ｔ１−Ｔ１−Ａ−Ａ
、Ｔ１−Ｔ２−Ｃ−Ａ、Ｔ１−Ｔ３−Ｇ−ＡおよびＴ１−Ｔ４−Ｔ−Ａ（各々異
なるタグＴは特有なものであるか、または特有のオリゴマー、例えばＴ１＝ｔ
１−ｔ１、Ｔ２＝ｔ１−ｔ２、Ｔ３＝ｔ１−ｔ３，Ｔ４＝ｔ１−ｔ４を表しう
る）として表れる。

【００７９】複数分子の検出を要するプローブの従来のラベリングは本発明において必要と
されないが、所望とあらばオリゴヌクレオチドを蛍光色素、化学発光系、放射活
性標識（例えば、³⁵Ｓ、³Ｈ，³²Ｐまたは³³Ｐ）または質量分析法によって検出
される同位体で、当該技術分野で知られている種々の方法のいずれかによってラ
ベルしてもよい。

【００８０】ハイブリダイゼーション反応それぞれの溶液に基づいたハイブリダイゼーション反応に用いるプローブの数
および種類は、読み取り機の検出／ラベル解析能力、読み取り機に識別されない
異なる配列を持つプローブに対する有益なプール（またはその他のプール）の統
計、およびＳＢＨ適用（例えば、de novo配列決定、再配列決定、または遺伝子
型決定が望ましいかどうか）に依存する。同じ長さのすべての可能性のあるプロ
ーブ配列の完全なセットを使用してよく、またはその完全なセットのほんの一部
分を用いることができる。あるいは、異なる長さのプローブを用いてよい。必要
なのは、いくつかの（必ずしもすべてでなくてよい）プローブ分子の情報領域の
配列間に重複部分が存在することだけである。

【００８１】本発明によれば、単に統計的因子は、読み取り機は標的核酸にハイブリダイズ
した５〜１０のプローブを検出すべきであることが示唆されている。ハイブリダ
イズできる利用可能なプローブ分子のほんのある画分だけが標的核酸に実際にハ
イブリダイズするという事実、読み取り機が標的核酸にハイブリダイズするプロ
ーブ分子すべてを読まないという事実、また生成末端の使用などの他の付加的な
因子を考慮すると、理論的にはそれぞれの情報領域配列は、約５０００またはそ
れ以下、または約１０³またはそれ以下、または約５００またはそれ以下、また
は約１０²またはそれ以下で十分であるが、約１０⁴またはそれ以下、または１０ ⁵ またはそれ以下のプローブ分子により示される。

【００８２】陽性プローブが選択または検出される前に、不適当な組み合わせの標的：プロ
ーブハイブリッドを除去するために当業者に公知の手法、例えば、ミスマッチの
ハイブリダイゼーション領域に特異的な酵素またはミスマッチのハイブリッドを
分解する化学物質を用いることができる。

【００８３】ハイブリダイゼーションの条件ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、本質的に完全にマッチしたハイブ
リッド（7つの部位中6つでハイブリダイズした断片およびプローブなど）を検出
するようにに選択してよく、またはさらに厳密な条件を用いて、完全にマッチし
たハイブリッドのみを検出するように選択できる。

【００８４】以下の発明による例証的な条件は、概して、情報領域に結合しないプローブ分
子を用いるよりも、プローブ分子の情報領域中の標的核酸に完全に相補的なプロ
ーブ分子を用いたプローブ：標的ハイブリダイゼーションをさらに産出する条件
を含む。そのような条件では、標的に完全に相補的でないプローブから標的に完
全に相補的なプローブを識別することができる。

【００８５】好適なハイブリダイゼーション条件は、最適な手順または予備研究により慣例
的に決定することができる。そのような手順および研究は、研究室において用い
るプロトコールを確立すために、当業者により慣例的に実施された。例えば、す
べてが参考文献として本明細書に組み込まれる、Ausubelら、Current Protocols
in Molecular Biology,Vol.1~2,Jhon Wiley & Sons（1989）；Sambrok et al.
,Molecular Cloning A Laboratory Manual,2nd Ed.,Vols.1~3,Cold Spring Har
borPress（1989）；およびManiatisら、Molecular Cloning：A Laboratory Manu
al,Cold Spring Habor Laboratory Cold Spring Harbar,New York（1982）を参
照のこと。これらはすべて参考として本明細に組み込まれている。例えば、温度
、成分の濃度、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の時間、緩衝液の組成および
ｐＨ、イオン強度といった条件は、変えてよい。どちらも参考文献により本明細
書に組み込まれる、１９９８年７月２３日発行の国際特許明細書番号第ＷＯ９
８／３１８３６号および１９９９年２月２８日発行の第ＷＯ９９／０９２１
７号も参照のこと。

【００８６】陽性プローブの選択陽性プローブのサブセット、すなわち、ハイブリダイゼーション反応工程の間
に標的ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブは、種々の異なる方法で
プローブの初期プールから選択、またはさらに分離してよい。例えば、標的核酸
にハイブリダイズした二本鎖のプローブ：標的ハイブリッドは、一本鎖の核酸ま
たはミスマッチのハイブリダイズした核酸を認識する酵素を用いた、一本鎖の核
酸またはミスマッチプローブの酵素的分解により一本鎖の陰性プローブから選択
できる（一本鎖の核酸がすべて分解されれば、残りの核酸は陽性プローブである
）。本技術分野で公知の好適なエキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼは
どれでも用いることができる。例証的な酵素として、ヤエナリヌクレアーゼ、エ
キソヌクレアーゼVII、Bal3Iヌクレアーゼおよびヌクレアーゼ S1（一本鎖末端
を分解するだけでなく、小さなミスマッチの隙間を開裂させる）があげられる。
一般的に、Maniatis,Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, Cold Spring Harbor(1982)を参照のこと。

【００８７】あるいは、二本鎖のプローブ：標的ハイブリッドは、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィー、ゲル電気泳動、またはその他の勾配などの本技術分野で公知
の手順により一本鎖核酸から分離することができる。

【００８８】さらなる実施様態においては、標的核酸またはプローブは分離タグ、例えばビ
オチンまたはフルオレセインに結合させることができ、標的核酸にハイブリダイ
ズした陽性プローブを、例えばアビジンまたは抗フルオレセイン抗体で溶液から
標的核酸を分離するために分離タグを用いることにより選択することができる。
本技術分野で公知の好適な結合相手はどれも、例えば、ビオチン−ストレプトア
ビジン、抗原抗体結合相手対（ＦＬＡＧラベル抗体など）、ヒスチジンラベルニ
ッケル、カルモジュリン結合ペプチド−カルモジュリン、還元酵素−メトトレキ
セート二水素葉酸エステル、マルトース結合タンパク質−アミロース、キチン質
結合ドメイン−キチン、セルロース結合ドメイン−セルロース、およびグルタチ
オン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−グルタチオン、および本技術分野で
公知のその他の結合相手対のように、分離タグとして用いることができる。

【００８９】他の例と同様、より短いプローブの2つのセットを組み合わせて結合（連結）
させ、より長いプローブのより大きい対を刺激する、フォーマット3様型ＳＢＨ
法を用いた場合、２つのより短いプローブが、それらが標的ポリヌクレオチド上
に連続的にハイブリダイズする場合に連結する。より短いプローブ対それぞれが
共通にタグ付けされ、それぞれのセットに対して異なる共通分離タグ、例えば、
一つの対にタグＡ、別の対にタグＢを用いた場合、陽性プローブに結合した対は
タグＡとタグＢを両方持つが、連結しなかった陰性プローブは（タグＡかタグＢ
）１つのタグしか持たない。これらの分離タグによりこのように、連続した２段
階過程で陽性プローブを分離することができる。

【００９０】１つの特定の実施様態においては、ビオチンラベルした８マーのセットおよび
フルオレセインでタグ付けした９マーのセットをハイブリダイゼーション反応に
用い、標的に連続的にハイブリダイズしたプローブは、ビオチンおよびフルオレ
セイン両方でタグ付けされた陽性１７マープローブを形成する。そこで１７マー
はまず溶液を支持体結合アビジンと接触させ、続いて結合しなかったプローブお
よび標的を洗浄、除去し、ついで溶液を支持体結合抗フルオレセイン抗体と接触
させ、続いて結合しなかったプローブを洗浄、除去することにより（またはその
逆）溶液から分離することができる。

【００９１】陽性プローブを検出するために使用される読み取り機完全に相補的なプローブをミスマッチのプローブから識別することが可能な条
件下で標的核酸にハイブリダイズするプローブを検出するために種々の読み取り
機を用いることができる。本発明に有用な読み取り機の必要条件は、1）個々の
オリゴヌクレオチドプローブを分子レベルで検出し、それらを他のオリゴヌクレ
オチドプローブから識別する能力（プローブ配列自体を決定することによるか、
または1つ、2つ、またはそれ以上の、プローブに結合した識別タグを検出するこ
とによる）；2）多数（何百または何千）の異なるオリゴヌクレオチドを識別す
る能力；および3）ハイブリダイゼーション反応工程で生じるすべての陽性オリ
ゴヌクレオチドプローブを検出するのに十分な統計的サンプリングを行うことが
できる検出の速さ（1つまたは多数の統合検出チャンネルの使用）である。一方
、従来の検出法、例えば放射線同位体ラベルを用いた方法では、検出可能なシグ
ナルを得るために何百または何千の陽性プローブの存在が必要である。

【００９２】プローブ分子が識別タグを含む場合、好ましくはタグをプローブから分裂させ
ずに識別ラベルを読み取り機で検出する。さらに好ましくは、検出段階は溶液中
で実施する。最も好ましくは、多くの統合検出チャンネル／読み取り機を平行処
理により検出の速さを改善するために用いる。

【００９３】好適な読み取り機には、それぞれのプローブ分子がチャンネル中またはチャン
ネル上を通過すると結合した識別タグまたはプローブ配列自体が読まれる、とい
うナノポアチャンネルに基づいた読み取り機が含まれる。他の適切な読み取り機
には、分子レベルの顕微鏡によってで識別ラベルの識別ができる、顕微鏡画像に
基づいた読み取り機がある。本技術分野で公知の他のセンサーに基づく方法は、
上記の一般基準を満たしていれば、どれも本発明に有効である。

【００９４】好ましい読み取り機の一つは、オリゴヌクレオチド分子またはそれが結合した
タグがポア中またはポア上を通過した際のナノポアでの電気的またはその他の反
応の検出に基づく。例えば、本明細書に参考文献として組み込まれた関連発行物
である、Churchら、米国特許第５，７９５，７８２号を参照のこと。そこに記載
のように、分子は例えば、ポリメラーゼまたはその他の、ポアに連結しているか
、ポアの近くに位置している鋳型依存ポリマー複製触媒によって、または圧力勾
配または電場（すなわち、電気泳動）により、ポア上またはポア中を交差するよ
うに誘導されうる。参考文献により本明細書に組み込まれる、関連出版物 Melle
rら、Proc. Nat’l Acad. Sci., 97：1079-1084（2000）を参照のこと。

【００９５】これらのナノポアチャンネルの大きさは検出すべき分子の種類に依存し、検出
の方法に影響を与えずに変えてよく、チャンネルはプローブ分子および任意の結
合した識別タグを適応させるのに十分な大きさであるべきであり、しかしプロー
ブ分子の通過がチャンネルの電気的またはその他の反応に対して検出可能な影響
を持つのに十分な小ささであるべきである。例証的な大きさとしては、約１ｎｍ
から約１００ｎｍのポアがあり、好ましくは直径約３〜３０ｎｍである。比較す
ると、核酸の直径は一般的に約０．３ｎｍである。

【００９６】ポアの代わりに、プローブ分子またはそれらの結合した識別タグが通過する際
にそれらを読むために様々な種類のゲートまたはチャンネルに基づいた器具を用
いてよい。ポアの（同一または異なる）2つの層を、プローブの5’および3’ラ
ベルを読むために用いてよい。

【００９７】オリゴヌクレオチドプローブが修飾またはタグ付けされていない場合、プロー
ブ中の天然塩基の識別をプローブの識別に利用してよい。4つの塩基［アデニン
（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミジン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）］すべてを識
別することは、ＡおよびＧ（２つの相対的に大きいプリンヌクレオチド）と、Ｔ
およびＣ（２つの相対的に小さいピリミジンヌクレオチド）を識別することより
も難しい。本発明に従ったプローブの検出のためには、４つの塩基すべてを識別
する必要はない。例えば、ＰｙＰｕＰｙＰｕＰｙＰｕなどの型のプローブを用い
た場合にはプリンとピリミジンの差異は十分でありうる。5´または3´末端オリ
ゴヌクレオチド配列もまた、デジタルバーコードを形成ために本方法で用いてよ
い。

【００９８】他の例のように、金属プラズモン共鳴微小粒子に基づく多彩光学免疫ラベルを
プローブに対する識別タグとして用いた場合、本明細に参考文献により組み込ま
れるSchultzら、Proc. Nat’l Acad. Sci., 97：996-1001（2000）に記載のよ
うに、蛍光を検出するために光学画像読み取り機を用いてよい。

【００９９】あるいは、個々の単一壁炭素微小管（ＳＷＮＴ）に基づく化学センサーを、低
濃度の毒ガス分子の検出に用い、また識別タグとして用いた分子の存在の検出に
も用いてよい。例えば、本明細に参考文献により組み込まれる、個々の（直径約
１．８ｎｍの）半導体ＳＷＮＴの電気抵抗が、常温でＮＯ₂またはＮＨ₃分子に数
秒さらすことで3倍の大きさに変化することを報告しているKongら、Science,287
：622-625（2000）を参照のこと。

【０１００】フォーマット３様ＳＢＨを用いた場合、陽性プローブ（２つの短いプローブの
結合体）を、陰性の（連結していない）短いプローブから、長さに基づいてまた
は２つの識別タグの存在により識別してよい。本実施様態においては、陽性プロ
ーブ（すなわち、適切な条件下で標的核酸にハイブリダイズするプローブ）は陰
性プローブから分離する必要はない。

【０１０１】陽性としてスコアリングされたプローブのサブセットは、誤って陽性とされた
ものをこのサブセットから除去するため、または誤って陰性体とされたものをこ
のサブセットに加えるために、さらに統計的に分析してよい。例えば、プローブ
Ｘが本当に陽性である見込みは、プローブＸの配列と塩基１つが異なるプローブ
が陽性とされる頻度を比較することにより決定してよい。プローブＸが本当に陽
性であれば、プローブＸの配列と塩基１つが異なるプローブは、相当の頻度で陽
性とされるであろう。

【０１０２】同じ情報領域を持つプローブの数を数えることは、ハイブリダイゼーションの
程度の測定となり、重複プローブ配列の統計的分析に特に有効である。

【０１０３】例証的適用理論的にはすべての可能なプローブを単一ハイブリダイゼーション反応に用い
ることができるが、単一ハイブリダイゼーション反応で用いたプローブの数は、
利用可能な特有の識別タグの数に事実上限定してよい。有益なプール方法論を用
いる場合、プールに対する共通タグで十分であり、それぞれのプローブを特有に
ラベルする必要はない。本発明の最適な利用のために、用いたプローブの数、用
いた識別タグの数、およびハイブリダイゼーション反応の数は変えてよい。非常
に多くのプローブを必要とする例証的なＳＢＨ適用には、下記のようなものがあ
る。

【０１０４】（１）ヒトまたはその他の複雑なゲノムの再配列決定に関して：３２の２０マ
ーの３×１０¹⁰の有益なプールを、３０００のハイブリダイゼーションでスコア
リングしてよく、それぞれは１０００万のオリゴヌクレオチドプローブを識別す
る能力を必要とする。

【０１０５】（２）多数の１×１０⁷の有益なプールを持つ、個々のヒトゲノムでの１００
万の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を遺伝子が多決定することに関して：１０
００万のプールが必要である可能性があり（１００万部位×２対立遺伝子×５重
複プローブ）、タグ付け戦略およびＳＮＰｓの同時検出および識別を可能にする
ための、異なる配列のでＳＮＰｓの選択およびグループ化に依存して、１〜１０
の独立したハイブリダイゼーション／連結反応で用いてよい。

【０１０６】（３）１７マーでの１００，０００残基のde novo配列決定に関して、１６，
３８４の１７マーの、１００万の有益なプールを、１つの単一ハイブリダイゼー
ション反応でスコアリングしてよく、または１００万の有益なプールを、（それ
ぞれの反応で繰り返し使用した６５，５３６の特有なタグでの）１６反応でスコ
アリングしてよい。

【０１０７】３つのすべての適用を、ハイブリダイゼーションのみを使用して、または少な
くとも１つの塩基までのＤＮＡポリメラーゼでのプローブ伸張で、または２のセ
ットのより短いプローブが、より長いプローブのより大きなセットと同等になる
ように組み合わせて結合（連結）するフォーマット３のようなＳＢＨで実施して
よい。後者のアプローチは、組合せプローブ合成においてさらなる柔軟性を提供
する（すなわち同様の反応容器内での異なる配列と特有の識別タグを持つ多くの
プローブの同時合成）。

【０１０８】少なくとも１残基までのＤＮＡポリメラーゼによるプローブ伸張は本質的には
、たとえば、参考文献として本明細書に組み込む、Cantorの米国特許第５，５０
３，９８０号で記載されているように実施してよい。簡単に記すと、プローブ：
標的ハイブリッドをヌクレオチドによって、たとえばｄｄＮＴＰのようなラベル
されたヌクレオチドを加えること、およびプローブ分子を伸張するためにポリメ
ラーゼ（たとえばクレノウ断片）を用いてことによって伸張できる。４つすべて
のヌクレオチドが異なってラベルまたはタグ付けされている場合は、これらを同
時に加えてよい。

【０１０９】１６のハイブリダイゼーション反応での１７マーの完全なセットを用いた１０
０ｋｂポリヌクレオチドの de novo配列決定の上記例のためのフォーマット３様
プローブ合成およびスコアリングを以下に記述する。

【０１１０】それぞれの必要な１７マープローブは、９マープローブおよび８マープローブ
を組み合わせることで形成してよい。９マーは以下のように調製してよい。たと
えば、すべての２５６の可能性ある４マーを２５６の別々の反応で合成し、２５
６の特有の識別タグで、３’末端に配置してタグ付けしてよい。すべての４マー
を互いに混合し、次いで６４のアリコートに分割し、それぞれを６４のすべての
可能性ある３マーの１つを加えるために反応にかけ、これによりすべての可能性
のある７マーが形成される。最後に、すべての７マーを互いに混合し、１６のア
リコートに分け、それぞれを１６のすべての可能性のある２マーを加えるために
反応させ、これによってすべての可能性のある９マー（およそ２６２，０００の
可能性のある９マー）が形成される。残っている９マーを１６のアリコートまた
はプールに分割し、それぞれを、それぞれの１６の独立したハイブリダイゼーシ
ョン反応に使用する。

【０１１１】８マーの関して、すべての２５６の可能性のある４マーの混合物を作製し、次
いで互いに混合させ、２５６すべての可能性のある４マーの１つをそれぞれの追
加するために２５６のさらなる反応にかけるように分割し、１つの特異的識別タ
グおよび、検出工程の間オリゴヌクレオチドプローブの開始に関する１つの共通
タグを５’末端に加える。次いですべての２５６の反応液をすべての８マーのプ
ールを形成するために混合する。

【０１１２】２５６の４マーをそれぞれの末端でラベルするために２５６のタグを用いる代
わりに、より少数のタグを、読みとり工程で十分に別個である可能性のない２つ
の４マーのうちの１つをラベルするために使用してよい。

【０１１３】９マーの１６の別々のプールおよび８マーのすべてのプールのうちの１つを、
好ましい条件下で標的核酸とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション反
応が完了した時に、連結産物を（たとえば上述のように分離タグの連続的な結合
によって）選択し、読み取り機で検出する。その開始は、８マーからの５’タグ
（たとえばアニオン）によって定義できる。有益なプールおよびタグのこの組合
せにおいて、１７マーに対する特異的なシグナルは、５’および３’末端両方で
の２つのシグナルの組合せである。それぞれの末端において、特異的な４マーま
たは４マーバーコードタグのどちらかが検出される。６５，５３６の異なる組合
せのシグナルのうちのどの１つのものも特有の４マー＋４マーおよび独立した反
応でハイブリダイズしたそれぞれでの１６プール１６，３８４の異なる中間９マ
ー配列を表し、したがって１６，３８４の１７マーの有益なプールが形成される
。

【０１１４】１００ｋｂの標的核酸に関して、ただ約２００，０００の１７マーが陽性であ
り（８０，０００のうちの１つ）、しかしこれらの２００，０００の陽性プロー
ブのそれぞれが、約１０倍を表すべきであり、すべての陽性プローブの代表であ
るべきである統計学的サンプリングを可能にする（結果として合計２００万の陽
性プローブ分子となる）。ほぼすべての１７マーを標本とするために、選択的に
約１００万のプローブ分子をスコアリングし、その主なものは重複しており、し
たがって多重検出によって確認する可能性がある。

【０１１５】従来のフォーマット１および２のＳＢＨＡ．アッセイフォーマットフォーマット１ＳＢＨは、試料の大きなセットの同時解析に好ましい。大アレ
イ上での数千の試料の平行スコアリングを、数千の、膜小片を使用した独立した
ハイブリッド反応で実施してよい。ＤＮＡの同定には、反応あたり１〜２０プロ
ーブを含みえ、突然変異の同定はいくつかの場合、それぞれの試料に対して特異
的に選択し、または設計した１０００以上のプローブが含まれうる。変異したＤ
ＮＡ部分の性質の同定のために、特定のプローブを、ハイブリダイゼーションの
第一ラウンドにて検出したそれぞれの変異に関して合成または選択してよい。

【０１１６】ＤＮＡ試料は、好ましいスペーサーによって分離されてよく、そして多重ウェ
ルプレート内でアレイしてよいオリゴヌクレオチドのセットより選択したプロー
ブで同時に試験してよい小アレイで調製してよい。小アレイは１またはそれ以上
のアレイからなってよい。それぞれの小アレイ中のＤＮＡ試料には、変異体また
は配列の個々の試料が含まれてよい。連続的な小アレイは、より大きなアレイ中
に組織化してよい。そのようなより大きなアレイには、同じ小アレイの複製物を
含んでよく、または異なるＤＮＡ断片の試料のアレイを含んでよい。プローブの
共通セットには、たとえばそれぞれの塩基対（「ｂｐ」）の過剰な読みとりに関
するような、先に特定した精度でＤＮＡ断片を解析するのに十分なプローブを含
む。これらのセットには、１つの特定の断片に関して十分である以上のプローブ
を含んでよいが、しかし異なる配列の数千のＤＮＡ試料を試験するのに必要であ
るより最も少ないプローブを含んでもよい。

【０１１７】ＤＮＡまたは対立遺伝子同定および診断的配列決定工程は以下の工程を含んで
よい。

【０１１８】１）多数の小アレイのそれぞれとハイブリダイズするべき専用の、代表的なま
たは共通セットからのプローブのサブセットの選択。

【０１１９】２）平行して解析するための、それぞれのアレイ上のそれぞれのサブアレイに
第一プローブを加えること。

【０１２０】３）ハイブリダイゼーションの実施およびハイブリダイゼーションの結果のス
コアリング。

【０１２１】４）すでに使用したプローブの除去。

【０１２２】５）スコアリングすべき残余プローブに関するハイブリダイゼーションの繰り
返し、スコアリングおよび除去工程。

【０１２３】５）最終解析を得またはさらなるハイブリダイズすべきプローブの決定のため
の、得られた結果の処理。

【０１２４】６）特定のサブアレイに関するさらなるハイブリダイゼーションの実施。

【０１２５】７）完全なデータセットの処理および最終結果を得るコンピュータ処理。

【０１２６】本アプローチは、１つの型（たとえばＤＮＡ、ＲＮＡ）の少数のヌクレオチド
試料の素早い同定および配列決定を提供し、また処理可能な大きさのプローブの
、先に合成されたセットを用いることによってサブアレイの形成における多くの
試料種類の平行解析を提供する。２つのアプローチが、ＤＮＡ同定の決定のため
、ＤＮＡ診断のため、および変異の検出のための効率的な用途の広い処理を行う
ために組み合わされる。

【０１２７】公知の配列の同定のために、より短いプローブの小さなセットを、より長い特
有のプローブの代わりに使用してよい。本アプローチにおいて、スコアリングす
べきより多くのプローブが存在する可能性があるけれども、プローブの共通セッ
トを任意の配列型をカバーするように合成してよい。たとえば、６マーのすべて
のセットには４，０９６プローブのみが含まれ、７マーの完全なセットには１６
，３８４プローブのみが含まれる。

【０１２８】ＤＮＡ断片の全配列決定は、２レベルのハイブリダイゼーションで実施してよ
い。１レベルは少なくとも１回、すべての塩基をカバーする十分なプローブのセ
ットのハイブリダイゼーションである。この目的のために、特定のプローブのセ
ットを標準試料に対して合成してよい。そのようなプローブのセットでのハイブ
リダイゼーションの結果は、変異（差異）が非標準試料で起こったかどうか、お
よびどこで起こったかを明らかにする。変化の同一性を決定するためにさらに特
異的なプローブをこの試料にハイブリダイゼーションしてよい。

【０１２９】他の変法では、共通セットからのすべてのプローブをスコアリングしてよい。
プローブの共通セットにより、望ましくない時間の浪費なしに、２段階工程での
試料あたりの比較的少数のプローブのスコアリングが可能である。ハイブリダイ
ゼーション工程には、第一にハイブリダイズし、次いで得られた結果に基づいた
プローブの最適なサブセットの見積もりの第一工程、共通セットでのこれらより
スコアリングすべきさらなるプローブを決定する第二段階の、連続的な測定装置
を含んでよい。

【０１３０】Ｂ．配列アセンブルＳＢＨ配列アセンブルにおいて、偶然または生物学的理由によって解析したＤ
ＮＡ配列内で繰り返し起こるＫ−１オリゴヌクレオチドを、特別に考慮してよい
。さらなる情報がない場合、比較的小さなＤＮＡ断片を完全にアセンブルしてよ
く、同様にすべての塩基対を何回か読む。

【０１３１】比較的長い断片のアセンブルにおいて、Ｋ−１配列（すなわちプローブの長さ
よりも短い配列）の陽性スコアリングプローブのセットにおける繰り返しの発生
のために不正確さが発生する可能性がある。この問題は、変異したか、または同
様の配列が決定されなければならない（すなわちＫ−１配列が同じように繰り返
されてはいない）場合には存在しない。１つの配列の知見を、鋳型上での最もよ
い適合を表示するために未知の配列に対する陽性プローブをアレイすることによ
り、（たとえばデータベースでのその存在により）同一であると公知の配列を正
しくアセンブルするための鋳型として使用してよい。

【０１３２】ＤＮＡ内で、特定のプローブの局在は、配列データの重ね合わせによって決定
する場合に交換可能でありえ、結果として、部分的配列の位置の不正確さとなる
。配列情報がＳＢＨにて決定されるけれども、（ｉ）完全ゲル配列決定の費用分
割における長い読み長、１回通過配列決定、または（ｉｉ）関連配列との比較の
いずれかを、そのような不正確さ(「分岐点(branch points)」)が起こる部分のハ
イブリダイゼーションデータを整理するために使用してよい。さらに、（遺伝子
内では発見されない）ジャンクＤＮＡ中の区画を無作為に何回も繰り返してよい
。この区画の配列がＤＢＨで決定されるけれども、一回ゲル通過配列決定を、無
作為に繰り返した区画が存在する部分でのタンデムリピートの数を決定するため
に使用してよい。タンデムリピートは、遺伝子のタンパク質コード部分ではほと
んど起こらないので、ゲル配列決定工程は、配列に対する商業的価値が決定され
た場合のみ実施される可能性がある。

【０１３３】Ｃ．変異体の配列決定試料アレイのアレイの使用は、単一試料上または試料の小さなセット上での多
くのオリゴヌクレオチドの連続的なスコアリングをさける。このアプローチによ
り、ただ１つの身体的な操作と平行して、より多くのプローブのスコアリングを
可能にする。長さにして１０００ｂｐのＤＮＡ試料のサブアレイを、比較的短時
間に配列決定可能である。試料がアレイ中５０サブアレイでスポットされ、アレ
イを１０回再プローブ化した場合、５００のプローブをスコアリング可能である
。変異の発生に関するスクリーニングの場合、およそ３３５のプローブがそれぞ
れの塩基を３回カバーするのに使用できる。変異が存在する場合、いくつかのカ
バーしているプローブが影響を与える可能性がある。陰性プローブの同定に関す
る情報を使用することで、２つの塩基の精度を持つ変異を遺伝子上に位置づける
ことができる。この精度で位置づけられた単一塩基変異を説明するために、さら
に１５プローブを使用してよい。これらのプローブは、（欠失および挿入が含ま
れないことを想定する）２つの疑わし部分に関する任意の塩基組合せをカバーす
る。これらのプローブを、与えられた試料を含む５０のサブアレイ上で１サイク
ルでスコアリングしてよい。多重ラベル色スキーム（すなわち多重化）の手法に
おいて、それぞれ異なる蛍光色素のような異なるラベルを持っている２〜６のプ
ローブをプールとして使用してよく、それによって、ハイブリッドサイクルの数
が減少し、配列の工程が短くなる。

【０１３４】より複雑な場合、２つの近い変異または挿入が存在する可能性がある。これら
は、より多くのプローブで扱ってよい。たとえば、３塩基挿入は６４のプローブ
で解決しうる。最も複雑な場合は、いくつかの工程のハイブリダイゼーション、
および先のハイブリダイゼーションの結果に基づいた新規プローブのセットの選
択によってアプローチしてよい。

【０１３５】解析すべきサブアレイが数十または数百の１つの型の試料を含む場合、ここで
これらのいくつかを、１つまたはそれ以上の変化（変異、挿入または欠失）を含
むと認めてよい。変異が起こっているそれぞれの区画に関して、特定のプローブ
のセットをスコアリングしてよい。試料の型に関してスコアリングすべきプロー
ブの総数は数百であってよい。平行してのレプリカアレイのスコアリングは、比
較的少数のサイクルでの数百のプローブの平行レプリカアレイのスコアリングを
促進する。さらに、競合的プローブをプールしてよい。陽性ハイブリダイゼーシ
ョンは、それらの区画が通常その要素塩基の７５％で異なるので、特定のＤＮＡ
区画を確認するために選択したプローブに割り当ててよい。

【０１３６】より長いプローブのより大きなセットを使用することによって、より長い標的
を都合よく解析できる。これらの標的は、エキソンクローンのプールのようなよ
り短い断片のプールを表しうる。

【０１３７】Ｄ．ＳＢＨを用いたヘテロ接合体の同定特定のハイブリダイゼーションスコアリング方法を、二倍体染色体のセットか
ら配列決定すべきゲノム区画内でのヘテロ接合体（配列変異体）の存在を定義す
るために実施してよい。２つの変異体は、ｉ）１つの染色体からの配列が、新規
変異体を表す他のものからの基本型および配列を表している、またはｉｉ）両方
の染色体が新規の、しかし異なる変異体を含む場所である部分である。第一の場
合、変化を位置づけるために設計した走査工程は、ヘテロ接合体部位において２
倍の最大シグナル差異を与える。第二の場合、マスキングはないが、ハイブリダ
イゼーションの続くラウンドに関するプローブのより複雑な選択が示唆されうる
。

【０１３８】第一の場合で必要とされた２倍シグナル差異をスコアリングすることは、基礎
的配列型のみを含む対照および他の解析した試料からのシグナルと、相当するシ
グナルを比較することによって効果的に実施してよい。このアプローチにより、
与えられた試料中のそれぞれの特定のプローブに対するハイブリダイゼーション
シグナルの相対的な減少の測定が可能になる。これは、ハイブリダイゼーション
効率が、同様の完全にマッチする標的を有している異なるＤＮＡ断片とハイブリ
ダイズした特定のプローブに関して、２倍以上変化する可能性があるので、明ら
かである。さらに、ヘテロ接合体部位は、オリゴヌクレオチドプローブの数に依
存しながら、１つ以上のプローブに影響する可能性がある。２〜４の連続的なプ
ローブに関するシグナルの減少は、ヘテロ接合体部位のより明白は指示を産出す
る。結果を、１または数個のプローブを、その中で平均で、ミスマッチを含有す
る二本鎖から発生しているシグナルなるよりも８倍強力である完全にマッチする
シグナルを与えるように選択した、選択したプローブの小さなセットで試験する
ことで確認してよい。

【０１３９】分割した膜によって、得られた配列型を示している相対的に多数の試料、また
は比較的少数の試料で表された試料の多くの異なる型を適応するために、より柔
軟な実験の体系化が可能である。４〜２５６の試料の範囲は、とりわけ効率よく
扱うことができる。この範囲のドット数内でのサブアレイが、オリゴヌクレオチ
ドの保存およびラベルのために使用した標準の多重ウェルプレートの形態および
大きさをあわせるように設計してよい。サブアレイの大きさは、異なる大きさの
試料に対して調整してよく、または２，３の標準のサブアレイの大きさを使用し
てよい。型のすべての試料が１つのサブアッセイで適合しない場合、さらなるサ
ブアッセイまたは膜を使用してよく、同様のプローブで処理してよい。加えて、
それぞれのサブアレイのためにる多数の複製物を調整することによって、同定ま
たは配列決定工程の完了ための時間を変えてもよい。

【０１４０】ＳＢＨでのサイン解析約２００オリゴヌクレオチドプローブのみのセットに関して示した（約５％の
努力が完全な配列決定に対して必要である）ハイブリダイゼーションの程度につ
いての情報を得ることは、それぞれの遺伝子の特有のサインを定義し、ライブラ
リーが同一遺伝子の多重コピーを含むかどうか決定するためにライブラリーより
ｃＤＮＡを選別するために使用してよい。そのような特徴によって、同一の、同
様の、そして異なったｃＤＮＡを区別でき、概括できる。

【０１４１】ハイブリダイゼーションによるフォーマット３配列決定（フォーマット１および２と同様に）フォーマット３ＳＢＨは、たとえば本
明細書に参考文献として組み込んだ、１９９８年７月２３日に発行された国際特
許明細書番号第ＷＯ９８／３１８３６号、および１９９９年２月２８日に発行さ
れたＷＯ９９／０９２１７号でより完全に記述されている。フォーマット３にお
いては、公知の配列のオリゴヌクレオチドプローブの第一のセットを、それらが
それぞれ相補的な配列を持っている核酸にハイブリダイズすることを許容する条
件下で、固体支持体に固定化する。ラベルした第二のオリゴヌクレオチドプロー
ブのセットを溶液中で提供する。セット内およびセット間両方で、プローブは同
一の長さであってよく、または異なる長さであってよい。配列決定すべき核酸ま
たはその中間断片を、二本鎖形態(とりわけrecAタンパク質が、非変性条件下で
ハイブリダイゼーションを許容するために存在する場合)で、または一本鎖形態
および異なる程度の相補性のハイブリダイゼーションを許容する条件下(たとえ
ば完全なマッチと1塩基のミスマッチハイブリッドを識別する条件下)で、プロー
ブの第一のセットに適用してよい。配列決定すべき核酸またはその中間断片を、
プローブの第二のセット前、後または同時に、プローブの第一セットに適用して
よい。リガーゼまたは非隣接プローブ間ではなく、隣接プローブ間での化学結合
形成を引き起こす他の方法を、プローブの第二セットの前、後または同時に適用
してよい。隣接プローブを化学結合するように許容した後、プローブの第一セッ
トのメンバーへの化学結合によって表面に固定化されなかった断片およびプロー
ブを、たとえばハイブリッドをとかす高温（１００℃まで）洗浄溶液を用いて洗
い流す。次いで第二セットからの結合したプローブを、使用したラベル(たとえ
ば化学発光、蛍光、放射活性、酵素的または濃度的であってよい)に対して適切
な方法によって検出する。

【０１４２】本明細書で、特定の条件下で水素結合により安定な二本鎖を形成する場合、核
酸塩基は「マッチし」、「相補的」である。たとえば、ハイブリダイゼーションアッ
セイで一般的に使用する条件下で、アデニン(「A」)はチミン(「T」)とマッチし、し
かしグアニン(「G」)またはシトシン(「C」)とはマッチしない。同様にGはCとマッチ
するが、AまたはTとマッチしない。イノシンまたは普遍的な塩基(「M」塩基、Nich
olsら、1994)、またはたとえばメチル化塩基のような他の修飾された塩基のよう
な、特異的でない様式で水素結合する他の塩基は、それらが特定の条件下で安定
な二本鎖を形成するための塩基と相補的である。プローブは、プローブ中のそれ
ぞれの塩基が、配列決定すべき核酸中の塩基に対して水素結合することにより二
本鎖を形成する場合に、「完全に相補的」であるといい、または「完全にマッチ
する」であるという。安定な二本鎖を形成しないプローブ中のそれぞれの塩基は
、特定のハイブリダイゼーション条件下で「ミスマッチ」であるという。

【０１４３】プローブのリストは、それぞれのプローブが、配列決定すべき核酸に完全にマ
ッチしているように整理してよい。次いでこのリスト上のプローブを、最大重複
様式でそれらを配列するために解析してよい。そのような配列化は、第二プロー
ブの５’末端での塩基の配列と同一である、もっとも長い塩基配列を持っている
３’末端を持つプローブを決定するために、リスト上のそれぞれの他のプローブ
に対して第一プローブを比較することで実施してよい。次いで第一および第二プ
ローブを重なり合わせてよく、この工程は、第二プローブの５’末端を、残って
いるすべてのプローブの５’末端と比較することで、および第一プローブの３’
末端と、残っているすべてのプローブの３’末端と比較することで繰り返してよ
い。この工程は、他のプローブと重なりあわなかったリスト上のプローブがなく
なるまで継続してよい。あるいは、１つ以上のプローブを、陽性プローブから選
択してよく、１つ以上の重なり合ったプローブ(「配列核(sequence nucleus)」の
セットを平行して作製してよい。そのようないずれかの配列アセンブルの処理の
ためのプローブのリストは、配列決定すべき核酸に完全に相補的なすべてのプロ
ーブのリストであってよく、その任意のサブセットであってよい。

【０１４４】配列核の５’および３’末端を重なり合わせて、より長い配列を作製してよい
。プローブまたは配列核と選択的に適切に重なり合う有効性のために、配列アセ
ンブルにおいて不正確さが起こる場合、重複選択肢の部分に広がるより長いプロ
ーブとのハイブリダイゼーション、競合的ハイブリダイゼーション、他の末端の
、不正確さまたは１回通過ゲル解析に広がるプローブの末端対への連結（配列ア
センブルのための明白な骨格を提供するために）を使用してよい。

【０１４５】上記手順を使用することで、任意の望ましいレベルの配列を、アセンブルした
配列核を介した重複または非重複プローブへの、そして中間断片または全供給源
ＤＮＡ分子（たとえば染色体）に関する完全配列に対して（核酸試料を識別する
ためのサインとして利用するために核酸試料の識別と関連する可能性がある）ハ
イブリダイゼーションのパターンより得ることができる。

【０１４６】配列決定は、一般的に以下の工程を含んでよい。（ａ）固定化したプローブと相補的な配列を持つ断片が、断片がハイブリダイズ
した部分とハイブリダイズしない部分を持つように、固定化したプローブと第一
複合体を形成することを許容するのに十分な条件下で、固定化オリゴヌクレオチ
ドプローブを核酸断片と接触させること、（ｂ）ラベルされたプローブのそれと相補的な非ハイブリダイゼーション配列を
含む第一複合体が、ラベルしたプローブに対してハイブリダイズすることを許容
するのに効果的な条件下で、ハイブリダイズしていない配列第一複合体を溶液中
のラベルされたオリゴヌクレオチドプローブのセットと接触させ、それによって
断片が固定化プローブとラベルされたプローブの両方にハイブリダイズする第二
複合体を形成すること、（ｃ）第二複合体より、固定化したプローブに近接してハイブリダイズしなかっ
たラベルされたプローブを除去すること、（ｄ）ラベルの存在を検出することで隣接したラベルおよび非ラベルプローブの
存在を検出すること、（ｅ）固定化、ラベルされたプローブの公知の配列を連結することによって、断
片のヌクレオチド配列を決定すること。

【０１４７】ＳＢＨの本実施様態において、連結を、化学連結剤（たとえば水溶性カルボジ
イミドまたは臭化シアン）によって実行してよい。Ｔ４細菌からの商業的に入手
可能なＴ４ＤＮＡリガーゼのようなリガーゼ酵素を使用してよい。隣接したラ
ベルされて固定化されたプローブと、隣接していないラベルされて固定化された
プローブを見分けるために選択した洗浄条件は、連続的に積み重なるか連結した
隣接プローブの安定性の違いを利用して選択する。

【０１４８】本発明を実施するに当たって、数多くの修飾および変更をなすことが、本発明
の現在のところ好ましい実施態様の以上の記載を考慮すれば当業者に想起される
と予測される。従って、本発明の範囲に付されるべき限定は、特許請求の範囲に
おけるもののみである。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１に、本発明の磁気、光学または導電特性に基づく、バーコー
ドの一例を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】標的核酸の配列を検出する方法であって、以下の工程すなわ
ち、（ａ）標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数のオリゴヌクレ
オチドプローブ分子［各プローブ分子は情報領域を含み、少なくとも２のプロー
ブ分子は異なる情報領域を有する］の、１またはそれ以上の混合物に、情報領域
でミスマッチがあるプローブ分子とよりも平均して多くの、プローブ分子の情報
領域内で標的核酸に完全に相補的なプローブ分子との、プローブ：標的ハイブリ
ダイゼーションを生じさせる条件下に接触させ［この際、該標的核酸は支持体に
付着されておらず、プローブ分子は支持体に付着されていない］、（ｂ）個々のプローブ分子を検出することができる読み取り機を使用して、標
的核酸とハイブリダイズするプローブ分子を検出し、および（ｃ）工程（ａ）にて標的に接触させられるプローブ分子のうち少なくとも２
の情報領域の配列を重ね合わせることによって、標的核酸の配列を検出する、工程を含む方法。
【請求項２】少なくとも２の混合物が、同時に接触させられる請求項１記
載の方法。
【請求項３】少なくとも２の混合物が、連続的に接触させられる請求項１
記載の方法。
【請求項４】プローブ分子の混合物が、その情報領域において別異の、少
なくとも約１０のプローブ分子を含む請求項１記載の方法。
【請求項５】プローブ分子の混合物が、その情報領域において別異の、少
なくとも約１００のプローブ分子を含む請求項１記載の方法。
【請求項６】プローブ分子の混合物が、その情報領域において別異の、少
なくとも約１，０００のプローブ分子を含む請求項１記載の方法。
【請求項７】プローブ分子の混合物が、その情報領域において別異の、少
なくとも約１０，０００のプローブ分子を含む請求項１記載の方法。
【請求項８】プローブ分子が、修飾された塩基を含む請求項１記載の方法
。
【請求項９】複数のプローブ分子が、識別タグに会合している請求項１記
載の方法。
【請求項１０】複数のプローブ分子が各々、２の識別タグを有している請
求項９記載の方法。
【請求項１１】同じ情報領域を有する複数のプローブ分子が各々、同じ識
別タグに会合している請求項９記載の方法。
【請求項１２】異なる情報領域を有する少なくとも２のプローブ分子が、
異なる識別タグに会合している請求項９記載の方法。
【請求項１３】プローブ分子がプールに分けられ、各プールは異なる情報
領域を有する少なくとも２のプローブ分子を含み、且つ各プール内の全プローブ
分子が、プールに特有の同じ識別タグに会合している請求項９記載の方法。
【請求項１４】少なくとも１の識別タグがバーコードである請求項９記載
の方法。
【請求項１５】バーコードが、サイズ、形状、電気特性、磁気特性、光学
特性、および化学特性よりなる群から選択される特性に基づくものである請求項
１４記載の方法。
【請求項１６】識別タグが、修飾された塩基を含むＤＮＡバーコードであ
る請求項１４記載の方法。
【請求項１７】識別タグが、分子バーコードである請求項１４記載の方法
。
【請求項１８】識別タグが、ナノ粒子バーコードである請求項１４記載の
方法。
【請求項１９】バーコードが、様々な長さのエレメントを含み、各エレメ
ントは設定数のユニット・タグを含む請求項１４記載の方法。
【請求項２０】標的核酸が、セパレータ・タグと会合している請求項１記
載の方法。
【請求項２１】プローブ分子が、セパレータ・タグと会合している請求項
１記載の方法。
【請求項２２】検出工程（ｂ）の前に、標的核酸とハイブリダイズするプ
ローブ分子が、標的核酸とハイブリダイズしないプローブ分子から分離される請
求項１記載の方法。
【請求項２３】標的核酸とハイブリダイズしないプローブ分子が、酵素消
化によって除去される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】工程（ｂ）がさらに、同じ情報領域を有するプローブ分子
が検出される回数を計数することを含む請求項１記載の方法。
【請求項２５】工程（ｂ）においてプローブ分子を検出するために、ナノ
ポアチャンネルを含む読み取り機が使用される請求項１記載の方法。
【請求項２６】工程（ｂ）においてプローブ分子を検出するために、ナノ
ポアチャンネル内またはその周辺の電気的応答のセンシングが使用される請求項
２５記載の方法。
【請求項２７】読み取り機が、工程（ｂ）において分子バーコードを検出
する請求項２５記載の方法。
【請求項２８】プローブ分子が、検出工程（ｂ）の実施中にプローブ分子
の５’／３’方向を同定することを許容する１またはそれ以上のタグに会合して
いる請求項１記載の方法。
【請求項２９】工程（ｂ）において、プローブ分子（１または複数）の配
列が検出される請求項１記載の方法。
【請求項３０】少なくとも２のプローブ分子が識別タグに会合しており、
そして識別タグも工程（ｂ）において検出される請求項２９記載の方法。
【請求項３１】標的核酸を配列決定する方法であって、以下の工程すなわ
ち、（ａ）標的核酸を、所定の長さおよび所定の配列を有する複数のオリゴヌクレ
オチドプローブ分子の、１またはそれ以上の混合物［各プローブ分子は情報領域
を含み、少なくとも２のプローブ分子は異なる情報領域を有する］に、情報領域
でミスマッチがあるプローブ分子とよりも平均して多くの、プローブ分子の情報
領域内で標的核酸に完全に相補的なプローブ分子との、プローブ：標的ハイブリ
ダイゼーションを生じさせる条件下に接触させ［この際、該標的核酸は支持体に
付着されておらず、プローブ分子は支持体に付着されていない］、（ｂ）プローブ分子の情報領域内で標的に完全に相補的な、近接するプローブ
：標的ハイブリッドを形成するプローブ分子を共有結合させ、および（ｃ）共有結合されたプローブ分子を、個々のプローブ分子を検出することが
できる読み取り機を用いて検出する、工程を含む方法。
【請求項３２】さらに、以下の工程すなわち、（ｄ）工程（ａ）にて標的核酸に接触させられる２のプローブ分子の情報領域
の配列を組み合わせることにより作製される少なくとも２の配列を重ね合わせる
ことによって、標的核酸の配列を検出する、工程を含む請求項３１記載の方法。
【請求項３３】検出工程（ｃ）の前に、共有結合しているプローブ分子が
、共有結合していないプローブ分子から分離される請求項３１記載の方法。
【請求項３４】少なくとも１のヌクレオチドが、ポリメラーゼまたはその
活性断片を用いて、標的核酸にハイブリダイズする１またはそれ以上のプローブ
分子の末端に付加される請求項１または１８に記載の方法。
【請求項３５】プローブ分子が、特有にラベルされた異なる４のヌクレオ
チドの混合物と接触される請求項３４記載の方法。
【請求項３６】全ヒトゲノムを含む標的核酸が、プローブ分子と接触させ
られる請求項１記載の方法。
【請求項３７】単一のヌクレオチドの多型が検出される請求項１、１８ま
たは２０のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】プローブ分子の混合物を含むキットであって、約１００ま
たはそれ以上のプローブ分子が各々、別異の情報領域を有し、混合物の中の該別
異の情報領域の２またはそれ以上の配列が重複しているキット。
【請求項３９】約１０⁵またはそれ未満のプローブ分子が各々、同じ情報
領域を有している請求項３８記載のキット。
【請求項４０】約１０⁴またはそれ未満のプローブ分子が各々、同じ情報
領域を有している請求項３８記載のキット。
【請求項４１】各情報領域が、同じ情報領域を有する１０⁴またはそれ以
上のプローブ分子によって提示される請求項３８記載のキット。
【請求項４２】同じ情報領域を有する少なくとも２のプローブ分子が、同
じ識別タグを有している請求項３８記載のキット。
【請求項４３】プローブ分子の混合物のセットを含むキットであって、約
１００またはそれ以上のプローブ分子が各々、別異の情報領域を有し、セットの
中の該別異の情報領域の２またはそれ以上の配列が重複しているキット。
【請求項４４】約１０⁵またはそれ未満のプローブ分子が各々、同じ情報
領域を有している請求項４３記載のキット。
【請求項４５】異なる情報領域を有する少なくとも２のプローブ分子が同
じプール内にあり、そして同じ識別タグを有している請求項４３記載のキット。
【請求項４６】約５０００またはそれ以上のプローブ分子が各々、同じ情
報領域を有している請求項３８または４３記載のキット。
【請求項４７】様々な検出可能な特性のエレメントの交互配置（alternat
ing arrangement）を含むバーコードであるタグであり、継続的なエレメントが
それらの検出可能な特性の少なくとも１つに相異を有しているタグ。
【請求項４８】前記エレメントが、様々な検出可能な特性の複合ユニット
タグ（multiple unit tag）を含み、該エレメントは長さが様々なものである請
求項４７記載のタグ。