WO2001056691A2 - Verfahren und vorrichtung zur synthese und analyse von trägergebundenen arrays von oligomeren, insbesondere von primerpaaren für die pcr, sowie träger mit oligomeren - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur synthese und analyse von trägergebundenen arrays von oligomeren, insbesondere von primerpaaren für die pcr, sowie träger mit oligomeren Download PDF

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Definitions

  • the invention relates to methods and devices for the synthesis and analysis of carrier-bound arrays of oligomers, in particular of primer pairs for PCR (polymerase chain reaction - polymerase chain reaction), and carriers with oligomers.
  • the invention relates to methods and devices for the parallel synthesis of complex oligomer, in particular oligonucleotide, libraries.
  • oligomer library or “oligonucleotide library” here means the entirety of many different oligomers, peptides, nucleotides or ribonucleotides bound to defined locations on a support, the different oligomers or - (ribo) nucleotides should be arranged as compact as possible. Before molecular libraries arise, especially through the combinatorial synthesis of a limited number of monomers.
  • complex denotes molecular libraries with more than 10 2 different representatives, but in particular molecular libraries with more than 10 4 different representatives.
  • PCR array denotes the entirety of many different oligonucleotide pairs with a free 3'OH end that are bound at defined locations on a support. These primer pairs have the property of binding suitable template DNA, which results in an amplificate which is bound to the carrier in a location-defined manner depending on the Prime ⁇ aar under PCR conditions.
  • a number of methods for combinatorial synthesis of molecular libraries are already known. These include printing processes for combinatorial synthesis, in which liquids are applied to a carrier in a defined location.
  • An example of this process is the inkjet printer (patent application WO 97 44134 A, Incyte Pharmaceutical Inc., 1997; or US5449754, Nishioka, 1995).
  • Another method for combinatorial synthesis uses a compact disc as a carrier (WO 98 12559 A, Demers, 1998).
  • Another method uses a controllable chip as a carrier (US5667667, Southern, 1996).
  • Another method uses a color laser printer with modified clay particles (PCT / DE99 / 03982).
  • lithographic methods are known (US5424186, Very large scale immobilized polymer synthesis, Fodor et al, 1991), in which, sequentially:
  • oligonucleotides in particular prime pairs for PCR
  • a support with the aim of a highly parallelizable PCR US5641658, US6060288 and US6090592.
  • the great advantage of these methods is that the prime pairs are covalently coupled to the carrier.
  • the PCR products are also coupled to the carrier with the primers so that no cross-contamination from primers or PCR products can occur. This ensures that different PCR reactions do not have to be separated from one another by separate reaction spaces. This goal is very elegantly achieved solely by the spatially separated coupling of prime pairs to a carrier.
  • ohgonucleotides in particular but also other types of oligomers, have a polarity is given little attention in the inventions mentioned.
  • Ohgonucleotides have e.g. a 5'OH end and a 3'OH end, peptides have an amino and a carboxy terminal end.
  • This polarity also applies to each individual building block of the oligomer, e.g. Nuleotides in the case of the ohgonucleotides or amino acids in the case of the peptides.
  • the ohgonucleotides bound to the support must have a free 3'OH end, since they then only serve as a substrate for a polymerase.
  • the present invention provides an incredibly simple solution as to how these synthetic artifacts can be cleaned off in situ and thus in a highly parallel manner.
  • the invention is therefore suitable for in-situ cleaning of the desired end products on a carrier, in particular in the case of a complex array. In many cases, this is the prerequisite for the sensible use of arrays, since many observable effects are disturbed by contaminants.
  • the invention causes the oligomers anchored to the support to be “turned over” so that the end initially anchored to the support, in particular the 3′OH end of an oligonucleotide, is subsequently freely accessible for a suitable enzymatic activity.
  • the invention thus simultaneously opens up a particularly simple way of producing PCR arrays (arrays by Prime ⁇ aaren).
  • a major technical advantage here is that, according to the invention, the particularly easily accessible components last coupled to the carrier are cross-linked. This largely prevents steric problems caused by the possibly very bulky side protection groups. As the length of the oligomers built up on the carrier increases, these make it more difficult to access the "linker” which connects the oligomer to the carrier. This is a problem which is particularly well known to the person skilled in the art if the "linker” itself has to play the decisive role in "turning over” the synthesized oligomer, as described, for example, in US Pat. No. 5,555,215: "Polymer reversal on solid surfaces” becomes.
  • This invention is intended, in particular, to enable a synthesis of prime-pairs with a free 3'-OH end which are suitable for a subsequent PCR analysis and which are formed as a pair by the combinatorial synthesis at a defined location on a support in each case.
  • An alternative method uses monomers where the temporary protecting group is located at the 3'OH end.
  • the use of these monomers gives rise to ohgonucleotides with a free 3'OH end which bind to the support with their 5'OH end.
  • Monomers of this type for oligonucleotide synthesis are sold by Glensearch (www.glenres.com). So far, this type of monomers have been used for special applications such as more stable antisense ohgonucleotides, or for the synthesis of double strands that hybridize in parallel. Among other things, this is because these monomers are very expensive.
  • the object of the invention is to provide improved methods and devices for the synthesis or analysis of oligomers on a support, in particular prime pairs for PCR (polymerase chain reaction), and improved supports with oligomers purified in situ ,
  • 2a the splitting off of a second non-permanent protective group 20 which differs from the first temporary protective group 4 on the support 9, as a result of which a reactive group 22 is formed on the support
  • 2b shows the structure of a second array of precisely defined oligonucleotides 2 on the reactive group 22 by means of combinatorial synthesis
  • 3a shows the formation of cross-links 7 between the free 5'-OH ends 5 of the second array of precisely defined oligonucleotides 2, which results in an array of prime pairs 21 of defined sequence, each of which is defined in a precisely defined manner
  • 4a shows the hybridization of template DNA 23 at precisely defined locations 10 to a complementary primer 2, a DNA polymerase synthesizing the counter strand 26 starting from the 3'OH end 3 of the primer 2 and an adjustable heating block 11 the hybridization temperature the temperature which provides the temperature for the DNA polymerization and the temperature for the melting of the DNA double strand,
  • 4b shows the hybridization of the DNA single strand 26 synthesized at the 3'OH end 3 of the primer 2 after opening. melt the DNA double strand to the complementary counter strand primer 24,
  • Fig. 4d the installation or storage of a for the detection of
  • PCR product 27 serving fluorescent dye 25 into the precisely defined PCR product 27, which can be multiplied by further PCR cycles,
  • the covalent bond 8 via the 3'OH end of the synthesized ohgonucleotides the carrier 9 is split off in part, preferably in a major part of the synthesized ohgonucleotides or oligoribonucleotides 2, so that free 3'OH ends 3 are formed and, after these 3'OH ends 3 have been split off from the carrier 9, part, preferably a predominant part of the synthesized ohgonucleotides or oligoribonucleotides 2 can bind covalently to the carrier 9 due to the cross-links 7 at the 5'OH end 5,
  • the synthesis artefact 28 which was formed in the synthesis and bound to the support 9 was provided with a "cap" 29 during the synthesis,
  • oligonucleotides (2) are mentioned in the description of FIGS. 1 to 7.
  • the description also applies to other oligomers (2), as can already be seen from the labeling table.
  • nucleotides these are the 3'OH end and the 5'OH end, in the case of amino acids the COOH group and the NH 2 group, for other monomers there are other groups.
  • the invention relates to all of these different combinatorial syntheses.
  • the invention not only enables the synthesis of oligonucleotides (2) with a free 3'OH end (3), but also the in situ purification of carrier-bound oligomers (2).
  • Most of these synthesis artefacts 28 result from the fact that after the temporary protective groups (4) have been split off, not all reactive groups react with a new monomer.
  • the temporary protective groups 4 (an example of such a group)
  • the protecting group is 4 ', 4 , -dimethoxytrityl chloride (DMTr)) at the 5'-OH end 5 of the ohgonucleotides 2 and then the now free 5'-OH ends 5 cross-linked via cross-links 7. This is done in a manner known per se.
  • a second non-permanent protective group 20 for example 2-acetyl-5, 5-dimethyl-l, 3- cleaved cyclohexanedione, (Dde)
  • the second non-permanent protective group 20 can be introduced during the above-mentioned crosslinking of the free 5'-OH ends, or else it could have been applied to the support 9 prior to the synthesis of the first array 1 of oligonucleotides 2 bound at certain locations 10.
  • a reactive group 22 for example a hydroxyl group or an amino group
  • a second array of precisely defined oligonucleotides 2 can be constructed, the free 5'-OH ends 5 of which are cross-linked as described above (cross-links 7). This creates an array of Prime ⁇ aaren 21 defined sequence, which are each defined precisely.
  • the permanent protective groups 6 are separated in a fourth step in a manner known per se. ten, the selection of suitable "cell phones" 8 ensuring that the majority of the ohgonucleotides 2 are now present with the free 3'-OH end 3.
  • the further anchoring 8 of the ohgonucleotides 2 is preferably achieved by incomplete cleavage of the above-mentioned mobile phones 8, for example by derivatizing the carrier 9 with a mixture of mobile phones 8, part of which is split off under the selected conditions, while a preferably smaller proportion of the mobile phones 8 remains covalently connected to the carrier 9 under the selected conditions.
  • ohgonucleotides have free 3'-OH ends instead of a free 5'-OH end and thus represent a template-dependent potential substrate for DNA polymerases
  • the latter purification of the only exemplary and non-limiting ohgonucleotides has great advantages in practice and can also be used without problems with other oligomers, such as, for example, RNA or peptides, instead of with oligonucleotides.
  • the majority of the synthesis has artifacts 28 no free 5'-OH end and is therefore not cross-linked in the first step at 7 described above.
  • the fourth step described together with the oligonucleotides cross-linked at the 5'OH end, most of the synthesis artifacts 28 are also cleaved off and can then be washed away from the support.
  • the Prime ⁇ aare 21 described can serve a precisely defined "solid phase PCR". Compared to conventional PCR methods, thousands of PCR reactions can be carried out very easily in a reaction vessel.
  • Fig. 4a shows how template DNA 23 at precisely defined locations 10 hybridizes to a complementary primer 2.
  • a DNA polymerase synthesizes the counter-strand 26 starting from the 3'OH end 3 of the primer 2.
  • a controllable heating block 11 supplies the necessary components for hybridization, for DNA polymerization and for melting the DNA double strand
  • a preferably thermostable enzymatic activity for example a helicase, a gyrase or topoisomerase together with ATP
  • a preferably thermostable enzymatic activity can be added to the solid-phase PCR, which resolves super-helical twists, especially for solid-phase PCRs that involve longer DNA regions be reproduced.
  • FIG. 4b shows how, after the DNA double strand has melted, that which is shown in FIG. 4a on the 3'OH end 3 of the primer 2 synthesized DNA single strand 26 hybridized to the complementary counter strand polymer 24.
  • 4c illustrates the formation of a double-stranded PCR product 27 after renewed DNA polymerization.
  • a fluorescent dye 25, which is used to detect the precisely defined PCR product 27 that can be amplified by further PCR cycles, can be incorporated or incorporated as indicated in FIG. 4d.
  • a method for the synthesis of a carrier-bound array 1 of oligonucleotides 2 with free 3'OH ends 3 is described below with reference to FIG.
  • the temporary protective group 4 is split off from the 5'OH end 5 after the combinatorial synthesis has taken place. Subsequently, the free 5'OH ends 5 are connected by crosslinking 7 before the permanent protective groups 6 are split off.
  • the covalent bond 8 is cleaved via the 3'OH end of the synthesized ohgonucleotides to the carrier 9 in part, preferably in the majority, of the synthesized ohgonucleotides or oligoribonucleotides 2, so that free 3'OH- Ends 3 arise.
  • the carrier 9 part, preferably a predominant part, of the synthesized ohgonucleotides or oligoribonucleotides 2 binds on account of the mentioned cross-linking 7 at the 5'OH end 5 covalently 8 to the support 9.
  • FIG. 6 schematically shows a device for parallel analysis of PCR reactions, in which the metallic heating block 11 present in most commercially available PCR machines has been milled planar, so that a close contact 12 with a planar array 1 of oligonucleotides 2 with free ones 3'OH ends 3 can arise.
  • an array 1 of oligonucleotides 2 is covered with an interchangeable, transparent, in particular also transparent to UV light planar film or disk 13, which can be fixed on the array 1, so that the evaporation of the reaction buffer is avoided.
  • the array 1 is irradiated with oligonucleotides 2 with excitation light 14, which is particularly suitable for exciting the fluorescent dye 15 associated with the double-stranded DNA 25 formed ,
  • the fluorescent dye 15 is excited by an excitation light source 16 mounted above the array 1 of oligonucleotides 2.
  • a fluorescent light filter 18 is mounted between the detection unit 17, which in a particularly advantageous manner consists of a digital camera, and the said array 1 of oligonucleotides 2, which filters the stimulus. hides light 14, but lets the emitted fluorescent light 19 pass.
  • the data recorded by the detection unit 17 are transferred to an essentially commercially available computer and subjected to an image analysis there.
  • the device described for the parallel analysis of PCR reactions is particularly suitable for the parallelized "online" detection of PCR reactions.
  • FIG. 7 schematically describes the m situ purification of oligomers 2 bound to support 9 at 8.
  • the synthesis artefact 28 which was formed in the synthesis and was bound to support 9 at 8 was provided with a "cap” 29 during the synthesis, so that this molecule 28 cannot participate in the formation of cross-links 7 between the free ends 5.
  • the synthesis artifact 28 can be washed away, which results in a (partial) in-situ purification of the oligomer 2.
  • the percentage on the support 9 in the case of 8 bound oligomers 2 and thus also the degree of purification is determined by the choice of the "cell phones" 8. At this point it should be pointed out that this in situ cleaning method is suitable for all combinatorial syntheses.
  • said array of oligonucleotides is irradiated with excitation light, in particular with UV light, which is particularly suitable for exciting a fluorescent dye, in particular etliidium bromide.
  • excitation light in particular with UV light
  • excitation of the fluorescent dye is done by an excitation light source mounted above the array of oligonucleotides.
  • a fluorescent light filter is installed between the detection unit, which in a particularly advantageous manner consists of a digital camera, and the array of oligonucleotides mentioned, which filters out the excitation light but allows the emitted fluorescent light to pass.
  • Materials produced according to the invention include the molecular libraries produced by the methods, materials or devices mentioned, in particular oligonucleotide libraries with free 3'OH ends. Characteristic of these oligonucleotide libraries is
  • oligonucleotide libraries mentioned are used for very simple PCR analysis, in particular of complex template mixtures.
  • the prime sequences of suitable sequences synthesized thereon multiply regions of preferably a large number of different genes of pathogens, so that it can be diagnosed at the same time whether an infection with one of these pathogens is present or not.
  • thermostable enzymatic activity for example a helical cheese, a gyrase or topoisomerase together with ATP
  • a preferably thermostable enzymatic activity for example a helical cheese, a gyrase or topoisomerase together with ATP
  • a preferably thermostable enzymatic activity for example a helical cheese, a gyrase or topoisomerase together with ATP
  • a preferably thermostable enzymatic activity for example a helical cheese, a gyrase or topoisomerase together with ATP
  • the prime pairs of suitable sequences synthesized thereon reproduce regions of preferably as many human firsts as possible (expressed sequence tags), so that so-called "expression profiling” can be carried out after the hybridization of complex cDNA. It is analyzed in parallel which and how many mRNAs (and thus the cDNAs derived from them) are expressed in a preferably human tissue or a preferably human cell line.
  • This type of array is particularly suitable for comparing several complex cDNAs with one another and thus for identifying comparatively up-regulated or down-regulated genes.
  • Genomic DNA can also be analyzed with this type of array.
  • a quantitative PCR can be used to find out, for example, which genome areas are homozygous or heterozygous dele- with the aim of assigning these areas to a genetic disease.
  • such an array serves for the detection of polymorphisms and thus z.
  • a computer program searches the sequences of the human chromosome 22 available in the databases for restriction sites which are 100 to 300 bp apart.
  • the same program then designs Prime ⁇ aare, each of which already contains one of the two restriction sites mentioned in the primer sequence, but the other restriction control only in the DNA multiplied by the Prime ⁇ aar.
  • Prime ⁇ aare design of these prime-pairs
  • an array of prime-pairs is produced using the methods described here, the individual prime-pairs preferably being in a linear arrangement which corresponds to their position on the human chromosome 22.
  • a highly parallelized PCR is then carried out with such an array as described, typically comparing the results obtained with the genomic DNA of the father, mother and child as a template.
  • the restriction digest results in a precisely defined position by the location of the prime pair. the diffuse courtyard.
  • This courtyard is created by the diffusing, amplified PCR amplificate, for example, stained with ethidium bromide. If only one chromosome codes both restriction sites, a sharply delimited nucleus of carrier-bound PCR amplificate remains within the comparatively weaker diffuse courtyard. If the mentioned second restriction site is missing on both chromosomes, the mentioned courtyard is missing after the restriction digest. If the images of father, mother and child are now graphically superimposed (e.g. by assigning false colors), the chromosomal areas of the child can be assigned very easily and at the same time very precisely to either the father or the mother.
  • the mentioned arrays of prime-pairs can be reused if, after the PCR reaction, the filters are digested with suitable restriction endonucleases and then heated and non-carrier-bound DNA is then washed away.
  • the prerequisite is that the 3 'ends of the primers used contain one of several suitable recognition sequences for the restriction endonucleases mentioned. This method is particularly useful if two different complex templates are compared with one another, whereby comparative quantitative data are to be obtained and, as far as possible, variations in the filter production are to be avoided.
  • a special feature of the arrays mentioned is an unprecedented sensitivity to analysis, since the measuring principle of these arrays is based on the poly merase chain reaction (PCR) based, which is much more sensitive compared to the hybridizations previously used.
  • PCR poly merase chain reaction
  • RNA-dependent DNA polymerase can be used instead for an RNA template.
  • arrays can in principle be used, for example, for the parallel sequencing of complex templates and for highly parallelized polymerase chain reactions. The reaction conditions required are known to the person skilled in the art.
  • two defined ohgonucleotides are synthesized in a site-defined manner.
  • one of the primers of the prime pair can be presented in a significantly smaller amount compared to the other primer, so that predominantly single-stranded DNA is produced after a few propagation cycles. If ddNTPs are added at this stage, a family of single-stranded oligonucleotides is formed, which can be analyzed by mass analysis, for example. sens spectrometer enables sequence determination of the increased template DNA.
  • the analysis of the individual fluorescent points which are assigned to the corresponding location-defined prime pairs can be carried out after the end of the PCR reaction or, in a particularly advantageous manner
  • the mentioned arrays of Prime ⁇ aaren can be reused if, after the PCR reaction, the filters are digested with suitable restriction endonucleases and non-carrier-bound DNA is then washed away.
  • the prerequisite is that the 3'OH ends of the primers used contain one of several suitable recognition sequences for the restriction endonucleases mentioned. This procedure is particularly useful if two different ones complex templates are compared with each other. In such analyzes, comparative quantitative data should be obtained as far as possible and, as far as possible, variations in the filter production should be avoided.
  • a particularly advantageous application of the arrays mentioned results in the almost completely automated parallel diagnosis of many different diseases, in particular infectious diseases with the help of PCR.
  • the reliability of diagnosis for the individual diseases can also be significantly increased by analyzing not just one, but many disease-specific prime pairs.
  • Another particularly advantageous application of the arrays mentioned is to create an expression pattern, in particular a comparative expression pattern.
  • the mRNA of a tissue or a cell line is rewritten in a manner known per se into (highly complex) cDNA, which in turn serves as a template for the arrays mentioned. If these arrays now carry prime pairs which can reproduce human EST sequences (Expressed Sequence Tag), then the EST sequences present in the mRNA or cDNA mentioned are site-defined and increased almost quantitatively.
  • a comparison of tumor tissue with the surrounding normal tissue reveals EST sequences that are comparatively strongly or weakly expressed in the tumor tissue. Due to the tremendous sensitivity of the PCR technique, even weakly expressed genes can be analyzed and comparatively small amounts of templates can be used are used, which means that these filters are far superior to the current state of the art.
  • Another particularly advantageous application of the arrays mentioned is the assignment of homozygous or heterozygous deleted areas to somatic genetic diseases and hereditary diseases. This can be found out using the quantitative PCR described in more detail above. For this purpose, an array with suitable prime-pairs must be used, which duplicate the sequence regions of the genes which encode the ESTs mentioned.
  • a suitable carrier with free amino groups (or hydroxyl groups) is made by standard methods. If not already present in the first step, a suitable linker is synthesized on the free amino groups (or hydroxyl groups) with the aid of standard synthesis familiar to the person skilled in the art under anhydrous conditions.
  • This linker preferably consists of Dde-Fmoc-Lys, one amino group of which is protected by a frnoc protecting group and the other of which is protected by a Dde- Protection group are blocked.
  • the frnoc protecting group is cleaved at 25 ° C. for 10 minutes with 20% piperidine in DMF, ie under conditions in which the Dde protecting group remains stable.
  • one or two RNA phosphoramidites are activated with the aid of tetrazole using techniques known to the person skilled in the art and coupled to the support. A small proportion of less than 5% of the corresponding DNA phosphoramidites can be added during the coupling reaction during the coupling reaction.
  • the support is printed with 4 different toners which contain the 4 different phosphoramidite monomers.
  • the phosphoramidites are activated with the aid of tetrazole, coupled to the support, uncoupled monomers washed away and then the DMTr protective group is cleaved from the 5'OH end of the growing oligonucleotide. Repetition of this process leads to a combinatorial synthesis of oligonucleotides.
  • the DMTr protective group is cleaved from the 5'OH end and the free 5'OH groups, for example crosslinked with crosslinked cellulose acetate or EDTA, or triethylene teframine hexaacetic acid and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide (DCC) under conditions known to the person skilled in the art.
  • DCC triethylene teframine hexaacetic acid and N, N'-dicyclohexylcarbodiimide
  • the prior introduction of an amino group at the 5'OH end is particularly suitable for this. This can be achieved, for example, with the 5 'amino modifier 5 (Eurogentec; # 10190502).
  • RNA phosphoramidites mentioned can be printed on as phosphoramidite clay articles or else distributed uniformly in coupling buffer over the support. As described above, a small proportion of the corresponding DNA phosphoramidites can be added during the coupling reaction during the coupling reaction.
  • an array of oligonucleotides is synthesized and cross-linked at the 5'OH end. Finally, all protective groups are cleaved with ammonia for 45 minutes at 55 ° C to 70 ° C, the support is washed with acetonitrile and dried, so that the end result is a support with different defined areas, each representing a pair of oligonucleotides.
  • the pairs of oligonucleotides represent sequences for the duplication of approximately 50,000 different human ESTs.
  • the 3'0H ends of the ohgonucleotides are cleaved from the support with RNase or cleaved under alkaline conditions.
  • mRNA is obtained using a technique known to the person skilled in the art, this is transcribed into cDNA and used as a complex template for hybridization to the array described under A).
  • thermophilic DNA polymerases are then added in a suitable buffer and the PCR reaction is started.
  • a curve of the PCR reaction is created for each defined Prime ⁇ aar, which enables each of the ESTs defined by the Prime ⁇ aare to be assigned a value characterizing this curve.
  • the values obtained with cDNA from a patient's tumor tissue and the values obtained with cDNA from the surrounding normal tissue are compared with one another. This leads to the identification of genes that are over or under-expressed in the tumor tissue compared to the normal tissue.
  • Another application example is the parallel PCR diagnostics of pathogens.

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Abstract

Zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays von Oligomeren mit freien Enden A, wobei am 5'-OH-Ende der Oligomere eine temporäre Schutzgruppe und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen vorgesehen sind wird vorgeschlagen, dass nach der kombinatorischen Synthese der Oligomere auf den Träger die temporäre Schutzgruppe vom Ende B abgespalten wird, anschiessend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen die freien Enden B quervernetzt werden, dann die kovalente Bindung der synthetisierten Oligomere über das Ende A auf den Träger abgespalten werden kann, so dass freie Enden A entstehen und auch nach der Abspaltung der Enden A vom Träger ein Teil der synthetisierten Oligomere kovalent an den Träger bindet.

Description

Verfaliren und Vorrichtung zur Synthese und Analyse von trägergebundenen Arrays von Oligomeren, insbesondere von Primerpaaren für die PCR, sowie Träger mit Oligomeren
Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Synthese und A- nalyse von träger-gebundenen Arrays von Oligomeren, insbesondere von Primerpaaren für die PCR (Polymerase Chain Reaction - Polymerase Kettenreaktion), sowie Träger mit Oligomeren. Im besonderen betrifft die Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zur parallelen Synthese komplexer Oligomer-, insbesondere Oligonukleotidbibliotheken.
Dabei bezeichnet hier der Begriff "Oligomer-" bzw. "Oligonukleotidbibli- othek" die Gesamtheit von vielen unterschiedlichen, an definierten Orten auf einem Träger gebundenen Oligomeren, -peptiden, -nukleotiden oder -ribonukleotiden, wobei die unterschiedlichen Oligomere bzw. -(ribo)nukleotide möglichst kompakt angeordnet sein sollen. Sol- ehe Molekülbibliotheken entstehen insbesondere durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von Monomeren.
Der Begriff "komplex" bezeichnet Molekülbibliotheken mit mehr als 102 unterschiedlichen Vertretern, insbesondere jedoch Molekülbibliotheken mit mehr als 104 unterschiedlichen Vertretern. Der Begriff "PCR-Array" bezeichnet die Gesamtheit von vielen unterschiedlichen, an definierten Orten auf einem Träger gebundenen Oligo- nukleotidpaaren mit freiem 3'OH-Ende. Diese Primerpaare haben die Eigenschaft geeignete Template DNA zu binden, wodurch unter PCR- Bedingungen ein je nach Primeφaar ortsdefiniert an den Träger gebundenes Amplifikat entsteht.
Es sind eine Reihe von Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Molekülbibliotheken bereits bekannt. Darunter sind Druckverfahren zur kombinatorischen Synthese, bei denen Flüssigkeiten ortsdefiniert auf ei- nen Träger aufgebracht werden. Als Prototyp dieser Verfahren sei hier der Tintenstrahldrucker genannt (Patentanmeldung WO 97 44134 A, Incyte Pharmaceutical Inc., 1997; bzw. US5449754, Nishioka, 1995). Ein weiteres Verfahren zur kombinatorischen Synthese verwendet eine Compact Disc als Träger (WO 98 12559 A, Demers, 1998). Ein weiteres Verfahren verwendet einen ansteuerbaren Chip als Träger (US5667667, Southern, 1996). Ein weiteres Verfahren benützt einen Farblaserdrucker mit modifizierten Toneφartikeln (PCT/DE99/03982). Daneben sind lithographische Methoden bekannt (US5424186, Very large scale immobilized polymer synthesis, Fodor et al, 1991), bei denen sequenziell:
- definierte Orte mit Licht bestrahlt werden
- diese Orte dadurch aktiviert werden für die kovalente Kopplung von Monomeren für die kombinatorische Synthese - diese aktivierten Orte anschließend zusammen mit den nicht-aktivierten Orten in Kontakt mit einem flüssigen Lösungsmittel gebracht werden, in dem geeignete Monomere für die kombinatorische Synthese gelöst sind
- die daraufhin ortsdefiniert an den Träger koppeln können.
- die Wiederholung dieses Vorgangs mit den unterschiedlichen Monomeren führt zunächst zur ortsdefinierten Kopplung einer ersten Schicht von unterschiedlichen Monomeren
- weitere Wiederholungen dieses Vorgangs führen zur ortsdefinierten Kopplung weiterer Schichten von unterschiedlichen Monomeren und da- mit zum ortsdefinierten Aufbau von Oligomeren.
Gleichfalls bekannt sind Verfahren, bei denen Oligonukleotide, insbesondere Primeφaare für die PCR, an einen Träger gekoppelt werden mit dem Ziel emer hochgradig parallelisierbaren PCR (US5641658, US6060288 und US6090592). Der große Vorteil dieser Verfahren liegt darin, dass die Primeφaare kovalent an den Träger gekoppelt sind. Mit den Primem werden auch die PCR-Produkte an den Träger gekoppelt, sodass keine Kreuzkontamination durch Primer oder PCR-Produkte entstehen kann. Dadurch wird erreicht, dass verschiedene PCR Reaktionen nicht durch getrennte Reaktionsräume voneinander abgetrennt werden müssen. Dieses Ziel wird sehr elegant alleine durch die räumlich getrennte Kopplung von Primeφaaren an einen Träger erreicht. Damit bietet sich eine Kombination der Verfahren zur kombinatorischen Synthese von Oligonukleotiden mit den beschriebenen Verfahren einer hochgradig parallelisierbaren PCR an, da die kombinatorische Synthese von Oligonukleotiden besonders dafür geeignet ist große Zahlen von un- terschiedhchen Oligonukleotiden vergleichsweise einfach herzustellen. Das US-Patent US6156494 zeigt auch einen Weg auf, wie eine kombinatorische Synthese durchgeführt werden kann, diesmal mit dem Ziel Arrays von Primeφaaren für die PCR zu erhalten. Als Träger dient in diesem Fall ein Array von Glasfasern.
In den genannten Erfindungen findet aber die Tatsache wenig Beachtung, dass Ohgonukleotide im Besonderen, aber auch andere Arten von Oligomeren eine Polarität aufweisen. Ohgonukleotide besitzen z.B. ein 5'OH-Ende und ein 3'OH-Ende, Peptide besitzen ein amino- und ein carboxyterminales Ende. Diese Polarität gilt auch für jeden einzelnen Baustein des Oligomers, z.B. Nuleotide im Falle der Ohgonukleotide oder Aminosäuren im Falle der Peptide. Ist das Ziel z.B. die kombinatorische Synthese eines Arrays von Primeφaaren für eine nachfolgende PCR, so müssen die an den Träger gebundenen Ohgonukleotide ein freies 3'OH- Ende aufweisen, da sie nur dann als Substrat für eine Polymerase dienen.
Wenig Beachtung findet auch eine allen chemischen Synthesen inhärente Eigenschaft: Keine chemische Synthese läuft in endlicher Zeit vollständig ab. U.a. deshalb werden bei den einzelnen Syntheseschritten bei der Synthese von Oligonukleotiden oder Peptiden (ausgehend von den monome- ren Bausteinen) in der Regel nur Syntheseeffizienzen von 90-96% Ausbeute erreicht. Diese Tatsache ist dem Fachmann bestens bekannt, weswegen normalerweise bei diesen Synthesen ein "Capping" Schritt eingeführt wird. Dabei reagiert der größte Teil der freien (d.h. nicht abreagier- ten) Enden des Festphasen-gekoppelten wachsenden Oligomers mit einem reaktiven "Capping" Molekül (Fig. 7; 29), das im großen Überschuss zugegeben wird. Dadurch wird bewirkt, dass dieses Oligomer nicht mehr an weiteren Syntheseschritten teilnehmen kann. Mit zunehmender Zahl der Syntheseschritte, d.h., je länger das Oligomer wird, liegen immer mehr an den Träger gekoppelte Syntheseartefakte vor, die nach spätestens 30 Synthesezyklen die überwiegende Mehrzahl der hergestellten Moleküle darstellen.
Die vorliegende Erfindung gibt eine verblüffend einfache Lösung an, wie diese Syntheseartefakte in situ und damit hochgradig parallelisiert abge- reinigt werden können. Die Erfindung eignet sich damit zur in situ Reinigung der gewünschten Endprodukte auf einem Träger, insbesondere bei einem komplexen Array. Dies ist in vielen Fällen die Voraussetzung für einen sinnvollen Einsatz von Arrays, da viele beobachtbare Effekte durch Verunreinigungen gestört werden. Die Erfindung bewirkt gleichzeitig, dass die auf dem Träger verankerten Oligomere "umgedreht" werden, so- dass das zunächst am Träger verankerte Ende, insbesondere das 3'OH- Ende eines Oligonukleotids anschließend frei zugänglich für eine geeignete enzymatische Aktivität ist. Damit eröffnet die Erfindung gleichzeitig einen besonders einfachen Weg zur Herstellung von PCR- Arrays (Arrays von Primeφaaren). Ein großer technischer Vorteil ist dabei, dass erfin- dungsgemäß die besonders gut zugänglichen zuletzt an den Träger gekoppelten Bauelemente quervernetzt werden. Damit werden sterische Probleme u.a. durch die u.U. sehr sperrigen Seitenschutzgruppen weitgehend vermieden. Diese erschweren mit zunehmender Länge der auf dem Träger aufgebauten Oligomere msbesondere den Zugang zu dem "Linker", der das Oligomer mit dem Träger verbindet. Dies ist insbesondere dann ein dem Fachmann wohlbekanntes Problem, wenn der "Linker" selbst die entscheidende Rolle beim "Umdrehen" des synthetisierten Oligomers ü- hernehmen muss, wie z.B. in dem US-Patent US5550215: "Polymer re- versal on solid surfaces" beschrieben wird.
Damit soll diese Erfindung insbesondere eine Synthese von Primeφaaren mit freiem 3'-OH-Ende ermöglichen, die für eine nachfolgende PCR Analyse geeignet sind und die als Paar an jeweils einem definierten Ort auf einem Träger durch die kombinatorische Synthese entstehen.
Die meisten der bisher bekannten Festphasen-Synthesemethoden für die Synthese von Oligonukleotiden und die kombinatorische Synthese von Oligonukleotidarrays verankern das wachsende Oligonukleotid mit dem 3'-OH-Ende am Träger, während neue Monomere nach dem Abspalten der temporären Schutzgruppe an das 5'-OH-Ende gekoppelt werden. Nach erfolgter Synthese werden alle Schutzgruppen abgespalten. Bei diesem letzten Schritt entscheidet die Verankerungsweise an den Träger, ob das Oligonuklotid mit seinem 3'-OH-Ende am Träger gebunden bleibt, oder ob es in die lösliche Fraktion übergeht.
Bei emer alternativen Methode werden Monomere verwendet, wo sich die temporäre Schutzgruppe am 3'OH-Ende befindet. Durch den Einsatz die- ser Monomere entstehen Ohgonukleotide mit freiem 3'OH-Ende, die mit ihrem 5'OH-Ende an den Träger binden. Monomere dieser Art für die Oligonukleotidsynthese werden von der Firma Glensearch verkauft (www.glenres.com). Bisher wurden diese Art Monomere v.a. für Spezial- anwendungen wie stabilere Antisense Ohgonukleotide, oder für die Syn- these von parallel aneinander hybridisierenden Doppelsträngen verwendet. Dies liegt u.a. daran, dass diese Monomere sehr teurer sind.
Für die Synthese eines Arrays von Primeφaaren wurden diese Monomere bisher nicht eingesetzt. Es wäre jedoch vorteilhaft, wenn definierte Primeφaare mit jeweils freien 3'-OH-Enden nicht nur an einem definierten Ort fixiert werden könnten, sondern auch gleichzeitig in situ angereinigt, denn damit können z.B. taufende PCR-Reaktionen sehr einfach parallel durchgeführt werden. Der Grund liegt darin, dass dabei die Primer nicht durchmischt werden, sondern ortsdefiniert am Träger fixiert bleiben.
Die bisherigen technischen Verfahren stehen dem jedoch entgegen, denn die synthetisierten Ohgonukleotide binden meist mit ihrem 3'OH-Ende an den Träger. Eine in situ Anreicherung der synthetisierten Oligomere findet dabei nicht statt. Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Synthese bzw. Analyse von Oligomeren auf einem Träger, insbesondere von Primeφaaren für die PCR (Polymerase Chain Reaction - Polymerase Kettenreaktion), sowie verbesserte Trä- ger mit in situ gereinigten Oligomeren anzugeben.
Die Aufgabe wird gelöst von Verfahren bzw. Vorrichtungen mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche. Vorteilhafte Durch- bzw. Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung einiger Beispiele in Verbindung mit der Zeichnung. Es zeigen jeweils schematisch
Fig. la das Abspalten der temporären Schutzgruppen 4 am 5'-
OH-Ende 5 der Ohgonukleotide 2 nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an be- stimmten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2,
Fig. lb die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den nun freien 5'-OH-Enden 5 der Ohgonukleotide 2,
Fig. 2a das Abspalten einer von der ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedlichen zweiten nicht- permanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9, wodurch auf dem Träger eine reaktive Gruppe 22 entsteht, Fig. 2b den Aufbau eines zweiten Arrays von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2 auf der reaktiven Gruppe 22 mittels kombinatorischer Synthese,
Fig. 3a die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien 5'-OH-Enden 5 des zweiten Arrays von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2, wodurch ein Array von Primeφaaren 21 definierter Sequenz entsteht, die jeweils ortsgenau definiert sind,
Fig. 3b das Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6, wobei durch die Wahl geeigneter "Handies" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Ohgonukleotide 2 mit freiem 3'- OH-Ende 3 vorliegt,
Fig. 4a das Hybridisieren von Template-DNA 23 an genau definierten Orten 10 an einen komplementären Primer 2, wo- bei eine DNA-Polymerase ausgehend vom 3'OH-Ende 3 des Primers 2 den Gegenstrang 26 synthetisiert und ein regulierbarer Heizblock 11 die Hybridisierungstempera- tur, die Temperatur für die DNA-Polymerisation und die Temperatur für das Aufschmelzen des DNA- Doppelstrangs liefert,
Fig. 4b das Hybridisieren des an das 3'OH-Ende 3 des Primers 2 synthetisierten DNA-Einzelstrangs 26 nach dem Auf- schmelzen des DNA-Doppelstrangs an den komplementären Gegenstrangprimer 24,
Fig. 4c die Bildung eines doppelsträngigen PCR-Produktes 27 nach einer erneuten DNA-Polymerisation,
Fig. 4d den Einbau oder das Einlagern eines zum Nachweis des
PCR-Produktes 27 dienenden Fluoreszenzfarbstoffs 25 in das ortsgenau definiert entstandene PCR-Produkt 27, das durch weitere PCR-Zyklen vermehrt werden kann,
Fig. 5a + 5b ein Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Ar- rays 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH-Enden 3, wobei (Fig. 5, I.) nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe 4 vom 5'OH-Ende 5 abgespalten wird und anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 die freien 5'OH-Enden 5 quervernetzt werden, worauf (Fig. 5, II.) die kovalente Bindung 8 über das 3'OH-Ende der synthetisierten Ohgonukleotide an den Träger 9 bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Ohgonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 ab- gespalten wird, so dass freie 3'OH-Enden 3 entstehen und nach der Abspaltung dieser 3'OH-Enden 3 vom Träger 9 ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Ohgonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 aufgrund der Quervernetzungen 7 am 5'OH-Ende 5 kovalent an den Träger 9 binden kann,
Fig. 6 eine Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-
Reaktionen, bei welcher der metallische Heizblock 11 planar gefräst und zwischen einer Detektionseinheit 17 und einem Array 1 von Oligonukleotiden 2 ein Fluoreszenzlichtfilter 18 vorgesehen ist, der Anregungslicht 14 ausblendet, aber emittiertes Fluoreszenzlicht 19 passieren lässt.
Fig. 7a die Synthese eines an einem Träger 9 bei 8 gebundenen
Oligonukleotids 2 und das Abspalten einer ersten temporären Schutzgruppe 4. Dabei entsteht eine freie 5'OH- Gruppe. Der bei der Synthese entstandene am Träger 9 gebundene Synthese Artefakt 28 wurde während der Synthese mit einem "cap" 29 versehen,
Fig. 7b die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien
5'OH-Enden 5. Aufgrund des "caps" 29 an dem 5'OH- Ende 5 wird der Synthese Artefakt 28 dabei nicht mit quervernetzt,
Fig. 7c das Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 und die
(partielle) Abspaltung der Verbindung des Oligonukleotids 2 zum Träger 9, wobei durch die Wahl geeigneter "Handies" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Ohgonukleotide 2 mit freiem 3'OH-Ende 3 vorliegt. Da der Synthese Artefakt 28 danach nicht mehr kovalent an den Träger 9 gekoppelt ist, kann er weggewaschen werden. Dadurch kommt es zu einer (partiellen) in situ Reinigung des Oligonukleotids 2.
Um eine klare Sprache zu ermöglichen, ist in der Beschreibung der Fig. 1 bis Fig. 7 nur von Oligonukleotiden (2) die Rede. Die Beschreibung gilt aber genauso für andere Oligomere (2), wie auch schon aus der Beschrif- tungstabelle ersichtlich. Es gibt viele kombinatorische Synthesen, wo die unterschiedlichen Monomere jeweils zwei unterscheidbare Enden A (3) und B (5) haben. Bei Nukleontiden sind das das 3'OH-Ende und das 5'OH-Ende, bei Aminosäuren die COOH Gruppe und die NH2 Gruppe, bei anderen Monomeren sind es wieder andere Gruppen. Die Erfindung bezieht sich auf alle diese unterschiedlichen kombinatorischen Synthesen.
Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass die Erfindung nicht nur die Synthese von Oligonukleotiden (2) mit freiem 3'OH-Ende (3) ermöglicht, sondern darüber hinaus die in situ Reinigung von Träger gebundenen Oligomeren (2). Je länger ein Oligomer bei der kombinatorischen Synthese wird, um so mehr trägergebundene Synthese Artefakte 28 entstehen (dargestellt in Fig. 7), die den bei weitem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere ausmachen können. Dies stört bei sehr vielen Anwendungen, denn man möchte eine Bindung oder einen anderen beob- achtbaren Effekt dem definierten Oligomer, dessen Sequenz bekannt ist und nicht einem Undefinierten Artefakt zuschreiben. Meistens entstehen diese Synthese Artefakte 28 dadurch, dass nach der Abspaltung der temporären Schutzgruppen (4) nicht alle reaktiven Gruppen mit einem neuen Monomer abreagieren. Diese werden deswegen normalerweise "gecapt" 29 bevor ein neuer Kopplungszyklus mit dem Abspalten der temporären Schutzgruppe (4) beginnt. Durch das "cappen" 29 aber verlieren die Synthese Artefakte 28 ihre reaktive Gruppe, womit sie auch nicht quervernetzt (7) werden können. Wenn schließlich nach der Quervernetzung (7) ein Teil (vorzugsweise ein sehr großer Teil) der Enden A (3) vom Träger abgespalten wird (Fig. 3b) wird derselbe Anteil von Synthese Artefakten 28 abgespalten. Da diese nicht quervernetzt (7) sind, binden sie nicht mehr an den Träger (9) und können weggewaschen werden.
Um die Synthese von an einem Träger fixierten definierten Primeφaaren 21 mit jeweils freiem 3'-OH-Enden an einem definierten Ort zu erreichen, werden die nach dem Stand der Technik bekannten kombinatorischen Synthesen wie folgt geändert (siehe Fig. 1 , Fig. 2 und Fig. 3).
Wie in den Fig. la und lb schematisch angedeutet ist, werden in einem ersten Schritt nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an bestimmten, genau definierten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2 die temporären Schutzgruppen 4 (ein Beispiel für eine solche Schutzgruppe ist 4',4,-Dimethoxytritylchlorid (DMTr)) am 5'-OH-Ende 5 der Ohgonukleotide 2 abgespalten und anschließend die nun freien 5'-OH-Enden 5 über Quervernetzungen 7 quervernetzt. Dies geschieht in an sich bekannter Weise.
Wie in den Fig. lb und Fig. 2a schematisch dargestellt, wird anschließend in einem zweiten Schritt eine von der genannten ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedliche zweite nicht-permanente Schutzgruppe 20 (z.B. 2-Acetyl-5, 5-dimethyl-l, 3-cyclohexandion, (Dde)) auf dem Träger 9 abgespalten. Dies geschieht ebenfalls in an sich bekannter Weise. Die zweite nicht-permanente Schutzgruppe 20 kann während des genannten Quervernetzens der freien 5'-OH-Enden eingeführt werden oder aber schon vor der Synthese des ersten Arrays 1 von an bestimmten Orten 10 gebundenen Oligonukleotiden 2 auf den Träger 9 aufgebracht worden sein.
In einem dritten, in den Fig.2a und 2b sowie Fig. 3a schematisch dargestellten Schritt entsteht durch die Abspaltung der zweiten nicht- permanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9 eine reaktive Gruppe 22 (z.B. eme Hydroxylguppe oder eine Aminogruppe) auf der mit Hilfe von bekannten kombinatorischen Synthesen ein zweites Array von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2 aufgebaut werden kann, dessen freie 5'- OH-Enden 5 wie oben beschrieben quervernetzt werden (Quervernetzun- gen 7). Dadurch entsteht ein Array von Primeφaaren 21 definierter Sequenz, die jeweils ortsgenau definiert sind.
Anschließend werden, wie in Fig. 3b angedeutet, in einem vierten Schritt in an sich bekannter Weise die permanenten Schutzgruppen 6 abgespal- ten, wobei durch die Wahl geeigneter "Handies" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Ohgonukleotide 2 nun mit freiem 3'-OH-Ende 3 vorliegen. Die weitere Verankerung 8 der Ohgonukleotide 2 wird dabei vorzugsweise durch unvollständige Abspaltung der genannten Handies 8 erreicht, z.B. durch Derivatvisieren des Trägers 9 mit einem Gemisch von Handies 8, deren einer Teil unter den gewählten Bedingungen abgespalten wird, während ein vorzugsweise kleinerer Anteil der Handies 8 unter den gewählten Bedingungen kovalent mit dem Träger 9 verbunden bleibt.
Diese erfindungsgemäßen Verfahren haben unter anderem den Vorteil,
- dass anstelle eines Arrays von jeweils einzelnen ortsgenau definierten Oligonukleotiden ein Array von definierten Oligonukleotid- Paaren entsteht,
- dass die Ohgonukleotide anstelle eines freien 5'-OH-Endes freie 3'- OH-Enden besitzen und somit ein template-abhängiges potentielles Substrat für DNA-Polymerasen darstellen,
- dass eine in situ Anreinigung der definierten Ohgonukleotide stattfindet.
Insbesondere letztgenannte Anreinigung der lediglich bespielhaft und nicht beschränkend genannten Ohgonukleotide hat in der Praxis große Vorteile und kann problemlos statt bei Oligonukleotiden auch bei anderen Oligomeren, wie z.B. RNA oder Peptiden, angewendet werden. So hat bei den bislang bekannten Verfahren die Mehrzahl der Synthese Artefakte 28 kein freies 5'-OH-Ende und wird somit bei dem oben beschriebenen ersten Schritt bei 7 nicht quervernetzt. Beim beschriebenen vierten Schritt wird jedoch zusammen mit den am 5'OH-Ende quervernetzten Oligonukleotiden auch der größte Teil der Synthese Artefakte 28 abgespalten und kann anschließend vom Träger weggewaschen werden.
Die beschriebenen Primeφaare 21 können einer ortsgenau definierten „Festphasen-PCR" dienen. Verglichen mit herkömmlichen PCR- Verfahren können dabei sehr einfach tausende von PCR-Reaktionen in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Fig. 4a zeigt, wie Template- DNA 23 an genau definierten Orten 10 an einen komplementären Primer 2 hybridisiert. Eine DNA-Polymerase synthetisiert den Gegenstrang 26 ausgehend vom 3'OH-Ende 3 des Primers 2. Ein regulierbarer Heizblock 11 liefert die zur Hybridisierung, zur DNA-Polymerisation und zum Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs jeweils benötigte Wärme. Um steri- sehe Probleme zu vermeiden, die durch die doppelhehcale Struktur der DNA auftreten können, kann der Festphasen-PCR eine vorzugsweise thermostabile enzymatische Aktivität (z. B. eine Helikase, eine Gyrase oder Topoisomerase zusammen mit ATP) beigefügt werden, die superhe- licale Verdrillungen auflöst. Dies gilt insbesondere für Festphasen-PCRs, bei denen längere DNA-Bereiche vervielfältigt werden.
In Fig. 4b ist gezeigt, wie nach dem Aufschmelzen des DNA- Doppelstrangs der wie in Fig.4a gezeigt an das 3'OH-Ende 3 des Primers 2 synthetisierte DNA-Einzelstrang 26 an den komplementären Gegen- strangpπmer 24 hybridisiert.
Fig. 4c veranschaulicht die Bildung eines doppelsträngigen PCR- Produktes 27 nach einer erneuten DNA-Polymerisation.
Ein zum Nachweis des ortsgenau definiert entstandenen PCR-Produktes 27, das durch weitere PCR-Zyklen vermehrt werden kann, dienender Fluoreszenzfarbstoff 25 kann wie in Fig. 4d angedeutet eingebaut oder eingelagert werden.
Mit Bezug auf Fig.5 wird nachfolgend ein Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Arrays 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH- Enden 3 beschrieben.
Wie in Fig. 5a gezeigt, wird nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe 4 vom 5'OH-Ende 5 abgespalten. Anschließend werden noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 die freien 5'OH-Enden 5 durch Quervernetzungen 7 verbunden.
Anschließend wird wie in Fig. 5b gezeigt die kovalente Bindung 8 über das 3'OH-Ende der synthetisierten Ohgonukleotide an den Träger 9 bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Ohgonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 abgespalten, so dass freie 3'OH-Enden 3 entstehen. Nach der Abspaltung dieser 3'OH-Enden 3 vom Träger 9 bindet ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Ohgonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 aufgrund der genannten Querveraetzung 7 am 5'OH-Ende 5 kovalent 8 an den Träger 9.
Die Fig.6 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen, bei welcher der in den meisten handelsüblichen PCR- Maschinen vorhandene metallische Heizblock 11 planar gefräst wurde, so dass ein enger Kontakt 12 mit einem planaren Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH-Enden 3 entstehen kann. Bei der Anwendung einer solchen Vorrichtung wird ein Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit einer auswechselbaren, durchsichtigen, insbesondere auch für UV-Licht durch- sichtigen planaren Folie oder Scheibe 13 abgedeckt, die auf dem Array 1 fixiert werden kann, so dass die Verdunstung des Reaktionspuffers vermieden wird.
Um nun einen parallelen Nachweis der bei den PCR-Reaktionen entstandenen doppelsträngigen DNA 25 zu ermöglichen, wird das genannte Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit Anregungslicht 14 bestrahlt, das im besonderen Maße dafür geeignet ist, den mit der gebildeten doppelsträngigen DNA 25 assoziierten Fluoreszenzfarbstoff 15 anzuregen. Die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs 15 geschieht durch eine über dem Array 1 von Oligonukleotiden 2 montierte Anregungslichtquelle 16.
Zwischen der Detektionseinheit 17, die in besonders vorteilhafter Weise aus einer digitalen Kamera besteht, und dem genannten Array 1 von Oligonukleotiden 2 ist ein Fluoreszenzlichtfilter 18 montiert, der das Anre- gungslicht 14 ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht 19 passieren lässt.
Die von der Detektionseinheit 17 erfassten Daten werden auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bild- analyse unterzogen. Die beschriebene Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen eignet sich in besonderer Weise zur parallelisierten "online" Detektion von PCR-Reaktionen.
Die Fig. 7 beschreibt schematisch die m situ Reinigung von am Träger 9 bei 8 gebundenen Oligomeren 2. Der bei der Synthese entstandene am Träger 9 bei 8 gebundene Synthese Artefakt 28 wurde während der Synthese mit einem "cap" 29 versehen, so dass dieses Molekül 28 nicht an der Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien Enden 5 teilnehmen kann. Nach dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 und der (partiellen) Abspaltung der Verbindung 8 des Oligomers 2 zum Träger 9 kann der Synthese Artefakt 28 weggewaschen werden, Dadurch kommt es zu einer (partiellen) in situ Reinigung des Oligomers 2. Der Prozentsatz am Träger 9 bei 8 gebundener Oligomere 2 und damit auch der Reinigungsgrad wird dabei durch die Wahl der "Handies" 8 bestimmt. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass sich diese in situ Reini- gungsmethode für alle kombinatorischen Synthesen eignet.
Nachfolgend werden eine erfindungsmäßige Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen mit Hilfe eines Arrays von Oligonukleoti- den mit freien 3'OH-Enden und die Anwendung einer solchen Vorrichtung beschrieben.
Die Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen basiert auf im wesentlichen handelsüblichen PCR-Maschinen, die wie im folgenden beschrieben verändert werden, um eine besonders vorteilhafte, weil sehr einfache Analyse von vielen PCR-Reaktionen gleichzeitig zu ermöglichen:
a) Der in den meisten handelsüblichen PCR-Maschinen vorhandene metallische Heizblock wird planar gefräst, wodurch ein enger Kontakt mit einem planaren Array von Oligonukleotiden mit freien 3OH-
Enden ermöglicht wird.
b) Das genannte Array von Oligonukleotiden wird mit einer auswechselbaren, durchsichtigen, insbesondere auch für UV-Licht durchsichtigen planaren Folie oder Scheibe abgedeckt, die auf dem Array fixiert werden kann, so dass die Verdunstung des
Reaktionspuffers vermieden wird.
c) Zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen wird das genannte Array von Oligonukleotiden mit Anregungslicht bestrahlt, insbesondere mit UV-Licht, das im besonderen Maße dafür geeignet ist, einen Fluores- zenzfarbstoff, insbesondere Etliidiumbromid anzuregen. d) Die genannte Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs geschieht durch eine über dem genannten Array von Oligonukleotiden montierte Anregungslichtquelle .
e) Zwischen der Detektionseinheit, die in besonders vorteilhafter Weise aus einer digitalen Kamera besteht und dem genannten Array von Oligonukleotiden wird ein Fluoreszenzlichtfilter montiert, der das Anregungslicht ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht passieren lässt.
f) Die von der genannten Detektionseinheit erfassten Daten werden auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bildanalyse unterzogen.
Nachfolgend werden erfindungsgemäß produzierte Arrays von Oligonukleotiden mit freien 3OH-Enden zur parallelen Analyse von PCR- Reaktionen und deren mögliche Anwendungen beschrieben.
Erfindungsmäßig produzierte Materialien beinhalten die mit den genannten Verfahren, Materialien oder Vorrichtungen produzierten Molekülbibliotheken, insbesondere Oligonukleotidbibliotheken mit freien 3'OH- Enden. Kennzeichen dieser Oligonukleotidbibliotheken ist,
- dass sie durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von geeigneten Nukleosid-Monomeren entstanden sind, - dass sie als 2-dimensionales Array auf einem geeigneten derivatisier- ten Träger vorliegen, wobei die einzelnen Bestandteile der O- lignukleotidbibliothek ortsgenau zugeordnet werden können (die Dervatisierung des Trägers erfolgt dabei in an sich bekannter Wei- se),
- dass sie ein freies 3'OH-Ende haben, das nach der Hybridisierung von Template-DNA Substrat von template-abhängigen DNA-Poly- merasen ist,
- dass vorzugsweise zwei definierte Ohgonukleotide pro definiertem Ort synthetisiert wurden.
Die genannten Oligonukleotidbibliotheken dienen zur sehr einfachen PCR-Analyse, insbesondere von komplexen Templategemischen.
Dabei vervielfältigen bei einer Art von Arrays die darauf synthetisierten Primeφaare geeigneter Sequenz Bereiche von vorzugsweise einer Viel- zahl von verschiedenen Genen von Pathogenen, so dass gleichzeitig diagnostiziert werden kann, ob eine Infektion mit einem dieser Pathogene vorliegt oder nicht. Um sterische Probleme zu vermeiden, die durch die doppelhehcale Struktur der DNA auftreten können, wird der Festphasen-PCR eine vorzugsweise thermostabile enzymatische Aktivität (z. B. eine Heli- käse, eine Gyrase oder Topoisomerase zusammen mit ATP) beigefügt, die superhelicale Verdrillungen auflöst. Beispielsweise können auf einem Array mit lO3 verschiedenen Primeφaaren 1000 Infektionskrankheiten mit jeweils 100 verschiedenen Primeφaaren abgedeckt werden, darunter nahezu alle bekannten human-pathogenen Virusgenome (z.B. Hepatitis A, B, C, HIV, Papillomviren, Rhinovieren, Grippeviren etc.), Bakteriengenome (z.B. Helicobacter pylori, Haemophi- lus influenza, E.coli etc.) und die Genome verschiedener humanpathoge- ner Einzeller (z.B. Entamoebae histolitica, Plasmodium, Trypanosomen etc.).
Bei einer anderen Art von Arrays vervielfältigen die darauf synthetisierten Primeφaare geeigneter Sequenz Bereiche von vorzugsweise möglichst vielen menschlichen Ersts (Expressed Sequence Tags), so dass nach der Hybridisierung von komplexer cDNA ein sogenanntes "Expression Profi- ling" durchgeführt werden kann. Dabei wird parallel analysiert, welche und wie viele mRNAs (und damit die davon abgeleiteten cDNAs) in ei- nem vorzugsweise mensclilichen Gewebe oder einer vorzugsweise menschlichen Zelllinie exprimiert werden. Insbesondere eignet sich diese Art von Arrays für den Vergleich mehrerer komplexer cDNAs untereinander und damit für die Identifizierung von vergleichsweise hochregulierten oder herunterregulierten Genen.
Mit einer solchen Art von Array kann auch genomische DNA analysiert werden. Dabei kann mit Hilfe einer quantitativen PCR z.B. herausgefunden werden, welche Genombereiche homozygot oder heterozygot dele- tiert sind, mit dem Ziel diese Bereiche wiederum einer genetischen Erkrankung zuzuordnen.
In emer anderen Anwendung dient ein solches Array zum Nachweis von Polymoφhismen und damit z. B. zur Feinkartierung von Krankheitsgenen. Ein Computeφrogramm sucht die in den Datenbanken verfügbaren Sequenzen des humanen Chromosoms 22 nach Restriktionsstellen ab, die 100 bis 300 Bp voneinander entfernt sind. Dasselbe Programm entwirft anschließend Primeφaare, die jeweils eine der genannten zwei Restriktionsstellen bereits in der Primersequenz enthalten, die jeweils andere Re- striktionssteüe jedoch nur in der durch das Primeφaar vervielfältigten DNA. Mit vielen dieser Primeφaare wird mit den hier beschriebenen Methoden ein Array von Primeφaaren hergestellt, wobei die einzelnen Primeφaare vorzugsweise in einer linearen Anordnung vorliegen, die ihrer Lage auf dem menschlichen Chromosom 22 entspricht.
Mit einem solchen Array wird anschließend wie beschrieben eine hochgradig parallelisierte PCR durchgefühlt, wobei typischerweise die Ergebnisse verglichen werden, die mit der genomischen DNA des Vaters, der Mutter und des Kindes als Template erzielt werden.
Befindet sich im Bereich der jeweils zweiten Restriktionsstelle ein geneti- scher Polymoφhismus, so kann dieser sehr einfach durch den Verdau mit dem entsprechenden Restriktionsenzym nachgewiesen werden Codieren beide Chromosomen jeweils beide Restriktionsstellen, so entsteht beim Restriktionsverdau ein durch die Lage der Primeφaare ortsgenau definier- ter diffuser Hof. Dieser Hof entsteht durch das wegdiffundierende, beispielsweise mit Ethidiumbromid gefärbte PCR-Amplifikat. Codiert nur ein Chromosomen jeweils beide Restriktionsstellen, so bleibt innerhalb des vergleichsweise schwächeren diffusen Hofs ein scharf abgegrenzter Kern Träger-gebundenen PCR-Amplifikats zurück. Fehlt die genannte zweite Restriktionsstelle auf beiden Chromosomen, so fehlt der genannte Hof nach dem Restriktionsverdau. Werden nun die Bilder von Vater, Mutter und Kind graphisch überlagert (z. B. durch die Zuweisung von Falschfarben), so können die chromosomalen Bereiche des Kindes sehr einfach und gleichzeitig sehr genau entweder dem Vater oder der Mutter zugeordnet werden.
Die genannten Arrays von Primeφaaren können wiederverwendet werden, wenn nach erfolgter PCR-Reaktion die Filter mit geeigneten Restrik- tionsendonukleasen verdaut und dann erhitzt werden und nicht-träger- gebundene DNA anschließend weggewaschen wird. Voraussetzung ist, dass die 3 '-Enden der verwendeten Primer eine von mehreren geeigneten Erkennungssequenzen für die genannten Restriktionsendonukleasen enthalten. Dieses Verfahren ist insbesondere dann sinnvoll, wenn zwei verschiedene komplexe Templates miteinander vergleichen werden, wobei vergleichende quantitative Daten erhalten werden sollen und somit möglichst Variationen in der Filteφroduktion vermieden werden sollen.
Besonderes Kennzeichen der genannten Arrays ist eine bisher unerreichte Analyseempfindlichkeit, da das Messprinzip dieser Arrays auf der Poly- merasenkettenreaktion (PCR) basiert, die verglichen mit den bisher verwendeten Hybridisierungen wesentlich empfindlicher ist.
Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung eines Arrays von Oligonukleotiden mit jeweils freien 3'OH-Enden. Wird Template- DNA an ein solches Array von Oligonukleotiden hybridisiert, so kann der entstehende Komplex aus träger-gebundenem Oligonukleotid und Template-DNA als Substrat für DNA-abhängige DNA-Polymerasen dienen. Bei einem RNA-Template kann stattdessen eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet werden. Damit können solche Arrays prin- zipiell beispielsweise für das parallele Sequenzieren komplexer Templates und oder für hochgradig parallelisierte Polymerasenkettenreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann sind die dabei benötigten Reaktionsbe- dingungen bekannt.
Für den Fall der Analyse von hochgradig parallelisierten Polymerasenket- tenreaktionen ist es besonders vorteilhaft, wenn wie oben beschrieben statt eines definierten Oligonukleotids zwei definierte Ohgonukleotide ortsdefiniert synthetisiert werden. Dabei kann insbesondere für das anschließende parallele Sequenzieren komplexer Templates jeweils einer der Primer des Primeφaares verglichen mit dem anderen Primer in deut- lieh geringerer Menge vorgelegt werden, so dass nach einigen Vermehrungszyklen überwiegend einzelsträngige DNA produziert wird. Werden in diesem Stadium ddNTPs zugegeben, so entsteht eine Schar von ein- zelsträngigen Oligonukleotiden, die z.B. durch ihre Analyse im Mas- senspektrometer eine Sequenzbestimmung der vermehrten Template DNA ermöglicht.
Mit Hilfe eines Primelpaars kann sehr einfach die für die PCR-typische hohe Spezifität erreicht werden, während ein einziger Primer zumin- destens bei einem komplexen Gemisch von Templates einen großen Anteil von Artefakten ergeben würde.
Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Tatsache, dass bei den genannten Arrays die Primer an den Träger fixiert sind, denn dies erst ermöglicht die parallele Analyse vieler PCR-Reaktionen gleichzeitig in einem Reaktions- gefäß, da das ansonsten resultierende Primelgemisch zu unvorhersagbaren Amplifikaten führen würde. Dieses Design ermöglicht es sogar, die eingesetzte Template-DNA nach einem oder wenigen PCR-Zyklen wegzuwa- schen, so dass auch die dabei neu entstandene Template-DNA nur noch in trägergebundener Form vorliegt. Damit wird der Anteil von PCR- Artefakten weiter reduziert.
Die Analyse von hochgradig parallelisierten Polymerasenkettenreaktionen erfolgt zweckmäßiger Weise mit der weiter oben beschriebenen erfindun- gemäßen Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen.
Die Analyse der einzelnen fluoreszierenden Punkte, die den ent- sprechenden ortsdefinierten Primeφaaren zugeordnet werden, kann nach dem Ende der PCR-Reaktion erfolgen oder, in besonders vorteilhafter
Weise, "online" mit der genannten erfindungsmäßen Vorrichtung zur pa- rallelen Analyse von PCR-Reaktionen. Auch dabei werden die einzelnen fluoreszierenden Punkte den entsprechenden ortsdefinierten Primeφaaren zugeordnet, allerdings ergibt dieses Verfahren für jedes ortsdefinierte Primeφaar eine Verlaufskurve der PCR-Reaktion, so dass die PCR- Reaktion eines jeden Primeφaars quantifiziert werden kann.
Dabei kann in besonders vorteilhafter Art und Weise die Tatsache ausgenutzt werden, dass freie Nukleotide oder einzelsträngige DNA wie die genannten Oligonukleotidprimer ein wesentlich schwächeres Fluoreszenzsignal mit eingelagertem Ethidiumbromid ergeben als doppelsträngige DNA.
Daneben gibt es weitere dem Fachmann bekannte Verfahren zur Quantifizierung von PCR-Reaktionen, die ebenfalls auf dem Einbau oder der Einlagerung von Fluorochromen in die bei der PCR-Reaktion gebildete doppelsträngige DNA beruhen. Nicht zuletzt gibt es auch die Möglichkeit, direkt die Absoφtionsänderung zu verfolgen, die bei der Umwandlung von Mononukleotiden in eine doppelsträngige DNA erfolgt.
Die genannten Arrays von Primeφaaren können wiederverwendet werden, wenn nach erfolgter PCR-Reaktion die Filter mit geeigneten Restrik- tionsendonukleasen verdaut werden und nicht-träger-gebundene-DNA anschließend weggewaschen wird. Voraussetzung ist, dass die 3'OH- Enden der verwendeten Primer eine von mehreren geeigneten Erkennungssequenzen für die genannten Restriktionsendonukleasen enthalten. Dieses Verfahren ist insbesondere dann sinnvoll, wenn zwei verschiedene komplexe Templates miteinander verglichen werden. Bei solchen Analysen sollen möglichst vergleichende quantitative Daten erhalten und somit möglichst auch Variationen in der Filteφroduktion vermieden werden.
Eine besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays ergibt sich bei der nahezu vollkommen automatisierten parallelen Diagnose sehr vieler unterschiedlicher Krankheiten, insbesondere von Infektionskranklieiten mit Hilfe der PCR. Dabei kann außerdem die Diagnosesicherheit für die einzelnen Krankheiten deutlich erhöht werden, indem nicht nur ein, sondern viele krankheitsspezifische Primeφaare analysiert werden.
Eine weitere besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays liegt im Erstellen eines Expressionsmusters, insbesondere eines vergleichenden Expressionsmusters. Dabei wird die mRNA eines Gewebes oder einer Zellinie in an sich bekannter Weise in (hochkomplexe) cDNA umgeschrieben, die wiederum als Template für die genannten Arrays dient. Wenn diese Arrays nun Primeφaare tragen, die menschliche EST- Sequenzen (Expressed Sequence Tag) vervielfältigen können, so werden die in der genannten mRNA oder cDNA vorliegenden EST-Sequenzen ortsdefiniert und nahezu quantitativ vermehrt. Insbesondere ein Vergleich von Tumorgewebe mit dem umliegenden Normalgewebe ergibt dabei EST-Sequenzen, die m dem Tumorgewebe vergleichsweise stark oder schwach exprimiert sind. Dabei sind auf Grund der ungeheuren Sensitivi- tät der PCR-Technik auch schwach exprimierte Gene einer Analyse zugänglich und es können vergleichsweise winzige Mengen an Template eingesetzt werden, wodurch diese Filter dem jetzigen Stand der Technik weit überlegen sind.
Eine weitere besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays ist die Zuordnung von homozygot oder heterozygot deletierten Bereichen zu somatischen genetischen Erkrankungen und Erbkrankheiten. Dies kann mit Hilfe der oben näher beschriebenen quantitativen PCR herausgefunden werden. Dazu muss ein Array mit geeigneten Primeφaaren verwendet werden, die Sequenzbereiche der Gene vervielfältigen, die die genannten ESTs kodieren.
Nachfolgend sind einige Beispiele der Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren bzw. der Anwendung erfindungsgemäßer Vorrichtungen beschrieben:
A) Synthese eines Arrays von Primeφaaren mit jeweils freien 3'OH- Enden auf einem Träger mit Hilfe eines umgebauten Farb- laserdruckers.
Ein geeigneter Träger mit freien Aminogruppen (oder Hydroxylgruppen) wird mit Standardmethoden hergestellt. Dabei wird, falls nicht schon durch den ersten Schritt vorhanden, an die freien Aminogruppen (oder Hydroxylgruppen) mit Hilfe von dem Fachmann geläufiger Standardsyn- these unter wasserfreien Bedingungen ein geeigneter Linker synthetisiert.
Vorzugsweise besteht dieser Linker aus Dde-Fmoc-Lys, dessen eine A- minogruppe durch eine frnoc- Schutzgruppe, die andere durch eine Dde- Schutzgruppe blockiert sind. Die frnoc-Schutzgruppe wird bei 25°C für 10 Minuten mit 20% Piperidin in DMF abgespalten, d.h. unter Bedingungen, bei denen die Dde-Schutzgruppe stabil bleibt. Anschließend werden mit dem Fachmann bekannten Techniken ein oder zwei RNA- Phosphoramidite mit Hilfe von Tetrazol aktiviert und an den Träger gekoppelt. Dabei kann während der Kopplungsreaktion ein kleiner Anteil von unter 5% der entsprechenden DNA-Phosphoramidite während der Kopplungsreaktion beigemengt werden.
Nach dem Abspalten der DMTr- Schutzgruppe vom 5'OH-Ende der an den Träger gekoppelten Ribonukleosid-Monomere, wird der Träger mit 4 verschiedenen Tonern bedruckt, die die 4 verschiedenen Phosphoramidit- Monomere enthalten. Die Phosphoramidite werden mit Hilfe von Tetrazol aktiviert, an den Träger gekoppelt, ungekoppelte Monomere weggewaschen und anschließend die DMTr- Schutzgruppe vom 5'OH-Ende des wachsenden Oligonukleotids abgespalten. Eine Wiederholung dieses Vorgangs führt zu emer kombinatorischen Synthese von Oligonukleotiden.
Die Kopplung der aktivierten Phosphoramidite (mit Schutzgruppen) an den Träger, das Abspalten der Schutzgruppen und die Waschschritte fin- den dabei unter den dem Fachmann bekannten Standardbedingungen für die Oligonukleotidsynthese statt.
Nachdem so ein erstes Array von Oligonukleotiden synthetisiert wurde, wird am Ende die DMTr-Schutzgruppe vom 5'OH-Ende abgespalten und die freien 5'OH-Gruppen z.B. mit quervernetztem Cellulose Acetat, oder EDTA, oder Triethylenteframinhexaessigsäure und N, N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) mit dem Fachmann bekannten Bedingungen quervernetzt. Insbesondere eignet sich dafür die vorherige Einfüh- rung einer Aminogruppe am 5'OH-Ende. Dies kann z.B. mit dem 5' Ami- no Modifier 5 (Eurogentec; #10190502) erreicht werden.
Anschließend wird die genannte Dde-Schutzgruppe bei 25°C mit 2% Hydrazin in DMF für 10 Minuten abgespalten und wie oben beschrieben zunächst em oder zwei RNA-Phosphoramidite an die Aminosäure des genannten Lysin-Linkers synthetisiert. Dabei können die genannten RNA- Phosphoramidite als Phosphoramidit-Toneφartikel aufgedruckt oder aber gleichmäßig in Kopplungspuffer über den Träger verteilt werden. Wie oben beschrieben kann während der Kopplungsreaktion ein kleiner Anteil der entsprechenden DNA-Phosphoramidite während der Kopplungsreak- tion beigemengt werden.
Erneut wird wie oben beschrieben ein Array von Oligonukleotiden synthetisiert und am 5'OH-Ende quervernetzt. Schließlich werden alle Schutzgruppen mit Ammoniak für 45 Minuten bei 55°C bis 70°C abgespalten, der Träger mit Acetonitril gewaschen und getrocknet, so dass im Endeffekt ein Träger mit verschiedenen definierten Bereichen entsteht, die jeweils ein Paar von Oligonukleotiden repräsentieren. Im gegebenen Beispiel repräsentieren die Paare von Oligonukleotiden Sequenzen für die Vervielfältigung von ca 50.000 verschiedenen menschlichen ESTs. In ei- nem letzten Schritt werden die 3'0H-Enden der Ohgonukleotide mit RNa- se vom Träger abgespalten oder unter alkalischen Bedingungen gespalten.
B) Vergleich der Genexpressionsprofile von Tumorgewebe mit normalem Gewebe
Aus dem Tumorgewebe eines Patienten und aus dem umgebenden normalem Gewebe wird mit dem Fachmann bekannter Technik mRNA gewonnen, diese in cDNA umgeschrieben und als komplexes Template für die Hybridisierung an den unter A) beschriebenen Array verwendet.
Der genannte Array wird zusammen mit der genannten Template-cDNA in die oben beschriebene Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR- Raktionen eingespannt. Anschließend werden bekannte geeignete ther- mophile DNA-Polymerasen in einem geeigneten Puffer zugegeben und die PCR-Reaktion gestartet. Mit der in Fig. 6 genannten Vorrichtung wird dabei für jedes definierte Primeφaar eine Verlaufskurve der PCR- Reaktion erstellt, die es ermöglicht jedem der durch die Primeφaare definierten ESTs einen diese Verlaufskurve charakterisierenden Wert zuzuordnen.
Die Werte, die mit cDNA aus dem Tumorgewebe eines Patienten erhalten werden und die Werte, die mit cDNA aus dem umgebenden normalen Gewebe erhalten werden, werden miteinander verglichen. Dies führt zur Identifizierung von Genen, die im Tumorgewebe verglichen mit dem Normalgewebe über oder unterexprimiert sind. Ein weiteres Anwendungsbespiel ist die parallele PCR-Diagnostik von Krankheitserregern.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von Oligoribo- nukleotiden, mit freien Enden A, insbesondere mit freien 3'OH-Enden (3), wobei an einem Ende B, vorzugsweise am 5'OH-Ende (5) der Oligomere, eine temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet,
- dass nach erfolgter kombinatorischer Synthese der Oligomere (2) auf dem Träger (9) die temporäre Schutzgruppe (4) vom Ende B, insbesondere vom 5'OH-Ende (5) abgespalten wird,
- dass anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen (6) die freien Enden B, insbesondere die 5'OH-Enden (5) über eine Quervernetzung (7) quervernetzt werden,
- dass anschließend die kovalente Bindung (8) der synthetisierten Oligomere (2), insbesondere der Ohgonukleotide (2) oder Oligoribonukleotide (2) über das Ende A, insbesondere das 3'OH-Ende an den Träger (9) bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere (2) gespalten werden kann, so dass freie En- den A, insbesondere freie 3'OH-Enden (3) entstehen, - dass auch nach der Abspaltung der Enden A, insbesondere der 3'OH-Enden (3) vom Träger (9) ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligomere (2) aufgrund der genannten Quervernetzung (7) am Ende B, insbesondere am 5'OH-Ende (5) kova- lent (8) an den Träger (9) bindet.
2. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von Oligoribonukleotide, mit freien Enden A, insbesondere mit freien 3'OH-Enden (3), wobei am Ende B, insbesondere am 5'OH-Ende (5) der Oligomere eine erste temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet,
- dass in einem ersten Schritt nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays (1) von an bestimmten, genau definierten Orten (10) auf dem Träger (9) gebundenen Oligomeren (2) die erste temporäre
Schutzgruppe (4) am Ende B, insbesondere am 5'-OH-Ende (5) der O- ligomere abgespalten wird und anschließend die nun freien Enden B, entweder durch eine Quervernetzung (7) quervernetzt werden oder durch eine zweite permanente Schutzgruppe (30) blockiert werden,
. dass in einem zweiten Schritt eine von der genannten ersten temporären Schutzgruppe (4) unterschiedliche zweite temporäre Schutzgruppe (20) auf dem Träger (9) abgespalten wird, wodurch auf dem Träger (9) eine reaktive Gruppe (22) entsteht, - dass in einem dritten Schritt auf der reaktiven Gruppe (22) vorzugsweise mittels kombinatorischer Synthese ein zweites Array von ortsgenau definierten Oligomeren (2) aufgebaut wird, dessen freie Enden B, insbesondere dessen freie 5'-OH-Enden (5) wie im ersten Schritt quer- vernetzt werden können,
- dass in einem vierten Schritt die permanenten Schutzgruppen (6, 30) abgespalten werden, wobei durch die Wahl geeigneter Handies (8) erreicht wird, dass die Mehrzahl der Oligomere mit freiem Ende A, insbesondere mit freiem 3'-OH-Ende (3) vorliegen.
3. Verfaliren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Verankerung der Oligomere durch unvollständiges Abspalten der Handies (8) erreicht wird, insbesondere durch Derivatisieren des Trägers (9) mit einem Gemisch von Handies (8), deren einer Teil unter den gewählten Bedingungen abgespalten wird, während ein vorzugs- weise kleinerer Anteil der Handies (8) unter den gewählten Bedingungen kovalent mit dem Träger (9) verbunden bleibt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite temporäre Schutzgruppe (20) während des Quervernetzens der freien 5'-OH-Enden im ersten Schritt eingeführt wird oder aber schon vor der Synthese des ersten Arrays (1) von an bestimmten Orten (10) gebundenen Oligomeren (2) auf den Träger (9) aufgebracht worden ist.
5. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere Oligonukleotiden oder Oligoribonukleotiden, mit freien 3'OH-Enden (3), wobei am 5'OH-Ende (5) der Oligomere eine temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen per- manente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind,
dadurch gekennzeichnet,
- dass nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe (4) vom 5'OH-Ende (5) abgespalten wird,
- dass anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutz- gruppen (6) die freien 5'OH-Enden (5) durch Quervernetzungen (7) verbunden werden,
- dass die kovalente Bindung (8) über das 3'OH-Ende der synthetisierten Oligomere an den Träger (9) bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere abgespalten wird, so dass freie 3'OH-Enden (3) entstehen, so dass nach dem Abspalten der 3'OH-Enden vom Träger ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligomere aufgrund der Quervernetzungen (7) am 5'OH-Ende (5) kovalent an den Träger (9) binden kann.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeich- net, dass zwei unterschiedliche Oligomere, insbesondere zwei unterschiedliche Ohgonukleotide oder Oligoribonukleotide pro definiertem Ort (10) synthetisiert werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Array (1) mehr als 100 ortsdefinierte Oligomere pro cm2 an den Träger (9) gebunden werden.
8. Verfaliren nach emem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass an das Array (1) DNA, RNA oder PNA hybridisiert wird.
9. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Arrays (1) mit DNA-Polymerasen oder RNA- Polymerasen in Kontakt gebracht werden.
10. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeich- net, dass die genannten Arrays (1) für eine PCR- Analyse verwendet werden.
11. Festphasen-PCR, wobei Template-DNA an genau definierten Orten (10) an einen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auf einem Träger synthetisierten Primer hybridisiert und mittels eines steuerbaren Heiz- blocks (11) die zur Hybridisierung, zur DNA-Polymerisation und zum
Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs jeweils benötigte Wärme zugeführt wird.
12. Vorrichtung zur Analyse von Arrays ( 1 ) von Oligomeren,
dadurch gekennzeichnet,
- dass ein Heizblock (11) mit im wesentlichen planer Auflagefläche vorgesehen ist, - dass Mittel zum Einstrahlen von Anregungslicht (14), insbesondere von UV-Licht auf ein auf dem Heizblock befindliches Array vorgesehen sind,
- dass eine Detektionseinheit (17), insbesondere ein CCD-Array für von dem Array von Oligomeren emittiertes Fluoreszenzlicht (19) vorgesehen ist,
- dass zwischen der Detektionseinheit (17) und dem zu untersuchenden Array (1) ein Fluoreszenzlichtfilter (18) vorgesehen ist, der das Anregungslicht (14) ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht (19) passieren lässt und
- dass die genannte Analyse wiederholt, insbesondere als zeitliche Verlaufskurve während einer fortlaufenden enzymatischen Reaktion, insbesondere während einer PCR-Reaktion, die das genannte Array von Oligomeren verändert, vorgenommen wird.
13. Verfahren zur Analyse der nach Anspruch 1 bis 10 synthetisierten Arrays (1) von Oligomeren unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 12,
dadurch gekennzeichnet,
- dass ein zu untersuchendes Array in engen Kontakt mit dem Heiz- block (11) gebracht wird, - dass das Array (1) zur Vermeidung der Verdunstung eines Reaktionspuffers mit einer lichtdurchlässigen planen Folie oder Scheibe (13) abgedeckt wird,
- dass das Array (1) zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen mit Anregungslicht (14), insbesondere mit UV-Licht, bestrahlt wird,
- dass die von der Detektionseinheit (17) erfassten Daten auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bildanalyse unterzogen werden.
14. Verfahren zur Analyse der nach Anspruch 1 bis 10 synthetisierten Ar- rays (1) von Oligomeren unter Verwendung einer Vorrichtung nach
Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Arrays (1) mit der in Anspruch 12 genannten Vorrichtung analysiert werden.
15. Träger mit wenigstens einem Array von Oligomeren mit freien 3'OH- Enden zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen, dadurch gekenn- zeichnet, dass das Array nach einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren auf den Träger aufgebracht wurde.
16. Träger nach Anspruch 15 mit einer Ohgonukleotidbibhothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Ohgonukleotidbibhothek durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von geeigneten Monomeren entstanden ist.
17. Träger nach Anspruch 15 oder 16 mit einer Ohgonukleotidbibhothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Ohgonukleotidbibhothek als 2- dimensionales Array auf dem in geeigneter Weise derivatisierten Träger vorliegt, wobei die einzelnen Bestandteile der Oligonukleotidbiblio- thek ortsgenau zugeordnet sind.
18. Träger nach einem der Ansprüche 15 bis 17 mit emer Ohgonukleotidbibhothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Ohgonukleotidbibhothek ein freies 3'OH-Ende hat, das nach der Hybridisierung von Template-DNA Substrat von template-abhängigen DNA-Polymerasen oder RNA-Polymerasen ist.
19. Träger nach einem der Ansprüche 15 bis 18 mit einer Ohgonukleotidbibhothek, dadurch gekennzeichnet, dass in der Ohgonukleotidbibhothek zwei definierte Ohgonukleotide pro definiertem Ort synthetisiert wurden.
20. Träger mit wenigstens einem Array von Oligomeren, die einem in situ Reinigungsschritt unterworfen worden sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Array nach einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren auf den Träger aufgebracht wurde.
21. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oli- gomer-Paaren (21), insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von
Oligoribunukleotiden, dadurch gekennzeichnet, - dass pro definiertem Ort auf einem Array (10) mindestens zwei voneinander verschiedene Oligomere (2) synthetisiert oder aufgebracht werden, dass beide Oligomere (2) freie 3'-OH-Enden (3) haben oder zu freien 3'-OH-Enden (3) derivatisiert werden, und dass mit dem Array von Oligomer-Paaren (21) eine hochgradig parallehsierte Polymerasen Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird und dass während der PCR- Reaktion eine vorzugsweise thermostabile enzymatische Aktivität , insbesondere eine Helikase, eine Gyrase oder Topoisomerase zusammen mit ATP beigefügt wird, die superhelicale Verdrillungen auflöst.
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