DE69314951T2

DE69314951T2 - Dns sequenzierungsverfahren

Info

Publication number: DE69314951T2
Application number: DE69314951T
Authority: DE
Inventors: Sydney Brenner; Andre Rosenthal
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1992-04-22
Filing date: 1993-04-22
Publication date: 1998-03-19
Anticipated expiration: 2013-04-23
Also published as: EP0640146B1; US6087095A; WO1993021340A1; JPH07507681A; DE69314951D1; EP0640146A1; GB9208733D0; ATE159766T1; CA2133956C; ES2110604T3; AU4020893A; CA2133956A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur DNA- Sequenzierung. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur automatisierten Sequenzierung großer DNA-Fragmente.
Die DNA-Sequenzanalyse ist zu einem der wichtigsten Werkzeuge geworden, die dem Molekularbiologen zur verfügung stehen. Die gegenwärtige Sequenzierungstechnik ermöglicht die Gewinnung von Sequenzdaten aus praktisch jedem DNA- Fragment. Dadurch wurde nicht nur die Sequenzterung kompletter Gene und anderer genomischer Sequenzen möglich, sondern auch die Identftizierung der Sequenz von RNA- Transkripten durch cDNA-Sequenzierung. Gegenwärtig wird die Betonung auf die genomische Sequenzierung zur Bestimmung der DNA-Sequenz kompletter Genome gelegt. Letztendlich hofft man, die Sequenz des menschlichen Genoms zu entziffern.
Die herkömmlichen DNA-Sequenzierungstechniken haben drei wesentliche Schritte in ihrem Ansatz der Sequenzbestimmung gemeinsam. Zunächst wird aus einer DNA-Spezies, die sequenziert werden soll, eine Vielzahl von DNA-Fragmenten erzeugt. Diese Fragmente sind unvollständige kopien der zu sequenzierenden DNA-Spezies. Das Ziel ist es, eine Leiter aus DNA-Fragmenten zu bilden, von denen jedes eine Base länger ist als das vorhergehende. Dies läßt sich durch selektiven chemischen Abbau mehrerer Kopien der zu sequenzierenden DNA-Spezies wie beim Verfahren von Maxam und Gilbert erreichen (A. Maxam und W. Gilbert, PNAS 74, S. 560, 1977). Alternativ kann die DNA-Spezies als Matrize für eine DNA- Polvmerase dienen, um eine Reihe unvollständiger kione zu bilden wie beim Verfahren von Sanger (F. Sanger, S. Nicklen und A. Coulson, PNAS 74, S. 5463, 1977). Diese Fragmente, die sich in ihrer Länge jeweils nur durch eine Base unterscheiden, werden dann auf einer Apparatur getrennt, die Größenunterschiede von einer einzigen Base auftrennen kann. Bei diesem Vorgang wlra stets ein dünnes Polyacryiamid-Gel verwendet. Der dritte und letzte Schritt ist die Bestimmung der Art der Base am Ende eines jeden Fragments. Ordnet man diese Basen nach der Größe der Fragmente, deren Terminus sie bilden, so ergeben sie die Sequenz der ursprünglichen DNA-Spezies.
Die Bestimmung der Art der jeweiligen Base wird durch vorhergehendes Selektionieren der terminalen Base eines jeden Fragments erreicht. Beim Sanger-Verfahren beispielsweise werden Dideoxynucleosidtriphosphate (ddNTPs) verwendet, um wachsende DNA-klone selektiv an einem A-, C-, G- oder T-Rest zu terminieren. Dies bedeutet, daß für jeden Sequenzierungsdurchgang vier verschiedene Reaktionen durchgeführt werden müssen, jeweils in einem gesonderten Röhrchen und mit einem anderen ddNTP. In einem Röhrchen endet daher jedes marklerte Fragment mit einem A-Rest, dagegen im nächsten Röhrchen mit einem C-Rest und so weiter. Wird jede Gruppe von Fragmenten nebeneinander auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt, so zeigt sich die Sequenz der Matrize anhand der relativen Größe der einzelnen Fragmente.
Beim Verfahren von Maxam und Gilbert dagegen wird die Selektivität beim chemischen Abbauprozeß erreicht. Es werden Chemikalien verwendet, welche die DNA-Stränge nur an A, nur an C, G und A oder T und C spalten. Die Verwendung von Grenzkonzentrationen derartiger Chemikalien ermöglicht den partiellen Verdau der DNA-Spezies. Wie bei der Sanger- Methode müssen vier verschiedene Reaktionen ausgeführt und die Produkte nebeneinander auf einem Polyacrylamid-Gel getrennt werden.
Die Nachteile dieser Verfahren des Standes der Technik sind zahlreich. Sie erfordern die Durchführung einer Reihe komplizierter Bearbeitungen in wenigstens vier Röhrchen. Sie sind fehleranfällig aufgrund der Bildung sekundärer Strukturen in der DNA oder anderer Phänomene, welche eine getreue Replikation einer DNA-Matrize beim Sanger-Verfahren verhindern oder bewirken, daß die Basenspezifität durch die reagierenden chemischen Stoffe beim Verfahren von Maxam und Gilbert verlorengeht. Die schwerwiegendsten Probleme ergeben sich jedoch aus der Erfordernis, die DNA-Fragmente an einem Polyacrylamid-Gel der Größe nach zu trennen. Dieser Vorgang ist zeitraubend, verbraucht große Mengen teurer Chemikalien, und schränkt infolge des begrenzten Auflösungsvermögens des Geis die Zahl der Basen erheblich ein, die bei jedem einzelnen Experiment sequenziert werden können. Des weiteren ist das Ablesen der Gele zur Gewinnung der Daten arbeitsintensiv und langsam.
Es wurde eine Reihe von Verbesserungen an diesen Sequenzierungsverfahren vorgenommen, um die Wirksamkeit und Schnelligkeit der DNA-Sequenzierung zu verbessern. Einige dieser Verbesserungen betreffen die Sequenzierungsreaktion selbst. Beispielsweise wurden verbesserte Polymerase-Enzyme wie z.B. Sequenase und Taquenase eingeführt, die größere Genauigkeit beim Sanger-Verf ahren ergeben. Verbesserte Reagenzien beeinflussen jedoch die Schnelligkeit bei der Erstellung der Sequenzierungsdaten nicht wesentlich oder vereinfachen den Sequenzierungsvorgang nicht wesentlich.
Im Interesse sowohl von Schnelligkeit als auch Einfachheit wurde in den letzten Jahren eine Reihe von "Sequenzierautomaten" eingeführt (besprochen in T. Hunkapiller, R. Kaiser, B. Koop und L. Hood, Science, 254, S. 59, 1991). Diese Geräte sind jedoch keine echten Sequenzierautomaten. Es sind lediglich automatische Gel-Ableser, bei denen die standardmäßigen Sequenzierungsreaktionen durchgeführt werden müssen, ehe die Proben auf das Gel aufgebracht werden. Allerdings erbringen sie schon eine geringfügige Erhöhung der Schnelligkeit wegen schnellerer Ablesung der Gele und Abgleichung der gewonnenen Daten in Computern für die nachfolgende Analyse.
Bei vielen Sequenzierautomaten werden neuere Entwicklungen genutzt, die in der Markierungstechnik erreicht wurden. In herkömmlicher Weise werden radioaktive Markierungen in Form von ³²P oder ³&sup5;S verwendet, um jedes DNA-Fragment zu markieren. In neuerer Zeit haben jedoch Fluorophore als Markierung Anerkennung gefunden. Diese Farbstoffe, die entweder am Sequenzierungsprimer oder an Nudeotide angelagert werden, werden auf dem Polyacrylamid-Gel von einem Laser- Strahl in einen fluoreszierenden Zustand angeregt. Ein Sequenzierautomat kann daher markierte Fragmente erfassen, wenn sie unter einem Laser in einen Ablesebereich gelangen. Die Verwendung von Farbstoffen, die bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren, gestattet das einzelne Markieren von A-, G-, C- und T-Resten, wodurch es möglich wird, die Produkte aller vier Sequenzierungsreaktionen in einer einzigen Bahn des Gels laufen zu lassen.
Doch auch durch Einführen derartiger Verfeinerungen können Sequenzierautomaten noch immer nicht mehr als etwa 100 kb an fertiggestellter Sequenz pro Person und Jahr liefern. Bei dieser Geschwindigkeit würde eine Person 73 000 Jahre zur Sequenzierung des menschlichen Genoms brauchen.
Soll das Ziel der Sequenzierung des menschlichen Genoms erreicht werden, dann ist klar, daß die gegenwärtige Sequenzierungstechnik völlig unzulänglich ist. Angesichts dessen wurden einige Vorschläge für alternative Sequenzierungsstrategien gemacht, bei denen es sich nicht um bloße Verbesserungen der alten Technik handelt.
Eines dieser Verfahren, die Sequenzierung durch Hybridisierung (SBH), beruht auf dem mathematischen Nachweis, daß die Sequenz eines relativ kurzen (beispielsweise 100 kbp) Fragments von DNA erhalten werden kann durch Synthetisieren aller möglichen N-meren Oligonudeotide und Bestimmen, welche Oligonudeotide an das Fragment ohne eine einzige Fehlpaarung hyhridisieren (R. Drmanac, I. Labat, I. Bruckner und R. Crkvenjakov, Genomics, 4, S. 114, 1989; R. Drmanac, Z. Stvanovic, R. Crkvenjakov, DNA Cell Biology 9, S. 527, 1990; W. Bains und G. Smith, J. Theor. Biol. 135, S. 303-307, 1988; K.R. Khrapko et al., FEBS Lett. 256, S. 118- 122, 1989; P.A. Pevzner, J. Biomolecular Structure and Dynamics 7, 5. 63-73, 1989; U. Maskos und E.M. Southern, Cold Spring Harbour Symposium on Genome Mapping and Sequencing, Abstracts, 5. 143, 1991). N kann 8, 9 oder 10 sein, wobei diese Größen einen Kompromiß zwischen der Erfordernis nach vernünftigen Hybridisierungsparametern und handlichen Bibliothekgrößen darstellen.
Die Technik kann durch Binden der Oligonudeotide auf einem zweidimensionalen Gitter in einem bekannten Muster automatisiert werden. Das zu sequenzierende Fragment wird anschließend an die Oligonudeotide auf dem Gitter hybridisiert, und die Oligonudeotide, an welche die Sequenz hybridisiert hat, werden mit einem rechnergestützten Detektor erfaßt. Die Bestimmung der DNA-Sequenz ist dann eine Sache der Berechnung.
Allerdings ergeben sich Fehler aus der Schwierigkeit bei der Bestimmung des Unterschieds zwischen perfekter Übereinstimmung und Einzelbasen-Fehlpaarungen. Ein Problem können auch die repetitiven Sequenzen sein, die recht häufig im menschlichen Genom auftreten.
Ein weiterer Vorschlag betrifft den Fluoreszenznachweis enzelner Moleküle (J. Jett et al., J. Biomol. Struct. Dyn. 7, S. 301, 1989; D. Nguyen, et al., Anal. Chem. 56, S. 348, 1987). Bei diesem Verfahren wird ein einzelnes, großes DNA- Molekül in eine Fließströmung gehängt, unter Anwendung von Lichtdruck von einem Paar Laser-Strahlen. Einzelne Basen, von denen jede mit einem kennzeichnenden Fluorophor markiert ist, werden dann vom Ende des Moleküls her abgeschnitten une von der Fließströmung durch einen Fluoreszenzdetektor getragen
Dieses Verfahren könnte möglicherweise die genaue Sequenzierung einer großen Zahl von Basenpaaren - mehreren hundert - pro Sekunde ermöglichen. Allerdings ist die Durchführbarkeit dieser Methode noch nicht erwiesen.
Ein drittes Verfahren ist die Sequenzierung mittels Rastertunnelmikroskopie (scanning tunnelling microscopy; STM) (S. Lindsay, et al., Genet. Anal. Tech. Appl. 8, S. 8, 1991; D. Allison et al., Scanning Microsc., 4, S. 517, 1990; R. Driscoll et al., Nature 346, 5. 294, 1990; M. Salmeron et al., J. Vac. Sci. Technol. 8, 5. 635, 1990). Diese Technik erfordert direktes dreidimensionales Abbilden eines DNA- Moleküls unte Anwendung der STM. Zwar können Abbildungen der einzelnen Basen erhalten werden, doch bleibt die Interpretation dieser Abbildungen sehr schwierig. Das Verfahren ist noch unzuverlässig, und die Erfoigsrate ist gering.
Ein viertes Verfahren betrifft den Nachweis der Pyrophosphat-Gruppe, die aufgrund der Polymerisationsreaktion freigesetzt wird, welche eintritt, wenn ein Nucleotid im Zuge einer Primer-Verlängerungs reaktion an einen DNA-Primer angefügt wird (E.D. Hyman, Anal. Biochem. 174, S. 423, 1988). Bei diesem Verfahren wird versucht, das Anfügen einzelner Nudeotide an einen Primer zu erfassen, wobei das Enzym Luciferase verwendet wird, um ein Signal bei Freisetzung von Pyrophosphat zu erzeugen. Allerdings weist dieses Verfahren eine Reihe von Nachteilen auf, nicht zuletzt den, daß dATP ein Substrat für Luciferase ist und daher immer ein Signal ergibt, ob es nun in die Kette eingebaut wird oder nicht. Die angefügten Nucleotide sind nicht markiert, und es wird keine Methode offenbart, die die Verwendung markierter Nucleotide ermöglichen würde. In WO91/06618 wtrd ein Verfahren zur sequenzierung von DNA beschrieben, hei dem die Blockierungsgruppe und die Reportergruppe an die 3'-OH-Gruppe der Zuckereinheit gebunden sind. Diese Nucleotid-Derivate sind sehr schlechte Substrate für Polymerasen. Zudem ist das Deblockieren der Schutzgruppe und der Reportergruppe schwierig, ergibt schlechte Ausbeuten und führt zur Denaturierung der doppelsträngigen DNA.
Zusammenfassend wird zwar ein jeder der vorstehend beschriebenen neuen Ansätze zur DNA-Sequenzierung einige der mit den herkömmlichen Methoden verbundenen Probleme lösen, bringt aber etliche eigene Probleme ein. Allgemein sind die meisten dieser Verfahren aufwendig und gegenwärtig nicht durchführbar.
Es besteht daher Bedarf an einem Sequenzierungsverfahren, das schnelle, eindeutige Sequenzierung von DNA zu geringen Kosten ermöglicht. Die Anforderungen an ein solches System sind:
1. es sollte nicht auf der Geitrennung unterschiedlich großer Oligomere beruhen;
2. es sollte schnellere Sequenzierung als aktuelle Verfahren ermöglichen;
3. es sollte die parallele Verarbeitung mehrerer DNA-Klone ermöglichen;
4. die Kosten für Hardware sollten im Rahmen bleiben;
5. es sollte weniger pro Base der Sequenz kosten als die aktuelle Technologie; und
6. es sollte zum gegenwärtigen Zeitpunkt technisch durchführbar sein
Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Sequenzierungssystem bereit, umfassend ein Verfahren zum sequentiellen Anfügen von Nudeotiden an einen Primer auf einer DNA-Matrize.
Nach einem ersten Aspekt der vorliegenaen Erfindung wird ein Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Nucleinsäure bereitgestellt, umfassend die Schritte:
a) Bildung einer einsträngigen Matrize, umfassend die zu sequenzierende Nucleinsäure;
b) Hybridisierung eines Primers an die Matrize, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;
c) Verlängerung des Primers durch Anfügen eines einzelnen markierten Nucleotids, wobei das markierte Nucleotid kein Kettenverlängerungsinhibitor ist;
d) Bestimmung der Art des am Primer angefügten markierten Nucleotids;
e) Entfernung oder Neutralisierung der Markierung; und
f) sequentielle Wiederholung der Schritte c) bis e) und Aufzeichnung der Reihenfolge des Einbaus der markierten Nucleotide.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren wird eine einsträngige Matrize aus einem Nucleinsäure-Fragment erzeugt, welches man zu sequenzieren wünscht. Vorzugsweise ist die Nucleinsäure DNA. Ein Teil der Sequenz dieses Fragments ist möglicherweise bekannt, so daß ein spezieller Prlmer aufgebaut und an die Matrize hybridisiert werden kann. Alternativ kann ein Linker an ein Fragment unbekannter Sequenz ligasiert werden, um die Hybridisierung eines Primers zu ermöglichen.
Die Matrize kann linear oder kreisförmig sein. Vorzugsweise ist die Matrize an einen Festphasenträger gebunden. Die Matrize kann beispielsweise an einen Stift, eine Glasplatte oder einen Sequenzierungschip gebunden sein. Die Bereitstellung einer Festphasen-Matrize ermöglicht schnel]es und wirksames Zugeben und Entfernen von Reagenzien, insbesondere wenn das erfindungsgemäße Verfahren automatisiert ist. Außerdem lassen sich viele Proben tm gleichen Gefäß verarbeiten und dennoch getrennt halten.
Vorzugsweise wird die Matrize mit Hilfe eines bindenden Linkers an den festen Träger gebunden. Beispielsweise kann einer der handelsüblichen W-niversalprimer an das 5'-Ende der Matrize igasiert oder mit Hilfe der Polymerase- Kettenreaktion problemlos an einem der Enden der Matrizen eingebaut werden.
Der bindende Linker kann mit Hilfe eines Biotin/- Streptavidin-kopplungssystems an den festen Träger gebunden werden. Zum Beispiel kann die Oberfläche des festen Trägers derivatisiert werden durch Aufbringen von Biotin, gefolgt von Streptavidin. Dann wird ein biotinylierter bindender Linker an die Matrize ligasiert, um sie an den festen Träger zu binden, oder die mittels PCR erzeugte biotinylierte Matrize wird an den festen Träger gebunden.
In einer alturnativen Ausführungsform wird ein unligasierter bindender Linker mit Hilfe des Biotin/Streptavidin- Systems an den festen Träger gebunden. Dann wird die Matrize an den bindenden Linker hybridisiert. Der bindende Linker kann ein gesonderter bindender Linker sein, bei dem es sich nicht um den Sequenzierungsprimer handelt. Alternativ kann der bindende Linker auch als Sequenzierungsprimer fungieren.
Offensichtlich ist es bei der letzteren Ausführungsform wesentlich, daß die Matrize eine Komplementaritätsregion zu dem am festen Träger gebundenen bindenden Linker besitzen sollte. Ist die Matrize an einen Linker ligasiert, so kann die Komplementarität durch diesen Linker bereitgestellt werden. Alternativ kann der bindende Linker zu einer unverwechselbaren Sequenz in der Matrize selbst komplementär sein.
Vorzugsweise wird der feste Träger unter Verwendung einer Maske derivatislert, um so eine hochauflösende Packung der Matrize(n) aul dem Träger zu ermöglichen. Auf diese Weise kann eine Anordnung von Matrizenbindungsbereichen auf einer Glasplatte oder einem Sequenzierungschip gebildet werden, wodurch die parallele Bearbeitung einer großen Zahl verschiedener Matrizen möglich wird. Werden Stifte als fester Träger verwendet, so wird für jede Matrize ein einziger Stift benötigt. Die einzelnen Stifte können zu Anordnungen gruppiert werden. Es wird ins Auge gefaßt, daß eine Anordnung von 100 × 100 Stiften oder Bindungsbereichen verwendet werden kann, um die gleichzeitige Bearbeitung von 10&sup4; Klonen zu ermöglichen.
Der Primer wird mit Hilfe einer DNA-Polymerase in Gegenwart eines einzelnen markierten Nucleotids, entweder A, C, G oder T, verlängert. Geeignete DNA-Polymerasen sind beispielsweise Sequenase 2.0 , T4-DNA-Polymerase oder das Klenow-Fragment von DNA-Polymerase 1 sowie wärmebeständige Polymerasen wie etwa Taq-Polymerase (zum Beispiel Taquenase ) und Vent-Polymerase.
Bei einem manuell ausgeführten Verfahren unter Verwendung einer einzelnen Matrize werden die markierten Nucleotide einzeln und nacheinander eingesetzt, um zu versuchen, das Nucleotid an den Primer anzufügen. Das Nucleotid wird am Primer angefügt, wenn es zum nächsten Nucleotid in der Matrize komplementär ist. Es können ein, zwei, drei oder vier Schritte erforderlich sein, ehe das passende markierte Nucleotid verwendet wird. Sobald jedoch festgestellt wird, daß ein markiertes Nucleotid am Primer angefügt ist, kann Schritt (e) ausgeführt werden.
Bei einem automatisierten Verfahren, besonders wenn eine große Anzahl Matrizen gleichzeitig sequrnziert werden, werden in Schritt (c) alle vier markierten Nudeotide nacheinander eingesetzt, und man achtet lediglich darauf, welches der markierten Nudeotide angefügt wird; d.h., es wird festgestellt, ob es das erste, zweite, dritte oder vierte markierte Nucleotid ist, das angefügt wird.
Es wurde gefunden, daß unspezifisches End-Anfügen und falscher Einbau von Nucleotiden zu Hintergrund-Problemen führen Konnen, wenn der Einbauschritt einige Male wiederholt worden ist. Diese Nebenreaktionen gehen hauptsächlich darauf zurück, daß ein einziges Nucleotid und nicht alle vier Nucleosidtriphosphate vorliegen. Tatsächlich wurde beobachtet, daß es zwar möglich ist, bestimmte Matrizen durch sequentielles Anfügen einzelner Nudeotide in Abwesenheit der anderen drei zu sequenzieren, sich aber erhebliche Probleme mit anderen Matrizen ergeben, besonders denjenigen Matrizen, die mehrere Basenwiederholungen enthalten, was auf den unspezifischen Einbau eines Nucleotids zurückgeht, der dadurch hervorgerufen wird, daß die Polymerase effektiv eine nichtkomplementäre Base überspringt.
Um hohe Arbeitsgenauigkeit beim Primer-Verlängerungsschritt sicherzustellen, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, den Schritt (c) in Gegenwart von Kettenverlängerungsinhibitoren auszuführen.
Kettenverlängerungsinhibitoren sind Nucleotid-Analoga, die entweder Kettenterminatoren sind, die das weitere Anfügen von Nucleotiden an das 3'-Ende der Kette durch die Polymerase verhindern, indem sie selbst in die Kette eingebaut werden oder um den Einbau konkurrieren, ohne tatsächlich eingebaut zu werden. Vorzugsweise sind die Kettenverlängerungsinhibitoren Dideoxynucleosidtriphosphate. Werden die Kettenverlängerungsinhibitoren in die wachsende Polynucleotid-Kette eingebaut, so ist es wichtig, daß sie entfernt werden, nachdem der Einbau des markierten Nucleotids festgestellt wurde, damit die Sequenzierungsreaktion unter Verwendung der verschiedenen markierten Nucleotide weitergehen kann. Wie nachstehend beschrieben, wurde gefunden, daß 3'T5'-Exonucleasen wie beispielsweise Exonudease III imstande sind, Dideoxynudeotide zu entfernen. Dieser Befund ermöglicht die Verwendung von Dideoxynudeotiden als Kettenverlängerungsinhibitoren, um die Genauigkeit der Polymerase beim erfindungsgemäßen Sequenzierungsverfahren zu fördern. Die Genauigkeit der Polymerase ist wesentlich, wenn 10&sup4; klone gleichzeitig bearbeitet werden sollen, denn es ist die hohe Polymerase- Genauigkeit, die ermöglicht, daß die Sequenzierungsreaktion mit einer einzigen Matrize anstelle von vier verschiedenen Reaktionen durchgeführt werden kann.
Alternativ können die Kettenverlängerungsinhibitoren Deoxynucleosid-5'-[α,β-methylen] triphosphate sein. Diese Verbindungen werden nicht in die Kette eingebaut. Es können auch andere Nucleotid-Derivate wie beispielsweise Deoxynucleosiddiphosphate oder Deoxynudeos idinonophosphate verwendet werden, die ebenfalls nicht in die Kette eingebaut werden.
Eine weitere Überlegung ist, daß blockierende Gruppen an der 3'-Einheit der Deoxyribose-Gruppe des markierten Nucleotids verwendet werden können, um unspezifischen Einbau zu verhindern. Vorzugsweise wird daher das markierte Nucleotid durch Anlagern einer Fluoreszenzfarbstoff-Gruppe an die 3'-Einheit der Deoxyribose-Gruppe markiert, und die Markierung wird durch Abspaltung des Fluoreszenzfarbstoffs vom Nucleotid entfernt, unter Bildung einer 3'-Hydroxyl- Gruppe. Der Fluoreszenzfarbstoff ist vorzugsweise durch einen Linker-Arm an die Deoxyribose geknüpft der chemisch oder enzymatisch ohne weiteres abgespalten wird.
Offensichtlich sollten bei Verwendung von Nucleotid-analogen Kettenverlängerungsinhibitoren nur solche Analoga zugesetzt werden, die nicht dem markierten Nucleotid entsprechen. Derartige Analoga werden hierin als heterogene Kettenverlängerungsinhibitoren bezeichnet.
Idealerweise wird die Markierung nur dann in den Matrizel/Primer-Kompiex eingebaut, wenn das der Reaktion zugesetzte markierte Nucleotid komplementär zu dem Nucleotid auf der Matrize ist, das dem 3'-Ende des Primers benachbart ist. Die Matrize wird anschließend gewaschen, um jegliche nicht eingebaute Markierung zu entfernen, und die Gegenwart jeglicher eingebauter Markierung wird bestimmt. Eine radioaktive Markierung kann durch Zählen oder irgendeine andere, in der Fachwelt bekannte Methode bestimmt werden, während Fluoreszenzmarkierungen beispielsweise durch Laser-Anregung zum Fluoreszieren gebracht werden können.
Es dürfte klar sein, daß jede Markierung, die in der Fachwelt als geeignet zur Markierung von Nucleinsäuren bekannt ist, bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann. Allerdings wird gegenwärtig die Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen bevorzugt, was auf die Empfindlichkeit der zur Zeit verfügbaren Nachweissysteme für derartige Markierungen zurückgeht, bei denen keine radioaktiven Substanzen verwendet werden.
Zu den Beispielen für gegenwärtig verfügbare fluoreszenzmarkierte Nudeotide gehören Fluorescein-12-DUTP, Fluorescein-15-dCTP, Fluorescein-15-dATP und Fluorescein-15-dITP. Es hat sich als sehr schwierig erwiesen, eine geeignete fluoreszierende Guanosin-Verbindung zu synthetisieren, so daß eine Inosin-Verbindung an deren Stelle verwendet wird. Sollte eine fluoreszierende Guanosin-Verbindung verfügbar werden, so wird deren Verwendung bei der vorliegenden Erfindung ins Auge gefaßt.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, eine Mischung aus unmarkierten und markierten Nucleotiden beim Anfügeschritt zu verwenden.
Bei Verwendung einer Fluoreszenzmarkierung haben sich für die Herstellung aller möglichen Verlängerungsprodukte auf einer Matrize, die eine Serie eines bestimmten Nucleotids besitzt, die folgenden Verhältnisse als etwa optimal erwiesen:
Fluorescein-15-dATP/dATP 500:1
Fluorescein-15-dITP/dGTP 500:1
Fluorescein-12-dUTP/dTTP 15:1
Fluorescein-12-dCTP/dCTP 15:1.
Vorzugsweise werden deshalb die obigen Verhältnisse im Zusammenhang mit fluoreszenzmarkierten Nucleotiden verwendet.
Durch Wiederholen der Schritte des Einbaus und Markierungsnachweises bis zum Nachweis eines Einbaus läßt sich das Nucleotid auf der Matrize identifizieren, das dem 3'-Ende des Primers benachbart ist. Sobald dies erreicht ist, muß die Markierung vor dem Wiederholen des Vorgangs entfernt werden, um die Identität des nächsten Nucleotids herauszufinden. Das Entfernen der Markierung kann durch Entfernen des markierten Nucleotids mit einer 3'T5'-Exonuclease und nachfolgendes Ersetzen durch ein unmarkiertes Nucleotid erfolgen. Alternativ kann die Markierungsgruppe vom Nucleotid entfernt werden. Bei einer weiteren Alternative - wenn die Markierung eine Fluoreszenzmarkierung ist - ist es möglich, die Markierung durch Entfärben mit Laser-Strahlung zu neutralisieren.
Wurden Kettenterminatoren oder 3'-blocklerende Gruppen verwendet, so sollten diese entfernt werden, ehe der nächste Zyklus stattfinden kann. Kettenterminatoren werden vorzugsweise mit einer 3'T5'-Exonuclease entfernt. Vorzugsweise wird Exonudease III verwendet. 3'-Blockierende Gruppen können durch chemische oder enzymatische Abspaltung der blockierende Gruppe vom Nucieotid entfernt werden.
Bei Verwendung von Exonudease III zum Entfernen der Kettenterminatoren ist es wesentlich, zu verhindern, daß sich die Exonudease III entlang der wachsenden Kette zurückfrißt und so Nudeotide, die bereits eingebaut wurden, oder gar den Primer selbst entfernt. Zur Ersetzung der markierten Nudeotide wird daher vorzugsweise ein Nucleosid- Derivat eingesetzt, das der Abspaltung durch Exonucleasen widersteht. Vorteilhaft werden Deoxynucleosidphosphorothioattriphosphate (dsNTPs) verwendet. Ebenso umfaßt der Primer vorzugsweise eine Phosphorothioatnucleosid-Base (n) an seinem 3'-Ende, die bei der Primer-Synthese oder einem zusätzlichen enzymatischen Capping-Schritt eingebaut wird.
Es ist bekannt, daß Deoxynucleosidphosphorothioat-Derivate dem Verdau durch Exonudease III widerstehen (S. Labeit et al., DNA 5, S. 173, 1986). Diese Widerstandsfähigkeit besteht jedoch nicht uneingeschränkt, und die Bedingungen sollten angepaßt werden, um sicherzustellen, daß übermäßiger Verdau und Entfernen von Phosphorothioat-Basen nicht eintritt.
Zum Beispiel wurde gefunden, daß der pH des exoIII-Puffers (50 mM Tris/HCl, 5 mM MgCl&sub2;) das Ausmaß des eintretenden Zurückfressens beeinflußt. Experimente, die bei pH 6,0, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 und 10,0 (37ºC) durchgeführt wurden, zeigen, daß pH 10,0 das Optimum hinsichtlich Reaktionsgeschwindigkeit und Spezifität von exolil ist. Es wurde gezeigt, daß die Reaktion bei diesem pH in weniger als 1 Minute ohne feststellbares Zurückfressen vollständig abläuft.
Sobald die Markierung und die terminierenden/blockierenden Gruppen entfernt sind, wird der Zyklus wiederholt, um die Identität des nächsten Nucleotids festzustellen.
Bei einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Schritte (c) und (d) im ersten Aspekt der Erfindung vor dem Entfernen oder Neutralisieren der Markierung mehrmals nacheinander wiederholt.
Wie oft sich die Schritte (c) und (d) wiederholen lassen, richtet sich nach der Empfindlichkeit des Geräts, mit dem erfaßt wird, wenn ein markiertes Nucleotid an den Primer angefügt worden ist. Ist beispielsweise jedes Nucleotid mit einer anderen Fluoreszenzmarkierung markiert, so muß das Nachweisgerät eine jede Markierung unterscheiden können und ist idealerweise in der Lage, die Anzahl eines jedes Fluoreszenzmarkierungstyps zu zählen. Alternativ muß, wenn jedes Nucleotid radioaktiv markiert oder mit dem gleichen Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, das Gerät die Gesamtzahl der Markierungen zählen können, die an den Primer angefügt wurden.
Wie bei der ersten Ausführungsform der Erfindung werden bei manueller Arbeitsweise unter Verwendung einer einzigen Matrize die markierten Nudeotide einzeln und nacheinander eingesetzt, bis ein markiertes Nucleotid angefügt ist, worauf die Abfolge wiederholt wird. Bei automatisierter Arbeitsweise werden alle vier markierten Nudeotide nacheinander eingesetzt, und das Gerät ist so programmiert, daß es erfaßt, welche Nudeotide in welcher Reihenfolge an den Primer angefügt wurden.
Sobald die Anzahl Markierungen das Trennvermögen des Nachweisgeräts erreicht hat, wird das Entfernen oder Neutralisieren der Markierung in einem Schritt durchgeführt. So wird die Anzahl Schritte beim Entfernen der Markierungen wesentlich verringert.
Bei dieser alternativen Ausführungsform umfassen die Schritte (c) und (d) im ersten Aspekt der Erfindung vorzugsweise:
Zufügen eines markierten Nucieotids zusammen mit drei heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, etwa 5'-[α,β-Methylen] triphosphate;
ii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;
iii) Bestimmen, ob die Markierung eingebaut wurde; und
iv) Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) mit einem anderen markierten Nucleotid bis entweder ein markiertos Nucleotid eingebaut wurde oder alle vier markierten Nudeotide verwendet wurden.
Diese Technik erfordert die Verwendung eines anspruchsvolleren Zählers oder Markierungsmeßgeräts. Für Serien repetierter Nucleotide sollte das Markierungsmeßgerät in der Lage sein, das Vorhandensein von zwischen vier und sechzehn markierten Nucleotiden genau zu erfassen. Für die Messung langer Spannen repetierter Nucleotide kann ein Gerät größerer Kapazität erforderlich sein.

Schema 1

Entsprechend einem bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Fragment nach folgendem Schema sequenziert:
1) ein mit Cap versehener Primer, der ein Phosphorothioatdeoxynucleosid-Derivat enthält, wird an eine Matrize hybridisiert, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;
2) ein markiertes Deoxynucleosidtriphosphat (dNTP), wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, wird zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren und einer geeigneteh Polymerase dem Matrize/Primer-Komplex zugefügt;
3) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
4) die Menge eingebauter Markierung wird gemessen;
5) der Matrize/Primer-Komplex wird zur Entfernung des markierten Nucleotids und der Kettenterminatoren mit einer Exonudease behandelt;
6) die Exonuclease wird durch Waschen entfernt;
7) ein Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphat, entsprechend dem in Schritt 2 zugefügten markierten Deoxynucleosidtriphosphat wird zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren zugesetzt;
8) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
9) der Matrize/Primer-Kompiex wird zur Entfernung der Kettenterminatoren mit einer Exonuclease behandelt;
10) die Exonudease wird durch Waschen entfernt; und
11) die Schritte 2) bis 10) werden jeweils mit einem anderen markierten Nucleotid zusammen mit den passenden heterogenen Kettenterminatoren viermal wiederholt.
Beispielsweise könnte das markierte Nucleotid in obigem Schritt 2 dATP sein. In diesem Falle könnten die heterogenen Kettenterminatoren ddGTP, ddTTP und ddCTP sein. In Schritt 7 würde Phosphorothioat-dATP zugesetzt, um das markierte dATP zu ersetzen, das in Schritt 6 mit der Exonuclease entfernt worden war. Der Zyklus kann dann mit einem anderen markierten Nucieotid wiederholt werden, zum Beispiel dGTP zusammen mit den heterogenen Dideoxynucleosidtriphosphaten ddATP, ddTTP und ddCTP. Dadurch wird Markierung in alle Ketten eingebaut, die mit G weitergehen. Daran schließt sich wiederum markiertes dTTP und markiertes dCTP an, worauf wieder mit dATP, dGTP, dTTP und dCTP und so weiter fortgefahren wird.

Schema 2

Entsprechend einem zweiten bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Fragment nach folgendem Schema sequenziert:
1) ein mit Cap versehener Primer, der ein Phosphorothioatnucleosid-Derivat enthält, wird an eine Matrize hybridisiert, um einen Matrize/Primer-komplex zu bilden;
2) ein markiertes Deoxynucleosidtriphosphat, wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, wird zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren und einer geeigneten Polymerase dem Matrize/Primer-komplex zugefügt;
3) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
4) die Menge eingebauter Markierung wird gemessen;
5) markiertes Nucleotid und Kettenterminatoren werden mit einer Exonuclease entfernt;
6) die Exonuclease wird durch Waschen entfernt;
7) ein Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphat wird zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, zugesetzt;
8) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt; und
9) die Schritte 2) bis 8) werden jeweils mit einem anderen markierten Deoxynucleosidtriphosphat viermal wiederholt.
Dieses Schema ist im wesentlichen ein Unterschema zu Schema 1. Der Hauptunterschied ist, daß beim Capping-schritt 7 die Dideoxynucleotide durch die entsprechenden 5'-[α,β- Methylenjtriphosphat-Derivate ersetzt werden. Es können jedoch auch andere Kettenverlängerungsinhibitoren wie Deoxynucleosiddiphosphat- oder Deoxynucleosidmonophosphat- Derivate verwendet werden. Da diese Derivate nicht in die wachsende Polynucleotid-Kette eingebaut werden, besteht keine Notwendigkeit, sie zu entfernen. Daher fehlen bei Schema 2 der Schritt der Exonuclease-Behandlung und der nachfolgende Waschschritt von Schema 1 völlig.

Schema 3

Entsprechend einem dritten bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Fragment nach folgendem Schema sequenziert:
1) ein mit Cap versehener Primer, der ein Phosphorothioatdeoxynucleosid-Derfivat enthält, wird an eine Matrize hybridisiert, um einen Matrize/Primer- Komplex zu bilden;
2) ein markiertes Deoxynucleosidtriphosphat, wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein kettenverlängerungsinnibitor ist, wird zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, zugefügt;
3) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
4) die Menge eingebauter Markierung wird gemessen;
5) die Schritte 2 bis 4 werden unter Zusatz anderer markierter Deoxynucleosidtriphosphate in Gegenwart ihrer entsprechenden heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, wiederholt bis alle vier markierten Deoxynucleosidtriphosphate angefügt sind;
6) alle markierten Nudeotide werden mit Exonuclease entfernt;
7) die Exonudease wird durch Waschen entfernt;
8) das Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphat, entsprechend dem ersten der Reaktion in Schritt 2 zugefügten markierten Deoxynucleosidtriphosphat, wird zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhlbitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, und einer geeigneten Polymerase zugefügt;
9) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
10) die Schritte 8 und 9 werden mit den drei verbleibenden Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphaten wiederholt.
Dieses Schema hat den bemerkenswerten Vorteil, daß die Gesamtzahl der Exonudease-Schritte verringert wird. Alle vier markierten Nudeotlde werden nacheinaner an die Kette angefügt und einzeln erfaßt, ehe alle eingebauten Nucleotide durch einen einzigen Exonuclease-Verdauschritt entfernt werden. Die Chase-Reaktionen werden dann nacheinander mit den passenden Phosphorothioatnucleosid-Derivaten durchgeführt.

Schema 4

Entsprechend einem vierten bevorzugten Aspekt der Erfindung wird ein DNA-Fragment nach folgendem Schema sequenziert:
1) ein mit Cap versehener Primer wird an eine Matrize hybridisiert, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;
2) ein fluoreszierendes Nucleosidtriphosphat, wobei das fluoreszierende Nucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, wird zusammen mit drei heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, und einer geeigneten Polymerase zugefügt;
3) überschüssige Reagenzien werden durch Waschen entfernt;
4) die Menge eingebauter Markierung wird gemessen;
5) die Schritte 2 bis 4 werden mit allen drei verschiedenen Nucleosidtriphosphaten, ein jedes mit einer fluoreszierenden Markierung, in Gegenwart der jeweiligen heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, wiederholt;
6) die fluoreszierenden Markierungen werden durch Entfärben mit einem Laser oder mittels einer geeigneten chemischen Reaktion zerstört, oder die fluoreszierenden Markierungen werden mit Hilfe eines chemischen Spaltungsschritts entfernt.
Dieses Schema hat den Vorteil&sub1; daß keine enzymatische Abspaltung eingebauter Markierung mit Hilfe einer Exonudease-Reaktion erforderlich ist, noch ist eine Chase- Reaktion mit einem Phosphorothioatnucleosid-Derivat erforderlich. Stattdessen werden alle eingebauten Fluorophore chemisch zerstört, entweder mit Hilfe der Laser- Entfärbungstechnik oder geeigneter chemischer Reaktionen, um den Farbstoff zu zerstören oder den Farbstoff von den Nucleotiden abzuspalten.
Vorzugsweise muß, wenn der verwendete Detektor die quantitative Messung eingebauter Markierung erlaubt, der Entfärbungs- oder Spaltungsschritt nur von Zeit zu Zolt und nicht nach jedem aufeinanderfolgenden Anfügen durchgeführt werden.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Sequenzierungs-Kit bereitgestellt, umfassend mehrfach das Folgende:
i) einen Linker zur Anlagerung einer DNA-Matrize an eine Festphasenmatrix, wobei der Linker einen Primer mit einem Phosphorothioatdeoxynucleosid-Rest an dessen 3'-Ende umfaßt;
ii) Kettenverlängerungsinhibitoren;
iii) markierte Nucleosidtriphosphate;
iv) Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphate;
v) eine 5'T3'-DNA-Polymerase; und
vi) eine 3'T5'-Exonuclease.
Zudem kann ein solches Kit einen festen Träger zur Durchführung der Reaktion umfassen, sowie biotinylierte Primer oder Linker und Biotin/Streptavidin-Reagenzien zum Koppeln des Linkers an den festen Träger. Die 3'T5'- Exonuclease kann Exonudease III sein. Vorzugsweise umfaßt das Kit alle Komponenten i-vi.
Die Erfindung umfaßt auch einen Sequenzierungsautomaten, der so angepaßt ist, daß er eine Nudeinsäure im wesentlichen durch Ausführen der Schritte eines erfindungsgemäßen Verfahren sequenziert.
Das Gerät ist so angepaßt, daß es entweder den festen Träger, der die Matrize(n) trägt, in die erforderlichen Reagens- und Waschlösungen hinein- und herausbewegt oder Reagenzien und Waschlösungen nacheinander über den festen Träger pumpt. Der Träger vom Typ der Stiftanordnung ist für das erste Verfahren besser geeignet, während Glasplatten und Sequenzierungschips besser für das zweite geeignet sind.
Zwischen jede Reagenzienzugabe werden Waschschritte eingeschoben, um das Mitschleppen von Reagenzien zu minimieren.
Das Vorhandensein von Markierung läßt sich im Fall einer Chip-Anordnung dadurch bestimmen, daß man die Anordnung über einen feststehenden Detektor gleiten läßt, der den Markierungsgrad relativ zur Position der Anordnung über dem Detektor aufzeichnet. Im Falle einer feststehenden Glasplatte oder einer Sequenzierungschip-Anordnung kann eine radiocktive oder fluoreszierende Abbildung mit Hilfe eines feststehenden, über der Anordnung befindlichen Detektors erhalten werden. Alternativ kann die Glasplatte oder die Sequenzierungschip-Anordnung und/oder der Detektor beweglich sein. Der Detektor liefert eine zweidimensionale Abbildung, die mit Hilfe eines Computers analysiert wird.
Bei gemeinsamer Verwendung mit fluoreszierenden Markierungen können alternativ optische Fasern, die direkt an einen Sequenzierungschip oder an die Stifte in einer Stiftanordnung angeschlossen sind, verwendet werden, um Daten an einen Prozessor zu übertragen.
Nur zum Zweck der Erläuterung soll die Erfindung nun unter Hinweis auf die folgenden Figuren beschrieben werden.
Figur 1 ist eine Kurve, die die Beziehung der emittierten Fluoreszenz zur Anzahl der eingebauten Nucleotide unter Verwendung von dUTP-12-Fluorescein zeigt.
Figur 2 ist wie Figur 1, außer daß DCTP-12-Fluorescein verwendet wird.

BEISPIELE

BEISPIEL 1

Herstellung des DNA-Matrize/Primer-Komplexes 1

Bildung der Matrize und Binden an den festen Träger

Bei diesem 7eisciel wurde ein verankertes einsträngiges PCR-Produkt verwendet, das mit Hilfe bekannter Methoden erzeugt wurde (T. Hultman et al., Nucleic Acids Res. 17, (1989), 4937-4946; D.S.C. Jones et al., DNA Sequence 1 (1991), 279-283). Kurz umrissen wurde die Matrize mit Hilfe der Polymerase-kettenreaktion (PCR) gebildet, wobei ein biotinylierter Primer und ein normaler Primer verwendet wurde, und das Produkt wurde anschließend an Streptavidinbeschichtete magnetische Kügelchen gebunden. Durch Behandeln des verankerten doppelstränglgen PCR-Produkts mit Alkali wird der nichtverankerte Matrizenstrang entfernt. Alle Schritte wurden wie folgt durchgeführt:
Die PCR wurde in 50 µl durchgeführt, wobei 0,5 ml-Prüfröhrchen verwendet wurden. Es wurden die folgenden Dinge zugesetzt: 30 µl Wasser, 5 µl 10 × PCR-Puffer (Cetus) , 5 µl 2,5 mM dNTPs, 2,5 µl 10 µM 5'-biotinylierter reverser Universalprimer mit der Sequenz: 5'-Bio-AACAGCTATGACCATG-3', 2,5 µl 10 µM (-20) Vorwärts-Universalprimer mit der Sequenz: 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3', 1 µl Bluescript KS-Plasmid- DNA in einer Konzentration von 1 ng/µl, 0,5 µl (2,5 Einheiten) native Tag-Polymerase (Cetus) . Nach Über schichten mit leichtem Mineralöl wurden die folgenden Zyklen ausgeführt: 95ºC 90 s, [95ºC 30 s, 55ºC 60 s, 72ºC 60 s] × 35, 72ºC 180 s. Alle Zyklen wurden mit den maximal möglichen Heiz- und Abkühlgeschwindigkeiten mit dem Techne PHC-1 oder PHC-2 durchgeführt.
Das Binden des biotinylierten PCR-Produkts mit einer Länge von etwa 250 bp an die Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal) erfolgt durch Sminütigqs Inkubieren von 100 µl Kugeichen unter Mineralöl bei Raumtemperatur. Die Kügelchen werden mit einem starken Magneten sedimentiert, und der das Mineralöl enthaltende Überstand wird entfernt. Weitere Spuren ungenutzter Nucleotide, Primer und Puffer werden durch Waschen der Kügelchen mit 100 µl Wasser entfernt. Der nicht-biotinylierte DNA-Strang wird durch Sminütiges Inkubieren der Kugelchen mit 50 µl 0,15 M NaOH bei Raumtemperatur entfernt. Die Kügelchen werden sedimentiert und der Überstand wird entfernt, gefolgt von elner weiteren Behandlung mit 50 µl 0,15 M NaOH und drei Wäschen mit 100 µl Wasser. Schließlich werden die Kügelchen in 10 µl Wasser resuspendiert.

Anlagern (Annealing) des Seguenzierungsprimers an die verankerte einsträngige DNA-Matrize

Zu 10 µl der resuspendierten Kügelchen mit der verankerten einsträngigen DNA-Matrize (etwa 2 pmol), werden 4 µl 5 × Sequenase-Annealing-Puffer (200 mM Tris/HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl&sub2;, 250 mM NaCl, USB) und 4 µl (4 pmol) T7-Primer mit der Sequenz 5'-AATACGACTCACTATAG-3' zugegeben. Die Mischung wird 3 min lang auf 65ºC erwärmt und dann auf Eis gekühlt. Der Matrize/Primer-Komplex ist nun bereit zum Sequenzieren. Die folgende Darstellung teigt Teile seiner Struktur: Komplex 1: Polymer-Streptavidin-Biotin-

Capping des Primers mit Thionucleotiden

Zu 18 µl Annealing-Mischung werden 10 µl 100 µM dsGTP, dsCTP, ddATP, ddTTP und 4 µl (5 Einheiten) verdünnte Sequenase 2.0 (USB) gegeben, und die Mischung wird 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gemäß dem Komplementärstrang werden so die folgenden fünf Nucleotide nacheinander in den Primer angefügt: dsG, dsG, dsC, dsG und ddA. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten sedimentiert, und der Überstand wird entfernt. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 50 µl Wasser gewaschen.

Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer

Zu den Kügelchen wurden 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT gegeben, und die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Durch diesen Schritt wurde das Dideoxy-A-Nucleotid vom 3'- Ende des Primers entfernt.

Sequenzierung durch sequentielles Anfugen einzelner markierter Nucleotide: erster vollständiger Zyklus aus 9 Schritten

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µCi α-³²P-dATP einer spezifischen Aktivität von 400 Ci/mmol, 4 µM kaltes dATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentteren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Markierung wird mit einem Handzähler ausgezählt.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,51 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Mischung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonuclease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Sequenzierung durch sequentielles Anfügen einzelner Nucleotide: zweiter vollständiger Zyklus aus 9 Schritten

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µCi α-³²P-dTTP einer spezifischen Aktivität von 400 Ci/mmol, 4 µM kaltes dTTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Markierung wird mit einem Handzähler ausgezählt.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der vorstehend genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µ l Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Misonung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wuraen zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsTTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der vorstehend genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

BEISPIEL 2

Dieses Experiment wurde zur Bestätigung dessen durchgeführt, daß alle in Beispiel 1 beschriebenen Reaktionen die richtigen Verlängerungen und Abbauprodukte ergeben haben. Um dies zu belgen, wurde das in Beispiel 1 beschriebene Experiment mit ³²P-markiertem Primer hn Kombination mit kalten Nudeotiden wiederholt. Es wurden die folgenden Abwandlungen vorgenommen:
1. beim Annealing-Schritt wurden 4 pmol eines 5'-³²P-markierten Sequenzierungsprimers mit der Sequenz 5'-AATACGACTCACTATAG-3' eingesetzt;
2. in Schritt 2 des ersten Zyklus wurde die markierte Verbindung α-³²P-dATP In der Nucleotid-Mischung weggelassen, und die Konzentration an kaltem dATP wurde auf 100 µM erhöht;
3. in Schritt 2 des zweiten Zyklus wurde die markierte Verbindung α-³²P-dTTP in der Nucleotid-Mischung weggelassen, und die Konzentration an kaltem dTTP wurde auf 100 µM erhöht;
4. der Schritt 4 in beiden Zyklen war nicht erforderlich;
5. Nach jeder enzymatischen Reaktion und darauffolgenden Wäsche wurde eine 1/100-Aliquote der Kügelchen abgetrennt und in ein gesondertes 0,5 ml-Prüfröhrchen gegeben.
Nach Durchführung aller in Beispiel 1 beschriebenen Schritte wurden jedem einzelnen aliquoten Teil der Kügelchen 5 µl 90% Formamid-Farbstoffmischung zugesetzt, die Mischungen wurden 3 min lang auf 95ºC erhitzt, 5 Sekunden lang mit 13 000 g zentrifugiert und auf Eis abgekühlt. Ein kleiner aliquoter Teil (1 µl) einer jeden Probe wurde in eine einzelne Vertiefung eines 7 M Harnstoff enthaltenden 20% Polyacrylamid-Gels gegeben und 3 bis 4 Stunden lang bei 700 V elektrophorethsiert. Nach der Elektrophorese wurde die obere Glasplatte abgenommen, und es wurde etwa 2 bis 4 Stunden lang auf einen Röntgenfilm belichtet. Das erhaltene Bandenmuster wär in völliger Übereinstimmung mit den vorhergesagten Längen aller Primerverlängerungs- und Abbauprodukte.

BEISPIEL 3

Herstellung des verankerte DNA-Matrize/Primer-Komplexes 2

Annealing und Bindung des Matrize/Primer-Komplexes an einen festen Träger

Bei diesem Beispiel wurde der biotinylierte Sequenzierungsprimer zunächst an die komplementäre Region einer einsträngigen M13-Matrize angelagert und der Komplex anschließend über die 5'-Biotin-Einheit des Primers an den festen Träger (Streptavidin-Kügelchen) gebunden. 2 µg (1 pmol) M13mp18- DNA wurden mit 2 pmol 5'-biotinyliertem (-20) Vorwärts- Universalprimer mit der Sequenz 5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3' in 40 mM Tris/HCl, pH 7,5, 20 mM MgCl&sub2;, 50 mM NaCl in insgesamt 10 µl vereinigt. Die Mischung wurde 3 min lang auf 65ºC erwärmt und über einen Zeitraum von 20 min langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. 30 µl der Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen (Dynal) wurden zugegeben, und die Mischung wurde 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Kügelchen wurden sedimentiert, der Überstand entfernt, und die Kügelchen in 10 µl Wasser resuspendiert.

Capping des Primers mit Thionucleotiden

Zu 18 µl Annealing-Mischung werden 10 µl 100 µM dsGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP und 4 µl (5 Einheiten) verdünnte Sequenase 2.0 (USB) gegeben, und die Mischung wird 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gemäß dem Komplementärstrang werden so die folgenden zwei Nucleotide nacheinander an den Prirner angefügt: dsG und ddA. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten sedimentiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 50 µl Wasser gewaschen.

Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer

Zu den Kügelchen wurden 10 µl (20 Einheiten) einer Exonudease-Lösung in 50 rnm Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT gegeben, und die Mischuno wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Durch diesen Schritt wurde das Dideoxy-A-Nucleotid vom 3'- Ende des Primers entfernt.

Sequenzierung durch sequentielles Anfügen einzelner markierter Nucleotide: erster vollständiger Zyklus aus 9 Schritten

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µCi α-³²P-dATP einer spezifischen Aktivität von 400 Ci/mmol, 4 µM kaltes dATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Markierung wird mit einem Handzähler ausgezählt.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Mischung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügehcnen in 13 µl Wasser resuspendiern. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenz-Puffer, 10 µl einer Nucieotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimennieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen min 50 µl Wasser.

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µCi α-³²P-dTTP einer spezifischen Aktivität von 400 Ci/mmol, 4 µM kaltes dTTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei T-Nucleotide und ein Dideoxy-C-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Markierung wird mit einem Handzähler ausgezählt.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der vorstehend angegebenen Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren dc- kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Mischung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsTTP, 100 µM ddGTP, 200 µM ddATP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte-Nucleotide und ein Dideoxy-C-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotfd wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

BEISPIEL 4

Herstellung des DNA-Matrize/Primer-Komplexes 2

Matrizen-Herstellung, Binden der Matrize an den festen Träger und Annealing des Sequenzierungsprimers wurden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben, außer daß beim Annealing-Schritt 4 µl (4 pmol) des radioaktiv markierten T7-Primers mit der Sequenz ³²P-5'-AATACGACTCACTATAG-3' eingesetzt wurden. Matrize/Primer-Komplex 2: Polymer-Streptavidin-Biotin-

Capping des Primers mit Thionucleotiden

Zu 18 µl Annealing-Mischung werden 10 µl 100 µM dsGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP sowie 4 µl (5 Einheiten) verdünnte Sequenase 2.0 (USB) gegeben, und die Mischung wird 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gemäß dem Komplementärstrang werden so die folgenden drei Nueleotide nacheinander an den Primer angefügt: dsG, dsG und ddC. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten sedirnentiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 50 µl Wasser gewaschen.

Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer

Zu den Kügelchen wurden 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT gegeden, und die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Durch diesen Schritt wurde das Dideoxy-C-Nucleotid vom 3'- Ende des Primers entfernt.

Erster Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 2) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dCTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddTTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde gemäß dem komplementären Strang ein C-Nucleotid und ein Dideoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Dieser Schritt entfällt, da sich die Markierung am Primer befindet.

Schritte 5 und 6

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsCTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddTTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes C-Nucleotid und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprlmer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Zweiter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 2) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde gemäß dem komplementären Strang ein G-Nucleotid und ein Dideoxy-A-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Prhmers angefügt.

Schritt 4

Dieser Schritt entfällt, da sich die Markierung am Primer befindet.

Schritte 5 und 6

Schritte 7 und 8

Zum tappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, getolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes G-Nucleotid und ein Dideoxy-A-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease 121-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Dritter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 2) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min Lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedirnentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des räberstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Dieser Schritt entfällt&sub1; da sich die Markierung am Primer befindet.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonudease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Mischung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsATP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddTTP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde eine thiolatiertes A-Nucleotid und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Vierter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 2) wurden in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dTTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM DDCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min Lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Dieser Schritt entfällt, da sich die Markierung am Primer befindet.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nudeotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Das Entfernen der Markierung wurde durch Messen der Mischung mit dem Handzähler überprüft.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 13 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 5 µl 5 × Sequenase-Puffer, 10 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 100 µM dsTTP, 100 µM ddGTP, 100 µM ddATP, 100 µM ddCTP, und 4 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min Lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes T-Nucleotid und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

BEISPIEL 5

Als Einzelmarkierung, die an alle vier Deoxynucleotide angelagert wurde, wurde Fluorescein verwendet. Insbesondere haben wir die folgenden Fluorescein-markierten Deoxynucleosidtriphosphate verwendet: Fluorescein-12-dUTP, Fluorescein-15-dATP, Fluorescein-15-dCTP, Fluorescein-15-dITP.

Herstellung der Matrizen

Als Modell-Matrize verwendeten wir zwei einsträngige PCR- Produkte, die von der Multiklonierungsstelle von Bluescript II KS stammten. Die Amplifikation der Bluescript II KS-Vektor-DNA unter Verwendung des biotinylierten M23(-21)-Vorwärtsprimers und des nichtbiotinylierten reversen M13- Primers ergab ein PCR-Produkt, das wie in Beispiel 1 beschrieben über die Biotin-Einheit an den Streptavidin-beschichteten Kügelchen verankert wurde. Der nichtbiotinylierte (+)-Strang wurde entfernt durch Sminütiges Inkubieren der Kügelchen mit 0,15 M NaOH, gefolgt von einer Wäsche mit 0,15 M NaOH und drei Wäschen mit Wasser. Die Matrize, umfassend den (-)-Strang der Multiklonierungsstelle des Bluescript II KS-Vektors, wurde als PCR-Matrize 1 bezeichnet. Die Amplifikation des Bluescript II KS- Vektors unter Verwendung des biotinylierten reversen M13- Primers und des nichtbiotinylierten M13(-22)-Vorwärtsprimers ergab ein PCR-Produkt, das wie in Beispiel 1 beschrieben über die Biotin-Einheit an den Streptavidin-beschichteten Kügelchen verankert wurde. Der nichtbiotinylierte (-)-Strang wurde entfernt durch Sminütiges Inkubieren der Kügelchen mit 0,15 M NaOH, gefolgt von einer Wäsche mit 0,15 M NaOH und drei Wäschen mit Wasser. Diese Matrize, umfassend den (+)-Strang der Multiklonierungsstelle des Bluescript II KS-Vektors, wurde als PCR-Matrize 2 bezeichnet.

Synthese von 5'-TAMRA-markierten spezifischen Oligonucleotid-Primern

Unter Verwendung der Bluescript-Sequenz der PCR-Matrizen 1 und 2 wurden für jedes fluoreszenzmarkierte Nucleotid vier verschiedene Primer geschaffen. Die Primer befanden sich vor Serien eines einzelnen Nucleotids, wodurch der Einbau von einem, zwei, drei, vier oder fünf Nucleotiden der gleichen Art ermöglicht wird. Für den Einbau von Fluorescein-12-dUTP wurden die folgenden Primer synthetisiert: Für den Einbau von Fluorescein-15-dCTP wurden die folgenden Primer synthetisiert: Für den Einbau von Fluorescein-15-dATP wurden die folgenden Primer synthetisiert: Für den Einbau von Fluorescein-15-dITP wurden die folgenden Primer synthetisiert:

Annealing

In sechzehn verschiedenen Annealing-Reaktionen wurden 2 µl Wasser, 5 µl der passenden einsträngigen PCR-Matrize 1 oder 2 (siehe Tabellen), 2 µl 5 × Sequenase-Puffer und 1 µl (0,5 pmol) der passenden TAMRA-markierten Primer (siehe Tabellen) zusammengegeben, 3 Minuten lang auf 65 ºC erwärmt und dann auf Eis Lnkubiert.

Verlängerungsreaktionen

In sechzehn verschiedenen Verlängerungsreaktionen wurden zu 6 µl der jeweiligen Annealing-Mischung 2 µl einer Nucleotid-Mischung (siehe Tabellen), enthaltend die passenden unmarkierten dNTPs (mit 10 µM) , das passende fluoreszenzmarkierte dNTP (mit 10 µM) und das passende ddNTP (mit 10 µM), und 2 µl vcrdünnte Sequenase 2.0 gegeben, und die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 5 µl 80% Formamid gestoppt und 3 min lang auf 80ºC erwärmt, gefolgt von Sedimentieren der Kügelchen mit einem Magneten und Entfernen des Überstands.

Erfassungs-/Abbildungsschri tt (Quantifizierung)

1 µl eines jeden Überstands wurde mit einer auf einem Fluoreszenzmikroskop aufgesetzten SIT-Kamera (Modell C2 400-08, Hamamatsu Photonics SA) gemessen. Die emittierte Fluoreszenz des am 5'-Ende des Primers befindlichen Rhodamin-Farbstoffs TAMRA und des durch Nucleotid-Einbau am 3'-Ende des Primers eingeführten Fluorescein-Farbstoffs wurde unter Verwendung geeigneter Filtersysteme für jede Probe bestimmt. Ebenso wurde eine Kontrollprobe aus 80% Formamid gemessen. Die emittierte Fluoreszenz ΔI Fluorescein und ΔI Rhodamin wurde aufgezeichnet. Das Verhältnis von ΔI Fluorescein zu AI Rhodamin wurde zur Normierung der Daten verwendet.
Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:
- Einbau von bis zu fünf Fluorescein-markierten Pyrimidin-Nudeotiden (Fluorescein-12-U, Fluorescein-15-C).
- Quantitative Messungen zeigen eine lineare Beziehung zwischen emittierter Fluoreszenz und der Anzahl eingebauter Fluorescein-markierter Pyrimidin-Nucleotide. Es wurde keine Fluoreszenzlöschung beobachtet (siehe Figuren 1 und 2).
- Mit dem obenerwähnten Erfassungs-/Abbildungssystem von Hamamatsu Photonics waren wir in der Lage, eine Menge von nur 10&sup8; Molekülen in einem Volumen von 1 nl (Konzentration: 150 nM) nachzuweisen, wodurch im Prinzip die Verwendung von bis zu 10&sup4; verschiedenen Matrizen auf einer Anordnung von 8 cm × 8 cm ermöglicht wird.
- Einbau von bis zu zwei Fluorescein-marklerten Purin-Nucleotiden (Fluorescein-15-A, Fluorescein-15-I) . Mit dem obigen Detektorsystem waren wir in der Lage, den Unterschied zwischen einem und zwei Fluorescein-markierten Purin-Nucleotiden zu messen.

BEISPIEL 6

Herstellung des DNA-Matrize/Primer-Komplexes 1

Bilden der Matrize und Binden an einen festen Träger, Anlagern des Sequenzierungsprimers an die verankerte einsträngige DNA-Matrize, Cappen des Primers mit Thionucleotiden und Entfernen des Dideoxynucleotkds vom mit Cap versehenen Primer wurden wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Sequenzierung durch sequentielles Anfügen einzelner fluoreszenzmarkierter Nudeotide: erster vollständiger Zyklus aus 9 Schritten

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fiuorescein-15-dATP (Boehringer Mannheim), 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei Fluorescein-15-A-Nucleotide und ein Dideoxy-T- Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Fluoreszenz wurde mit einer auf einem Fluoreszenzmikroskop aufgesetzten SIT-Kamera (Modell C2 400-08, Hamamatsu Photonics SA) gemessen.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucieotid und die fluoreszenzmarkierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fluorescein-22-dUTP (Boehringer Mannheim), 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß dem komplementären Strang zwei Fluorescein-markierte -Nudeotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Die Fluoreszenz wurde mit einer auf einem Fluoreszenzmikroskop aufgesetzten SIT-Kamera (Modell 400-08, Hamamatsu Photonics SA) gemessen.

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucieotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der vorstehend angegebenen Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelcnen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

BEISPIEL 7

Herstellung des DNA-Matrize/Primer-Komplexes 1

Bilden der Matrize und Binden an den festen Träger, Anlagern des Sequenzierungsprimers an die verankerte einsträngige DNA-Matrize, Cappen des Primers mit Thionucleotiden und Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt.

Sequenzierung durch sequentielles Anfügen einzelner fluoreszenzmarkierter Nudeotide: erster vollständiger Zyklus aus 9 Schritten

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 500 µM Fluorescein-15-dATP, 1,0 µM dATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß Anweisung durch den komplementären Strang Fluorescein-15-A-Nucleotide, A- Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid, die Deoxynudeotide und die fluoreszenzmarkierten Nudeotide wurden durch Zugabe von 20 µl (20 Einheiten) einer Exonudease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentleren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucieotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die fnlgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Pufter, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 15 µM Fluorescein-12-dUTP, 1,0 µM dTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, ge£olgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß Anweisung durch den komplementären Strang Fluoresce in-markierge U-Nucleotide, T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucieotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleonid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der vorstehend angegebenen Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimenrieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Übersnands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucieotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

BEISPIEL 8

Herstellung des DNA-Matrize/Primer-Komplexes 1

Bilden der Matrize, Binden der Matrize an einen festen Träger und Anlagern des Sequenzierungsprimers wurden durchgeführt wie in Beispiel 1 beschrieben.

Capping des Primers mit Thionucleotiden

Zu 18 µl Annealing-Mischung werden 10 µl 100 µM dsGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP und 4 µl (5 Einheiten) verdünnte Sequenase 2.0 (USB) gegeben, und die Mischung wird 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gemäß Anweisung durch Komplementärstrang werden so die folgenden drei Nudeotide nacheinander an den Primer angefügt: dsG, dsG, ddC. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten sedimentiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 50 µl Wasser gewaschen.

Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer

Zu den Kügelchen wurden 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT gegeben, und die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Durch diesen Schritt wurde das Dideoxy-C-Nucleotid vom 3'- Ende des Primers entfernt.

Erster Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fluorescein-15-dCTP (Boehringer Mannheim), 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde gemäß Anweisung durch den komplementären Strang ein Fluorescein-markiertes C-Nucleotid und ein Dtdeoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die Fluorescein-markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonudease III-Lösung in 50 wM Tris/HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM DsCTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes C-Nucleotid und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Zweiter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fluorescein-15-dITP (Boehringer Mannheim), 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schrinn wurde gemäß Anweisung durch den komplementären Strang ein Fluorescein-markiertes I-Nucleotid und ein Dideoxy-A-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiern. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucieotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaknion wurde gestoppt durch Sedirnentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes G-Nucleonid und ein Dideoxy-A-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppc durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Dritter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fluorescein-15-dATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß Anweisung durch den komplementären Strang zwei Fluorescein-markierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nudeotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimenrieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolanierte A-Nucleotide und ein Dideoxy-T-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Vierter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 10 µM Fluorescein-12-dUTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden gemäß Anweisung durch den komplementären Strang zwei Fluorescein-markierte U-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an das 3'-Ende des mit Cap versehenen Primers angefügt.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Prirners wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

BEISPIEL 9

Herstellung des DNA-Matrizelprimer-Komplexes 1

Capping des Primers mit Thionucleotiden

Zu 18 µl Annealing-Mischung werden 10 µl 100 µM dsGTP, ddATP, ddTTP und ddCTP sowie 4 µl (5 Einheiten) verdünnte Sequenase 2.0 (USB) gegeben, und die Mischung wird 2 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Gemäß Anweisung durch den Komplementärstrang werden so die folgenden drei Nucleotide nacheinander an den Primer angefügt: dsG, dsG, ddC. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten sedirnentiert, und der Überstand wurde entfernt. Die Kügelchen wurden dann zweimal mit 50 µl Wasser gewaschen.

Entfernen des Dideoxynucleotids vom mit Cap versehenen Primer

Zu den Kügelchen wurden 10 µl (20 Einheiten) einer Exonudease-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT gegeben, und die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC Inkubiert. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser. Durch diesen Schritt wurde das Dideoxy-C-Nucleotid vom 3'- Ende des Primers entfernt.

Erster Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 15 µM Fluorescein-15-dCTP, 1,0 µM dCTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die Fluorescein-markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonudease III-Lösung in 50 InM Tris/HCI, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsCTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte C-Nucieotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonudease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen min dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Zweiter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 500 µM Fluorescein-15-dITP, 1,0 µM dGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nudeotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddTTP, 10 µM DDCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurde ein thiolatiertes G-Nucleotid und ein Dideoxy-A-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) der oben genannten Exonuclease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischüng bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Dritter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 500 µM Fluorescein-15-dATP, 1 µM dATP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddTTP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Das Dideoxynucleotid und die markierten Nucleotide wurden durch Zugabe von 10 µl (20 Einheiten) einer Exonuclease III-Lösung in 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 5 mN MgCl&sub2;, 5 mM DTT und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC entfernt. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritte 7 und 8

Schritte 9 und 10

Das Dideoxynucleotid wurde entfernt durch Zugabe von 10 µl (20 Einneiten) der oben genannten Exonuclease III-Lösung und 2minütiges Inkubieren der Mischung bei 37ºC. Die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei Wäschen mit 50 µl Wasser.

Vierter Sequenzierungszyklus (9 Schritte)

Schema 1

Schritte 2 und 3

Die Kügelchen (verankerte Matrize/Primer-Komplex 1) wurden in 4 µl Wasser resuspendiert. Die folgenden Dinge wurden zugesetzt: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid- Mischung, enthaltend 15 µM Fluorescein-12-dUTP, 1,0 µM dTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Überstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser.

Schritt 4

Schritte 5 und 6

Schritte 7 und 8

Zum Cappen des Primers wurden die Kügelchen in 4 µl Wasser resuspendiert. Die £olgenden Dinge wurden zugegeben: 2 µl 5 × Sequenase-Puffer, 2 µl einer Nucleotid-Mischung, enthaltend 10 µM dsTTP, 10 µM ddGTP, 10 µM ddATP, 10 µM ddCTP, und 2 µl verdünnte Sequenase 2.0. Die Mischung wurde 2 min lang bei 37ºC inkubiert, und die Reaktion wurde gestoppt durch Sedimentieren der Kügelchen mit dem Magneten und Entfernen des Gberstands, gefolgt von drei weiteren Wäschen mit 50 µl Wasser. Bei diesem Schritt wurden zwei thiolatierte T-Nucleotide und ein Dideoxy-G-Nucleotid an den Sequenzierungsprimer angefügt.

Schritte 9 und 10

Claims

1. Verfahren zur Bestimmung der Sequenz einer Nucleinsäure, umfassend die Schritte:

a) Bildung einer einsträngigen Matrize, umfassend die zu sequenzierende Nucleinsäure;

b) Hybridisierung eines Primers an die Matrize, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;

c) Verlängerung des Primers durch Anfügen eines einzelnen markierten Nucleotids, wobei das markierte Nucleotid kein Kettenverlängerungsinhibitor ist;

d) Bestimmung der Art des am Primer angefügten markierten Nucleotids;

e) Entfernung oder Neutralisierung der Markierung; und

f) Sequentielle Wiederholung der Schritte c) bis e) und Aufzeichnung der Reihenfolge des Einbaus der markierten Nucleotide

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Matrize/Primer- Komplex an einen Festphasenträger gebunden ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei der Schritt c) die Verwendung einer Mischung sowohl markierter als auch unmarkierter Nudeotide umfaßt.

4. Verfahren nach irgendeinem vorstehenden Anspruch, wobei das markierte Nucleotid in Gegenwart von Kettenverlängerungsinhibitoren an den Matrize/Primer-Komplex angefügt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kettenverlängerungsinhibitoren Kettenterminatoren sind, die in den Matrize/Primer-Komplex eingebaut werden, und Schritt e) des weiteren die Abspaltung der Kettenterminatoren umfaßt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Kettenverlängerungsinhibitoren Dideoxynucleosidtriphosphate sind.

7. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kettenverlängerungsinhibitoren nicht in den Matrize/Primer-Komplex eingebaut werden.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Kettenverlängerungsinhibitoren Deoxynucleosid-5'-[α,β-methylen]triphosphate, Deoxynucleosiddiphosphate oder Deoxynucleosidmonophosphate sind.

9. Verfahren nach irgendeinem vorstehenden Anspruch, wobei der Matrize/Primer-Komplex einen Primer mit einem Phosphorothioatnucleosid-Derivat an seinem 3'-Ende umfaßt.

10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Schritt e)

i) das Entfernen des markierten Nucleotids mit einer Exonuclease, und

ii) das Ersetzen des markierten Nucleotids durch ein entsprechendes unmarkiertes Phosphorothioatnucleosid-Derivat in Gegenwart von Kettenverlängerungsinhibitoren

umfaßt

11. Verfahren nach irgendeinem vorstehenden Anspruch, wobei die Schritte c) und d) vor dem Entfernen oder Neutralisieren der Markierung oder des markierten Nucleotids mehrere Male sequentiell wiederholt werden.

12. Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Markierung eine fluoreszierende Markierung ist und der Schritt e) die Neutralisierung der Markierung durch Entfärben mit Laser-Strahlung oder chemischen Mitteln oder durch Abtrennen der Markierung vom markierten Nucleotid umfaßt.

13. Verfahren zur Seguenzierung eines DNA-Fragments, umfassend die Schritte:

i) Hybridisierung eines mit einer Cap Struktur versehenen Primers, der ein Phosphorothioatnucleosid-Derivat enthält, an eine Matrize, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;

ii) Zufügen eines markierten Deoxynucleosidtriphosphats, wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren und einer geeigneten Polymerase zum Matrize/Primer- Komplex;

iii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

iv) Messen der Menge eingebauter Markierung;

v) Behandeln des Matrize/Primer-Komplexes mit einer Exonuclease zur Entfernung des markierten Nucleotids und der Kettenterminatoren;

vi) Entfernen der Exonuclease durch Waschen;

vii) Zufügen eines Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphats, entsprechend dem in Schritt ii) zugefügten markierten Deoxynucleosidtriphosphat, zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren;

Viii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

ix) Behandeln des Matrize/Primer-Komplexes mit einer Exonuclease zur Entfernung der Kettenterminatoren;

x) Entfernen der Exonudease durch Waschen; und

xi) Wiederholen der Schritte ii) bis x) jeweils mit einem anderen markierten Deoxynucleosidtriphosphat.

14. Verfahren zur Sequenzierung eines DNA-Fragments, umfassend die Schritte:

ii) Zufügen eines markierten Deoxynucleosidtriphosphats, wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungslnhibitor ist, zusammen mit heterogenen Kettenterminatoren und einer geeigneten Polymerase zum Matrize/Primer- Komplex;

iii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

iv) Messen der Menge eingebauter Markierung;

v) Entfernen des markierten Nucleotids und der Kettenterminatoren mit einer Exonuclease;

vi) Entfernen der Exonudease durch Waschen;

vii) Zufügen eines Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphats zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden;

viii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen; und

ix) Wiederholen der Schritte ii) bis viii) jeweils mit einem anderen markierten Deoxynucleosidtriphosphat.

15. Verfahren zur Sequenzierung eines DNA-Fragments, umfassend die Schritte:

i) Hybridisierung eines mit einer Cap Struktur versehenen Primers, der ein Phosphorothioatdeoxynucleosid-Derivat enthält, an eine Matrize, um einen Matrize/Primer- Komplex zu bilden;

ii) Zufügen eines markierten Deoxynucleosidtriphosphats, wobei das markierte Deoxynucleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, und einer geeigneten Polymerase zum Matrize/Primer-Komplex;

iii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

iv) Messen der Menge eingebauter Markierung;

v) Wiederholen der Schritte ii) bis iv) bis alle vier verschiedenen markierten Deoxynucleosidtriphosphate in Gegenwart ihrer entsprechenden heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, angefügt sind;

vi) Entfernen aller markierten Nudeotide mit Exonucleasen;

vii) Entfernen der Exonuclease durch Waschen;

viii) Zufügen des Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphats, entsprechend dem ersten der Reaktion in Schritt ii) zugefügten markierten Deoxynucleosidtriphosphat, zusammen mit heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, und einer geeigneten Polymerase zum Matrize/Pri;mer-Komplex;

ix) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

Wiederholen der Schritte viii) und ix) mit den drei verbleibenden Deoxynucleosidtriphosphaten.

16. Verfahren zur Sequenzierung eines DNA-Fragments, umfassend die Schritte:

i) Hybridisierung eines mit einer Cap Struktur versehenen Primers an eine Matrize, um einen Matrize/Primer-Komplex zu bilden;

ii) zufügen eines fluoreszierenden Nuleosidtriphosphats, wobei das fluoreszierende Nuleosidtriphosphat kein Kettenverlängerungsinhibitor ist, zusammen mit drei heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden, und einer geeigneten Polymerase zum Matrize/Primer-Komplex;

iii) Entfernen überschüssiger Reagenzien durch Waschen;

iv) Messen der Menge eingebauter Markierung;

v) Wiederholen der Schritte ii) bis iv) mit allen drei verschiedenen Nucleosidtriphosphaten, ein jedes mit einer fluoreszierenden Markierung, in Gegenwart der jeweiligen heterogenen Kettenverlängerungsinhibitoren, die nicht in die Kette eingebaut werden;

vi) Zerstören der fluoreszierenden Markierungen durch Entfärben mit einem Laser oder mittels einer geeigneten chemischen Reaktion, oder Entfernen der fluoreszierenden Markierungen mit Hilfe eines chemischen Spaltungsschritts.

17. DNA-Sequenzierungs-Kit, umfassend mehrfach das Folgende:

i) einen Linker zur Anlagerung einer DNA-Matrize an eine Festphasenmatrix, wobei der Linker einen Primer mit einem Phosphorothioatdeoxynucleosid-Rest an dessen 3'-Ende umfaßt;

ii) Kettenverlängerungsinhibitoren;

iii) markierte Nucleosidtriphosphate;

iv) Phosphorothioatdeoxynucleosidtriphosphate;

v) eine 5'T3'-DNA-Polymerase; und

vi) eine 3'T5'-Exonuclease.

18. Sequenzierautomat, der so angepaßt ist, daß er eine Nucleinsäure im wesentlichen durch Ausführen der Schritte eines Verfahren nach irgendeinem der Anspruche 1 bis 15 sequenz iert, umfassend:

i) Hilfsmittel, um einen Festphasenträger, an den der Matrize/Primer-Komplex gebunden ist, in die erforderlichen Reagens- und Waschlösungen hinein- und herauszubewegen, oder Hilfsmittel zum sequentiellen Pumpen von Reagenzien und Waschlösungen über den festen Träger, und

ii) Hilfsmittel zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Markierung.