DE10030588A1

DE10030588A1 - Verfahren und Vorrichtung zur Synthese und Analyse von trägergebundenen Arrays von Oligomeren, insbesondere von Primerpaaren für die PCR, sowie Träger mit Oligomeren

Info

Publication number: DE10030588A1
Application number: DE10030588A
Authority: DE
Inventors: Frank Breitling; Annemarie Poustka; Dipl-Phys Gros; Frieder Breitling
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2000-06-21
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2002-01-03

Abstract

Zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays von Oligomeren mit freien Enden A, wobei am 5'-OH-Ende der Oligomere eine temporäre Schutzgruppe und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen vorgesehen sind, wird vorgeschlagen, dass nach der kombinatorischen Synthese der Oligomere auf den Träger die temporäre Schutzgruppe vom Ende B abgespalten wird, anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen die freien Enden B quervernetzt werden, dann die kovalente Bindung der synthetisierten Oligomere über das Ende A auf den Träger abgespalten werden kann, so dass freie Enden A entstehen und auch nach der Abspaltung der Enden A vom Träger ein Teil der synthetisierten Oligomere kovalent an den Träger bindet.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Synthese und Analyse von träger-gebundenen Arrays von Oligomeren, insbesondere von Primerpaaren für die PCR (Polymerase Chain Reaction - Polymerase Kettenreaktion), sowie Träger mit Oligomeren. Im besonderen betrifft die Erfindung Verfahren und Vorrichtungen zur parallelen Synthese komplexer Oligomer-, insbesondere Oligonukleotidbibliotheken.

Dabei bezeichnet hier der Begriff "Oligomer-" bzw. "Oligonukleo tidbibliothek" die Gesamtheit von vielen unterschiedlichen, an definierten Orten auf einem Träger gebundenen Oligomeren, -peptiden, -nukleotiden oder -ribonukleotiden, wobei die unterschiedlichen Oligomere bzw. -(ribo)nukleotide möglichst kompakt angeordnet sein sollen. Solche Molekülbibliotheken entstehen insbesondere durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von Monomeren.

Die genannten Molekülbibliotheken können jedoch auch durch das ortsdefinierte Aufbringen von bereits fertig synthetisierten Oligomeren entstehen, wobei im Kontext dieses Patents insbesondere das ortsdefinierte Aufbringen und kovalente Koppeln von Primerpaaren für die PCR gemeint ist.

Der Begriff "komplex" bezeichnet Molekülbibliotheken mit mehr als 10² unterschiedlichen Vertretern, insbesondere jedoch Molekülbibliotheken mit mehr als 10⁴ unterschiedlichen Vertretern.

Die Erfindung soll insbesondere eine Synthese von Primerpaaren mit freiem 3'-OH-Ende ermöglichen, die für eine nachfolgende PCR Analyse geeignet sind und die als Paar an jeweils einem definierten Ort auf einem Träger durch die kombinatorische Synthese entstehen.

In einer alternativen Methode entstehen die genannten Molekülbibliotheken durch das ortsdefinierte Aufbringen von bereits fertig synthetisierten Primerpaaren für die PCR. Die meisten der bisher bekannten Festphasen-Synthesemethoden für die Synthese von Oligonukleotiden und die kombinatorische Synthese von Oligo nukleotidarrays verankern das wachsende Oligonukleotid mit dem 3'-OH- Ende am Träger, während neue Monomere nach dem Abspalten der temporären Schutzgruppe an das 5'-OH-Ende gekoppelt werden. Nach erfolgter Synthese werden alle Schutzgruppen abgespalten. Bei diesem letzten Schritt entscheidet die Verankerungsweise an den Träger, ob das Oligonukleotid mit seinem 3'-OH-Ende am Träger gebunden bleibt, oder ob es in die lösliche Fraktion übergeht. Die Synthese von zwei unterschiedlichen definierten Oligonukleotidarrays an jeweils einem definierten Ort ist bisher nicht beschrieben.

Bei einer alternativen Methode werden Monomere verwendet, wo sich die temporäre Schutzgruppe am 3'OH-Ende befindet. Durch den Einsatz dieser Monomere wird die Syntheserichtung umgedreht, d. h. dabei entstehen Oligonukleotide mit freiem 3'OH-Ende, die mit ihrem 5'OH- Ende an den Träger binden. Monomere dieser Art für die Oligonukleotidsynthese werden von der Firma Glensearch verkauft (www.glenres.com). Bisher wurden diese Art Monomere aber nur für Spezialanwendungen wie stabilere Antisense Oligonukleotide, oder für die Synthese von parallel aneinander hybridisierenden Doppelsträngen verwendet.

Für die Synthese eines Arrays von Primerpaaren wurden diese Monomere bisher nicht eingesetzt.

Es wäre jedoch vorteilhaft, wenn definierte Primerpaare mit jeweils freien 3'-OH-Enden an einem definierten Ort fixiert werden könnten, denn damit können z. B. tausende PCR-Reaktionen sehr einfach parallel durchgeführt werden. Der Grund liegt darin, dass dabei die Primer nicht durchmischt werden, sondern ortsdefiniert am Träger fixiert bleiben.

Die bisherigen Verfahren stehen dem jedoch entgegen, denn es wird in der Regel nur ein definiertes Oligonukleotid pro definiertem Ort synthetisiert oder ortsdefiniert an den Träger gekoppelt und die synthetisierten Oligonukleotide binden meist mit ihrem 3'OH-Ende an den Träger.

Davon ausgehend liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Synthese bzw. Analyse von Oligomeren auf einem Träger, insbesondere von Primerpaaren für die PCR (Polymerase Chain Reaction - Polymerase Kettenreaktion), sowie verbesserte Träger mit in situ gereinigten Oligomeren anzugeben.

Die Aufgabe wird gelöst von Verfahren bzw. Vorrichtungen mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche. Vorteilhafte Durch- bzw. Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung einiger Beispiele in Verbindung mit der Zeichnung. Es zeigen jeweils schematisch

Fig. 1, I. das Abspalten der temporären Schutzgruppen 4 am 5'- OH-Ende 5 der Oligonukleotide 2 nach der kombi natorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an be stimmten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2,

Fig. 1, II. die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den nun freien 5'-OH-Enden 5 der Oligonukleotide 2,

Fig. 2, III. das Abspalten einer von der ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedlichen zweiten nicht permanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9, wo durch auf dem Träger eine reaktive Gruppe 22 entsteht,

Fig. 2, IV. den Aufbau eines zweiten Arrays von ortsgenau defi nierten Oligonukleotiden 2 auf der reaktiven Gruppe 22 mittels kombinatorischer Synthese,

Fig. 3, V. die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien 5'-OH-Enden 5 des zweiten Arrays von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2, wodurch ein Array von Primerpaaren 21 definierter Sequenz entsteht, die jeweils ortsgenau definiert sind,

Fig. 3, VI. das Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6, wobei durch die Wahl geeigneter "Handles" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Oligonukleotide 2 mit freiem 3'- OH-Ende 3 vorliegt,

Fig. 4, VII. das Hybridisieren von Template-DNA 23 an genau definierten Orten 10 an einen komplementären Primer 2, wobei eine DNA-Polymerase ausgehend vom 3'OH-Ende 3 des Primers 2 den Gegenstrang 26 synthetisiert und ein regulierbarer Heizblock 11 die Hybridisierungstemperatur, die Temperatur für die DNA- Polymerisation und die Temperatur für das Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs liefert,

Fig. 4, VIII. das Hybridisieren des an das 3'OH-Ende 3 des Primers 2 synthetisierten DNA-Einzelstrangs 26 nach dem Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs an den komplementären Gegenstrangprimer 24,

Fig. 4, IX. die Bildung eines doppelsträngigen PCR-Produktes 27 nach einer erneuten DNA-Polymerisation,

Fig. 4, X. den Einbau oder das Einlagern eines zum Nachweis des PCR-Produktes 27 dienenden Fluoreszenzfarbstoffs 25 in das ortsgenau definiert entstandene PCR-Produkt 27, das durch weitere PCR-Zyklen vermehrt werden kann,

Fig. 5, I. & II. ein Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH-Enden 3, wobei (Fig. 5, I.) nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe 4 vom 5'OH-Ende 5 abgespalten wird und anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 die freien 5'OH-Enden 5 quervernetzt werden, worauf (Fig. 5, II) die kovalente Bindung 8 über das 3'OH-Ende der synthetisierten Oligonukleotide an den Träger 9 bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 abgespalten wird, so dass freie 3'OH-Enden 3 entstehen und nach der Abspaltung dieser 3'OH-Enden 3 vom Träger 9 ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligonukleotide oder Oligoribonukleo tide 2 aufgrund der Quervernetzungen 7 am 5'OH-Ende 5 kovalent an den Träger 9 binden kann,

Fig. 6 eine Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Re aktionen, bei welcher der metallische Heizblock 11 planar gefräst und zwischen einer Detektionseinheit 17 und einem Array 1 von Oligonukleotiden 2 ein Fluoreszenzlichtfilter 18 vorgesehen ist, der An regungslicht 14 ausblendet, aber emittiertes Fluores zenzlicht 19 passieren läßt.

Fig. 7 I die Synthese eines an einem Träger 9 bei 8 gebundenen Oligonukleotids 2 und das Abspalten einer ersten temporären Schutzgruppe 4. Dabei entsteht eine freie 5'OH-Gruppe. Der bei der Synthese entstandene am Träger 9 gebundene Synthese Artefakt 28 wurde während der Synthese mit einem "cap" 29 versehen,

Fig. 7 II die Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien 5'OH-Enden 5. Aufgrund des "caps" 29 an dem 5'OH- Ende 5 wird der Synthese Artefakt 28 dabei nicht mit quervernetzt,

Fig. 7 III das Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 und die (partielle) Abspaltung der Verbindung des Oligonukleotids 2 zum Träger 9, wobei durch die Wahl geeigneter "Handles" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Oligonukleotide 2 mit freiem 3'OH-Ende 3 vorliegt. Da der Synthese Artefakt 28 danach nicht mehr kovalent an den Träger 9 gekoppelt ist, kann er weggewaschen werden. Dadurch kommt es zu einer (partiellen) in situ Reinigung des Oligonukleotids 2,

Fig. 8 I eine alternative Synthese von Oligonukleotiden 2, bei der Monomere verwendet werden, die die temporäre Schutzgruppe 4 am 3'OH-Ende tragen und die über das 5'OH-Ende bei 8 an den Träger 9 koppeln. Gezeigt wird das Abspalten der temporären Schutzgruppe 4 am 3'OH- Ende 3 der Oligonukleotide 2 nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an bestimmten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2,

Fig. 8 II das Blockieren der freien 3'OH-Enden 3 der Oligonukleotide 2 mit einer zweiten permanenten Schutzgruppe 30,

Fig. 9 III das Abspalten einer von der ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedlichen zweiten nicht permanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9, wodurch auf dem Träger 9 eine reaktive Gruppe 22 entsteht,

Fig. 9 IV den Aufbau eines zweiten Arrays von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2 auf der reaktiven Gruppe 22 mittels kombinatorischer Synthese,

Fig. 10 V das Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 und der zweiten permanenten Schutzgruppe 30, so dass die Mehrzahl der Oligonukleotide 2 mit freiem 3'OH-Ende 3 vorliegt,

Fig. 11 I das ortsdefinierte Aufbringen von Primerpaaren. Der Träger weist in diesem Fall Carboxylgruppen auf, die vor dem Aufbringen der Primerpaare z. B. mit DIC (= N,N- Diisopropyl-Carbodiimide; Sigma #D-4781) voraktiviert werden. Die Primerpaare tragen am 5'OH-Ende eine freie Aminofunktion, die z. B. durch eine Standard Synthese mit dem 5' Amino Modifier 5 (Eurogentec; #10190502; vollständiger Name: 2-(2-(4-Monomethoxytrityl) aminoethoxy) ethyl)-(2-cyanothyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidite) eingeführt werden kann. Die Primer sind dabei vor dem ortsdefinierten Aufbringen von einem anderen festen Träger z. B. durch einen Licht-spaltbaren Linker, oder einen vergleichsweise mit den Seitenschutzgruppen labilen Linker (z. B. universal Q- Linker; Glenresearch #21-5000-01) abgespalten worden, sodass die Seitenschutzgruppen unerwünschte Nebenreaktionen mit den aktivierten Carboxylfunktionen des genannten Trägers verhindern.

Fig. 11, II das ortsdefinierte Koppeln von Primerpaaren, gefolgt von der Abspaltung der Seitenschutzgruppen.

Um eine klare Sprache zu ermöglichen, ist in der Beschreibung der Fig. 1 bis Fig. 10 nur von Oligonukleotiden (2) die Rede. Die Beschreibung gilt aber genauso für andere Oligomere (2), wie auch schon aus der Beschriftungstabelle ersichtlich. Es gibt viele kombinatorische Synthesen, wo die unterschiedlichen Monomere jeweils zwei unterscheidbare Enden A (3) und B (5) haben. Bei Nukleotiden sind das das 3'OH-Ende und das 5'OH-Ende, bei Aminosäuren die COOH Gruppe und die NH₂ Gruppe, bei anderen Monomeren sind es wieder andere Gruppen. Die Erfindung bezieht sich auf alle diese unterschiedlichen kombinatorischen Synthesen. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass die Erfindung nicht nur die Synthese von Oligonukleotiden (2) mit freiem 3'OH-Ende (3) ermöglicht, sondern darüber hinaus die in situ Reinigung von Träger gebundenen Oligomeren (2). Je, länger ein Oligomer bei der kombinatorischen Synthese wird, um so mehr trägergebundene Synthese Artefakte 28 entstehen (dargestellt in Fig. 7), die den bei weitem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere ausmachen können. Dies stört bei sehr vielen Anwendungen, denn man möchte eine Bindung oder einen anderen beobachtbaren Effekt dem definierten Oligomer und nicht einem undefinierten Artefakt zuschreiben. Meistens entstehen diese Synthese Artefakte 28 dadurch, dass nach der Abspaltung der temporären Schutzgruppen (4) nicht alle reaktiven Gruppen mit einem neuen Monomer abreagieren. Diese werden deswegen normalerweise "gecapt" 29 bevor ein neuer Kopplungszyklus mit dem Abspalten der temporären Schutzgruppe (4) beginnt. Durch das "cappen" 29 aber verlieren die Synthese Artefakte 28 ihre reaktive Gruppe, womit sie auch nicht quervernetzt (7) werden können. Wenn schließlich nach der Quervernetzung (7) ein Teil (vorzugsweise ein sehr großer Teil) der Enden A (3) vom Träger abgespalten wird (Fig. 3, VI) wird derselbe Anteil von Synthese Artefakten 28 abgespalten. Da diese nicht quervernetzt (7) sind, binden sie nicht mehr an den Träger (9) und können weggewaschen werden.

Um die Synthese von an einem Träger fixierten definierten Primerpaaren 21 mit jeweils freiem 3'-OH-Enden an einem definierten Ort zu erreichen, werden die nach dem Stand der Technik bekannten kombinatorischen Synthesen wie folgt geändert (siehe Fig. 1, Fig. 2 und Fig. 3 sowie Fig. 8, Fig. 9 und Fig. 10):
Wie in den Fig. 1, I und II schematisch angedeutet ist, werden in einem ersten Schritt nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an bestimmten, genau definierten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2 die temporären Schutzgruppen 4 (ein Beispiel für eine solche Schutzgruppe ist 4',4'-Dimethoxytritylchlorid (DMTr)) am 5'-OH-Ende 5 der Oligonukleotide 2 abgespalten und anschließend die nun freien 5'-OH-Enden 5 über Quervernetzungen 7 quervernetzt. Dies geschieht in an sich bekannter Weise.

Wie in den Fig. 1, II und Fig. 2, III schematisch dargestellt, wird an schließend in einem zweiten Schritt eine von der genannten ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedliche zweite nicht-permanente Schutzgruppe 20 (z. B. 2-Acetyl-5, 5-dimethyl-1, 3-cyclohexandion, (Dde)) auf dem Träger 9 abgespalten. Dies geschieht ebenfalls in an sich bekannter Weise. Die zweite nicht-permanente Schutzgruppe 20 kann während des genannten Quervernetzens der freien 5'-OH-Enden eingeführt werden oder aber schon vor der Synthese des ersten Arrays 1 von an bestimmten Orten 10 gebundenen Oligonukleotiden 2 auf den Träger 9 aufgebracht worden sein.

In einem dritten, in den Fig. 2, III & IV sowie Fig. 3, V schematisch dargestellten Schritt entsteht durch die Abspaltung der zweiten nicht permanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9 eine reaktive Gruppe 22 (z. B. eine Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe) auf der mit Hilfe von bekannten kombinatorischen Synthesen ein zweites Array von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2 aufgebaut werden kann, dessen freie 5'- OH-Enden 5 wie oben beschrieben quervernetzt werden (Quervernetzungen 7). Dadurch entsteht ein Array von Primerpaaren 21 definierter Sequenz, die jeweils ortsgenau definiert sind.

Anschließend werden, wie in Fig. 3, VI angedeutet, in einem vierten Schritt in an sich bekannter Weise die permanenten Schutzgruppen 6 abgespalten, wobei durch die Wahl geeigneter "Handles" 8 erreicht wird, dass die Mehrzahl der Oligonukleotide 2 nun mit freiem 3'-OH-Ende 3 vorliegen. Die weitere Verankerung 8 der Oligonukleotide 2 wird dabei vorzugsweise durch unvollständige Abspaltung der genannten Handles 8 erreicht, z. B. durch Derivatisieren des Trägers 9 mit einem Gemisch von Handles 8, deren einer Teil unter den gewählten Bedingungen abgespalten wird, während ein vorzugsweise kleinerer Anteil der Handles 8 unter den gewählten Bedingungen kovalent mit dem Träger 9 verbunden bleibt.

In Fig. 8, Fig. 9 und Fig. 10 ist ein alternatives Verfahren dargestellt. Dabei werden Monomere verwendet, die eine temporäre Schutzgruppe 4 am 3'OH-Ende 3 tragen. Wie in Fig. 8 I und II schematisch angedeutet ist, werden in einem ersten Schritt nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays 1 von an bestimmten, genau definierten Orten 10 auf dem Träger 9 gebundenen Oligonukleotiden 2 die temporären Schutzgruppen 4 (ein Beispiel für eine solche Schutzgruppe ist 4',4'- Dimethoxytritychlorid (DMTr)) diesmal am 3'OH-Ende 3 der Oligonukleotide 2 abgespalten. Anschließend werden die nun freien 3'OH-Enden mit einer zweiten permanenten Schutzgruppe 30 blockiert. Dies geschieht in an sich bekannter Weise.

Wie in Fig. 8 II und Fig. 9 III schematisch dargestellt, wird anschließend in einem zweiten Schritt eine von der genannten ersten temporären Schutzgruppe 4 unterschiedliche zweite nicht-permanente Schutzgruppe 20 (z. B. 2-Acetyl-5, 5-dimethyl-1, 3-cyclohexandion (Dde)) auf dem Träger 9 abgespalten. Dies geschieht ebenfalls in an sich bekannter Weise.

In einem dritten, in Fig. 9 III und IV schematisch dargestellten Schritt entsteht durch die Abspaltung der zweiten nichtpermanenten Schutzgruppe 20 auf dem Träger 9 eine reaktive Gruppe 22 (z. B. eine Hydroxylgruppe oder eine Aminogruppe), auf der mit Hilfe von bekannten kombinatorischen Synthesen ein zweites Array von ortsgenau definierten Oligonukleotiden 2 aufgebaut werden kann.

Anschließend werden, wie in Fig. 10 V angedeutet, in einem vierten Schritt in an sich bekannter Weise die permanenten Schutzgruppen 6 und die zweite permanente Schutzgruppe 30 abgespalten. Dabei entsteht ein am Träger 9 bei 8 gebundenes Array 1 von an Orten 10 ortsdefinierten 10 Primerpaaren 21.

In Fig. 11 ist ein weiteres alternatives Verfahren dargestellt. Dabei werden die Primerpaare 21 unabhängig von dem beschriebenen Array 1 hergestellt. Am 5'OH-Ende wird dabei vorzugsweise eine Aminogruppe 31 eingeführt, die mit voraktivierten Carboxylgruppen 32 auf der Trägeroberfläche 9 abreagieren kann. Während dieser Reaktion sind die reaktiven Seitengruppen der Oligonukleotide 2 vorzugsweise durch Schutzgruppen 6 geschützt. Nachdem diese abgespalten worden sind, wie in Fig. 11, II angedeutet, entstehen Primerpaare mit freien 3'OH-Enden 21, mit denen an definierten Orten 10 PCR Reaktionen durchgeführt werden können.

Diese erfindungsgemäßen Verfahren haben unter anderem den Vorteil,

- dass anstelle eines Arrays von jeweils einzelnen ortsgenau defi nierten Oligonukleotiden ein Array von definierten Oligonukleotid- Paaren entsteht,
- dass die Oligonukleotide anstelle eines freien 5'-OH-Endes freie 3'- OH-Enden besitzen und somit ein template-abhängiges potentielles Substrat für DNA-Polymerasen darstellen,
- dass eine in situ Anreinigung der definierten Oligonukleotide stattfindet (diese in situ Reinigung findet in dem in Fig. 8 bis Fig. 10 dargestellten Verfahren nicht statt; in Fig. 11 kann eine Reinigung vor dem Aufbringen der Primerpaare erfolgen, z. B. mit Hilfe einer Monomethoxytrityl - Gruppe am mit einer Aminogruppe modifizierten 5'OH-Ende; 5' Amino Modifier 5 von Eurogentec; #10190502; vollständiger Name: 2-(2-(4-Monomethoxytrityl) aminoethoxy) ethyl)-(2-cyanothyl)-(N,N-diisopropyl)- phosphoramidite).

Insbesondere letztgenannte Anreinigung der lediglich beispielhaft und nicht beschränkend genannten Oligonukleotide hat in der Praxis große Vorteile und kann problemlos statt bei Oligonukleotiden auch bei anderen Oligomeren, wie z. B. RNA oder Peptiden, angewendet werden. So hat bei den bislang bekannten Verfahren die Mehrzahl der Synthese Artefakte 28 kein freies 5'-OH-Ende und wird somit bei dem oben be schriebenen ersten Schritt bei 7 nicht quervernetzt. Beim beschriebenen vierten Schritt wird jedoch zusammen mit den am 5'OH-Ende quer vernetzten Oligonukleotiden auch der größte Teil der Synthese Artefakte 28 abgespalten und kann anschließend vom Träger weggewaschen werden.

Die beschriebenen Primerpaare 21 können einer ortsgenau definierten "Festphasen-PCR" dienen. Verglichen mit herkömmlichen PCR- Verfahren können dabei sehr einfach tausende von PCR-Reaktionen in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Fig. 4 VII. zeigt, wie Template-DNA 23 an genau definierten Orten 10 an einen komplementären Primer 2 hybridisiert. Eine DNA-Polymerase synthetisiert den Gegenstrang 26 ausgehend vom 3'OH-Ende 3 des Primers 2. Ein regulierbarer Heizblock 11 liefert die zur Hybridisierung, zur DNA-Polymerisation und zum Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs jeweils benötigte Wärme. Um sterische Probleme zu vermeiden, die durch die doppelhelicale Struktur der DNA auftreten können, kann der Festphasen-PCR eine vorzugsweise thermostabile enzymatische Aktivität (z. B. eine Helikase, eine Gyrase oder Topoisomerase zusammen mit ATP) beigefügt werden, die superhelicale Verdrillungen auflöst.

In Fig. 4, VIII. ist gezeigt, wie nach dem Aufschmelzen des DNA- Doppelstrangs der wie in Fig. 4, VII gezeigt an das 3'OH-Ende 3 des Primers 2 synthetisierte DNA-Einzelstrang 26 an den komplementären Gegenstrangprimer 24 hybridisiert.

Fig. 4, IX. veranschaulicht die Bildung eines doppelsträngigen PCR- Produktes 27 nach einer erneuten DNA-Polymerisation.

Ein zum Nachweis des ortsgenau definiert entstandenen PCR-Produktes 27, das durch weitere PCR-Zyklen vermehrt werden kann, dienender Fluoreszenzfarbstoff 25 kann wie in Fig. 4. X. angedeutet eingebaut oder eingelagert werden.

Mit Bezug auf Fig. 5 wird nachfolgend ein Verfahren zur Synthese eines trägergebundenen Arrays 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH- Enden 3 beschrieben.

Wie in Fig. 5, I. gezeigt, wird nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe 4 vom 5'OH-Ende 5 abgespalten.

Anschließend werden noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen C die freien 5'OH-Enden 5 durch Quervernetzungen 7 verbunden.

Anschließend wird wie in Fig. 5, II. gezeigt die kovalente Bindung 8 über das 3'OH-Ende der synthetisierten Oligonukleotide an den Träger 9 bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 abgespalten, so dass freie 3'OH-Enden 3 entstehen. Nach der Abspaltung dieser 3'OH- Enden 3 vom Träger 9 bindet ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide 2 aufgrund der genannten Quervernetzung 7 am 5'OH-Ende 5 kovalent 8 an den Träger 9.

Die Fig. 6 zeigt schematisch eine Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen, bei welcher der in den meisten handelsüblichen PCR- Maschinen vorhandene metallische Heizblock 11 planar gefräst wurde, so dass ein enger Kontakt 12 mit einem planaren Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit freien 3'OH-Enden 3 entstehen kann. Bei der Anwendung einer solchen Vorrichtung wird ein Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit einer auswechselbaren, durchsichtigen, insbesondere auch für UV-Licht durchsichtigen planaren Folie oder Scheibe 13 abgedeckt, die auf dem Array 1 fixiert werden kann, so dass die Verdunstung des Reaktionspuffers vermieden wird.

Um nun einen parallelen Nachweis der bei den PCR-Reaktionen ent standenen doppelsträngigen DNA 25 zu ermöglichen, wird das genannte. Array 1 von Oligonukleotiden 2 mit Anregungslicht 14 bestrahlt, das im besonderen Maße dafür geeignet ist, den mit der gebildeten doppelsträngigen DNA 25 assoziierten Fluoreszenzfarbstoff 15 anzuregen. Die Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs 15 geschieht durch eine über dem Array 1 von Oligonukleotiden 2 montierte An regungslichtquelle 16.

Zwischen der Detektionseinheit 17, die in besonders vorteilhafter Weise aus einer digitalen Kamera besteht, und dem genannten Array 1 von Oligonukleotiden 2 ist ein Fluoreszenzlichtfilter 18 montiert, der das Anregungslicht 14 ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht 19 passieren läßt.

Die von der Detektionseinheit 17 erfaßten Daten werden auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bildanalyse unterzogen.

Die Fig. 7 beschreibt schematisch die in situ Reinigung von am Träger 9 bei 8 gebundenen Oligomeren 2. Der bei der Synthese entstandene am Träger 9 bei 8 gebundene Synthese Artefakt 28 wurde während der Synthese mit einem "cap" 29 versehen, so dass dieses Molekül 28 nicht an der Bildung von Quervernetzungen 7 zwischen den freien Enden 5 teilnehmen kann. Nach dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen 6 und der (partiellen) Abspaltung der Verbindung 8 des Oligomers 2 zum Träger 9 kann der Synthese Artefakt 28 weggewaschen werden. Dadurch kommt es zu einer (partiellen) in situ Reinigung des Oligomers 2. Der Prozentsatz am Träger 9 bei 8 gebundener Oligomere 2 und damit auch der Reinigungsgrad wird dabei durch die Wahl der "Handles" 8 bestimmt. Es sei an dieser Stelle darauf hingewiesen, dass sich diese in situ Reinigungsmethode für alle kombinatorischen Synthesen eignet.

Nachfolgend werden eine erfindungsmäßige Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen mit Hilfe eines Arrays von Oligonukleotiden mit freien 3'OH-Enden und die Anwendung einer solchen Vorrichtung beschrieben.

Die Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen basiert auf im wesentlichen handelsüblichen PCR-Maschinen, die wie im folgenden beschrieben verändert werden, um eine besonders vorteilhafte, weil sehr einfache Analyse von vielen PCR-Reaktionen gleichzeitig zu ermöglichen:

a) Der in den meisten handelsüblichen PCR-Maschinen vorhandene metallische Heizblock wird planar gefräst, wodurch ein enger Kontakt mit einem planaren Array von Oligonukleotiden mit freien 3'OH- Enden ermöglicht wird.
b) Das genannte Array von Oligonukleotiden wird mit einer auswechselbaren, durchsichtigen, insbesondere auch für UV-Licht durchsichtigen planaren Folie oder Scheibe abgedeckt, die auf dem Array fixiert werden kann, so dass die Verdunstung des Reaktionspuffers vermieden wird.
c) Zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen wird das genannte Array von Oligonukleotiden mit Anregungslicht bestrahlt, insbesondere mit UV-Licht, das im besonderen Maße dafür geeignet ist, einen Fluoreszenzfarbstoff, insbesondere Ethidiumbromid anzuregen.
d) Die genannte Anregung des Fluoreszenzfarbstoffs geschieht durch eine über dem genannten Array von Oligonukleotiden montierte Anregungslichtquelle.
e) Zwischen der Detektionseinheit, die in besonders vorteilhafter Weise aus einer digitalen Kamera besteht und dem genannten Array von Oligonukleotiden wird ein Fluoreszenzlichtfilter montiert, der das Anregungslicht ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht passieren läßt.
f) Die von der genannten Detektionseinheit erfaßten Daten werden auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bildanalyse unterzogen.

Nachfolgend werden erfindungsgemäß produzierte Arrays von Oligo nukleotiden mit freien 3'OH-Enden zur parallelen Analyse von PCR- Reaktionen und deren mögliche Anwendungen beschrieben.

Erfindungsmäßig produzierte Materialien beinhalten die mit den ge nannten Verfahren, Materialien oder Vorrichtungen produzierten Molekülbibliotheken, insbesondere Oligonukleotidbibliotheken mit freien 3'OH-Enden. Kennzeichen dieser Oligonukleotidbibliotheken ist,

- dass sie durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von geeigneten Nukleosid-Monomeren entstanden sind,
- dass sie als 2-dimensionales Array auf einem geeigneten deriva tisierten Träger vorliegen, wobei die einzelnen Bestandteile der Oligonukleotidbibliothek ortsgenau zugeordnet werden können (die Derivatisierung des Trägers erfolgt dabei in an sich bekannter Weise),
- dass sie ein freies 3'OH-Ende haben, das nach der Hybridisierung von Template-DNA Substrat von templateabhängigen DNA-Poly merasen ist,
- dass vorzugsweise zwei definierte Oligonukleotide pro definiertem Ort synthetisiert wurden.

Die genannten Oligonukleotidbibliotheken dienen zur sehr einfachen PCR-Analyse, insbesondere von komplexen Templategemischen.

Dabei vervielfältigen bei einer Art von Arrays die darauf synthetisierten Primerpaare geeigneter Sequenz Bereiche von vorzugsweise einer Vielzahl von verschiedenen Genen von Pathogenen, so dass gleichzeitig diagnostiziert werden kann, ob eine Infektion mit einem dieser Pathogene vorliegt oder nicht. Um sterische Probleme zu vermeiden, die durch die doppelhelicale Struktur der DNA auftreten können, kann der Festphasen- PCR eine vorzugsweise thermostabile enzymatische Aktivität (z. B. eine Helikase, eine Gyrase oder Topoisomerase zusammen mit ATP) beigefügt werden, die superhelicale Verdrillungen auflöst.

Beispielsweise können auf einem Array mit 10⁵ verschiedenen Primerpaaren 1000 Infektionskrankheiten mit jeweils 100 verschiedenen Primerpaaren abgedeckt werden, darunter nahezu alle bekannten human pathogenen Virusgenome (z. B. Hepatitis A, B, C, HIV, Papillomviren, Rhinovieren, Grippeviren etc.), Bakteriengenome (z. B. Helicobacter pylori, Haemophilus influenza, E.coli etc.) und die Genome verschiedener human-pathogener Einzeller (z. B. Entamoebae histolitica, Plasmodium, Trypanosomen etc.).

Bei einer anderen Art von Arrays vervielfältigen die darauf syntheti sierten Primerpaare geeigneter Sequenz Bereiche von vorzugsweise möglichst vielen menschlichen ESTs (Expressed Sequence Tags), so dass nach der Hybridisierung von komplexer cDNA ein sogenanntes "Expression Profiling" durchgeführt werden kann. Dabei wird parallel analysiert, welche und wie viele mRNAs (und damit die davon abgeleiteten eDNAs) in einem vorzugsweise menschlichen Gewebe oder einer vorzugsweise menschlichen Zelllinie exprimiert werden. Insbesondere eignet sich diese Art von Arrays für den Vergleich mehrerer komplexer cDNAs untereinander und damit für die Identifizierung von vergleichsweise hochregulierten oder herunterregulierten Genen.

Mit einer solchen Art von Array kann auch genomische DNA analysiert werden. Dabei kann mit Hilfe einer quantitativen PCR z. B. herausgefunden werden, welche Genombereiche homozygot oder heterozygot delektiert sind, mit dem Ziel diese Bereiche wiederum einer genetischen Erkrankung zuzuordnen.

In einer anderen Anwendung dient ein solches Array zum Nachweis von Polymorphismen und damit z. B. zur Feinkartierung von Krankheitsgenen. Ein Computerprogramm sucht die in den Datenbanken verfügbaren Sequenzen des humanen Chromosoms 22 nach Restriktionsstellen ab, die 100 bis 300 Bp voneinander entfernt sind. Dasselbe Programm entwirft anschließend Primerpaare, die jeweils eine der genannten zwei Restriktionsstellen bereits in der Primersequenz enthalten, die jeweils andere Restriktionsstelle jedoch nur in der durch das Primerpaar vervielfältigten DNA. Mit vielen dieser Primerpaare wird mit den hier beschriebenen Methoden ein Array von Primerpaaren hergestellt, wobei die einzelnen Primerpaare vorzugsweise in einer linearen Anordnung vorliegen, die ihrer Lage auf dem menschlichen Chromosom 22 entspricht.

Mit einem solchen Array wird anschließend wie beschrieben eine hochgradig parallelisierte PCR durchgeführt, wobei typischerweise die Ergebnisse verglichen werden, die mit der genomischen DNA des Vaters, der Mutter und des Kindes als Template erzielt werden.

Befindet sich im Bereich der jeweils zweiten Restriktionsstelle ein genetischer Polymorphismus, so kann dieser sehr einfach durch den Verdau mit dem entsprechenden Restriktionsenzym nachgewiesen werden Codieren beide Chromosomen jeweils beide Restriktionsstellen, so entsteht beim Restriktionsverdau ein durch die Lage der Primerpaare ortsgenau definierter diffuser Hof. Dieser Hof entsteht durch das wegdiffundierende, bespielsweise mit Ethidiumbromid gefärbte PCR- Amplifikat. Codiert nur ein Chromosomen jeweils beide Restriktionsstellen, so bleibt innerhalb des vergleichsweise schwächeren diffusen Hofs ein scharf abgegrenzter Kern Träger gebundenen PCR- Amplifikats zurück. Fehlt die genannte zweite Restriktionsstelle auf beiden Chromosomen, so fehlt der genannte Hof nach dem Restriktionsverdau. Werden nun die Bilder von Vater, Mutter und Kind graphisch überlagert (z. B. durch die Zuweisung von Falschfarben), so können die chromosomalen Bereiche des Kindes sehr einfach und gleichzeitig sehr genau entweder dem Vater oder der Mutter zugeordnet werden.

Die genannten Arrays von Primerpaaren können wiederverwendet werden, wenn nach erfolgter PCR-Reaktion die Filter mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut und dann erhitzt werden und nicht- träger-gebundene DNA anschließend weggewaschen wird. Voraussetzung ist, dass die 3'-Enden der verwendeten Primer eine von mehreren geeigneten Erkennungssequenzen für die genannten Restriktionsendonukleasen enthalten. Dieses Verfahren ist insbesondere dann sinnvoll, wenn zwei verschiedene komplexe Templates miteinander vergleichen werden, wobei vergleichende quantitative Daten erhalten werden sollen und somit möglichst Variationen in der Filterproduktion vermieden werden sollen.

Besonderes Kennzeichen der genannten Arrays ist eine bisher unerreichte Analyseempfindlichkeit, da das Meßprinzip dieser Arrays auf der Polymerasenkettenreaktion (PCR) basiert, die verglichen mit den bisher verwendeten Hybridisierungen wesentlich empfindlicher ist.

Das oben beschriebene Verfahren ermöglicht die Herstellung eines Arrays von Oligonukleotiden mit jeweils freien 3'OH-Enden. Wird Template-DNA an ein solches Array von Oligonukleotiden hybridisiert, so kann der entstehende Komplex aus träger-gebundenem Oligonukleotid und Template-DNA als Substrat für DNA-abhängige DNA-Polymerasen dienen. Bei einem RNA-Template kann stattdessen eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet werden. Damit können solche Arrays prinzipiell beispielsweise für das parallele Sequenzieren komplexer Templates und oder für hochgradig parallelisierte Polymerasenkettenreaktionen eingesetzt werden. Dem Fachmann sind die dabei benötigten Reaktionsbedingungen bekannt.

Für den Fall der Analyse von hochgradig parallelisierten Polymerasenkettenreaktionen ist es besonders vorteilhaft, wenn wie oben beschrieben statt eines definierten Oligonukleotids zwei definierte Oligonukleotide ortsdefiniert synthetisiert werden. Dabei kann insbesondere für das anschließende parallele Sequenzieren komplexer Templates jeweils einer der Primer des Primerpaares verglichen mit dem anderen Primer in deutlich geringerer Menge vorgelegt werden, so dass nach einigen Vermehrungszyklen überwiegend einzelsträngige DNA produziert wird. Werden in diesem Stadium ddNTPs zugegeben, so entsteht eine Schar von einzelsträngigen Oligonukleotiden, die z. B. durch ihre Analyse im Massenspektrometer eine Sequenzbestimmung der vermehrten Template DNA ermöglicht.

Mit Hilfe eines Primerpaars kann sehr einfach die für die PCR-typische hohe Spezifität erreicht werden, während ein einziger Primer zumindestens bei einem komplexen Gemisch von Templates einen großen Anteil von Artefakten ergeben würde.

Ein weiterer wichtiger Punkt ist die Tatsache, dass bei den genannten Arrays die Primer an den Träger fixiert sind, denn dies erst ermöglicht die parallele Analyse vieler PCR-Reaktionen gleichzeitig in einem Reaktionsgefäß, da das ansonsten resultierende Primergemisch zu unvorhersagbaren Amplifikaten führen würde. Dieses Design ermöglich es sogar, die eingesetzte Template-DNA nach einem oder wenigen PCR- Zyklen wegzuwaschen, so dass auch die dabei neu entstandene Template- DNA nur noch in trägergebundener Form vorliegt. Damit wird der Anteil von PCR-Artefakten weiter reduziert.

Die Analyse von hochgradig parallelisierten Polymerasenkettenreaktionen erfolgt zweckmäßiger Weise mit der weiter oben beschriebenen erfindungsmäßen Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR- Reaktionen.

Die Analyse der einzelnen fluoreszierenden Punkte, die den ent sprechenden ortsdefinierten Primerpaaren zugeordnet werden, kann nach dem Ende der PCR-Reaktion erfolgen oder, in besonders vorteilhafter Weise, "online" mit der genannten erfindungsmäßen Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen. Auch dabei werden die einzelnen fluoreszierenden Punkte den entsprechenden ortsdefinierten Primerpaaren zugeordnet, allerdings ergibt dieses Verfahren für jedes ortsdefinierte Primerpaar eine Verlaufskurve der PCR-Reaktion, so dass die PCR-Reaktion eines jeden Primerpaars quantifiziert werden kann.

Dabei kann in besonders vorteilhafter Art und Weise die Tatsache ausgenutzt werden, dass freie Nukleotide oder einzelsträngige DNA wie die genannten Oligonukleotidprimer ein wesentlich schwächeres Fluoreszenzsignal mit eingelagertem Ethidiumbromid ergeben als doppelsträngige DNA.

Daneben gibt es weitere dem Fachmann bekannte Verfahren zur Quantifizierung von PCR-Reaktionen, die ebenfalls auf dem Einbau oder der Einlagerung von Fluorochromen in die bei der PCR-Reaktion gebildete doppelsträngige DNA beruhen. Nicht zuletzt gibt es auch die Möglichkeit, direkt die Absorptionsänderung zu verfolgen, die bei der Umwandlung von Mononukleotiden in eine doppelsträngige DNA erfolgt.

Die genannten Arrays von Primerpaaren können wiederverwendet werden, wenn nach erfolgter PCR-Reaktion die Filter mit geeigneten Restriktionsendonukleasen verdaut werden und nicht-träger-gebundene- DNA anschließend weggewaschen wird. Voraussetzung ist, dass die 3'OH-Enden der verwendeten Primer eine von mehreren geeigneten Erkennungssequenzen für die genannten Restriktionsendonukleasen enthalten. Dieses Verfahren ist insbesondere dann sinnvoll, wenn zwei verschiedene komplexe Templates miteinander verglichen werden. Bei solchen Analysen sollen möglichst vergleichende quantitative Daten erhalten und somit möglichst auch Variationen in der Filterproduktion vermieden werden.

Eine besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays ergibt sich bei der nahezu vollkommen automatisierten parallelen Diagnose sehr vieler unterschiedlicher Krankheiten, insbesondere von Infektionskrankheiten mit Hilfe der PCR. Dabei kann außerdem die Diagnosesicherheit für die einzelnen Krankheiten deutlich erhöht werden, indem nicht nur ein, sondern viele krankheitsspezifische Primerpaare analysiert werden.

Eine weitere besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays liegt im Erstellen eines Expressionsmusters, insbesondere eines vergleichenden Expressionsmusters. Dabei wird die mRNA eines Gewebes oder einer Zellinie in an sich bekannter Weise in (hochkomplexe) cDNA umgeschrieben, die wiederum als Template für die genannten Arrays dient. Wenn diese Arrays nun Primerpaare tragen, die menschliche EST-Sequenzen (Expressed Sequence Tag) vervielfältigen können, so werden die in der genannten mRNA oder cDNA vorliegenden EST-Sequenzen ortsdefiniert und nahezu quantitativ vermehrt. Insbesondere ein Vergleich von Tumorgewebe mit dem umliegenden Normalgewebe ergibt dabei EST-Sequenzen, die in dem Tumorgewebe vergleichsweise stark oder schwach exprimiert sind. Dabei sind auf Grund der ungeheuren Sensitivität der PCR-Technik auch schwach exprimierte Gene einer Analyse zugänglich und es können vergleichsweise winzige Mengen an Template eingesetzt werden, wodurch diese Filter dem jetzigen Stand der Technik weit überlegen sind.

Eine weitere besonders vorteilhafte Anwendung der genannten Arrays ist die Zuordnung von homozygot oder heterozygot deletierten Bereichen zu somatischen genetischen Erkrankungen und Erbkrankheiten. Dies kann mit Hilfe der oben näher beschriebenen quantitativen PCR herausgefunden werden. Dazu muß ein Array mit geeigneten Primerpaaren verwendet werden, die Sequenzbereiche der Gene verviel fältigen, die die genannten ESTs kodieren.

Nachfolgend sind einige Beispiele der Durchführung erfindungsgemäßer Verfahren bzw. der Anwendung erfindungsgemäßer Vorrichtungen beschrieben:

A) Synthese eines Arrays von Primerpaaren mit jeweils freien 3'OH- Enden auf einem Träger mit Hilfe eines umgebauten Farb laserdruckers

Ein geeigneter Träger mit freien Aminogruppen (oder Hydroxylgruppen) wird mit Standardmethoden hergestellt. Dabei wird, falls nicht schon durch den ersten Schritt vorhanden, an die freien Aminogruppen (oder Hydroxylgruppen) mit Hilfe von dem Fachmann geläufiger Standardsynthese unter wasserfreien Bedingungen ein geeigneter Linker synthetisiert.

Vorzugsweise besteht dieser Linker aus Dde-Fmoc-Lys, dessen eine Aminogruppe durch eine fmoc-Schutzgruppe, die andere durch eine Dde- Schutzgruppe blockiert sind. Die fmoc-Schutzgruppe wird bei 25°C für 10 Minuten mit 20% Piperidin in DMF abgespalten, d. h. unter Bedingungen, bei denen die Dde-Schutzgruppe stabil bleibt. Anschließend werden mit dem Fachmann bekannten Techniken ein oder zwei RNA- Phosphoramidite mit Hilfe von Tetrazol aktiviert und an den Träger gekoppelt. Dabei kann während der Kopplungsreaktion ein kleiner Anteil von unter 5% der entsprechenden DNA-Phosphoramidite während der Kopplungsreaktion beigemengt werden.

Nach dem Abspalten der DMTr-Schutzgruppe vom 5'OH-Ende der an den Träger gekoppelten Ribonukleosid-Monomere, wird der Träger mit 4 verschiedenen Tonerflüssigkeiten bedruckt, die die 4 verschiedenen Phosphoramidit-Monomere enthalten. Die Phosphoramidite werden mit Hilfe von Tetrazol aktiviert, an den Träger gekoppelt, ungekoppelte Monomere weggewaschen und anschließend die DMTr-Schutzgruppe vom 5'OH-Ende des wachsenden Oligonukleotids abgespalten. Eine Wiederholung dieses Vorgangs führt zu einer kombinatorischen Synthese von Oligonukleotiden.

Die Kopplung der aktivierten Phosphoramidite (mit Schutzgruppen) an den Träger, das Abspalten der Schutzgruppen und die Waschschritte finden dabei unter den dem Fachmann bekannten Standardbedingungen für die Oligonukleotidsynthese statt.

Nachdem so ein erstes Array von Oligonukleotiden synthetisiert wurde, wird am Ende die DMTr-Schutzgruppe vom 5'OH-Ende abgespalten und die freien 5'OH-Gruppen z. B. mit quervernetztem Cellulose Acetat, oder EDTA, oder Triethylentetraminhexaessigsäure und N, N'- Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) mit dem Fachmann bekannten Bedingungen quervernetzt. Insbesondere eignet sich dafür die vorherige Einführung einer Aminogruppe am 5'OH-Ende. Dies kann z. B. mit dem 5' Amino Modifier 5 (Eurogentec; #10190502) erreicht werden.

Anschließend wird die genannte Dde-Schutzgruppe bei 25°C mit 2% Hydrazin in DMF für 10 Minuten abgespalten und wie oben beschrieben zunächst ein oder zwei RNA-Phosphoramidite an die Aminosäure des genannten Lysin-Linkers synthetisiert. Dabei können die genannten RNA- Phosphoramidite als Phosphoramidit-Tonerpartikel aufgedruckt oder aber gleichmäßig in Kopplungspuffer über den Träger verteilt werden. Wie oben beschrieben kann während der Kopplungsreaktion ein kleiner Anteil der entsprechenden DNA-Phosphoramidite während der Kopplungsreaktion beigemengt werden.

Erneut wird wie oben beschrieben ein Array von Oligonukleotiden synthetisiert und am 5'OH-Ende quervernetzt. Schließlich werden alle Schutzgruppen mit Ammoniak für 45 Minuten bei 55°C bis 70°C abgespalten, der Träger mit Acetonitril gewaschen und getrocknet, so dass im Endeffekt ein Träger mit verschiedenen definierten Bereichen entsteht, die jeweils ein Paar von Oligonukleotiden repräsentieren. Im gegebenen Beispiel repräsentieren die Paare von Oligonukleotiden Sequenzen für die Vervielfältigung von ca. 50.000 verschiedenen menschlichen ESTs. In einem letzten Schritt werden die 3'OH-Enden der Oligonukleotide mit RNase vom Träger abgespalten oder unter alkalischen Bedingungen gespalten.

B) Alternative Methode zur Synthese eines Arrays von Primerpaaren mit jeweils freien 3'OH-Enden

Wie in Beispiel A beschrieben, wird ein Träger mit einem Linker bestehend aus Dde-Fmoc-Lys derivatisiert und anschließend die Fmoc Schutzgruppe abgespalten. Anschließend wird wie beschrieben ein erstes Array von Deoxy-Oligonukleotiden durch kombinatorische Synthese hergestellt. Dabei kann diesmal auf ein abspaltbares "Handle" 8 verzichtet werden. Im Unterschied zu Beispiel A werden diesmal Monomere verwendet, die temporäre Schutzgruppe am 3'OH-Ende tragen. Solche Monomere werden z. B. von der Eurogentec (Glensearch) vertrieben:

Nach dem letzten Syntheseschritt wird die temporäre Schutzgruppe DNTr vom 3'OH-Ende abgespalten und das nun freie 3'OH-Ende zunächst mit einem Ribonukleotid-Monomer und anschließend mit einem dideoxy- Ribonukleotid-Monomer umgesetzt, um es für die nachfolgenden Schritte vor unerwünschten Reaktionen zu schützen.

Anschließend wird wie in Beispiel A beschreiben die Dde-Schutzgruppe vom Träger abgespalten und ein zweites Array von Oligonukleotiden synthetisiert.

Danach werden die permanenten Schutzgruppen abgespalten und das im ersten Schritt beschriebene Ribonukleotid-Monomer zusammen mit dem dideoxy- Ribonukleotid-Monomer mit Rnase abgespalten. Am 3'OH-Ende verbliebene Phosphatreste können noch mit T4-Polynukleotidkinase entfernt werden, so dass ein Array von Primerpaaren mit jeweils freien 3'OH-Enden entsteht.

C) Herstellung eines Arrays von Primerpaaren durch das ortsdefinierte Aufbringen und kovalente Koppeln von Oligonukleotiden

Die Oligonukleotide werden mit einer Standard Festphasensynthese einzeln synthetisiert. Dabei wird ein Linker zu einem Träger verwendet, der es erlaubt die Oligonukleotide unter milden Bedingungen abzuspalten, sodass die Seitenschutzgruppen 6 im wesentlichen nicht abgespalten werden. Ein Beispiel für einen solchen Linker ist der universal Q-Linker (Glenresearch #21-5000-01), der es erlaubt die synthetisierten Oligonukleotide unter sehr milden alkalischen Bedingungen abzuspalten, sodass der Grossteil der Seitenschutzgruppen nicht abgespalten wird. Vorzugsweise wird am 5'OH-Ende der so synthetisierten Oligonukleotide vorher eine vergleichsweise reaktive Gruppe eingeführt, die es später erlaubt, die mit den Seitenschutzgruppen geschützten Oligonukleotide kovalent an einen voraktivierten zweidimensionalen Träger zu koppeln. Ein Beispiel für die genannte vergleichsweise reaktive Gruppe ist eine Aminogruppe, die mit dem 5' Amino Modifier 5 (Eurogentec; #10190502) unter Standard Bedingungen eingeführt werden kann. Falls gewünscht, ermöglicht der genannte 5' Amino Modifier 5 zusätzlich eine Reinigung der synthetisierten Oligonukleotide mit Hilfe der mit eingeführten Monomethoxytrityl-Gruppe. Auch dies findet mit dem Fachmann geläufigen Standard Bedingungen statt.

Je 2 Oligonukleotide mit freien Aminogruppen (d. h. mit abgespaltener Monomethoxytrityl-Gruppe) werden miteinander gemischt und mit Hilfe eines Spot-Roboters ortsdefiniert auf einen zweidimensionalen Träger aufgebracht. Dieser Träger wird unter im wesentlichen wasserfreien Bedingungen mit einem Moläquivalent DIC voraktiviert (die Molmengen sind bezogen auf die freien Carboxylgruppen). Die dabei entstehenden reaktiven Gruppen reagieren mit den genannten Aminogruppen. Dies führt zu einer kovalenten Kopplung der ortsdefiniert aufgebrachten Oligonukleotide an den Träger.

Im letzten Schritt werden die Seitenschutzgruppen mit 25% Ammoniak abgespalten und die Spaltprodukte weggewaschen.

D) Vergleich der Genexpressionsprofile von Tumorgewebe mit normalem Gewebe

Aus dem Tumorgewebe eines Patienten und aus dem umgebenden normalem Gewebe wird mit dem Fachmann bekannter Technik mRNA gewonnen, diese in cDNA umgeschrieben und als komplexes Template für die Hybridisierung an den unter A) beschriebenen Array verwendet.

Der genannte Array wird zusammen mit der genannten Template-cDNA in die oben beschriebene Vorrichtung zur parallelen Analyse von PCR- Reaktionen eingespannt. Anschließend werden bekannte geeignete thermophile DNA-Polymerasen in einem geeigneten Puffer zugegeben und die PCR-Reaktion gestartet. Mit der im Beispiel genannten Vorrichtung wird dabei für jedes definierte Primerpaar eine Verlaufskurve der PCR-Reaktion erstellt, die es ermöglicht jedem der durch die Primerpaare definierten ESTs einen diese Verlaufskurve charakterisierenden Wert zuzuordnen.

Die Werte, die mit cDNA aus dem Tumorgewebe eines Patienten erhalten werden und die Werte, die mit cDNA aus dem umgebenden normalen Gewebe erhalten werden, werden miteinander verglichen. Dies führt zur Identifizierung von Genen, die im Tumorgewebe verglichen mit dem Normalgewebe über oder unterexprimiert sind.

Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist die parallele PCR-Diagnostik von Krankheitserregern.

Bezugszeichenliste

1

Array

2

Oligomer, insbesondere Oligonukleotid

3

freies Ende A, insbesondere 3'-OH-Ende

4

erste temporäre Schutzgruppe

5

freies Ende B, insbesondere 5'-OH-Ende

6

permanente Schutzgruppe

7

Quervernetzung der freien Enden B, insbesondere der 5'-OH-Enden

8

"Handle" (kovalente Bindung an den Träger)

9

Träger

10

definierter Ort auf einem Array

11

planar gefräster Heizblock einer PCR-Maschine

12

Kontaktstelle zwischen Träger

9

und Heizblock

11

13

plane Folie oder Scheibe zum Abdecken eines Arrays

14

Anregungslicht

15

Fluoreszenzfarbstoff

16

Anregungslichtquelle

17

Detektionseinheit für das emittierte Fluoreszenzlicht

18

Fluoreszenzlichtfilter

19

emittiertes Fluoreszenzlicht

20

zweite temporäre Schutzgruppe

21

Array vom Oligomerpaaren, insbesondere von Primerpaaren

22

reaktive Gruppe

23

Template

24

Gegenstrang-Primer

25

mit doppelsträngiger DNA, RNA oder PNA assozijerter Fluoreszenz farbstoff

26

einzelsträngiger Gegenstrang

27

doppelsträngiges PCR-Produkt

28

"gecappter" Synthese Artefakt

29

cap

30

zweite permanente Schutzgruppe

31

am 5'OH-Ende eingeführte Aminogruppe

32

mit DIC aktivierte Carboxylgruppen

Claims

1. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von Oligoribonukleotiden, mit freien Enden A, insbesondere mit freien 3'OH-Enden (3), wobei an einem Ende B, vorzugsweise am 5'OH- Ende (5) der Oligomere, eine temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet,
dass nach erfolgter kombinatorischer Synthese der Oligomere (2) auf dem Träger (9) die temporäre Schutzgruppe (4) vom Ende B, insbesondere vom 5'OH-Ende (5) abgespalten wird,
dass anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen (6) die freien Enden B, insbesondere die 5'OH-Enden (5) über eine Quervernetzung (7) quervernetzt werden,
dass anschließend die kovalente Bindung (8) der synthetisierten Oligomere (2), insbesondere der Oligonukleotide (2) oder Oligoribonukleotide (2) über das Ende A, insbesondere das 3'OH- Ende an den Träger (9) bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere (2) gespalten werden kann, so dass freie Enden A, insbesondere freie 3'OH-Enden (3) entstehen,
dass auch nach der Abspaltung der Enden A, insbesondere der 3'OH-Enden (3) vom Träger (9) ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligomere (2) aufgrund der genannten Quervernetzung (7) am Ende B, insbesondere am 5'OH- Ende (5) kovalent (8) an den Träger (9) bindet.

2. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von Oligoribonukleotiden, mit freien Enden A, insbesondere mit freien 3'OH-Enden (3), wobei am Ende B, insbesondere am 5'OH-Ende (5) der Oligomere eine erste temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet,
dass in einem ersten Schritt nach der kombinatorischen Synthese eines ersten Arrays (1) von an bestimmten, genau definierten Orten (10) auf dem Träger (9) gebundenen Oligomeren (2) die erste temporäre Schutzgruppe (4) am Ende B, insbesondere am 5'-OH- Ende (5) der Oligomere abgespalten wird und anschließend die nun freien Enden B, entweder durch eine Quervernetzung (7) quervernetzt werden oder durch eine zweite permanente Schutzgruppe (30) blockiert werden,
dass in einem zweiten Schritt eine von der genannten ersten temporären Schutzgruppe (4) unterschiedliche zweite temporäre Schutzgruppe (20) auf dem Träger (9) abgespalten wird, wodurch auf dem Träger (9) eine reaktive Gruppe (22) entsteht,
dass in einem dritten Sehritt auf der reaktiven Gruppe (22) vorzugsweise mittels kombinatorischer Synthese ein zweites Array von ortsgenau definierten Oligomeren (2) aufgebaut wird, dessen freie Enden B, insbesondere dessen freie 5'-OH-Enden (5) wie im ersten Schritt quervernetzt werden können,
dass in einem vierten Schritt die permanenten Schutzgruppen (6, 30) abgespalten werden, wobei durch die Wahl geeigneter Handles (8) erreicht wird, dass die Mehrzahl der Oligomere mit freiem Ende A, insbesondere mit freiem 3'-OH-Ende (3) vorliegen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die weitere Verankerung der Oligomere durch unvollständiges Abspalten der Handles (8) erreicht wird, insbesondere durch Derivatisieren des Trägers (9) mit einem Gemisch von Handles (8), deren einer Teil unter den gewählten Bedingungen abgespalten wird, während ein vorzugsweise kleinerer Anteil der Handles (8) unter den gewählten Bedingungen kovalent mit dem Träger (9) verbunden bleibt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die zweite temporäre Schutzgruppe (20) während des Quervernetzens der freien 5'-OH-Enden im ersten Schritt eingeführt wird oder aber schon vor der Synthese des ersten Arrays (1) von an bestimmten Orten (10) gebundenen Oligomeren (2) auf den Träger (9) aufgebracht worden ist.

5. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomeren, insbesondere Oligonukleotiden oder Oligoribonukleotiden, mit freien 3'OH-Enden (3), wobei am 5'OH- Ende (5) der Oligomere eine temporäre Schutzgruppe (4) und an reaktiven Seitengruppen permanente Schutzgruppen (6) vorgesehen sind, dadurch gekennzeichnet,
dass nach erfolgter kombinatorischer Synthese die temporäre Schutzgruppe (4) vom 5'OH-Ende (5) abgespalten wird,
dass anschließend noch vor dem Abspalten der permanenten Schutzgruppen (6) die freien 5'OH-Enden (5) durch Quervernetzungen (7) verbunden werden,
dass die kovalente Bindung (8) über das 3'OH-Ende der synthetisierten Oligomere an den Träger (9) bei einem Teil, vorzugsweise bei einem überwiegenden Teil der synthetisierten Oligomere abgespalten wird, so dass freie 3'OH-Enden (3) entstehen, so dass nach dem Abspalten der 3'OH-Enden vom Träger ein Teil, vorzugsweise ein überwiegender Teil der synthetisierten Oligomere aufgrund der Quervernetzungen (7) am 5'OH-Ende (5) kovalent an den Träger (9) binden kann.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass zwei unterschiedliche Oligomere, insbesondere zwei unterschiedliche Oligonukleotide oder Oligoribonukleotide pro definiertem Ort (10) synthetisiert werden.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei dem Array (1) mehr als 100 ortsdefinierte Oligomere pro cm² an den Träger (9) gebunden werden.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass an das Array (1) DNA, RNA oder PNA hybridisiert wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Arrays (1) mit DNA- Polymerasen oder RNA-Polymerasen in Kontakt gebracht werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die genannten Arrays (1) für eine PCR- Analyse verwendet werden.

11. Festphasen-PCR, wobei Template-DNA an genau definierten Orten (10) an einen nach einem der Ansprüche 1 bis 10 auf einem Träger synthetisierten Primer hybridisiert und mittels eines steuerbaren Heizblocks (11) die zur Hybridisierung, zur DNA-Polymerisation und zum Aufschmelzen des DNA-Doppelstrangs jeweils benötigte Wärme zugeführt wird.

12. Vorrichtung zur Analyse der nach Anspruch 1 bis 10 synthetisierten Arrays (1) von Oligomeren, dadurch gekennzeichnet,
dass ein Heizblock (11) mit im wesentlichen planer Auflagefläche vorgesehen ist,
dass Mittel zum Einstrahlen von Anregungslicht (14), insbesondere von UV-Licht auf ein auf dem Heizblock befindliches Array vorgesehen sind,
dass eine Detektionseinheit (17), insbesondere ein CCD-Array für von dem Array von Oligomeren emittiertes Fluoreszenzlicht (19) vorgesehen ist und
dass zwischen der Detektionseinheit (17) und dem zu untersuchenden Array (1) ein Fluoreszenzlichtfilter (18) vorgesehen ist, der das Anregungslicht (14) ausblendet, aber das emittierte Fluoreszenzlicht (19) passieren läßt.

13. Verfahren zur Analyse der nach Anspruch 1 bis 10 synthetisierten Arrays (1) von Oligomeren unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet,
dass ein zu untersuchendes Array in engen Kontakt mit dem Heizblock (11) gebracht wird,
dass das Array (1) zur Vermeidung der Verdunstung eines Reaktionspuffers mit einer lichtdurchlässigen planen Folie oder Scheibe (13) abgedeckt wird,
dass das Array (1) zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen mit Anregungslicht (14), insbesondere mit UV-Licht, bestrahlt wird,
dass die von der Detektionseinheit (17) erfaßten Daten auf einen im wesentlichen handelsüblichen Computer übertragen und dort einer Bildanalyse unterzogen werden.

14. Verfahren zur Analyse der nach Anspruch 1 bis 10 synthetisierten Arrays (1) von Oligomeren unter Verwendung einer Vorrichtung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Arrays (1) mit der in Anspruch 12 genannten Vorrichtung analysiert werden.

15. Träger mit wenigstens einem Array von Oligomeren mit freien 3'OH-Enden zur parallelen Analyse von PCR-Reaktionen, dadurch gekennzeichnet, dass das Array nach einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren auf den Träger aufgebracht wurde.

16. Träger nach Anspruch 15 mit einer Oligonukleotidbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidbibliothek durch die kombinatorische Synthese einer begrenzten Zahl von geeigneten Monomeren entstanden ist.

17. Träger nach Anspruch 15 oder 16 mit einer Oligonukleotidbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidbibliothek als 2-dimensionales Array auf dem in geeigneter Weise derivatisierten Träger vorliegt, wobei die einzelnen Bestandteile der Oligonukleotidbibliothek ortsgenau zugeordnet sind.

18. Träger nach einem der Ansprüche 15 bis 17 mit einer Oligonukleotidbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidbibliothek ein freies 3'OH-Ende hat, das nach der Hybridisierung von Template-DNA Substrat von template abhängigen DNA-Polymerasen oder RNA-Polymerasen ist.

19. Träger nach einem der Ansprüche 15 bis 18 mit einer Oligonukleotidbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass in der Oligonukleotidbibliothek zwei definierte Oligonukleotide pro definiertem Ort synthetisiert wurden.

20. Träger mit wenigstens einem Array von Oligomeren, die einem in situ Reinigungsschritt unterworfen worden sind, dadurch gekennzeichnet, dass das Array nach einem der in den Ansprüchen 1 bis 10 beschriebenen Verfahren auf den Träger aufgebracht wurde.

21. Verfahren zur Synthese eines träger-gebundenen Arrays (1) von Oligomer-Paaren (21), insbesondere von Oligonukleotiden (2) oder von Oligoribunukleotiden, dadurch gekennzeichnet,
dass pro definiertem Ort auf einem Array (10) mindestens zwei voneinander verschiedene Oligomere (2) synthetisiert oder aufgebracht werden,
dass beide Oligomere (2) freie 3'-OH-Enden (3) haben oder zu freien 3'-OH-Enden (3) derivatisiert werden können und
dass mit dem Array von Oligomer-Paaren (21) eine hochgradig parallelisierte Polymerasen Kettenreaktion (PCR) durchgeführt wird.