JP2008546424A - 修飾ポリヌクレオチドを作製する方法および配列決定する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国仮特許出願第60/694,783号(2005年6月28日出願)の優先権を主張する。上記出願の教示全体は、本明細書中で参考として援用される。
政府支援
本発明は、合衆国国立衛生研究所からの助成金HG00357により、全体または一部が支援された。該政府は、本発明において一定の権利を有する。
近年、ヒトゲノムならびに種々の他の生物のゲノム配列を決定するために広範な努力がなされている。ゲノミクスの出現は、正確かつ効率的なDNA配列決定技法に依存しており、遺伝子のヌクレオチド配列を決定する能力は、依然として分子遺伝学研究の必須な要素である。生物学的研究におけるDNA配列決定の広範な使用にとって、従来より一般に使用されている技法よりも簡便で効率的である新規なDNA配列決定技法の開発が必要である。
当該出願の発明は、核酸(例えば、DNA)の新規な配列決定法、ならびに核酸(例えば、DNA)の直接的配列決定を実施するための改善された方法を提供する。本発明は、核酸ポリメラーゼ(例えば、DNAポリメラーゼ)が、チオールヌクレオシドトリホスフェート(例えば、5’チオール−ヌクレオシドトリホスフェート、3’チオール−ヌクレオシドトリホスフェート)を、伸長中のポリヌクレオチド鎖に組込んで、少なくとも1つのホスホロチオレート結合を含むポリヌクレオチド配列を作出できるという発見に一部基づいている。
一般構造[I]:
一般構造[I]におけるR1は、例えば、水素(−H)、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニル、またはアリール基、あるいはR2であり、R2は、例えば、−SH、または−SR3であり、R3は、例えば、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基であり得る。特定の実施形態において、R1は−SCH3である。
本発明は、核酸ポリメラーゼが、チオール−ヌクレオシドトリホスフェートを、1つ以上のホスホロチオレート結合を含むポリヌクレオチドを作出するために伸長中のポリヌクレオチド鎖に組み込むことができるという出願人の発見に一部基づく。したがって、ホスホロチオレート結合を含むポリヌクレオチドは、化学的に合成されるよりもむしろポリメラーゼを用いて酵素的に合成され得る。したがって、本発明は、修飾ポリヌクレオチド配列を作製する方法を提供し、該修飾ポリヌクレオチド配列は、(1つ以上の)切断可能なヌクレオシド間結合を含む。本明細書に用いられる「切断可能なヌクレオシド間結合」または「切断可能な結合」とは、実質的にホスホジエステル結合を開裂しない条件下で開裂できるヌクレオシド間結合のことである。本明細書に記載される核酸ポリメラーゼは、1つ以上の切断可能なヌクレオシド間結合を含むポリヌクレオチドを作出するために使用できる。特定の実施形態において、切断可能なヌクレオシド間結合は、(1つ以上の)ホスホロチオレート結合である。
R1は、水素、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基、またはR2であり、
R2は、−SH、または−SR3であり、
R3は、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基である。
材料および方法
5’端において二重ビオチンタグにより標識化し、磁気ビーズに結合させた一本鎖DNAテンプレート
結果
該反応の完了後、該DNA増幅産物に、5つまでの3’−デオキシ−ジチオメチルチミジンヌクレオチドが首尾よく組み込まれた。低濃度(5.0μm)で存在する場合、0、1、2、3、4、または5つの修飾チミジン残基を有するDNA産物を回収した(図3D)。しかし、大多数の反応産物は、0または1つの修飾ヌクレオチドを含んだ。より高濃度(1.0mM)で存在する場合、大多数の反応産物は5つの修飾チミジン残基を含んだ(図3E)。シークエナーゼ、エキソTaqポリメラーゼおよびエキソBstポリメラーゼなどの他のポリメラーゼを用いて反応を行った場合も同様な結果が得られた。これらのデータは、DNAポリメラーゼを含んだ合成反応の間に、修飾3’−デオキシ−ジチオメチルチミジンヌクレオチドを、伸長するDNA鎖に容易に組み込み得ることを示している。
実施例2:銀イオン存在下での3’チオール修飾ヌクレオチドを含むDNAの化学的開裂
開裂前に、1本鎖上に5つの3’チオール修飾チミジンヌクレオチド含む修飾ヌクレオチド(実施例1を参照)を25mMの酢酸マグネシウムで洗浄した。該産物を50μm(図4B)または500μm(図4D)の濃度の10μlの硝酸銀(AgNO3)と共に、室温で15分間インキュベートすることにより、開裂を誘導した。非結合の開裂断片をdH2O中で洗浄することにより除去し、該プライマーを含有する結合反応産物を標準的なゲル移動アッセイを用いて分析した。試験した双方の濃度のAgNO3が、3’チオール修飾チミジンヌクレオチドを含有するDNA産物の開裂をもたらした(図4Bおよび図4D)。
実施例3:3’チオールヌクレオシドトリホスフェート(sdNTP類)を用いたプライマー伸長によるDNA合成および化学的に開裂した伸長産物回収の予想的実施例
非修飾ヌクレオシドトリホスフェートと修飾3’−チオールヌクレオシドトリホスフェート双方の存在下でDNAテンプレート上のプライマー伸長を行う(図1A)。修飾ヌクレオシドトリホスフェートが低濃度で用いられる場合、それらは、低頻度で、天然dNTP類の次に、伸長するDNA鎖にランダムに組み込まれる(図1B)。該DNAへのこれらの修飾ヌクレオチドの組込みにより、1つ以上の3’−ホスホロチオレート結合(図5)がDNA鎖に導入される。ホスホロチオレート結合の硫黄−リン結合は、銀イオン(Ag+)への曝露により、特異的に速やかに開裂される。その結果、該反応物への硝酸銀(AgNO3)の添加により、ホスホロチオレート結合を含む各鎖が、該鎖の中の3’−チオールヌクレオチドの数に依存して、2つ以上の断片に開裂されることが確実になる(図1C)。該反応に用いられるプライマーがビオチンなどのアフィニティータグによって標識化されるならば、アフィニティータグを有するプライマー配列を含む5’端の断片が、ストレプトアビジン磁気ビーズを用いて容易に単離される(図1D)。捕捉したら、残りの非タグ化断片を洗浄除去する。精製した断片をゲル電気泳動により分析し、断片ラダーを得ることができる。4つの3’チオールヌクレオチドトリホスフェートの各々を別個の蛍光体によって蛍光標識する場合、該産物を標準的な蛍光ベースの配列決定機器上で分析し、該鎖の配列を読み取る。さらに、各プライマーが異なるタグを含有する2種のプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行う場合(図2A〜図2B)、双方の鎖の5’端伸長産物を別個に回収し、双方の鎖の配列を分析できる(図2C)。
Claims (94)
- 少なくとも1種のプライマーをテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすること、および、1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、前記プライマーを伸長することを含む、修飾ポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが修飾されており、前記修飾ヌクレオチド配列が、ホスホロチオレート結合を含み、それによって修飾ヌクレオチド配列を作製する、方法。
- 前記ホスホロチオレート結合が、3’結合である、請求項1に記載の方法。
- 前記ホスホロチオレート結合が、5’結合である、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項1に記載の方法。
- 修飾ポリヌクレオチド配列を作製する方法であって、
a) 少なくとも1種のプライマーをテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすること、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、前記プライマーを伸長させることにより、少なくとも1種の修飾ヌクレオチドを含む修飾ポリヌクレオチド配列を作製することであって、
ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが、一般構造[I]:
式中、R1は、水素、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基、またはR2であり、
R2は、−SH、または−SR3であり、
R3は、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基であり、
ここで、前記修飾ポリヌクレオチド配列は、一般構造[II]:
- R1が、水素(−H)または−SCH3である、請求項5に記載の方法。
- 前記テンプレートポリヌクレオチド配列が、センスおよびアンチセンス鎖を含み、少なくとも1種のプライマーが、ステップ(b)の前に各鎖にアニールされる、請求項5に記載の方法。
- 前記プライマーが、少なくとも1つのタグを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記タグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、タグを含む、請求項5に記載の方法。
- 前記タグが、ピリミジン塩基の5位の炭素、またはプリン塩基の7デアザ位の炭素に存在する、請求項10に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項10に記載の方法。
- 一般構造[I]における前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項5に記載の方法。
- 前記テンプレートポリヌクレオチド配列が、センスおよびアンチセンス鎖を含み、少なくとも1種のプライマーが、ステップ(b)の前に各鎖にアニールされる、請求項15に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプライマーが、第一のタグを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記第一のタグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプライマーが、第二のタグをさらに含む、請求項17に記載の方法。
- 前記第二のタグが、ピリミジン塩基の5位の炭素、またはプリン塩基の7デアザ位の炭素に存在する、請求項19に記載の方法。
- 前記第二のタグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項19に記載の方法。
- 一般構造[III]における塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記少なくとも1種のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項15に記載の方法。
- ポリヌクレオチド配列を決定する方法であって、
a) 複数のプライマーを複数のテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすること、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で前記複数のプライマーを伸長させ、それによって、複数の伸長産物を作製することであって、ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが修飾されており、ここで、前記複数の伸長産物が、1つ以上のホスホロチオレート結合を有する修飾ヌクレオチド配列を含むこと、
c) 複数の断片が作製される条件下、前記伸長産物における前記ホスホロチオレート結合を開裂すること、
d) c)において作製された断片の中から、前記プライマーを含む断片を同定すること、および
e) d)において同定された断片の3’末端におけるヌクレオチドを同定すること、を含み、
それによってポリヌクレオチド配列を決定する方法。 - 前記複数のプライマーにおける各プライマーが、第一のタグを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記第一のタグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、タグを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項27に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、各塩基に対して互いに異なるタグを含み、前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記複数のプライマーにおける各プライマーが、第二のタグをさらに含む、請求項25に記載の方法。
- 前記第二のタグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項30に記載の方法。
- 前記ホスホロチオレート結合が、Ag+、Hg2+またはCu2+により開裂される、請求項24に記載の方法。
- 前記ホスホロチオレート結合が、約7のpHおよび約22℃から約37℃までの温度で開裂される、請求項32に記載の方法。
- ステップe)の前に、プライマーを含む前記断片が単離される、請求項25に記載の方法。
- プライマーを含む前記断片が単離手段を用いて単離され、前記単離手段が前記プライマー上のタグに結合する、請求項34に記載の方法。
- 前記複数のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項24に記載の方法。
- ポリヌクレオチド配列を決定する方法であって、
a) 複数のプライマーを複数のテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすること、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、前記複数のプライマーを伸長させ、
それによって、修飾ポリヌクレオチド配列を含む複数の伸長産物を作製することであって、
ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが、一般構造[I]:
式中、R1は、水素、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基、またはR2であり、
R2は、−SH、または−SR3であり、
R3は、置換または非置換:アルキル、アルケニル、アルキニルまたはアリール基であり、
ここで、前記修飾ポリヌクレオチド配列は、一般構造[II]:
c) 複数の断片が作製される条件下、前記伸長産物において前記少なくとも1つの3’ホスホロチオレート結合を開裂すること、
d) c)において作製された断片の中から、前記プライマーを含む断片を同定すること、および
e) d)において同定された断片の3’末端におけるヌクレオチドを同定すること、を含み、
それによってポリヌクレオチド配列を決定する方法。 - R1が、水素(−H)または−SCH3である、請求項37に記載の方法。
- 前記複数のテンプレートポリヌクレオチド配列における各テンプレートポリヌクレオチド配列が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、少なくとも1種のプライマーが、ステップ(b)の前に各鎖にアニールされる、請求項37に記載の方法。
- 前記複数のプライマーにおける各プライマーが、タグを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記タグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、タグを含む、請求項37に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項42に記載の方法。
- 一般構造[I]における前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、各塩基に対して互いに異なるタグを含み、前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの3’ホスホロチオレート結合が、Ag+、Hg2+またはCu2+により開裂される、請求項37に記載の方法。
- 前記少なくとも1つのホスホロチオレート結合が、約7のpHおよび約22℃から約37℃までの温度で開裂される、請求項46に記載の方法。
- ステップ(e)の前に、プライマーを含む前記断片が単離される、請求項37に記載の方法。
- プライマーを含む前記断片が単離手段を用いて単離され、前記単離手段が前記プライマー上のタグに結合する、請求項48に記載の方法。
- 前記複数のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項37に記載の方法。
- ポリヌクレオチド配列を決定する方法であって、
a) 複数のプライマーを、複数のテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすることであって、前記複数のプライマー中の各プライマーが、第一のタグを含むこと、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で前記複数のプライマーを伸長させ、それによって、複数の伸長産物を作製することであって、
ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが、一般構造[III]:
ここで、前記複数の伸長産物が、一般構造[IV]:
前記一般構造[IV]が、少なくとも1つの5’ホスホロチオレート結合を含むこと、
c) 複数の断片が作製される条件下、前記伸長産物において少なくとも1つの5’ホスホロチオレート結合を開裂すること、
d) c)において作製された断片の中から、プライマーを含む断片を同定すること、および
e) d)において同定された断片の3’末端におけるヌクレオチドを同定すること、を含み、
それによってポリヌクレオチド配列を決定する方法。 - 前記複数のテンプレートポリヌクレオチド配列における各テンプレートポリヌクレオチド配列が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、少なくとも1種のプライマーが、ステップ(b)の前に各鎖にアニールされる、請求項51に記載の方法。
- 前記第一のタグが、アフィニティータグである、請求項51に記載の方法。
- 前記アフィニティータグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項53に記載の方法。
- 前記複数のプライマーにおける各プライマーが、第二のタグをさらに含む、請求項54に記載の方法。
- 前記第二のタグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項55に記載の方法。
- 一般構造[III]における前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項51に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの5’ホスホロチオレート結合が、Ag+、Hg2+またはCu2+により開裂される、請求項51に記載の方法。
- 前記少なくとも1つの5’ホスホロチオレート結合が、約7のpHおよび約22℃から約37℃までの温度で開裂される、請求項58に記載の方法。
- ステップ(e)の前に、プライマーを含む前記断片が単離される、請求項51に記載の方法。
- プライマーを含む前記断片が単離手段を用いて単離され、前記単離手段が前記プライマー上のタグに結合する、請求項60に記載の方法。
- 前記複数のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項51に記載の方法。
- 1種以上の正方向伸長産物を、1種以上の逆方向伸長産物から分離する方法であって、
a) 第一のプライマーおよび第二のプライマーを、センスヌクレオチド鎖およびアンチセンスヌクレオチド鎖を含むテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすることであって、前記第一のプライマーが、前記センス鎖にアニールし、前記第二のプライマーが、前記アンチセンス鎖にアニールし、少なくとも1種のプライマーが第一のタグを含むこと、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーを伸長させ、それによって、少なくとも1種の正方向伸長産物および少なくとも1種の逆方向伸長産物を作製することであって、ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが修飾されており、前記少なくとも1種の正方向伸長産物および前記少なくとも1種の逆方向伸長産物が、1つ以上のホスホロチオレート結合を有する修飾ヌクレオチド配列を含むこと、
c) 複数の断片が作製される条件下、少なくとも1種の正方向伸長産物および少なくとも1種の逆方向伸長産物における1つ以上のホスホロチオレート結合を開裂すること、
d) c)において作製された断片の中から、第一のプライマーを含む1つ以上の断片および第二のプライマーを含む1つ以上の断片を同定すること、および
e) 第一のプライマーを含む1つ以上の断片を、第二のプライマーを含む1つ以上の断片から分離すること、を含み、
それによって1種以上の正方向伸長産物を、1種以上の逆方向伸長産物から分離する方法。 - 第一のプライマーを含む前記1つ以上の断片および第二のプライマーを含む前記1つ以上の断片が、第一のタグを用いて分離される、請求項63に記載の方法。
- 前記第一のタグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記1つ以上のヌクレオシドトリホスフェートが、タグをさらに含む、請求項63に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項66に記載の方法。
- 第一のタグを含む前記少なくとも1種のプライマーが、第二のタグをさらに含む、請求項63に記載の方法。
- 前記第二のタグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項68に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、各塩基に対して互いに異なるタグを含み、前記塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項63に記載の方法。
- 前記1つ以上のホスホロチオレート結合が、Ag+、Hg2+またはCu2+により開裂される、請求項63に記載の方法。
- 前記1つ以上のホスホロチオレート結合が、約7のpHおよび約22℃から約37℃までの温度で開裂される、請求項71に記載の方法。
- 前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーが、核酸ポリメラーゼの存在下で伸長される、請求項63に記載の方法。
- 1種以上の前方向伸長産物を、1種以上の逆方向伸長産物から分離する方法であって、
a) 第一のプライマーおよび第二のプライマーを、センスヌクレオチド鎖およびアンチセンスヌクレオチド鎖を含むテンプレートポリヌクレオチド配列にアニーリングすることであって、前記第一のプライマーが、前記センス鎖にアニールし、前記第二のプライマーが、前記アンチセンス鎖にアニールし、前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーが各々、タグを含み、前記第一のプライマー上のタグが、前記第二のプライマー上のタグとは異なっていること、
b) 1種以上のヌクレオシドトリホスフェートの存在下で前記第一のプライマーおよび前記第二のプライマーを伸長させ、それによって、少なくとも1種の正方向伸長産物および少なくとも1種の逆方向伸長産物を作製することであって、ここで、少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが修飾されており、前記少なくとも1種の正方向伸長産物および前記少なくとも1種の逆方向伸長産物が、1つ以上のホスホロチオレート結合を有する修飾ヌクレオチド配列を含むこと、
c) 複数の断片が作製される条件下、前記少なくとも1種の正方向伸長産物および前記少なくとも1種の逆方向伸長産物における1つ以上のホスホロチオレート結合を開裂すること、
d) c)において作製された断片の中から、第一のプライマーを含む1つ以上の断片および第二のプライマーを含む1つ以上の断片を同定すること、および
e) 第一のプライマーを含む前記1つ以上の断片を、第二のプライマーを含む前記1つ以上の断片から分離すること、を含み、
それによって1種以上の正方向伸長産物を、1種以上の逆方向伸長産物から分離する方法。 - 第一のプライマーを含む前記1つ以上の断片および第二のプライマーを含む前記1つ以上の断片が、各プライマー上の互いに異なるタグを用いて分離される、請求項74に記載の方法。
- 前記互いに異なるタグが、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテン、リガンド、ペプチドおよび核酸よりなる群から選択される、請求項74に記載の方法。
- 前記修飾ヌクレオチドが、タグをさらに含む、請求項74に記載の方法。
- 前記タグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項77に記載の方法。
- 前記第一のプライマーおよび/または前記第二のプライマーが、追加のタグをさらに含む、請求項74に記載の方法。
- 前記追加のタグが、蛍光体、質量タグまたは電気泳動タグである、請求項79に記載の方法。
- 前記1種以上のヌクレオシドトリホスフェートが、各々の塩基に対して互いに異なるタグを含み、各々の塩基が、グアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシル、イノシンおよび7−デアザ−グアニンよりなる群から選択される、請求項74に記載の方法。
- 前記1つ以上のホスホロチオレート結合が、Ag+、Hg2+またはCu2+により開裂される、請求項74に記載の方法。
- 前記1つ以上のホスホロチオレート結合が、約7のpHおよび約22℃から約37℃までの温度で開裂される、請求項82に記載の方法。
- 少なくとも1種の前記ヌクレオシドトリホスフェートが修飾チオール−ヌクレオシドトリホスフェートである1種以上のヌクレオシドトリホスフェート、および核酸ポリメラーゼを含む、キット。
- 前記修飾チオールヌクレオシドトリホスフェートが標識されている、請求項84に記載のキット。
- 伸長用緩衝液、少なくとも1種のプライマーおよび製造元の取扱い説明書よりなる群から選択される1種以上の追加の構成要素をさらに含む、請求項84に記載のキット。
- 前記少なくとも1種のプライマーが、少なくとも1種のタグを含む、請求項87に記載のキット。
- 前記伸長用緩衝液が、マグネシウムイオン源を含む、請求項87に記載のキット。
- ピロホスフェートをさらに含む、請求項87に記載のキット。
- 開裂用緩衝液をさらに含む、請求項90に記載のキット。
- 前記開裂用緩衝液が、少なくとも1種の金属イオン源を含む、請求項91に記載のキット。
- 前記少なくとも1種の金属イオンが、銀イオン源である、請求項92に記載のキット。
- 前記銀イオン源が、AgNO3である、請求項93に記載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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