BR112017002489B1 - Instrumento configurado para fazer interface com um chip de teste, aparelho, método de análise de um espécime, método para sequenciar uma molécula-alvo de ácido nucleico e método para sequenciamento de ácido nucleico - Google Patents

Instrumento configurado para fazer interface com um chip de teste, aparelho, método de análise de um espécime, método para sequenciar uma molécula-alvo de ácido nucleico e método para sequenciamento de ácido nucleico Download PDF

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Ali Kabiri
Jason W. Sickler
Brett J. Gyarfas
Jeremy Lackey
Gerard Schmid
Paul E. Glenn
Lawrence C. West
Benjamin Cipriany
Keith G. Fife
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Abstract

SISTEMA ÓPTICO E CHIP DE ENSAIO PARA SONDAR, DETECTAR E ANALISAR MOLÉCULAS. Trata-se de aparelho e métodos para analisar molécula única e realizar sequenciamento de ácido nucleico. Um aparelho pode incluir um chip de ensaio que inclui múltiplos pixels com cavidades de amostra configuradas para receber uma amostra, que, quando excitada, emite energia de emissão; pelo menos um elemento para direcionar a energia de emissão em uma direção particular; e uma trajetória de luz ao longo da qual a energia de emissão se desloca da cavidade de amostra em direção a um sensor. O aparelho também inclui um instrumento que faz interface com o chip de ensaio. O instrumento inclui uma fonte de luz de excitação para excitar a amostra em cada cavidade de amostra; em que uma pluralidade de sensores são correspondentes às cavidades de amostra. Cada sensor pode detectar energia de emissão de uma amostra em uma respectiva cavidade de amostra. O instrumento inclui pelo menos um elemento óptico que direciona a energia de emissão de cada cavidade de amostra em direção a um respectivo sensor dentre a pluralidade de sensores.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/035.242, intitulado "OPTICAL SYSTEM AND ASSAY CHIP FOR PROBING, DETECTING AND ANALYZING MOLECULES", depositado em 8 de agosto de 2014, o qual está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.
[0002] Este pedido é relacionado aos pedidos a seguir:
[0003] • Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/164.506, intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS", depositado em 20 de maio de 2015;
[0004] • Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/164.485, intitulado "PULSED LASER", depositado em 20 de maio de 2015;
[0005] • Pedido de Patente Provisório n° U.S. 62/164.482, intitulado "METHODS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING", depositado em 20 de maio de 2015;
[0006] • Pedido de Patente Provisório n° U.S 62/164.464, intitulado "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING DETECTING AND ANALYZING MOLECULES", depositado em 20 de maio de 2015;
[0007] • Um pedido de patente não provisório depositado na mesma data do presente pedido, que porta o n° de dossiê R0708.70002US02, intitulado "INTEGRATED DEVICE FOR TEMPORAL BINNING OF RECEIVED PHOTONS"; e
[0008] • Um pedido de patente não provisório depositado na mesma data do presente pedido, que porta o n° de dossiê R0708.70004US02, intitulado "INTEGRATED DEVICE WITH EXTERNAL LIGHT SOURCE FOR PROBING, DETECTING, AND ANALYZING MOLECULES".
[0009] Cada um dos pedidos relacionados listados acima está aqui incorporado, a título de referência, em sua totalidade.
ANTECEDENTES CAMPO
[00010] A presente aplicação é direcionada geralmente a dispositivos, métodos e conjuntos de procedimentos para realizar análise rápida, massivamente paralela e quantitativa de amostras biológicas e/ou químicas, e métodos de fabricar os ditos dispositivos. TÉCNICA RELACIONADA
[00011] A detecção e a análise de amostras biológicas podem ser realizadas com uso de ensaios biológicos ("bioensaios"). Os bioensaios envolvem convencionalmente equipamentos de laboratório dispendiosos grandes que exigem pesquisadores treinados para operar o equipamento e realizar os bioensaios. Além disso, os bioensaios são convencionalmente realizados em volume, de modo que uma quantidade grande de um tipo particular de amostra seja necessária para detecção e quantificação.
[00012] Alguns bioensaios são realizados etiquetando-se amostras com etiquetas luminescentes que emitem luz de um comprimento de onda particular. As etiquetas são iluminadas com uma fonte de luz de excitação para causar luminescência, e a luz luminescente é detectada com um fotodetector para quantizar a quantidade de luz luminescente emitida pelas etiquetas. Os bioensaios que usam etiquetas luminescentes envolvem convencionalmente fontes de luz laser dispendiosas para iluminar amostras e componentes ópticos e eletrônicos de detecção volumosos e complicados para coletar a luminescência a partir das amostras iluminadas.
SUMÁRIO
[00013] Algumas modalidades se referem a um instrumento configurado para fazer interface com um chip de teste que inclui uma pluralidade de cavidades de amostra. Cada cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra pode receber uma amostra. O instrumento inclui pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada para excitar a amostra de pelo menos uma porção da pluralidade de cavidades de amostra. O instrumento também inclui uma pluralidade de sensores, em que cada sensor da pluralidade de sensores é correspondente a uma cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra. Cada sensor dentre a pluralidade de sensores detecta energia de emissão a partir da amostra em uma respectiva cavidade de amostra. Adicionalmente, cada sensor dentre uma pluralidade de sensores tem capacidade para detectar o tempo de detecção da energia de emissão. O instrumento também inclui pelo menos um elemento óptico configurado para direcionar a energia de emissão a partir de cada cavidade de amostra da pluralidade de cavidades de amostra em direção a um respectivo sensor dentre a pluralidade de sensores.
[00014] Algumas modalidades se referem a um aparelho que inclui um chip de teste e um instrumento. O chip de teste inclui uma pluralidade de pixels. Cada pixel do chip de teste inclui uma cavidade de amostra que recebe uma amostra, que, quando excitada, emite energia de emissão. Cada pixel do chip de teste também inclui pelo menos um elemento para direcionar a energia de emissão em uma direção particular. O pelo menos um elemento pode ser um elemento refrativo, um elemento difrativo, a elemento plasmônico ou um ressonador. Cada pixel do chip de teste também inclui uma trajetória de luz ao longo da qual a energia de emissão se desloca da cavidade de amostra em direção a um sensor do instrumento. O instrumento faz interface com o chip de teste e inclui pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada que excita a amostra em cada cavidade de amostra. O instrumento também inclui uma pluralidade de sensores, em que cada sensor dentre a pluralidade de sensores é correspondente a uma respectiva cavidade de amostra. Cada sensor dentre a pluralidade de sensores detecta a energia de emissão da amostra na respectiva cavidade de amostra e detecta o tempo de detecção da energia de emissão. O instrumento também inclui pelo menos um elemento óptico que direciona a energia de emissão a partir de cada cavidade de amostra em direção a um respectivo sensor dentre a pluralidade de sensores.
[00015] Algumas modalidades se referem a um método de analisar um espécime. O método inclui fornecer o espécime na superfície de topo de um chip de teste que inclui uma pluralidade de cavidades de amostra. O método também inclui alinhar o chip com um instrumento que inclui pelo menos uma fonte de luz de excitação e pelo menos um sensor. O método também inclui excitar uma amostra do espécime em pelo menos uma dentre a pluralidade de cavidades de amostra com luz de excitação pulsada a partir da pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada. O método também inclui detectar, com o pelo menos um sensor, a energia de emissão gerada pela amostra na pelo menos uma cavidade de amostra em resposta à excitação pela luz de excitação. O pelo menos um sensor tem capacidade de determinar o tempo de vida da energia de emissão gerada pela amostra.
[00016] Algumas modalidades se referem a um método para sequenciar uma molécula-alvo de ácido nucleico. O método inclui fornecer um chip adjacente a um instrumento que inclui uma fonte de excitação pulsada e um sensor com capacidade para detectar pelo menos uma propriedade temporal de luz. O chip inclui pelo menos uma cavidade que é acoplada de modo operativo à dita fonte de excitação e ao dito sensor quando o dito chip está em uma posição de captação do dito instrumento. A cavidade contém a dita molécula-alvo de ácido nucleico, uma enzima de polimerização e uma pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo. O método também inclui, com o dito chip na dita posição de captação, realizar uma reação de extensão em um local de preparação da dita molécula-alvo de ácido nucleico na presença da dita enzima de polimerização para incorporar sequencialmente os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo em um filamento crescente que é complementar à dita molécula-alvo de ácido nucleico. Mediante incorporação e excitação por energia de excitação da dita fonte de excitação, os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos emitem sinais na dita cavidade. O método também inclui usar o dito sensor para detectar padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais que são distinguíveis para a dita pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo. O método também inclui identificar os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo com base nos ditos padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais, assim sequenciando a dita molécula-alvo de ácido nucleico.
[00017] Algumas modalidades se referem a um método para sequenciamento de ácido nucleico. O método inclui fornecer um chip adjacente a um instrumento. O chip inclui uma pluralidade de cavidades que são, cada uma, acopladas de modo operativo a uma fonte de excitação pulsada e um sensor do dito instrumento quando o dito chip está em uma posição de captação do dito instrumento. Uma cavidade individual dentre a dita pluralidade de cavidades contém a dita molécula- alvo de ácido nucleico, uma enzima de polimerização e uma pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo. O método também inclui, com o chip na dita posição de captação, submeter a dita molécula-alvo de ácido nucleico a uma reação de polimerização para render um filamento crescente que é complementar à dita molécula-alvo de ácido nucleico na presença dos ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo e da dita enzima de polimerização. Os nucleotídeos ou os análogos de nucleotídeos emitem sinais na dita cavidade individual mediante excitação por energia de excitação a partir da dita fonte de excitação durante a incorporação. O método também inclui usar o dito sensor para detectar padrões de distribuição temporal dos ditos sinais que são distinguíveis para a dita pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo. O método também inclui identificar uma sequência da dita molécula-alvo de ácido nucleico com base nos ditos padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais.
[00018] O supracitado e outros aspectos, modalidades, e recursos dos presentes ensinamentos podem ser mais completamente entendidos a partir da descrição a seguir em combinação com os desenhos anexos.
[00019] O termo "pixel" pode ser usado na presente invenção para se referir a uma célula de unidade de um dispositivo integrado. A célula de unidade pode incluir uma cavidade de amostra e um sensor. A célula de unidade pode incluir adicionalmente uma fonte de excitação. A célula de unidade pode incluir adicionalmente pelo menos uma estrutura óptica de acoplamento por excitação (que pode ser chamada de "primeira estrutura") que é configurada para intensificar o acoplamento de energia de excitação da fonte de excitação à cavidade de amostra. A célula de unidade pode incluir adicionalmente pelo menos uma estrutura de acoplamento por emissão que é configurada para intensificar o acoplamento de emissão da cavidade de amostra ao sensor. A célula de unidade pode incluir adicionalmente dispositivos eletrônicos integrados (por exemplo, dispositivos CMOS). Pode haver uma pluralidade de pixels disposta em uma matriz em um dispositivo integrado.
[00020] O termo "óptico" pode ser usado na presente invenção para se referir a bandas espectrais visível, quase infravermelho e de infravermelho de comprimento de onda curto.
[00021] O termo "etiqueta" pode ser usado na presente invenção para referir a uma etiqueta, sonda, marcador, ou repórter anexado a uma amostra a ser analisada ou anexada a um reagente que pode reagir com uma amostra.
[00022] A expressão "energia de excitação" pode ser usada na presente invenção para se referir a qualquer forma de energia (por exemplo, radioativa ou não radioativa) entregue a uma amostra e/ou etiqueta dentro da cavidade de amostra. A energia de excitação radioativa pode compreender radiação óptica em um ou mais comprimentos de onda distintos.
[00023] A expressão "comprimento de onda distinto" pode ser usada na presente invenção para se referir a um comprimento de onda central ou predominante dentro de uma largura de banda limitada de radiação. Em alguns casos, a mesma pode se referir a um comprimento de onda de pico de uma largura de banda de radiação. Exemplos de comprimentos de onda distintos de fluoróforos são 563 nm, 595 nm, 662 nm, e 687 nm.
[00024] A expressão "energia distinta" pode ser usada na presente invenção para se referir a uma energia associada a um comprimento de onda distinto.
[00025] O termo "emissão" pode ser usado na presente invenção para se referir à emissão a partir de uma etiqueta e/ou amostra. Isso pode incluir emissão radioativa (por exemplo, emissão óptica) ou transferência de energia não radioativa (por exemplo, transferência de energia de Dexter ou transferência de energia ressonante de Forster). A emissão resulta a partir de excitação de uma amostra e/ou etiqueta dentro da cavidade de amostra.
[00026] A expressão "emissão a partir de uma cavidade de amostra" ou "emissão a partir de uma amostra" pode ser usada na presente invenção para se referir à emissão a partir de uma etiqueta e/ou amostra dentro de uma cavidade de amostra.
[00027] O termo "autoalinhado" pode ser usado na presente invenção para se referir a um processo de microfabricação no qual pelo menos dois elementos distintos (por exemplo, uma cavidade de amostra e uma estrutura de acoplamento por emissão, uma cavidade de amostra e uma fonte de excitação) podem ser fabricados e alinhados entre si sem usar duas etapas de padronização litográfica separada nas quais uma primeira etapa de padronização litográfica (por exemplo, fotolitografia, litografia de feixe de íons, litografia EUV) imprime um padrão de um primeiro elemento e uma segunda etapa de padronização litográfica é alinhada à primeira etapa de padronização litográfica e imprime um padrão do segundo elemento. Um processo autoalinhado pode compreender incluir o padrão tanto do primeiro quanto do segundo elemento em uma etapa de padronização litográfica única, ou pode compreender formar o segundo elemento com uso de recursos de uma estrutura fabricada do primeiro elemento.
[00028] O termo "sensor" pode ser usado na presente invenção para se referir a um ou mais dispositivos de circuito integrado configurados para detectar a emissão da cavidade de amostra e produzir pelo menos um sinal elétrico representativo da emissão detectada.
[00029] O termo "nanoescala" pode ser usado na presente invenção para se referir a uma estrutura que tem pelo menos uma dimensão ou tamanho de recurso mínimo na ordem de 150 nanômetros (nm) ou menos, mas não maior que aproximadamente 500 nm.
[00030] O termo "microescala" pode ser usado na presente invenção para se referir a uma estrutura que tem pelo menos uma dimensão ou tamanho de recurso mínimo entre aproximadamente 500 nm e aproximadamente 100 mícrons.
[00031] A expressão "intensificar energia de excitação" pode ser usada na presente invenção para se referir a aumentar uma intensidade de energia de excitação em uma região de excitação de uma cavidade de amostra. A intensidade pode ser aumentada concentrando-se e/ou ressonando energia de excitação incidente na cavidade de amostra, por exemplo. Em alguns casos, a intensidade pode ser aumentada por revestimentos antirreflexivos ou camadas com perdas que permitem que a energia de excitação penetre adicionalmente a região de excitação de uma cavidade de amostra. Uma intensificação de energia de excitação pode ser uma referência comparativa a uma modalidade que não inclui estruturas para intensificar a energia de excitação em uma região de excitação de uma cavidade de amostra.
[00032] Os termos "cerca de", "aproximadamente", e "substancialmente" podem ser usados na presente invenção para se referir a um valor, e são destinados a abranger o valor referenciado mais e menos variações aceitáveis. A quantidade de variação pode ser menor que 5% em algumas modalidades, menor que 10% em algumas modalidades, e ainda menor que 20% em algumas modalidades. Em modalidades em que um aparelho pode funcionar apropriadamente por uma faixa grande de valores, por exemplo, uma faixa que inclui uma ou mais ordens de magnitude, a quantidade de variação pode ser um fator de dois. Por exemplo, se um aparelho funcionar apropriadamente para um valor na faixa de 20 a 350, "aproximadamente 80" pode abranger valores entre 40 e 160.
[00033] O termo "adjacente" pode ser usado na presente invenção para se referir a dois elementos dispostos em proximidade entre si (por exemplo, dentro de uma distância que é menor que cerca de um quinto de uma dimensão transversal ou vertical de um pixel). Em alguns casos, podem haver estruturas ou camadas intermediárias entre elementos adjacentes. Em alguns casos, elementos adjacentes podem ser imediatamente adjacentes entre si sem estruturas ou elementos intermediários.
[00034] O termo "detectar" pode ser usado na presente invenção para se referir a receber uma emissão em um sensor de uma cavidade de amostra e produzir pelo menos um sinal elétrico representativo de ou associado à emissão. O termo "detectar" também pode ser usado na presente invenção para se referir a determinar a presença de, ou identificar uma propriedade de, uma amostra ou marcador particular na cavidade de amostra com base na emissão a partir da cavidade de amostra.
BREVE DESCRIÇÃO
[00035] O artesão versado na técnica entenderá que as Figuras, descritas no presente documento, são apenas com propósitos de ilustração. Deve ser entendido que, em alguns casos, vários aspectos da invenção podem ser mostrados de modo exagerado ou ampliado para facilitar um entendimento da invenção. Nos desenhos, caracteres de referência semelhantes se referem geralmente a recursos semelhantes, elementos funcionalmente similares e/ou estruturalmente similares ao longo das várias Figuras. Os desenhos não estão necessariamente em escala, em que a ênfase é dada, em vez disso, na ilustração dos princípios dos ensinamentos. Os desenhos não são destinados a limitar o escopo dos presentes ensinamentos em qualquer maneira.
[00036] A Figura 1-1 ilustra as curvas de tempo de vida de fluorescente para dois marcadores diferentes, de acordo com algumas modalidades.
[00037] A Figura 1-2A ilustra espectros de comprimento de onda de emissão, de acordo com algumas modalidades.
[00038] A Figura 1-2B ilustra espectros de comprimento de onda de absorção, de acordo com algumas modalidades.
[00039] A Figura 1-2C ilustra espectros de comprimento de onda de emissão, de acordo com algumas modalidades.
[00040] A Figura 1-3A ilustra um espaço de fase para comprimento de onda de emissão e tempo de vida de emissão.
[00041] A Figura 1-3B ilustra um espaço de fase para comprimento de onda de absorção e tempo de vida de emissão.
[00042] A Figura 1-4 ilustra um espaço de fase para comprimento de onda de emissão, comprimento de onda de absorção, e tempo de vida de emissão.
[00043] A Figura 2-1 é uma representação de diagrama de blocos de um aparelho que pode ser usado para análise móvel rápida de espécimes biológicos e químicos, de acordo com algumas modalidades.
[00044] A Figura 2-2 é um diagrama esquemático da relação entre pixels do chip de sensor e pixels do chip de teste, de acordo com algumas modalidades.
[00045] A Figura 2-3 ilustra componentes associados ao pixel único do chip de teste e um pixel único do chip de sensor, de acordo com algumas modalidades.
[00046] A Figura 2-4 ilustra uma porção dos componentes do instrumento, de acordo com algumas modalidades.
[00047] A Figura 3-1A é uma vista em perspectiva de topo do chip de teste e um quadro retentor de chip, de acordo com algumas modalidades.
[00048] A Figura 3-1B é uma vista em perspectiva de fundo do chip de teste e do quadro retentor de chip, de acordo com algumas modalidades.
[00049] A Figura 3-1C é uma vista em corte transversal do chip de teste e do quadro retentor de chip, de acordo com algumas modalidades.
[00050] A Figura 3-2 ilustra energia de excitação incidente em uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00051] A Figura 3-3 ilustra a atenuação de energia de excitação ao longo de uma cavidade de amostra que é formada como um guia de onda de modo zero, de acordo com algumas modalidades.
[00052] A Figura 3-4 ilustra uma cavidade de amostra que inclui uma concavidade, que aumenta a energia de excitação em uma região de excitação associada à cavidade de amostra em algumas modalidades.
[00053] A Figura 3-5 compara intensidades de excitação para cavidades de amostra com e sem uma concavidade, de acordo com uma modalidade.
[00054] A Figura 3-6 ilustra uma cavidade de amostra e concavidade formadas em uma protuberância, de acordo com algumas modalidades.
[00055] A Figura 3-7A ilustra uma cavidade de amostra que tem paredes laterais afuniladas, de acordo com algumas modalidades.
[00056] A Figura 3-7B ilustra uma cavidade de amostra que tem paredes laterais curvadas e uma concavidade com uma dimensão transversal menor, de acordo com algumas modalidades.
[00057] A Figura 3-7C ilustra uma vista em elevação lateral de uma cavidade de amostra formada a partir de estruturas plasmônicas de superfície.
[00058] A Figura 3-7D ilustra uma vista plana de uma cavidade de amostra formada a partir de estruturas plasmônicas de superfície.
[00059] A Figura 3-7E ilustra uma cavidade de amostra que inclui uma estrutura de intensificação de energia de excitação formada ao longo de paredes laterais da cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00060] A Figura 3-7F ilustra uma cavidade de amostra formada em uma pilha de múltiplas camadas, de acordo com algumas modalidades.
[00061] A Figura 3-8 ilustra um revestimento de superfície formado em superfícies de uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00062] A Figura 3-9A à Figura 3-9E ilustram estruturas associadas a um processo de desprendimento de formar uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00063] A Figura 3-9F ilustra uma estrutura associada a um processo de desprendimento alternativo de formar uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00064] A Figura 3-10A à Figura 3-10D ilustram estruturas associadas a um processo de gravação direta de formar uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00065] A Figura 3-11 ilustra uma cavidade de amostra que pode ser formada em múltiplas camadas com uso de um processo de desprendimento ou um processo de gravação direta, de acordo com algumas modalidades.
[00066] A Figura 3-12 ilustra uma estrutura associada a um processo de gravação que pode ser usado para formar uma concavidade, de acordo com algumas modalidades.
[00067] A Figura 3-13A à Figura 3-13C ilustram estruturas associadas a um processo alternativo de formar uma concavidade, de acordo com algumas modalidades.
[00068] A Figura 3-14A à Figura 3-14D ilustram estruturas associadas a um processo para depositar um aderente e camadas de passivação, de acordo com algumas modalidades.
[00069] A Figura 3-15 ilustra uma estrutura associada a um processo para depositar um aderente de modo central dentro de uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00070] A Figura 4-1A e a Figura 4-1B ilustram uma estrutura de plasmon de superfície, de acordo com apenas uma modalidade.
[00071] A Figura 4-1C ilustra uma estrutura de plasmon de superfície formada adjacente a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00072] A Figura 4-1D e a Figura 4-1E ilustram estruturas de plasmon de superfície formadas em uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00073] A Figura 4-2A à Figura 4-2C ilustram exemplos de estruturas de plasmon de superfície periódica, de acordo com algumas modalidades.
[00074] A Figura 4-2D ilustra uma simulação numérica de energia de excitação em uma cavidade de amostra formada adjacente a uma estrutura de plasmon de superfície periódica, de acordo com algumas modalidades.
[00075] A Figura 4-2E à Figura 4-2G ilustram estruturas de plasmon de superfície periódica, de acordo com algumas modalidades.
[00076] A Figura 4-2H e a Figura 4-2I ilustram uma nanoantena que compreende estruturas de plasmon de superfície, de acordo com algumas modalidades.
[00077] A Figura 4-3A à Figura 4-3E ilustram estruturas associadas a etapas de processo para formar uma estrutura de plasmon de superfície, de acordo com algumas modalidades.
[00078] A Figura 4-4A à Figura 4-4G ilustram estruturas associadas a etapas de processo para formar uma estrutura de plasmon de superfície e uma cavidade de amostra autoalinhada, de acordo com algumas modalidades.
[00079] A Figura 4-5A à Figura 4-4E ilustram estruturas associadas a etapas de processo para formar uma estrutura de plasmon de superfície e uma cavidade de amostra autoalinhada, de acordo com algumas modalidades.
[00080] A Figura 4-6A ilustra uma película com perdas fina formada adjacente a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00081] A Figura 4-6B e a Figura 4-6C ilustram resultados a partir de simulações numéricas de energia de excitação na adjacência de uma cavidade de amostra e película com perdas fina, de acordo com algumas modalidades.
[00082] A Figura 4-6D ilustra uma película com perdas fina espaçada a partir de uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00083] A Figura 4-6E ilustra uma pilha de películas com perdas finas formadas adjacente a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00084] A Figura 4-7A ilustra uma pilha reflexiva que pode ser usada para formar uma cavidade ressonante adjacente a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00085] A Figura 4-7B ilustra uma estrutura dielétrica que pode ser usada para concentrar energia de excitação em uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00086] A Figura 4-7C e a Figura 4-7D ilustram uma estrutura de lacuna na banda fotônica que pode ser padronizada adjacente a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00087] A Figura 4-8A à Figura 4-8G ilustram estruturas associadas a etapas de processo para formar estruturas dielétricas e uma cavidade de amostra autoalinhada, de acordo com algumas modalidades.
[00088] A Figura 4-9A e a Figura 4-9B ilustram estruturas para acoplar a energia de excitação a uma amostra através de um processo não radioativo, de acordo com algumas modalidades.
[00089] A Figura 4-9C ilustra uma estrutura para acoplar a energia de excitação a uma amostra por múltiplos processos não radioativos, de acordo com algumas modalidades.
[00090] A Figura 4-9D ilustra uma estrutura que incorpora uma ou mais partículas de conversão de energia para acoplar energia de excitação a uma amostra através de um processo radioativo ou não radioativo, de acordo com algumas modalidades.
[00091] A Figura 4-9E ilustra espectros associados à conversão descendente de energia de excitação para uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00092] A Figura 4-9F ilustra espectros associados à conversão ascendente de energia de excitação para uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[00093] A Figura 5-1 ilustra uma grade circular plasmônica concêntrica, de acordo com algumas modalidades.
[00094] A Figura 5-2 ilustra uma grade plasmônica espiral, de acordo com algumas modalidades.
[00095] A Figura 5-3A ilustra padrões de distribuição espacial de emissão a partir de uma grade circular plasmônica concêntrica, de acordo com algumas modalidades.
[00096] A Figura 5-3B ilustra a diretividade de grades circulares plasmônicas concêntricas aperiódicas e periódicas, de acordo com algumas modalidades.
[00097] A Figura 5-4A à Figura 5-4B ilustram nanoantenas plasmônicas, de acordo com algumas modalidades.
[00098] A Figura 5-5A à Figura 5-5B ilustram nanoantenas plasmônicas, de acordo com algumas modalidades.
[00099] A Figura 5-5C ilustra o padrão de radiação de energia de emissão de uma matriz de nanoantena, de acordo com algumas modalidades.
[000100] A Figura 5-6A ilustra componentes ópticos refrativos do chip de teste, de acordo com algumas modalidades.
[000101] A Figura 5-6B ilustra lentes Fresnel do chip de teste, de acordo com algumas modalidades.
[000102] A Figura 6-1 ilustra componentes de microscopia do instrumento, de acordo com algumas modalidades.
[000103] A Figura 6-2A ilustra elementos de classificação espectral de campo distante do chip de sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000104] A Figura 6-2B ilustra elementos de filtração de campo distante do chip de sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000105] A Figura 6-3A e a Figura 6-3B ilustra películas com perda finas do chip de sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000106] A Figura 6-4A e a Figura 6-4B ilustram o bloco óptico do instrumento, de acordo com algumas modalidades.
[000107] A Figura 6-5 ilustra trajetórias ópticas pelo sistema óptico, de acordo com algumas modalidades.
[000108] A Figura 7-1A ilustra, em vista em elevação, um sensor dentro de um pixel de um chip de sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000109] A Figura 7-1B ilustra um sensor do tipo alvo que tem duas áreas ativas separadas e concêntricas, de acordo com algumas modalidades.
[000110] A Figura 7-1C ilustra um sensor em tira que tem quatro áreas ativas separadas, de acordo com algumas modalidades.
[000111] A Figura 7-1D ilustra um sensor quad que tem quatro áreas ativas separadas, de acordo com algumas modalidades.
[000112] A Figura 7-1E ilustra um sensor de segmento de arco que tem quatro áreas ativas separadas, de acordo com algumas modalidades.
[000113] A Figura 7-1F ilustra um sensor de segmento empilhado, de acordo com algumas modalidades.
[000114] A Figura 7-2A ilustra uma distribuição de emissão dos elementos de classificação para energia emitida em um primeiro comprimento de onda, de acordo com algumas modalidades.
[000115] A Figura 7-2B ilustra um padrão de radiação recebido por um sensor do tipo alvo correspondente à distribuição de emissão ilustrada na Figura 7-2A, de acordo com algumas modalidades.
[000116] A Figura 7-2C ilustra uma distribuição de emissão dos elementos de classificação para energia emitida em um segundo comprimento de onda, de acordo com algumas modalidades.
[000117] A Figura 7-2D ilustra um padrão de radiação recebido por um sensor do tipo alvo correspondente à distribuição de emissão ilustrada na Figura 7-2C, de acordo com algumas modalidades.
[000118] A Figura 7-2E representa os resultados a partir de uma simulação numérica de detecção de sinal para um sensor do tipo alvo que tem duas áreas ativas para um primeiro comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000119] A Figura 7-2F representa os resultados a partir de uma simulação numérica de detecção de sinal para o sensor do tipo alvo associado à Figura 7-2E para um segundo comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000120] A Figura 7-2G representa os resultados a partir de uma simulação numérica de detecção de sinal para o sensor do tipo alvo associado à Figura 7-2E para um terceiro comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000121] A Figura 7-2H representa os resultados a partir de uma simulação numérica de detecção de sinal para o sensor do tipo alvo associado à Figura 7-2E para um quarto comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000122] A Figura 7-2I representa resultados de uma simulação numérica de detecção de sinal para um sensor do tipo alvo que tem quatro áreas ativas para um primeiro comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000123] A Figura 7-2J representa resultados de uma simulação numérica de detecção de sinal para o sensor do tipo alvo associado à Figura 7-2I para um segundo comprimento de onda de emissão de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000124] A Figura 7-3A ilustra o conjunto de circuitos em um instrumento que pode ser usado para ler sinais de um sensor que compreende duas áreas ativas, de acordo com algumas modalidades.
[000125] A Figura 7-3B ilustra um circuito de três transistores que pode ser incluído em um chip de sensor para acúmulo de sinal e leitura, de acordo com algumas modalidades.
[000126] A Figura 7-3C ilustra um conjunto de circuitos em um instrumento que pode ser usado para ler sinais de um sensor que compreende quatro áreas ativas, de acordo com algumas modalidades.
[000127] A Figura 7-4A ilustra as características de emissão temporal para dois emissores diferentes que podem ser usados para análise de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000128] A Figura 7-4B ilustra a evolução temporal de uma fonte de excitação e luminescência de uma amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000129] A Figura 7-4C ilustra a amostragem de intervalo de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[000130] A Figura 7-4D ilustra características de emissão temporal para dois emissores diferentes, de acordo com algumas modalidades.
[000131] A Figura 7-4E ilustra a dinâmica de tensão em um nó de acúmulo de carga de um sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000132] A Figura 7-4F ilustra uma leitura dupla de um segmento de sensor sem redefinição, de acordo com algumas modalidades.
[000133] A Figura 7-4G e a Figura 7-4H ilustram o primeiro e o segundo níveis de sinal de leitura associados a dois emissores que têm características de emissão distintas de modo temporal, de acordo com algumas modalidades.
[000134] A Figura 7-5 ilustra um diagrama esquemático de um pixel com capacidade de resolução de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[000135] A Figura 7-6 ilustra um diagrama esquemático de um pixel com capacidade de resolução de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[000136] A Figura 8-1A e a Figura 8-1B ilustram bandas de excitação espectral de fontes de excitação, de acordo com algumas modalidades.
[000137] A Figura 8-2A é uma esquemática de uma fonte de luz coerente, de acordo com algumas modalidades.
[000138] A Figura 8-2B ilustra perfis de intensidade temporal de uma fonte de excitação, de acordo com algumas modalidades.
[000139] A Figura 8-3 ilustra oscilações de relaxamento e um sinal de luz de uma fonte de excitação, de acordo com algumas modalidades.
[000140] A Figura 8-4 ilustra o uso de um pulso elétrico ajustado para reduzir a potência de um rastro em um pulso óptico de saída, de acordo com algumas modalidades.
[000141] A Figura 8-5 e a Figura 8-6 ilustram a potência de saída óptica de uma fonte de excitação como uma função de tempo, de acordo com algumas modalidades.
[000142] A Figura 8-7 ilustra uma corrente mais alta em frequências mais altas que resultam a partir do uso de um número grande de ligações de fio, de acordo com algumas modalidades.
[000143] A Figura 8-8A é uma esquemática de um pulsar de linha de transmissão, de acordo com algumas modalidades.
[000144] A Figura 8-8B ilustra perfis temporais de pulsos de luz obtidos a partir de uma linha de transmissão, de acordo com algumas modalidades.
[000145] A Figura 8-9 e a Figura 8-10 são esquemáticos de circuitos exemplificativos para gerar luz de excitação pulsada, de acordo com algumas modalidades.
[000146] A Figura 8-11A ilustra um circuito exemplificativo que tem um amplificador de RF que pode ser usado para produzir um sinal elétrico ajustado como um pulso de saída, de acordo com algumas modalidades.
[000147] A Figura 8-11B ilustra um perfil de pulso elétrico obtido a partir do circuito da Figura 8-11A.
[000148] A Figura 8-12A ilustra um circuito exemplificativo que tem um amplificador de RF que pode ser usado para produzir um sinal elétrico ajustado como um pulso de saída, de acordo com algumas modalidades.
[000149] A Figura 8-12B ilustra um perfil de pulso elétrico obtido a partir do circuito da Figura 8-12A.
[000150] A Figura 8-13A ilustra uma esquemática para combinar quatro fontes diferentes, de acordo com algumas modalidades.
[000151] A Figura 8-13B ilustra a corrente, eficácia de potência, e a tensão para quatro fontes como uma função de impedância, de acordo com algumas modalidades.
[000152] A Figura 9-1 ilustra um método de operação de um aparelho compacto que pode ser usado para análise móvel rápida de espécimes biológicos e químicas, de acordo com algumas modalidades.
[000153] A Figura 9-2 ilustra um procedimento de calibração, de acordo com algumas modalidades.
[000154] A Figura 9-3 ilustra um procedimento de análise de dados, de acordo com algumas modalidades.
[000155] A Figura 10-1 é uma esquemática de sequenciamento de ácido nucleico de molécula única, de acordo com algumas modalidades.
[000156] A Figura 10-2 ilustra esquematicamente um processo de sequenciamento em uma cavidade de amostra única ao longo do tempo.
[000157] A Figura 10-3 ilustra um processo para preparar uma superfície de cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000158] A Figura 10-4 ilustra medições de tempo de vida exemplificativas, de acordo com algumas modalidades.
[000159] A Figura 10-5 ilustra uma lente Fresnel integrada com um sensor, de acordo com algumas modalidades.
[000160] A Figura 10-6 ilustra os tempos de vida luminescente de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000161] A Figura 10-7 ilustra 16 distâncias de tempo usadas por um sensor para distinguir os marcadores da Figura 10-6.
[000162] A Figura 10-8 ilustra os tempos de vida luminescente de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000163] A Figura 10-9 ilustra 13 distâncias de tempo usadas por um sensor para distinguir os marcadores da Figura 10-6.
[000164] A Figura 10-10 ilustra um tempo de vida e um esquema de medição espectral, de acordo com algumas modalidades.
[000165] A Figura 10-11 ilustra a separação entre quatro marcadores com base no tempo de vida e no comprimento de onda de emissão, de acordo com algumas modalidades.
[000166] A Figura 10-12 ilustra os espectros de emissão de três marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000167] A Figura 10-13 ilustra os tempos de vida de fluorescência de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000168] A Figura 10-14 ilustra perfis de sinal dos três marcadores a partir da Figura 10-12 com uso de um sensor de quatro segmentos, de acordo com algumas modalidades.
[000169] A Figura 10-15 ilustra os tempos de vida de fluorescência de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000170] A Figura 10-16 ilustra perfis de sinal de ATRho14 com uso de um sensor de quatro segmentos, de acordo com algumas modalidades.
[000171] A Figura 10-17 ilustra um tempo de vida e um esquema de medição de energia de absorção, de acordo com algumas modalidades.
[000172] A Figura 10-18 ilustra os espectros de absorção de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000173] A Figura 10-19 ilustra as medições de tempo de vida de dois marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000174] A Figura 10-20 ilustra 8 distâncias de tempo usadas por um sensor para distinguir os marcadores da Figura 10-19.
[000175] A Figura 10-21 ilustra os perfis de sinal de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000176] A Figura 10-22 ilustra o espectro de emissão de quatro marcadores, de acordo com algumas modalidades.
[000177] A Figura 10-23 ilustra um ambiente de computação, de acordo com algumas modalidades.
[000178] A Figura 11-1 ilustra um método de fabricar uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000179] A Figura 11-2 ilustra um método de fabricar uma cavidade de amostra com uso de um método de desprendimento, de acordo com algumas modalidades.
[000180] A Figura 11-3 ilustra um método de formar uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades.
[000181] A Figura 11-4 ilustra um método de formar uma grade concêntrica, de acordo com algumas modalidades.
[000182] A Figura 11-5 ilustra um método de formar uma grade concêntrica, de acordo com algumas modalidades.
[000183] A Figura 11-6 ilustra um método de posicionar a nanopassagem, de acordo com algumas modalidades.
[000184] A Figura 11-7 ilustra um método de fabricação de matriz de lente, de acordo com algumas modalidades.
[000185] A Figura 11-8 ilustra uma matriz de lente refrativa, de acordo com algumas modalidades.
[000186] A Figura 11-9 ilustra uma matriz de lente refrativa, de acordo com algumas modalidades.
[000187] A Figura 11-10 ilustra um método de formar uma lente, de acordo com algumas modalidades.
[000188] A Figura 11-11 ilustra um método de formar uma lente, de acordo com algumas modalidades.
[000189] A Figura 11-12 ilustra um elemento difrativo óptico, de acordo com algumas modalidades.
[000190] A Figura 11-13 ilustra duas camadas de célula de unidade usadas para formar um elemento difrativo óptico, de acordo com algumas modalidades.
[000191] A Figura 11-14 ilustra um padrão de lente difrativa de acordo com algumas modalidades.
[000192] A Figura 11-15 e a Figura 11-16 ilustram um método de fabricar um elemento difrativo óptico, de acordo com algumas modalidades.
[000193] A Figura 11-17 e a Figura 11-18 e a Figura 11-19 ilustram um método de fabricar uma lente Fresnel incorporada, de acordo com algumas modalidades.
[000194] Os recursos e vantagens de modalidades da presente aplicação se tornarão mais evidentes a partir da descrição detalhada estabelecida abaixo, quando tomada em combinação com os desenhos. DESCRIÇÃO DETALHADA
[000195] Os inventores reconheceram e notaram que aparelhos convencionais para realizar bioensaios são maiores, dispendiosos e exigem conjuntos de procedimentos de laboratório avançados para execução. Muitos tipos de bioensaios dependem da detecção de moléculas únicas em um espécime. De modo convencional, a detecção de molécula única pode exigir sistemas volumosos grandes usados para gerar luz de intensidade alta necessária para excitação de moléculas. Além disso, componentes ópticos volumosos podem ser usados para direcionar a luz laser ao espécime e componentes ópticos adicionais podem ser usados para direcionar a luz luminescente do espécime para um sensor. Esses componentes ópticos convencionais podem exigir alinhamento e estabilização precisos. O equipamento e o treino de laboratório convencional exigidos para usar esse equipamento convencional pode resultar em bioensaios dispendiosos complexos.
[000196] Os inventores reconheceram e notaram que há uma necessidade por um dispositivo que pode analisar de modo simples e não dispendioso os espécimes biológicos e/ou químicos para determinar a identidade de suas partes constituintes. Uma aplicação de tal dispositivo pode ser para sequenciar uma biomolécula, como uma molécula de ácido nucleico ou um polipeptídeo (por exemplo, proteína) que tem uma pluralidade de aminoácidos. Um aparelho compacto de velocidade alta para realizar detecção e quantificação de moléculas ou partículas únicas pode reduzir o custo de realizar medições quantitativas complexas de amostras biológicas e/ou químicas e avançar rapidamente a taxa de constatações tecnológicas bioquímicas. Além disso, um dispositivo custo-benefício que é prontamente transportável pode transformar não apenas a maneira em que os bioensaios são realizados no mundo desenvolvido, como também fornecer às pessoas nas regiões em desenvolvimento, pela primeira vez, acesso imediato a testes diagnósticos essenciais que pode melhorar drasticamente sua saúde e seu bem-estar. Por exemplo, em algumas modalidades, um aparelho para realizar bioensaios é usado para realizar testes diagnósticos de amostras biológicas, como sangue, urina e/ou saliva. O aparelho pode ser usado por indivíduos em sua residência, por um doutor em clínicas remotas de países em desenvolvimento ou qualquer outro local, como consultórios rurais. Tais testes diagnósticos podem incluir a detecção de biomoléculas em uma amostra biológica de um indivíduo, como uma molécula de ácido nucleico ou proteína. Em alguns exemplos, os testes diagnósticos incluem sequenciar uma molécula de ácido nucleico em uma amostra biológica de um indivíduo, como sequenciamento de moléculas de ácido desoxirribonucleico livres de célula ou produtos de expressão em uma amostra biológica do indivíduo.
[000197] Os inventores também reconheceram e notaram que, quando uma amostra é etiquetada com uma pluralidade de tipos diferentes de marcadores luminescentes, qualquer característica adequada de marcadores luminescentes pode ser usada para identificar o tipo de marcador que está presente em um pixel particular do dispositivo integrado. Por exemplo, as características da luminescência emitida pelos marcadores e/ou características da absorção de excitação podem ser usadas para identificar os marcadores. Em algumas modalidades, a energia de emissão da luminescência (que é diretamente relacionada ao comprimento de onda da luz) pode ser usada para distinguir um primeiro tipo de marcador de um segundo tipo de marcador. Adicional ou alternativamente, as medições de tempo de vida de luminescência também podem ser usadas para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular. Em algumas modalidades, as medições de tempo de vida de luminescência podem ser feitas com uma fonte de excitação pulsada com uso de um sensor com capacidade para distinguir um tempo quando um fóton é detectado com resolução suficiente para obter informações de tempo de vida. Adicional, ou alternativamente, a energia da luz de excitação absorvida pelos tipos diferentes de marcadores pode ser usada para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular. Por exemplo, um primeiro marcador pode absorver luz de um primeiro comprimento de onda, mas não absorver igualmente a luz de um segundo comprimento de onda, enquanto um segundo marcador pode absorver luz do segundo comprimento de onda, mas não absorver igualmente a luz do primeiro comprimento de onda. Nessa maneira, quando mais de uma fonte de excitação de luz, cada uma com uma energia de excitação diferente, puder ser usada para iluminar a amostra de maneira entrelaçada, a energia de absorção dos marcadores pode ser usada para identificar que tipo de marcador está presente em uma amostra. Os marcadores diferentes também podem ter intensidades luminescentes diferentes. Consequentemente, a intensidade detectada da luminescência também pode ser usada para identificar o tipo de marcador presente em um pixel particular.
[000198] Um exemplo não limitante de uma aplicação de um dispositivo contemplado pelos inventores é um dispositivo com capacidade de realizar sequenciamento de uma biomolécula, como um ácido nucleico ou um polipeptídeo (por exemplo, proteína) que tem uma pluralidade de aminoácidos. Os testes diagnósticos que podem ser realizados com uso de tal dispositivo incluem sequenciar uma molécula de ácido nucleico em uma amostra biológica de um indivíduo, como sequenciamento de moléculas de ácido desoxirribonucleico livres de célula ou produtos de expressão em uma amostra biológica do indivíduo.
[000199] A presente aplicação fornece dispositivos, sistemas e métodos para detectar biomoléculas ou subunidades dos mesmos, como moléculas de ácido nucleico. Tal detecção pode incluir sequenciamento. Uma biomolécula pode ser extraída a partir de uma amostra biológica obtida a partir de um indivíduo. A amostra biológica pode ser extraída a partir de um fluido corporal ou tecido do indivíduo, como hálito, saliva, urina ou sangue (por exemplo, sangue total ou plasma). O indivíduo pode ser suspeito de ter uma condição de saúde, como uma doença (por exemplo, câncer). Em alguns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são extraídas a partir do fluido corporal ou tecido do indivíduo. O um ou mais ácidos nucleicos pode ser extraído a partir de uma ou mais células obtidas a partir do indivíduo, como parte de um tecido do indivíduo, ou obtido a partir de um fluido corporal livre de célula do indivíduo, como sangue total.
[000200] O sequenciamento pode incluir a determinação de subunidades individuais de uma biomolécula modelo (por exemplo, molécula de ácido nucleico) sintetizando-se outra biomolécula que é complementar ou análoga ao modelo, como sintetizando-se uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma molécula de ácido nucleico modelo e identificando-se a incorporação de nucleotídeos com tempo (isto é, sequenciamento por síntese). Como alternativa, o sequenciamento pode incluir a identificação direta de subunidades individuais da biomolécula.
[000201] Durante o sequenciamento, os sinais indicativos de subunidades individuais de uma biomolécula podem ser coletados em uma memória e processados em tempo real ou em um ponto posterior no tempo para determinar uma sequência da biomolécula. Tal processamento pode incluir uma comparação entre os sinais e os sinais de referência que possibilitam a identificação das subunidades individuais que, em alguns casos, rende leituras. As leituras podem ser sequências de comprimento suficiente (por exemplo, pelo menos cerca de 30 pares de bases (bp)) que podem ser usadas para identificar uma sequência ou região maior, por exemplo, que pode ser alinhada a um local em uma região cromossômica ou genômica ou gene.
[000202] As subunidades individuais de biomoléculas podem ser identificadas com uso de marcadores. Em alguns exemplos, os marcadores luminescentes são usados para identificar subunidades individuais de biomoléculas. Algumas modalidades usam marcadores luminescentes (também chamados, no presente documento, de "marcadores"), que podem ser marcadores exógenos ou endógenos. Os marcadores exógenos podem ser marcadores luminescentes externos usados como um repórter e/ou etiqueta para identificação luminescente. Exemplos de marcadores exógenos podem incluir, mas sem limitação, moléculas fluorescentes, fluoróforos, corantes fluorescentes, manchas fluorescentes, corantes orgânicos, proteínas fluorescentes, espécies que participam na transferência ressonante de energia por fluorescência (FRET), enzimas, e/ou pontos quânticos. Outros marcadores exógenos são conhecidos na técnica. Tais marcadores exógenos podem ser conjugados para uma sonda ou grupo funcional (por exemplo, molécula, íon e/ou ligante) que se liga especificamente a um alvo ou componente particular. Anexar uma etiqueta ou repórter exógeno a uma sonda permite a identificação do alvo através de detecção da presença da etiqueta ou repórter exógeno. Exemplos de sondas podem incluir proteínas, moléculas de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA), lipídeos e sondas de anticorpo. A combinação de um marcador exógeno e um grupo funcional pode formar quaisquer sondas, etiquetas, e/ou identificações adequadas usadas para detecção, incluindo sondas moleculares, sondas identificadas, sondas de hibridização, sondas de anticorpo, sondas de proteína (por exemplo, sondas de ligação de biotina), identificações de enzima, sondas fluorescentes, etiquetas fluorescentes, e/ou repórteres de enzima.
[000203] Embora a presente invenção faça referência a marcadores luminescentes, outros tipos de marcadores podem ser usados com dispositivos, sistemas e métodos fornecidos no presente documento. Tais marcadores pode ser etiquetas de massa, etiquetas eletrostáticas, ou etiquetas eletroquímicas.
[000204] Embora marcadores exógenos possam ser adicionados a uma amostra, marcadores endógenos já podem ser parte da amostra. Os marcadores endógenos podem incluir qualquer marcador luminescente presente que pode luminescer ou "autofluorescer" na presença de energia de excitação. A autofluorescência de fluoróforos endógenos pode ser livre de identificações e ter identificação não invasiva sem exigir a introdução de fluoróforos exógenos. Exemplos de tais fluoróforos endógenos podem incluir hemoglobina, oxi- hemoglobina, lipídeos, reticulações de colágeno e elastina, dinucleotídeo de nicotinamida e adenina reduzida (NADH), flavinas oxidadas (FAD e FMN), lipofuscina, queratina, e/ou porfirinas, a título de exemplo, e não limitação.
[000205] Embora algumas modalidades possam ser direcionadas a teste de diagnóstico detectando-se moléculas únicas em um espécime, os inventores também reconheceram que as capacidades de detecção de molécula única da presente invenção podem ser usadas para realizar sequenciamento de polipeptídeo (por exemplo, proteína) ou sequenciamento de ácido nucleico (por exemplo, DNA, RNA) de um ou mais segmentos de ácido nucleico de, por exemplo, genes. As tecnologias de sequenciamento de ácido nucleico podem variar nos métodos usados para determinar a sequência de ácido nucleico, assim como na taxa, no comprimento de leitura, e na incidência de erros no processo de sequenciamento. Por exemplo, alguns métodos de sequenciamento de ácido nucleico têm base em sequenciamento por síntese, nos quais a identidade de um nucleotídeo é determinada à medida em que o nucleotídeo é incorporado em um filamento recém- sintetizado de ácido nucleico que é complementar ao ácido nucleico- alvo.
[000206] Reconhecendo-se a necessidade por aparelhos menos complexos e simples para realizar detecção de molécula única e/ou sequenciamento de ácido nucleico, os inventores conceberam técnicas para detectar moléculas únicas com uso de conjuntos de conjuntos de etiquetas luminescentes para rotular moléculas diferentes com o uso de conjuntos de etiquetas, como etiquetas ópticas (por exemplo, luminescentes), para identificar moléculas diferentes. Tais moléculas únicas podem ser nucleotídeos ou aminoácidos que têm etiquetas. As etiquetas podem ser detectadas enquanto ligadas a moléculas únicas, mediante a liberação a partir das moléculas únicas ou enquanto ligadas e mediante liberação das moléculas únicas. Em alguns exemplos, as etiquetas são etiquetas luminescentes. Cada etiqueta luminescente em um conjunto selecionado é associada a uma respectiva molécula. Por exemplo, um conjunto de quatro etiquetas pode ser usado para "identificar" as nucleobases presentes no DNA - em que cada etiqueta do conjunto é associada a uma nucleobase diferente, por exemplo, em que uma primeira etiqueta é associada à adenina (A), uma segunda etiqueta é associada à citosina (C), uma terceira etiqueta é associada à guanina (G) e uma quarta etiqueta é associada à timina (T). Além disso, cada uma dentre as etiquetas luminescentes no conjunto de etiquetas tem propriedades diferentes que podem ser usadas para distinguir uma primeira etiqueta do conjunto das outras etiquetas no conjunto. Dessa maneira, cada etiqueta é exclusivamente identificável com uso de uma ou mais dentre essas características distinguíveis. A título de exemplificação e não de limitação, as características das etiquetas que podem ser usadas para distinguir uma etiqueta da outra podem incluir a energia de emissão e/ou comprimento de onda da luz que é emitida pela etiqueta em resposta à energia de excitação e/ou ao comprimento de onda da luz de excitação que é absorvida por uma etiqueta particular para colocar a etiqueta em um estado excitado.
[000207] Os marcadores luminescentes variam no comprimento de onda de luz que os mesmos emitem, as características temporais da luz que os mesmos emitem (por exemplo, seus períodos de tempo de declínio de emissão) e suas respostas para energia de excitação. Consequentemente, marcadores luminescentes podem ser identificados ou discriminados a partir de outros marcadores luminescentes com base na detecção dessas propriedades. Tais técnicas de identificação ou discriminação podem ser usadas de modo independente ou em qualquer combinação adequada.
[000208] Em algumas modalidades, um fotodetector integrado, conforme descrito no presente pedido, pode medir ou discriminar os tempos de vida de luminância, como tempos de vida de fluorescência. As medições de tempo de vida têm base na excitação de um ou mais marcadores (por exemplo, moléculas fluorescentes), e na medição da variação de tempo na luminescência emitida. A probabilidade de um marcador emitir um fóton após o marcador alcançar um estado excitado diminui exponencialmente ao longo do tempo. A taxa na qual a probabilidade diminui pode ser distinta de um marcador e pode ser diferente para marcadores diferentes. Detectar as características temporais de luz emitida por marcadores pode permitir identificar marcadores e/ou discriminar marcadores um em relação ao outro.
[000209] Após alcançar um estado excitado, um marcador pode emitir um fóton com uma determinada probabilidade em um determinado momento. A probabilidade de um fóton ser emitido a partir de um marcador excitado pode diminuir ao longo do tempo após a excitação do marcador. A diminuição na probabilidade de um fóton ser emitido ao longo do tempo pode ser representada por uma função de decaimento exponencial p(t)=eA(-t/T), em que p(t) é a probabilidade de emissão de fóton em um tempo, t, e T é um parâmetro temporal do marcador. O parâmetro temporal T indica um tempo após a excitação quando a probabilidade do marcador que emite um fóton for um certo valor. O parâmetro temporal, t, é uma propriedade de um marcador que pode ser distinta de suas propriedades espectrais de absorção e emissão. Tal parâmetro temporal, T, é chamado de tempo de vida de luminância, de tempo de vida de fluorescência ou simplesmente de "tempo de vida" de um marcador.
[000210] A Figura 1-1 plota a probabilidade de um fóton ser emitido como uma função de tempo para dois marcadores com tempos de vida diferentes. O marcador representado pela curva de probabilidade B tem uma probabilidade de emissão que decai mais rapidamente que a probabilidade de emissão para o marcador representado pela curva de probabilidade A. O marcador representado pela curva de probabilidade B tem um parâmetro temporal, t, ou tempo de vida mais curto que o marcador representado pela curva de probabilidade A. Os marcadores podem ter tempos de vida na faixa de 0,1 a 20 ns, em algumas modalidades. Entretanto, os conjuntos de procedimentos descritos no presente documento não são limitados como os tempos de vida do marcador (ou marcadores) usado.
[000211] O tempo de vida de um marcador pode ser usado para distinguir entre mais de um marcador e/ou pode ser usado para identificar marcador (ou marcadores). Em algumas modalidades, as medições de tempo de vida podem ser realizadas, na qual uma pluralidade de marcadores que têm tempos de vida diferentes é excitada por uma fonte de excitação. Como exemplo, quatro marcadores que têm tempos de vida de 0,5, 1, 2, e 3 nanossegundos, respectivamente, podem ser excitados por uma fonte de luz que emite luz tendo um comprimento de onda selecionado (por exemplo, 635 nm, a título de exemplo). Os marcadores podem ser identificados ou diferenciados entre si com base na medição do tempo de vida da luz emitida pelos marcadores.
[000212] As medições de tempo de vida podem usar medições de intensidade relativas comparando-se como a intensidade muda ao longo do tempo, em oposição aos valores de intensidade absolutos. Como resultado, as medições de tempo de vida podem evitar algumas das dificuldades de medições de intensidade absolutas. As medições de intensidade absolutas podem depender da concentração de marcadores presentes e etapas de calibração podem ser necessárias para variar concentrações de marcador. Em contraste, as medições de tempo de vida podem ser insensíveis à concentração de marcadores.
[000213] As modalidades podem usar qualquer combinação adequada de características de etiqueta para distinguir uma primeira etiqueta em um conjunto de etiquetas das outras etiquetas no mesmo conjunto. Por exemplo, algumas modalidades podem usar apenas as informações de temporização da luz de emissão das etiquetas para identificar as etiquetas. Em tais modalidades, cada etiqueta em um conjunto selecionado de etiquetas tem um tempo de vida de emissão diferente das outras etiquetas no conjunto e as etiquetas luminescentes são todas excitadas por luz a partir de uma fonte de excitação única. A Figura 1-2A ilustra a temporização de emissão a partir de quatro etiquetas luminescentes de acordo com uma modalidade em que as quatro etiquetas exibem tempos de vida de emissão média diferentes (T). A probabilidade que uma etiqueta é medida para ter um tempo de vida de um valor particular é denominada, no presente documento, como a "temporização de emissão" da etiqueta. Uma primeira temporização de emissão 1-101 de uma primeira etiqueta luminescente tem uma probabilidade de pico de ter um tempo de vida em t1, uma segunda temporização de emissão 1-102 de uma segunda etiqueta luminescente tem uma probabilidade de pico de ter um tempo de vida de t2, uma terceira temporização de emissão 1-103 de uma terceira etiqueta luminescente tem uma probabilidade de pico de ter um tempo de vida de t3 e uma quarta temporização de emissão 1-104 de uma quarta etiqueta luminescente tem uma probabilidade de pico de ter um tempo de vida de T4. Nessa modalidade, os picos de probabilidade de tempo de vida das quatro etiquetas luminescentes podem ter quaisquer valores adequados que satisfaçam a relação d < T2 < T3 < T4. Os quatro gráficos de emissão de temporização podem ou não se sobrepor devido a variações leves no tempo de vida de uma etiqueta luminescente particular, conforme ilustrado na Figura 1-2A. Nessa modalidade, o comprimento de onda de excitação no qual cada um dentre as quatro etiquetas absorve luz maximamente da fonte de excitação é substancialmente igual, mas esse não precisa ser o caso. Com uso do conjunto de etiquetas acima, quatro moléculas diferentes podem ser identificadas com uma respectiva etiqueta do conjunto de marcadores, em que as etiquetas podem ser excitadas com uso de uma fonte de excitação única e as etiquetas podem ser distinguidas entre si detectando-se o tempo de vida de emissão das etiquetas com uso de um sistema óptico e sensores. Embora a Figura 1-2A ilustre quatro etiquetas diferentes, deve ser notado que qualquer número adequado de etiquetas pode ser usado.
[000214] Outras modalidades podem usar qualquer combinação adequada de características de etiqueta para determinar a identidade da etiqueta dentro de um conjunto de etiquetas. Exemplos das características de etiqueta que podem ser usados incluem, mas sem limitação, comprimento de onda de excitação, comprimento de onda de emissão, e tempo de vida de emissão. A combinação de características de etiqueta forma um espaço de fase e cada etiqueta pode ser representada como um ponto dentro desse espaço de fase. As etiquetas dentro de um conjunto de etiquetas devem ser selecionadas de modo que a "distância" entre cada etiqueta dentro do conjunto seja suficientemente grande, para que o mecanismo de detecção possa distinguir cada etiqueta das outras etiquetas no conjunto. Por exemplo, em algumas modalidades, um conjunto de etiquetas pode ser selecionado, em que um subconjunto das etiquetas tem o mesmo comprimento de onda de emissão, mas tem tempos de vida de emissão diferentes e/ou comprimentos de onda de excitação diferentes. Em outras modalidades, um conjunto de etiquetas pode ser selecionado, em que um subconjunto das etiquetas tem o mesmo tempo de vida de emissão, mas tem comprimentos de onda de emissão diferentes e/ou comprimentos de onda de excitação diferentes. Em outras modalidades, um conjunto de marcadores pode ser selecionado, em que um subconjunto das etiquetas tem o mesmo comprimento de onda de excitação, mas tem comprimentos de onda de emissão diferentes e/ou tempos de vida de emissão diferentes.
[000215] A título de exemplo e não limitação, a Figura 1-2B ilustra os espectros de emissão de quatro etiquetas luminescentes, de acordo com uma modalidade, em que duas dentre as etiquetas têm um primeiro comprimento de onda de emissão de pico e as outras duas etiquetas têm um segundo comprimento de onda de emissão de pico. Um primeiro espectro de emissão 1-105 a partir de uma primeira etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de emissão de pico em À1, um segundo espectro de emissão 1-106 a partir de uma segunda marcador etiqueta também tem um comprimento de onda de emissão de pico em À1, um terceiro espectro de emissão 1-107 a partir de uma terceira etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de emissão de pico em À2 e um quarto espectro de emissão 1-108 a partir de uma quarta etiqueta luminescente também tem um comprimento de onda de emissão de pico em À2. Nessa modalidade, os picos de emissão das quatro etiquetas luminescentes podem ter quaisquer valores adequados que satisfazem a relação À1 < À2. Nas modalidades como essa em que o comprimento de onda de emissão de pico é o mesmo para mais de uma etiqueta luminescente, uma característica separada das etiquetas que têm o mesmo comprimento de onda de emissão deve ser diferente. Por exemplo, as duas etiquetas que emitem em À1 podem ter tempos de vida de emissão diferentes. A Figura 1-3A ilustra essa situação esquematicamente em um espaço de fase distribuído pelo comprimento de onda de emissão e pelo tempo de vida de emissão. Uma primeira etiqueta tem um comprimento de onda de emissão À1 e um tempo de vida de emissão T1 , uma segunda etiqueta tem um comprimento de onda de emissão À1 e um tempo de vida de emissão T4, uma terceira etiqueta tem um comprimento de onda de emissão À2 e um tempo de vida de emissão d e uma quarta etiqueta tem um comprimento de onda de emissão À2 e um tempo de vida de emissão T4. Dessa maneira, todas as quatro etiquetas no conjunto de etiquetas mostrado na Figura 1-3A são distinguíveis entre si. O uso de tal conjunto de etiquetas permite distinguir entre quatro etiquetas mesmo quando os comprimentos de onda de absorção para as quatro etiquetas são idênticos. Isso é possível com uso de um sensor que pode detectar o tempo de emissão da fotoluminescência, assim como o comprimento de onda de emissão.
[000216] A título de exemplo e não limitação, a Figura 1-2C ilustra os espectros de absorção de quatro etiquetas luminescentes, de acordo com outra modalidade. Nessa modalidade, duas dentre as etiquetas têm um primeiro comprimento de onda de absorção de pico e as outras duas etiquetas têm um segundo comprimento de onda de absorção de pico. Um primeiro espectro de absorção 1-109 para a primeira etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de absorção de pico em À3, um segundo espectro de absorção 1-110 para a segunda etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de absorção de pico em À4, um terceiro espectro de absorção 1-111 para a terceira etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de absorção de pico em À3 e um quarto espectro de absorção 1-112 para a quarta etiqueta luminescente tem um comprimento de onda de absorção de pico em À4. Deve ser verificado que as etiquetas que compartilham um comprimento de onda de absorção de pico na Figura 1-2C são distinguíveis através de outra etiqueta distinta, como tempo de vida de emissão. A Figura 13B ilustra essa situação esquematicamente em um espaço de fase distribuído pelo comprimento de onda de absorção e pelo tempo de vida de emissão. Uma primeira etiqueta tem um comprimento de onda de absorção À3 e um tempo de vida de emissão d, uma segunda etiqueta tem um comprimento de onda de absorção À3 e um tempo de vida de emissão T4, uma terceira etiqueta tem um comprimento de onda de absorção À4 e um tempo de vida de emissão d e uma quarta etiqueta tem um comprimento de onda de absorção À4 e um tempo de vida de emissão T4. Dessa maneira, todas as quatro etiquetas no conjunto de etiquetas mostrado na Figura 1-3A são distinguíveis entre si.
[000217] O uso de tal conjunto de etiquetas permite distinguir entre quatro etiquetas mesmo quando os comprimentos de onda de emissão para os quatro corantes são idênticos. Isso é possível com uso de duas fontes de excitação que emitem em comprimentos de onda diferentes ou uma fonte de excitação única com capacidade para emitir em múltiplos comprimentos de onda em conexão com um sensor que pode detectar o tempo de emissão da fotoluminescência. Se o comprimento de onda da luz de excitação for conhecido para cada evento de emissão detectada, então, pode ser determinado qual etiqueta esteve presente. A fonte (ou fontes) de excitação pode alternar entre um primeiro comprimento de onda de excitação e um segundo comprimento de onda de excitação, que é chamado de entrelaçado. Alternativamente, dois ou mais pulsos do primeiro comprimento de onda de excitação podem ser usados após dois ou mais pulsos do segundo comprimento de onda de excitação.
[000218] O número de fontes de excitação ou comprimentos de onda de excitação usados para distinguir as etiquetas não é limitado a dois e, em algumas modalidades, mais de dois comprimentos de onda de excitação ou energias podem ser usados para distinguir as etiquetas. Em tais modalidades, as etiquetas podem ser distinguidas pela intensidade ou número de fótons emitidos em resposta a múltiplos comprimentos de onda de excitação. Uma etiqueta pode ser distinguível dentre múltiplas etiquetas detectando-se o número de fótons emitidos em resposta à exposição da etiqueta a um certo comprimento de onda de excitação. Em algumas modalidades, uma etiqueta pode ser distinguível identificando-se a energia de excitação dentre múltiplas energias de excitação, em que a etiqueta emitiu o número mais alto de fótons. Em outras modalidades, a quantidade de fótons emitidos a partir de uma etiqueta em resposta às energias de excitação diferentes pode ser usada para identificar a etiqueta. Uma primeira etiqueta que tem uma probabilidade mais alta de emitir fótons em resposta a uma primeira energia de excitação que uma segunda energia de excitação pode ser distinguida de uma segunda etiqueta que tem uma probabilidade mais alta de emitir fótons em resposta à segunda energia de excitação que a primeira energia de excitação. Dessa maneira, as etiquetas que têm probabilidades distinguíveis de emitir certas quantidades de fótons em resposta às energias de excitação diferentes podem ser identificadas medindo-se os fótons emitidos enquanto expõe uma etiqueta desconhecida às energias de excitação diferentes. Em tais modalidades, uma etiqueta pode ser exposta a múltiplas energias de excitação e a identificação da etiqueta pode ser alcançada determinando-se se a etiqueta emitiu qualquer luz e/ou um número particular de fótons emitidos. Qualquer número adequado de energia de fontes de excitação pode ser usado. Em algumas modalidades, quatro energias de excitação diferentes podem ser usadas para distinguir dentre etiquetas diferentes (por exemplo, quatro etiquetas diferentes). Em algumas modalidades, três energias de excitação diferentes podem ser usadas para distinguir dentre etiquetas diferentes. Outras características de uma etiqueta podem ser usadas para distinguir a presença de uma etiqueta em combinação com a quantidade de fótons emitida em resposta a energias de excitação diferentes, incluindo tempo de vida de emissão e espectros de emissão.
[000219] Em outras modalidades, mais de duas características das etiquetas em um conjunto de etiquetas podem ser usadas para distinguir qual etiqueta está presente. A Figura 1-4 ilustra um espaço de fase ilustrativo distribuído pelo comprimento de onda de absorção, pelo comprimento de onda de emissão e pelo tempo de vida de emissão das etiquetas. Na Figura 1-4, oito etiquetas diferentes são distribuídas no espaço de fase. Quatro dentre as oito etiquetas têm o mesmo comprimento de onda de emissão, quatro etiquetas diferentes têm o mesmo comprimento de onda de absorção e quatro etiquetas diferentes têm o mesmo tempo de vida de emissão. No entanto, cada uma dentre as etiquetas é distinguível a partir de todas as outras etiquetas quando todas as três características das etiquetas são consideradas. As modalidades não são limitadas a qualquer número de etiquetas. Esse conceito pode ser estendido para incluir qualquer número de etiquetas que pode ser distinguido de outro com uso pelo menos dessas três características de etiqueta.
[000220] Embora não ilustrado nas Figuras, outras modalidades podem determinar a identidade de uma etiqueta luminescente com base na frequência de absorção independentemente. Tais modalidades são possíveis se a luz de excitação puder ser sintonizada para comprimentos de onda específicos que correspondem ao espectro de absorção das etiquetas em um conjunto de etiquetas. Em tais modalidades, o sistema e o sensor ópticos usados para direcionar e detectar a luz emitida a partir de cada etiqueta não precisam ter capacidade para detectar o comprimento de onda da luz emitida. Isso pode ser vantajoso em algumas modalidades devido ao fato de que reduz a complexidade do sistema e dos sensores ópticos devido ao fato de que a detecção de comprimento de onda de emissão não é exigida em tais modalidades.
[000221] Conforme discutido acima, os inventores reconheceram e notaram a necessidade de poder distinguir etiquetas luminescentes diferentes entre si com uso de várias características das etiquetas. O tipo de características usadas para determinar a identidade de uma etiqueta tem impacto sobre o dispositivo físico usado para realizar essa análise. A presente aplicação revela diversas modalidades de um aparelho, dispositivo, instrumento e métodos para realizar esses experimentos diferentes.
[000222] Brevemente, os inventores reconheceram e verificaram que um dispositivo de sensor com pixels com um número relativamente grande de pixels (por exemplo, centenas, milhares, milhões ou mais) que permite a detecção de uma pluralidade de moléculas individuais ou partículas em paralelo. Tais moléculas únicas podem ser nucleotídeos ou aminoácidos que têm etiquetas. As etiquetas podem ser detectadas enquanto ligadas a moléculas únicas, mediante a liberação a partir das moléculas únicas ou enquanto ligadas e mediante liberação das moléculas únicas. Em alguns exemplos, as etiquetas são etiquetas luminescentes. As moléculas podem ser, a título de exemplo e não limitação, proteínas e/ou ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA). Além disso, um dispositivo de velocidade alta que pode adquirir dados em mais de cem quadros por segundo permite a detecção e a análise de processos ou mudanças dinâmicas que ocorrem ao longo do tempo dentro da amostra em análise.
[000223] Os inventores reconheceram e verificaram que um chip de teste descartável de uso único, baixo custo pode ser usado em conexão com um instrumento que inclui uma fonte de luz de excitação, ópticos e um sensor de luz para medir um sinal óptico (por exemplo, luz luminescente) emitido a partir de amostras biológicas. O uso de um chip de teste de custo baixo reduz o custo de realizar um dado bioensaio. Uma amostra biológica é colocada no chip de teste e, mediante conclusão de um bioensaio, pode ser descartada. Em algumas modalidades, mais de um tipo de amostra pode ser analisado de modo simultâneo, em paralelo, colocando-se múltiplas amostras em porções diferentes do chip de teste ao mesmo tempo. O chip de teste faz interface com o instrumento de múltiplos usos mais dispendioso, que pode ser usado repetidamente com muitos chips de teste descartáveis diferentes. Um chip de teste de custo baixo que faz interface com um instrumento portátil compacto pode ser usado em qualquer local no mundo, sem a restrição de laboratórios biológicos de custo alto que exigem conhecimento específico de laboratório para analisar amostras. Desse modo, a bioanalítica automatizada pode ser trazida para regiões do mundo que não podiam realizar anteriormente a análise quantitativa de amostras biológicas. Por exemplo, os testes sanguíneos para crianças podem ser realizados colocando-se uma amostra sanguínea em um chip de teste descartável, colocando-se o chip de teste descartável no instrumento portátil pequeno para análise e processando os resultados por um computador que se conecta ao instrumento para revisão imediata por um usuário. Os dados também podem ser transmitidos por uma rede de dados para um local remoto para serem analisados, e/ou arquivados para análises clínicas subsequentes. Alternativamente, o instrumento pode incluir um ou mais processadores para analisar os dados obtidos a partir dos sensores do instrumento.
[000224] Várias modalidades são descritas em mais detalhes abaixo.
I. VISÃO GERAL DO APARELHO DE ACORDO COM ALGUMAS MODALIDADES
[000225] Uma vista geral esquemática do aparelho 2-100 é ilustrada nas Figuras 2-1. O sistema compreende tanto um chip de teste 2-110 quanto um instrumento 2-120 que compreende uma fonte de excitação 2-121 e pelo menos um sensor 2-122. O chip de teste 2-110 faz interface com o instrumento 2-120 com o uso de qualquer interface de chip de teste adequada. Por exemplo, o chip de teste interface do instrumento 2-120 pode incluir um soquete (não ilustrado) para receber o chip de teste 2-110 e prender o mesmo em alinhamento óptico preciso com a fonte de excitação 2-110 e o pelo menos um sensor 2-122. A fonte de excitação externa 2-121 no instrumento 2-120 é configurada para fornecer energia de excitação para o chip de teste 2-110 com o propósito de excitar uma amostra na cavidade de amostra 2-111 do chip de teste 2-110. Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 tem múltiplos pixels, uma cavidade de amostra 2-111 de cada pixel configurada para receber uma amostra usada em uma análise independente dos outros pixels. Cada pixel do chip de teste 2-110 compreende uma cavidade de amostra 2-211 para receber, reter e analisar uma amostra do espécime que é analisada. Tais pixels podem ser denominados "pixels de fonte passiva" visto que os pixels recebem energia de excitação de uma fonte de excitação separada do pixel. Em algumas modalidades, há um pixel no instrumento 2-120 que corresponde a cada pixel presente no chip de teste 2-110. Cada pixel do instrumento 2-120 compreende pelo menos um sensor para detectar energia de emissão emitida pela amostra em resposta à amostra que é iluminada com energia de excitação da fonte de excitação 2-121. Em algumas modalidades, cada sensor pode incluir múltiplos subsensores, em que cada subsensor é configurado para detectar um comprimento de onda diferente de energia de emissão a partir da amostra. Enquanto mais de um subsensor pode detectar energia de emissão de um determinado comprimento de onda, cada subsensor pode detectar uma banda de comprimento de onda diferente de energia de emissão.
[000226] Em algumas modalidades, elementos ópticos para guiar e acoplar energia de excitação da fonte de excitação 2-121 para a cavidade de amostra 2-111 estão localizados tanto no chip de teste 2110 quanto no instrumento 2-120, conforme representado pela seta 2101 na Figura 2-1. Tais elementos de fonte para cavidade podem incluir espelhos, lentes, revestimentos dielétricos e combinantes de feixe localizados no instrumento 2-120 para acoplar energia de excitação ao chip de teste 2-110 e lentes, elementos plasmáticos e revestimentos dielétricos no chip de teste 1-110 para direcionar a energia de excitação recebida do instrumento 2-120 para a cavidade de amostra 2-111. Adicionalmente, em algumas modalidades, elementos ópticos para guiar energia de emissão da cavidade de amostra 2-111 para o sensor 2-122 estão localizados no chip de teste 2-110 e no instrumento 2-120, conforme representado pela seta 2-102 na Figura 2-1. Tais elementos de cavidade para amostra podem incluir lentes, elementos plasmáticos e revestimentos dielétricos localizados no chip de teste 2-110 para direcionar energia de emissão do chip de teste 2-110 para o instrumento 2-120 e lentes, espelhos, revestimentos dielétricos, filtros e elementos ópticos difrativos no instrumento 1-120 para direcionar a energia de emissão recebida do chip de teste 2-110 para o sensor 2-111. Em algumas modalidades, um componente único pode ter um papel tanto no acoplamento de energia de excitação a uma cavidade de amostra quanto na entrega de energia de emissão da cavidade de amostra para o sensor.
[000227] Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 compreende uma pluralidade de pixels, em que cada pixel é associado à sua própria cavidade de amostra individual 2-111 e seu próprio sensor associado 2122 ao instrumento 2-120. A pluralidade de pixels pode ser disposta em uma matriz e pode ter qualquer número adequado de pixels. Por exemplo, o chip de teste pode incluir aproximadamente 1.000 pixels, 10.000 pixels, aproximadamente 100.000 pixels, aproximadamente 1.000.000 pixels, aproximadamente 10.000.000 pixels ou aproximadamente 100.000.000 pixels.
[000228] Em algumas modalidades, o instrumento 2-120 inclui um chip de sensor que compreende uma pluralidade de sensores 2-122 dispostos como uma pluralidade de pixels. Cada pixel do chip de sensor corresponde a um pixel no chip de teste 2-110. A pluralidade de pixels pode ser disposta em uma matriz e pode ter qualquer número adequado de pixels. Em algumas modalidades, o chip de sensor tem o mesmo número de pixels como o chip de teste 2-110. Por exemplo, o chip de sensor pode incluir aproximadamente 10.000 pixels, aproximadamente 100.000 pixels, aproximadamente 1.000.000 pixels, aproximadamente 10.000,000 pixels ou aproximadamente 100.000.000 pixels.
[000229] O instrumento 2-120 faz interface com o chip de teste 2-110 através de um chip de teste interface (não mostrado). O chip de teste interface pode incluir componentes para posicionar e/ou alinhar o chip de teste 2-110 ao instrumento 2-120 para melhorar o acoplamento da energia de excitação da fonte de excitação 2-121 para o chip de teste 2-110. Em algumas modalidades, a fonte de excitação 2-121 inclui múltiplas fontes de excitação que são combinadas para entregar a energia de excitação para o chip de teste 2-110. As múltiplas fontes de excitação podem ser configuradas para produzir múltiplas energias de excitação que correspondem à luz de comprimentos de onda diferentes.
[000230] O instrumento 2-120 inclui uma interface de usuário 2-125 para controlar a operação do instrumento. A interface de usuário 2-125 é configurada para permitir que um usuário insira as informações no instrumento, como comandos e/ou definições usadas para controlar o funcionamento do instrumento. Em algumas modalidades, a interface de usuário 2-125 pode incluir botões, comutadores, discos seletores, e um microfone para comandos de voz. Adicionalmente, a interface de usuário 2-125 pode permitir que um usuário receba retorno sobre o desempenho do instrumento e/ou chip de teste, como alinhamento apropriado e/ou informações obtidas por sinais de leitura dos sensores no chip de sensor. Em algumas modalidades, a interface de usuário 2125 pode fornecer retroalimentação com uso de um alto-falante para fornecer retorno audível, e luzes de indicador e/ou uma tela de exibição para fornecer retroalimentação visual. Em algumas modalidades, o instrumento 2-120 inclui uma interface de computador 2-124 usada para se conectar a um dispositivo de computação 2-130. Qualquer interface de computador adequada 2-124 e dispositivo de computação 2-130 pode ser usado. Por exemplo, a interface de computador 2-124 pode ser uma interface USB ou uma interface firewire. O dispositivo de computação 2-130 pode ser qualquer computador de propósito geral, como um computador do tipo laptop, um computador do tipo desktop ou um computador do tipo tablet, ou um dispositivo móvel como um telefone celular. A interface de computador 2-124 facilita a comunicação de informações entre o instrumento 2-120 e o dispositivo de computação 2-130. As informações de entrada para controlar e/ou configurar o instrumento 2-120 podem ser fornecidas através do dispositivo de computação 2-130 conectado à interface de computador 2-124 do instrumento. Adicionalmente, as informações de saída podem ser recebidas pelo dispositivo de computação 2-130 através da interface de computador 2-124. Tais informações de saída podem incluir retorno sobre o desempenho do instrumento 2-120 e informações dos sinais de leitura do sensor 2-122. O instrumento 2-120 também pode incluir um dispositivo de processamento 2-123 para analisar dados recebidos do sensor 2-122. Em algumas modalidades, o dispositivo de processamento 2-123 pode ser um processador de propósito geral (por exemplo, uma unidade de processamento central (CPU), uma matriz de portas programável em campo (FPGA) ou um circuito integrado personalizado, como um circuito integrado específico de aplicação (ASIC). Em algumas modalidades, o processamento de dados do sensor 1-122 pode ser realizado tanto pelo dispositivo de processamento 2-123 quanto pelo dispositivo de computação externo 2130. Em outras modalidades, o dispositivo de computação 2-130 pode ser omitido e o processamento de dados a partir do sensor 2-122 pode ser realizado somente pelo dispositivo de processamento 2-123.
[000231] Quando a fonte de excitação 2-121 ilumina o chip de teste 2110 com energia de excitação, amostras dentro de um ou mais pixels do chip de teste 2-110 podem ser excitadas. Em algumas modalidades, um espécime é rotulado com múltiplos marcadores e os múltiplos marcadores, cada um associado a uma amostra diferente dentro do espécime, são identificáveis pela energia de emissão. A trajetória da cavidade de amostra 2-111 para o sensor 2-122 pode incluir um ou mais componentes que auxiliam na identificação dos múltiplos marcadores com base na energia de emissão. Os componentes podem focar a energia de emissão em direção ao sensor 2-122 e podem separar adicional ou alternativamente as energias de emissão que têm energias características diferentes e, portanto, comprimentos de onda diferentes. Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 pode incluir componentes que direcionam energia de emissão para o sensor 2-122 e o instrumento 2-120 pode incluir componentes para separar de modo espacial energia de emissão de comprimentos de onda diferentes. Por exemplo, filtros ópticos ou elementos ópticos difrativos podem ser usados para acoplar o comprimento de onda da energia de emissão a um grau espacial de liberdade. O sensor ou região de sensor pode conter múltiplos subsensores configurados para detectar uma distribuição espacial da energia de emissão que depende do padrão de radiação. As etiquetas luminescentes que emitem energias de emissão diferentes e/ou faixas espectrais podem formar padrões de radiação diferentes. O sensor ou a região de sensor pode detectar informações sobre a distribuição espacial da energia de emissão que pode ser usada para identificar um marcador dentre os múltiplos marcadores.
[000232] A energia de emissão da amostra na cavidade de amostra 2110 pode ser detectada pelo sensor 2-122 e convertida para pelo menos um sinal elétrico. Os sinais elétricos podem ser transmitidos ao longo de linhas condutoras no conjunto de circuitos do instrumento 2-120 e processados e/ou analisados pelo dispositivo de processamento 2-123 e/ou dispositivo de computação 2-130.
[000233] A Figura 2-2 é uma vista superior do chip de teste 2-110 e a vista superior do chip de sensor 2-260 e ilustra a correspondência entre os pixels dos dois chips. O chip de teste 2-110 compreende uma pluralidade de pixels, em que cada pixel inclui uma cavidade de amostra 2-111 formada na camada 2-221. A camada 2-221 pode compreender um material condutor que inclui um metal, um semicondutor dopado altamente degenerativo e grafeno. Em algumas modalidades, a camada 2-221 pode compreender uma pluralidade de camadas formadas a partir de um ou mais tipos diferentes de materiais (por exemplo, metal, semicondutor, dielétrico, isolante). O chip de sensor 2-260 também compreende uma pluralidade de pixels, em que cada pixel inclui um sensor 2-121 formado em ou em um substrato 2-247. As setas na Figura 2-2 ilustram a correspondência entre dois dos pixels do chip de teste 2110 e dois dos pixels do chip de sensor 2-260. Embora não ilustrado por uma questão de clareza, cada pixel do chip de teste 2-110 é associado a um pixel do chip de sensor 2-260.
[000234] Os pixels do chip de teste 2-110 e o chip de sensor 2-260 podem ter qualquer tamanho, formato e disposição adequados. Em algumas modalidades, os pixels do chip de teste 2-100 e o chip de sensor 2-260 podem ser dispostos em uma configuração retangular ou quadrada, conforme mostrado na Figura 2-2.
[000235] Uma visão geral de alguns componentes associados a um único pixel do chip de teste 2-110 e um único pixel do chip de sensor 2260 é ilustrada na Figura 2-3. O aparelho 2-100 compreende tanto o chip de teste 2-110 quanto o instrumento 2-120. Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 é um chip descartável projetado para a análise de um único espécime. O chip de teste 2-110 inclui uma ou mais camadas de metal 2-221, uma ou mais camadas dielétricas 2-225 e elementos de focalização 2-227. Em algumas modalidades, a camada de metal 2-221 inclui uma pilha de camadas, algumas das quais podem incluir camadas de absorção. O instrumento 2-120 inclui uma ou mais fontes de excitação 2-250, pelo menos espelho policrômico 2-230 e o chip de sensor 2-260, que pode incluir elementos de filtragem 2-241, elementos de classificação espectral 2-243, elementos de focalização 2-245 e pelo menos um sensor 2-122 em ou no substrato 2-247. Embora a Figura 2-3 ilustre apenas um único pixel do chip de teste 2-110 e apenas um único pixel do chip de sensor 2-260, alguns componentes do instrumento 2-120, como a fonte de excitação 2-250, o espelho policrômico 2-230 e elementos de filtragem 2-241, podem ser comuns para uma pluralidade dos pixels. Por exemplo, em algumas modalidades, uma única fonte de excitação 2-250 e espelho policrômico 2-230 pode direcionar a energia de excitação para cada pixel do chip de teste 2-110.
[000236] A cavidade de amostra 2-211 dentro da camada de metal 2221 forma um volume de amostra para uma amostra do espécime entrar. Em algumas modalidades, o espécime pode incluir fluido corporal, como sangue, urina ou saliva. As aberturas na extremidade da cavidade de amostra 2-211 podem ser denominadas uma nanoabertura. A nanoabertura pode ter uma largura que é menor que o comprimento de onda da energia de excitação 2-251 emitida pela de excitação 2-250. Uma porção do espécime, denominada uma amostra, pode entrar no volume de amostra definida pela cavidade de amostra 2-211. A amostra pode ser qualquer partícula, molécula, proteína, material genético ou qualquer outra amostra presente no espécime.
[000237] A fonte de excitação 2-250 emite energia de excitação 2-251, que é direcionada para a cavidade de amostra 2-211 para iluminar a amostra. Em algumas modalidades, a fonte de excitação 2-251 pode ser uma única fonte de luz que fornece energia de excitação para todos os pixels de chip de teste 2-110. O espelho policrômico 2-230 reflete a luz da fonte de excitação 2-250 e direciona a energia de excitação 2-251 em direção a uma ou mais cavidades de amostra 2-211 do chip de teste 2-110. Desse modo, em algumas modalidades, pode haver apenas um único espelho policrômico 2-230 que direciona a energia de excitação para todas as cavidades de amostra, em vez de cada pixel ser associado a seu próprio espelho policrômico. De modo similar, pode haver uma relação de um para muitos entre outros elementos ópticos usados para direcionar a energia de excitação para as cavidades de amostra 2-211.
[000238] Uma grade circular concêntrica 2-223 pode ser formada adjacente à nanoabertura de fundo da cavidade de amostra 2-211. As grades circulares concêntricas 2-223 podem se projetar a partir de uma superfície de fundo da camada de metal 2-221. A cavidade de amostra 2-211 pode estar localizada em ou próxima ao centro da grade circular 2-223. Tanto a escala de subcomprimento de onda da nanoabertura da cavidade de amostra 2-211 quanto as grades circulares concêntricas 2223 criam um efeito de aprimoramento de campo que aumenta a intensidade da energia de excitação na cavidade de amostra 2-211, resultando em acoplamento aumentado da energia de excitação para uma amostra presente na cavidade de amostra 2-211. Pelo menos em algum momento, a amostra absorve um fóton da energia de excitação e emite um fóton (denominada "energia de emissão" 2-253) com uma energia menor que aquela da energia de excitação 2-251. A energia de emissão 2-253 pode ser emitida em uma direção para baixo. A grade circular 2-223 atua como elementos plasmáticos que pode ser usada para reduzir a dissipação da energia de emissão 2-253 e direcionar a energia de emissão 2-253 para um sensor associado.
[000239] A energia de emissão 2-253 se desloca através da camada dielétrica 2-225, que pode ser uma camada espaçadora usada para permitir que a energia de emissão 2-253 se propague em alguma distância. A camada dielétrica 2-225 também pode fornecer resistência estrutural para o chip de teste 2-110. A energia de emissão 2-253, então, se desloca através de um ou mais elementos de focalização 2227 usados para direcionar adicionalmente a energia de emissão 2-253 para o sensor 2-122 no pixel associado do chip de sensor 2-2260 dentro do instrumento 2-120.
[000240] O espelho policrômico 2-230 pode transmitir a energia de emissão 2-253 e/ou refletir uma porção de qualquer energia de excitação 2-251 refletida do chip de teste 2-110. A porção da luz de excitação que não é refletida pelo chip de teste 2-110 é ou transmitida através do chip de teste ou absorvida pelo chip de teste. Para reduzir adicionalmente a quantidade de energia de excitação 2-251 refletida pelo chip de teste 2-110 e não refletida pelo espelho policrômico 2-230, os elementos de filtragem 2-241 podem estar dispostos na trajetória óptica em direção ao chip de sensor 2-260. Os componentes de filtragem 2-241 podem atuar para reduzir energia de excitação 2-251 detectada pelo sensor 2-122. Os elementos de filtragem 2-241 podem incluir, a título de exemplificação e não de limitação, um filtro de banda larga, um filtro de nó ou um filtro de borda, que transmite energia de emissão 2-253, mas absorve e/ou reflete energia de excitação 2-251.
[000241] Em algumas modalidades, para facilitar o uso de propriedades espectrais da energia de emissão 2-253 para determinar a identidade do marcador na cavidade de amostra 2-211, elementos de classificação espectral 2-243 podem ser incluídos no chip de sensor 2260 para acoplar o grau espectral de liberdade da energia de emissão 2-253 para a direção da energia de emissão 2-253 está se deslocando. Por exemplo, um elemento óptico difrativo pode ser usado para direcionar energia de emissão 2-253 de um primeiro comprimento de onda em uma primeira direção e energia de emissão 2-253 de um segundo comprimento de onda em uma segunda direção. Um ou mais elementos de focalização 2-245 podem ser usados para direcionar a luz classificada de modo espectral no sensor 2-122. O sensor 2-122 pode incluir um ou mais subsensores (não mostrados), em que cada um dos quais é associado a um comprimento de onda diferente da energia de emissão 2-253 com base no redirecionamento de luz de comprimentos de onda diferentes pelo elemento de classificação espectral 2-243. Dessa maneira, o um ou mais elementos de focalização 2-245 podem formar padrões de distribuição diferentes para energia de emissão que tem comprimentos de onda característicos diferentes, que pode permitir identificação de marcadores com base em comprimento de onda característico de energia de emissão.
[000242] Em modalidades nas quais o tempo de vida da energia de emissão 2-253 é usado para determinar a identidade do marcador na cavidade de amostra 2-211, o sensor 2-122 pode ter capacidade para detectar quando um fóton de energia de emissão é absorvido pelo sensor 2-122. O sensor 2-122 pode, por exemplo, ser um dispositivo de CMOS com capacidade para classificar fótons detectados em uma pluralidade de distâncias de tempo. O tempo de vida pode ser determinado detectando-se uma pluralidade de energia de emissão fótons que resultam de uma pluralidade de pulsos de excitação.
[000243] A descrição acima da Figura 2-3 é uma vista geral, mas não necessariamente completa, de alguns dentre os componentes do aparelho, de acordo com algumas modalidades. Em algumas modalidades, um ou mais elementos da Figura 2-3 podem estar ausentes ou em um local diferente. Os componentes do chip de teste 2210 e do instrumento 2-220 são descritos em maiores detalhes abaixo.
[000244] O chip de teste 2-110 e o instrumento 2-120 podem ser alinhados de modo mecânico, acoplados de modo removível e separáveis um do outro. O instrumento 2-120 pode incluir um alojamento de instrumento, dentro do qual uma placa de montagem está disposta. A Figura 2-4 ilustra pelo menos alguns dos componentes que podem ser incluídos na placa de montagem 2-405 do instrumento 2-120. A placa de montagem 2-405, que pode incluir uma placa de circuito impressa, pode ter o chip de sensor 2-260 (não visível na Figura 2-4), um dissipador de calor 2-407 e um alojamento óptico 2-401 montado na mesma. Os diversos componentes ópticos do instrumento 2-120 podem estar dispostos dentro do alojamento óptico 2-401. Em algumas modalidades, o alojamento de instrumento e a placa de montagem podem ter qualquer tamanho ou formato adequado. Por exemplo, a placa de montagem pode ser substancialmente circular com um diâmetro de aproximadamente 17,7 a 20,3 centímetros (7 a 8"). O chip de teste 2-110 se acopla ao alojamento óptico 2-401 para garantir alinhamento com os componentes ópticos dentro do alojamento óptico 2-401.
[000245] Um quadro retentor de chip 3-102 pode ser alinhado com uma abertura do alojamento óptico 2-401. O chip de teste 2-110 pode ser alojado em quadro retentor de chip 2-401. Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 pode estar situado na face inferior de quadro retentor de chip 3-102 de modo que tal posicionamento do quadro retentor de chip 3-102 relativo ao instrumento 2-120 localize o chip de teste 2-110 em um lado de quadro retentor de chip 3-102 próximo ao instrumento 2-120. O quadro retentor de chip 3-102 pode compreender qualquer material adequado. Em algumas modalidades, o quadro retentor de chip 3-102 pode incluir um metal ferromagnético (por exemplo, aço) de modo que o quadro retentor de chip 3-102 possa se alinhar a uma abertura de alojamento óptico 2-401 por um ou mais componentes magnéticos posicionados em uma superfície do alojamento óptico 2-401 que atua para prender o quadro retentor de chip 3-102 no lugar.
[000246] Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 pode ser acoplado de modo removível ao instrumento 2-120. Um ou mais componentes magnéticos 2-403a, 2-403b e 2-403c de qualquer formato e tamanho adequados, como cilindros magnéticos, conforme mostrado na Figura 2-4, podem ser colocados ao redor de uma abertura do alojamento óptico 3-401 através da qual a energia de excitação sai do alojamento óptico 2-401. Adicionalmente, os componentes magnéticos 2-403a, 2-403b e 2-2-403c podem ser calibrados de modo que o quadro retentor de chip 3-102 seja preso em alinhamento com a abertura. O quadro retentor de chip 3-102 pode ser posicionado com uma precisão de nível de mícron com o uso dos componentes magnéticos 2-403a 2403b, e 2-2-403c. Em algumas modalidades, os componentes magnéticos 2-403a, 2-403b e 2-2-403c são usados para criar o alinhamento de quadro retentor de chip. No entanto, as modalidades não são limitadas e qualquer número adequado de componentes magnéticos, carregados por mola, pneumáticos ou outros tais componentes podem ser usados para prender o chip no lugar em uma configuração alinhada. Por exemplo, o quadro retentor de chip 3-102 pode ser preso no lugar com um elemento não magnético, como uma mola, pressão de ar ou sucção de um vácuo. Opcionalmente, o quadro retentor de chip 3-102 pode ser construído com o uso de qualquer material rígido adequado para posicionar o chip em alinhamento com o bloco óptico.
[000247] De acordo com alguns aspectos do presente pedido, quando o chip de teste 2-110 é conectado ao instrumento 2-120, a distância entre as cavidades de amostra do chip de teste 2-110 e os sensores do chip de sensor 2-260 no instrumento 2-120 pode estar dentro de uma distância desejada para alcançar um nível suficiente de desempenho para o sistema. Em algumas modalidades, a distância óptica entre as cavidades de amostra e os sensores pode ser menor que 30 cm, menor que 10 cm, menor que 5 cm ou menor que 1 cm.
II. CHIP DE TESTE
[000248] Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 não inclui quaisquer componentes eletrônicos ativos. Tanto a fonte de excitação 2-250 quanto o sensor 2-122 para cada pixel estão localizados fora do chip no instrumento 2-120.
[000249] Em algumas modalidades, o chip de teste 2-110 pode ser alojado em um quadro retentor de chip 3-102, conforme ilustrado na Figura 3-1A. O quadro retentor de chip 3-102 pode ser descartável e pode estar disposto ao longo do chip de teste 2-110 após um único uso. O chip de teste 2-110 pode estar situado na face inferior do quadro retentor de chip 3-102, conforme ilustrado na Figura 3-1B. O quadro retentor de chip 3-102 pode compreender qualquer metal ferromagnético adequado, como aço, de modo que os componentes magnéticos 2-403a, 2-403b e 2-403c fixados ao alojamento óptico 2-401 prendam o quadro retentor de chip 3-102 e, desse modo, o chip de teste 2-110, no lugar. Em algumas modalidades, o quadro retentor de chip 3102 pode ser fixado à superfície de topo do alojamento óptico 2-401, conforme ilustrado na Figura 2-4.
[000250] Em outras modalidades, ilustradas na Figura 3-1C, o chip de teste 2-110 pode ser fixado a uma superfície de topo do quadro retentor de chip 3-102. Uma cobertura de plástico 3-103 envolve o chip de teste 2-110 de modo que a matriz de pixel do chip de teste 2-110 seja exposta por meio de uma abertura na cobertura de plástico 3-103. Um usuário do chip de teste 2-110 pode colocar o espécime na abertura da cobertura de plástico 3-103. Ao estar em contato com a superfície de topo do chip de teste 2-110, as amostras dentro do espécime podem ser introduzidas a uma ou mais da pluralidade de pixels do chip de teste 2110 para análise. Em algumas modalidades, nenhum canal ou dispositivo de fluidos para distribuir porções da amostra para os pixels por meio de fluxo de fluidos forçado são necessários.
[000251] Em algumas modalidades, o chip de teste pode incluir camadas de componentes empilhadas de modo vertical. Esses componentes podem incluir elementos ópticos, elétricos, químicos, bioquímicos e estruturais. Em algumas modalidades, cada camada do chip de teste é a mesma para cada pixel. A seguir se encontra uma descrição de um único pixel, mas cada pixel na matriz de pixels em um chip de teste pode ter exatamente o mesmo modelo de acordo com algumas modalidades.
A. CAMADA DE CAVIDADE DE AMOSTRA
[000252] Conforme ilustrado na Figura 2-3, e em mais detalhes na Figura 3-2, algumas modalidades incluem uma cavidade de amostra 2211 formada em um ou mais pixels do chip de teste 2-110. Uma cavidade de amostra pode compreender um pequeno volume ou região formada dentro da camada de metal 2-221 e disposta de modo que as amostras possam difundir dentro e fora da cavidade de amostra a partir de um espécime depositado na superfície do chip de teste 2-110. Em várias modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser disposta para receber energia de excitação de uma fonte de excitação 2-250. As amostras que se difundem à cavidade de amostra podem ser retidas, de modo temporário ou permanente, dentro de uma região de excitação 3-215 da cavidade de amostra por um aderente 3-211. Na região de excitação, a amostra pode ser excitada por energia de excitação (por exemplo, luz de excitação 3-245) e, subsequentemente, emitir energia que pode ser observada e avaliada para distinguir a amostra.
[000253] Em detalhes adicionais de operação, pelo menos uma amostra 3-101 a ser analisada pode ser introduzida na cavidade de amostra 2-211, por exemplo, a partir de um espécime (não mostrado) que contém uma suspensão fluida das amostras. A energia de excitação 3-245 de uma fonte de excitação 2-250 no instrumento 2-120 pode excitar a amostra ou pelo menos uma etiqueta (também denominada como um marcador biológico, relator ou sonda) anexado à amostra ou, de outro modo, associado à amostra enquanto a mesma está dentro de uma região de excitação 3-215 dentro da cavidade de amostra. De acordo com algumas modalidades, uma etiqueta pode ser uma molécula luminescente (por exemplo, uma etiqueta ou sonda luminescente) ou ponto quântico. Em algumas implantações, pode haver mais do que uma etiqueta que é usado para analisar uma amostra (por exemplo, etiquetas distintas que são usadas para sequenciamento genético de única molécula conforme descrito em "Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules", por J. Eid, et al., Science 323, p. 133 (2009), que é incorporado a título de referência). Durante e/ou após a excitação, a amostra ou etiqueta podem emitir energia de emissão. Quando múltiplas etiquetas são usadas, as mesmas podem emitir em diferentes energias distintas (e, portanto, ter diferentes comprimentos de onda) e/ou emitir com diferentes características temporais. Em algumas modalidades, a energia de emissão pode incluir qualquer número de comprimentos de onda, por exemplo, dois, três, quatro, cinco, seis, sete ou oito diferentes comprimentos de onda. As emissões da cavidade de amostra 2-211 podem irradiar a um sensor 2-122 no instrumento 2-120 em que as mesmas são detectadas e convertidas em sinais elétricos que podem ser usados para distinguir a amostra.
[000254] De acordo com algumas modalidades, a cavidade de amostra 2-211 pode ser uma estrutura parcialmente encerrada, conforme ilustrado na Figura 3-2. Em algumas implantações, uma cavidade de amostra 2-211 compreende um furo ou abertura dimensionada em submícron (distinguido por pelo menos uma dimensão transversal Dsw) formado em pelo menos uma camada de material 2-221. A dimensão transversal da cavidade de amostra pode ser entre aproximadamente 20 nanômetros e aproximadamente 1 mícron, de acordo com algumas modalidades, embora o maior e o menor tamanhos possam ser usados em algumas implantações. Um volume da cavidade de amostra 2-211 pode ser entre cerca de 10-21 litros e cerca de 10-15 litros, em algumas implantações. Uma cavidade de amostra pode ser formada como uma guia de onda que pode ou não suportar um modo de propagação. Em algumas modalidades, a cavidade de amostra pode ser formada como uma guia de onda de modo zero (ZMW) que tem um formato cilíndrico (ou formato similar) com um diâmetro (ou maior dimensão transversal) Dsw. Um ZMW pode ser formado em uma única camada de metal como um furo em nanoescala que não suporta um modo óptico de propagação através do furo.
[000255] Devido ao fato de que a cavidade de amostra 2-211 tem um pequeno volume, a detecção de eventos de amostra única (por exemplo, eventos de molécula única) em cada pixel pode ser possível mesmo que as amostras possam ser concentradas em um espécime examinado em concentrações que são similares às constatadas em ambientes naturais. Por exemplo, concentrações micromolares da amostra podem estar presentes em um espécime que é colocado em contato com o chip de teste, mas no nível de pixel somente aproximado. As cavidades de amostra do teste 2-110 são dimensionadas de modo que, estatisticamente, as mesmas mais provavelmente não contêm amostra ou contêm uma amostra, de modo que molécula de análise única possa ser realizada. Por exemplo, em algumas modalidades 30 a 40% das cavidades de amostra contêm uma única amostra. No entanto, cavidades de amostra podem conter mais do que uma amostra. Devido ao fato de que os eventos de molécula única ou de amostra única podem ser analisados em cada pixel, o chip de teste torna possível detectar eventos raros que podem, de outro modo, seguir despercebidos em medições ponderadas de conjunto.
[000256] Uma dimensão transversal Dsw de uma cavidade de amostra pode ser entre cerca de 500 nanômetros (nm) e cerca de um mícron em algumas modalidades, entre cerca de 250 nm e cerca de 500 nm em algumas modalidades, entre cerca de 100 nm e cerca de 250 nm em algumas modalidades, e ainda entre cerca de 20 nm e cerca de 100 nm em algumas modalidades. A dimensão transversal de uma cavidade de amostra pode ser aproximadamente 100 nm, aproximadamente 130 nm ou aproximadamente 190 nm. De acordo com algumas implantações, uma dimensão transversal de uma cavidade de amostra é entre aproximadamente 80 nm e aproximadamente 180 nm, ou entre aproximadamente um quarto e um oitavo do comprimento de onda de excitação ou comprimento de onda de emissão. De acordo com outras implantações, a dimensão transversal de uma cavidade de amostra é entre aproximadamente 120 nm e aproximadamente 170 nm. Em algumas modalidades, a profundidade ou altura da cavidade de amostra 2-211 pode ser entre cerca de 50 nm e cerca de 500 nm. Em algumas implantações, a profundidade ou altura da cavidade de amostra 2-211 pode ser entre cerca de 80 nm e cerca de 200 nm. A camada de material 2-221 que forma a cavidade de amostra 2-211 pode ter uma espessura ou altura ou aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, aproximadamente 150 nm, aproximadamente 200 nm, ou aproximadamente 250 nm.
[000257] Uma cavidade de amostra 2-211 que tem um subcomprimento de onda, a dimensão transversal pode aprimorar a operação de um pixel 2-100 de um chip de teste 2-110 de pelo menos duas maneiras. Por exemplo, o incidente de energia de excitação 32415 na cavidade de amostra de um lado oposto ao espécime pode se acoplar à região de excitação 3-215 com potência exponencialmente decrescente, e não se propagar através da cavidade de amostra ao espécime. Como resultado, a energia de excitação é aumentada na região de excitação em que a mesma excita a amostra de interesse, e é reduzida no espécime em que a mesma poderia excitar outras amostras que contribuiriam para o ruído de fundo. Além disso, a emissão de uma amostra retida em uma base da cavidade é preferencialmente direcionada ao sensor no instrumento 2-120, visto que a emissão não pode se propagar através da cavidade de amostra. Ambos esses efeitos podem aprimorar a razão de sinal para ruído no pixel. Os inventores reconheceram diversos aspectos da cavidade de amostra que podem ser melhorados para intensificação adicional de níveis de sinal para ruído no pixel. Esses aspectos se referem ao formato e estrutura da cavidade, e colocação relativa às estruturas ópticas e plasmônicas adjacentes (descritas abaixo) que auxiliam no acoplamento de energia de excitação à cavidade de amostra e energia emitida da cavidade de amostra.
[000258] De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada como uma nanopassagem de subcorte (SCN), que não suporta um modo de propagação. Por exemplo, a cavidade de amostra 2-211 pode compreender um furo ou buraco em formato cilíndrico em uma camada condutora 2-221. O corte transversal de uma cavidade de amostra não precisa ser redondo, e pode ser elíptico, quadrado, retangular ou poligonal em algumas modalidades. A energia de excitação 3-245 (por exemplo, radiação visível ou quase infravermelha) pode entrar na cavidade de amostra através de uma passagem de entrada 3-212 que pode ser definida por paredes 3-214 da cavidade de amostra 2-211 em uma primeira extremidade da cavidade, conforme ilustrado na Figura 3-2. Quando formada como uma SCN, a energia de excitação 3-245 pode decair exponencialmente ao longo da SCN. Em algumas implantações, a guia de onda pode compreender uma SCN para energia emitida da amostra, mas pode não ser uma SCN para energia de excitação. Por exemplo, a passagem e guia de onda formada pela cavidade de amostra pode ser grande o suficiente para suportar um modo de propagação para a energia de excitação, visto que a mesma pode ter um comprimento de onda mais curto do que a energia emitida. A emissão, em um comprimento de onda maior, pode estar além de um comprimento de onda cortado para um modo de propagação na guia de onda. De acordo com algumas modalidades, a cavidade de amostra 2-211 pode compreender uma SCN para a energia de excitação 3-245, de modo que a maior intensidade de energia de excitação seja localizada em uma região de excitação 3-215 da cavidade de amostra em uma entrada à cavidade de amostra 2-211 (por exemplo, localizada próxima à interface entre a camada 3-235 e a camada 2-221 conforme retratado na Figura). 3-2). Tal localização da energia de excitação pode aumentar a densidade de energia de emissão da amostra, e confinar adicionalmente a energia de excitação próxima à passagem de entrada 3-212, limitando assim a emissão observada a uma amostra única (por exemplo, uma molécula única).
[000259] Um exemplo de localização de excitação próxima a uma entrada de uma cavidade de amostra que compreende uma SCN é retratado na Figura 3-3. Uma simulação numérica foi realizada para determinar a intensidade de energia de excitação dentro de uma cavidade de amostra 2-211 formada como uma SCN e próximo à mesma. Os resultados mostraram que a intensidade da energia de excitação é cerca de 70% da energia incidente em uma passagem de entrada da cavidade de amostra e cai para cerca de 20% da intensidade incidente dentro de cerca de 100 nm na cavidade de amostra. Para essa simulação, o comprimento de onda distinto da energia de excitação foi de 633nm e o diâmetro da cavidade de amostra 2-211 foi de 140 nm. A cavidade de amostra 2-211 foi formada em uma camada de metal de ouro. Cada divisão horizontal no gráfico é de 50 nm. Conforme mostrado pelo gráfico, mais do que uma metade da energia de excitação recebida na cavidade de amostra é localizada em cerca de 50 nm dentro da passagem de entrada 3-212 da cavidade de amostra 2-211.
[000260] Para melhorar a intensidade da energia de excitação que é localizada na cavidade de amostra 2-211, outras estruturas de cavidade de amostra foram desenvolvidas e estudadas pelos inventores. A Figura 3-4 ilustra uma modalidade de uma cavidade de amostra que inclui uma cavidade ou concavidade 3-216 em uma extremidade de excitação da cavidade de amostra 2-211. Conforme pode ser observado nos resultados de simulação da Figura 3-3, uma região de maior intensidade de excitação existe logo antes da passagem de entrada 2-212 da cavidade de amostra. Adicionar uma concavidade 3-216 à cavidade de amostra 2-211 permite que a amostra se mova à região de maior intensidade de excitação, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, o formato e estrutura da concavidade altera o campo de excitação local (por exemplo, devido a uma diferença no índice refrativo entre a camada 3-235 e o fluido do espécime na cavidade de amostra), e pode aumentar assim a intensidade da energia de excitação na concavidade.
[000261] A concavidade pode ter qualquer formato adequado. A concavidade pode ter um formato transversal que é substancialmente equivalente a um formato transversal da cavidade de amostra, por exemplo, redondo, elíptico, quadrado, retangular, poligonal, etc. Em algumas modalidades, as paredes laterais da concavidade pode ser substancialmente reta e vertical, como as paredes da cavidade de amostra. Em algumas implantações, as paredes laterais da concavidade podem estar em declive e/ou ser curvadas, conforme retratado no desenho. A dimensão transversal da concavidade pode ser aproximadamente do mesmo tamanho que a dimensão transversal da cavidade de amostra em algumas modalidades, pode ser menor do que a dimensão transversal da cavidade de amostra em algumas modalidades, ou pode ser maior do que a dimensão transversal da cavidade de amostra em algumas modalidades. A concavidade 3-216 pode se estender entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 200 nm além da camada metálica 2-221 da cavidade de amostra. Em algumas implantações, a concavidade pode se estender entre aproximadamente 50 nm e aproximadamente 150 nm além da camada metálica 2-221 da cavidade de amostra. Formando-se a concavidade, a região de excitação 3-215 pode se estender fora da camada metálica 2221 da cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 3-4.
[000262] A Figura 3-5 ilustra a melhoria de energia de excitação na região de excitação para uma cavidade de amostra que contém uma concavidade (mostrada na imagem de simulação esquerda). Para comparação, o campo de excitação é também simulado para uma cavidade de amostra sem uma concavidade, mostrado à direita. A magnitude de campo foi convertida de uma renderização de cor nessas plotagens, e a região escura na base da concavidade representa maior intensidade do que a região de luz dentro da cavidade de amostra. As regiões escuras acima da cavidade de amostra representam a menor intensidade. Conforme pode ser observado, a concavidade permite que uma amostra 3-101 se mova para uma região de maior intensidade de excitação, e a concavidade também aumente a localização de região de maior intensidade em uma extremidade de excitação da cavidade de amostra. Observe que a região de alta intensidade é mais distribuída para a cavidade de amostra sem a concavidade. Em algumas modalidades, a concavidade 3-216 fornece um aumento de energia de excitação na região de excitação por um fator de dois ou mais. Em algumas implantações, um aumento de mais do que um fator de dois pode ser obtido dependendo do formato e profundidade da concavidade. Nessas simulações, a cavidade de amostra compreende uma camada de Al que tem 100 nm de espessura, com uma concavidade que tem 50 nm de profundidade, com energia de excitação em 635 nm de comprimento de onda.
[000263] A Figura 3-6 retrata outra modalidade de uma cavidade de amostra 2-211 na qual a cavidade de amostra, que inclui a concavidade 3-216, são formadas sobre uma protuberância 3-615 em uma superfície de um substrato. Uma estrutura resultante para a cavidade de amostra pode aumentar a energia de excitação na amostra em mais do que um fator de dois em comparação a uma cavidade de amostra mostrada na Figura 3-2, e pode direcionar a emissão da cavidade de amostra ao sensor no instrumento 2-120. De acordo com algumas modalidades, uma protuberância 3-615 é padronizada em uma primeira camada 3610 do material. A protuberância pode ser formada como um pedestal circular ou uma crista com corte transversal retangular em algumas implantações, e uma segunda camada 3-620 do material pode ser depositada sobre a primeira camada e a protuberância. Na protuberância, a segunda camada pode formar um formato acima da protuberância que se aproxima de uma porção cilíndrica 3-625, conforme retratado. Em algumas modalidades, uma camada condutora 3-230 (por exemplo, um metal reflexivo) pode ser depositada sobre a segunda camada 3-620 e padronizada para formar uma cavidade de amostra 3-210 na camada condutora acima da protuberância. Uma concavidade 3-216 pode ser então gravada na segunda camada. A concavidade pode se estender entre cerca de 50 nm e cerca de 150 nm abaixo da camada condutora 3-230. De acordo com algumas modalidades, a primeira camada 3-610 e a segunda camada 3-620 pode ser opticamente transparente, e pode ou não ser formada de um mesmo material. Em algumas implantações, a primeira camada 3-610 pode ser formada de um óxido (por exemplo, SiO2) ou um nitreto (por exemplo, Si3N4), e a segunda camada 3-620 pode ser formada de um óxido ou um nitreto.
[000264] De acordo com algumas modalidades, a camada condutora 3-230 acima da protuberância 3-625 é modelada aproximadamente como um refletor esférico 3-630. O formato da porção esférica pode ser controlado pela seleção da altura de protuberância h, diâmetro ou dimensão transversal w da protuberância, e uma espessura t da segunda camada 3-620. O local da região de excitação e posição da amostra pode ser ajustada em relação a um ponto focal óptico do refletor cilíndrico pela seleção da profundidade de concavidade d. pode- se verificar que o refletor esférico 3-630 pode concentrar energia de excitação na região de excitação 3-215, e também pode coletar a energia emitida de uma amostra e refletir e concentrar a radiação ao sensor 3-260.
[000265] Conforme observado acima, uma cavidade de amostra pode ser formada em qualquer formato adequado, e não é limitada somente a formatos cilíndricos. Em algumas implantações, uma cavidade de amostra pode ser cônica, em formato de tetraedro, pentaedro, etc. A Figura 3-7A à Figura 3-7F ilustram alguns formatos e estruturas de cavidade de amostra exemplificadores que podem ser usados em algumas modalidades. Uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada para ter uma primeira passagem 3-212 que é maior do que uma segunda passagem 3-218 para a energia de excitação, de acordo com algumas modalidades. As paredes laterais da cavidade de amostra podem ser afuniladas ou curvadas. Formar a cavidade de amostra dessa maneira pode admitir mais energia de excitação para a região de excitação, ainda assim atenuar de modo apreciável a energia de excitação que se desloca ao espécime. Adicionalmente, a emissão irradiada por uma amostra pode irradiar de modo apreciável para a extremidade da cavidade de amostra com a maior passagem, devido à transferência de energia favorável naquela direção.
[000266] Em algumas modalidades, uma concavidade 3-216 pode ter uma dimensão transversal menor do que a base da cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-7B. Uma concavidade menor pode ser formada revestindo-se as paredes laterais da cavidade de amostra com uma camada sacrificial antes de gravar a concavidade, e, subsequentemente, remover a camada sacrificial. Uma concavidade menor pode ser formada para reter a amostra em uma região que é mais equidistante das paredes condutoras da cavidade de amostra. Reter uma amostra equidistante das paredes da cavidade de amostra pode reduzir efeitos indesejáveis da cavidade de paredes de amostra na amostra radiante, por exemplo, extinção de emissão e/ou alteração de tempos de vida de radiação.
[000267] As Figuras 3-7C e 3-7D retratam outra modalidade de uma cavidade de amostra. De acordo com essa modalidade, uma cavidade de amostra 2-211 pode compreender estruturas de intensificação de energia de excitação 3-711 e um aderente 3-211 formado adjacente às estruturas de intensificação de energia de excitação. As estruturas de intensificação de energia 3-711 podem compreender plasmon de superfície ou estruturas de nanoantena formado em materiais condutores em uma camada opticamente transparente 3-235, de acordo com algumas modalidades. A Figura 3-7C ilustra uma vista em elevação da cavidade de amostra 2-211 e próximo à estrutura, e a Figura 3-7D ilustra uma vista plana. As estruturas de intensificação de energia de excitação 3-711 podem ser modeladas e dispostas para intensificar a energia de excitação em uma pequena região localizada. Por exemplo, as estruturas podem incluir condutores apontados que têm ângulos agudos na cavidade de amostra que aumentam a intensidade da energia de excitação dentro de uma região de excitação 3-215. No exemplo retratado, as estruturas de intensificação de energia de excitação 3-711 estão na forma de uma gravata borboleta. As amostras 3-101 que se difundem à região podem ser retidas, de modo temporário ou permanente, pelo aderente 3-211 e excitadas pela energia de excitação que podem ser entregues de uma fonte de excitação 2-250 localizada no instrumento 2-120. De acordo com algumas modalidades, a energia de excitação pode acionar as correntes de plasmon de superfície nas estruturas de intensificação de energia 3-711. As correntes de plasmon de superfície resultantes podem produzir altos campos elétricos nos pontos acentuados das estruturas 3-711, e esses altos campos podem excitar uma amostra retida na região de excitação 3-215. Em algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 retratada na Figura 3-7C pode incluir uma concavidade 3-216.
[000268] Outra modalidade de uma cavidade de amostra é retratada na Figura 3-7E, e mostra uma estrutura de intensificação de energia de excitação 3-720 formada ao longo das paredes interiores da cavidade de amostra 2-211. A estrutura de intensificação de energia de excitação 3-720 pode compreender um metal ou condutor, e pode ser formada com o uso de uma deposição angulada (ou sombreada), direcional em que o substrato no qual a cavidade de amostra é formada gira durante a deposição. Durante a deposição, a base da cavidade de amostra 2211 é obscurecida pelas paredes superiores da cavidade, de modo que o material depositado não se acumule na base. A estrutura resultante 3720 pode formar um ângulo agudo 3-722 no fundo da estrutura, e esse ângulo agudo do condutor pode intensificar a energia de excitação dentro da cavidade de amostra.
[000269] Em uma modalidade conforme retratado na Figura 3-7E, o material 3-232 no qual a cavidade de amostra é formada não precisa ser condutor, e pode ser qualquer material adequado tal como material dielétrico. De acordo com algumas implantações, a cavidade de amostra 2-211 e a estrutura de intensificação de energia de excitação 3-720 pode ser formada em um furo cego gravado em uma camada dielétrica 3-235, e uma camada separada 3-232 não precisa ser depositada.
[000270] Em algumas implantações, uma evaporação sombreada pode ser subsequentemente realizada na estrutura mostrada na Figura 3-7E para depositar uma estrutura metálica ou intensificadora de energia condutora, por exemplo, uma estrutura trapezoidal ou cone apontado na base da cavidade de amostra, conforme retratado pela linha pontilhada. A estrutura intensificadora de energia pode intensificar a energia de excitação dentro da cavidade através de plasmons de superfície. Após a evaporação sombreada, um processo de aplanação (por exemplo, uma etapa de polimento químico-mecânico ou um processo de gravação de plasma) pode ser realizada para remover ou gravar o material depositado na parte superior da cavidade de amostra, ao deixar a estrutura intensificadora de energia dentro da cavidade.
[000271] Em algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada a partir de mais do que uma única camada de metal. A Figura 3-7F ilustra uma cavidade de amostra formada em uma estrutura de múltiplas camadas, em que diferentes materiais podem ser usados para as diferentes camadas. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada em uma primeira camada 3-232 (que pode ser um material semicondutor ou condutor), uma segunda camada 3-234 (que pode ser um isolante ou dielétrico), e a terceira camada 2-221 (que pode ser um condutor ou semicondutor). Em algumas modalidades, um semicondutor enriquecido de modo degenerativo ou grafeno pode ser usado para uma camada da cavidade de amostra. Em algumas implantações, uma cavidade de amostra pode ser formada em duas camadas e, em outras implantações, uma cavidade de amostra pode ser formada em quatro ou mais camadas. Em algumas modalidades, os materiais de múltiplas camadas usados para formar uma cavidade de amostra podem ser selecionados para aumentar a geração de plasmon de superfície em uma base da cavidade de amostra ou suprimir a radiação de plasmon de superfície em uma parte superior da cavidade. Em algumas modalidades, materiais de múltiplas camadas usados para formar uma cavidade de amostra podem ser selecionados para suprimir a energia de excitação de se propagar além da cavidade de amostra e da estrutura de múltiplas camadas ao espécime de volume.
[000272] Em algumas modalidades, materiais de múltiplas camadas usados para formar uma cavidade de amostra podem ser selecionados para aumentar ou suprimir excitações interfaciais que podem ser geradas por energia de excitação incidente em uma cavidade de amostra. Por exemplo, múltiplos éxcitons, tais como biéxcitons e triéxcitons, podem ser geradas em uma interface entre duas camadas semicondutoras diferentes adjacentes a uma cavidade de amostra. A cavidade de amostra pode ser formada tanto na camada de metal quanto na primeira camada semicondutora de modo que a interface entre a primeira camada semicondutora e uma segunda camada semicondutora está em uma região de excitação 3-215 da cavidade de amostra. Os éxcitons interfaciais podem ter tempos de vida maiores do que éxcitons dentro do volume de uma única camada semicondutora, aumentando a probabilidade de que os éxcitons excitarão uma amostra ou etiqueta através de FRET ou DET. Em algumas modalidades, pelo menos um ponto quântico no qual múltiplos éxcitons podem ser excitados pode ser anexado a um fundo da cavidade de amostra (por exemplo, por uma molécula ligante). Os éxcitons excitados em um ponto quântico também podem ter tempos de vida maiores do que éxcitons dentro do volume de uma única camada semicondutora. Éxcitons interfaciais ou éxcitons gerados em um ponto quântico podem aumentar a taxa de FRET ou DET, de acordo com algumas modalidades.
[000273] Vários materiais podem ser usados para formar cavidades de amostra descritas nas modalidades precedentes. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada de pelo menos uma camada de material 2-221, que pode compreender qualquer um dentre um material condutor, um semicondutor, e um isolante ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 compreende uma camada metálica altamente condutora, por exemplo, ouro, prata, alumínio, cobre. Em algumas modalidades, a camada 2-221 pode compreender uma pilha de múltiplas camadas que inclui qualquer um dentre ouro, prata, alumínio, cobre, titânio, nitreto de titânio e cromo ou uma combinação dos mesmos. Em algumas implantações, outros metais podem ser usados adicional ou alternativamente. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra pode compreender um uma liga tal como AlCu ou AlSi.
[000274] Em algumas modalidades, as múltiplas camadas de diferentes metais ou ligas podem ser usadas para formar uma cavidade de amostra. Em algumas implantações, o material no qual uma cavidade de amostra 2-211 é formada pode compreender camadas alternativas de metais e não metais, por exemplo, camadas alternativas de metal e um ou mais dielétricos. Em algumas modalidades, o não metal pode incluir um polímero, tal como ácido fosfônico de polivinila ou a polietileno glicol (PEG)-tiol.
[000275] Uma camada 2-221 na qual uma cavidade de amostra é formada pode ser depositada em ou adjacente a pelo menos uma camada opticamente transparente 3-235, de acordo com algumas modalidades, de modo que a energia de excitação (por exemplo, na forma de radiação visível ou próximo a infravermelho) e a energia de emissão (por exemplo, na forma de radiação visível ou próximo a infravermelho) pode se deslocar à cavidade de amostra 2-211 e a partir da mesma sem atenuação significativa. Por exemplo, a energia de excitação de uma fonte de excitação 2-250 pode atravessar a pelo menos uma camada opticamente transparente 3-235 à região de excitação 3-215, e emissão da amostra pode atravessar a mesma camada ou camadas ao sensor 2-250.
[000276] Em algumas modalidades, pelo menos uma superfície da cavidade de amostra 2-211 pode ser revestida com uma ou mais camadas 3-211, 3-280 de material que afetam a ação de uma amostra dentro da cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-8. Por exemplo, uma camada dielétrica fina 3-280 (por exemplo, alumina, nitreto de titânio ou sílica) pode ser depositada como um revestimento passivante em paredes laterais da cavidade de amostra. Tal revestimento pode ser implantado para reduzir a adesão de amostra de uma amostra fora da região de excitação 3-215, ou para reduzir a interação entre a amostra e o material 2-221 no qual a cavidade de amostra 2-211 é formada. A espessura de um revestimento passivante dentro da cavidade de amostra pode ser entre cerca de 5 nm e cerca de 50 nm, de acordo com algumas modalidades.
[000277] Em algumas implantações, um material para uma camada de revestimento 3-280 pode ser selecionado com base em uma afinidade de um agente químico para o material, de modo que a camada 3-280 possa ser tratada com uma substância química e biológica para inibir mais a adesão de uma espécie de amostra à camada. Por exemplo, uma camada de revestimento 3-280 pode compreender alumina, que pode ser passivada com uma camada de passivação de polifosfonato, de acordo com algumas modalidades. Revestimentos adicionais ou alternativos e agentes de passivação podem ser usados em algumas modalidades.
[000278] De acordo com algumas modalidades, pelo menos uma superfície de fundo da cavidade de amostra 2-211 e/ou concavidade 3216 podem ser tratadas com um aderente químico ou biológico 3-211 (por exemplo, biotina) para promover a retenção de uma amostra. A amostra pode ser retida de modo permanente ou temporário, por exemplo, por pelo menos um período de tempo entre cerca de 0,5 milissegundos e cerca de 50 milissegundos. Em outra modalidade, o aderente pode promover a retenção temporária de uma amostra 3-101 por períodos maiores. Qualquer aderente adequado pode ser usado em várias modalidades, e não é limitado à biotina.
[000279] De acordo com algumas modalidades, a camada de material 3-235 adjacente à cavidade de amostra pode ser selecionada com base em uma afinidade de um aderente para o material dessa camada. Em algumas modalidades, a passividade das paredes laterais da cavidade de amostra pode inibir o revestimento de um aderente nas paredes laterais, de modo que o aderente 3-211 se deposite preferencialmente na base da cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um revestimento de aderente pode se estender as paredes laterais da porção da cavidade de amostra. Em algumas implantações, um aderente pode ser depositado por um processo de deposição física anisotrópica (por exemplo, evaporação, dispersão), de modo que o aderente se acumule na base de uma cavidade de amostra ou concavidade e não forme de modo apreciável em paredes laterais da cavidade de amostra.
[000280] Vários conjuntos de procedimentos de fabricação podem ser empregados para fabricar cavidades de amostra 2-211 para um chip de teste. Alguns processos exemplificadores são descritos abaixo, mas a invenção não é limitada somente a esses exemplos.
[000281] A cavidade de amostra 2-211 pode ser formada por qualquer processo de micro ou nanofabricação adequado, que pode incluir, porém, sem limitação, processar etapas associadas a fotolitografia, fotolitografia de ultravioleta profunda, fotolitografia de imersão, fotolitografia de contato óptico de campo próximo, litografia de EUV, litografia de raio X, litografia de nanoimpressão, litografia interferométrica, litografia tipo step e flash, litografia de feixe de elétron de gravação direta, litografia de feixe de íon, fresagem de feixe de íon, processamento de desprendimento, gravação de íon negativo, epitaxia seletiva, automontagem molecular, síntese orgânica, etc. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada com o uso de fotolitografia e processamento de desprendimento. As etapas de fabricação exemplificadoras associadas ao processamento de desprendimento de uma cavidade de amostra são retratadas na Figura 3-9A à Figura 3-9E. Embora a fabricação de somente uma única cavidade de amostra ou estrutura em um pixel seja tipicamente retratada nos desenhos, será entendido que um grande número de cavidades de amostra ou estruturas pode ser fabricado em um substrato (por exemplo, em cada pixel) em paralelo.
[000282] De acordo com algumas modalidades, uma camada 3-235 (por exemplo, uma camada de óxido) em um substrato pode ser coberta com uma camada de revestimento antirreflexo (ARC) 3-910 e fotorresistência 3-920, conforme ilustrado na Figura 3-9A. A fotorresistência 3-920 pode ser exposta e padronizada com o uso de fotolitografia e desenvolvimento da resistência. A fotorresistência 3-920 pode ser desenvolvida para remover porções expostas ou porções não expostas (dependendo do tipo de resistência), deixando um pilar 3-922 que tem um diâmetro aproximadamente igual a um diâmetro desejado para a cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-9B. A altura do pilar 3-922 pode ser maior do que uma profundidade desejada da cavidade de amostra.
[000283] O padrão do pilar 3-922 pode ser transferido para a camada de ARC 3-910 através de gravação de íon anisotrópica reativa (RIE), por exemplo, conforme mostrado na Figura 3-9C. A região pode ser então revestida com pelo menos um material 2-221, por exemplo, um condutor ou metal, que é desejado para formar a cavidade de amostra. Uma porção do material depositado, ou materiais, forma uma capa 3232 sobre o pilar 3-922, conforme ilustrado na Figura 3-9D. A fotorresistência 3-920 e a camada de ARC 3-910 podem ser então esvaziadas do substrato, com o uso de um processo de remoção seletivo (por exemplo, com o uso de um banho químico com ou sem agitação que dissolve pelo menos a resistência e libera ou "desprende" a capa). Se a camada de ARC 3-910 permanecer, a mesma pode ser esvaziada do substrato com o uso de uma gravação seletiva, deixando a cavidade de amostra 3-210 conforme mostrado na Figura 3-9E. De acordo com algumas modalidades, as paredes laterais 3-214 da cavidade de amostra podem estar em declive devido à natureza da deposição do pelo menos um material 2-221.
[000284] Conforme usado no presente documento, uma "gravação seletiva" significa um processo de gravação no qual um agente de gravação seletivamente grava um material que é desejado para ser removido ou gravado em uma taxa maior (por exemplo, pelo menos duas vezes a taxa) do que o agente de gravação grava outros materiais que não são destinados a serem removidos.
[000285] Devido ao fato de que a resistência e a camada de ARC são tipicamente baseadas em polímero, os mesmos são considerados materiais leves que podem não ser adequados para formar cavidades de amostra que tem altas razões de aspecto (por exemplo, razões de aspecto maiores do que cerca de 2:1 em relação à altura para largura). Para cavidades de amostra que têm maiores razões de aspecto, um material rígido pode ser incluído no processo de desprendimento. Por exemplo, antes de depositar a camada de ARC e a fotorresistência, uma camada de um material rígido (por exemplo, um material inorgânico) pode ser depositada. Em algumas modalidades, uma camada de nitreto de titânio ou silício pode ser depositada. A camada de material rígido deve exibir gravação preferencial sobre o material, ou materiais, 2-221 nos quais a cavidade de amostra é formada. Depois que a fotorresistência é padronizada, um padrão do pilar pode ser transferido na camada de ARC e o material rígido subjacente 3-930 que rende uma estrutura conforme ilustrado na Figura 3-9F. A fotorresistência e a camada de ARC podem ser então esvaziadas, o material (ou materiais) 2-221 depositado, e uma etapa de desprendimento realizada para formar a cavidade de amostra.
[000286] De acordo com algumas modalidades, um processo de desprendimento pode ser usado para formar uma cavidade de amostra que compreende estruturas de intensificação de energia 3-711, conforme ilustrado na Figura 3-7C e a Figura 3-7D.
[000287] Um processo alternativo para formar uma cavidade de amostra é retratado nas Figuras 3-10A a 3-10D. Nesse processo, a cavidade de amostra pode ser diretamente gravada em pelo menos um material 3-236. Por exemplo, pelo menos um material 3-236 no qual uma cavidade de amostra deve ser formada pode ser depositada em um substrato 3-325. A camada pode ser coberta por uma camada de ARC 3-910 e uma fotorresistência 3-920, conforme ilustrado na Figura 3-10A. A fotorresistência pode ser padronizado para formar um furo que tem um diâmetro aproximadamente igual a um diâmetro desejado da cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-10B. O padrão do furo pode ser transferido para a camada de ARC e através da camada 3-230 com o uso de uma gravação de íon anisotrópica reativa, conforme mostrado na Figura 3-10C, por exemplo. A resistência e a camada de ARC podem ser esvaziadas, rendendo uma cavidade de amostra conforme ilustrado na Figura 3-10D. De acordo com algumas modalidades, as paredes laterais de uma cavidade de amostra formada gravando-se a camada de material 3-230 pode ser mais vertical do que as paredes laterais resultantes do processo de desprendimento.
[000288] Em algumas modalidades, a fotorresistência e a camada de ARC podem ser usadas para padronizar uma máscara rígida (por exemplo, um nitreto de silício ou camada de óxido, não mostrado) sobre o material 3-236. O furo padronizado pode ser então transferido para a máscara rígida, que é então usada para transferir o padrão para a camada de material 2-221. Uma máscara rígida pode permitir maiores profundidades de gravação na camada de material 2-221, de modo a formar cavidades de amostra de maior razão de aspecto.
[000289] Será verificado que os processos de desprendimento e os conjuntos de procedimentos de fabricação de gravação direta descritos acima podem ser usados para formar a cavidade de amostra quando múltiplas camadas de diferentes materiais são usadas para formar uma pilha de material na qual a cavidade de amostra é formada. Uma pilha exemplificadora é mostrada na Figura 3-11. De acordo com algumas modalidades, uma pilha de material pode ser usada para formar a cavidade de amostra para melhorar acoplamento de energia de excitação à região de excitação de uma cavidade de amostra, ou para a reduzir transmissão ou nova radiação de energia de excitação ao espécime de volume. Por exemplo, uma camada absorvente 3-942 pode ser depositada sobre uma primeira camada 3-940. A primeira camada pode compreender um metal ou liga de metal, e a camada absorvente pode compreender um material que inibe plasmons de superfície, por exemplo, silício amorfo, TaN, TiN ou Cr. Em algumas implantações, uma camada de superfície 3-944 também pode ser depositada para passivar a superfície que circunda a cavidade de amostra (por exemplo, inibir a adesão de moléculas).
[000290] A formação de uma cavidade de amostra incluindo uma concavidade 3-216 pode ser feita de qualquer maneira adequada. Em algumas modalidades, uma concavidade pode ser formada gravando- se mais em uma camada adjacente 3-235, e/ou qualquer camada ou camadas de intervenção, adjacente à cavidade de amostra. Por exemplo, depois de formar uma cavidade de amostra em uma camada de material 2-221, essa camada 2-221 pode ser usada como uma máscara de gravação para padronizar uma concavidade, conforme ilustrado na Figura 3-12. Por exemplo, o substrato pode ser submetido a uma gravação de íon reativo anisotrópico seletivo de modo que uma concavidade 3-216 possa ser gravada na camada adjacente 3-235. Por exemplo, em uma modalidade em que o material 2-221 é metálico e a camada adjacente 3-235 de óxido de silício, uma gravação de plasma de íon reativo que tem um gás de alimentação que compreende CHF3 ou CF4 pode ser usado para remover preferencialmente óxido de silício exposto abaixo da cavidade de amostra e formar a concavidade 3-216. Conforme usado no presente documento, "óxido de silício" se refere, em geral, a SiOx e pode incluir dióxido de silício, por exemplo.
[000291] Em algumas modalidades, as condições dentro do plasma (por exemplo, desvio ao substrato e pressão) durante uma gravação podem ser controladas para determinar o perfil de gravação da concavidade 3-216. Por exemplo, em baixa pressão (por exemplo, menos do que cerca de 100 mTorr) e desvio de alta CC (por exemplo, maior do que cerca de 20V), a gravação pode ser altamente anisotrópica e formar paredes laterais substancialmente retas e verticais da concavidade, conforme retratado no desenho. Em pressões maiores e desvios menores, a gravação pode ser mais isotrópica rendendo paredes laterais afuniladas e/ou curvadas da concavidade. Em algumas implantações, uma gravação a úmido pode ser usada para formar a concavidade, que pode ser substancialmente isotrópica e formar uma concavidade aproximadamente esférica que pode se estender lateralmente sob o material 2-221, até ou além das paredes laterais da cavidade de amostra.
[000292] A Figura 3-13A à Figura 3-13C retratam etapas de processo que podem ser usadas para formar uma concavidade 3-216 que tem uma dimensão transversal menor do que a cavidade de amostra 2-211 (por exemplo, uma concavidade como a retratada na Figura 3-7B). Em algumas implantações, depois de formar uma cavidade de amostra, uma camada sacrificial isolante 3-960 pode ser depositada sobre a região que inclui a cavidade de amostra. De acordo com algumas modalidades, a camada sacrificial 3-960 pode ser depositada por um processo de deposição de vapor, por exemplo, deposição de vapor químico (CVD), CVD intensificada por plasma, ou deposição de camada atômica (ALD). A camada sacrificial pode ser então gravada de volta com o uso de uma primeira gravação anisotrópica que é seletiva à camada sacrificial 3-960, remove a camada das superfícies horizontais, deixa revestimentos de parede lateral 3-962 em paredes da cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-13B. A gravação posterior pode ser seletiva e parar no material 2-221 e a camada adjacente 3-235 em algumas modalidades, ou pode ser uma gravação temporizada não seletiva em algumas modalidades.
[000293] Uma segunda gravação anisotrópica que é seletiva à camada adjacente 3-235 pode ser executada para gravar uma concavidade 3-216 na camada adjacente conforme ilustrado na Figura 3-13C. Os revestimentos sacrificiais de parede lateral 3-962 podem ser então opcionalmente removidos por uma gravação seletiva a úmido ou a seco. A remoção dos revestimentos de parede lateral abre a cavidade de amostra para ter uma dimensão transversal maior do que a concavidade 3-216.
[000294] De acordo com algumas modalidades, a camada sacrificial 3-960 pode compreender o mesmo material que a camada adjacente 3235. Em tais modalidades, a segunda gravação pode remover pelo menos uma parte do revestimento de parede lateral 3-962 à medida que a concavidade é gravada na camada adjacente 3-235. Essa gravação posterior do revestimento de parede lateral pode formar paredes laterais afuniladas da concavidade em algumas modalidades.
[000295] Em algumas implantações, a camada sacrificial 3-960 pode ser formada de um material, ou incluir uma camada do mesmo, que é usado para passivar as paredes laterais da cavidade de amostra (por exemplo, reduzir a adesão de amostras nas paredes laterais da cavidade de amostra). Pelo menos uma parte da camada 3-960 pode ser então deixada nas paredes da cavidade de amostra após a formação da concavidade.
[000296] De acordo com algumas modalidades, a formação dos revestimentos de parede lateral 3-962 ocorre após a formação da concavidade. Em tal modalidade, a camada 3-960 reveste as paredes laterais da concavidade. Tal processo pode ser usado para passivar as paredes laterais da concavidade e localizar a amostra no centro da concavidade.
[000297] As etapas de processo associadas à deposição de um aderente 3-211 em uma base de uma cavidade de amostra 2-211 e uma camada de passivação 3-280 são retratadas nas Figuras 3-14A a 3-14D. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra pode incluir uma primeira camada de passivação 3-280 nas paredes da cavidade de amostra. A primeira camada de passivação pode ser formada, por exemplo, conforme descrito acima em conexão com a Figura 3-13B ou a Figura 3-8. Em algumas modalidades, a primeira camada de passivação 3-280 pode ser formada por qualquer processo de deposição adequado e gravação posterior. Em algumas modalidades, uma primeira camada de passivação pode ser formada oxidando-se o material 3-230 no qual a cavidade de amostra é formada. Por exemplo, a cavidade de amostra pode ser formada de alumínio, que pode ser oxidada para criar um revestimento de alumina nas paredes laterais da cavidade de amostra.
[000298] Um aderente 3-980 ou um precursor de aderente (por exemplo, um material que se cola preferencialmente a um aderente) pode ser depositado no substrato com o uso de um processo de deposição física anisotrópica, por exemplo, uma deposição evaporativa, conforme ilustrado na Figura 3-14A. O aderente ou precursor de aderente 3-980 pode formar uma camada de aderente 3-211 na base da cavidade de amostra, conforme ilustrado na Figura 3-14B, e pode revestir uma superfície superior do material 2-221 no qual a cavidade de amostra é formada. Uma deposição direcional angulada subsequente retratada na Figura 3-14C (algumas vezes denominada como uma deposição sombreada ou processo de evaporação sombreada) pode ser usada para depositar uma segunda camada de passivação 2-280 sobre uma superfície superior do material 2-221 sem cobrir a camada de aderente 3-211. Durante o processo de deposição sombreado, o substrato pode ser girado ao redor de um eixo geométrico normal ao substrato enquanto os percursores de camada de passivação 3-990 são depositados, de modo que a segunda camada de passivação 3-280 se deposite de modo mais uniforme ao redor de um aro superior da cavidade de amostra. Uma estrutura resultante é retratada na Figura 3-14D, de acordo com algumas realizações. Como uma alternativa à deposição da segunda camada de passivação, uma gravação de aplanação (por exemplo, uma etapa de CMP) pode ser usada para remover o aderente de uma superfície superior do material 3-230.
[000299] De acordo com algumas implantações, uma camada de aderente 3-211 pode ser depositada de modo centralizado na base de uma cavidade de amostra afunilada, conforme ilustrado na Figura 3-15. Por exemplo, um aderente, ou precursor de aderente, pode ser depositado de modo direcional, conforme ilustrado na Figura 3-14A, em uma cavidade de amostra afunilada, formada conforme descrito acima. As paredes da cavidade de amostra podem ser passivadas por um processo de oxidação antes ou após a deposição da camada de aderente 3-211. O aderente ou precursor que permanecem em uma superfície do material 2-221 podem ser passivados conforme descrito em conexão com a Figura 3-14D. Em algumas modalidades, um aderente em uma superfície superior do material 2-221 pode ser removido por uma etapa de polimento químico-mecânico. Formando-se uma camada de aderente, ou uma camada de aderente precursora, de modo centralizado na base de uma cavidade de amostra, efeitos deletérios na emissão de uma amostra (por exemplo, supressão ou extinção de radiação de amostra das paredes de amostra, distribuição de radiação desfavorável da amostra devido ao fato de que a mesma não é localizada de modo centralizado em relação às estruturas de acoplamento de energia formadas ao redor de uma cavidade de amostra, efeitos adversos no tempo de vida luminescente para uma amostra) podem ser reduzidos.
[000300] Em algumas modalidades, o padrão de desprendimento, gravação, e processos de deposição usados para formar a cavidade de amostra e a concavidade podem ser compatíveis com os processos de CMOS que são usados para formar circuitos de CMOS integrados em um chip de sensor. Consequentemente, um sensor pode ser fabricado com o uso de instalações de CMOS convencionais e conjuntos de procedimentos de fabricação, embora instalações de fabricação personalizada ou personalizada possam ser usadas em algumas implantações.
[000301] Variações das etapas de processo descritas acima podem ser usadas para formar modalidades alternativas de cavidades de amostra. Por exemplo, uma cavidade de amostra afunilada tal como conforme ilustrado na Figura 3-7A ou na Figura 3-7B pode ser formada com o uso de um processo de deposição angulada retratado na Figura 3-14C. Para a cavidade de amostra da Figura 3-7B, o ângulo de deposição pode ser mudado durante o processo de deposição. Para tais modalidades, uma cavidade de amostra que tem paredes laterais substancialmente retas e verticais pode ser primeiro formada, e então material adicional 2-221 depositado por uma deposição angulada para afunilar as paredes laterais da cavidade de amostra.
B. ACOPLAMENTO DE ENERGIA DE EXCITAÇÃO À CAVIDADE DE AMOSTRA
[000302] Conforme ilustrado na Figura. 2-1 e na Figura 2-3, a energia de excitação 2-251 da fonte de excitação 2-250 é orientada para a cavidade de amostra 2-211 com o uso de componentes do instrumento 2-120 e componentes do chip de teste 2-110. Esta seção descreve os componentes do chip de teste 2-110 que podem ajudar no acoplamento de energia de excitação 2-251 à cavidade de amostra 2-211.
[000303] O acoplamento de energia de uma fonte de excitação a uma cavidade de amostra pode ser melhorado ou afetado formando-se estruturas de acoplamento por excitação dentro e/ou adjacentes a uma cavidade de amostra. As estruturas de acoplamento por excitação podem compreender estruturas de escala micro ou nano fabricadas ao redor de uma cavidade de amostra em algumas modalidades, ou pode compreender estruturas ou partículas formadas em uma cavidade de amostra em algumas modalidades. As estruturas de acoplamento por excitação podem afetar a excitação radioativa de uma amostra em algumas implantações, e podem afetar a excitação não radioativa de uma amostra em algumas implantações. Em diversas modalidades, as estruturas de acoplamento por excitação radioativas podem aumentar uma intensidade de energia de excitação dentro de uma região de excitação de uma cavidade de amostra. As estruturas de acoplamento por excitação não radioativas podem intensificar e/ou alterar trajetórias de transferências de energia não radioativa de uma fonte de excitação (que pode ser radioativa ou não radioativa) para uma amostra.
C. ESTRUTURAS DE ACOPLAMENTO POR EXCITAÇÃO RADIOATIVA
[000304] Existem inúmeros tipos diferentes de estruturas de acoplamento por excitação radioativas que podem ser usadas para afetar o acoplamento de energia de excitação de uma fonte de excitação para uma região de excitação dentro de uma cavidade de amostra. Algumas estruturas de acoplamento radioativo podem ser formadas por um condutor (por exemplo, incluir uma camada de metal), e sustentar oscilações de plasmon de superfície que afetam localmente a energia de excitação (por exemplo, alterar localmente um campo eletromagnético) próximas e/ou dentro da cavidade de amostra. Em alguns casos, estruturas de plasmon de superfície podem intensificar a energia de excitação dentro de uma região de excitação da cavidade de amostra por um fator de dois ou mais. Algumas estruturas de acoplamento radioativo podem alterar a fase e/ou amplitude de um campo de excitação para intensificar a energia de excitação dentro de uma cavidade de amostra. Diversas modalidades de estruturas de acoplamento por excitação radioativas são descritas nesta seção.
[000305] A Figura 4-1A retrata apenas um exemplo de uma estrutura de plasmon de superfície 4-120 que pode ser usada para intensificar o acoplamento de energia de excitação em uma cavidade de amostra. O desenho retrata uma vista plana de uma região ao redor de uma estrutura de plasmon de superfície 4-120, e representa os resultados de uma simulação numérica de intensidade de campo elétrico ao redor da estrutura. O desenho retrata uma estrutura de plasmon de superfície que compreende três recursos triangulares que tem ápices agudos que estão localizados em proximidade a uma cavidade de amostra (não mostrada). De acordo com algumas modalidades, uma estrutura de plasmon de superfície pode compreender um metal ou condutor (por exemplo, uma película fina padronizada de qualquer um ou uma combinação dos seguintes metais ou ligas de metal: Al, Au, Ag, Ti, TiN). Uma espessura da película pode estar entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 100 nm em algumas modalidades, embora outras espessuras possam ser usadas em outras modalidades. Uma estrutura de plasmon de superfície, em algumas modalidades, pode incluir recursos agudos 4-110 localizados em proximidade a uma cavidade de amostra (por exemplo, dentro de cerca de 100 nm).
[000306] A Figura 4-1B retrata uma vista em elevação em corte transversal da estrutura de plasmon de superfície da Figura 4-1A, tomada na linha tracejada. A simulação mostra uma região de alta intensidade localizada 4-505 da energia de excitação adjacente a um ápice de um triângulo da estrutura de plasmon de superfície. Para essa simulação, a estrutura de plasmon de superfície 4-120 estava localizada em uma camada dielétrica 4-135 (dióxido de silício). A estrutura de plasmon de superfície deriva energia de um campo evanescente da guia de onda, e intensifica a intensidade na cavidade de amostra.
[000307] Em algumas modalidades, a intensificação de energia de excitação por uma estrutura de plasmon de superfície pode estar localizada a uma extensão que uma cavidade de amostra profunda 2211 não seja necessária. Por exemplo, se uma região de alta intensidade 4-505 for formada tendo um diâmetro de aproximadamente 100 nm com um valor de intensidade de pico maior que cerca de 80% da intensidade fora da região, então, uma cavidade de amostra profunda pode não ser necessária. Apenas as amostras dentro da região de alta intensidade 4-505 contribuiriam emissão apreciável para propósitos de detecção.
[000308] Quando um campo eletromagnético incidente interage com uma estrutura de plasmon de superfície, as correntes de onda de superfície são geradas na estrutura. O formato da estrutura pode afetar a intensidade e a distribuição desses plasmons de superfície. Essas correntes localizadas podem interagir e alterar e intensificar de modo significativo o campo eletromagnético incidente na vizinhança imediata da estrutura de plasmon de superfície, por exemplo, conforme retratado pela região de alta intensidade 4-505 na Figura 4-1B. Em algumas modalidades, um emissor (por exemplo, uma etiqueta fluorescente) que emite energia próximo a uma estrutura de plasmon de superfície pode ter sua emissão alterada pela estrutura, de modo a alterar um padrão de radiação de campo distante do emissor.
[000309] Outra modalidade de uma estrutura de plasmon de superfície 4-122 é retratada na vista plana da Figura 4-1C. Uma estrutura de gravata borboleta ilustrada compreende duas estruturas metálicas triangulares localizadas adjacentes a uma cavidade de amostra 2-211. As estruturas podem ser padronizadas abaixo de uma cavidade de amostra, por exemplo, e/ou adjacente uma região de excitação da cavidade de amostra. Pode existir uma lacuna 4-127 entre a cavidade de amostra e recursos agudos 4-125 da estrutura de plasmon de superfície, em algumas implantações. A lacuna 4-127 pode ser de entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 200 nm, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, a lacuna 4-127 pode ser de entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 100 nm. Os recursos agudos 4-125 pode compreender uma ponta ou flexão acentuada em uma borda da estrutura de plasmon de superfície, conforme retratado no desenho. Os recursos agudos podem ter qualquer formato adequado. Em algumas modalidades, um raio de flexão de um recurso agudo 4-125 pode ser menos de aproximadamente cinco comprimentos de onda associado à energia de excitação incidente. Em algumas modalidades, um raio de flexão de um recurso agudo 4-125 pode ser menos de aproximadamente dois comprimentos de onda associado à energia de excitação incidente. Em algumas modalidades, um raio de flexão de um recurso agudo 4-125 pode ser menos de aproximadamente cinco comprimentos de onda associado a uma onda de plasmon de superfície que é excitada pela energia de excitação incidente. Em algumas modalidades, um raio de flexão de um recurso agudo 4-125 pode ser menos de aproximadamente dois comprimentos de onda associado a uma onda de plasmon de superfície que é excitada pela energia de excitação incidente.
[000310] De acordo com algumas modalidades, as estruturas de plasmon de superfície 4-122 podem ser padronizadas dentro de uma cavidade de amostra 2-211 conforme ilustrado na vista em elevação da Figura 4-1D. Em algumas modalidades, uma estrutura de plasmon de superfície dentro de a cavidade de amostra pode compreender um ou mais dedos (por exemplo, dedos metálicos) padronizados em paredes laterais da cavidade de amostra, conforme retratado no desenho. A Figura 4-1E retrata uma vista plana da cavidade de amostra 2-211 que mostra as estruturas de plasmon de superfície 4-122 formadas em paredes laterais dentro da cavidade de amostra. Em algumas modalidades, as extremidades inferiores dessas estruturas de plasmon de superfície 4-122 de recursos ou flexões agudas em que o campo eletromagnético será intensificado. As estruturas de plasmon de superfície 4-122 podem se estender, ou não, a uma base da cavidade de amostra.
[000311] Em algumas modalidades, as estruturas de plasmon de superfície 4-122 podem ser dispostas para afetar a polarização da energia de excitação e/ou energia emitida da cavidade de amostra. Por exemplo, um padrão conforme retratado na Figura 4-1E pode ser usado para afetar uma orientação preferencial de polarização de excitação linear ou elíptica e/ou uma orientação preferencial de polarização linear ou elíptica de um emissor dentro da cavidade de amostra.
[000312] As estruturas de plasmon de superfície podem ser padronizadas em formatos que não sejam aquelas retratadas na Figura 4-1A até a Figura 4-1E. Por exemplo, estruturas de plasmon de superfície podem ser padronizadas como estruturas regulares ou periódicas, conforme retratado na Figura 4-2A, de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, uma estrutura de plasmon de superfície que pode ser padronizada é uma matriz de recursos salientes 4-210 em uma superfície inferior de um material 2-221 no qual a cavidade de amostra 2-211 é formada. As estruturas de plasmon de superfície periódicas podem ser formadas em uma matriz regular, por exemplo, uma grade, uma grelha, uma treliça, uma grade circular, uma grade espiral, uma grade elíptica ou qualquer outra estrutura adequada. Pode existir um espaçamento substancialmente uniforme s entre as saliências 4-210 de uma estrutura de plasmon de superfície. Em algumas implantações, o espaçamento s pode ter qualquer valor entre aproximadamente 40 nm e aproximadamente 250 nm. De acordo com algumas modalidades, as saliências podem ter uma altura h entre aproximadamente 20 nm e aproximadamente 100 nm. Em algumas implantações, o espaçamento s pode ser não uniforme ou pode ser chiado (que tem um valor decrescente em distâncias radiais maiores). Em algumas modalidades, as saliências 4-210 de uma estrutura de plasmon de superfície podem ser padronizadas como uma placa de zona Fresnel. De acordo com algumas modalidades, uma estrutura de plasmon de superfície de 4-210 pode ser formada adjacente a uma camada transparente e/ou camada dielétrica 3-235. Em algumas modalidades, o espaçamento entre as saliências 4-210 pode ser periódico, enquanto em outras modalidades as saliências 4-210 podem ser aperiódicas.
[000313] Em algumas implantações, uma estrutura de plasmon de superfície 4-212 pode ser separada de um material 2-221 no qual a cavidade de amostra é formada conforme retratado na Figura 4-2B. Por exemplo, pode haver uma camada dielétrica intermediária 4-247 entre a estrutura de plasmon de superfície 4-212 e o material 4-230. De acordo com algumas modalidades, uma estrutura de plasmons de superfície 4-212 pode estar localizada adjacente a uma concavidade 3216 de uma cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 4-2B. Por exemplo, uma estrutura de plasmon de superfície 4-212 pode estar localizada adjacente a paredes laterais de uma concavidade 3-216, conforme retratado na Figura 4-2B.
[000314] A Figura 4-2C ilustra uma estrutura de plasmon de superfície 4-214 que é formada como uma grade circular concêntrica. A estrutura 4-214 pode compreender anéis condutores concêntricos 4-215, de acordo com algumas modalidades. Os anéis podem ser separados por um espaçamento regular s e têm uma altura h, conforme descrito em conexão com a Figura 4-2A. De acordo com algumas modalidades, uma cavidade de amostra 4-210 com uma concavidade opcional pode estar localizada em um centro dos anéis. A grade circular pode ser padronizada adjacente à base da cavidade de amostra.
[000315] Uma periodicidade de uma estrutura de plasmon de superfície pode ser selecionada para formar uma estrutura ressonante de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, um espaçamento s de uma estrutura de plasmon de superfície pode ser selecionado como aproximadamente meio comprimento de onda de uma onda de plasmon de superfície que é gerada na estrutura pela energia de excitação. Quando formada como uma estrutura ressonante, uma estrutura de plasmon de superfície pode acumular e ressonar a energia de excitação ao longo da direção da estrutura de plasmon de superfície periódica. Tal comportamento ressonante pode intensificar a energia eletromagnética dentro de uma cavidade de amostra, ou adjacente à cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 4-2D. Embora o espaçamento da estrutura de plasmon de superfície possa ser periódico em algumas modalidades, em outras modalidades, o espaçamento pode ser aperiódico. O uso de espaçamento aperiódico permite que a intensificação de campo seja projetada de modo específico para os comprimentos de onda de energia de excitação e os comprimentos de onda de energia de emissão envolvidos. A Figura 4-2D representa resultados de campo eletromagnético simulados de modo numérico na base da cavidade de amostra e ao redor de uma estrutura de plasmon de superfície periódica. A estrutura de plasmon de superfície 4-216 está localizada adjacente ao material 2-221 no qual a cavidade de amostra é mostrada, e é adjacente a uma base de uma cavidade de amostra 2211. A estrutura de plasmon de superfície pode estar na forma de uma grade ou grade circular que se repete a intervalos de espaçamento regulares ou irregulares em regiões longe da cavidade de amostra e fora da região simulada. Por exemplo, pode haver entre três e cinquenta saliências de grade repetidas da estrutura de plasmon de superfície 4216. Uma região de alta intensidade 4-240 pode ser vista na base da cavidade de amostra 2-211. A intensidade dentro dessa região foi intensificada por mais de um fator de 2 sobre a região circundante imediatamente abaixo da estrutura de plasmon de superfície.
[000316] A Figura 4-2E retrata, em vista em elevação, uma modalidade alternativa de uma estrutura de plasmon de superfície ressonante 4-218. De acordo com algumas modalidades, uma estrutura de plasmon de superfície pode ser formada como padrões de grade ou grelha periódicos ou aperiódicos, e pode ser padronizada em múltiplas camadas 4-247. Uma cavidade de amostra 2-211 pode ser padronizada através das múltiplas camadas 4-247 e dentro da estrutura de plasmon de superfície ressonante 4-218, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, a estrutura de plasmon de superfície ressonante pode compreender elementos condutores discretos 4-222 é retratada na vista plana da Figura 4-2F. Em algumas implantações, uma estrutura de plasmon de superfície ressonante pode compreender um padrão de treliça contínuo 4-250, conforme retratado na Figura 4-2G. Uma carga dielétrica 4-252 pode estar localizada em espaços vazios do material condutor 4-250 e uma cavidade de amostra 2-211 pode estar localizada com um espaço vazio.
[000317] Existe uma variedade de estruturas de plasmon de superfície diferentes que pode ser usada para intensificar o acoplamento em uma cavidade de amostra ou para afetar a emissão de uma amostra dentro da cavidade de amostra. A Figura 4-2H retrata, em vista plana, ainda uma modalidade alternativa da estrutura de plasmon de superfície. Uma vista em corte transversal da estrutura é retratada na Figura 4-2I tomada através da linha 4-2I da Figura 4-2H. De acordo com algumas implantações, uma estrutura de plasmon de superfície pode compreender uma matriz de discos 4-260 distribuída ao redor de uma cavidade de amostra 2-211. Em algumas modalidades, cada disco 4260 pode estar a aproximadamente uma distância R da cavidade de amostra 2-211. Entretanto, conforme ilustrado, a distância de cada disco 4-260 até a cavidade de amostra 2-211 pode variar. Também, o tamanho de cada disco 4-260 pode ser diferente. Em algumas implantações, em vez de usar discos condutores 4-260, uma estrutura de plasmon de superfície pode compreender uma camada condutora através da qual um padrão distribuído de furos é formado. Tal estrutura pode ser referida como uma "nanoantena".
[000318] Uma variedade de processos diferentes pode ser usada para padronizar estruturas de plasmon de superfície adjacentes a uma cavidade de amostra. A Figura 4-3A a Figura 4-5E retratam estruturas associadas a etapas de processo que podem ser usadas para formar estruturas de plasmon de superfície adjacentes a uma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades. Referindo-se agora à Figura 4-3A, um processo para formar uma estrutura de plasmon de superfície pode compreender formar uma camada de resistência 4-310 em um revestimento antirreflexivo (ARC) 4-320 em uma camada de mascaramento 4-330. As camadas podem ser dispostas em uma camada dielétrica transparente 3-235, de acordo com algumas implantações. A camada de resistência 4-310 pode compreender uma fotorresistência ou uma resistência de feixe de elétrons ou íons que pode ser padronizada de modo litográfico. A camada de mascaramento 4-330 pode compreender uma máscara rígida formada por um material inorgânico (por exemplo, nitreto de silício ou sílica, ou qualquer outro material adequado), de acordo com algumas modalidades.
[000319] Em algumas implantações, um processo fotolitográfico pode ser usado para padronizar a resistência 4-310 conforme retratado na Figura 4-3B. O padrão selecionado pode compreender um gabarito de saliências ou furos que será usado para formar uma estrutura de plasmon de superfície desejada. Após o desenvolvimento da resistência 4-310, as regiões do ARC serão expostas, e o padrão pode ser gravado na camada de ARC 4-320 e, então, na camada de mascaramento 4330. A resistência e o ARC podem ser esvaziados do substrato, e uma estrutura resultante pode aparecer conforme mostrado na Figura 4-3C. A camada de mascaramento 4-330 pode ser usada, então, como uma máscara de gravação, para que o padrão possa ser transferido para a camada dielétrica subjacente 3-235 por meio de uma gravação anisotrópica seletiva, conforme retratado na Figura 4-3D.
[000320] Um material condutor 2-221, ou uma camada de materiais que compreende um condutor, pode ser depositada, então, sobre a região, conforme ilustrado na Figura 4-3E. Qualquer material condutor adequado pode ser usado para formar uma estrutura de plasmon de superfície, esteja o mesmo depositado ou não como uma camada separada do material 2-221. Por exemplo, em alguns casos, um primeiro material condutor pode estar depositado como uma camada-base de material 2-221 na qual uma estrutura de plasmon de superfície é formada. Os exemplos de materiais que podem ser usados para formar uma estrutura de plasmon de superfície incluem, mas não estão limitados a, Au, Al, Ti, TiN, Ag, Cu e camadas de combinação ou ligas dos mesmos.
[000321] O material 2-221, ou camada de materiais, pode ser depositado por qualquer processo de depósito adequado, incluindo, mas não limitado a, um processo de depósito físico ou um processo de depósito de vapor químico. Em algumas modalidades, o material 2-221 pode ter uma espessura entre aproximadamente 80 nm e aproximadamente 300 nm. Em algumas implantações, o material 2-221 pode ser aplanado (por exemplo, com o uso de um processo de CMP), embora a aplanação não seja necessária. Uma cavidade de amostra pode ser formada no material 2-221 com o uso de qualquer processo adequado descrito no presente documento em conexão com a fabricação de uma cavidade de amostra.
[000322] Os inventores reconheceram que formar uma estrutura de plasmon de superfície de acordo com as etapas mostradas na Figura 4- 3A à Figura 4-3E pode exigir o alinhamento preciso da cavidade de amostra à estrutura de plasmon de superfície. Por exemplo, uma estrutura de plasmon de superfície que compreende uma grade concêntrica, conforme retratado na Figura 4-2C, pode exigir o alinhamento preciso da cavidade de amostra 2-211 ao centro da estrutura de plasmon de superfície 4-214. Para evitar as dificuldades de fabricação associadas a tal alinhamento preciso, os processos de autoalinhamento retratados na Figura 4-4A à Figura 4-5E podem ser usados.
[000323] Referindo-se agora à Figura 4-4A, um processo para formar uma estrutura de plasmon de superfície e uma cavidade de amostra que seja autoalinhada à estrutura de plasmon de superfície pode compreender formar uma camada de mascaramento 4-410 em uma camada dielétrica transparente 3-235. A camada de mascaramento pode compreender uma máscara rígida formada por um material inorgânico, como nitreto de silício ou sílica, de acordo com algumas modalidades. Uma espessura da camada de mascaramento 4-410 pode ser aproximadamente igual a uma altura desejada de uma cavidade de amostra 2-212. Por exemplo, a espessura da camada de mascaramento estar entre aproximadamente 50 nm e aproximadamente 200 nm, de acordo com algumas modalidades, embora outras espessuras possam ser usadas em outras modalidades.
[000324] A camada de mascaramento 4-410 pode ser padronizada para criar espaços vazios 4-430 que têm o padrão desejado de uma estrutura de plasmon de superfície que será padronizada na camada dielétrica 3-235. A padronização da camada de mascaramento 4-410 pode ser feita com qualquer processo de litografia adequado (por exemplo, fotolitografia, litografia por feixe de elétrons, litografia por feixe de íons, litografia por EUV, litografia por raios-X). A estrutura resultante pode aparecer conforme mostrado na Figura 4-4B. A estrutura pode incluir um pilar central 4-420, que será usado de modo subsequente para formar a cavidade de amostra autoalinhada.
[000325] Uma resistência 4-440 (por exemplo, uma fotorresistência) pode ser padronizada, então, sobre a camada de mascaramento padronizada 4-410, conforme retratado na Figura 4-4C. O alinhamento para padronizar a resistência 4-440 (por exemplo, máscara ao alinhamento de substrato) não precisa ser altamente preciso, e exige apenas que a resistência 4-440 cubra um pilar central 4-420 e não cubra espaços vazios 4-430 que serão usados para formar a estrutura de plasmon de superfície.
[000326] Uma gravação anisotrópica seletiva pode ser usada, então, para gravar a camada dielétrica 3-235 e transferir o padrão da estrutura de plasmon de superfície no dielétrico, conforme retratado na Figura 44D de acordo com algumas modalidades. Uma gravação isotrópica seletiva pode ser usada, então, para remover as porções expostas da camada de mascaramento 4-410. A gravação isotrópica pode ser uma gravação úmida, por exemplo, embora uma gravação seca isotrópica possa ser usada em algumas modalidades. Devido ao fato da resistência 4-440 cobrir o pilar central 4-420, o pilar central não será gravado e permanecerá no substrato, conforme retratado na Figura 4- 4E. A resistência 4-440 pode ser esvaziada, então, do substrato, expondo o pilar 4-420, conforme retratado na Figura 4-4F.
[000327] De acordo com algumas modalidades, um material condutor de metal 2-221, ou uma pilha de materiais que inclui um material condutor, pode ser depositada, então, sobre a região conforme ilustrado na Figura 4-4G. O pilar central 4-420 e uma capa de material depositado sobre o pilar podem ser removidos, então, por uma gravação úmida seletiva do pilar, o que levanta a capa. A remoção do pilar central deixa uma cavidade de amostra que é autoalinhada à estrutura de plasmon de superfície subjacente 4-450.
[000328] Um processo alternativo pode ser usado para formar uma cavidade de amostra que é autoalinhada a uma estrutura de plasmon de superfície, e é retratada na Figura 4-5A à Figura 4-5E. De acordo com algumas modalidades, uma ou mais camadas condutoras 4-510, 4520 podem ser padronizadas em uma camada dielétrica transparente 3235 com o uso de qualquer processo de litografia adequado, conforme retratado na Figura 4-5A. Em algumas implantações, uma primeira camada 4-510 pode compreender alumínio, e uma segunda camada 4520 pode compreender nitreto de titânio, embora outras combinações de material possam ser usadas em diversas modalidades. Uma espessura total das uma ou mais camadas pode ser aproximadamente equivalente a uma altura desejada da cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades. A padronização pode formar uma cavidade de amostra 2-211, e espaços vazios 4-525 adjacentes à cavidade de amostra nas uma ou mais camadas de metal. Os espaços vazios podem ser dispostos no padrão de uma estrutura de plasmon de superfície desejada.
[000329] Em algumas implantações, a camada dielétrica 3-235 pode ser gravada para transferir o padrão da estrutura de plasmon de superfície e a cavidade de amostra 2-211 na camada dielétrica para formar espaços vazios dielétricos 4-530, conforme retratado na Figura 4-5B. A profundidade de gravura dos espaços vazios dielétricos 4-530 pode ser de entre aproximadamente 20 nm e aproximadamente 150 nm, de acordo com algumas modalidades. Uma resistência 4-440 pode ser padronizada para cobrir a cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 4-5C. O alinhamento para a padronização da resistência não precisa ser altamente preciso, e precisa cobrir apenas a cavidade de amostra sem cobrir regiões gravadas adjacentes da camada dielétrica 3-235 que serão usadas para formar a estrutura de plasmon de superfície.
[000330] Conforme ilustrado na Figura. 4-5D, um material condutor 4512, ou camadas de materiais que incluem um condutor, pode ser depositado sobre a região com o uso de qualquer processo de depósito adequado. O material 4-512 pode preencher as regiões gravadas da camada dielétrica, e pode se estender acima das uma ou mais camadas 4-510, 4-520. A resistência 4-440 e o material que cobre a resistência podem ser removidos, então, de acordo com um processo de levantamento. A estrutura resultante, mostrada na Figura 4-5E, deixa uma cavidade de amostra que é autoalinhada à estrutura de plasmon de superfície circundante. A cavidade de amostra inclui uma concavidade 3-216.
[000331] Em algumas modalidades, o processo retratado na Figura 4- 5A à Figura 4-5E pode ser usado para formar uma cavidade de amostra que não tem uma concavidade 3-216. Por exemplo, a resistência 4-440 pode ser padronizada sobre a cavidade de amostra 2-211 antes da camada dielétrica 3-235 ser gravada. A camada dielétrica 3-235, então, pode ser gravada, o que transferirá o padrão da estrutura de plasmon de superfície para a camada dielétrica, mas não formará uma concavidade. O processo, então, pode prosseguir conforme ilustrado na Figura 4-5D e na Figura 4-5E para criar uma cavidade de amostra autoalinhada que não tem concavidade.
[000332] Outras estruturas, além ou como alternativa às estruturas de plasmon de superfície, podem ser padronizadas na vizinhança da cavidade de amostra 2-211 para aumentar a energia de excitação dentro da cavidade de amostra. Por exemplo, algumas estruturas podem alterar a fase e/ou a amplitude do campo de excitação incidente de modo a aumentar a intensidade da energia de excitação dentro da cavidade de amostra. A Figura 4-6A retrata uma película com perda fina 4-610 que pode ser usada para alterar a fase e a amplitude de energia da excitação incidente e aumentar a intensidade de radiação eletromagnética dentro da cavidade de amostra.
[000333] De acordo com algumas modalidades, uma película com perda fina 4-610 pode criar interferência construtiva da energia de excitação, o que resulta na intensificação de campo dentro de uma região de excitação da cavidade de amostra. A Figura 4-6B retrata uma simulação numérica de energia de excitação incidente em uma cavidade de amostra em que a película com perda fina 4-610 foi formada imediatamente adjacente à cavidade de amostra. Para a simulação, a cavidade de amostra tem um diâmetro de aproximadamente 80 nm e é formada em uma camada metálica de outro de aproximadamente 200 nm de espessura. A cavidade de amostra compreende um SCN, e suprime a propagação de energia de excitação através da cavidade de amostra. A película com perda fina 4-610 tem aproximadamente 10 nm de espessura, é formada por germânio, e cobre um dielétrico transparente subjacente que compreende dióxido de silício. A película com perda fina se estende ao longo de uma passagem de entrada da cavidade de amostra. A simulação mostra que a intensidade da energia de excitação é um valor mais alto possível na passagem de entrada da cavidade de amostra. A intensidade da energia de excitação nessa região clara 4-620 é mais do que o dobro do valor da intensidade à esquerda e à direita da cavidade de amostra.
[000334] Uma película com perda fina pode ser feita de qualquer material adequado. Por exemplo, uma película com perda fina pode ser feita de um material em que o índice de refração n é aproximadamente da mesma ordem de magnitude que o coeficiente de extinção k para o material. Em algumas modalidades, uma película com perda fina pode ser feita de um material em que o índice de refração n está dentro de cerca de duas ordens de magnitude de diferença do valor do coeficiente de extinção k do material. Os exemplos não imitantes de tais materiais em comprimentos de onda visíveis são germânio e silício.
[000335] Uma película com perda fina pode ter qualquer espessura adequada, que pode depender de um comprimento (ou comprimentos) de onda característico associado à fonte (ou fontes) de excitação. Em algumas modalidades, uma película com perda fina pode ter entre aproximadamente 1 nm e aproximadamente 45 nm de espessura. Em outras modalidades, uma película com perda fina pode ter entre aproximadamente 15 nm e aproximadamente 45 nm de espessura. Em ainda outras modalidades, uma película com perda fina pode ter entre aproximadamente 1 nm e aproximadamente 20 nm de espessura.
[000336] Os efeitos de uma película com perda fina na refletância do material 2-221 no qual uma cavidade de amostra é formada, a perda de energia de excitação dentro da película com perda fina e a perda de energia de excitação dentro do material 2-221 são mostrados no gráfico da Figura 4-6C. Uma curva plotada no gráfico representa uma curva de refletância 4-634, e mostra como a refletância do material 2-221 e a película com perda fina 4-610 variam conforme a espessura da película com perda fina muda de 0 nm para 100 nm. A refletância alcança um valor mínimo em cerca de 25 nm, de acordo com a modalidade simulada. O mínimo de refletância ocorrerá em diferentes espessuras dependendo de um comprimento de onda característico da energia de excitação e dos materiais usados para a película com perda fina e o material 2-221. Em algumas implantações, uma espessura de película com perda fina é selecionada de modo que a refletância seja aproximadamente em seu valor mínimo. A curva 4-632 representa a perda na película como uma função da espessura de película fina, e a curva 4-636 representa a perda no metal como uma função da espessura de película fina.
[000337] Em algumas modalidades, uma película com perda fina 4610 pode estar espaçada de uma cavidade de amostra 2-211 e do material 2-221, conforme retratado na Figura 4-6D. Por exemplo, uma camada dielétrica fina 4-620 (por exemplo, um óxido de silício SiOx) pode ser formado sobre uma película com perda fina, e uma cavidade de amostra 2-211 pode ser formada adjacente à camada dielétrica 4620. Uma espessura da camada dielétrica 4-620 pode estar entre aproximadamente 10 nm e aproximadamente 150 nm de acordo com algumas modalidades, embora outras espessuras possam ser usadas em algumas modalidades.
[000338] Embora retratada como uma única camada, uma película com perda fina pode compreender múltiplas camadas de dois ou mais materiais. Em algumas implantações, uma pilha de múltiplas camadas que compreende camadas alternadas de uma película com perda fina 4-610 e uma camada dielétrica 4-620 pode ser formada adjacente a uma cavidade de amostra 2-211, conforme retratado na Figura 4-6E. Uma espessura de uma película com perda fina 4-610 em uma pilha de camadas pode estar entre aproximadamente 5 nm e aproximadamente 100 nm, e uma espessura de uma camada dielétrica 4-620 dentro da pilha pode estar entre aproximadamente 5 nm e aproximadamente 100 nm, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, a pilha de múltiplas camadas pode compreender uma camada de dióxido de silício (4,2 nm de espessura), uma camada de silício (14,35 nm de espessura) e uma camada de germânio (6,46 nm de espessura), embora outras espessuras possam ser usadas em outras modalidades. Em algumas implantações, a pilha de múltiplas camadas pode compreender uma camada de dióxido de silício (aproximadamente 4,2 nm de espessura), uma camada de silício (aproximadamente 14,4 nm de espessura) e uma camada de germânio (aproximadamente 6,5 nm de espessura), embora outras espessuras possam ser usadas em outras modalidades.
[000339] Uma película com perda fina pode ser fabricada a partir de qualquer material adequado que exiba pelo menos alguma perda à radiação incidente. Em algumas modalidades, uma película com perda fina pode compreender um material semicondutor, por exemplo silício e germânio, embora outros materiais possam ser usados. Em algumas implantações, uma película com perda fina pode compreender material inorgânico ou um metal. Em algumas modalidades, uma película com perda fina pode compreender um semicondutor de liga ou composto. Por exemplo, uma película com perda fina pode compreender uma liga que inclui Si (57,4% em peso), Ge (25,8% em peso) e SiO2 (16,8% em peso), embora outras razões e composições possam ser usadas em outras modalidades.
[000340] De acordo com algumas modalidades, uma película com perda fina pode ser formada no substrato com o uso de qualquer processo de deposição de cobertor adequado, por exemplo, um processo de depósito físico, um processo de depósito de vapor químico, uma rotação no processo, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, a película com perda fina pode ser tratada após o depósito, por exemplo, aquecida, anelada e/ou submetida à implantação de íon.
[000341] Outras estruturas de alteração de fase/amplitude podem ser usadas adicional ou alternativamente para intensificar a energia de excitação dentro da cavidade de amostra. De acordo com algumas implantações e conforme mostrado na Figura 4-7A, uma pilha refletora 4-705 pode ser espaçada de uma cavidade de amostra 2-211. Em algumas modalidades, uma pilha refletora pode compreender uma pilha de materiais dielétricos que têm índices alternados de refração. Por exemplo, uma primeira camada dielétrica 4-710 pode ter um primeiro índice de refração, e uma segunda camada dielétrica 4-720 podem ter um segundo índice de refração diferente do primeiro índice de refração. A pilha refletora 4-705 pode exibir uma refletividade alta para a energia de excitação em algumas modalidades, e exibir uma refletividade baixa para a emissão radioativa de um emissor dentro da cavidade de amostra. Por exemplo, uma pilha refletora 4-705 pode exibir uma refletividade maior que aproximadamente 80% para a energia de excitação e uma refletividade menor que aproximadamente 40% para a emissão de uma amostra, embora outros valores de refletividade possam ser usados em algumas modalidades. Uma camada dielétrica 4-730 que transmite a energia de excitação pode estar localizada entre a pilha refletora e a cavidade de amostra.
[000342] De acordo com algumas implantações, uma pilha refletora 4705 retratada na Figura 4-7A pode formar um ressonador com o material 2-221 no qual a cavidade de amostra 2-211 é formada. Por exemplo, a pilha refletora pode ser espaçada do material 2-221 por uma distância que é aproximadamente igual a metade do comprimento de onda da energia de excitação dentro do material dielétrico 4-730 ou um múltiplo de número inteiro do mesmo. Formando-se um ressonador, a energia de excitação pode atravessar a pilha refletora, ressonar e se acumular no espaço entre o material 2-221 e a pilha refletora 4-705. Isso pode aumentar a intensidade de excitação dentro da cavidade de amostra 2211. Por exemplo, a intensidade pode aumentar dentro da estrutura ressonante por mais de um fator de 2 em algumas modalidades, e mais de um fator de 5 em algumas modalidades, e ainda mais que um fator de 10 em algumas modalidades.
[000343] Estruturas adicionais podem ser adicionadas na vizinhança da cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 4-7B e na Figura 4-7C. De acordo com algumas modalidades, uma tomada dielétrica 4740 que tem um primeiro índice de refração que é maior que um segundo índice de refração da camada dielétrica 4-730 pode ser formada adjacente à cavidade de amostra 2-211, conforme retratado na Figura 4-7B. O plugue pode estar no formato de um cilindro que tem um diâmetro aproximadamente igual àquele da cavidade de amostra, embora outros formatos e tamanhos possam ser usados. Devido ao fato de seu índice refrativo maior, a tomada dielétrica 4-740 pode condensar e orientar a energia de excitação em direção à cavidade de amostra.
[000344] Uma estrutura dielétrica, como a tomada 4-740, pode ser usada com ou sem uma pilha refletora 4-705, de acordo com algumas modalidades. Tal estrutura dielétrica pode ser referida como uma antena ressonante dielétrica. A antena ressonante dielétrica pode ter qualquer formato adequado, por exemplo, cilíndrico, retangular, quadrado, poligonal, trapezoidal ou pirâmide.
[000345] A Figura 4-7C e a Figura 4-7D retratam uma lacuna na estrutura de banda fotônica (PBG) que pode ser formada na vizinhança de uma cavidade de amostra 2-211, de acordo com algumas modalidades. Uma estrutura de lacuna na banda fotônica pode compreender uma matriz regular ou treliça de estruturas de contraste óptico 4-750. As estruturas de contraste óptico podem compreender um material dielétrico que tem um índice refrativo que é diferente de um índice refrativo do material dielétrico circundante, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, as estruturas de contraste óptico 4-750 podem ter um valor de perda que é diferente do meio circundante. Em algumas implantações, uma cavidade de amostra 2-211 pode estar localizada em um defeito na treliça conforme retratado na Figura 4-7D. De acordo com diversas modalidades, o defeito na treliça fotônica pode confinar fótons dentro da região do defeito e pode intensificar a intensidade da energia de excitação na cavidade de amostra. O confinamento devido à estrutura de lacuna na banda fotônica pode ser substancialmente em duas dimensões transversais a uma superfície do substrato. Quando combinado com a pilha refletora 4-705, o confinamento pode ser em três dimensões na cavidade de amostra. Em algumas modalidades, uma estrutura de lacuna na banda fotônica pode ser usada sem uma pilha refletora.
[000346] Diversos métodos foram contemplados para fabricar as estruturas de acoplamento por excitação retratadas na Figura 4-6A à Figura 4-7D. As estruturas que exigem películas planas finas (por exemplo, películas dielétricas de índice refrativo alternante) podem ser formadas por processos de depósito planos, de acordo com algumas modalidades. Os processos de depósito planos podem compreender o depósito físico (por exemplo, evaporação ou crepitação de feixe de elétrons) ou processos de depósito de vapor químico. As estruturas que exigem dielétricos embutidos discretos formados em formatos tridimensionais, como uma antena ressonante dielétrica 4-740 mostrada na Figura 4-7B ou as estruturas de contraste óptico 4-750 mostradas na Figura 4-7C, podem ser formadas com o uso de processos de padronização e gravação litográfica para gravar o padrão no substrato, e com o uso de depósito subsequente de uma camada dielétrica, e uma aplanação do substrato, por exemplo. Também são contempladas técnicas de processamento de autoalinhamento para formar antenas ressonantes dielétricas assim como estruturas de lacuna na banda fotônica na vizinhança da cavidade de amostra 2-211.
[000347] A Figura 4-8A à Figura 4-8G retratam estruturas associadas a etapas de processo para apenas um processo de autoalinhamento que pode ser usado para formar uma estrutura de lacuna na banda fotônica e uma cavidade de amostra autoalinhada conforme ilustrado na Figura 4-7C. De acordo com algumas modalidades, uma pilha refletora 4-705 pode ser formada primeiro em um substrato acima de uma camada dielétrica 3-235, conforme ilustrado na Figura 4-8A. Uma segunda camada dielétrica 4-730 pode ser depositada, então, sobre a pilha refletora. A espessura da camada dielétrica 4-730 pode ser aproximadamente igual a cerca de metade de um comprimento de onda da energia de excitação no material, ou um múltiplo de número inteiro do mesmo. As etapas de processo descritas em conexão com a Figura 4-4A à Figura 4-4E pode ser executada, então, para formar um pilar 4-420 acima da camada dielétrica 4-730 e um padrão de recursos gravados 4-810 para a estrutura de lacuna na banda fotônica. Os recursos gravados podem se estender na camada dielétrica 4-730 e opcionalmente na pilha refletora 4-705. A estrutura resultante pode aparecer conforme mostrado na Figura 4-8A.
[000348] Uma resistência 4-440 que cobre o pilar 4-420 pode ser esvaziada do substrato e um depósito isolante realizado para preencher os recursos gravados com um material de preenchimento 4-820, conforme retratado na Figura 4-8B. O material de preenchimento 4-820 pode ser o mesmo material que é usado para formar o pilar 4-420, de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, o material de preenchimento 4-820 e o pilar 4-420 pode ser formado por nitreto de silício e a camada dielétrica 4-730 pode compreender um óxido, por exemplo, SiO2.
[000349] Uma gravação anisotrópica, então, pode ser executada para gravar de volta o material de preenchimento 4-820. O material de preenchimento pode ser gravado de volta para expor uma superfície da camada dielétrica 4-730, de acordo com algumas modalidades, o que resulta em uma estrutura conforme retratado na Figura 4-8C. A gravação pode deixar um pilar 4-830 que compreende o pilar original 4420 e paredes laterais 4-822 que permanecem do material de preenchimento 4-820.
[000350] Uma resistência 4-440, então, pode ser padronizada sobre o substrato conforme retratado na Figura 4-8D. Por exemplo, a resistência pode ser revestida no substrato, um furo padronizado na resistência, e a resistência desenvolvida para abrir uma região na resistência ao redor do pilar 4-830. O alinhamento do furo ao pilar não precisa ser altamente preciso, e precisa expor apenas o pilar 4-830 sem expor as estruturas de lacuna na banda fotônica subjacentes embutidas na camada dielétrica 4-730.
[000351] Após o pilar 4-830 ser exposto, a gravação isotrópica pode ser usada para reduzir a dimensão transversal do pilar. De acordo com algumas modalidades, o formato do pilar resultante pode aparecer conforme retratado na Figura 4-8E. A resistência 4-440 pode ser esvaziada, então, do substrato e um material 2-221, ou camadas de materiais, pode ser depositado sobre a região. Em algumas modalidades, o material 2-221 pode ser gravado de volta com o uso de um processo de CMP para aplanar a região conforme retratado na Figura 4-8F. De modo subsequente, uma estrutura de pilar restante pode ser usada para remover uma estrutura de pilar restante que sai de uma cavidade de amostra 2-211, conforme ilustrado na Figura 4-8G. Conforme indicado pelos desenhos, a cavidade de amostra 2-211 é autoalinhada à estrutura de lacuna na banda fotônica padronizada na camada dielétrica 4-730.
[000352] Como um processo alternativo, o material de preenchimento 4-820 pode compreender um material diferente do material usado para formar o pilar 4-420. Nesse processo, as etapas associadas à Figura 48D e à Figura 4-8E podem ser omitidas. Após o depósito do material 2221 e a aplanação, conforme retratado na Figura 4-8F, uma gravação seletiva pode ser realizada para remover o pilar 4-420. Isso pode deixar as paredes laterais do material de preenchimento 4-820 que reveste a cavidade de amostra 2-211.
D. ESTRUTURAS DE ACOPLAMENTO POR EXCITAÇÃO NÃO RADIOATIVAS
[000353] A presente invenção fornece estruturas para o acoplamento não radioativo de energia de excitação a uma amostra dentro da cavidade de amostra. Apenas uma modalidade de uma estrutura de acoplamento não radioativa é retratada na Figura 4-9A. De acordo com algumas modalidades, uma estrutura de acoplamento não radioativa pode compreender uma camada semicondutora 4-910 formada imediatamente adjacente à cavidade de amostra 2-211. A camada semicondutora 4-910 pode ser um semicondutor orgânico em algumas modalidades, ou um semicondutor inorgânico em algumas modalidades. Em algumas implantações, uma concavidade 3-216 pode, ou não, ser formada na camada semicondutora. A camada semicondutora 4-910 pode ter uma espessura entre aproximadamente 5 nm e aproximadamente 100 nm de acordo com algumas modalidades, embora outras espessuras possam ser usadas em algumas modalidades. De acordo com algumas implantações, a energia ou fótons de excitação 4-930 de uma fonte de excitação pode colidir sobre a camada semicondutora 4-910 e produzir éxcitons 4-920. Os éxcitons podem se difundir a uma superfície da cavidade de amostra em que os mesmos podem se recombinar de modo não radioativo e transferir energia para uma amostra adjacente às paredes da cavidade de amostra.
[000354] A Figura 4-9B retrata outra modalidade na qual uma camada semicondutora 4-912 pode ser usada para transferir de modo não radioativo a energia da energia de excitação para uma amostra. Em algumas modalidades, a camada semicondutora 4-912 pode ser formada no fundo de uma cavidade de amostra ou em uma concavidade da cavidade de amostra 2-211, conforme retratado no desenho. A camada semicondutora 4-912 pode ser formada em uma cavidade de amostra com o uso de um processo de depósito direcional conforme descrito no presente documento em conexão com etapas de processo para depositar um aderente na base da cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades. A camada semicondutora 4-912 pode ter uma espessura entre aproximadamente 5 nm e aproximadamente 100 nm de acordo com algumas modalidades, embora outras espessuras possam ser usadas em outras modalidades. A radiação incidente pode gerar éxcitons dentro da camada semicondutora, que podem se difundir, então, a uma superfície de fundo da cavidade de amostra 2-211. Os éxcitons, então, podem não transferir de modo não radioativo a energia a uma amostra dentro da cavidade de amostra.
[000355] A presente invenção também fornece múltiplas trajetórias não radioativas para transferir energia de excitação a uma amostra. De acordo com algumas modalidades, e conforme retratado na Figura 4- 9C, uma partícula de transferência de energia 4-940 pode ser depositada dentro de uma cavidade de amostra. A partícula de transferência de energia pode compreender um ponto quântico em algumas modalidades, ou pode compreender uma molécula em algumas modalidades. Em algumas implantações, a partícula de transferência de energia 4-940 pode ser funcionalizada a uma superfície da cavidade de amostra através de uma molécula de ligação. Uma camada semicondutora fina 4-910 pode ser formada adjacente à cavidade de amostra, ou dentro da cavidade de amostra, e éxcitons podem ser gerados dentro da camada semicondutora da energia de excitação incidente na camada semicondutora, conforme retratado no desenho. Os éxcitons podem se difundir à superfície da cavidade de amostra, e transferir energia de modo não radioativo para a partícula de transferência de energia 4-940. A partícula de transferência de energia 4-940, então, pode transferir energia de modo não radioativo para uma amostra 3-101 dentro da cavidade de amostra.
[000356] De acordo com algumas implantações, pode haver mais de uma partícula de transferência de energia 4-940 dentro de uma cavidade de amostra. Por exemplo, uma camada de partículas de transferência de energia 4-942 pode ser depositada dentro de uma cavidade de amostra, como a cavidade de amostra retratada na Figura 4-9C.
[000357] Em algumas implantações, partículas de transferência de energia 4-942, ou uma single partícula de transferência de energia 4940, pode ser depositada em uma base de uma cavidade de amostra, conforme retratado na Figura 4-9D. A partícula de transferência de energia, ou partículas, podem transferir energia de modo radioativo ou de modo não radioativo de excitação para a amostra 3-101 dentro do furo. Por exemplo, uma partícula de transferência de energia pode absorver a energia incidente para formar um estado excitado da partícula de transferência de energia, e, então, transferir energia de modo radioativo ou de modo não radioativo para a amostra 3-101.
[000358] Em algumas implantações, uma partícula de transferência de energia pode absorver energia de excitação incidente, e, então, reemite a energia radioativa a um comprimento de onda que é diferente do comprimento de onda da energia de excitação absorvida. A energia reemitida pode ser usada, então, para excitar uma amostra dentro da cavidade de amostra. A Figura 4-9E representa gráficos espectrais associados a uma partícula de transferência de energia de conversão descendente. De acordo com algumas modalidades, uma partícula de transferência de energia de conversão descendente compreende um ponto quântico que pode absorver radiação de comprimento de onda curta (energia maior), e emitir um ou mais radiações comprimento de onda mais longas (energia menor). Uma curva de absorção exemplificativa 4-952 é retratada no gráfico como uma linha tracejada para um ponto quântico que tem um raio entre 6 a 7 nm. O ponto quântico pode emitir uma primeira banda de radiação ilustrada pela curva 4-954, uma segunda banda de radiação ilustrada pela curva 4956, e uma terceira banda de radiação ilustrada pela curva 4-958.
[000359] Em algumas implantações uma partícula de transferência de energia pode converter de modo ascendente a energia de uma fonte de excitação. A Figura 4-9F retrata espectros associados à conversão ascendente de uma partícula de transferência de energia. De acordo com algumas modalidades, um ponto quântico pode ser excitado com radiação em aproximadamente 980 nm, e, então, reemitir em uma das três bandas espectrais conforme ilustrado no gráfico. Uma primeira banda pode ser centralizada em aproximadamente 483 nm, uma segunda banda pode ser centralizada em aproximadamente 538 nm, e uma terceira banda pode ser centralizada em aproximadamente 642 nm. Os fótons reemitidos do ponto quântico são mais energéticos que os fótons da radiação usados para excitar o ponto quântico. Consequentemente, a energia da fonte de excitação é convertida de modo ascendente. Uma ou mais das bandas espectrais emitidas podem ser usadas para excitar uma ou mais amostras dentro da cavidade de amostra.
E. DIRECIONAR A EMISSÃO DE ENERGIA NO SENTIDO DO SENSOR
[000360] O chip de teste 2-110 pode incluir um ou mais componentes por pixel para melhorar a coleta de emissão de energia através dos sensores no instrumento. Tais componentes podem ser projetados para direcionar espacialmente a emissão de energia no sentido dos sensores e aumentar a direcionalidade da energia de emissão do poço de amostras 2-211. Tanto os ópticos de superfície quanto os ópticos de campo distante pode ser usado para direcionar a emissão de energia no sentido do sensor.
1. ÓPTICOS DE SUPERFÍCIE
[000361] Os componentes em um pixel do chip de teste 2-110 localizado próximo do poço de amostras do pixel podem ser configurados para se acoplar à emissão de energia emitida por uma amostra. Tais componentes podem ser formados na interface entre duas camadas do chip de teste. Por exemplo, alguns elementos de acoplagem de energia de emissão podem ser formados na interface entre uma camada de poço de amostras e a camada adjacente à camada de poço de amostras oposta a onde os poços de amostras são formados. Em alguns casos, a camada abaixo da camada de poço de amostras é uma camada dielétrica e os elementos de acoplamento de emissão de energia podem apoiar plasmons de superfície. Em outras modalidades, a camada de poço de amostras pode ser um material condutivo adjacente a um material opticamente transparente. Os elementos de acoplamento de energia de superfície podem ser estruturas ópticas de superfície que são excitadas pela emissão radiativa do poço de amostras e interagem com o mesmo.
[000362] A dimensão característica de uma estrutura óptica de superfície tal como um período de graduação, um tamanho de recurso ou uma distância do poço de amostras pode ser selecionada para maximamente acoplar um componente paralelo de um vetor de momento de energia de emissão em um vetor de momento de onda de superfície para um plasmon de superfície. Por exemplo, o componente paralelo do vetor de momento de energia de emissão pode estar em contiguidade com o vetor de momento de onda de superfície para um plasmon de superfície apoiado pela estrutura, de acordo com algumas modalidades. Em algumas modalidades, uma distância d do poço de amostras até uma borda ou o recurso característico de uma estrutura óptica de superfície pode ser selecionado de modo a direcionar uma emissão de energia do poço de amostras em uma direção selecionada, tal como normal à superfície ou inclinada em um ângulo θ até normal à superfície. Por exemplo, a distância, d, pode ser um número inteiro de comprimentos de onda de plasmon de superfície para direcionar a emissão normal à superfície. Em algumas modalidades, a distância, d, pode ser selecionada para ser um comprimento de onda de plasmon de superfície fracionário, ou um módulo de comprimento de onda do mesmo.
[000363] De acordo com algumas modalidades, as estruturas ópticas de superfície podem direcionar uma emissão de energia radiativa de um poço de amostras em uma direção normal à camada de poço de amostras. A energia acoplada pode ser direcionada na direção normal em um padrão de radiação direcional estreito.
[000364] Um exemplo de uma estrutura óptica de superfície é um graduador concêntrico. Uma estrutura de grade concêntrica que pode ser formada em um pixel do chip de teste para direcionar uma emissão de energia no sentido de um ou mais sensores do pixel. A estrutura de grade concêntrica pode ser formada ao redor de um poço de amostras. Um exemplo de uma superfície de grade circular concêntrica 5-102 como uma estrutura de plasmon de superfície é retratado na Figura 51. A grade circular pode compreender qualquer quantidade adequada de anéis e a quantidade de anéis (seis) mostrada na Figura 10-1 é um exemplo não limitante. A grade circular pode compreender anéis projetantes de uma superfície de uma camada condutiva. Por exemplo, a grade circular pode ser formada na interface da camada de poço de amostras e uma camada dielétrica formada abaixo da camada de poço de amostras. A camada de poço de amostras pode ser um material condutivo e a grade concêntrica pode ser formada padronizando-se a estrutura de grade na interface entre o material condutivo e o dielétrico. Os anéis da grade circular podem ser em um espaçamento periódico regular, ou podem ter espaçamentos aperiódicos ou irregulares entre os anéis. O poço de amostras pode ser localizado no centro ou perto do centro da grade circular. Em algumas modalidades, o poço de amostras pode ser localizado descentralizado da grade circular e pode ser posicionado a uma certa distância do centro da grade. Em algumas modalidades, um componente de acoplamento de energia de superfície do tipo grade pode compreender uma grade espiral. Um exemplo de uma grade espiral 5-202 é retratado na Figura 5-2. A grade espiral 5202 pode compreender uma abertura espiral em um filme condutivo. Quaisquer dimensões adequadas da grade espiral podem ser usadas para formar a grade espiral.
[000365] Uma grade concêntrica pode ter qualquer quantidade adequada de anéis e ser de qualquer tamanho adequado a título de exemplo e não limitação, uma grade concêntrica pode ter seis anéis com raios que têm aproximadamente 234 nm, aproximadamente 606 nm, aproximadamente 1.005 nm, aproximadamente 1.397 nm, aproximadamente 1.791 nm e aproximadamente 2.186 nm. Em outras modalidades, o anel concêntrico pode ter duas, três, quatro ou oito anéis.
[000366] A Figura 5-3A ilustra um padrão de radiação 5-302 para uma emissão de energia do poço de amostras 2-211. A estrutura de grade concêntrica 2-223 faz com que a emissão de energia tenha uma direcionalidade maior em comparação com o padrão de radiação formado na ausência da estrutura de grade 2-223. Em algumas modalidades, a emissão de energia é direcionada a jusante, normal em relação à camada de metal 2-221. O padrão de radiação pode focar a emissão de energia de maneira que a maioria da luz é focada substancialmente na mesma direção no sentido do sensor. Em algumas modalidades, o padrão de radiação pode focar a luminescência de maneira que a maioria da luminescência forma um formato semelhante a coluna estreito centralizado abaixo do volume alvo e direcionado a jusante no sentido dos sensores. Em algumas modalidades, uma grade concêntrica pode fornecer uma diretividade de mais do que 10 para 1 anel, mais do que 15 para 2 anéis, mais do que 18 para 3 anéis, mais do que 20 para quatro anéis ou mais do que 15 para 1 anel, conforme mostrado pela plotagem na Figura 5-3B.
[000367] Outro exemplo de uma estrutura óptica de superfície ou de plasmon de superfície é uma estrutura de nanoantena. Uma estrutura de nanoantena pode ser projetada para direcionar espacialmente uma emissão de energia do poço de amostras. Em algumas modalidades, o local do poço de amostras em relação à estrutura de nanoantena é selecionado de modo a direcionar a emissão de energia do poço de amostras em uma direção particular no sentido de um ou mais sensores. As nanoantenas podem compreender estruturas de antena dipolo em escala nano que são projetadas para produzir um padrão de radiação direcional quando excitada por uma energia de emissão. As nanoantenas podem ser distribuídas ao redor de um poço de amostras. O padrão de radiação direcional pode resultar de uma soma dos campos eletromagnéticos das antenas. Em algumas modalidades, o padrão de radiação direcional pode resultar de uma soma dos campos eletromagnéticos das antenas com o campo emitido diretamente da amostra. Em algumas implantações, o campo emitido diretamente da amostra pode ser mediado por um plasmon de superfície entre o poço de amostras e a estrutura de nanoantena.
[000368] As dimensões das nanoantenas individuais que formam a estrutura de nanoantena podem ser selecionados para a habilidade combinada da estrutura de nanoantena em geral para produzir padrões de distribuição específicos. Por exemplo, os diâmetros das nanoantenas individuais podem variar em uma estrutura de nanoantena. No entanto, em alguns casos, os diâmetros podem ser iguais em um conjunto de nanoantenas. Em outras implantações, poucos diâmetros selecionados podem ser usados por toda a estrutura de nanoantena em geral. Algumas nanoantenas podem ser distribuídas em um círculo de raio R e algumas podem ser comutadas em uma direção radial do círculo. Algumas nanoantenas podem ser igualmente espaçadas ao redor de um círculo de raio R (por exemplo, centralizadas em incrementos de ângulo polar equivalente), e algumas podem ser comutadas de um espaçamento igual ao redor do círculo. Em algumas modalidades, as nanoantenas podem ser dispostas em uma configuração espiral ao redor de um poço de amostras. Adicional ou alternativamente, outras configurações de nanoantenas são possíveis, tal como um arranjo de matriz ao redor do poço de amostras, uma distribuição em cruz e distribuições em estrela. As nanoantenas individuais podem ter formatos que não sejam um círculo, tal como um quadrado, retangular, em cruz, triangular, de gravata borboleta, de anel anular, de pentágono, de hexágono, de polígonos etc. Em algumas modalidades, a circunferência de uma abertura ou disco pode ter aproximadamente um múltiplo inteiro de um comprimento de onda fracionário, por exemplo, (N/2)X.
[000369] Um arranjo de nanoantena pode direcionar uma emissão de energia de uma amostra em lóbulos de radiação concentrada. Quando uma amostra emite energia, a mesma pode excitar os plasmons de superfície que propagam do poço de amostras para as nanoantenas distribuídas ao redor do poço de amostras. Os plasmons de superfície podem então excitar os modos de radiação ou emissores dipolo nas nanoantenas que emitem radiação perpendicular à superfície da camada de poço de amostras. A fase de um modo excitado ou dipolo em uma nanoantena irá depender da distância da nanoantena do poço de amostras. Selecionar a distância entre o poço de amostras e uma nanoantena individual controla a fase de radiação emitida da nanoantena. O modo de radiação espacial excitado em uma nanoantena irá depender da geometria e/ou do tamanho da nanoantena. Selecionar o tamanho e/ou a geometria de uma nanoantena individual controla o modo de radiação espacial emitido da nanoantena. As contribuições de todas as nanoantenas no arranjo e, em alguns casos no poço de amostras, podem determinar um lóbulo ou lóbulos de radiação em geral que forma o padrão de radiação. Conforme pode ser apreciado, a fase e o modo de radiação espacial emitido de uma nanoantena individual pode depender de um comprimento de onda, de maneira que o lóbulo ou os lóbulos de radiação em geral que forma o padrão de radiação será também dependente de em comprimento de onda. As simulações numéricas dos campos eletromagnéticos podem ser empregadas para determinar padrões de lóbulo de radiação em geral para energias de emissão de comprimentos de onda característicos diferentes.
[000370] A nanoantena pode compreender um arranjo de furos ou aberturas em um filme condutivo. Por exemplo, a estrutura de nanoantena pode ser formada na interface entre uma camada de poço de amostras condutiva e uma camada dielétrica subjacente. Os furos podem compreender conjuntos de furos distribuídos em círculos concêntricos que cercam um ponto central. Em algumas modalidades, um poço de amostras está localizado no ponto central do arranjo, enquanto em outras modalidades o poço de amostras pode ser fora do centro. Cada conjunto de furos distribuídos de modo circular pode compreender uma coleção de diferentes diâmetros dispostos do menor para o maior ao redor da distribuição circular. Os diâmetros de furo podem ser diferentes entre os conjuntos (por exemplo, um menor furo em um conjunto pode ser maior do que um menor furo em outro conjunto), e o local do menor furo pode ser orientado em um ângulo polar diferente para cada conjunto de círculos. Em algumas modalidades, pode haver de um a sete conjuntos dos furos distribuídos de modo circular em uma nanoantena. Em outras modalidades, pode haver mais do que sete conjuntos. Em algumas modalidades, os furos podem não ser circulares, mas podem ser de qualquer formato adequado. Por exemplo, os furos podem ser elipses, triângulos, retângulos, etc. Em outras modalidades, a distribuição de furos pode não ser circulares, mas podem criar um formato espiral.
[000371] As Figuras 5-4A e 5-4B ilustram a estrutura de nanoantena exemplificativa que compreende furos ou aberturas em uma camada condutiva. A Figura 5-4A mostra uma vista plana superior da superfície de um chip de teste com um poço de amostras 5-108 cercado por furos 5-122. Os furos de nanoantena são distribuídos com seus centros aproximadamente ao redor de um círculo de raio R. Nesse exemplo não limitante, os diâmetros de furo variam aumentando-se de modo incremental ao redor da circunferência do círculo de furos. A Figura 54B mostra uma esquemática de uma vista em corte transversal do chip de teste mostrado na Figura 5-4A ao longo da linha B-B’. A camada de poço de amostras 5-116 que inclui o poço de amostras 5-108 e as aberturas 5-122 que são parte da estrutura de nanoantena. A camada 5-118 do chip de teste repousa abaixo da camada de poço de amostras 5-116. A camada 5-118 pode ter um material dielétrico e/ou um material opticamente transparente.
[000372] Em algumas modalidades, a estrutura de nanoantena pode compreender uma pluralidade de discos magnéticos. Os discos magnéticos da estrutura de nanoantena podem ser formados como discos magnéticos condutivos que se projetam de uma superfície de um material condutivo. O material condutivo pode ser adjacente a um material opticamente transparente. Em algumas modalidades, as nanoantenas podem ser distribuídas ao redor de um poço de amostras. Em alguns casos, as nanoantenas podem ser distribuídas aproximadamente ao redor de um poço de amostras em um círculo de raio R. Um arranjo de nanoantena pode compreender múltiplos conjuntos de nanoantenas distribuídas aproximadamente em círculos adicionais de diferentes raios ao redor de um poço de amostras.
[000373] As Figuras 5-5A e 5-5B ilustram uma modalidade exemplificativa de uma estrutura de nanoantena que compreende discos magnéticos que se projetam de uma camada condutiva. A Figura 5-5A mostra uma vista plana superior esquemática da superfície de um chip de teste com um poço de amostras 5-208 cercado por discos magnéticos 5-224. Os discos magnéticos de nanoantena são distribuídos aproximadamente ao redor de um círculo de raio R. Nesse exemplo não limitante, dois diâmetros são usados para os discos magnéticos e os discos magnéticos alternam entre esses dois diâmetros ao redor da circunferência do círculo de nanoantena. A Figura 5-5B mostra uma esquemática de uma vista em corte transversal do chip de teste mostrado na Figura 5-5A ao longo da linha C-C’. A camada de poço de amostras 5-216 inclui o poço de amostras 5-208 e os discos magnéticos 5-224 que são parte da estrutura de nanoantena. Os discos magnéticos 5-224 se projetam da camada de poço de amostras 5-216 por uma certa distância. Em algumas modalidades, a distância que os discos magnéticos se estendem da camada de poço de amostras pode variar em uma estrutura de nanoantena. A camada 5-218 do chip de teste repousa abaixo da camada de poço de amostras 5-216. A camada 5-18 pode ter um material dielétrico e/ou um material opticamente transparente. A camada de poço de amostras 5-216 e os discos magnéticos que se projetam podem ser de um material condutivo.
[000374] Em algumas modalidades uma estrutura de nanoantena pode ser centralizada próxima a um poço de amostras. A nanoantena pode tomar qualquer formato adequado. A título de exemplo e não limitação, a nanoantena pode ter um formato simétrico tal como um cilindro, disco ou cubo. A nanoantena pode ser feita de qualquer material dielétrico adequado, por exemplo, nitreto de sílica. Alternativamente, óxido de titânio pode ser usado. As dimensões de nanoantena podem depender do dielétrico material usado e podem ser personalizadas para realizar o melhoramento desejado. Em algumas modalidades, a nanoantena pode ter uma largura de aproximadamente 800 nm e uma profundidade de aproximadamente 1.050 nm. A nanoantena pode o padrão de radiação de uma emissão de energia de um poço de amostras de maneira que a maioria da luz seja focada substancialmente na mesma direção, tal como em um formato semelhante a coluna estreito centralizado abaixo do volume alvo e da nanoantena correspondente e direcionado a jusante no sentido dos sensores, conforme ilustrado na Figura 5-5C. Em algumas modalidades, uma diretividade de 39,7 é prevista.
[000375] Além de focar a luminescência no sentido do sensor, a nanoantena pode melhorar a energia de excitação no poço de amostras. A energia de excitação de baixo da nanoantena e direcionada no sentido do volume alvo entra na nanoantena e é amplamente concentrada no volume alvo. Em algumas modalidades, um melhoramento de 57,4 é previsto no poço de amostras para uma nanoantena de uma largura de 400 nm e uma altura de 1.050 μm.
2. ÓPTICOS DE CAMPO DISTANTE
[000376] Em algumas modalidades, a camada diretamente abaixo dos ópticos de superfície pode ser uma camada espaçadora 2-225 de qualquer espessura adequada e ser feita de qualquer material dielétrico adequado. A camada espaçadora pode ter, por exemplo, 10 μm de espessura e pode ser feita de dióxido de sílica. Alternativamente, essa camada espaçadora pode ter 48 μm ou 50 μm. Abaixo da camada espaçadora pode ter uma ou mais camadas de lente com camadas espaçadoras adicionais. Por exemplo, a Figura 5-6A ilustra uma camada de lente superior 5-601 que pode incluir pelo menos uma lente refrativa. Em algumas modalidades, a camada de lente superior pode estar localizada 5 μm abaixo da camada de poço de amostras 2-221. Pode haver uma ou mais lentes associada a cada poço de amostras. Em algumas modalidades, um arranjo de lente pode ser usado, tal como um arranjo de lente refrativa. Em algumas modalidades, cada lente da camada de lente superior 5-601 é centralizada abaixo do poço de amostras 2-211 e pode ter um raio, por exemplo, menor do que 10,5 μm. A camada de lente superior pode ser feita de qualquer material dielétrico adequado tal como, a título de exemplo e não limitação, nitreto de sílica.
[000377] Em algumas modalidades, as dimensões da camada de lente superior são conforme a seguir: d1 pode ter aproximadamente 12 μm; d2 pode ter aproximadamente 2 μm; a distância entre d1 em lentes vizinhas pode ter aproximadamente 20,966 μm; e o raio de curvatura da lente pode ter aproximadamente 20,35 μm. Alternativamente, d1 pode ter aproximadamente 8 μm e d2 pode ter aproximadamente 6 μm.
[000378] A camada diretamente abaixo da camada de lente superior pode ser uma camada estrutural e/ou óptica 5-605 feita de qualquer dielétrico adequado. Essa camada estrutural e/ou óptica 5-605 pode ser feita de dióxido de sílica na forma de sílica fundida. A camada diretamente abaixo da camada estrutural pode ser uma camada de lente inferior 5-603 que pode incluir pelo menos uma lente adicional. Em algumas modalidades, cada lente na camada de lente inferior 5-603 pode também estar centralizada abaixo do poço de amostras. A camada de lente inferior 5-603 pode ser feita de qualquer material dielétrico adequado tal como, a título de exemplo e não limitação, nitreto de sílica. A distância do topo da camada de lente superior para o fundo da camada de lente inferior pode ser de 100 a 500 μm. A camada diretamente abaixo da camada de lente inferior pode incluir uma camada antirreflexão que passa tanto a energia de excitação quanto a emissão de energia e reduz a quantidade de luz refletida. A camada diretamente abaixo da camada antirreflexão pode incluir componentes estruturais para permitir que o chip se alinhe ao instrumento e se monte sobre o mesmo. A camada diretamente abaixo da camada de montagem de chip pode incluir uma cobertura protetora para proteger o sistema de dano e contaminação, inclusive poeira.
[000379] Embora a Figura 5-6A ilustre duas camadas de lente que usam lentes refrativas, qualquer lente adequada pode ser usada. Por exemplo, lentes de Fresnel, microlentes, pares de lentes refrativas e/ou lentes planas podem ser usadas. A Figura 5-6B ilustra uma modalidade que usa lentes de Fresnel tanto em uma camada de lente superior 5611 quanto em uma camada de lente inferior 5-613, separadas por uma camada estrutural e/ou óptica 5-605.
[000380] Em algumas modalidades, qualquer uma das interfaces entre as camadas descritas acima no chip pode incluir um revestimento antirreflexão ou uma camada antirreflexão. Tanto a camada de lente superior quanto a segunda camada de lente podem ser dispostas abaixo o poço de amostras para focar a luminescência emitido do arranjo de poços de amostras em uma lente inversora do instrumento. A distância do fundo da camada de poço de amostras até um ponto focal da luminescência dos volumes alvo pode ter aproximadamente 30,3 mm, por exemplo. Esse ponto focal pode ocorrer na lente inversora, por exemplo, em um ponto de centro longitudinal da lente inversora.
III. COMPONENTES DE INSTRUMENTO A. CAMADA DE MICROSCOPIA DO INSTRUMENTO
[000381] Em algumas modalidades, o instrumento pode incluir uma camada de microscopia que pode incluir subcamadas conforme ilustrado na Figura 6-1. Em particular, a camada de microscopia pode incluir uma subcamada que inclui um espelho policroico 2-230 inclinado em um ângulo θ para direcionar a energia de excitação no sentido do chip de teste. Esse espelho policroico pode ser substancialmente dielétrico, e reflete a energia de excitação enquanto substancialmente transmite a emissão de energia da amostra em um ou mais dos poços de amostras no chip de teste. Opcionalmente, um elemento de compensação de astigmatismo 6-101 que inclui uma camada dielétrica adicional pode ser fornecido abaixo do espelho policroico e inclinado no mesmo ângulo θ, mas cerca de um eixo geométrico que é ortogonal ao mesmo da inclinação do espelho policroico, a fim de fornecer uma compensação para astigmatismo introduzida pelo espelho policroico. Na Figura 6-1, o elemento de compensação de astigmatismo 6-101 é ilustrado como inclinado no mesmo plano que o filtro superior, mas deve ser apreciado que a ilustração representa uma inclinação em relação ao filtro superior e não se destina a limitar a orientação do elemento de compensação de astigmatismo 6-101 em nenhuma maneira. Esse elemento de compensação de astigmatismo 6-101 pode também fornecer uma filtragem adicional. Por exemplo, o elemento de compensação de astigmatismo 6-101 pode ser outro espelho policroico que filtra adicionalmente a energia de excitação enquanto transmite a emissão de energia. Uma lente 6-103 pode ser fornecida abaixo do elemento de compensação de astigmatismo 6-101 para ajudar adicionalmente a processar a emissão de energia dos poços de amostras. A lente 6-103 pode ter, por exemplo, 25,4 μm de diâmetro, mas qualquer diâmetro adequado pode ser usado. Em algumas modalidades, a lente é uma lente inversora que compreende uma pluralidade de elementos de lente. Por exemplo, a lente inversora pode incluir seis elementos de lente separados. Em algumas modalidades, a lente inversora pode ter aproximadamente 17,5 mm de comprimento. Elementos de filtragem adicionais podem ser usados antes ou depois da lente 6-103 rejeitar adicionalmente a energia de excitação para impedir que a mesma alcance os sensores.
B. CHIP DE SENSOR
[000382] Uma emissão de energia emitido de uma amostra no poço de amostras pode ser transmitida para o sensor de um pixel em uma variedade de maneiras, os quais alguns exemplos são descritos em detalhes abaixo. Algumas modalidades podem usar componentes ópticos e/ou plasmônicos para aumentar a probabilidade de que uma luz de um comprimento de onda em particular seja direcionada para uma área ou porção do sensor que é dedicado a detectar luz desse comprimento de onda em particular. O sensor pode incluir múltiplos subsensores para simultaneamente detectar uma emissão de energia de diferentes comprimentos de onda.
[000383] A Figura 6-2A é um diagrama esquemático de um único pixel do chip de sensor de acordo com algumas modalidades em que pelo menos um elemento de classificação 6-127 é usado para direcionar uma emissão de energia de um comprimento de onda em particular até um respectivo subsensor 6-111, 6-112, 6-113 e 6-114. A emissão de energia 2-253 percorre de um poço de amostras através do chip de teste e o sistema óptico do instrumento até que o mesmo alcance um elemento de classificação 6-127 do chip de sensor. O elemento de classificação 6-127 acopla o comprimento de onda da energia de emissão 2-253 a um grau espacial de liberdade, e através disso separa a emissão de energia em seus componentes de comprimento de onda constituintes, chamados de energia de emissão classificada. A Figura 6-2A ilustra esquematicamente a emissão de energia 2-253 ao ser dividida em quatro trajetórias de emissão de energia classificadas através de um material dielétrico 6-129, sendo que cada uma das quatro trajetórias é associada a um subsensor 6-111 até 6-114 do pixel. Desse modo, cada subsensor é associado a uma diferente porção do espectro, que forma um espectrômetro para cada pixel do chip de sensor.
[000384] Qualquer elemento de classificação adequado 6-127 pode ser usado para separar os diferentes comprimentos de onda da emissão de energia. As modalidades podem usar elementos ópticos ou plasmônicos. Os exemplos de elementos de classificação ópticos incluem, mas não de modo limitado, grades holográficas, grades de máscara de fase, grades de máscara de amplitude e lentes de Fresnel desviadas. Os exemplos de elementos de classificação plasmônica incluem, mas não de modo limitado, arranjos de nanoantena faseados, e quasicristais plasmônicos.
[000385] A Figura 6-2B é um diagrama esquemático de um único pixel do chip de sensor de acordo com algumas modalidades em que os elementos de filtragem 6-121, 6-122, 6-123 e 6-124 são usados para direcionar uma emissão de energia de um comprimento de onda em particular até um respectivo subsensor e impedir uma emissão de energia de outros comprimentos de onda de alcançar os outros subsensores. A emissão de energia 2-253 percorre de um poço de amostras através do chip de teste e do sistema óptico do instrumento até que o mesmo alcance um dos elementos de filtragem 6-121 até 6124. Os elementos de filtragem 6-121 até 6-124, cada um associado a um subsensor em particular 6-111 até 6-114, são, cada um, configurados para transmitir uma emissão de energia de um respectivo comprimento de onda e rejeitar uma emissão de energia de outros comprimentos de onda absorvendo-se a emissão de energia (não ilustrado na Figura 6-1B) e/ou refletindo-se a emissão de energia. Após passar através de um respectivo elemento de filtragem, a emissão de energia filtrada percorre através de um material dielétrico 6-129 e impinge em um subsensor correspondente 6-111 até 6-114 do pixel. Desse modo, cada subsensor é associado a uma diferente porção do espectro, de modo a formar um espectrômetro para cada pixel do chip de sensor.
[000386] Quaisquer elementos de filtragem adequados podem ser usados para separar os diferentes comprimentos de onda da emissão de energia. As modalidades podem usar elementos de filtragem óptica ou plasmônica. Os exemplos de elementos de classificação ópticos incluem, mas não de modo limitado, filtros dielétricos de multicamada refletiva ou filtros de absorção. Os exemplos de elementos de classificação plasmônica incluem, mas não de modo limitado, superfícies seletivas de frequência projetadas para transmitir energia em um comprimento de onda em particular e cristais de intervalo de banda fotônicos.
[000387] Alternativamente, ou além dos elementos de classificação e elementos de filtragem mencionados acima, os elementos de filtragem adicionais podem ser colocados adjacentes a cada subsensor 6-111 até 6-114. Os elementos de filtragem adicionais podem incluir uma película fina com perdas configurada para criar uma interferência construtiva para uma emissão de energia de um comprimento de onda em particular. A película fina com perdas pode ser uma película única ou de multicamada. A película fina com perdas pode ser feita de qualquer material adequado. Por exemplo, a película fina com perdas pode ser feita de um material em que o índice de refração n tem aproximadamente a mesma ordem de magnitude que o coeficiente de extinção k. Em outras modalidades, a película fina com perdas pode ser feita de um material em que o índice de refração n tem dentro de cerca de duas ordens de magnitude de diferença do valor do coeficiente de extinção k do material. Os exemplos não limitantes de tais materiais em comprimentos de onda visíveis são germano e silício.
[000388] A película fina com perdas pode ter qualquer espessura adequada. Em algumas modalidades, a película fina com perdas pode ter 1 a 45 nm de espessura. Em outras modalidades, a película fina com perdas pode ter 15 a 45 nm de espessura. Em ainda outras modalidades, a película fina com perdas pode ter 1 a 20 nm de espessura. A Figura 6-3A ilustra uma modalidade em que as películas finas com perdas 6-211 até 6-214 têm, cada, uma espessura diferente determinada pelo menos em parte pelo comprimento de onda que está associado a cada subsensor 6-11 até 6-114. A espessura da película determina, pelo menos em parte, um comprimento de onda distinto que irá passar seletivamente através da película fina com perdas até o subsensor. Conforme ilustrado na Figura 6-211, a película fina com perdas 6-211 tem uma espessura d1, a película fina com perdas 6-212 tem uma espessura d2, a película fina com perdas 6-213 tem uma espessura d3 e a película fina com perdas 6-214 tem uma espessura d4. A espessura de cada película fina com perdas subsequente é menor do que a película fina com perdas anterior de maneira que d1 > d2 > d3 > d4.
[000389] Adicional ou alternativamente, as películas finas com perdas podem ser formadas de um material diferente com propriedades diferentes de maneira que uma emissão de energia de diferentes comprimentos de onda interfira de modo construtivo em cada respectivo subsensor. Por exemplo, o índice de refração n e/ou o coeficiente de extinção k pode ter selecionado para otimizar a transmissão de uma emissão de energia de um comprimento de onda em particular. A Figura 6-3B ilustra as películas finas com perdas 6-221, 6-222, 6-223 e 6-224 com a mesma espessura, mas cada película fina com perdas é formada de um material diferente. Em algumas modalidades, tanto o material das películas finas com perdas quanto a espessura das películas finas com perdas pode ter selecionado de maneira que uma emissão de energia de um comprimento de onda desejado interfira de modo construtivo e seja transmitida através da película.
[000390] A Figura 6-1 ilustra uma modalidade em que uma combinação de elementos difrativos e lentes são usados para classificar a emissão de energia por comprimento de onda. Uma primeira camada 6-105 do chip de sensor pode incluir uma grade de fase de difração. A grade de difração pode ser submetida a difração, por exemplo, em um ângulo Φ substancialmente igual a 40 graus e o espaçamento de linha da grade de difração (X) pode ser substancialmente igual a 1,25 μm. Uma pessoa versada na técnica pode apreciar que diferentes ângulos e periodicidades de difração podem ter usados para alcançar uma separação de luz de diferentes comprimentos de onda de energia de emissão. Ademais, qualquer elemento óptico difrativo adequado pode ser usado para separar os diferentes comprimentos de onda da emissão de energia. Por exemplo, uma máscara de fase, uma máscara de amplitude, uma grade de difração ou uma lente de Fresnel desviada pode ter usado.
[000391] Uma segunda camada 6-106 do chip de sensor 2-260 pode incluir uma ou mais lentes de Fresnel disposta embaixo da primeira camada 6-105 para adicionalmente classificar e direcionar a emissão de energia até os sensores 6-107. Ademais, qualquer elemento de lente adequado pode ser usado para separar adicionalmente os diferentes comprimentos de onda da emissão de energia. Por exemplo, uma lente refrativa pode ser usada ao invés de uma lente de Fresnel.
[000392] A lente de Fresnel da terceira camada de lente e a grade de fase de difração podem ser coletivamente chamados de elementos ópticos difrativos (DOE). Em algumas modalidades, os DOEs têm uma espessura na faixa de aproximadamente 400 a 600 μm em que a largura é na faixa de aproximadamente 10 mícrons a 30 mícrons. Uma camada espaçadora de ar pode ser posicionada diretamente abaixo dos DOEs e pode ter uma espessura de aproximadamente 150 μm, em algumas modalidades. Alternativamente, a camada espaçadora pode ter a mesma espessura óptica que o comprimento focal de DOE e/ou ser feita de dióxido de sílica.
[000393] Os vários componentes da Figura 6-1 podem ser espaçados entre si em quaisquer distâncias adequadas. Por exemplo, a superfície dos sensores podem ser localizada em uma distância de 5 μm embaixo da camada de lente de Fresnel 6-106; a distância do centro da lente 6103 da camada de microscopia até a camada de lente de Fresnel 6-106 pode ter 50,6 mm; a grade de fase de difração 6-105 pode ser localizada em uma distância de aproximadamente 100 μm acima da superfície dos sensores. Alternativamente, a distância do fundo do chip de teste até o topo da grade 6-105 pode ter aproximadamente 53 mm. A largura da camada de sensor pode ter aproximadamente 10 mm. A lente de Fresnel pode ser espaçada uma da outra na camada em uma distância de aproximadamente 10 mícrons, aproximadamente 20 mícrons e aproximadamente 30 mícrons.
[000394] Em algumas modalidades, uma lente de Fresnel desviada pode ser usada em que a lente de Fresnel tem um centro que pode ser desviado do centro da lente, tal como a lente 6-103 mostrada na Figura 6-1. O centro da lente de Fresnel desviada pode ser desviado em aproximadamente 50 mícrons, aproximadamente 60 mícrons, aproximadamente 70 mícrons ou aproximadamente 80 mícrons, mas outras distâncias são possíveis. Em algumas modalidades, a lente de Fresnel desviada pode ter um segundo desvio que é o desvio do centro da lente de Fresnel desviada até o centro do sensor, que pode ser, por exemplo, na ordem de 10 um ou 100 um, mas outras distâncias são possíveis. A lente de Fresnel desviada pode ser criada em qualquer maneira adequada. Por exemplo, duas seções, cada uma com um passo diferente de grade podem ser sobrepostas para criar um único Fresnel desviado com eficiência melhorada sobre uma estrutura de lente de Fresnel desviada binária. Em algumas modalidades, uma seção "pequena" com passo de 220 nm e uma seção "grande" com passo de 440 nm podem ser sobrepostas para criar a lente de Fresnel desviada mostrada. O arranjo de lente de Fresnel desviada pode ser posicionado no topo do arranjo de sensor, pode ter um desvio lateral do centro de elemento de lente de Fresnel desviada até o centro de sensor, e pode ser projetado para operar com um comprimento focal na faixa de aproximadamente 80 mícrons até aproximadamente 150 mícrons e projetado para um comprimento de onda de 625 nm.
[000395] A camada diretamente abaixo dos ópticos de imageamento e da camada de espaçador de ar pode ter uma camada de sensor. A camada de sensor pode incluir uma pluralidade de sensores, inclusive sensores fotossensíveis do tipo CMOS. A camada de sensor pode ter qualquer espessura adequada, inclusive na faixa de aproximadamente 6 mícrons a aproximadamente 8 mícrons. Alternativamente, a espessura de camada de sensor pode ter na faixa de 2 um a 15 um. Os sensores podem ser separados em uma pluralidade de segmentos ou pixels e pode ter uma largura de aproximadamente 21 μm. A distância do topo da camada de sensor até um ponto focal da energia de emissão pode ter aproximadamente 30,3 mm.
[000396] As várias camadas do chip de teste e do instrumento não precisam estar na ordem descrita acima. Em algumas modalidades, os elementos de focalização e/ou classificação e os ópticos de imageamento do instrumento podem estar em ordem reversa. Por exemplo, a grade de fase de difração 6-105 pode ser colocada após a camada de lente de Fresnel 6-106. Alternativamente, os elementos de focalização e/ou classificação e os ópticos de imageamento podem ser incorporados em um único elemento óptico difrativo (DOE). Além disso, vários componentes do chip de teste e do instrumento podem ser misturados de modo que, por exemplo, os ópticos de imageamento podem ocorrer tanto acima quanto abaixo dos elementos de focalização e/ou classificação.
[000397] Qualquer uma das interfaces entre as camadas, inclusive a interface entre ar e uma camada do sistema, descritas acima no sistema pode incluir um revestimento antirreflexão.
C. BLOCO ÓPTICO DO INSTRUMENTO
[000398] Em algumas modalidades, o bloco óptico do instrumento 1120 pode incluir alguns ou todos os componentes ópticos descritos acima. O bloco óptico pode fornecer os componentes ópticos conforme disposto na Figura 6-4A. A Figura 6-4A ilustra uma luz que tem À1 e À2 que passa através dos componentes ópticos mostrados na Figura 6-4A. Além dos componentes descritos abaixo, o bloco óptico pode incluir um primeiro conector de fibra 6-401 em que uma primeira fibra óptica que carrega um primeiro comprimento de onda de energia de excitação, À1, pode conectar e um segundo conector de fibra 6-402 em que uma segunda fibra óptica que carrega um segundo comprimento de onda de energia de excitação, À2, pode conectar. A título de exemplo e não limitação, o primeiro comprimento de onda de excitação da energia de excitação pode ter 630 a 640 nm. Os conectores de fibra óptica podem ser qualquer conector convencional adequado, tal como um conector do tipo DC ou LC. Se dois comprimentos de onda diferentes são inseridos, os comprimentos de onda podem ser combinados com um combinador de comprimento de onda 6-403, tal como um espelho dicroico ou policroico. O segundo comprimento de onda de excitação pode ter 515 a 535 nm. A energia de excitação de entrada pode ter qualquer polarização adequada, tal como a polarização linear. Em algumas modalidades, a fibra que carrega a energia de excitação pode ter uma fibra de manutenção de polarização. Opcionalmente, os filtros de excitação e polarizadores, tais como acopladores de fibra óptica a espaço livre, podem ser usados após a entrada de fibra óptica para adicionalmente filtrar ou modificar as características da energia de excitação.
[000399] O bloco óptico pode incluir um ou mais alojamentos de metal para reter lentes e outros componentes ópticos para um processamento óptico tal como formatação de feixe. A Figura 6-4A ilustra quatro alojamentos de metal 6-405 até 6-408, em que cada um retém uma lente e/ou outros componentes ópticos. Pode haver qualquer quantidade de lentes usadas para colimar e focar a energia de excitação. Um ou mais espelhos 6-411 e 6-412 são situados entre alguns dos alojamentos de metal para guiar a energia de excitação no sentido do chip de teste 2110. Na Figura 6-4A, o primeiro espelho 6-411 direciona a energia de excitação do segundo alojamento 6-406 para o terceiro alojamento 6407 e o segundo espelho 6-412 reflete a energia de excitação do quarto alojamento 6-408 para um espelho dielétrico policroico 2-230. O espelho dielétrico policroico 2-230 direciona a energia de excitação no sentido de um filtro de compensação de astigmatismo 6-601.
[000400] Em algumas modalidades, a luz circularmente polarizada pode ser direcionada no poço de amostras para fazer com que os marcadores luminescentes emitam uma luminescência com força similar. Uma placa de quarto de onda pode ser usada para transferir a luz linearmente polarizada para a luz circularmente polarizada antes que a mesma alcance o chip de teste. O espelho dielétrico policroico 2-230 direciona a energia de excitação para a placa de quarto de onda 6-415. Conforme ilustrado na Figura 6-4A, a placa de quarto de onda 6-415 pode ser disposta entre o filtro de compensação de astigmatismo 6-101 e o chip de teste 2-110. A energia de excitação circularmente polarizada é então direcionada no sentido da pluralidade de pixels no chip de teste. A energia de excitação que não é dirigida no sentido dos pixels pode ter absorvida por um componente de despejo de feixe 6-417. A energia de excitação que alcança a amostra dentro de um ou mais poços de amostras fará com que a amostra emita energia de emissão, que é direcionada no sentido do sensor 2-260. A emissão de energia pode passar através de componentes ópticos tais como ópticos de polarização, o elemento de compensação de astigmatismo 6-101, o espelho policroico 2-230 e uma lente inversora 6-103. O espelho policroico age como um filtro, que pode ser, a título de exemplo, um filtro rejeita-faixa, um filtro de pico ou um filtro de corte. A lente inversora 6103 pode imagear a emissão de energia no sentido do sensor. Uma porção da energia de emissão pode então passar através de um ou mais filtros de emissão 6-421 e 6-422, situados acima do sensor 2-260, que pode adicionalmente filtrar a emissão de energia. Em algumas modalidades, os filtros de emissão podem ser inclinados em um ângulo relativo à direção de propagação de emissão de energia incidente a fim de afinar as características de transmissão dos filtros e/ou reduzir a interferência causada por retrorreflexões. Se o filtro superior 6-421 é inclinado em um ângulo θ, o filtro de fundo 6-422 pode ser inclinado no mesmo ângulo θ, mas cerca de um eixo geométrico que é ortogonal ao mesmo da inclinação do filtro superior, para assegurar que nenhum astigmatismo é introduzido na trajetória de feixe de radiação de emissão.
[000401] A Figura 6-5 ilustra um exemplo de um traço de raio que representa uma trajetória óptica através do aparelho do chip de teste 2110 para o chip de sensor 2-260. Cada ponto de início no chip de teste 2-110 representa um pixel que emite uma emissão de energia e é imageado pelo sistema para um pixel correspondente no chip de sensor 2-260. A trajetória pode existir ao longo de uma distância de aproximadamente 55,4 mm, mas qualquer distância adequada pode ter usada. No exemplo ilustrado, os raios emitidos do arranjo de poço de amostras são filtrados e focados no sentido do sensor com o uso dos elementos ópticos descritos acima. A Figura 6-5 ilustra uma lente inversora possível 6-103 que compreende seis lentes individuais. Deve ser reconhecido que qualquer quantidade de lentes e/ou de outros elementos ópticos pode ser usada como uma lente inversora.
IV. SENSORES
[000402] A presente invenção fornece várias modalidades de sensores, operação de sensor, e métodos de processamento de sinal. De acordo com algumas modalidades, um sensor 2-122 em um pixel do chip de sensor 2-260 pode compreender qualquer sensor adequado capaz de receber energia de emissão a partir de uma ou mais etiquetas na cavidade de amostra, e produzir um ou mais sinais elétricos representativos da energia de emissão recebida. Em algumas modalidades, um sensor pode compreender pelo menos um fotodetector (por exemplo, uma junção p-n formada em um substrato semicondutor). A Figura 7-1A e a Figura 7-1B retratam uma modalidade de um sensor que pode ser fabricado dentro de um pixel 2-100 de um chip de sensor.
[000403] De acordo com algumas modalidades, um sensor 2-122 pode ser formado em cada pixel 2-100 de um chip de sensor. O sensor pode ser associado a uma cavidade de amostra 2-211 do chip de teste. Pode haver um ou mais camadas transparentes 7-110 acima do sensor, para que a emissão da cavidade de amostra possa se deslocar para o sensor sem atenuação significativa. O sensor 2-122 pode ser formado em um substrato semicondutor 7-120 em uma base do pixel, de acordo com algumas modalidades, e ser localizado em um mesmo lado da cavidade de amostra como o chip de teste (não mostrado).
[000404] O sensor pode compreender um ou mais segmentos de fotodetector de junção de semicondutor. Cada junção de semicondutor pode compreender uma cavidade de um primeiro tipo de condutividade. Por exemplo, cada junção de semicondutor pode compreender uma cavidade tipo-n formada em um substrato tipo-p, conforme retratado no desenho. De acordo com algumas modalidades, um sensor 2-122 pode ser disposto como um detector de alvo 7-162, conforme retratado na vista plana da Figura 7-1B. Um primeiro fotodetector 7-124 pode ser localizado em um centro do sensor, e um segundo fotodetector anular 7-122 pode circundar o fotodetector central. Os contatos elétricos para as cavidades podem ser feitos através de traços condutores 7-134 formados em um primeiro nível de metalização ou subsequente e através de vias condutoras 7-132. Pode haver uma região de material semicondutor altamente dopado 7-126 em regiões de contato das vias. Em algumas modalidades, um óxido de campo 7-115 pode ser formado em superfícies entre os fotodetectores e pode cobrir uma porção de cada fotodetector. Em algumas implantações, pode haver dispositivos semicondutores adicionais 7-125 (por exemplo, transistores, amplificadores, etc.) formados dentro do pixel adjacente ao sensor 2122. Pode haver níveis de metalização adicionais 7-138, 7-136 dentro do pixel.
[000405] Em algumas implantações, um nível de metalização 7-136 pode se estender através de uma maior parte do pixel e ter uma abertura centrada acima do fotodetector 7-124, para que a emissão da cavidade de amostra possa alcançar o sensor. Em alguns casos, um nível de metalização 7-136 pode servir como um potencial de referência ou um plano terra, e adicionalmente servir como um bloqueio óptico para impedir que pelo menos alguma radiação de fundo (por exemplo, radiação de uma fonte de excitação ou do ambiente) alcance o sensor 2-260.
[000406] Conforme ilustrado na Figura 7-1A e na Figura 7-1B, um sensor 2-122 pode ser subdividido em uma pluralidade de segmentos de fotodetector 7-122, 7-124 que são espacial e eletricamente separados entre si. Em algumas modalidades, os segmentos de um sensor 2-122 podem compreender regiões de material semicondutor dopado opostamente. Por exemplo, uma primeira cavidade de acúmulo de carga 7-124 para um primeiro segmento de sensor pode ser formada dopando-se uma primeira região de um substrato para ter um primeiro tipo de condutividade (por exemplo, tipo-n) dentro da primeira cavidade. O substrato pode ser do tipo-p. Uma segunda cavidade de acúmulo de carga 7-122 para um segundo segmento de sensor pode ser formada dopando-se uma segunda região do substrato para ter o primeiro tipo de condutividade dentro da segunda cavidade. A primeira e segunda cavidades podem ser separadas por uma região tipo-p do substrato.
[000407] A pluralidade de segmentos do sensor 2-122 pode ser disposta de qualquer forma adequada além de um traçado de alvo, e pode haver mais do que dois segmentos em um sensor. Por exemplo, em algumas modalidades, uma pluralidade de segmentos de fotodetector 7-142 pode ser separada lateralmente entre si para formar um sensor de listra 7-164, conforme retratado na Figura 7-1C. Em algumas modalidades, um sensor quadrado (ou quadrante) 7-166 pode ser formado dispondo-se os segmentos 7-144 em um padrão quadrado, conforme retratado na Figura 7-1D Em algumas implantações, segmentos de arco 7-146 podem ser formados em combinação com um padrão de alvo, conforme retratado na Figura 7-1E, para formar um sensor segmentado em arcos 7-168. Outra configuração de sensor pode compreender seções de fatia de torta, que podem incluir sensores individuais dispostos em seção separada de um círculo. Em alguns casos, segmentos de sensor podem ser dispostos simetricamente ao redor de uma cavidade de amostra 2-211 ou assimetricamente ao redor de uma cavidade de amostra. A disposição de segmentos de sensor não é limitada apenas às disposições supramencionadas, e qualquer distribuição adequada de segmentos de sensor pode ser usada.
[000408] Os inventores constataram que um sensor de quadrante 7166, sensor de fatia de torta ou sensor de setor similar pode escalar para tamanhos de pixel menores mais favoravelmente do que outras configurações de sensor. Detectores de quadrante e setor podem consumir menos área de pixel para um número de comprimentos de onda detectados e área de sensor ativo.
[000409] Os sensores podem ser dispostos em várias configurações geométricas. Em alguns exemplos, os sensores são dispostos em uma configuração quadrada ou configuração hexagonal.
[000410] Os sensores podem ser dimensionados e posicionados de qualquer forma adequada para capturar a energia de emissão emitida de uma cavidade de amostra. Por exemplo, o sensor pode ser centrado sob a cavidade de amostra e ter dimensões planas de 5 um x 5 um. Alternativamente, cada subsensor pode ter dimensões de 1,6 um x 10 um com uma densidade de 4,6 um (isto é, 3 um de lacuna entre cada subsensor).
[000411] Os sensores da presente invenção podem ser endereçáveis independentemente (ou individualmente). Um sensor endereçável individualmente é capaz de detectar um sinal e fornecer uma saída independente de outros sensores. Um sensor endereçável individualmente pode ser legível individualmente.
[000412] Em algumas modalidades, um sensor empilhado 7-169 pode ser formado fabricando-se uma pluralidade de segmentos de sensor separados 7-148 em uma pilha vertical, conforme retratado na Figura 7- 1F. Por exemplo, os segmentos podem ser localizados um acima do outro, e pode, ou não, haver camadas isolantes entre os segmentos empilhados. Cada camada vertical pode ser configurada para absorver energia de emissão de uma energia particular, e passar a emissão em energias diferentes. Por exemplo, um primeiro detector pode absorver e detectar de comprimento de onda mais curto (por exemplo, radiação de comprimento de onda de azul abaixo de cerca de 500 nm de uma amostra). O primeiro detector pode passar emissões de comprimento de onda de verde e vermelho de uma amostra. Um segundo detector pode absorver e detectar radiação de comprimento de onda de verde (por exemplo, entre cerca de 500 nm e cerca de 600 nm) e passar emissões de vermelho. Um terceiro detector pode absorver e detectar as emissões de vermelho. Filmes refletivos 7-149 podem ser incorporados na pilha, em algumas modalidades, para refletir luz de uma banda de comprimento de onda selecionada de volta através de um segmento. Por exemplo, um filme pode refletir radiação de comprimento de onda de verde, que não tenha sido absorvida pelo segundo segmento, de volta através do segundo segmento para aumentar sua eficiência de detecção.
[000413] Em algumas modalidades com segmentos de sensor empilhados verticalmente, componentes de acoplamento de emissão podem não ser incluídos na cavidade de amostra para produzir padrões de distribuição espacial distintos de emissão de amostra que são dependentes de comprimento de onda de emissão. O discernimento de emissões diferentes espectralmente pode ser alcançado com um sensor empilhado verticalmente 7-169 analisando-se a razão de sinais de seu segmento empilhado, de acordo com algumas modalidades.
[000414] Em algumas modalidades, os segmentos de um sensor 2122 são formados de silício, embora qualquer semicondutor adequado (por exemplo, Ge, GaAs, SiGe, InP, etc.) possa ser usado. Em algumas modalidades, um segmento de sensor pode compreender um filme fotocondutor orgânico. Em outras modalidades, fotodetectores de ponto quântico podem ser usados para segmentos de sensor. Os fotodetectores de ponto quântico podem responder a energias de emissão diferentes com base no tamanho do ponto quântico. Em algumas modalidades, uma pluralidade de pontos quânticos de tamanhos variáveis pode ser usada para discriminar entre energias ou comprimentos de onda de emissão diferentes recebidos da cavidade de amostra. Por exemplo, um primeiro segmento pode ser formado de pontos quânticos que têm um primeiro tamanho, e um segundo segmento pode ser formado de pontos quânticos que têm um segundo tamanho. Em várias modalidades, os sensores 2-122 podem ser formados com o uso de processos CMOS convencionais.
[000415] Conforme descrito acima, os componentes de acoplamento de emissão podem ser fabricados adjacentes à cavidade de amostra em algumas modalidades. Os elementos de classificação 2-243 podem alterar a emissão de uma amostra dentro da cavidade de amostra 2-211 para produzir padrões de distribuição espacial distintos de emissão de amostra que são dependentes do comprimento de onda de emissão. A Figura 7-2A retrata um exemplo de um primeiro padrão de distribuição espacial 7-250 que pode ser produzido a partir de uma primeira amostra em um primeiro comprimento de onda. O primeiro padrão de distribuição espacial 7-250 pode ter um lóbulo central proeminente direcionado para um segmento central de um sensor de alvo 7-162, por exemplo, conforme mostrado na Figura 7-2B. Esse padrão 7-250 pode ser produzido por qualquer adequado elemento difrativo quando a amostra emite em um comprimento de onda de cerca de 663 nm. Um padrão projetado 7-252 incidente no sensor pode parecer conforme ilustrado na Figura 7-2B.
[000416] A Figura 7-2C retrata um padrão de distribuição espacial 7260 que pode ser produzido a partir de uma segunda amostra que emite em um segundo comprimento de onda da mesma cavidade de amostra, de acordo com algumas modalidades. O segundo padrão de distribuição espacial 7-260 pode compreender dois lóbulos de radiação e diferir do primeiro padrão de distribuição espacial 7-250. Um padrão projetado 7262 do segundo padrão de distribuição espacial 7-260 pode parecer conforme retratado na Figura 7-2D, de acordo com algumas modalidades. O segundo padrão de distribuição espacial 7-260 pode ser produzido por qualquer elemento difrativo adequado quando a amostra emite em um comprimento de onda de cerca de 687 nm.
[000417] Os segmentos de um sensor 2-122 podem ser dispostos para detectar energias de emissão particulares, de acordo com algumas modalidades. Por exemplo, estruturas de acoplamento de emissão adjacentes à cavidade de amostra e aos segmentos de um sensor podem ser projetadas em combinação para aumentar a diferenciação de sinal entre energias de emissão particulares. As energias de emissão podem corresponder a etiquetas selecionadas que serão usadas com o chip de sensor. Como um exemplo, um sensor de alvo 7-162 poderia ter seus segmentos dimensionados e/ou localizados para corresponder melhor aos padrões projetados 7-260, 7-262 a partir de uma amostra, de modo que as regiões de intensidade superior fiquem mais centralmente dentro de segmentos ativos do sensor. Alternativa ou adicionalmente, os elementos difrativos podem ser projetados para alterar os padrões projetados 7-260, 7-262 de modo que as regiões intensas fiquem mais centralmente dentro dos segmentos do sensor.
[000418] Embora um sensor 2-122 possa compreender dois segmentos, é possível em algumas modalidades discernir mais do que duas bandas de emissão distintas espectralmente a partir de uma amostra. Por exemplo, cada banda de emissão pode produzir um padrão projetado distinto nos segmentos de sensor e gerar uma combinação distinta de sinais a partir dos segmentos de sensor. A combinação de sinais pode ser analisada para discernir e identificar a banda de emissão. A Figura 7-2E à Figura 7-2H representam resultados de simulações numéricas de sinais de um sensor de dois segmentos 2122 exposto a quatro padrões de emissão distintos. Como pode ser visto, cada combinação de sinais dos dois segmentos de sensor é distinta, e pode ser usada para discriminar entre emissores nos quatro comprimentos de onda. Para a simulação, devido ao fato de que o segmento de detector externo do sensor de alvo 7-162 tinha uma área maior, mais sinal foi integrado para aquele detector. Além disso, a luz que incidiu em uma área entre os detectores gerou carreadores que podem derivar em direção a qualquer segmento de detector e contribuir para sinais de ambos os segmentos.
[000419] Em algumas modalidades, pode haver N segmentos de fotodetector por pixel, em que N pode ser qualquer valor de número inteiro. Em algumas modalidades, N pode ser maior ou igual a 1 e menor ou igual a 10. Em outras modalidades, N pode ser maior ou igual a 2 e menor ou igual a 5. O número M de emissões de amostra discerníveis (por exemplo, comprimentos de onda de emissão distintos de diferentes etiquetas luminescentes) que podem ser detectadas pelos N detectores pode ser igual a ou maior do que N. O discernimento de M emissões de amostra pode ser alcançado avaliando-se a razão de sinais de cada segmento de sensor, de acordo com algumas modalidades. Em algumas implantações, a razão, soma e/ou amplitudes dos sinais recebidos podem ser medidas e analisadas para determinar um comprimento de onda característico de emissão da cavidade de amostra.
[000420] Em algumas modalidades, mais do que um emissor pode emitir em diferentes comprimentos de onda característicos em uma dada janela de tempo dentro de uma cavidade de amostra 2-211. Um sensor 2-122 pode detectar simultaneamente sinais de múltiplas emissões em comprimentos de onda diferentes e fornecer o sinal somado para processamento de dados. Em algumas implantações, a emissão de múltiplos comprimentos de onda pode ser distinguível como outro conjunto de valores de sinal dos segmentos de sensor (por exemplo, valores de sinal diferentes daqueles mostrados na Figura 7- 2E à Figura 7-2H). Os valores de sinal podem ser analisados para discernir que emissão de múltiplos comprimentos de onda ocorreu e para identificar uma combinação particular de emissores associados às emissões.
[000421] Os inventores também contemplaram e analisaram um sensor de alvo que tem quatro segmentos concêntricos. Os sinais dos segmentos são plotados na Figura 7-2I e na Figura 7-2J para as mesmas condições de emissão associadas à Figura 7-2G e a Figura 72H, respectivamente. O sensor de alvo de quatro segmentos também mostra sinais discerníveis que podem ser analisados para identificar um emissor particular dentro da cavidade de amostra.
[000422] Quando filtragem de comprimento de onda é usada em cada segmento de sensor, ou a separação espectral é alta, cada segmento de um sensor pode detectar substancialmente apenas uma banda de emissão selecionada. Por exemplo, um primeiro comprimento de onda pode ser detectado por um primeiro segmento, um segundo comprimento de onda pode ser detectado por um segundo segmento, e um terceiro comprimento de onda pode ser detectado por um terceiro segmento.
[000423] Em referência novamente à Figura 7-1A, pode haver conjunto de circuitos eletrônicos adicionais 7-125 dentro de um pixel 2- 100 que pode ser usado para coleta e leitura de sinais de cada segmento de um sensor 2-122. A Figura 7-3A e a Figura 7-3D retratam o conjunto de circuitos que pode ser usado em combinação com um sensor de múltiplos segmentos, de acordo com algumas modalidades. Como um exemplo, a conjunto de circuitos de coleta de sinal 7-310 pode compreender três transistores para cada segmento de sensor. Uma disposição dos três transistores é retratada na Figura 7-3B, de acordo com algumas implantações. Um nível de sinal em um nó de acúmulo de carga 7-311 associado a cada segmento pode ser reinicializado do por um transistor de reinicialização RST, e um nível de sinal para o segmento (determinado pela quantidade de carga no nó de acúmulo de carga) pode ser lido com um transistor de leitura RD.
[000424] O conjunto de circuitos de pixel pode adicionalmente incluir conjunto de circuitos de amplificação e amostragem dupla correlacionada 7-320, de acordo com algumas modalidades. O conjunto de circuitos de amplificação e amostragem dupla pode compreender transistores configurados para amplificar sinais dos segmentos de sensor bem como transistores configurados para reinicializar o nível de tensão no nó de acúmulo de carga e para ler um sinal de fundo, ou "reinicialização", no nó quando nenhuma energia de emissão está presente no sensor (por exemplo, antes da aplicação de energia de excitação na cavidade de amostra) e para ler um sinal de emissão subsequente, por exemplo.
[000425] De acordo com algumas modalidades, amostragem dupla correlacionada é empregada para reduzir ruído de fundo subtraindo-se um nível de sinal de fundo ou reinicialização do nível de sinal de emissão detectado. O sinal de emissão coletado e o sinal de fundo associado a cada segmento do sensor podem ser lidos em linhas de coluna 7-330. Em algumas modalidades, um nível de sinal de emissão e sinal de fundo são multiplexados por tempo em uma linha de coluna comum. Pode haver uma linha de coluna separada para cada segmento de sensor. Os sinais a partir das linhas de coluna podem ser armazenados temporariamente e/ou amplificados com o conjunto de circuitos de amplificação 7-340 (que pode ficar localizado do lado de fora de uma matriz de pixel ativa), e fornecidos para processamento e análise adicionais. Em algumas modalidades a subtração dos sinais duplamente amostrados é calculada fora do chip, por exemplo, por um processador de sistema. Em outras modalidades, a subtração pode ser realizada no chip ou no conjunto de circuitos do instrumento.
[000426] Algumas modalidades de amostragem dupla correlacionada podem operar selecionando-se uma fileira para amostra, em que os sensores associados à fileira têm cargas de sinal integradas ao longo de um período de amostragem e contêm níveis de sinal. Os níveis de sinal podem ser lidos simultaneamente nas linhas de colunas. Após a amostragem dos níveis de sinal integrados, todos os pixels na fileira selecionada podem ser reinicializados e amostrados imediatamente. Esse nível de reinicialização pode ser correlacionado ao próximo sinal integrado que começa a acumular após a reinicialização ser liberada, e termina integrando um tempo de quadro posteriormente quando a mesma fileira é selecionada novamente. Em algumas modalidades, os valores de reinicialização do quadro podem ser armazenados fora do chip para que quando os sinais tiverem terminado a integração e tiverem sido amostrados, os valores de reinicialização correlacionados armazenados possam ser subtraídos.
[000427] Em algumas modalidades, um sensor 2-122 com mais do que dois segmentos pode exigir conjunto de circuitos adicional. A Figura 7-3C retrata conjunto de circuitos de coleta de sinal 7-312, de amplificação 7-320 e de amostragem dupla associados a um sensor quadrado. De acordo com algumas modalidades, os sinais de dois ou mais segmentos podem ser multiplexados por tempo em um canal de sinal comum no pixel, conforme retratado no desenho. Os sinais multiplexados por tempo podem incluir sinais de fundo amostrados para cada segmento para cancelamento de ruído. Além disso, os sinais de dois ou mais segmentos podem ser multiplexados por tempo em uma linha de coluna comum.
[000428] De acordo com algumas modalidades, conjuntos de procedimentos de aquisição de sinal temporal podem ser usados para reduzir níveis de sinal de fundo de uma fonte ou fontes de excitação, e/ou discernir emissões diferentes de emissores diferentes associados a uma amostra. A Figura 7-4A retrata emissão fluorescente e decaimento de dois emissores diferentes que podem ser usados para etiquetar uma amostra, de acordo com algumas modalidades. As duas emissões têm características de tempo de decaimento significativamente diferentes. Uma primeira curva de tempo de decaimento 7-410 de um primeiro emissor pode corresponder a uma molécula fluorescente comum tal como rodamina. Uma segunda curva de tempo de decaimento 7-420 pode ser característica de um segundo emissor, tal como um ponto quântico ou um emissor fosforescente. Ambos os emissores exibem um rastro de decaimento de emissão que se estende por algum tempo após a excitação inicial do emissor. Em algumas modalidades, os conjuntos de procedimentos de coleta de sinal aplicados durante o rastro de decaimento de emissão pode ser temporizados para reduzir um sinal de fundo de uma fonte de excitação, em algumas modalidades, e para distinguir entre os emissores, em algumas modalidades.
[000429] De acordo com algumas implantações, amostragem com atraso de tempo pode ser empregada durante o rastro de decaimento de emissão para reduzir um sinal de fundo devido à radiação de uma fonte de excitação. A Figura 7-4B e a Figura 7-4C ilustram amostragem com atraso de tempo, de acordo com algumas modalidades. A Figura 7-4B retrata a evolução temporal de um pulso de excitação 7-440 de energia de excitação de uma fonte de excitação, e um pulso de emissão subsequente 7-450 que pode seguir de uma amostra que é excitada dentro da cavidade de amostra. O pulso de excitação 7-440 pode resultar de acionamento da fonte de excitação com um sinal de acionamento 7-442 por um breve período de time, conforme retratado na Figura 7-4C. Por exemplo, o sinal de acionamento pode iniciar em um primeiro tempo t1 e terminar em um segundo tempo t2. A duração do sinal de acionamento (t2 - ti) pode ser entre cerca de 1 picossegundo e cerca de 50 nanossegundos, de acordo com algumas modalidades, embora durações mais curtas possam ser usadas em algumas implantações.
[000430] Em um tempo t3 que segue a conclusão do sinal de acionamento para a fonte de excitação, um sensor 2-260 (ou segmento de sensor) no pixel pode ser fechado para acumular carga em um nó de acúmulo de carga 7-311 durante um segundo intervalo de tempo 7-452 que se estende de um tempo t3 a um tempo t4. O segundo intervalo de tempo pode ser entre cerca de 1 nanossegundo e cerca de 50 microssegundos, de acordo com algumas modalidades, embora outras durações possam ser usadas em algumas implantações. Como pode ser visto em referência à Figura 7-4B, um nó de acúmulo de carga coletará mais cargas de sinal devido à amostra de emissão, então, devido à fonte de excitação. Consequentemente, uma razão de sinal para ruído melhorada pode ser obtida.
[000431] Em referência novamente à Figura 7-4A, devido às características de emissão temporal diferentes dos emissores, sinais correspondentes em um sensor podem atingir o pico em tempos diferentes. Em algumas implantações, conjuntos de procedimentos de aquisição de sinal aplicados durante o rastro de decaimento de emissão podem ser usados para discernir emissores diferentes. Em algumas modalidades, conjuntos de procedimentos de detecção temporal podem ser usados em combinação com conjuntos de procedimentos espacial e espectral (conforme descrito acima em conexão com a Figura 7-2, por exemplo) para discernir emissores diferentes.
[000432] A Figura 7-4D à Figura 7-4H ilustram como a amostragem dupla em um sensor, ou segmento de sensor, pode ser usada para distinguir entre dois emissores que têm características de emissão temporal diferentes. A Figura 7-4D retrata as curvas de emissão 7-470, 7-475 associadas a um primeiro emissor e segundo emissor, respectivamente. Como um exemplo, o primeiro emissor pode ser um fluoróforo comum tal como rodamina, e o segundo emissor pode ser um emissor de ponto quântico ou fosforescente.
[000433] A Figura 7-4E representa níveis de tensão dinâmicos em um nó de acúmulo de carga 7-311 que podem ocorrer em resposta às duas características de emissão diferentes da Figura 7-4D. No exemplo, uma primeira curva de tensão 7-472 que corresponde ao emissor fluorescente pode mudar mais rapidamente, devido ao intervalo de emissão mais curto, e alcança seu máximo (ou mínimo, dependendo da polaridade do nó) em um primeiro tempo t1. A segunda curva de tensão 7-477 pode mudar mais lentamente devido às características de emissão mais longas do segundo emissor, e alcançar seu máximo (ou mínimo) em um segundo tempo t2.
[000434] Em algumas modalidades, a amostragem do nó de acúmulo de carga pode ser feita em dois tempos t3, t4 após a excitação da amostra, conforme retratado na Figura 7-4F. Por exemplo, um primeiro sinal de leitura 7-481 pode ser aplicado para leitura de um primeiro valor de tensão do nó de acúmulo de carga em um primeiro tempo t3. Subsequentemente, um segundo sinal de leitura 7-482 pode ser aplicado para leitura de um segundo valor de tensão do nó de acúmulo de carga em um segundo tempo t4 sem reinicializar o nó de acúmulo de carga entre a primeira leitura e a segunda leitura. Uma análise dos dois valores de sinal amostrados pode, então, ser usada para identificar qual dos dois emissores forneceu os níveis de sinal detectados.
[000435] A Figura 7-4G retrata um exemplo de dois sinais da primeira leitura e segunda leitura que podem ser obtidos para o primeiro emissor que tem uma curva de emissão 7-470 conforme retratado na Figura 74D. A Figura 7-4H retrata um exemplo de dois sinais da primeira leitura e segunda leitura que podem ser obtidos para o segundo emissor que tem uma curva de emissão 7-475 conforme retratado na Figura 7-4D. Por exemplo, a sequência de amostragem mostrada na Figura 7-4F para o primeiro emissor amostrará a curva 7-472 e obterá aproximadamente os mesmos valores nos dois tempos de leitura. No caso do segundo emissor, a sequência de amostragem retratada na Figura 7-4F amostra dois valores diferentes da curva 7-477 nos dois tempos de leitura. Os pares resultantes de sinais dos dois tempos de leitura distinguem entre os dois emissores, e podem ser analisados para identificar cada emissor. De acordo com algumas modalidades, a amostragem dupla para subtração de fundo também pode ser executada para subtrair um sinal de fundo do primeiro e segundo sinais de leitura.
[000436] Em operação, os sensores 2-260 de um chip de sensor podem ser sujeitos a um procedimento de calibração de comprimento de onda antes da coleta de dados de um espécime a ser analisado. O procedimento de calibração de comprimento de onda pode incluir sujeitar os sensores a energias conhecidas diferentes tenham comprimentos de onda característicos que possam corresponder, ou não, aos comprimentos de onda de fluoróforo que pode ser usado com um chip de sensor. As energias diferentes podem ser aplicadas em uma sequência de modo que os sinais de calibração possam ser gravados a partir dos sensores para cada energia. Os sinais de calibração podem, então, ser armazenados como sinais de referência, que podem ser usados para processar a aquisição de dados reais e para determinar qual comprimento de onda ou comprimentos de onda de emissão são detectados pelos sensores.
[000437] Qualquer sensor adequado capaz de obter informações de distância de tempo pode ser usado para medições para detectar tempos de vida de marcadores luminescentes. Os sensores são alinhados de modo que cada cavidade de amostra tenha pelo menos uma região de sensor para detectar a luminescência da cavidade de amostra. Em algumas modalidades, o dispositivo integrado pode incluir matrizes de fotodiodo de avalanche modo Geiger e/ou matrizes de diodo de avalanche de único fóton (SPADs). O sensor pode incluir sensores CMOS de IR intensificado que podem incluir materiais de Si-Ge e/ou camadas modificadas tais como "silício preto". Esses materiais podem permitir que o sensor detecte marcadores luminescentes que emitem no infravermelho, e/ou são de outra forma fracamente detectados por CMOS sensores de IR não intensificado.
[000438] No presente documento é descrito um fotodetector integrado que pode medir com precisão, ou "compartimentar temporalmente", a temporização de chegada de fótons incidentes, e que pode ser usada em várias aplicações, tais como sequenciamento de ácidos nucleicos (por exemplo, sequenciamento de DNA), por exemplo. Em algumas modalidades, o fotodetector integrado pode medir a chegada de fótons com resolução de nanossegundo ou picossegundo, o que pode facilitar análise no domínio de tempo da chegada de fótons incidentes.
[000439] Algumas modalidades se referem a um circuito integrado que tem um fotodetector que produz carreadores de carga em resposta a fótons incidentes e que é capaz de discriminar a temporização em que os carreadores de carga são gerados pela chegada de fótons incidentes em relação a um tempo de referência (por exemplo, um evento desencadeador). Em algumas modalidades, uma estrutura de segregação de carreador de carga segrega os carreadores de carga gerados em tempos diferentes e direciona os carreadores de carga para uma ou mais regiões de armazenamento de carreador de carga (denominadas "compartimentos") que agregam carreadores de carga produzidos dentro de períodos de tempo diferentes. Cada compartimento armazena carreadores de carga produzidos dentro de um intervalo de tempo selecionado. A leitura da carga armazenada em cada compartimento pode fornecer informações sobre o número de fótons que chegaram dentro de cada intervalo de tempo. Esse circuito integrado pode ser usado em qualquer dentre várias aplicações, tais como aquelas descritas no presente documento.
[000440] Um exemplo de um circuito integrado que tem uma região de fotodetecção e um estrutura de segregação de carreador de carga será descrito. Em algumas modalidades, o circuito integrado pode incluir uma matriz de pixels, e cada pixel pode incluir uma ou mais regiões de fotodetecção e uma ou mais estruturas de segregação de carreador de carga, conforme discutido abaixo.
[000441] A Figura 7-5 mostra um diagrama de um pixel 100, de acordo com algumas modalidades. O pixel 100 inclui uma região de geração de absorção/carreador de fóton 102 (também denominada como uma região de fotodetecção), uma região de deslocamento/captura de carreador 106, uma região de armazenamento de carreador 108 que tem uma ou mais regiões de armazenamento de carreador de carga, também denominada no presente documento como "compartimentos de armazenamento de carreador de carga" ou simplesmente "compartimentos", e conjunto de circuitos de leitura 110 para leitura de sinais dos compartimentos de armazenamento de carreador de carga.
[000442] A região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode ser uma região de material semicondutor (por exemplo, silício) que pode converter os fótons incidentes em carreadores de carga fotogerados. A região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode ser exposta à luz, e pode receber fótons incidentes. Quando um fóton é absorvido pela região de geração de absorção/carreador de fóton 102 isso pode gerar carreadores de carga fotogerados, tais como um par elétron/furo. Os carreadores de carga fotogerados também são denominados, no presente documento, simplesmente como "carreadores de carga".
[000443] Um campo elétrico pode ser estabelecido na região de geração de absorção/carreador de fóton 102. Em algumas modalidades, o campo elétrico pode ser "estático", quando diferenciado do campo elétrico mutável na região de deslocamento/captura de carreador 106. O campo elétrico na região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode incluir um componente lateral, um componente vertical ou tanto um componente lateral com um vertical. O componente lateral do campo elétrico pode ser na direção descendente da Figura 7-5, conforme indicado pelas setas, que induz uma força em carreadores de carga fotogerados que aciona os mesmos em direção à região de deslocamento/captura de carreador 106. O campo elétrico pode ser formado de várias formas.
[000444] Em algumas modalidades, um ou mais eletrodos podem ser formados sobre a região de geração de absorção/carreador de fóton 102. O(s) eletrodos(s) pode(m) ter tensões aplicadas aos mesmos para estabelecer um campo elétrico na região de geração de absorção/carreador de fóton 102. Tal(tais) eletrodo(s) pode(m) ser denominado(s) "fotoportal (ou fotoportais)". Em algumas modalidades, a região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode ser uma região de silício que é totalmente desprovida de carreadores de carga.
[000445] Em algumas modalidades, o campo elétrico na região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode ser estabelecido por uma junção, tal como uma junção PN. O material semicondutor da região de geração de absorção/carreador de fóton 102 pode ser dopado para formar a junção PN com uma orientação e/ou formato que produz um campo elétrico que induz uma força em carreadores de carga fotogerados que aciona os mesmos em direção à região de deslocamento/captura de carreador 106. Em algumas modalidades, o terminal P do diodo de junção PN pode ser conectado a um terminal que define sua tensão. Esse diodo pode ser denominado como um fotodiodo "pinado". Um fotodiodo pinado pode promover recombinação de carreador na superfície, devido ao terminal que define sua tensão e atrai carreadores, que pode reduzir corrente escura. Os carreadores de carga fotogerados que se deseja capturar podem passar sob a área de recombinação na superfície. Em algumas modalidades, o campo elétrico lateral pode ser estabelecido com o uso de uma concentração de dopagem graduada no material semicondutor.
[000446] Conforme ilustrado na Figura 7-5, um fóton pode ser capturado e um carreador de carga 101A (por exemplo, um elétron) pode ser produzido no tempo t1. Em algumas modalidades, um gradiente de potencial elétrico pode ser estabelecido ao longo da região de geração de absorção/carreador de fóton 102 e da região de deslocamento/captura de carreador 106 o que faz com que o carreador de carga 101A se desloque na direção descendente da Figura 7-5 (conforme ilustrado pelas setas mostradas na Figura 7-5). Em resposta ao gradiente de potencial, o carreador de carga 101A pode se mover de sua posição no tempo t1 para uma segunda posição no tempo t2, uma terceira posição no tempo t3, uma quarta posição no tempo t4 e uma quinta posição no tempo t5. O carreador de carga 101A, desse modo, se move na região de deslocamento/captura de carreador 106 em resposta ao gradiente de potencial.
[000447] A região de deslocamento/captura de carreador 106 pode ser uma região semicondutora. Em algumas modalidades, a região de deslocamento/captura de carreador 106 pode ser uma região semicondutora do mesmo material que a região de geração de absorção/carreador de fóton 102 (por exemplo, silício) com a exceção de que a região de deslocamento/captura de carreador 106 pode ser blindada de luz incidente (por exemplo, por um material opaco sobreposto, tal como uma camada de metal).
[000448] Em algumas modalidades, e conforme discutido adicionalmente abaixo, um gradiente de potencial pode ser estabelecido na região de geração de absorção/carreador de fóton 102 e na região de deslocamento/captura de carreador 106 por eletrodos posicionados acima dessas regiões. No entanto, os conjuntos de procedimentos descritos no presente documento não são limitados como para as posições particulares de eletrodos usadas para produzir um gradiente de potencial elétrico. Tampouco são os conjuntos de procedimentos descritos no presente documento limitados a estabelecer um gradiente de potencial elétrico com o uso de eletrodos. Em algumas modalidades, um gradiente de potencial elétrico pode ser estabelecido com o uso de um perfil de dopagem graduado espacialmente. Qualquer conjunto de procedimentos adequado pode ser usado para estabelecer um gradiente de potencial elétrico que faz com que os carreadores de carga se desloquem ao longo da região de geração de absorção/carreador de fóton 102 e da região de deslocamento/captura de carreador 106.
[000449] Uma estrutura de segregação de carreador de carga pode ser formada no pixel para permitir a segregação de carreadores de carga produzidos em tempos diferentes. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção da estrutura de segregação de carreador de carga pode ser formada sobre a região de deslocamento/captura de carreador 106. Conforme será descrito abaixo, a estrutura de segregação de carreador de carga pode incluir um ou mais eletrodos formados sobre a região de deslocamento/captura de carreador 106, cuja tensão pode ser controlada por conjunto de circuitos de controle para mudar o potencial elétrico na região de deslocamento/captura de carreador 106.
[000450] O potencial elétrico na região de deslocamento/captura de carreador 106 pode ser mudado para permitir a captura de um carreador de carga. O gradiente de potencial pode ser mudado mudando-se a tensão em um ou mais eletrodos que sobrepõem a região de deslocamento/captura de carreador 106 para produzir uma barreira de potencial que pode confinar um carreador dentro de uma região espacial predeterminada. Por exemplo, a tensão em um eletrodo que se sobrepõe à linha tracejada na região de deslocamento/captura de carreador 106 da Figura 7-5 pode ser mudada no tempo t5 para levantar uma barreira de potencial ao longo da linha tracejada na região de deslocamento/captura de carreador 106 da Figura 7-5, para, desse modo, capturar o carreador de carga 101A. Conforme mostrado na Figura 7-5, o carreador capturado no tempo t5 pode ser transferido para um compartimento "bin0" da região de armazenamento de carreador 108. A transferência do carreador para o compartimento de carreador de carga armazenamento pode ser realizada mudando-se o potencial na região de deslocamento/captura de carreador 106 e/ou na região de armazenamento de carreador 108 (por exemplo, mudando-se a tensão do(s) eletrodo(s) que sobrepõem essas regiões) para fazer com que o carreador se desloque para o compartimento de carreador de carga armazenamento.
[000451] A mudança do potencial em um certo ponto no tempo dentro de uma região espacial predeterminada da região de deslocamento/captura de carreador 106 pode permitir prender um carreador que foi gerado por absorção de fóton que ocorreu dentro de um intervalo de tempo específico. Prendendo-se os carreadores de carga fotogerados em tempos e/ou localizações diferentes, os tempos nos quais os carreadores de carga foram gerados por absorção de fóton podem ser discriminados. Nesse sentido, um carreador de carga pode ser "compartimentado no tempo" prendendo-se o carreador de carga em um certo ponto no tempo e/ou espaço após a ocorrência de um evento desencadeador. A compartimentação de tempo de um carreador de carga dentro de um compartimento particular fornece informações sobre o tempo em que a carreador de carga fotogerado foi gerado por absorção de um fóton incidente, e, desse modo, igualmente ás "distâncias de tempo", em relação ao evento desencadeador, a chegada do fóton incidente que produziu o carreador de carga fotogerado.
[000452] A Figura 7-6 ilustra a captura de um carreador de carga em um ponto diferente no tempo e espaço. Conforme mostrado na Figura 7-6, a tensão em um eletrodo que se sobrepõe à linha tracejada na região de deslocamento/captura de carreador 106 pode ser mudada no tempo t9 para levantar uma barreira de potencial ao longo da linha tracejada na região de deslocamento/captura de carreador 106 da Figura 7-6, para, desse modo, capturar o carreador 101B. Conforme mostrado na Figura 7-6, o carreador capturado no tempo t9 pode ser transferido para um compartimento "bin1" da região de armazenamento de carreador 108. Uma vez que o carreador de carga 101B é preso no tempo t9, o mesmo representa um evento de absorção de fóton que ocorreu em um tempo diferente (isto é, tempo t6) do evento de absorção de fóton (isto é, em t1) para o carreador 101A, que é capturado no tempo t5.
[000453] A realização de múltiplas medições e agregação de carreadores de carga nos compartimentos de armazenamento de carreador de carga da região de armazenamento de carreador 108 com base nos tempos em que os carreadores de carga são capturados pode fornecer informações sobre os tempos em que os fótons são capturado na área de geração de absorção/carreador de fóton 102. Tais informações podem ser úteis em várias aplicações, conforme discutido acima.
[000454] Em algumas modalidades, a duração de tempo que cada distância de tempo captura após um pulso de excitação pode variar. Por exemplo, distâncias de tempo mais curtas podem ser usadas para detectar luminescência logo após o pulso de excitação, enquanto que distâncias de tempo mais longas podem ser usadas em tempos adicionais a partir de um pulso de excitação. Variando-se os intervalos de distância de tempo, a razão de sinal para ruído para medições do sinal elétrico associado a cada distância de tempo pode ser melhorada para um dado sensor. Uma vez que a probabilidade de um evento de emissão de fóton é superior logo após um pulso de excitação, uma distância de tempo dentro desse tempo pode ter um intervalo de tempo mais curto para considerar para o potencial de mais fótons a detectar. Embora em tempos mais longos, a probabilidade de emissão de fóton pode ser menor e uma detecção de distância de tempo dentro desse tempo pode ser mais longa para considerar um potencial de um número menor de fótons. Em algumas modalidades, uma distância de tempo com uma duração de tempo significativamente mais longa pode ser usada para distinguir entre múltiplos tempos de vida. Por exemplo, a maior parte das distâncias de tempo pode capturar um intervalo de tempo na faixa de aproximadamente 0,1 a 0,5 ns, enquanto que uma distância de tempo pode capturar um intervalo de tempo na faixa de aproximadamente 2 a 5 ns. O número de distâncias de tempo e/ou o intervalo de tempo de cada distância pode depender do sensor usado para detectar os fótons emitidos a partir do objeto de amostra. A determinação do intervalo de tempo para cada distância pode incluir a identificação dos intervalos de tempo necessários para o número de distâncias de tempo fornecidas pelo sensor para distinguir entre os marcadores luminescentes usados para a análise de uma amostra. A distribuição do histograma gravado pode ser comparada a histogramas conhecidos de marcadores sob condições e distâncias de tempo similares para identificar o tipo de marcador na cavidade de amostra. Modalidades diferentes do presente pedido podem medir os tempos de vida de marcadores mas variar nas energias de excitação usadas para excitar um marcador, no número de regiões de sensor em cada pixel e/ou no comprimento de onda detectado pelos sensores.
V. FONTES DE EXCITAÇÃO
[000455] A fonte de excitação 2-250 pode ser qualquer fonte adequada que seja disposta para entregar energia de excitação para pelo menos uma cavidade de amostra 2-111 do chip de teste. Os pixels no chip de teste podem ser pixels de fonte passiva. O termo "pixel de fonte passiva" é usado para se referira a um pixel em que a energia de excitação é entregue para o pixel a partir de uma região fora do pixel ou matriz de pixel do chip de teste, por exemplo, a excitação pode ser no instrumento.
[000456] De acordo com algumas modalidades, uma fonte de excitação pode excitar uma amostra por meio de um processo radioativo. Por exemplo, uma fonte de excitação pode fornecer radiação visível (por exemplo, radiação que tem um comprimento de onda entre cerca de 350 nm e cerca de 750 nm ), radiação próxima ao infravermelho (por exemplo, radiação que tem um comprimento de onda entre cerca de 0,75 mícron e cerca de 1,4 mícrons), e/ou radiação infravermelha de comprimento de onda curto (por exemplo, radiação que tem um comprimento de onda entre cerca de 1,4 mícrons e cerca de 3 mícrons) para pelo menos uma região de excitação 3-215 de pelo menos uma cavidade de amostra do chip de teste. Em algumas modalidades, uma fonte de excitação radiativa pode fornecer energia para excitar um intermediário (por exemplo, uma molécula, um ponto quântico ou uma camada de material que compreende moléculas e/ou pontos quânticos selecionados) que é imediatamente adjacente a uma região de excitação de uma cavidade de amostra. O intermediário pode transferir sua energia para uma amostra por meio de um processo não radioativo (por exemplo, por meio de FRET ou DET).
[000457] Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pode fornecer mais do que uma fonte de energia de excitação. Por exemplo, uma fonte de excitação radiativa pode entregar energias de excitação que têm duas ou mais características espectrais distintas. Como um exemplo, um LED de múltiplas cores pode emitir energias centradas em dois ou mais comprimentos de onda, e essas energias podem ser entregues para uma região de excitação de uma cavidade de amostra.
[000458] Em visão geral e de acordo com algumas modalidades, um instrumento pode incluir pelo menos uma fonte de excitação 2-250 para fornecer energia de excitação para pelo menos uma região de excitação de pelo menos uma cavidade de amostra do chip de teste ou para pelo menos um intermediário que converte ou acopla a energia de excitação para pelo menos uma amostra dentro de uma ou mais regiões de excitação. Conforme ilustrado na Figura 2-3, a energia de excitação de radiação 2-251 de uma fonte de excitação 2-250 pode incidir em uma região ao redor de uma cavidade de amostra 2-211, por exemplo. Em algumas modalidades, pode haver estruturas de acoplamento de excitação 2-223 que auxiliem na concentração da energia de excitação incidente dentro de uma região de excitação 2-215 da cavidade de amostra.
[000459] Uma fonte de excitação pode ser caracterizada por uma ou mais bandas espectrais distintas em que cada uma tem um comprimento de onda característico. Apenas para fins instrucionais, um exemplo de emissão espectral de uma fonte de excitação é retratado no gráfico espectral da Figura 8-1A. A energia de excitação pode ser contida substancialmente dentro de uma banda de excitação espectral 8-110. Um pico comprimento de onda 8-120 da banda de excitação espectral pode ser usado para caracterizar a energia de excitação. A energia de excitação também pode ser caracterizada por uma distribuição espectral, por exemplo, um valor de largura a meia altura (FWHM) conforme mostrado no desenho. Uma fonte de excitação que produz energia conforme retratado na Figura 8-1A, pode ser caracterizada como entregando energia em um comprimento de onda de radiação de 540 nm aproximadamente e que tem uma FWHM largura de banda de aproximadamente 55 nm.
[000460] A Figura 8-1B retrata as características espectrais de uma fonte de excitação (ou fontes de excitação) que pode fornecer duas bandas de energia de excitação para uma ou mais cavidades de amostra. De acordo com algumas modalidades, uma primeira banda de excitação 8-112 é de aproximadamente 532 nm, e uma segunda banda de excitação 8-114 é de aproximadamente 638 nm, conforme ilustrado no desenho. Em algumas modalidades, uma primeira banda de excitação pode ser de aproximadamente 638 nm, e uma segunda banda de excitação pode ser de aproximadamente 650 nm. Em algumas modalidades, uma primeira banda de excitação pode ser de aproximadamente 680 nm e uma segunda banda de excitação pode ser de aproximadamente 690 nm. De acordo com algumas modalidades, os picos das bandas de excitação podem ficar dentro de ±5 nm desses valores.
[000461] Em alguns casos, uma fonte de excitação radiativa pode produzir uma banda de excitação larga conforme retratado na Figura 8- 1A. Uma banda de excitação larga 8-110 pode ter uma largura de banda maior do que aproximadamente 20 nm, de acordo com algumas modalidades. Uma banda de excitação larga pode ser produzida por um diodo emissor de luz (LED), por exemplo. Em algumas implantações, uma fonte de excitação radiativa pode produzir uma banda de excitação estreita, conforme retratado na Figura 8-1B. Uma banda de excitação estreita pode ser produzida por um diodo laser, por exemplo, ou pode ser produzido por filtragem espectral de uma saída de um LED.
[000462] Em algumas modalidades, a fonte de excitação pode ser uma fonte de luz. Qualquer fonte de luz adequada pode ser usada. Algumas modalidades podem usar fontes incoerentes e outras modalidades podem usas fontes de luz coerentes. A título de exemplo e não de limitação, as fontes de luz incoerentes de acordo com algumas modalidades podem incluir tipos diferentes de diodos emissores de luz (LEDs) tais como LEDs orgânicos (OLEDs), pontos quânticos (QLEDs), LEDs de nanofios e LEDs semicondutores (in)orgânicos. A titulo de exemplo e não de limitação, fontes de luz coerentes de acordo com algumas modalidades podem incluir tipos diferentes de lasers tais como lasers orgânicos, lasers de ponto quântico, superfície de cavidade vertical que emite lasers (VCSELs), bordas emissoras de lasers e diodos laser de retorno distribuído (DFB). Adicional ou alternativamente, laser de guia de onda óptica planar acoplado (SCOWLs) ou outras estruturas de guia de onda de modo único assimétricas podem ser usadas. Adicional ou alternativamente, um laser de estado sólido tal como Nd:YAG ou Nd:Vidro, pulsados por diodos laser ou flashlamp, podem ser usados. Adicional ou alternativamente, um laser de fibra pulsado por diodo laser pode ser usado. Em algumas modalidades, a saída de uma fonte de excitação de laser pode ser dobrada em frequência para metade do comprimento de onda, em um cristal não linear, ou um Niobato de Lítio Polarizado Periodicamente (PPLN) ou outro cristal não linear polarizado periodicamente similar. Esse processo de duplicação de frequência pode permitir o uso de lasers eficientes para gerar comprimentos de onda mais adequados à excitação. Pode haver mais do que um tipo de fonte de excitação para uma matriz de pixels. Em algumas modalidades, tipos diferentes de fontes de excitação podem ser combinados. A fonte de excitação pode ser fabricada de acordo com tecnologias convencionais que são usadas para fabricar um tipo selecionado de fonte de excitação.
[000463] O comprimento de onda característico de uma fonte de energia de excitação pode ser selecionado com base em uma escolha de marcadores luminescentes que são usados na análise de teste. Em algumas implantações, o comprimento de onda característico de uma fonte de energia de excitação é selecionado para excitação direta (por exemplo, excitação de único fóton) de um fluoróforo escolhido. Em algumas implantações, o comprimento de onda característico de uma fonte de energia de excitação é selecionado para a excitação indireta (por exemplo, excitação de múltiplos fótons ou conversão de harmônica para um comprimento de onda quer irá fornecer excitação direta). Em algumas modalidades, a energia de excitação pode ser gerada por uma fonte de luz que é configurada para gerar energia de excitação em um comprimento de onda específico para aplicação a um poço de amostra. Em algumas modalidades, um comprimento de onda característico da fonte de excitação pode ser menor que um comprimento de onda característico da emissão correspondente a partir da amostra. Em algumas implantações, um comprimento de onda característico da fonte de excitação pode ser maior que um comprimento de onda característico de emissão a partir da amostra, e a excitação da amostra pode através de absorção de múltiplos fótons.
[000464] A fonte de excitação pode incluir uma bateria ou qualquer outra fonte de alimentação, que pode estar localizada em algum lugar que não seja no dispositivo de bioanálise integrado. Por exemplo, a fonte de excitação pode estar localizada em um instrumento e a potência pode ser acoplada ao dispositivo de bioanálise integrado por meio de fios condutores e conectores.
[000465] De acordo com algumas modalidades, uma ou mais fontes de excitação podem estar localizadas externas ao dispositivo integrado, e podem ser dispostas para liberar pulsos de luz para um dispositivo integrado que tem poços de amostra. Os pulsos de luz podem ser acoplados a uma pluralidade de poços de amostra e usados para excitar um ou mais marcadores dentro dos poços, por exemplo. As uma ou mais fontes de excitação podem liberar pulsos de luz para um ou mais comprimentos de onda característicos, de acordo com algumas implantações. Em alguns casos, uma fonte de excitação pode ser empacotada como um módulo permutável que se encaixa ou acopla a um instrumento-base, no qual o dispositivo integrado pode ser carregado. A energia de uma fonte de excitação pode ser liberada radiativa ou não radiativamente para pelo menos um poço de amostra ou para pelo menos uma amostra em pelo menos um poço de amostra. Em algumas implantações, uma fonte de excitação que tem uma intensidade controlável pode ser disposta para liberar energia de excitação para uma pluralidade de pixels de um dispositivo integrado. Os pixels podem ser dispostos em uma matriz linear (por exemplo, fileira ou coluna), ou em uma matriz em 2D (por exemplo, uma subárea da matriz de pixels ou toda a matriz de pixels).
[000466] Qualquer fonte de luz adequada pode ser usada para uma fonte de excitação. Algumas modalidades podem usar fontes de luz incoerentes e outras modalidades podem usar fontes de luz coerentes. A título de exemplos não limitantes, as fontes de luz incoerentes, de acordo com algumas modalidades, podem incluir diferentes tipos de diodos emissores de luz (LEDs) como LEDs orgânicos (OLEDs), pontos quânticos (QLEDs), LEDs de nanofios, e LEDs de semicondutores (in)orgânicos. A título de exemplos não limitantes, as fontes de luz coerentes de acordo com algumas modalidades podem incluir diferentes tipos de lasers como lasers semicondutores (por exemplo, lasers emissores em superfície de cavidade vertical (VCSELs), lasers emissores em borda, e diodos de laser de retroalimentação distribuída (DFB)). Adicional ou alternativamente, o laser de guia de onda óptico acoplado a placa (SCOWLs) ou outras estruturas de guia de onda de único modo assimétricas podem ser usados. Em algumas implantações, as fontes de luz coerentes podem compreender lasers orgânicos, lasers de ponto quântico e lasers de estado sólido (por exemplo, um laser de Nd:YAG ou ND:Glass, bombeado por lasers de diodo ou lâmpadas de flash). Em algumas modalidades, um laser de fibra bombeada por diodo laser pode ser usado. Uma fonte de luz coerente pode ser passivamente com modo travado para produzir pulsos ultracurtos. Pode haver mais de um tipo de fonte de excitação para uma matriz de pixels em um dispositivo integrado. Em algumas modalidades, diferentes tipos de fontes de excitação podem ser combinados. Uma fonte de excitação pode ser fabricada de acordo com tecnologias convencionais que são usadas para fabricar um tipo selecionado de fonte de excitação.
[000467] Por meio de introdução e sem limitar a invenção, uma disposição exemplificativa de uma fonte de luz coerente é retratada na Figura 8 a 2A. O desenho ilustra um instrumento analítico 8-200 que pode incluir uma fonte de excitação a laser pulsado ultracurto 8-210 como a fonte de excitação. O laser pulsado ultracurto 8-210 pode compreender um meio de ganho 8-205 (que pode ser um material de estado sólido em algumas modalidades), uma fonte de bomba para excitar o meio de ganho (não mostrado), e pelo menos dois espelhos de cavidade 8-202, 8-204 que definem extremidades de uma cavidade de laser óptico. Em algumas modalidades, pode haver um ou mais elementos ópticos adicionais na cavidade de laser para fins de modelagem de feixe, seleção de comprimento de onda e/ou formação de pulso. Quando em operação, a fonte de excitação de laser pulsado 8-210 pode produzir um pulso óptico ultracurto 8-220 que circula para trás e para frente na cavidade de laser entre os espelhos de extremidade da cavidade 8-202, 8-204 e através do meio de ganho 8205. Um dos espelhos de cavidade 8-204 pode transmitir, parcialmente, uma porção do pulso circulante, para que um trem de pulsos ópticos 8222 seja emitido a partir do laser pulsado 8-210. Os pulsos emitidos podem varrer um feixe (indicado pelas linhas tracejadas) que é caracterizado por uma cintura do feixe w.
[000468] Os perfis de intensidade temporais medidos 8-224 dos pulsos emitidos 8-222 podem aparecer conforme retratados na Figura 8 a 2A. Em algumas modalidades, os valores de intensidade de pico dos pulsos emitidos podem ser aproximadamente iguais, e os perfis 8-224 podem ter um perfil temporal gaussiano, embora outros perfis como um perfil de sech possam ser possíveis. Em alguns casos, os pulsos podem não ter perfis temporais simétricos e podem ter outros formatos temporais. Em algumas modalidades, a dinâmica de ganho e/ou perda pode produzir pulsos que têm perfis assimétricos. A duração de cada pulso pode ser distinguida por um valor de largura total a meia-altura (FWHM), conforme indicado na Figura 8 a 2A. Os pulsos ópticos ultracurtos podem ter valores de FWHM menores que 100 picossegundos.
[000469] Os pulsos que emitem a partir de uma fonte de excitação a laser podem ser separados por intervalos regulares T. Em algumas modalidades, T pode ser determinado por meio de taxas de modulação de ganho e/ou perda ativa no laser. Para lasers com modo travado, T pode ser determinado por um tempo de viagem de ida e volta entre os espelhos de extremidade de cavidade 8-202, 8-204. De acordo com algumas modalidades, o tempo de separação de pulso T pode estar entre cerca de 1 ns e cerca de 100 ns. Em alguns casos, o tempo de separação de pulso T pode estar entre cerca de 0,1 ns e cerca de 1 ns. Em algumas implantações, o tempo de separação de pulso T pode estar entre cerca de 100 ns e cerca de 2 ns.
[000470] Em algumas modalidades, um sistema óptico 8-240 pode operar em um feixe de pulsos 8-222 a partir de uma fonte de excitação a laser 8-210. Por exemplo, o sistema óptico pode incluir uma ou mais lentes para remodelar o feixe e/ou alterar a divergência do feixe. A remodelagem do feixe pode incluir aumentar ou diminuir o valor da cintura do feixe e/ou alterar um formato em corte transversal do feixe (por exemplo, elíptico para circular, circular para elíptico, etc.). A alteração da divergência do feixe pode compreender convergir ou divergir o fluxo de feixes. Em algumas implantações, o sistema óptico 8240 pode incluir um atenuador ou amplificador para alterar a quantidade de energia de feixe. Em alguns casos, o sistema óptico pode incluir elementos de filtragem de comprimento de onda. Em algumas implantações, o sistema óptico pode incluir elementos de modelagem de pulso, por exemplo, um esticador de pulso e/ou compressor de pulso. Em algumas modalidades, o sistema óptico pode incluir um ou mais elementos ópticos não lineares, como um absorvedor passível de saturação para reduzir um comprimento de pulso. De acordo com algumas modalidades, o sistema óptico 8-240 pode incluir um ou mais elementos que alteram a polarização de pulsos de uma fonte de excitação a laser 8-210.
[000471] Em algumas implantações, um sistema óptico 8-240 pode incluir um cristal não linear para converter o comprimento de onda de saída de uma fonte de excitação 8-210 para um comprimento de onda mais curto por meio de duplicação de frequência ou para um comprimento de onda mais longo por meio de amplificação paramétrica. Por exemplo, uma saída do laser pode ter frequência duplicada em um cristal não linear (por exemplo, em niobato de lítio periodicamente polarizado (PPLN)) ou outro cristal não linear não polarizado. Tal processo de duplicação de frequência pode permitir lasers mais eficazes para gerar comprimentos de onda mais adequados para a excitação de fluoróforos selecionados.
[000472] A expressão "comprimento de onda característico" ou "comprimento de onda" pode se referir a um comprimento de onda central ou predominante dentro de uma largura de banda de radiação limitada produzida por uma fonte de excitação. Em alguns casos, a mesma pode se referir a um comprimento de onda de pico em uma largura de banda de radiação produzida por meio de uma fonte de excitação. Um comprimento de onda característico de uma fonte de excitação pode ser selecionado com base em uma escolha de marcadores luminescentes ou sondas que são usadas em um dispositivo de bioanálise, por exemplo. Em algumas implantações, o comprimento de onda característico de uma fonte de energia de excitação é selecionado para excitação direta (por exemplo, excitação de único fóton) de um fluoróforo escolhido. Em algumas implantações, o comprimento de onda característico de uma fonte de excitação é selecionado para a excitação indireta (por exemplo, excitação de múltiplos fótons ou conversão de harmônica para um comprimento de onda quer irá fornecer excitação direta). Em algumas modalidades, a radiação de excitação pode ser gerada por uma fonte de luz que é configurada para gerar energia de excitação em um comprimento de onda específico para aplicação a um poço de amostra. Em algumas modalidades, um comprimento de onda característico da fonte de excitação pode ser menor que um comprimento de onda característico da emissão correspondente a partir da amostra. Por exemplo, uma fonte de excitação pode emitir radiação que tem um comprimento de onda característico entre 500 nm e 700 nm (por exemplo, 515 nm, 532 nm, 563 nm, 594 nm, 612 nm, 632 nm, 647 nm). Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pode fornecer energia de excitação centralizada em dois comprimentos de onda diferentes, como 532 nm e 593 nm, por exemplo.
[000473] Em algumas modalidades, uma fonte de excitação pulsada pode ser usada para excitar um marcador luminescente a fim de medir um tempo de vida de emissão do marcador luminescente. Isso pode ser útil para distinguir marcadores luminescentes com base no tempo de vida de emissão em vez de na cor ou comprimento de onda de emissão. Como um exemplo, uma fonte de excitação pulsada pode excitar periodicamente um marcador luminescente a fim de gerar e detectar eventos de emissão de fóton subsequentes que são usados para determinar um tempo de vida para o marcador. As medições de tempo de vida de marcadores luminescentes podem ser possíveis quando o pulso de excitação de uma fonte de excitação transitar de uma potência ou intensidade de pulso de pico para uma potência ou intensidade inferior (por exemplo, quase extinguível) em uma duração de tempo que é menor que o tempo de vida do marcador luminescente. É benéfico se o pulso de excitação terminar rapidamente, para que o mesmo não excite novamente o marcador luminescente durante uma fase pós- excitação quando um tempo de vida do marcador luminescente estiver sendo avaliado. A título de exemplo e sem limitação, a potência do pulso pode cair para aproximadamente 20 dB, aproximadamente 40 dB, aproximadamente 80 dB ou aproximadamente 120 dB menor que a potência de pico após 250 picossegundos. Em algumas implantações, a potência do pulso pode cair para aproximadamente 20 dB, aproximadamente 40 dB, aproximadamente 80 dB ou aproximadamente 120 dB menor que a potência de pico após 100 picossegundos.
[000474] Uma vantagem adicional de usar pulsos de excitação ultracurtos para excitar marcadores luminescentes consiste em reduzir o fotobranqueamento dos marcadores. A aplicação de energia de excitação contínua a um marcador pode branquear e/ou danificar um marcador luminescente ao longo do tempo. Muito embora uma potência de pulso de pico da fonte de excitação pode ser consideravelmente maior que um nível que danificaria rapidamente um marcador em exposição contínua, o uso de pulsos ultracurtos pode aumentar a quantidade de tempo e número de medições úteis antes de o marcador se tornar danificado pela energia de excitação.
[000475] Quando se usa uma fonte de excitação pulsada para discernir tempos de vida de marcadores luminescentes, o tempo entre os pulsos de energia de excitação podem ser tão longos quanto um tempo de vida mais longo dos marcadores a fim de observar e avaliar eventos de emissão após cada pulso de excitação. Por exemplo, o intervalo de tempo T (consulte a Figura 8 a 2B) entre pulsos de excitação pode ser mais longo que qualquer tempo de vida de emissão dos fluoróforos examinados. Nesse caso, um pulso subsequente pode não chegar antes de um fluoróforo excitado a partir de um pulso anterior ter tido uma quantidade de tempo razoável para fluorescer. Em algumas modalidades, o intervalo T precisa ser longo o suficiente para determinar um tempo entre um pulso de excitação que excita um fluoróforo e um fóton subsequente emitido pelo fluoróforo após terminação do pulso de excitação e antes do próximo pulso de excitação.
[000476] Embora o intervalo entre pulsos de excitação T deva ser longo o bastante para observar propriedades de caimento dos fluoróforos, também é desejável que T seja curto o bastante para permitir que muitas medições sejam realizadas em um período de tempo curto. A título de exemplo e sem limitação, os tempos de vida de emissão de fluoróforos usados em algumas aplicações podem estar na faixa de cerca de 100 picossegundos a cerca de 10 nanossegundos. Dessa maneira, os pulsos de excitação usados para detectar e/ou discernir tais tempos de vida podem ter durações (FWHM) que variam de cerca de 25 picossegundos a cerca de 2 nanossegundos, e podem ser fornecidos em taxas de repetição de pulso que variam de cerca de 20 MHz a cerca de 1 GHz.
[000477] Em mais detalhes, quaisquer técnicas adequadas para modular a energia de excitação para criar uma fonte de excitação pulsada para medições de tempo de vida podem ser usadas. A modulação direta de uma fonte de excitação, como um laser, pode envolver modular o sinal de acionamento elétrico da fonte de excitação para que a potência emitida esteja na forma de pulsos. A potência de entrada para uma fonte de luz, incluindo a potência de bombeamento óptico, e injeção de carreador em estado excitado e/ou remoção de carreador a partir de uma porção da região de ganho, pode ser modulada para afetar o ganho do meio de ganho, permitindo a formação de pulsos de energia de excitação através de modelagem de ganho dinâmica. Adicionalmente, o fator de qualidade (Q) do ressonador óptico pode ser modulado através de vários meios para formar pulsos com o uso de técnicas de Q-switching. Tais técnicas de Q-switching podem ser ativas e/ou passivas. Os modos longitudinais de uma cavidade ressonante de um laser podem ter fase travada para produzir uma série de pulsos de luz emitida através de travamento de modo. Tais técnicas de travamento de modo podem ser ativas e/ou passivas. Uma cavidade de laser pode incluir uma seção de absorção separada para permitir a modulação da densidade de carreador e controlar a perda de absorção dessa seção fornecendo, assim, mecanismos adicionais para modelar o pulso de excitação. Em algumas modalidades, um modulador óptico pode ser usado para modular um feixe de luz de onda contínua (CW) para estar na forma de um pulso de energia de excitação. Em outras modalidades, um sinal enviado para um modulador óptico acústico (AOM) acoplado a uma fonte de excitação pode ser usado para alterar a deflexão, intensidade, frequência, fase e/ou polarização da luz emitida para produzir uma energia de excitação pulsada. Os AOMs também podem ser usados para a varredura de feixe de onda contínua, Q- switching e/ou travamento de modo. Embora as técnicas acima sejam descritas para criar uma fonte de excitação pulsada, qualquer modo adequado para produzir uma fonte de excitação pulsada pode ser usado para medir tempos de vida de marcadores luminescentes.
[000478] Em algumas modalidades, as técnicas para formar uma fonte de excitação pulsada adequada para as medições de tempo de vida podem incluir modulação de um sinal elétrico de entrada que aciona a emissão de fóton. Algumas fontes de excitação (por exemplo, lasers de diodo e LEDs) convertem um sinal elétrico, como uma corrente de entrada, em um sinal de luz. As características do sinal de luz podem depender de características do sinal elétrico. Na produção de um sinal de luz pulsado, o sinal elétrico pode variar ao longo do tempo a fim de produzir um sinal de luz variável. A modulação do sinal elétrico para ter uma forma de onda específica pode produzir um sinal óptico com uma forma de onda específica. O sinal elétrico pode ter uma forma de onda senoidal com uma determinada frequência e os pulsos de luz resultantes podem ocorrer dentro do intervalo de tempos em relação à frequência. Por exemplo, um sinal elétrico com uma frequência de 500 MHz pode produzir um sinal de luz com pulsos a cada 2 nanossegundos. Os feixes combinados produzidos por fontes de excitação pulsadas distintas, independente de serem semelhantes ou diferentes entre si, podem ter uma diferença de trajetória abaixo de 1 mm.
[000479] Em algumas fontes de excitação, tais diodos de laser, o sinal elétrico altera a densidade do carreador e os fótons são produzidos através da recombinação de elétron e pares de orifícios. A densidade de carreador está relacionada ao sinal de luz de modo que quando a densidade de carreador estiver acima de um limiar, um número substancial de fótons coerentes seja gerado por meio de emissão estimulada. A corrente fornecida a um diodo de laser pode injetar elétrons ou carreadores no dispositivo e, desse modo, aumentar a densidade de carreador. Quando a densidade de carreador estiver acima de um limiar, os fótons podem ser gerados em uma taxa mais rápida do que a corrente que abastece os carreadores e, então, a densidade de carreador pode diminuir abaixo do limiar e a geração de fóton reduz. Com a geração de fóton reduzida, a densidade de carreador começa a aumentar novamente, devido à injeção de corrente continuada e a absorção de fótons e, aumenta eventualmente acima do limiar novamente. Esse ciclo leva às oscilações da densidade de carreador ao redor do valor limiar para geração de fóton, resultando em um sinal de luz oscilante. Essa dinâmica, conhecida como oscilações de relaxamento, pode levar a artefatos no sinal de luz devido às oscilações da densidade de carreador. Quando a corrente for inicialmente fornecida a um laser, pode haver oscilações antes de o sinal de luz alcançar uma potência estável devido às oscilações na densidade de carreador. Quando se forma uma fonte de excitação pulsada, as oscilações da densidade de carreador podem introduzir artefatos para um sinal de luz pulsado. Por exemplo, a plotagem na Figura 8-3 ilustra como a densidade de carreador pode ter oscilações de relaxamento e um sinal de luz correspondente com potência oscilante através de modulação por meio de comutação de ganho. Os artefatos de tais oscilações de relaxamento podem ampliar um sinal de luz pulsado e/ou produzir um rastro no sinal de luz, limitando os tempos de vida que podem ser detectados por tal fonte de luz pulsada uma vez que o sinal de excitação pode se sobrepor com fótons emitidos por um marcador luminescente.
[000480] Em algumas modalidades, as técnicas para encurtar a duração de tempo de um pulso de excitação podem ser usadas para reduzir a energia de excitação necessária para detectar marcadores luminescentes e, desse modo, reduzir ou atrasar o branqueamento e outros danos aos marcadores luminescentes. As técnicas para encurtar a duração de tempo do pulso de excitação podem ser usadas para reduzir a potência e/ou intensidade da energia de excitação após um valor máximo ou pico do pulso de excitação, permitindo a detecção de tempos de vida mais curtos. Tais técnicas podem acionada eletricamente a fonte de excitação a fim de reduzir a potência de excitação após a potência de pico. Isso pode suprimir um rastro do pulso conforme mostrado na plotagem 8-401 da Figura 8-4. Um sinal de acionamento elétrico pode ser ajustado para acionar a intensidade do pulse de energia de excitação para zero tão rapidamente quanto possível após o pulso de pico. Um exemplo de um sinal de acionamento elétrico ajustado combinado com a comutação de ganho é mostrado na plotagem 8-402 da Figura 8-4. Tal técnica pode envolver inverter a indicação de um sinal de acionamento elétrico após a potência de pico ser produzida. Tal sinal de acionamento elétrico ajustado pode produzir uma saída óptica mostrada na plotagem 8-403 da Figura 8-4. O sinal elétrico pode ser ajustado para reduzir rapidamente a densidade de carreador após a primeira oscilação de relaxamento ou primeira oscilação do sinal óptico. Reduzindo-se a densidade de carreador após a primeira oscilação, um pulso de luz apenas da primeira oscilação pode ser gerado. O sinal elétrico pode ser configurado para gerar um pulso curto que desativa o sinal de luz rapidamente reduzindo-se o número de fótons emitidos após um pico no sinal, como mostrado pela plotagem na Figura 8-5 que mostra a saída de sinal de tal sinal elétrico. Um sistema de diodo de laser de picossegundo pode ser projetado para emitir pulsos de luz, de acordo com algumas modalidades. A Figura 8-6 ilustra uma plotagem de um pulso de luz exemplificativo com um pico de 985 mW, uma largura de 84. 3 picossegundos, e um sinal reduzido por aproximadamente 24,3 dB aproximadamente 250 picossegundos após o pico. Em algumas modalidades, os absorvedores passíveis de saturação, incluindo absorvedores passíveis de saturação semicondutores (SESAMs) podem ser usados para suprimir o rastro óptico. Em tais modalidades, o uso dos absorvedores passíveis de saturação pode suprimir o rastro óptico por 3 a 5 dB ou, em alguns casos, mais de 5 dB. A redução dos efeitos de um rastro no pulso de excitação pode reduzir e/ou eliminar quaisquer requisitos na filtragem adicional da energia de excitação, aumentar a faixa de tempos de vida que pode ser medida e/ou possibilitar taxas de pulso mais rápidas. O aumento da taxa de pulso de excitação pode possibilitar que mais experimentos sejam conduzidos em um dado tempo, o que pode diminuir o tempo necessário para adquirir estatísticas suficientes para identificar um tempo de vida para um marcador que identifica um objeto de amostra.
[000481] Adicionalmente, duas ou mais dessas técnicas podem ser usadas juntas para gerar energia de excitação pulsada. Por exemplo, a energia de excitação pulsada emitida a partir de uma fonte diretamente modulada pode ser adicionalmente modificada com o uso de técnicas de modulação óptica. As técnicas para modular o pulso de excitação e ajustar o sinal de acionamento de pulso elétrico podem ser combinadas de qualquer modo adequado para otimizar uma energia de excitação pulsada para realizar as medições de tempo de vida. Um sinal de acionamento elétrico ajustado pode ser aplicado a uma energia de excitação pulsada a partir de uma fonte diretamente modulada.
[000482] Em algumas modalidades, um diodo de laser que tem um determinado número de ligações de fios pode ser usado como uma fonte de excitação pulsada. Os diodos de laser com mais ligações de fios podem reduzir a indutância da fonte de excitação. Os diodos de laser que têm uma indutância menor (representada pelo indutor 8-701 da Figura 8-7) podem possibilitar que a corrente no laser opere em uma frequência maior. Conforme mostrado na Figura 8-7, quando acionada por um pulso de 18 V em uma linha de transmissão de 50 ohms, uma fonte de laser Oclaro 8-700 com uma resistência em série de 3 ohms (representada pelo resistor 8-702) e 36 ligações de fios tem uma corrente maior em frequências mais altas do que as fontes de laser com menos ligações de fios. A seleção de um método de empacotamento para minimizar a indutância pode aprimorar a potência fornecida à fonte de excitação em frequências mais altas, possibilitando pulsos de excitação mais curtos, reduções mais rápidas de potência óptica após o pico, e/ou taxa de repetição de pulso aumentada para detectar marcadores luminescentes.
[000483] Em algumas modalidades, uma linha de transmissão em combinação com uma fonte de excitação pode ser usada para gerar pulsos de luz. A linha de transmissão pode equiparar a impedância de um diodo de laser a fim de aprimorar o desempenho e/ou a qualidade de pulsos de luz. Em algumas modalidades, a impedância da linha de transmissão pode ser 50 ohms. Em algumas ocasiões, a resistência de terminação pode ser semelhante à resistência da linha a fim de evitar reflexões. Alternativa ou adicionalmente, a impedância de terminação pode ser semelhante à impedância da linha a fim de evitar reflexões. A impedância de terminação pode ser menor que a impedância da linha a fim de refletir um pulso negativo. Em outras modalidades, a impedância de terminação pode ter um componente capacitivo ou indutivo a fim de controlar o formato do pulso de reflexão negativo. Em outras modalidades, a linha de transmissão pode permitir uma frequência mais alta de pulsos. A Figura 8-8A ilustra um protótipo exemplificativo de um pulsar de linha de transmissão, e a Figura 8-8B ilustra perfis temporais exemplificativos de pulsos de luz obtidos com uma linha de transmissão. O uso de uma linha de transmissão pode produzir pulsos elétricos que têm uma frequência dentro de uma faixa de 40 MHz a 500 MHz. Uma linha de transmissão pode ser usada em combinação com um sinal elétrico ajustado descrito acima a fim de produzir uma fonte de luz pulsada com pulsos de luz que têm uma determinada duração de tempo e um intervalo de tempo específico.
[000484] As técnicas para ajustar o sinal elétrico para aprimorar a produção de pulsos de luz podem incluir conectar a fonte de excitação a um circuito com uma capacidade de polarização negativa. Em algumas modalidades, uma polarização negativa pode ser fornecida em uma fonte de excitação após emissões de um pulso de luz para reduzir a emissão de um rastro no pulso de luz. A Figura 8-9 ilustra um circuito exemplificativo 8-900 que contém uma fonte de corrente 8-901, laser de diodo 8-902, resistor 8-903, capacitor 8-904 e comutador 8-905 que pode ser implantado para reduzir a presença de um rastro em um pulso de luz. Tal circuito 8-900 pode criar uma corrente constante que desvia o laser de diodo 8-902 quando o comutador 8-905 for fechado, ou em um estado condutor. Quando o comutador 8-905 estiver aberto, o comutador 8-905 pode ter uma alta resistência e a corrente pode fluir através do laser de diodo 8-902. Os pulsos de luz podem ser gerados abrindo-se e fechando-se o comutador 8-905 para fornecer corrente intermitente para o laser de diodo 8-902. Em alguns casos, o resistor 8903 pode ser suficientemente alto e o capacitor 8-904, suficientemente pequeno de modo que haja uma tensão através do capacitor 8-904 quando o comutador 8-905 estiver aberto e o laser de diodo 8-902 emitir luz. Quando o comutador 8-905 for fechado, a tensão através do capacitor 8-904 irá inverter a polarização do laser de diodo 8-902. Tal polarização inversa pode reduzir ou eliminar a presença de um rastro no pulso de luz. Em tais casos, o comutador 8-905 pode ser configurado para fechar após o pico do pulso de luz a fim de reduzir a potência do laser logo após o pulso de luz de pico. O valor do resistor 8-903 no circuito 8-900 pode ser selecionado de modo que a carga no capacitor 8-904 descarregue antes de o comutador ser subsequentemente aberto e/ou um pulso de luz subsequente ser gerado pelo diodo de laser 8-902.
[000485] Os componentes de circuito adicionais podem ser fornecidos para ajustar um sinal elétrico de um diodo de laser a fim de produzir pulsos de luz. Em algumas modalidades, múltiplos capacitores, resistores e tensões podem ser conectados como um circuito em rede para controlar a forma de onda de um sinal elétrico fornecido a um diodo de laser. Uma forma de onda controlada pode ser criada comutando-se inúmeras tensões, V1, V2, ..., VN com sinais correspondentes S1, S2, ..., SN quando houver N subcircuitos de capacitor. Um circuito em rede exemplificativo de quatro subcircuitos de capacitor for mostrado na Figura 8-10 em que uma forma de onda elétrica controlada pode ser criada por tensões de comutação V1, V2, V3, e V4 com sinais S1, S2, S3, e S4, respectivamente. Em algumas modalidades, as tensões V1, V2, V3 e V4 podem ser variáveis. No exemplo mostrado na Figura 8-10, V4 é negativa para o laser e pode criar uma polarização inversa dependendo do sinal S4. A temporização da frequência de pulsos de luz emitida pelo laser, a duração de cada pulso de luz, e os recursos de cada pulso de luz podem ser ajustados com as entradas de sinal S1, S2, S3 e S4. Em algumas modalidades, a resistência adicional pode ser adicionada para baixar a corrente de pico. Em tais casos, a resistência pode ser adicionada após um ou mais dos comutadores S1, S2, S3, S4. Embora a Figura 8-10 mostre uma configuração com quatro capacitores e quatro tensões, qualquer configuração adequada e qualquer número adequado de componentes de circuito adicionais podem ser fornecidos para produzir um sinal elétrico ajustado para o diodo de laser para gerar pulsos de luz para medições de tempo de vida.
[000486] Em algumas modalidades, um sinal elétrico para gerar pulsos de luz pode usar um circuito que tem componentes distintos, incluindo componentes de radiofrequência (RF) e/ou de micro-ondas. Os componentes discretos que podem estar incluídos em tal circuito são bloqueadores de CC, adaptadores, portas lógicas, terminadores, desviadores de fase, atrasos, atenuadores, combinadores e/ou amplificadores de RF. Tais componentes podem ser usados para criar um sinal elétrico positivo que tem uma determinada amplitude seguido por um sinal elétrico negativo com uma outra amplitude. Pode haver um atraso entre os sinais elétricos positivo e negativo. A Figura 8-11A ilustra um circuito exemplificativo que tem um amplificador de RF que pode ser usado para produzir um sinal elétrico ajustado como um pulso de saída, como o perfil de pulso mostrado na Figura 8-11B, que pode ser fornecido a uma fonte de excitação, como um diodo de laser, para emitir um pulso de luz. Em outras modalidades, um circuito pode produzir múltiplos sinais elétricos combinados para formar um sinal de pulso elétrico configurado para acionar uma fonte de excitação. Tal circuito pode produzir uma saída diferencial que pode ser usada para aumentar a potência do pulso de luz. Ajustando-se os componentes discretos do circuito, o sinal elétrico de saída pode ser ajustado para produzir um pulso de luz adequado para medições de tempo de vida. Em um exemplo mostrado na Figura 8-12A, dois amplificadores de RF são usados para produzir um sinal de pulso de saída que tem um perfil mostrado na Figura 8-12B que consiste em um pulso de sinal elétrico positivo e um pulso de sinal elétrico negativo correspondente em que os pulsos de sinal elétrico positivo e negativo se sobrepõem e têm uma largura semelhante.
[000487] Em algumas modalidades, as fontes de excitação podem ser combinadas para gerar pulsos de luz para medições de tempo de vida. As fontes pulsadas sincronizadas podem ser acopladas a um circuito ou carga em uma determinada distância. Em algumas modalidades, as fontes de excitação podem ser acopladas em paralelo a um circuito. As fontes de excitação podem ser a partir da mesma fonte ou de múltiplas fontes. Em algumas modalidades com múltiplas fontes, as múltiplas fontes podem variar no tipo de fonte de excitação. Quando se combinam fontes, pode ser importante considerar a impedância do circuito e as fontes de excitação a fim de ter potência suficiente fornecida para as fontes de excitação. A combinação de fontes pode ser obtida com o uso de uma ou mais das técnicas descritas acima para produzir uma fonte de excitação pulsada. A Figura 8-13A ilustra um esquemático para combinar quatro fontes diferentes que têm um ou mais valores de impedância. A Figura 8-13B mostra uma plotagem de corrente, eficiência de potência e tensão em função da impedância. Essa modalidade exemplificativa mostra 4 fontes que entregam potência em linhas de transmissão de 50 ohms e essa entrega potência ideal ocorre quando a impedância da carga é igual à razão da impedância das linhas individuais para as inúmeras fontes.
[000488] Uma fonte de excitação pode incluir uma bateria ou qualquer outra fonte de alimentação disposta para fornecer potência para a fonte de excitação. Por exemplo, uma fonte de excitação pode estar localizada em um instrumento-base e sua potência de operação pode ser recebida através de um dispositivo de bioanálise integrado ao qual o mesmo está acoplado (por exemplo, por meio de fios condutores de potência). Uma fonte de excitação pode ser controlada independentemente ou em colaboração com o controle de um dispositivo de bioanálise integrado. Apenas como um exemplo, os sinais de controle para uma fonte de excitação podem ser fornecidos para a fonte de excitação de modo sem fio ou por meio de uma interconexão com fio (por exemplo, uma interconexão por USB) com um computador pessoal e/ou o dispositivo de bioanálise integrado.
[000489] Em algumas implantações, uma fonte de excitação pode ser operada de uma maneira com acionada por tempo e/ou sincronizada com um ou mais sensores de um dispositivo integrado. Por exemplo, uma fonte de excitação pode ser ativada para excitar um marcador luminescente e, então, desativada. O sensor pode ser desativado enquanto a fonte de excitação for ativada e, então, pode ser ativada para um intervalo de amostragem após a fonte de excitação ser desativada. Em algumas modalidades, o sensor pode ser ativado enquanto a fonte de excitação é ativada.
[000490] Em algumas modalidades, um laser de 50 mW Osram PL é usado, como um exemplo, para fornecer uma luz de excitação de 520 nm. Alternativamente, uma luz de excitação de 530 nm ou 532 nm é usada. Alternativa e/ou adicionalmente, o laser de 70mW Thorlabs LP637-SF70 é usado, como um exemplo, para fornecer uma luz de excitação de 637 nm. Um outro exemplo é um diodo de laser Oclaro HL63133 que fornece excitação a 638 nm. Essas fontes de laser ou outras fontes de laser adequadas podem ser usadas por si só ou em combinação. Uma ou mais fontes de laser são usadas e a luz de excitação de cada fonte é combinada em um combinador de feixe e, então, direcionado para o chip de teste. Cada fonte de luz pode ser acoplada a uma fibra óptica, cujo total pode, então, ser agrupado. As características ópticas da luz que sai do agrupamento de fibras podem ser controladas com o uso de um elemento de modelagem óptico (OSE). Opcionalmente, um multiplexador pode ser usado em que a luz de laser de múltiplas fontes de luz é multiplexada por meio de polarização, comprimento de onda e/ou parâmetros espaciais e enviados através de uma única fibra óptica. Um elemento óptico difrativo (DOE) pode ser usado para separar espectralmente os diferentes comprimentos de onda para que os mesmos sejam direcionados para um dos quatro subsensores.
A. MÚLTIPLAS FONTES DE EXCITAÇÃO
[000491] As múltiplas fontes de excitação podem fornecer luz que tem energias ou comprimentos de onda diferentes para a pluralidade de poços de amostra. Cada uma das múltiplas fontes de excitação pode fornecer luz que tem um comprimento de onda característico ou energia diferente. Um ou mais marcadores podem ser identificados com base na possibilidade de a luz de uma fonte de excitação excitar um marcador de modo que o marcador emita um fóton. Dessa maneira, os marcadores podem ser identificados com base em seu espectro de absorção medindo-se a resposta de uma amostra após iluminar a amostra com luz de diferentes fontes de excitação. Por exemplo, uma amostra que tem um marcador pode ser iluminada com luz de uma primeira fonte de excitação seguida pela luz de uma segunda fonte de excitação. Se o marcador emitir luminescência em resposta a ser iluminada pela luz da primeira fonte de excitação, então, o marcador pode ter um espectro de absorção que se sobrepõe com o comprimento de onda característico da primeira fonte de excitação.
[000492] Em algumas modalidades, é possível usar uma pluralidade de fontes de excitação para a energia de excitação. Essa pluralidade de fontes pode ser, por exemplo, implantada como uma barra de laser de diodo que compreende múltiplos emissores de laser de diodo. Na fabricação de diodos de laser, múltiplos emissores são comumente fabricados por meio de litografia em um único substrato e, então, divididos em pedaços de único emissor para empacotamento individual. Mas, também é possível dividir o substrato em pedaços com uma pluralidade de emissores. Em algumas modalidades, os emissores são quase idênticos, e podem ser espaçados igualmente entre si para tolerâncias litográficas, tipicamente da ordem de 0,1 micrômetro.
VI. MÉTODO DE USO, OPERAÇÃO DE INSTRUMENTO E INTERFACE DE USUÁRIO
[000493] O instrumento 2-120 pode ser controlado com o uso de software e/ou hardware. Por exemplo, o instrumento pode ser controlado com o uso de um dispositivo de processamento 1-123, como um ASIC, um FPGA e/ou um processador de uso geral que executa software.
[000494] A Figura 9-1 ilustra um fluxograma da operação do instrumento 2-120 de acordo com algumas modalidades. Após um usuário ter adquirido um espécime para análise, o usuário começa uma nova análise na ação 9-101. Isso pode ser feito fornecendo-se uma indicação ao instrumento 2-120 por meio da interface de usuário 2-125, por exemplo, pressionando-se um botão. Na ação 9-103, o instrumento 2-120 verifica se o chip de teste 2-110 de uma análise realizada anteriormente ainda é inserido no instrumento 2-120. Se for determinado que um chip de teste antigo está presente, então, a potência para a fonte de excitação pode ser desativada na ação 9-105, o usuário é instruído na ação 9-107 a ejetar o chip de teste anterior com o uso de um indicador da interface de usuário 2-125 e do instrumento 2120 a esperar que o chip de teste antigo seja ejetado na ação 9-109.
[000495] Quando o chip de teste anterior for ejetado pelo usuário, ou se o instrumento 2-120 determinou na ação 9-103 que o chip de teste anterior já foi removido, o usuário é instruído a inserir um novo chip de teste 2-110 para a nova análise na ação 9-111. O instrumento 2-120 espera, então, para que o novo chip de teste 2-110 seja inserido na ação 9-113. Quando o usuário inserir o novo chip de teste, o usuário é instruído na ação 9-115 por um indicador da interface de usuário 2-125 a colocar o espécime a ser analisado na superfície de topo exposta do chip de teste 2-110 e também é instruído a fechar a tampa no instrumento 2-120. O instrumento 2-120 espera, então, que a tampa seja fechada na ação 9-117. Quando a tampa foi fechada pelo usuário, na ação 9-119, a fonte de excitação pode ser acionada para produzir energia de excitação para excitar as porções de amostra do espécime presente nos poços de amostra do chip de teste 2-110. Na ação 9-121, a energia de emissão das amostras é detectada pelo sensor 2-122 e os dados do sensor 2-122 são transmitidos continuamente para o dispositivo de processamento 2-123 para análise. Em algumas modalidades, os dados podem ser transmitidos continuamente para o dispositivo de computação externo 2-130. Na ação 2-123, o instrumento 2-120 verifica se a aquisição de dados está concluída. A aquisição de dados pode ser concluída após uma duração de tempo específica, um número específico de pulsos de excitação da fonte de excitação ou um alvo específico foi identificado. Quando a aquisição de dados for concluída, a análise de dados é finalizada em 9-125.
[000496] A Figura 9-2 ilustra uma rotina de autocalibração exemplificativa de acordo com algumas modalidades. A rotina de calibração pode ser executada em qualquer momento adequado antes da análise de um espécime. Por exemplo, isso pode ser feito por um fabricante para cada instrumento antes do envio para o usuário final. Alternativamente, o usuário final pode realizar uma calibração em qualquer momento adequado. Conforme discutido acima, o instrumento 2-120 tem capacidade de distinguir entre energia de emissão que tem diferentes comprimentos de onda emitidos a partir de diferentes amostras. O instrumento 2-120 e/ou dispositivo de computação 2-130 pode ser calibrado com a calibração associada a cada cor de luz específica associada a, por exemplo, uma etiqueta luminescente usada para etiquetar moléculas de um espécime que é analisado. Desse modo, o sinal de saída preciso associado a uma cor específica pode ser determinado.
[000497] Para calibrar o dispositivo, um espécime de calibração associado a uma única etiqueta luminescente é fornecido para o instrumento 2-120 um de cada vez. A autocalibração começa na ação 9-201 quando um usuário coloca um espécime que compreende etiquetas luminescentes que emitem energia de emissão de um único comprimento de onda em um chip de teste 2-110 e insere o chip de teste 2-110 no instrumento 2-120. Com o uso da interface de usuário 2-125, o usuário instrui o instrumento 2-120 a começar a autocalibração. Em resposta, na ação 9-203, o instrumento 2-120 executa a análise por calibração iluminando-se o chip de teste 2-110 com energia de excitação e medindo-se a energia de emissão de único comprimento de onda a partir do espécime de calibração. O instrumento 2-120 pode, então, na ação 9-205, economizar padrão de detecção medido na matriz de subsensores do sensor 2-122 para cada pixel da matriz de sensores. O padrão de detecção para cada etiqueta luminescente pode ser considerado uma assinatura de detecção associada à etiqueta luminescente. Desse modo, as assinaturas podem ser usadas como um conjunto de dados de treinamento usado para analisar os dados recebidos de amostras desconhecidas analisadas nas execuções de análise subsequente.
[000498] A rotina de calibração pode ser, então, executada para o espécime de calibração associado a uma única etiqueta luminescente. Desse modo, cada sensor 2-122 da matriz de pixels é associado aos dados de calibração que podem ser usados para determinar a etiqueta luminescente presente em um poço de amostra durante uma análise subsequente implantada na ação 9-207 após a competição da rotina de calibração.
[000499] A Figura 9-3 ilustra adicionalmente como os dados de calibração podem ser adquiridos e usados para analisar os dados de acordo com algumas modalidades. Na ação 9-301, os dados de calibração são obtidos a partir de sensores. Isso pode ser feito com o uso da rotina de autocalibração mencionada anteriormente. Na ação 9303, uma matriz de transformação é gerada com base nos dados de calibração. A matriz de transformação mapeia os dados de sensor para o comprimento de onda de emissão de uma amostra e é uma matriz m x n, em que m é o número de etiquetas luminescentes com diferentes comprimentos de onda de emissão e n é o número de subsensores usados para detectar a energia de emissão por pixel. Desse modo, cada coluna da matriz de transformação representa os valores de calibração para o sensor. Por exemplo, se houver quatro subsensores por pixel ou cinco etiquetas luminescentes diferentes, então, a matriz de transformação é uma matriz 4 x 5 (isto é, quatro fileiras e cinco colunas) e cada coluna está associada a uma etiqueta luminescente diferente, os valores na coluna que correspondem aos valores medidos obtidos a partir dos subsensores durante a rotina de autocalibração. Em algumas modalidades, cada pixel pode ter sua própria matriz de transformação. Em outras modalidades, os dados de calibração de pelo menos alguns dos pixels podem ter a média calculada e todos os pixels podem, então, usar a mesma matriz de transformação com base nos dados com média calculada.
[000500] Na ação 9-305, os dados de análise associados a um bioensaio são obtidos a partir dos sensores. Isso pode ser feito em qualquer um dos modos descritos acima. Na ação 9-307, o comprimento de onda da energia de emissão e/ou a identidade da etiqueta luminescente pode ser determinado com o uso da matriz de transformação e dos dados de análise. Isso pode ser feito de qualquer modo adequado. Em algumas modalidades, os dados de análise são multiplicados pela pseudoinversa da matriz de transformação, resultando em um vetor m x 1. A etiqueta luminescente associada ao componente de vetor com o valor máximo pode, então, ser identificada como a etiqueta luminescente presente no poço de amostra. As modalidades não se limitam a essa técnica. Em algumas modalidades, realiza-se a prevenção de patologias possíveis que possam surgir quando a inversa de uma matriz com valores pequenos, uma rotina de otimização restrita, como um método de mínimos quadrados ou uma técnica de probabilidade máxima, pode ser realizado para determinar a etiqueta luminescente presente no poço de amostra.
[000501] O método anterior de usar os dados de calibração para analisar dados dos sensores pode ser implantado por um processador adequado. Por exemplo, o dispositivo de processamento 2-123 do instrumento 2-120 pode realizar a análise, ou o dispositivo de computação 2-130 pode realizar a análise.
VII. MEDIÇÕES EXEMPLIFICATIVAS COM O CHIP DE TESTE E INSTRUMENTO
[000502] As medições para detectar, analisar e/ou sondar moléculas em uma amostra podem ser obtidas com o uso de qualquer combinação do chip de teste e instrumento descrita no presente pedido. A fonte de excitação pode ser uma fonte de excitação pulsada ou, em alguns casos, uma fonte de onda contínua. Um marcador luminescente etiquetado para uma amostra específica pode indicar a presença da amostra. Os marcadores luminescentes podem ser distinguidos pela energia de excitação, energia de emissão e/ou pelo tempo de vida da energia de emissão emitida por um marcador. Os marcadores com comprimentos de onda de emissão de luminescência semelhantes podem ser identificados determinando-se o tempo de vida para cada marcador. Adicionalmente, os marcadores com tempos de vida semelhantes podem ser identificados através do comprimento de onda de emissão de luminescência para cada marcador. Com o uso de marcadores, em que os marcadores são identificados por uma combinação das propriedades temporais e/ou espectrais da luminescência emitida, pode-se realizar uma análise quantitativa e/ou indicação de marcadores e amostras associadas.
[000503] Medições de tempo de vida podem ser usadas para determinar que um marcador está presente em uma cavidade de amostra. O tempo de vida de um marcador luminescente pode ser identificado realizando-se múltiplos experimentos em que o marcador luminescente é excitado em um estado excitado e, então, o tempo quando um fóton emite é medido. A fonte de excitação é pulsada para produzir um pulso de energia de excitação e direcionado para o marcador. O tempo entre o pulso de excitação e um evento de emissão de fóton subsequente de um marcador luminescente é medido. Repetindo-se tais experimentos com uma pluralidade de pulsos de excitação, o número de vezes que um fóton emite dentro de um intervalo de tempo específico pode ser determinado. Tais resultados podem popular um histograma que representa o número de eventos de emissão de fóton que ocorrem dentro de uma série de intervalos de tempo ou distâncias de tempo discretos. O número de distâncias de tempo e/ou o intervalo de tempo de cada distância pode ser ajustado para identificar um conjunto específico de tempos de vida e/ou marcadores.
[000504] A seguir está uma descrição de medições exemplificativas que podem ser feitas para identificar marcadores luminescentes em algumas modalidades. Especificamente, exemplos de distinção de marcadores luminescentes com o uso de apenas uma medição de tempo de vida luminescente, uma medição de tempo de vida espectral e luminescente conjunta e apenas uma medição de tempo de vida luminescente, porém, com o uso de duas energias de excitação diferentes, são discutidos. As modalidades não são limitadas aos exemplos descritos abaixo. Por exemplo, algumas modalidades podem identificar os marcadores luminescentes com o uso apenas de medições espectrais.
[000505] Quaisquer marcadores luminescentes adequados podem ser usados. Em algumas modalidades, fluoróforos disponíveis para comercialização podem ser usados. A título de exemplo e sem limitação, os fluoróforos a seguir podem ser usados: Atto Rho14 ("ATRho14"), Dylight 650 ("D650"), SetaTau 647 ("ST647"), CF 633 ("C633"), CF 647 ("C647"), Alexa fluor 647 ("AF647"), BODIPY 630/650 ("B630"), CF 640R ("C640R") e/ou Atto 647N ("AT647N").
[000506] Adicional e/ou opcionalmente, marcadores luminescentes podem ser modificados de qualquer forma adequada para aumentar a velocidade e precisão do processo de análise da amostra. Por exemplo, um fotoestabilizador pode ser conjugado a um marcador luminescente. Exemplos de fotoestabilizadores incluem, porém sem limitação, sequestrantes de oxigênio ou supressores de estado de tripleto. Fotoestabilizadores de conjugação ao marcador luminescente podem aumentar a taxa de fótons emitidos e pode também reduzir um efeito "piscante" em que o marcador luminescente does não emite fótons. Em algumas modalidades, quando um evento biológico ocorre na escala de milissegundos, uma taxa maior de emissão de fóton emissão pode aumentar a probabilidade de detecção do evento biológico. Taxas maiores de eventos de fóton podem aumentar subsequentemente a razão de sinal para ruído de sinal de luminescência e aumentar a taxa em que medições de tempo de vida são feitas, levando a uma análise de amostra mais rápida e precisa.
[000507] Adicionalmente, o ambiente em uma cavidade de amostra de um dispositivo integrado pode ser adaptado para engendrar o tempo de vida dos marcadores conforme necessário. Isso pode ser alcançado reconhecendo-se que o tempo de vida de um marcador é efetuado pela densidade de estado do marcador que pode ser adaptado com o uso do ambiente. Por exemplo, quanto mais longe um marcador estiver da camada de metal de fundo da cavidade de amostra, mais longo será o tempo de vida. Consequentemente, para aumentar o tempo de vida de um marcador, a profundidade de uma superfície de fundo de uma cavidade de amostra, tal como uma concavidade, pode se estender a uma certa distância de uma camada de metal. Também, os materiais usados para formar a cavidade de amostra podem afetar o tempo de vida dos marcadores. Embora diferentes marcadores tenham, tipicamente, seus tempos de vida virados para a mesma direção (por exemplo, mais longa ou mais curta), o efeito pode escalar diferentemente para marcadores diferentes. Consequentemente, dois marcadores que não podem ser distintos por meio de medições de tempo de vida em espaço livre podem ser engendrados para serem distinguíveis fabricando-se o ambiente de cavidade de amostra para ajustar os tempos de vida dos vários marcadores.
A. DETECÇÃO E SEQUENCIAMENTO DE ÚNICA MOLÉCULA
[000508] De acordo com um aspecto do presente pedido, uma única molécula pode ser identificada (por exemplo, distinta de outras possíveis moléculas em uma amostra de reação) com base em uma ou mais propriedades de uma série de fótons que são emitidos da molécula quando a mesma é exposta a uma pluralidade de pulsos de luz separados. Em algumas modalidades, a molécula é identificada com um marcador luminescente. Em algumas modalidades, o marcador luminescente é um fluoróforo. Em algumas modalidades, o marcador luminescente pode ser identificado ou distinguido com base em uma propriedade do marcador luminescente. As propriedades de uma identificação luminescente (por exemplo, um fluoróforo) incluem, porém, sem limitação, tempos de vida luminescentes, espectros de absorção, espectros de emissão, rendimento quântico de luminescência e intensidade luminescente e combinações de dois ou mais dos mesmos.
[000509] Uma amostra biológica pode ser processada em preparação para detecção (por exemplo, sequenciamento). Tal processamento pode incluir isolamento e/ou purificação da biomolécula (por exemplo, molécula de ácido nucleico) da amostra biológica e a geração de mais cópias da biomolécula. Em alguns exemplos, uma ou mais moléculas de ácido nucleico são isoladas e purificadas formam um tecido ou fluido corporal do indivíduo e amplificadas através de amplificação de ácido nucleico, como reação de filamento de polimerase (PCR). Então, a uma ou mais subunidades ou moléculas de ácido nucleicos dos mesmos podem ser identificadas, como através de sequenciamento. Entretanto, em algumas modalidades, amostras de ácido nucleico podem ser avaliadas (por exemplo, sequenciadas) conforme descrito neste pedido sem exigir amplificação.
[000510] O sequenciamento pode incluir a determinação de subunidades individuais de uma biomolécula modelo (por exemplo, molécula de ácido nucleico) sintetizando-se outra biomolécula que é complementar ou análoga ao modelo, como sintetizando-se uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma molécula de ácido nucleico modelo e identificando-se a incorporação de nucleotídeos com tempo (por exemplo, sequenciamento por síntese). Como alternativa, o sequenciamento pode incluir a identificação direta de subunidades individuais da biomolécula.
[000511] Durante o sequenciamento, uma enzima de polimerização pode acoplar (por exemplo, fixar) a um local de preparação de uma molécula de ácido nucleico alvo. A localização de preparação pode ser um iniciador que é complementar à molécula-alvo de ácido nucleico. Como alternativa, a localização de preparação é uma lacuna ou entalhe que é fornecida dentro de um segmento entrelaçado duplo da molécula de ácido nucleico-alvo. Uma lacuna ou entalhe podem ser de 0 a pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 ou 40 nucleotídeos em comprimento. Um entalhe pode fornecer uma ruptura em um filamento de uma sequência com filamento duplo, que pode fornecer uma localização de preparação para uma enzima de polimerização, como, por exemplo, uma enzima polimerase de deslocamento de filamento.
[000512] Em alguns casos, um iniciador de sequenciamento pode ser recozido para uma molécula-alvo de ácido nucleico que pode ou não ser imobilizada para uma sustentação sólida, como uma cavidade de amostra. Em algumas modalidades, um iniciador de sequenciamento pode ser imobilizado para uma sustentação sólida e hibridação da molécula-alvo de ácido nucleico também imobiliza a molécula-alvo de ácido nucleico para a sustentação sólida. Por meio da ação de uma enzima (por exemplo, uma polimerase) que pode adicionar ou incorporar um nucleotídeo ao iniciador, nucleotídeos podem ser adicionados ao iniciador em 5’ a 3’, de forma ligada ao modelo. Tal incorporação de nucleotídeos a um iniciador (por exemplo, por meio da ação de uma polimerase) pode, em geral, ser referenciada como uma reação de extensão de iniciador. Cada nucleotídeo pode ser associado a uma etiqueta detectável que pode ser detectada e usada para determinar cada nucleotídeo incorporado ao iniciador e, desse modo, uma sequência da molécula de ácido nucleico sintetizada recentemente. Por meio de complementaridade de sequência da molécula de ácido nucleico recém sintetizada, a sequência da molécula- alvo de ácido nucleico também pode ser determinada. Em alguns casos, o recozimento de um iniciador de sequenciamento para uma molécula de ácido nucleico alvo e a incorporação de nucleotídeos ao iniciador de sequenciamento pode ocorrer em condições de reação similares (por exemplo, a temperatura de reação igual ou similar) ou em condições de reação diferentes (por exemplo, temperaturas de reação diferentes). Ademais, algum sequenciamento por métodos de síntese pode incluir a presença de uma população de moléculas-alvo de ácido nucleico (por exemplo, cópias de um ácido nucleico-alvo) e/ou uma etapa de amplificação do ácido nucleico-alvo para alcançar uma população de ácidos nucleicos-alvo.
[000513] Modalidades podem sequenciar moléculas de ácido nucleico únicas com alta precisão e comprimento de leitura longo. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico alvo usada em sequenciamento de molécula única é um modelo de ácido nucleico alvo de filamento simples (por exemplo, ácido desoxirribonucleico (DNA), derivados de DNA, ácido ribonucleico (RNA), derivados de RNA) que é adicionado ou imobilizado a uma cavidade de amostra que contém pelo menos um componente adicional de uma reação de sequenciamento (por exemplo, uma polimerase tal como uma polimerase de DNA, um iniciador de sequenciamento) imobilizado ou fixado a um suporte sólido tal como o fundo da cavidade de amostra. A molécula de ácido nucleico- alvo ou a polimerase podem ser fixadas a uma cavidade de amostra, como no fundo da cavidade de amostra diretamente ou através de um ligante. A cavidade de amostra pode também conter quaisquer outros reagentes necessários para síntese de ácido nucleico através de uma reação de extensão de iniciador, tal como, por exemplo, tampões, cofatores, enzimas (por exemplo, uma polimerase) e polifosfatos de desoxirribonucleosídeo adequados, tais como, por exemplo, trifosfatos de desoxirribonucleosídeo, incluindo trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trisfosfato de desoxiuridina (dUTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) dNTPs que incluem identificações luminescentes, tais como fluoróforos. Cada classe de dNTPs (por exemplo, dNTPs que contêm adenina (por exemplo, dATP), dNTPs que contêm citosina (por exemplo, dCTP), dNTPs que contêm guanina (por exemplo, dGTP), dNTPs que contêm uracil (por exemplo, dUTPs) e dNTPs que contêm timina (por exemplo, dTTP)) é conjugada a uma etiqueta luminescente distinta de tal modo que a detecção de luz emitida da etiqueta indica que a identidade do dNTP que foi incorporado no ácido nucleico sintetizado recentemente. A luz emitida da etiqueta luminescente pode ser detectada e atribuída a sua etiqueta luminescente apropriada (e, desse modo, o dNTP associado) através de qualquer dispositivo e/ou método adequado, incluindo tais dispositivos e métodos para detecção descritos em outro lugar no presente documento. A etiqueta luminescente pode ser conjugada ao dNTP em qualquer posição de tal modo que a presença da etiqueta luminescente não iniba a incorporação do dNTP no filamento de ácido nucleico recentemente sintetizado ou a atividade da polimerase. Em algumas modalidades, a etiqueta luminescente é conjugada ao fosfato terminal (o fosfato gama) do dNTP.
[000514] O modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único pode ser posto em contato com um iniciador de sequenciamento, dNTPs, polimerase e outros reagentes necessários para síntese de ácido nucleico. Em algumas modalidades, todos os dNTPs apropriados podem fazer contato com o modelo de ácido nucleico alvo de filamento simples simultaneamente (por exemplo, todos os dNTPs estão presentes simultaneamente) de tal modo que incorporação de dNTPs possa ocorrer continuamente. Em outras modalidades, os dNTPs podem ser postos em contato com o modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único de modo sequencial, em que o modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único é posto em contato com cada dNTP apropriado de modo separado, com etapas de lavagem entre contato do modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único com dNTPs diferentes. Tal ciclo de contato do modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único com cada dNTP de modo separado seguido por lavagem pode ser repetido para cada posição-base sucessiva do modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único a ser identificado.
[000515] O iniciador de sequenciamento realiza recozimento para o modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único e a polimerase, de modo consecutivo, incorpora os dNTPs (ou outro fosfato de deoxirribonucleósideo) ao iniciador por meio do modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único. A etiqueta luminescente singular associada a cada dNTP incorporado pode ser excitada com a luz de excitação apropriada durante ou após a incorporação do dNTP ao iniciador e sua emissão pode ser detectada subsequentemente, com o uso de qualquer dispositivo (ou dispositivos) e/ou método (ou métodos) adequados, incluindo dispositivos e métodos para detecção descritos em outro lugar no presente documento. A detecção de uma emissão particular de luz pode ser atribuída a um dNTP particular incorporado. A sequência obtida da coleta de identificações luminescentes detectadas pode, então, ser usada para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico alvo de filamento simples através de complementaridade de sequência.
[000516] Embora a presente invenção faça referência a dNTPs, dispositivos, sistemas e métodos fornecidos no presente documento podem ser usados com diversos tipos de nucleotídeos, como ribonucleotídeos e deoxirribonucleotídeos (por exemplo, fosfatos de deoxirribonucleotídeos com pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 grupos de fosfato). Tais ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos podem incluir vários tipos de identificações (ou marcadores) e ligantes.
[000517] Os sinais emitidos mediante a incorporação de nucleósidos podem ser armazenados na memória e processados em um ponto posterior em tempo para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico-alvo. Isso pode incluir comparar os sinais a sinais de referência para determinar as identidades dos nucleósidos incorporados como uma função de tempo. De modo alternativo ou além disso, sinal emitido mediante a incorporação de nucleósido pode ser coletado e processado em tempo real (isto é, mediante a incorporação de nucleósido) para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico-alvo em tempo real.
[000518] O sequenciamento de ácido nucleico de uma pluralidade de modelos de ácido nucleico-alvo de filamento único pode ser completando quando múltiplas cavidades de amostra estão disponíveis, como é o caso em dispositivos descritos em outro local no presente documento. Cada cavidade de amostra pode ser fornecida com um modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único e uma reação de sequenciamento pode ser completada em cada cavidade de amostra. Cada uma das cavidades de amostra pode fazer contato com os reagentes apropriados (por exemplo, dNTPs, iniciadores de sequenciamento, polimerase, cofatores, tampões apropriados, etc.) necessários para síntese de ácido nucleico durante uma reação de extensão de iniciador e a reação de sequenciamento pode prosseguir em cada cavidade de amostra. Em algumas modalidades, as múltiplas cavidades de amostra são postas em contato com todos os dNTPs apropriados de modo simultâneo. Em outras modalidades, as múltiplas cavidades de amostra são postas em contato com cada dNTP apropriado de modo separado e cada um lavado em contato com dNTP diferentes. Os dNTPs incorporados podem ser detectados em cada cavidade de amostra e uma sequência determinada para o ácido nucleico-alvo de filamento único em cada cavidade de amostra conforme é descrito acima.
[000519] As modalidades direcionadas para o sequenciamento de RNA de molécula única podem usar qualquer transcriptase reversa que tem capacidade para sintetizar DNA complementar (cDNA) de um modelo de RNA. Em tais modalidades, uma transcriptase reversa pode funcionar de uma maneira similar à polimerase na qual cDNA pode ser sintetizado a partir de um modelo de RNA por meio da incorporação de dNTPs a um iniciador de transcrição reversa recozido para um modelo de RNA. O cDNA pode, então, participar em uma reação de sequenciamento e sua sequência determinada conforme descrito acima. A sequência determinada do cDNA pode, então, ser usada, por meio de complementaridade de sequência, para determinar a sequência do modelo de RNA original. Exemplos de transcriptases reversas incluem transcriptases reversas de Vírus de Leucemia Murínica de Moloney (M-MLV), transcriptase reversa de vírus da mieloblastose aviária (AMV), transcriptases reversas de vírus de imunodeficiência humana (HIV-1) e transcriptase reversa de telomerase.
[000520] Leituras de sequência podem ser usadas para reconstruir uma região mais longa de um genoma de um indivíduo (por exemplo, através de alinhamento). As leituras podem ser usadas para reconstruir regiões de cromossomo, cromossomas completos ou todo o genoma. As leituras de sequência ou uma sequência maior gerada a partir de tais leituras podem ser usadas para analisar um genoma de um indivíduo, como para identificar variantes ou polimorfismos. Exemplos de variantes incluem, porém, sem limitação, polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) incluindo SNPs de tandem, deleções ou inserções de múltiplas bases de escala pequena, também referenciadas como poliformismos de inserção/deleção ou indels (DIPs), Polimorfismos de Múltiplos Nucleotídeos (MNPs), Repetições de Tandem Curtas (STRs), deleções, incluindo microdeleções, inserções, incluindo microinserções, variações estruturais, incluindo duplicações, inversões, translocações, multiplicações, variantes de múltiplos locais complexas, variações de número de cópia (CNV). As sequências genômicas podem compreender combinações de variantes. Por exemplo, sequências genômicas podem abranger a combinação de um ou mais SNPs e um ou mais CNVs.
[000521] Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em vida útil de luminescente. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em intensidade de luminescência. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base no comprimento de onda da energia de excitação distribuída necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em tanto na vida útil de luminescente quanto no comprimento de onda da energia de excitação distribuída necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em tanto na intensidade de luminescente quanto no comprimento de onda da energia de excitação distribuída necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em vida útil de luminescente, intensidade de luminescência e no comprimento de onda da energia de excitação distribuída necessária para observar um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base tanto na vida útil de luminescente quanto no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base tanto em uma intensidade de luminescência quanto no comprimento de onda de um fóton emitido. Em algumas modalidades, as moléculas são identificadas ou distinguidas com base em vida útil de luminescente, intensidade de luminescência e no comprimento de onda de um fóton emitido.
[000522] Em determinadas modalidades, tipos diferentes de moléculas em um experimento ou mistura de reação são etiquetados com marcadores diferentes luminescentes. Em algumas modalidades, os marcadores diferentes têm propriedades luminescentes diferentes que podem ser distinguidas. Em algumas modalidades, os marcadores diferentes são distinguidos devido ao fato de terem vidas úteis de luminescente diferentes, intensidades de luminescência diferentes, comprimentos de onda diferentes de fótons emitidos ou uma combinação dos mesmos. A presença de uma pluralidade de tipos de moléculas com marcadores diferentes luminescentes pode permitir que etapas diferentes de uma reação complexa sejam monitoradas, ou que componentes diferentes de um produto de reação complexa sejam identificados. Em algumas modalidades, a ordem na qual os tipos diferentes de moléculas reagem ou interagem pode ser determinada.
[000523] Em determinadas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas com marcadores diferentes luminescentes são usadas para identificar a sequência de uma biomolécula, como um ácido nucleico ou proteína. Em algumas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de moléculas com marcadores diferentes luminescentes são usadas para identificar moléculas únicas conforme as mesmas são incorporadas durante a síntese de uma biomolécula. Em algumas modalidades, as propriedades luminescentes de uma pluralidade de tipos de nucleotídeos com marcadores diferentes luminescentes são usadas para identificar nucleotídeos únicos conforme os mesmos são incorporados durante uma reação de sequenciamento. Em algumas modalidades, métodos, composições e dispositivos descritos no aplicativo podem ser usados para identificar uma série de nucleotídeos que são incorporados a um produto de reação de sequenciamento de ácido nucleico dependente de modelo sintetizado por uma enzima polimerase.
[000524] Em determinadas modalidades, o produto de sequenciamento de ácido nucleico dependente de modelo é produzido ocorrendo-se naturalmente polimerases de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a polimerase é uma variante mutante ou modificada de uma polimerase que ocorre naturalmente. Em algumas modalidades, o produto de sequência de ácido nucleico dependente de modelo irá compreender um ou mais segmentos de nucleotídeo complementares ao filamento de ácido nucleico de modelo. Em um aspecto, o pedido fornece um método para determinar a sequência de um filamento de ácido nucleico de modelo (ou alvo) determinando-se a sequência de seu filamento de ácido nucleico complementar.
[000525] Em outro aspecto, o pedido fornece métodos de sequenciamento ácidos nucleicos-alvo por sequenciamento de uma pluralidade de fragmentos de ácido nucleico, em que o ácido nucleico- alvo compreende os fragmentos. Em determinadas modalidades, o método compreende combinar uma pluralidade de sequência de fragmento para fornecer uma sequência ou sequência parcial para o ácido nucleico-alvo principal. Em algumas modalidades, a etapa de combinação é realizada por hardware e software de computador. Os métodos descritos no presente documento podem permitir que um conjunto de ácidos nucleicos-alvo relacionados, como um cromossomo ou genoma completos sejam sequenciados.
[000526] O termo "genoma", em geral, se refere a uma totalidade de informações hereditárias do organismo. Um genoma pode ser codificado ou em DNA ou em RNA. Um genoma pode compreender regiões de codificação que codificam proteínas, bem como regiões de não codificação. Um genoma pode incluir a sequência de todos os cromossomos juntos em um organismo. Por exemplo, o genoma humano tem um total de 46 cromossomos. A sequência de todos esses juntos constitui o genoma humano. Em algumas modalidades, a sequência de todo um genoma é determinada. Entretanto, em algumas modalidades, as informações de sequência para um subconjunto de um genoma (por exemplo, um ou alguns cromossomos ou regiões dos mesmos) ou para um ou alguns genes (ou fragmentos dos mesmos) são suficientes para diagnóstico, prognóstico e/ou aplicações terapêuticas.
[000527] Em alguns casos, um iniciador de sequenciamento pode ser recozido para uma molécula-alvo de ácido nucleico que pode ou não ser imobilizada para uma sustentação sólida, como uma cavidade de amostra (por exemplo, nanopassagem). Em algumas modalidades, um iniciador de sequenciamento pode ser imobilizado para uma sustentação sólida e hibridação da molécula-alvo de ácido nucleico também imobiliza a molécula-alvo de ácido nucleico para a sustentação sólida. Em algumas modalidades, uma polimerase é imobilizada para uma sustentação sólida e iniciador solúvel e ácido nucleico-alvo são postos em contato para a polimerase. No entanto, em algumas modalidades, um complexo que compreende uma polimerase, um ácido nucleico-alvo e um iniciador é formado na solução e o complexo é imobilizado para uma sustentação sólida (por exemplo, por meio de imobilização da polimerase, iniciador e/ou ácido nucleico-alvo).
[000528] Mediante condições apropriadas, uma enzima polimerase que é posta em contato com um ácido nucleico iniciador/alvo recozido pode adicionar ou incorporar um ou mais nucleotídeos no iniciador e os nucleotídeos podem ser adicionados ao iniciador em um modo de ligação modelo de 12,7 cm a 7,6 cm (5’ a 3’). Tal incorporação de nucleotídeos em um iniciador (por exemplo, por meio da ação de uma polimerase) pode, em geral, ser referenciada como uma reação de extensão de iniciador. Cada nucleotídeo pode ser associado a uma etiqueta detectável que pode ser detectada ou identificada (por exemplo, com base em seu tempo de vida luminescente, espectros de emissão, espectros de absorção e/ou outras características) e pode ser usado para determinar cada nucleotídeo incorporado no iniciador e, desse modo, uma sequência da molécula de ácido nucleico sintetizada recentemente. Por meio de complementaridade de sequência da molécula de ácido nucleico recém sintetizada, a sequência da molécula- alvo de ácido nucleico também pode ser determinada. Em algumas modalidades, algum sequenciamento por métodos de síntese pode incluir a presença de uma população de moléculas-alvo de ácido nucleico (por exemplo, cópias de um ácido nucleico-alvo) e/ou uma etapa de amplificação do ácido nucleico-alvo para alcançar uma população de ácidos nucleicos-alvo. Entretanto, em algumas modalidades, sequenciamento por síntese é usado para determinar a sequência de uma molécula única em cada reação que está sendo avaliada (e amplificação de ácido nucleico não é exigida para preparar o modelo-alvo para o sequenciamento). Em algumas modalidades, uma pluralidade de reações de sequenciamento de molécula única é realizada em paralelo (por exemplo, em um único dispositivo integrado ou chip) de acordo com os aspectos do presente pedido.
[000529] As modalidades têm capacidade para sequenciamento moléculas únicas de ácido nucleico com alta precisão e comprimentos de leitura longos, como uma precisão de pelo menos cerca de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,9%, 99,99%, 99,999% ou 99,9999%, e/ou comprimentos de leitura maiores que ou iguais a cerca de 10 pares de base (bp), 50 bp, 100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 1.000 bp, 10.000 bp, 20.000 bp, 30.000 bp, 40.000 bp, 50.000 bp ou 100.000 bp.
[000530] A molécula de ácido nucleico-alvo ou a polimerase podem ser fixadas a uma cavidade de amostra, como no fundo da cavidade de amostra diretamente ou através de um ligante. A cavidade de amostra (por exemplo, nanopassagem) pode também conter quaisquer outros reagentes necessários para síntese de ácido nucleico através de uma reação de extensão de iniciador, tal como, por exemplo, tampões, cofatores, enzimas (por exemplo, uma polimerase) e polifosfatos de desoxirribonucleosídeo adequados, tais como, por exemplo, trifosfatos de desoxirribonucleosídeo, incluindo trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trisfosfato de desoxiuridina (dUTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) dNTPs que incluem identificações luminescentes, tais como fluoróforos. Em algumas modalidades, cada classe de dNTPs (por exemplo, dNTPs que contêm adenina (por exemplo, dATP), dNTPs que contêm citosina (por exemplo, dCTP), dNTPs que contêm guanina (por exemplo, dGTP), dNTPs que contêm uracil (por exemplo, dUTPs) e dNTPs que contêm timina (por exemplo, dTTP)) é conjugada a uma etiqueta luminescente distinta de tal modo que a detecção de luz emitida da etiqueta indica que a identidade do dNTP que foi incorporado no ácido nucleico sintetizado recentemente. A luz emitida da etiqueta luminescente pode ser detectada e atribuída a sua etiqueta luminescente apropriada (e, desse modo, o dNTP associado) através de qualquer dispositivo e/ou método adequado, incluindo tais dispositivos e métodos para detecção descritos em outro lugar no presente documento. A etiqueta luminescente pode ser conjugada ao dNTP em qualquer posição de tal modo que a presença da etiqueta luminescente não iniba a incorporação do dNTP no filamento de ácido nucleico recentemente sintetizado ou a atividade da polimerase. Em algumas modalidades, a etiqueta luminescente é conjugada ao fosfato terminal (o fosfato gama) do dNTP.
[000531] Em algumas modalidades, o iniciador de sequenciamento realiza recozimento para o modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único e a polimerase, de modo consecutivo, incorpora os dNTPs (ou outro fosfato de deoxirribonucleósideo) ao iniciador por meio do modelo de ácido nucleico-alvo de filamento único. A etiqueta luminescente singular associada a cada dNTP incorporado pode ser excitada com a luz de excitação apropriada durante ou após a incorporação do dNTP ao iniciador e sua emissão pode ser detectada subsequentemente, com o uso de qualquer dispositivo (ou dispositivos) e/ou método (ou métodos) adequados, incluindo dispositivos e métodos para detecção descritos em outro lugar no presente documento. A detecção de uma emissão particular de luz (por exemplo, que tem uma vida útil de emissão particular, intensidade e/ou combinação dos mesmos) pode ser atribuída a um dNTP particular incorporado. A sequência obtida da coleta de identificações luminescentes detectadas pode, então, ser usada para determinar a sequência do modelo de ácido nucleico alvo de filamento simples através de complementaridade de sequência.
[000532] Embora a presente invenção faça referência a dNTPs, dispositivos, sistemas e métodos fornecidos no presente documento podem ser usados com diversos tipos de nucleotídeos, como ribonucleotídeos e deoxirribonucleotídeos (por exemplo, fosfatos de deoxirribonucleotídeos com pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 grupos de fosfato). Tais ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos podem incluir vários tipos de identificações (ou marcadores) e ligantes.
[000533] Como exemplo, a Figura 10-1 ilustra esquematicamente a configuração de um método de sequenciamento de ácido nucleico de molécula única. O exemplo não se destina a limitar a invenção de qualquer maneira. 610 é uma cavidade de amostra (por exemplo, nanoabertura) configurada para conter um único complexo que compreende uma polimerase de ácido nucleico 601, um ácido nucleico- alvo 602 a ser sequenciado e um iniciador 604. Nesse exemplo, uma região de fundo de cavidade de amostra 610 é ilustrada como um volume-alvo 620. Na Figura 10-1 o complexo que compreende polimerase 601 é confinado em volume-alvo 620. O complexo pode ser opcionalmente imobilizado fixando-se a uma superfície da cavidade de amostra. Nesse exemplo, o complexo é imobilizado por um ligante 603 que compreende uma ou mais biomoléculas (por exemplo, biotina) adequadas para fixar o ligante à polimerase 601.
[000534] O volume da cavidade de amostra também contém uma mistura de reação com solvente, tampão adequados e outros aditivos necessários para complexo de polimerase para sintetizar um filamento de ácido nucleico. A mistura de reação também contém uma pluralidade de tipos de nucleotídeos etiquetados de modo luminescente. Cada tipo de nucleotídeo é representado pelos símbolos *-A, @-T, $-G, #-C, em que A, T, G e C representam a base de nucleotídeo e os símbolos *, @, $ e # representam uma identificação luminescente singular fixada a cada nucleotídeo, através do ligante -. Na Figura 10-1, um nucleotídeo #-C está sendo atualmente incorporado ao filamento complementar 602. O nucleotídeo incorporado está localizado dentro do volume-alvo 620.
[000535] A Figura 10-1 também indicam com setas o conceito de uma energia de excitação que é distribuída para uma proximidade do volume-alvo e luminescência que é emitida em direção a um detector. As setas são esquemáticas e não se destinam a indicar a orientação particular de distribuição ou luminescência de energia de excitação. Algumas luminescências podem emitir em um vetor que não é direcionado ao detector (por exemplo, em direção à parede lateral da cavidade de amostra) e podem não ser detectadas.
[000536] A Figura 10-2 ilustra esquematicamente um processo de sequenciamento em uma cavidade de amostra única ao longo do tempo. Os estágios A a D ilustram uma cavidade de amostra com um complexo de polimerase como na Figura 10-1) O estágio A ilustra o estado inicial antes de quaisquer nucleotídeos terem sido adicionados ao iniciador. O estágio B ilustra o evento de incorporação de um nucleotídeo etiquetado de modo luminescente (#-C). O estágio C, ilustra o período entre eventos de incorporação. Nesse exemplo, nucleotídeo C foi adicionado ao iniciador e a etiqueta e ligante anteriormente fixados ao nucleotídeo etiquetado de modo luminescente (#-C) que foi clivado. O estágio D ilustra um segundo evento de incorporação de um nucleotídeo etiquetado de modo luminescente (*-A). O filamento complementar após estágio D consiste no iniciador, um nucleotídeo C e um nucleotídeo A.
[000537] Os estágios A e C, ambos ilustram os períodos antes ou entre os eventos de incorporação, que são indicados nesse exemplo para durar durante cerca de 10 milissegundos. Nos estágios A e C, devido ao fato de que não há nucleotídeo sendo incorporado, não há nucleotídeo etiquetado de modo luminescente no volume-alvo (não desenhado na Figura 10-2), através de luminescência antecedente ou luminescência artificial de um nucleotídeo etiquetado de modo luminescente que não está sendo incorporado pode ser detectado. Os estágios B e D mostram eventos de incorporação de nucleotídeos diferentes (#-C e *-A, respectivamente). Nesse exemplo, esses eventos também são indicados para durar durante cerca de 10 milissegundos.
[000538] A fileira etiquetada "dados de distância bruta" ilustra os dados gerados durante cada estágio. Durante todo o experimento exemplificativo, uma pluralidade de pulsos de luz é distribuída para a proximidade do volume-alvo. Para cada pulso, um detector é configurado para registrar qualquer fóton emitido recebido pelo detector e designar o fóton detectado para uma distância de tempo com base na duração de tempo visto desde o último pulso de energia de excitação. Nesse exemplo, há 3 distâncias, e os "dados de distância bruta" registram um valor de 1 (barras mais curtas), 2 (barras médias) ou 3 (barras mais longas), que correspondem às distâncias mais curtas, intermediárias e mais longas, respectivamente. Cada barra indica detecção de um fóton emitido.
[000539] Visto que não há nucleotídeo etiquetado de modo luminescente presente no volume-alvo para o estágio A ou C, não há fótons detectados. Para cada de estágio B e D, uma pluralidade de luminescências é detectada durante o evento de incorporação. A identificação luminescente # tem um tempo de vida de luminescência mais curto do que a identificação luminescente. Os dados de estágio B são, desse modo, ilustrados como tendo valores de distância média inferiores registrados que o estágio D no qual os valores de distâncias são maiores.
[000540] A fileira etiquetada "dados processados" ilustra dados brutos que foram processados para indicar o número (contagens) de fótons emitidos em tempos em relação a cada pulso. Nesse exemplo, os dados são apenas processados para determinar a vida útil de luminescente, mas os dados também são avaliados para outras propriedades luminescentes, como intensidade de luminescência ou o comprimento de onda dos fótons absorvidos ou emitidos. Os dados processados exemplificativos se aproximam de uma característica de curva de decadência exponencial para a vida útil de luminescência do marcador luminescente no volume-alvo. Devido ao fato de que a identificação luminescente # tem um tempo de vida de luminescência mais curto do que a identificação luminescente *, os dados processados para o Estágio B têm menos contagens em durações de tempo mais longas, enquanto os dados processados para o Estágio D têm contagens relativamente mais longas em durações de tempo mais longas.
[000541] O experimento exemplificativo da Figura 10-2 identificaria os dois primeiros nucleotídeos adicionados ao filamento complementar como CA. Para DNA, a sequência do filamento-alvo imediatamente após a região recozida para o iniciador seria, desse modo, identificada como GT. Nesse exemplo, os nucleotídeos C e A poderiam ser distinguidos dentre a pluralidade de C, G, T e A, com base em vida útil de luminescente apenas. Em algumas modalidades, outras propriedades, como a intensidade de luminescência ou o comprimento de onda dos fótons absorvidos ou emitidos podem ser necessárias para distinguir um ou mais nucleotídeos particulares.
B. PROPRIEDADES LUMINESCENTES
[000542] Conforme aqui descrito, uma molécula luminescente é uma molécula que absorve um ou mais fótons e pode emitir, subsequentemente, um ou mais fótons após uma ou mais durações de tempo. A luminescência da molécula é descrita por diversos parâmetros, incluindo, mas sem limitação, tempo de vida luminescente, espectros de absorção e/ou emissão, rendimento quântico luminescente e intensidade luminescente.
[000543] O fóton emitido a partir de um evento de emissão luminescente irá emitir a um comprimento de onda dentro de uma faixa espectral de possíveis e comprimentos de onda. Tipicamente, o fóton emitido tem um comprimento de onda mais longo (por exemplo, tem menos energia ou é trocado para vermelho) em comparação ao comprimento de onda do fóton de excitação. Em certas modalidades, uma molécula é identificada medindo-se o comprimento de onda de um fóton emitido. Em certas modalidades, uma molécula é definida medindo-se o comprimento de onda de uma pluralidade de fótons emitidos. Em certas modalidades, uma molécula é identificada medindose o espectro de emissão.
[000544] A tempo de vida luminescente se refere uma duração de tempo (por exemplo, tempo de decaimento de emissão) associada a um evento de excitação e um evento de emissão. Em algumas modalidades, a tempo de vida luminescente é expressada como a constante em uma equação de decaimento exponencial. Em algumas modalidades, em que há um ou mais eventos de pulso que entregam energia de excitação, a duração de tempo é o tempo entre o pulso e o evento de emissão subsequente.
[000545] O rendimento quântico luminescente se refere à fração de eventos de excitação em um dado comprimento de onda ou dentro de uma dada faixa espectral que leva a um evento de emissão e é tipicamente menos do que 1. Em algumas modalidades, o rendimento quântico luminescente de uma molécula descrita no presente documento está entre 0 e cerca de 0,001, entre cerca de 0,001 e cerca de 0,01, entre cerca de 0,01 e cerca de 0,1, entre cerca de 0,1 e cerca de 0,5, entre cerca de 0,5 e 0,9 ou entre cerca de 0,9 e 1. Em algumas modalidades, uma molécula é identificada determinando-se ou estimando-se o rendimento quântico luminescente.
[000546] Conforme usado no presente documento para moléculas únicas, a intensidade luminescente se refere ao número de fótons emitidos por unidade de tempo que são emitidos por uma molécula que está sendo excitada pela entrega de uma energia de excitação pulsada. Em algumas modalidades, a intensidade luminescente se refere ao número detectado de fótons emitidos per unidade de tempo que são emitidos por uma molécula que está sendo excitada pela entrega de uma energia de excitação pulsada e são detectados por um sensor específico ou um conjunto de sensores.
[000547] Em um aspecto, o pedido fornece um método de terminação da vida útil luminescente de uma molécula luminescente única que compreende: fornecer a molécula luminescente em um volume alvo; entregar uma pluralidade de pulsos de uma energia de excitação a uma adjacência do volume alvo; e detectar uma pluralidade de luminescências da molécula luminescente. Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, registrar uma pluralidade de durações de tempo entre cada par de pulsos e luminescências e avaliar a distribuição da pluralidade de durações de tempo entre cada par de pulsos e luminescências.
C. NUCLEOTÍDEOS IDENTIFICADOS DE MODO LUMINESCENTE
[000548] Em um aspecto, métodos e composições descritas no presente documento compreendem um ou mais nucleotídeos identificados de modo luminescente. Em certas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem nucleosídeos de desoxirribose. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos compreendem nucleosídeos de desoxirribose. Em certas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem nucleosídeos de ribose. Em algumas modalidades, todos os nucleotídeos compreendem nucleosídeos de ribose. Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem um açúcar de ribose modificado ou análogo de ribose (por exemplo, ácido nucleico bloqueado). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem bases de ocorrência natural (por exemplo, citosina, guanina, adenina, timina, uracil). Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos compreendem derivados ou análogos de citosina, guanina, adenina, timina ou uracil.
[000549] Em certas modalidades, um método compreende a etapa de expor um complexo de polimerase a uma pluralidade de nucleotídeos identificados de modo luminescente. Em certas modalidades, uma composição ou dispositivo compreende uma mistura de reação que compreende uma pluralidade de nucleotídeos identificados de modo luminescente. Em algumas modalidades, a pluralidade de nucleotídeos compreende quatro tipos de nucleotídeos. Em algumas modalidades, os quatro tipos de nucleotídeos compreendem, cada um, um dentre citosina, guanina, adenina e timina. Em algumas modalidades, os quatro tipos de nucleotídeos compreendem, cada um, um dentre citosina, guanina, adenina e uracil.
[000550] O termo "ácido nucleico" conforme usado no presente documento, se refere geralmente a uma molécula que compreende uma ou mais subunidades de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode incluir uma ou mais subunidades selecionadas a partir de adenosina (A), citosina (C), guanina (G), timina (T) e uracil (U) ou variantes das mesmas. Em alguns exemplos, um ácido nucleico é ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA) ou derivados dos mesmos. Um ácido nucleico pode ter cadeia simples ou cadeia dupla. Um ácido nucleico pode ser circular.
[000551] O termo "nucleotídeo", conforme usado aqui, geralmente se refere a uma subunidade de ácido nucleico que pode incluir A, C, G, T ou U, ou variantes ou análogos dos mesmos. Um nucleotídeo pode incluir qualquer subunidade que pode ser incorporada em uma cadeia de ácido nucleico crescente. Tal subunidade pode ser uma A, C, G, T ou U ou qualquer outra subunidade que é específica a uma ou mais A, C, G, T ou U complementar, ou complementar a uma purina (isto é, A ou G, ou variante ou análogos dos mesmos) ou uma pirimidina (isto é, C, T ou U, ou variante ou análogos dos mesmos). Uma subunidade pode permitir que bases de ácido nucleico individuais ou grupos de bases (por exemplo, AA, TA, AT, GC, CG, CT, TC, GT, TG, AC, CA ou contrapartidas de uracil das mesmas) sejam solucionadas.
[000552] Um nucleotídeo geralmente inclui um nucleosídeo e pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais grupos fosfato (PO3). Um nucleotídeo pode incluir uma nucleobase, um açúcar com cinco carbonos (ou ribose ou desoxirribose) e um ou mais grupos fosfato. Ribonucleotídeos são nucleotídeos em que o açúcar é ribose. Desoxirribonucleotídeos são nucleotídeos em que o açúcar é desoxirribose. Um nucleotídeo pode ser um monofosfato de nucleosídeo ou um polifosfato de nucleosídeo. Um nucleotídeo pode ser um polifosfato de desoxirribonucleosídeo, tal como, por exemplo, um trifosfato de desoxirribonucleosídeo que pode ser selecionado a partir de trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP), trifosfato de desoxiguanosina (dGTP), trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e trifosfato de desoxitimidina (dTTP) dNTPs que incluem identificações, tais como identificações ou marcadores luminescentes detectáveis (por exemplo, fluoróforos).
[000553] Um polifosfato de nucleosídeo pode ter "n" grupos fosfato, em que "n" é um número que é maior que ou igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. Exemplos de polifosfato de nucleosídeos incluem difosfato de nucleosídeo e trifosfato de nucleosídeo. Um nucleotídeo pode ser um fosfato terminal identificado como nucleosídeo, tal como um fosfato terminal identificado como polifosfato de nucleosídeo. Tal identificação pode ser uma identificação luminescente (por exemplo, fluorescente ou quemiluminescente), uma identificação fluorogênica, uma identificação colorida, uma identificação cromogênica, uma etiqueta de massa, uma identificação eletrostática ou uma identificação eletroquímica. Uma identificação (ou marcador) pode ser acoplada a um fosfato terminal através de um ligante. O ligante pode incluir, por exemplo, pelo menos um ou uma pluralidade de grupos hidroxila, grupos sulfidrila, grupos amino ou grupos haloalquila que podem ser adequados para formar, por exemplo, um éster de fosfato, um tioéster, um fosforamidato ou uma ligação de fosfonato de alquila no fosfato terminal de um nucleotídeo natural ou modificado. Um ligante pode ser clivado de modo a separar uma identificação do fosfato terminal, tal como com o auxílio de uma enzima de polimerização. Exemplos de nucleotídeos e ligantes são fornecidos no Pedido n° U.S. 7.041.812 que é incorporado totalmente no presente documento a título de referência.
D. IDENTIFICAÇÕES
[000554] Em certas modalidades, a molécula incorporada é uma molécula luminescente, por exemplo, sem fixação a um marcador luminescente distinto. Um nucleotídeo e aminoácidos típicos não são luminescentes ou não luminescem dentro de faixas adequadas de energias de excitação e emissão. Em certas modalidades, a molécula incorporada compreende um marcador luminescente. Em certas modalidades, a molécula incorporada é um nucleotídeo identificado de modo luminescente. Em certas modalidades, a molécula incorporada é um aminoácido identificado de modo luminescente ou tRNA identificado de modo luminescente. Em algumas modalidades, um nucleotídeo identificado de modo luminescente compreende um nucleotídeo e um marcador luminescente. Em algumas modalidades, um nucleotídeo identificado de modo luminescente compreende um nucleotídeo, um marcador luminescente e um ligante. Em algumas modalidades, o marcador luminescente é um fluoróforo.
[000555] Para sequenciamento de nucleotídeos, certas combinações de nucleotídeos identificados de modo luminescente podem ser preferenciais. Em algumas modalidades, pelo menos um dos nucleotídeos identificados de modo luminescente compreende um corante de cianina ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um nucleotídeo identificado de modo luminescente compreende um corante de rodamina ou um análogo do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um dos nucleotídeos identificados de modo luminescente compreende um corante de cianina ou um análogo do mesmo e pelo menos um nucleotídeo identificado de modo luminescente compreende um corante de rodamina ou um análogo do mesmo.
[000556] Em certas modalidades, o marcador luminescente é um corante selecionado da Tabela FL-1. Os corantes listados na Tabela FL- 1 não são limitadores e os marcadores luminescentes do pedido podem incluir corantes não listados na Tabela FL -1. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de um ou mais nucleotídeos identificados de modo luminescente são selecionados a partir da Tabela FL-1. Em certas modalidades, os marcadores luminescentes de quatro ou mais nucleotídeos identificados de modo luminescente são selecionados a partir da Tabela FL-1. TABELA FL-1. FLUORÓFOROS EXEMPLIFICATIVOS.
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[000557] Em determinadas modalidades, o marcador luminescente pode ser (Corante 101) ou (Corante 102), das fórmulas:
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[000558] ou um análogo das mesmas. Em algumas modalidades, cada sulfonato ou carboxilato é protonado independentemente, de modo opcional. Em algumas modalidades, os corantes acima são afixados ao ligante ou nucleotídeo pela formação de uma ligação de amida no ponto indicado de afixação.
[000559] Em determinadas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos ou pelo menos quatro dos tipos de nucleotídeos identificados de modo luminescente compreendem um marcador luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em 6-TAMRA, 5/6-Carboxirrodamina 6G, Alex Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 610, Alexa Fluor 647, Aberrior Star 635, ATTO 647N, ATTO Rho14, Chromis 630, Chromis 654A, Chromeo 642, CF514, CF532, CF543, CF546, CF546, CF555, CF568, CF633, CF640R, CF660C, CF660R, CF680R, Cy3, Cy3B, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Dyomics-530, Dyomics-547P1, Dyomics-549P1, Dyomics-550, Dyomics-554, Dyomics-555, Dyomics-556, Dyomics-560, Dyomics-650, Dyomics-680, DyLight 554-R1, DyLight 530-R2, DyLight 594, DyLight 635-B2, DyLight 650, DyLight 655-B4, DyLight 675-B2, DyLight 675-B4, DyLight 680, HiLyte Fluor 532, HiLyte Fluor 555, HiLyte Fluor 594, LightCycler 640R, Seta 555, Seta 670, Seta700, SeTau 647, e SeTau 665, ou são das fórmulas (Corante 101) ou (Corante 102), conforme descrito no presente documento.
[000560] Em algumas modalidades, pelo menos um tipo, pelo menos dois tipos, pelo menos três tipos, ou pelo menos quatro dos tipos de nucleotídeos identificados de modo luminescente compreendem um marcador luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, CF532, CF543, CF555, CF594, Cy3, DyLight 530-R2, DyLight 554-R1, DyLight 590-R2, DyLight 594, e DyLight 610-B1, ou são das fórmulas (Corante 101) ou (Corante 102).
[000561] Em algumas modalidades, um primeiro e um segundo tipos de nucleotídeo identificado de modo luminescente compreendem um marcador luminescente selecionado a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 555, CF532, CF543, CF555, Cy3, DyLight 530-R2 e DyLight 554-R1, e um terceiro e quarto tipos de nucleotídeo identificado de modo luminescente compreende um identificação luminescente selecionada a partir do grupo que consiste em Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 610, CF594, DyLight 590-R2, DyLight 594 e DyLight 610-B1, ou são das fórmulas (Corante 101) ou (Corante 102).
E. LIGANTES
[000562] Um marcador luminescente pode ser afixado à molécula diretamente, por exemplo, por uma ligação, ou pode ser afixada por meio de um ligante. Em determinadas modalidades, o ligante compreende um ou mais fosfatos. Em algumas modalidades, um nucleosídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante que compreende um ou mais fosfatos. Em algumas modalidades, um nucleosídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante que compreende três ou mais fosfatos. Em algumas modalidades, um nucleosídeo é conectado a um marcador luminescente por um ligante que compreende quatro ou mais fosfatos.
[000563] Em determinadas modalidades, um ligante compreende uma cadeia alifática. Em algumas modalidades um ligante compreende -(CH2)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 20, inclusive. Em algumas modalidades, n é um número inteiro de 1 a 10, inclusive. Em determinadas modalidades, um ligante compreende uma cadeia heteroalifática. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma porção química de glicol polietileno. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma porção química de glicol de polipropileno. Em algumas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 20, inclusive. Em algumas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)n-, em que n é um número inteiro de 1 a 10, inclusive. Em determinadas modalidades, um ligante compreende -(CH2CH2O)4-. Em determinadas modalidades, um ligante compreende um ou mais arilenos. Em algumas modalidades, um ligante compreende um ou mais fenilenos (por exemplo, fenileno parassubstituído). Em determinadas modalidades, um ligante compreende um centro quiral. Em algumas modalidades, um ligante compreende prolina, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende um hexâmero de prolina, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende cumarina, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende naftaleno, ou um derivado do mesmo. Em algumas modalidades, um ligante compreende antraceno, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende uma polifenilamida, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende cromanona, ou um derivado da mesma. Em algumas modalidades, um ligante compreende 4-aminopropargil-L- fenilalanina, ou um derivado do mesmo. Em determinadas modalidades, um ligante compreende um polipeptídeo.
[000564] Em algumas modalidades, um ligante compreende um oligonucleotídeo. Em algumas modalidades, um ligante compreende dois oligonucleotídeos recozidos. Em algumas modalidades, o oligonucleotídeo ou os oligonucleotídeos compreendem nucleotídeos desoxirribose, nucleotídeo ribose, ou nucleotídeos ribose travado. Em determinadas modalidades, um ligante compreende um fotoestabilizador.
F. PREPARAÇÃO DE SUPERFÍCIE DE POÇO DE AMOSTRA
[000565] Em determinadas modalidades, um método para detectar molécula de ona ou identificada de modo luminescente é realizado com as moléculas confinadas em um volume-alvo. Em algumas modalidades, o volume-alvo é uma região dentro um poço de amostra (por exemplo, uma nanopassagem). Em determinadas modalidades, o poço de amostra compreende uma superfície de fundo que compreende um primeiro material e paredes laterais formadas por uma pluralidade de camadas metálicas ou óxido metálicas. Em algumas modalidades, o primeiro material é um material transparente ou vidro. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é plana. Em algumas modalidades, a superfície de fundo é um poço curvado. Em algumas modalidades, a superfície de fundo inclui uma porção das paredes laterais abaixo das paredes laterais formadas por uma pluralidade de camadas metálicas ou de óxido metálico. Em algumas modalidades, o primeiro material é sílica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, a pluralidade de camadas de cada um compreende um metal (por exemplo, Al, Ti) ou óxido metálico (por exemplo, Al2O3, TiO2, TiN). G. PASSIVAÇÃO
[000566] Em algumas modalidades quando uma ou mais moléculas ou complexo são imobilizadas em uma superfície, é desejável passivar outras superfícies do dispositivo para impedir imobilização em um local indesejado. Em algumas modalidades, a molécula ou complexo são imobilizados em uma superfície de fundo de um poço de amostra e as paredes laterais do poço de amostra são passivadas. Em algumas modalidades, as paredes laterais são passivadas pelas etapas de: depositar uma camada de barreira metálica ou de óxido metálico nas superfícies de parede lateral; e aplicar um revestimento para camada de barreira. Em algumas modalidades, a camada de barreira de óxido metálico compreende óxido de alumínio. Em algumas modalidades, a etapa de depositar compreende depositar a camada de barreira metálica ou de óxido metálico nas superfícies de parede lateral e na superfície de fundo. Em algumas modalidades, a etapa de depositar compreende adicionalmente desbastar a camada de barreira metálica ou de óxido metálico da superfície de fundo.
[000567] Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende grupos fosfonato. Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende grupos fosfonato com uma cadeia de alquila. Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende um fosfonato polimérico. Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende ácido polivinilfosfórico (PVPA). Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende grupos fosfonato com uma cadeia de alquila substituída. Em algumas modalidades, a cadeia de alquila compreende uma ou mais amidas. Em algumas modalidades, a cadeia de alquila compreende uma ou mais cadeias de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, o revestimento compreende grupos fosfonato da fórmula:
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[000568] em que n é um número inteiro entre 0 e 100, inclusive, e é hidrogênio ou um ponto de afixação à superfície. Em algumas modalidades n é um número inteiro entre 3 e 20, inclusive. Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende uma mistura de tipos diferentes de grupos fosfonato. Em algumas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende uma mistura de grupos fosfonato que compreende cadeias de poli(etileno glicol) de peso de PEG diferentes.
[000569] Em determinadas modalidades, a camada de barreira compreende grupos nitrodopa. Em determinadas modalidades, o revestimento de camada de barreira compreende grupos da fórmula:
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[000570] em que RN é uma cadeia de alquila opcionalmente substituída e -~w é hidrogênio ou um ponto de afixação à superfície. Em algumas modalidades, RN compreende um polímero. Em algumas modalidades, RN compreende uma poli(lisina) ou a poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a camada de barreira compreende um copolímero de poli(lisina) que compreende monômeros de lisina, sendo que os monômeros de lisina compreendem independentemente PEG, grupos nitrodopa, grupos fosfonato, ou aminas primárias. Em determinadas modalidades, a camada de barreira compreende um polímero da fórmula (P):
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[000571] Em algumas modalidades, X é -OMe, um grupo biotina, fosfonato ou silano. Em algumas modalidades, cada um dentre i, j, k e l é, independentemente, um número inteiro entre 0 e 100, inclusive.
H. IMOBILIZAÇÃO DE POLIMERASE
[000572] Em algumas modalidades, quando uma ou mais moléculas ou complexo forem imobilizadas em uma superfície a superfície é funcionalizada para permitir a afixação de um ou mais das moléculas ou dos complexos. Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é uma superfície de fundo de um poço de amostra. Em determinadas modalidades, a superfície funcionalizada compreende um vidro transparente. Em determinadas modalidades, a superfície funcionalizada compreende sílica fundida ou dióxido de silício. Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um silano. Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um polímero carregado ionicamente. Em algumas modalidades, o polímero carregado ionicamente compreende poli(lisina). Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com poli(lisina)-enxerto-poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com albumina sérica bovina biotilinada (BSA).
[000573] Em determinadas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com o revestimento que compreende grupos nitrodopa. Em determinadas modalidades, o revestimento compreende grupos da fórmula:
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[000574] em que RN é uma cadeia de alquila opcionalmente substituída e é hidrogênio ou um ponto de afixação à superfície. Em algumas modalidades, RN compreende um polímero. Em algumas modalidades, RN compreende uma poli(lisina) ou a poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, RN compreende um poli(etileno glicol) biotinilado. Em algumas modalidades, o revestimento compreende um copolímero de poli(lisina) que compreende monômeros de lisina, em que os monômeros de lisina compreendem independentemente PEG, PEG biotinilado, grupos nitrodopa, grupos fosfonato ou silanos. Em determinadas modalidades, o revestimento compreende um polímero
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[000575] Em algumas modalidades, X é -OMe, um grupo biotina, fosfonato ou silano. Em algumas modalidades, cada um dentre i, j, k e l é, independentemente, um número inteiro entre 0 e 100, inclusive.
[000576] Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de alquila. Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de alquila opcionalmente substituída. Em algumas modalidades, a superfície é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de poli(etileno glicol). Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um silano que compreende um grupo de acoplamento. Por exemplo, o grupo de acoplamento pode compreender porções químicas de produtos químicos, tais como grupos amina, grupos carboxila, grupos hidroxila, grupos sulfidrila, metais, quelantes e semelhantes. Alternativamente, os mesmos podem incluir elementos de ligação específicos, tais como biotina, avidina, estreptavidina, neutravidina, lectinas, SNAP-tags™ ou substratos dos mesmos, peptídeos ou proteínas associativos ou de ligação, anticorpos ou fragmentos de anticorpo, ácidos nucleicos ou análogos de ácido nucleico, ou semelhantes. Adicional ou alternativamente, o grupo de acoplamento pode ser usado para acoplar um grupo adicional que é usado para se acoplar ou ligar à molécula de interesse, que pode, em alguns casos incluir tanto grupos funcionais químicos quanto elementos de ligação específicos. A título de exemplo, um grupo de acoplamento, por exemplo, biotina, pode ser depositado em uma superfície de substrato e ativado seletivamente em uma determinada área. Um agente de ligação intermediário, por exemplo, estreptavidina, pode, então, ser acoplada ao primeiro grupo de acoplamento. A molécula de interesse, que nesse exemplo particular seria biotinilada, é, então, acoplada à estreptavidina.
[000577] Em algumas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com um silano que compreende biotina, ou um análogo das mesmas. Em algumas modalidades, a superfície é funcionalizada com um silano que compreende uma cadeia de poli(etileno) glicol, em que a cadeia de poli(etileno glicol) compreende biotina. Em determinadas modalidades, a superfície funcionalizada é funcionalizada com a mistura de silanos, em que pelo menos um tipo de silano compreende biotina e pelo menos um tipo de silano não compreende biotina. Em algumas modalidades, a mistura compreende cerca de 10 vezes menos, cerca de 25 vezes menos, cerca de 50 vezes menos, cerca de 100 vezes menos, cerca de 250 vezes menos, cerca de 500 vezes menos, ou cerca de 1000 vezes menos do silano biotinilado que o silano que não compreende biotina.
[000578] A Figura 10 a 3 retrata um processo exemplificativo não limitante para preparar o poço de amostra superfície a partir do chip fabricado (por exemplo, dispositivo integrado) para a iniciação de uma reação de sequenciamento. O poço de amostra é retratado com uma superfície de fundo (retângulo sem sombra) e paredes laterais (retângulos verticais sombreados). As paredes laterais podem ser compostas de múltiplas camadas (por exemplo, Al, Al2O3, Ti, TiO2, TiN). Na etapa (a) as paredes laterais são depositadas com uma camada de barreira de Al2O3. A camada de barreira de Al2O3 é, então, revestida, na etapa (b), com grupos PEG fosfonato, por exemplo, tratando-se a superfície com um ou mais ácidos PEG-fosfônicos. Na etapa (c), a superfície de fundo é funcionalizada, por exemplo, com uma mistura de PEG-silano e PEG-silano biotinilado. As formas ovais representam grupos biotina individuais que podem fornecer locais para uma afixação de uma única molécula ou complexo, tal como um complexo de polimerase. Na etapa (d), um complexo de polimerase é afixado a um grupo biotina na superfície de fundo. A polimerase pode ser afixada por um agente de ligação, tal como estreptavidina e uma etiqueta de biotina no complexo de polimerase. O complexo de polimerase pode compreender adicionalmente um ácido nucleico modelo e iniciador (não mostrado). A etapa (e) retrata a iniciação de uma reação de sequenciamento pela exposição pelo complexo de polimerase imobilizado a nucleotídeos identificados de modo luminescente.
I. POLIMERASES
[000579] O termo "polimerase", conforme no presente documento, se refere, de modo geral, a qualquer enzima (ou enzima polimerizante) com a capacidade para catalisar uma reação de polimerização. Exemplos de polimerases incluem, sem limitação, uma polimerase de ácido nucleico, uma transcriptase ou uma ligase. Uma polimerase pode ser uma enzima de polimerização.
[000580] As modalidades direcionadas para a extensão de ácido nucleico de única molécula (por exemplo, para sequenciamento de ácido nucleico) pode usar qualquer polimerase que tem a capacidade para sintetizar um ácido nucleico complementar a uma molécula de ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, uma polimerase pode ser uma DNA polimerase, uma RNA polimerase, uma transcriptase reversa e/ou uma forma mutante ou alterada de um ou mais das mesmas.
[000581] As modalidades direcionadas para sequenciamento de ácido nucleico única molécula pode usar qualquer polimerase que tem a capacidade para sintetizar um ácido nucleico complementar a um ácido nucleico alvo. Exemplos de polimerases incluem, porém, sem limitação, uma DNA polimerase, uma RNA polimerase, uma polimerase termoestável, uma polimerase do tipo selvagem, uma polimerase modificada, E. coli DNA polimerase I, DNA polimerase T7, bacteriófago T4 DNA polimerase Φ29 (psi29) DNA polimerase, Taq polimerase, Tth polimerase, Tli polimerase, Pfu polimerase, Pwo polimerase, VENT polimerase, DEEPVENT polimerase, EX-Taq polimerase, LA-Taq polimerase, Sso polimerase, Poc polimerase, Pab polimerase, Mth polimerase, ES4 polimerase, Tru polimerase, Tac polimerase, Tne polimerase, Tma polimerase, Tca polimerase, Tih polimerase, Tfi polimerase, Platina Taq polimerases, Tbr polimerase, Tfl polimerase, Tth polimerase, Pfutubo polimerase, Pyrobest polimerase, Pwo polimerase, KOD polimerase, Bst polimerase, Sac polimerase, fragmento de Klenow, polimerase com atividade de 3’ a 5’ exonuclease, e variantes, produtos modificados e derivados dos mesmos. Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase de subunidade única. Exemplos não limitantes de DNA polimerases e suas propriedades são descritos em detalhes em, entre outros lugares, DNA Replication 2a edição, Kornberg e Baker, W. H. Freeman, New York, NY, EUA, 1991).
[000582] Com base no pareamento entre uma nucleobase de um ácido nucleico alvo e o dNTP complementar, em que a polimerase incorpora o dNTP no filamento de ácido nucleico sinterizado recentemente formando-se uma ligação de fosfodiéster entre a terminação de hidroxila 3’ do filamento sinterizado recentemente e o alfa fosfato do dNTP. Nos exemplos nos quais a etiqueta luminescente conjugada para o dNTP for um fluoróforo, sua presença é sinalizada pela excitação e um pulso de emissão é detectado durante ou após a etapa de incorporação. Para a detecção de identificações que são conjugadas ao fosfato (gama) terminal do dNTP, a incorporação do dNTP no filamento sinterizado recentemente resulta na liberação dos fosfatos beta e gama e a detecção de identificação, que é livre para se difundir no poço de amostra, que resulta em uma diminuição na emissão detectada do fluoróforo.
[000583] Em algumas modalidades, o polimerase é uma polimerase com alta capacidade de processamento. No entanto, em algumas modalidades, o polimerase é uma polimerase com capacidade de processamento reduzida. A capacidade de processamento de polimerase se refere, de modo geral, a capacidade de uma polimerase para incorporar consecutivamente dNTPs em um modelo de ácido nucleico sem liberar o modelo de ácido nucleico.
[000584] Em algumas modalidades, a polimerase é uma polimerase com baixa atividade de 5‘-3‘ exonucelase e/ou 3‘-5‘ exonuclease. Em algumas modalidades, a polimerase é modificada (por exemplo, por substituição de aminoácido) para ter atividade de 5‘-3‘ exonucelase reduzida e/ou atividade de 3^ relativa a uma polimerase do tipo selvagem correspondente. Exemplos não limitantes adicionais de DNA polimerases incluem 9°Nm™ DNA polimerase (New England Biolabs), e um P680G mutante da Klenow exo- polimerase (Tuske et al. (2000) JBC 275(31): páginas 23.759 a 23.768). Em algumas modalidades, uma polimerase que tem capacidade de processamento reduzida fornece precisão aumentada para padrões de sequenciamento que contém um ou mais estiramentos de repetições de nucleotídeo (por exemplo, duas ou mais bases sequenciais do mesmo tipo).
[000585] As modalidades direcionadas para a extensão de molécula de RNA única (por exemplo, para sequenciamento de RNA) podem usar qualquer transcriptase reversa que tem a capacidade para sinterizar DNA complementar (cDNA) de um modelo de RNA. Em tais modalidades, uma transcriptase reversa pode funcionar de uma maneira semelhante a polimerase em que o cDNA pode ser sinterizado a partir de um modelo de RNA por meio da incorporação de dNTPs para um iniciador de transcrição reverso recozido para um modelo RNA. O cDNA pode, então, participar em uma reação de sequenciamento e sua sequência determinada conforme descrito acima e em outra parte no presente documento. A sequência determinada do cDNA pode, então, ser usada, por meio de complementaridade de sequência, para determinar a sequência do modelo de RNA original. Exemplos de reverse transcriptases incluem transcriptase reversa do Vírus da Leucemia Moloney Murine (M-MLV), transcriptase reversa do vírus mieloblastosis aviária (AMV), transcriptase reversa do vírus da imunodeficiência humana (HIV-1) e transcriptase reversa de telomerase.
[000586] A capacidade de processamento, atividade de exonuclease, afinidade relativa para tipos diferentes de ácido nucleico, ou outra propriedade de uma polimerase de ácido nucleico podem ser aumentadas ou diminuídas por uma pessoa versada na técnica por mutação ou outra modificação em relação a uma polimerase do tipo selvagem correspondente.
J. MEDIÇÕES DE TEMPO DE VIDA
[000587] As medições de tempo de vida podem ser realizadas com o uso de um comprimento de onda de energia de excitação para excitar um marcador em um poço de amostra. Uma combinação de marcadores que tem tempos de vida distintos é selecionada para distinguir entre os marcadores individuais com base nas medições de tempo de vida. Adicionalmente, a combinação de marcadores pode alcançar um estado excitado quando iluminado pela fonte de excitação usada. Qualquer conjunto ou número de marcadores adequados pode ser usado, os quais têm tempos de vida distinguíveis. Por exemplo, três, quatro ou seis marcadores diferentes podem ser usados. Os marcadores luminescentes podem excitar no mesmo comprimento de onda de excitação ou dois ou quatro comprimentos de onda de excitação diferentes.
[000588] Uma fonte de excitação pulsada pode ser uma dentre as fontes de excitação pulsadas que usam as técnicas descritas acima. Em alguns exemplos, a fonte de excitação pulsada pode ser um diodo laser semicondutor configurado para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado direto do diodo laser. A potência dos pulsos é menor que 20 dB da potência de pico de pulso em aproximadamente 250 picossegundos após o pico. O intervalo de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20 a 200 picossegundos. A duração de tempo entre cada pulso de excitação está na faixa de 1 a 50 nanossegundos. Uma representação esquemática de como medições exemplificativas que pode ser realizada é mostrada na Figura 10-4, que ilustram a temporização de pulsos de excitação 10-401 gerados em intervalos regulares. A fileira de fundo da Figura 10-4 indica qual indicação está presente quando um pulso de excitação 10-401 chega. Em tal ocasião, não haverá indicação presente. Além disso, a fileira intermediária da Figura 10-4 ilustra a distribuição de probabilidade de emissão 10-402 para a indicação que está presente. Também é ilustrado na fileira intermediária um retângulo 10-403 que indica a detecção de um fóton da indicação. Conforme mostrado na Figura 10-4, há momentos em que um fóton não é emitido ou o fóton que é emitido não é detectado devido à perda ou ineficácia do detector.
[000589] O sensor para cada pixel tem pelo menos uma região fotossensível por um pixel. Em algumas modalidades, um chip de sensor pode incluir uma região de sensor única por pixel. A região fotossensível pode ter dimensões de 5 mícrons por 5 mícrons. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo de quando os mesmos alcançam o sensor. Aumentando-se o número de distâncias de tempo pode melhorar a resolução do histograma registrado de fótons coletados através de uma série de distâncias de tempo e aprimorar diferenciação entre marcadores luminescentes diferentes. Em algumas modalidades, elementos de focalização podem ser integrados com o sensor a fim de aprimorar a coleta de fótons emitidos por um marcador em um poço de amostra associado. Tais elementos de focalização podem incluir uma lente Fresnel 10-500 conforme mostrado na Figura 10-5. Quando o sensor for configurado para detectar um comprimento de onda particular, os quatro marcadores luminescentes podem emitir luminescência semelhante ao comprimento de onda particular. Alternativamente, os quatro marcadores luminescentes podem emitir luminescência em comprimentos de onda diferentes.
[000590] Em algumas modalidades, um objeto de amostra pode ser identificado com um dentre uma pluralidade de tipos diferentes de marcadores, cada um associado a um conjunto mutuamente exclusivo de objetos de amostra. Cada um dentre a pluralidade de marcadores emite energia de emissão com um tempo de vida diferente. Quando o sensor for configurado para detectar um comprimento de onda particular, a pluralidade marcadores pode emitir energia de emissão semelhante ao comprimento de onda particular. Alternativamente, a pluralidade de marcadores pode emitir energia de emissão em comprimentos de onda diferentes. As técnicas descritas no presente documento para determinar um tempo de vida para um marcador podem ser usadas. Em resposta a um pulso de energia de excitação da fonte de excitações, um dentre a pluralidade de marcadores etiquetado para a amostra pode emitir um fóton. O tempo do fóton após o pulso de excitação ser registrado. Os pulsos repetidos de energia de excitação podem produzir múltiplos eventos de emissão de fótons que são, então, usados para determinar um tempo de vida para o marcador. O tempo de vida determinado pode, então, ser usado para identificar o marcador no poço de amostra dentre a pluralidade de marcadores.
[000591] Um conjunto exemplificativo de quatro marcadores luminescentes que são distinguíveis com base nas medições de tempo de vida são ATRho14, Cy5, AT647N e CF633, conforme mostrado pela plotagem na Figura 10-6. Esses quatro marcadores têm tempos de vida variantes e produzem histogramas distinguíveis quando pelo menos quatro distâncias de tempo são usadas. A Figura 10-7 destaca um perfil de sinal para cada um dentre esses marcadores ao longo de 16 distâncias de tempo. O perfil de sinal é normalizado para cada marcador. As distâncias de tempo variam no intervalo de tempo a fim de fornecer um perfil de sinal único para cada um dentre os marcadores. Conforme ilustrado na Figura 10-7, um sensor que tem 16 distâncias de tempo definidas pelas delimitações de tempo com espaçamento variável pode ser usado para distinguir dentre ATTORho14, Cy5, ATTO647N e CF633 pela distribuição de contagens de fóton ao longo de uma ou mais dentre as 16 distâncias de tempo. Por exemplo, o sensor detecta 11% da luz total detectada pelo marcador ATTORho14 entre delimitações de tempo 0,692 ns e 0,792 ns. Como outro exemplo, o sensor detecta 10% da luz total detectada pelo marcador CF633 entre delimitações de tempo 1,991 ns e 2,507 ns. Dessa maneira, cada marcador pode ser distinguido pela quantidade total de luz em uma ou mais distâncias de tempo. A Figura 10-8 e 10-9 ilustram perfis de sinal, tanto contínuos quanto distintos, respectivamente, de outro conjunto exemplificativo de marcadores, ATTO Rho14, D650, ST647 e CF633, que são distinguíveis com base nas medições de tempo de vida. Outros conjuntos de marcadores incluem ATTO Rho14, C647, ST647, CF633; Alexa Fluor647, B630, C640R, CF633; e ATTO Rho14, ATTO 647N, AlexaFluor647, CF633.
K. MEDIÇÕES DE TEMPO DE VIDA ESPECTRAIS
[000592] As medições de tempo de vida podem ser combinadas com medições espectrais de um ou mais marcadores luminescentes. As medições espectrais podem depender do comprimento de onda de energia de emissão para marcadores individuais e serem capturada com o uso de pelo menos duas regiões de sensor por pixel. O sensor é configurado para detectar propriedades espectrais da energia de emissão emitida a partir de um poço de amostra. Uma estrutura exemplificativa do dispositivo integrado inclui pixels em que cada uma tem um sensor com duas regiões distintas, sendo que cada região é configurada para detectar um comprimento de onda diferente. Alguns marcadores podem ter espectros que sobrepõem substancialmente e/ou ter comprimentos de emissão de pico de onda que diferem em aproximadamente 5 nm ou menos, por exemplo, e são difíceis de distinguir com base apenas nas técnicas de detecção espectral. No entanto, esses marcadores podem ter tempos de vida variantes, e as técnicas para realizar medições de tempo de vida podem ser usadas para distinguir entre os marcadores.
[000593] A combinação de ambas as medições de tempo de vida com medições espectrais pode ser realizada com o uso de um comprimento de onda de energia de excitação para excitar um marcador em um poço de amostra, embora mais que um comprimento de onda de energia de excitação possa ser usado, em algumas modalidades. Uma combinação de marcadores é selecionada tendo pelo menos dois comprimentos de onda de emissão distintos, em que os marcadores que emitem em um comprimento de onda têm tempos de vida distintos são selecionados para distinguir entre os marcadores individuais com base no tempo de vida e nas medições espectrais. Adicionalmente, a combinação de marcadores é selecionada para poder alcançar um estado excitado quando iluminado pela fonte de excitação usada. Qualquer conjunto ou número de marcadores adequados pode ser usado, os quais têm comprimentos de onda de emissão diferentes e/ou tempos de vida diferentes.
[000594] A fonte de excitação é uma fonte de excitação pulsada e pode ser uma dentre as fontes de excitação que usam as técnicas descritas acima. Em alguns exemplos, a fonte de excitação pulsada pode ser um diodo laser semicondutor configurado para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado direto do diodo laser. A potência dos pulsos é menor que 20 dB do pico potência após 250 picossegundos após o pico. A duração de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20 a 200 picossegundos. O intervalo de tempo entre cada pulso de excitação está na faixa de 1 a 50 nanossegundos. Uma representação esquemática de como medições exemplificativas que pode ser realizada é mostrada na Figura 10-10. Em algumas modalidades, a fonte de excitação fornece energia de excitação que tem um comprimento de onda de aproximadamente 640 nm. Em algumas modalidades, a fonte de excitação fornece energia de excitação que tem um comprimento de onda na faixa de aproximadamente 515 nm a 535 nm.
[000595] O sensor é configurado para detectar tanto propriedades temporais quanto propriedades espectrais da energia de emissão de uma pluralidade de marcadores. O sensor para cada pixel tem pelo menos duas regiões fotossensíveis por pixel. Em algumas modalidades há duas regiões fotossensíveis por um pixel. Em outras modalidades, há quatro regiões fotossensíveis por um pixel. Cada região fotossensível é configurada para detectar um comprimento de onda diferente ou faixa de comprimentos de onda. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo de quando os mesmos alcançam o sensor. Aumentando-se o número de distâncias de tempo pode melhorar a resolução do histograma registrado de fótons coletados através de uma série de distâncias de tempo e aprimorar diferenciação entre marcadores luminescentes diferentes por seus tempos de vida individuais. Em algumas modalidades, há duas distâncias de tempo por uma região do sensor. Em outras modalidades, há quatro distâncias de tempo por uma região do sensor.
[000596] Em algumas modalidades, um sensor inclui dois subsensores que são usados para detectar quatro marcadores diferentes. Um primeiro subsensor pode ser associado ao primeiro comprimento de onda de emissão emitido por dois dentre os marcadores. O primeiro subsensor também pode ser associado aos dois tempos de vida distintos dos dois marcadores que emite no primeiro comprimento de onda de emissão. Um segundo subsensor pode ser associado ao segundo comprimento de onda emitido pelos outros dois marcadores. O segundo subsensor também pode ser associado aos dois tempos de vida distintos dos dois marcadores que emite no segundo comprimento de onda de emissão. A diferenciação entre os quatro marcadores luminescentes pode ocorrer com base em uma combinação de comprimento de onda detectado e tempo de vida detectado. Cada um dentre os dois subsensores pode detectar um único fóton da energia de emissão emitida a partir do marcador.
[000597] Um conjunto exemplificativo de quatro marcadores luminescentes que são distinguíveis com base nas medições de tempo de vida são ATTO Rho14, AS635, Alexa Fluor647, e ATTO 647N. Esses quatro marcadores têm dois que emitem em um comprimento de onda semelhante e outro comprimento de onda semelhante. Dentro de cada par de marcadores que emitem em um comprimento de onda semelhante, o par de marcadores tem tempos de vida diferentes e produz histogramas distinguíveis quando pelo menos quatro distâncias de tempo forem usadas. Nesse exemplo, ATTO Rho14 e AS635 emitem comprimentos de onda de luminescência semelhantes e têm tempos de vida distintos. Alexa Fluor 647 e ATTO 647N emitem comprimentos de onda de luminescência semelhantes, diferentes dos comprimentos de onda emitidos por ATTO Rho 14 e AS635, e têm tempos de vida distintos. A Figura 10-11 mostra um tempo de vida de plotagem como uma função de comprimento de onda de emissão para esse conjunto de marcadores para ilustrar como cada um dentre esses marcadores é distinguível com base em uma combinação de tempo de vida e comprimento de onda de emissão. Conforme mostrado na Figura 10-11, ATTO Rho14 pode emitir quase 645 nm, AS635 pode emitir quase 653 nm, Alexa Fluor 647 pode emitir quase 665 nm e ATTO Fluor 647N pode emitir quase 669 nm. AS635 e ATTO 647N têm tempos de vida semelhantes em aproximadamente 1,2 ns, e ATTO Rho14 e Alexa Fluor 647 têm tempos de vida menores tanto que AS635 quanto ATT0 647. Esses marcadores podem ser distinguidos com base em seus comprimentos de onda de emissão característicos e tempo de vida de emissão. Por exemplo, ATTO 647N e Alexa Fluor 647 têm comprimentos de emissão de pico de onda semelhantes, porém, têm tempos de vida distinguíveis. AS635 e ATTO 647N têm tempos de vida semelhantes, porém, têm comprimentos de emissão de pico de onda substancialmente diferentes.
[000598] Os marcadores podem excitar no mesmo comprimento de onda de excitação ou dois ou mais comprimentos de onda de excitação diferentes. Quando o sensor é configurado para detectar dois comprimentos de onda de energia de emissão, dois dentre os quatro marcadores podem emitir em um primeiro comprimento de onda enquanto os outros dois marcadores podem emitir em um segundo comprimento de onda. Alternativamente, quando o sensor for configurado para detectar quatro comprimentos de onda de emissão, cada marcador pode emitir em um comprimento de onda diferente e/ou pode ter densidade de probabilidade de emissão diferentes e tempos de vida. A Figura 10-12 mostra uma plotagem de potência como uma função de comprimento de onda para ATT Rho14, Alexa Fluor 647 e ATT) 647N.
[000599] A Figura 10-13 mostra plotagens de sinal de fluorescência ao longo do tempo para cada um dentre esses marcadores quando estiverem presentes em um poço de amostra com um diâmetro de 135 nm para ilustrar uma decadência de tempo diferente, e, desse modo, tempos de vida, para esses marcadores.
[000600] A Figura 10-14 ilustra o perfil de sinal para esses marcadores ao longo de quatro regiões de sensor e cada região captura quatro distâncias de tempo. Os perfis de sinal são normalizados e são usados para distinguir entre os marcadores diferentes pelo número relativo de fótons capturados por uma região fotossensível para cada uma dentre as quatro distâncias de tempo. A luz de um primeiro comprimento de onda de emissão, emitida a partir de um primeiro marcador (Alexa Fluor 647), é direcionada para uma primeira região de sensor. No entanto, a direcionalidade da luz não é perfeita e parte da luz é detectada por uma segunda região de sensor, uma terceira região de sensor e uma quarta região de sensor. Desse modo, luz emitida a partir do primeiro marcador é associada a um primeiro sinal detector de sensor, conforme ilustrado na representação esquemática intermediária da Figura 10-14 pelas estatísticas para porcentagem de luz total detectada pelas quatro regiões de sensor ao longo de quatro distâncias de tempo. Na segunda distância de tempo entre 1,184 ns e 2,069 ns, a primeira região de sensor detecta 4,2% da luz total detectada a partir do primeiro marcador, a segunda região de sensor detecta 11,7% da luz total detectada a partir do primeiro marcador, a terceira região de sensor detecta 18,6% da luz total detectada a partir do primeiro marcador, e a quarta região de sensor detecta 14,6% da luz total detectada a partir do primeiro marcador. Esse padrão de sensor detectado para uma ou mais distâncias de tempo constitui um primeiro sinal de detecção associado com o primeiro marcador. A Figura 10-14 mostra padrões de sensor e de distância de tempo para os marcadores ATRho14 e ATTO647N, que resulta em sinais de detecção distinguíveis entre pelo menos esses três marcadores. Por exemplo, o segundo sensor detecta 12,3 % da luz total do marcador ATTORho14 na primeira distância de tempo entre 0,25 ns e 1,184 ns. Dessa maneira, cada marcador pode ser distinguido com base em seus espectros e tempo de vida de emissão.
[000601] Outros conjuntos de quatro fluoróforos para tais medições de tempo de vida espectral são ATRho14, D650, ST647, CF633; ATTO Rho14, C647, ST647, CF633; Alexa Fluor 647, B630, C640R, CF633; e ATTO Rho 14, ATTO 647N, Alexa Fluor 647, CF633. A Figura 10-15 mostra uma plotagem do perfil de sinal de intensidade ao longo do tempo para ATRho14, D650, ST647 e C633. A Figura 10-16 ilustra o perfil de sinal para ATRho14.
L. MEDIÇÕES DE ENERGIA DE EXCITAÇÃO DE TEMPO DE VIDA
[000602] As medições de tempo de vida combinadas com o uso de pelo menos dois comprimentos de onda de energia de excitação podem ser usadas para distinguir entre múltiplos marcadores. Alguns marcadores podem se excitar quando um comprimento de onda de excitação for usado e outros não. Uma combinação de marcadores que tem tempos de vida distintos é selecionada para cada comprimento de onda de excitação para distinguir entre os marcadores individuais com base nas medições de tempo de vida. Nessa modalidade, um chip de sensor pode ser configurado para ter cada pixel com um sensor que tem uma região e o instrumento pode ser configurado para fornecer pelo menos dois comprimentos de onda de energia de excitação, tais como por lasers de diodo pulsado eletricamente modulados com entrelaçamento temporal.
[000603] Os marcadores podem se excitar em comprimentos de onda de excitação diferentes. Quando a fonte de luz for configurada para distribuir dois comprimentos de onda de energia de excitação, alguns marcadores podem se excitar em um primeiro comprimento de onda de excitação e não se excitarem em um segundo comprimento de onda de excitação, enquanto os outros marcadores se excitam em um segundo comprimento de onda de excitação e não se excitam, substancialmente, como um primeiro comprimento de onda de excitação. Em algumas modalidades, dois marcadores diferentes se excitam no primeiro comprimento de onda de excitação e não se excitam substancialmente no segundo comprimento de onda de excitação, porém, emitem em densidade de probabilidade de emissão diferentes e tempos de vida. Dois marcadores diferentes se excitam no segundo comprimento de onda de excitação e não se excitam substancialmente no primeiro comprimento de onda de excitação, porém, têm densidade de probabilidade de emissão diferentes e tempos de vida.
[000604] A fonte de excitação é uma combinação de pelo menos duas energias de excitação. A fonte de excitação é uma fonte de excitação pulsada e pode ser um ou mais dentre as fontes de excitação que usam as técnicas descritas acima. Em alguns exemplos, a fonte de excitação pulsada pode ser dois diodos laser semicondutores configurados para emitir pulsos através de bombeamento elétrico modulado direto do diodo laser. A potência dos pulsos é 20 dB menor que a potência de pico de pulso a 250 picossegundos após o pico. O intervalo de tempo para cada pulso de excitação está na faixa de 20 a 200 picossegundos. O intervalo de tempo entre cada pulso de excitação está na faixa de 1 a 50 nanossegundos. Um comprimento de onda de excitação é emitido por um pulso e conhecendo-se o comprimento de onda de excitação um subconjunto de marcadores com tempos de vida distintos é identificado unicamente. Em algumas modalidades, pulsos de excitação alternam entre os comprimentos de onda diferentes. Por exemplo, quando dois comprimentos de onda de excitação forem usados pulsos subsequentes alternam entre um comprimento de onda e o outro comprimento de onda. Uma representação esquemática de como medições exemplificativas que pode ser realizada é mostrada na Figura 10-17. Qualquer técnica adequada para combinar múltiplas fontes de excitação e pulsos entrelaçados que têm comprimentos de onda diferentes pode ser usada.
[000605] O sensor para cada pixel tem pelo menos uma região fotossensível por um pixel. A região fotossensível pode ter dimensões de 5 mícrons por 5 mícrons. Fótons são detectados dentro de intervalos de tempo de quando os mesmos alcançam o sensor. Aumentando-se o número de distâncias de tempo pode melhorar a resolução do histograma registrado de fótons coletados através de uma série de distâncias de tempo e aprimorar diferenciação entre marcadores luminescentes diferentes. O sensor tem pelo menos duas distâncias de tempo. Em algumas modalidades, o sensor pode ter quatro distâncias de tempo para identificar o tempo de vida de energia de emissão de um marcador.
[000606] Um conjunto exemplificativo de quatro marcadores luminescentes que são distinguíveis com base nas medições de tempo de vida são Alexa Fluor 546, Cy3B, Alexa Fluor 647 e ATTO 647N. Conforme mostrado na Figura 10-18, Alexa Fluor 546 e Cy3B se excitam em um comprimento de onda, tal como 532 nm, e têm tempos de vida distintos. Alexa Fluor 647 e ATTO 647N se excitam em outro comprimento de onda, 640 nm, e têm tempos de vida distintos, conforme mostrado na Figura 10-19. Por exemplo, as curvas para ATTO 647N e Alexa Fluor 647 são mostradas na Figura 10-19 que ilustra esses dois marcadores que têm tempos de vida diferentes. Os perfis de sinal normalizados distinguíveis ao longo de 16 distâncias de tempo para ATTO647N e CF633, são ambos excitados a 640 nm, são mostrados na Figura 10-20. Por exemplo, o sensor detecta 12% da luz total detectada a partir do marcador ATTO 647N entre delimitações de tempo 0,629 ns e 0,997 ns. Detectando-se um fóton após um comprimento de onda de excitação conhecido, um dentre esses dois pares de marcadores pode ser determinado com base no comprimento de onda de excitação anterior e cada marcador para um par é identificado com base nas medições de tempo de vida.
M. MEDIÇÕES ESPECTRAIS
[000607] Um ou mais sensores são configurados para detectar propriedades espectrais incluindo-se uma ou mais camadas do chip de teste ou chip de sensor configurado para classificar os comprimentos de onda antes dos mesmos alcançarem o sensor. Uma ou mais camadas podem incluir pelo menos um componente estrutural configurado para classificar de modo espectral a energia de emissão emitida a partir de um poço de amostra. O pelo menos um componente estrutural pode incluir um desvio de lente Fresnel, uma grade de fase aberta, ou qualquer outra estrutura adequada configurada para fornecer diretividade desejada para distribuição, de modo espectral, de energia de emissão.
[000608] Um pixel de um chip de sensor pode incluir múltiplos subsensores configurados para detectar uma distribuição espectral de energia de emissão direcionada a partir de um poço de amostra correspondente em um chip de teste. A configuração do chip de sensor e os múltiplos subsensores no chip de sensor podem ser dimensionados, formados e dispostos para distinguir suficientemente entre marcadores diferentes usados para identificar uma amostra.
[000609] A diferenciação entre marcadores luminescentes pode ocorrer com base no comprimento de onda detectado.
[000610] Em algumas modalidades, o sensor pode ser segmentado em quatro subsensores para detectar os quatro marcadores luminescentes diferentes. O sensor pode ser dimensionado e posicionado de qualquer forma posicionada para capturar a energia de emissão emitida a partir do poço de amostra.
[000611] Em algumas modalidades, cada subsensor é associado a um comprimento de onda de luminescência diferente. A luz de um primeiro comprimento de onda de luminescência, emitida a partir de um primeiro marcador luminescente (por exemplo, Alexa Fluor 555), é direcionada para um primeiro subsensor. No entanto, a direcionalidade da luz não é perfeita e parte da luz é detectada por um segundo subsensor, um terceiro subsensor e um quarto subsensor. Desse modo, luz emitida a partir do primeiro marcador luminescente é associada a um primeiro sinal detector de sensor, conforme ilustrado na Figura 10-21. Quando os fótons forem coletados durante o tempo de integração dos sensores, o primeiro subsensor detecta 42% da luz total detectada a partir do primeiro marcador luminescente, o segundo subsensor detecta 39% da luz total detectada a partir do primeiro marcador luminescente, o terceiro subsensor detecta 15% da luz total detectada a partir do primeiro marcador luminescente, e o quarto subsensor detecta 4% da luz total detectada a partir do primeiro marcador luminescente. Esse padrão de subsensor detectado constitui um primeiro sinal de detecção associado ao primeiro marcador luminescente. Os padrões de subsensor diferentes são associados aos comprimentos de onda de luminescência diferentes dos marcadores luminescentes diferentes que resultam em sinais de detecção distinguíveis, conforme ilustrado na Figura 10-21.
[000612] De modo semelhante, o segundo subsensor é associado a um segundo comprimento de onda de luminescência, o terceiro subsensor é associado a um terceiro comprimento de onda de luminescência, e o quarto subsensor é associado a um quarto comprimento de onda de luminescência. Dessa maneira, marcadores exemplificativos que são distinguíveis com base na energia de emissão são Alexa Fluor 555, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 647, e Alexa Fluor 660, que têm emissão espectros mostrados na Figura 10-22.
VII. DISPOSITIVO DE COMPUTAÇÃO
[000613] A Figura 10-23 ilustra um exemplo de um ambiente de sistema de computação 1000 adequado no qual modalidades podem ser implantadas. Por exemplo, o dispositivo de computação 2-130 da Figura 2-1 pode ser implantado de acordo com o ambiente de sistema de computação 1000. Adicionalmente, o ambiente de sistema de computação 1000 pode atuar como um sistema de controle que é programado para controlar o instrumento para realizar um ensaio. Por exemplo, o sistema de controle pode controlar a fonte de excitação para emitir e direcionar luz na direção dos poços de amostra do chip de teste; controlar os sensores para permitir detecção de luz de emissão a partir de um ou mais poços de amostra; e analisar sinais a partir de sensores para identificar, por exemplo, analisando-se a distribuição espacial da energia de emissão, a amostra presente em um poço de amostra. O ambiente de sistema de computação 1000 é apenas um exemplo de um ambiente de computação adequado e não se pretende sugerir qualquer limitação quanto ao escopo de uso ou funcionalidade da invenção. O ambiente de computação 1000 também não deve ser interpretado como tendo qualquer dependência ou exigência em relação a qualquer um dentre ou uma combinação de componentes ilustrados no ambiente operacional exemplificativo 1000.
[000614] As modalidades são operacionais com inúmeros outros ambientes de sistema de computação ou configurações de propósito geral ou propósito especial. Exemplos de sistemas de computação, ambientes e/ou configurações bem conhecidos que podem ser adequados para uso com a invenção incluem, porém sem limitação, computadores pessoais, computadores pessoais, computadores servidores, dispositivos de mão ou do tipo laptop, sistemas de multiprocessador, sistemas com base em multiprocessador, decodificadores de sinais, eletrônicos programáveis para consumidores, PCs de rede, minicomputadores, computadores mainframe, ambientes de computação distribuída que incluem qualquer um dos sistemas ou dispositivos acima, e similares.
[000615] O ambiente de computação pode executar instruções executáveis por computador, tais como módulos de programa. Em geral, módulos de programa incluem rotinas, programas, objetos, componentes, estruturas de dados, etc. que realizam tarefas particulares ou implementam tipos de dados abstratos particulares. A invenção também pode ser praticada em ambientes de computação distribuída em que as tarefas são realizadas por dispositivos de processamento remoto que são ligados através de uma rede de comunicação. Em um ambiente de computação distribuída, módulos de programa podem ser localizados em mídia de armazenamento de computador tanto locais quanto remotas incluindo dispositivos de armazenamento de memória.
[000616] Com referência à Figura 10-23, um sistema exemplificativo para implantar a invenção inclui um dispositivo de computação de propósito geral na forma de um computador 1010. Os componentes de computador 1010 podem incluir, porém sem limitação, uma unidade de processamento 1020, uma memória de sistema 1030, e um barramento de sistema 1021 que acopla vários componentes de sistema incluindo a memória de sistema à unidade de processamento 1020. O barramento de sistema 1021 pode ser qualquer um dentre vários tipos de estruturas de barramento incluindo um barramento de memória ou controlador de memória, um barramento periférico e um barramento local com uso de qualquer uma dentre uma variedade de arquiteturas de barramento. A título de exemplo, e não limitação, tais arquiteturas incluem barramento de Arquitetura Padrão Industrial (ISA), barramento de Arquitetura de Micro Canal (MCA), barramento de ISA Avançada (EISA), barramento local de Associação de Padrões Eletrônicos de Vídeo (VESA), e barramento de Interconector de Componentes Periféricos (PCI) também conhecido como barramento mezanino.
[000617] O computador 1010 tipicamente inclui uma variedade de mídia legível por computador. A mídia legível por computador pode ser qualquer mídia disponível que pode ser acessada por computador 1010 e inclui mídia tanto volátil quanto não volátil, mídia removível e não removível. A título de exemplo, e não limitação, a mídia legível por computador pode compreender mídia de armazenamento de computador e mídia de comunicação. A mídia de armazenamento de computador inclui mídia tanto volátil quanto não volátil, removível e não removível em qualquer método ou tecnologia para armazenamento de informações tais como instruções legíveis por, estruturas de dados, módulos de programa ou outros dados. Mídia de armazenamento de computador inclui, porém sem limitação, RAM, ROM, EEPROM, memória flash ou outra tecnologia de memória, CD-ROM, discos digitais versáteis (DVD) ou outro armazenamento de disco óptico, cassetes magnéticas, fita magnética, armazenamento de disco magnético ou outros dispositivos de armazenamento magnético, ou qualquer outro meio que pode ser usado para armazenar as informações desejadas e que podem ser acessados pelo computador 1010. A mídia de comunicação tipicamente incorpora instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa ou outros dados em um sinal de dados modulado tal como uma onda portadora ou outro mecanismo de transporte e inclui qualquer mídia de entrega de informações. O termo "sinal de dados modulado" significa um sinal que tem um ou mais de suas características ajustadas ou alteradas de maneira a codificar informações no sinal. A título de exemplo, e não limitação, a mídia de comunicação inclui mídia com fio tal como uma rede com fio ou uma conexão de ligação direta, e mídia sem fio tal como acústica, RF, infravermelho e outra mídia sem fio. Combinações de qualquer uma acima também devem ser incluídas dentro do escopo de mídia legível por computador.
[000618] A memória de sistema 1030 inclui mídia de armazenamento de computador na forma de memória volátil e/ou não volátil tal como memória apenas de leitura (ROM) 1031 e memória de acesso aleatório (RAM) 1032. Um sistema de entrada/saída básico 1033 (BIOS), que contém as rotinas básicas que ajudam a transferir informações entre elementos dentro do computador 1010, tal como durante a inicialização, é tipicamente armazenado na ROM 1031. A RAM 1032 tipicamente contém dados e/ou módulos de programa que são imediatamente acessíveis a e/ou presentemente sendo operados pela unidade de processamento 1020. A título de exemplo, e não limitação, a Figura 1023 ilustra o sistema operacional 1034, programas de aplicativo 1035, outros módulos de programa 1036, e dados de programa 1037.
[000619] O computador 1010 também pode incluir outra mídia de armazenamento de computador removível/não removível, volátil/não volátil. A título de exemplo apenas, a Figura 10-23 ilustra uma unidade de disco rígido 1041 que lê a partir de mídia magnética não volátil e não removível ou grava na mesma, uma unidade de disco magnético 1051 que lê a partir de um disco magnético não volátil e removível 1052 ou grava no mesmo, e uma unidade de disco óptico 1055 que lê a partir de um disco óptico não volátil 1056 e removível ou grava no mesmo tal como um CD ROM ou outra mídia óptica. Outra mídia de armazenamento de computador removível/não removível, volátil/não volátil que pode ser usada no ambiente operacional exemplificativo inclui, porém sem limitação, cassetes de fita magnética, cartões de memória flash, discos digitais versáteis, fita de vídeo digital, RAM de estado sólido, ROM de estado sólido, e similares. A unidade de disco rígido 1041 é tipicamente conectada ao barramento de sistema 1021 através de uma interface de memória não removível tal como a interface 1040, e a unidade de disco magnético 1051 e a unidade de disco óptico 1055 são tipicamente conectadas ao barramento de sistema 1021 por uma interface de memória removível, tal como interface 1050.
[000620] As unidades e sua mídia de armazenamento de computador associada discutidas acima e ilustradas na Figura 10 fornecem armazenamento de instruções legíveis por computador, estruturas de dados, módulos de programa e outros dados para o computador 1010. Na Figura 10-23, por exemplo, a unidade de disco rígido 1041 é ilustrada como armazenando o sistema operacional 1044, programas de aplicativos 1045, outros módulos de programa 1046, e dados de programa 1047. Observe que esses componentes podem ou ser idênticos ao sistema operacional 1034, aos programas de aplicativo 1035, a outros módulos de programa 1036 e aos dados de programa 1037 ou diferentes dos mesmos. O sistema operacional 1044, os programas de aplicativo 1045, outros módulos de programa 1046 e os dados de programa 1047 recebem números diferentes aqui para ilustrar que, em um mínimo, os mesmos são cópias diferentes. Um usuário pode inserir comandos e informações no computador 1010 através de dispositivos de entrada tais como um teclado 1062 e dispositivo apontador 1061, comumente referido como um mouse, trackball ou teclado sensível ao toque. Outros dispositivos de entrada (não são mostrados) podem incluir um microfone, joystick, gamepad, antena parabólica, dispositivo de varredura, ou similares. Esses e outros dispositivos de entrega são frequentemente conectados à unidade de processamento 1020 através de uma interface de entrada de usuário 1060 que é acoplada ao barramento de sistema, porém pode ser conectada por outras estruturas de interface e barramento, tal como uma porta paralela, porta de jogo ou um barramento serial universal (USB). Um monitor 1091 ou outro tipo de dispositivo de exibição também é conectado ao barramento de sistema 1021 por meio de uma interface, tal como uma interface de vídeo 1090. Além do monitor, os computadores também podem incluir outros dispositivos de saída periféricos tais como alto-falantes 1097 e impressora 1096, que podem ser conectados através de uma interface periférica de saída1095.
[000621] O computador 1010 pode operar em um ambiente em rede com uso de conexões lógicas a um ou mais computadores remotos, tal como um computador remoto 1080. O computador remoto 1080 pode ser um computador pessoal, um servidor, um roteador, um PC de rede, um dispositivo par ou outro nó de rede comum, e tipicamente inclui muitos ou todos os elementos descritos acima em relação ao computador 1010, apesar de apenas um dispositivo de armazenamento de memória 1081 ter sido ilustrado na Figura 10-23. As conexões lógicas retratadas na Figura 10-23 incluem uma rede de área local (LAN) 1071 e uma rede de área ampla (WAN) 1073, porém também pode incluir outras redes. Tais ambientes em rede são comuns em escritórios, redes de computador ampla de empresa, intranets e a Internet.
[000622] Quando usado em um ambiente em rede de LAN, o computador 1010 é conectado à LAN 1071 através de uma interface de rede ou adaptador 1070. Quando usado em um ambiente em rede de WAN, o computador 1010 tipicamente inclui um modem 1072 ou outros meios para estabelecer comunicações na WAN 1073, tal como a Internet. O modem 1072, que pode ser interno ou externo, pode ser conectado ao barramento de sistema 1021 através da interface de entrada de usuário 1060, ou outros mecanismos apropriados. Em um ambiente em rede, os módulos de programa retratados em relação ao computador 1010, ou porções do mesmo, podem ser armazenados no dispositivo de armazenamento de memória remoto. A título de exemplo, e não limitação, a Figura 10-23 ilustra programas de aplicativo remotos 1085 como residindo em dispositivo de memória 1081. Deve-se observar que as conexões de rede mostradas são exemplificativas e outros meios de estabelecer uma ligação de comunicação entre os computadores podem ser usados.
IX. ETAPAS DE FABRICAÇÃO
[000623] O dispositivo integrado acima pode ser fabricado de qualquer maneira adequada. O que segue é uma descrição da fabricação de vários componentes do dispositivo integrado, que pode ser combinado de qualquer maneira com conjuntos de procedimentos conhecidos na técnica, para criar um dispositivo integrado adequado.
A. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE NANOPASSAGEM
[000624] Um poço de amostra (por exemplo, nanopassagem) pode ser fabricado de qualquer maneira adequada. Em algumas modalidades, um poço de amostra pode ser fabricado com uso de processos de fotolitografia padrão e conjuntos de procedimentos de gravação. Um poço de amostra pode ser formado em uma camada que tem um metal (por exemplo, Al, TiN) ou qualquer material adequado compatível com processamento de fotolitografia. A Figura 11-1 ilustra um método exemplificativo para fabricar um poço de amostra de um dispositivo integrado. A camada 11-112 forma um poço de amostra e pode incluir um metal tal como Al ou TiN. A camada 11-110 pode atuar como uma camada dielétrica e pode ser formada a partir de qualquer substrato dielétrico adequado, tal como SiO2 ou nitreto de silício. Uma etapa do método inclui depositar a camada 11-112 diretamente sobre o substrato 11-110. Em algumas modalidades, as camadas adicionais podem ser depositadas entre a camada 11-112 e a camada 11-110. A camada 11-112 pode ser depositada em qualquer espessura adequada, e em algumas modalidades, a espessura pode determinar a altura do poço de amostra resultante. A espessura da camada 11-112 pode ser aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm, ou aproximadamente 150 nm. Um revestimento de antirreflexo (ARC) 11122 é, então, depositado no topo da camada 11-112. Máscara de gravação 11-120 (por exemplo, máscara de gravação fotorresistente) é depositada em ARC 11-122. Os conjuntos de procedimentos convencionais são usados para padronizar um orifício na máscara de gravação 11-120 e ARC 11-122. O orifício padronizado pela máscara de gravação 11-120 pode ter um diâmetro de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm ou aproximadamente 150 nm. O padrão do orifício é, então, transferido para a camada subjacente 11-112 com uso de uma gravação, por exemplo, conjuntos de procedimentos de gravação de íon reativa, para formar o poço de amostra. Gravação pode parar na superfície da camada 11-110, ou gravação pode criar uma concavidade na camada 11-110 sob o orifício na camada 11-112. Conjuntos de procedimentos convencionais são usados para remover a máscara de gravação 11-120 e ARC 11-122 da camada 11-112. O poço de amostra pode ter um diâmetro de t aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm ou aproximadamente 150 nm.
[000625] Alternativamente, um poço de amostra pode ser fabricado com uso de processos de fotolitografia padrão e conjuntos de procedimentos de desprendimento. A Figura 11-2 ilustra um método exemplificativo de formação de um poço de amostra com uso de conjuntos de procedimentos de desprendimento. O poço de amostra é formado na camada 11-212, que pode incluir um metal (por exemplo, Al, Au, Cr). A camada 11-212 é formada sobre a camada de substrato 11-210, que pode incluir qualquer material adequado tal como como um dielétrico (por exemplo, SiO2). A deposição da camada 11-212 pode ocorrer separadamente a partir do processo fotolitográfico ou após o mesmo. A primeira etapa no processo de fabricação de desprendimento mostrado na Figura 11-2 pode envolver depositar revestimento de antirreflexo (ARC) 11-222 sobre o substrato 11-210 seguido por máscara de gravação fotorresistente 11-220 diretamente no topo do substrato 11-210. Conjuntos de procedimentos fotolitográficos convencionais são usados para padronizar o fotorresistente de modo que um pilar 11-230 de resistência seja deixado para trás. O pilar pode ter qualquer tamanho e formato adequado que possa corresponder a um poço de amostra resultante. O pilar pode ter um diâmetro de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm ou aproximadamente 150 nm. Tais conjuntos de procedimentos podem incluir dissolver a resistência e a camada de ARC ao redor do pilar fora do substrato. A etapa a seguir pode envolver depositar a camada 11212 diretamente no topo do pilar de resistência e do substrato, criando um pilar coberto. Em outras modalidades, as camadas adicionais podem ser depositadas antes ou após a deposição da camada 11-212. Como um exemplo não limitante, o TiN pode ser depositado sobre a camada 11-212 formada de Al, opcionalmente seguido por uma deposição de Al2O3. A camada 11-212 pode ser depositada em qualquer espessura adequada, e em algumas modalidades pode ter uma espessura de aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm ou aproximadamente 150 nm. Para formar o poço de amostra, o pilar coberto pode ser removido por um solvente no caso fotorresistente ser usado ou por gravação seletiva no caso de máscaras de gravação duras de dióxido de silício ou nitreto de silício serem usadas. O poço de amostra pode ter um diâmetro de t aproximadamente 50 nm, aproximadamente 100 nm ou aproximadamente 150 nm.
[000626] Alternativamente, um poço de amostra pode ser fabricado com uso de processos de fotolitografia padrão e um conjunto de procedimentos de desprendimento alternativo. A Figura 11-3 ilustra uma modalidade exemplificativa de formação de um poço de amostra de um dispositivo integrado. Uma camada de máscara de gravação dura 11314 é depositada sobre o substrato 11-310. A camada de máscara de gravação dura 11-314 pode incluir Ti ou qualquer outro material adequado. O substrato 11-310 pode incluir um dielétrico (por exemplo, SiO2) ou qualquer outro material adequado. Uma camada de ARC 11322 é, então, depositada sobre a camada de máscara de gravação dura 11-314 seguido por camada fotorresistente 11-320. Conjuntos de procedimentos fotolitográficos convencionais são usados para padronizar o fotorresistente de modo que um pilar 11-320 de resistência seja formado. Esse padrão de pilar fotorresistente é usado como uma máscara de gravação para gravação da camada de ARC 11-322 e da camada de máscara de gravação dura 11-314. A camada fotorresistente 11-320 e ARC 11-322 é, então, removida, e o pilar 11-330 da máscara de gravação dura é deixado para trás. Conjuntos de procedimentos convencionais podem ser usados para remover por dissolução o fotorresistente restante e a camada de ARC do pilar. A etapa a seguir pode envolver depositar a camada 11-312 diretamente no topo do pilar 11-330, criando um pilar coberto. Para formar o poço de amostra, o pilar coberto é removido por uma gravação de peróxido de hidrogênio, ou outra gravação adequada, que erode a camada 11-314, "desprende" a cobertura e resulta em um poço de amostra na camada 11-312.
[000627] Em algumas modalidades, o poço de amostra pode ser fabricado para atenuar a transmissão de plasmon através do poço de amostra de qualquer maneira adequada. Por exemplo, o poço de amostra pode ser fabricado em uma pilha de múltiplas camadas. A pilha de múltiplas camadas pode incluir, porém sem limitação, uma camada de metal depositada sobre um substrato, uma camada absorvente e/ou uma camada de superfície. A camada de superfície pode ser uma camada de passivação. A pilha de múltiplas camadas pode ser fabricada de qualquer maneira adequada. Conjuntos de procedimentos de padronização e gravação convencionais podem ser usados. Uma camada de metal pode ser depositada sobre um substrato. Alternativamente, uma camada absorvente pode ser depositada na camada de metal. Alternativamente, uma camada de passivação de superfície pode ser depositada sobre a pilha de camada de metal/camada absorvente. Uma camada fotorresistente e de antirreflexo pode ser depositada sobre a camada superior da pilha de múltiplas camadas. A camada fotorresistente pode ser padronizada com as dimensões do poço de amostra. A pilha de múltiplas camadas pode ser diretamente gravada para formar o poço de amostra.
[000628] As camadas absorventes podem incluir quaisquer materiais absorventes. Os exemplos não limitantes incluem nitreto de silício, TiN, aSi, TaN, Ge e/ou Cr. Variantes dos materiais citados também são possíveis, tal como Si3N4. A camada de metal e a camada de superfície podem ser feitas de qualquer material adequado. Por exemplo, Al, AlSi, ou AlCu pode ser usado para a camada de metal. A camada de superfície pode ser feita de Al ou Al2O3, por exemplo. O poço de amostra na pilha de múltiplas camadas pode ser fabricado com uso dos processos descritos acima.
[000629] Adicional e/ou alternativamente, uma camada refletiva pode ser depositada diretamente no topo do substrato antes de depositar a pilha de múltiplas camadas para controlar o foco do feixe de luz durante a fotolitografia. Uma camada refletiva pode ser depositada diretamente no topo do substrato e padronizada com as dimensões do poço de amostra. Opcionalmente, uma camada de revestimento de antirreflexo seguida por uma camada de fotorresistente pode ser depositada no topo da camada de revestimento refletiva padronizada e padronizada para deixar um pilar de ARC e fotorresistente em um local no substrato. Uma pilha de múltiplas camadas pode, então, ser depositada no topo do pilar, da camada refletiva e do substrato. O pilar coberto pode ser removido com uso de um processo de desprendimento, conforme descrito acima, formando um poço de amostra no local do substrato onde o pilar esteve.
[000630] De modo similar, um pilar de Ti pode ser usado para criar o poço de amostra. A primeira etapa pode envolver depositar uma camada de Ti no substrato, seguido por uma camada de revestimento de antirreflexo e uma camada de fotorresistente. A camada de Ti pode ser padronizada e gravada para formar um pilar de Ti. A pilha de múltiplas camadas pode ser depositada no topo do pilar de Ti e substrato. Finalmente, o pilar de Ti pode ser removido, formando um poço de amostra em um local do substrato que corresponde a onde o pilar de Ti esteve.
[000631] Qualquer método de deposição adequado pode ser usado. Por exemplo, PVD, CVD, pulverização catódica, ALD, deposição por feixe de elétron e/ou evaporação térmica podem ser usados para depositar uma ou mais camadas. O ambiente de deposição pode ser controlado para impedir a oxidação das camadas entre deposições. Por exemplo, o ambiente pode ser mantido em estado de vácuo alto. e/ou baixo oxigênio durante e entre deposições de uma ou mais camadas. B. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE GRADE CONCÊNTRICA (ALVO)
[000632] Uma grade concêntrica, ou alvo, pode ser fabricada de qualquer maneira adequada. Em algumas modalidades, uma grade concêntrica pode ser fabricada com uso de processos de fotolitografia padrão e conjuntos de procedimentos de gravação. Qualquer material dielétrico adequado, tal como SiO2 ou nitreto de silício, pode ser usado para formar a grade concêntrica. Na modalidade ilustrada na Figura 114, uma camada de SiO2 11-1010 é usada para produzir a grade concêntrica. A primeira etapa no processo de fabricação pode envolver depositar uma máscara de gravação dura 11-1014 diretamente no topo da camada de SiO2. A próxima etapa (ato 11-1001) no processo de fabricação pode envolver depositar uma camada fotorresistente 111020 diretamente no topo de uma camada de revestimento de antirreflexo 11-1022 na máscara de gravação dura. Conjuntos de procedimentos fotolitográficos convencionais são usados para criar (ato 11-1003 e ato 11-1005) o padrão de alvo na máscara de gravação dura. O padrão de alvo é, então, transferido (11-1007) para a camada de SiO2 subjacente com uso de gravação, por exemplo conjuntos de procedimentos de gravação de íon reativa para formar a grade concêntrica. A espessura da grade concêntrica pode ser qualquer espessura adequada. Na modalidade ilustrada na Figura 11-4, a profundidade de gravação é aproximadamente 80 nm. Conjuntos de procedimentos convencionais são usados para remover (ato 11-1009) os resíduos de máscara de gravação e resistência e limpar a superfície da grade concêntrica. A nanopassagem na camada 11-1012 pode ser fabricada (ato 11-1011) diretamente no topo da grade concêntrica com uso dos processos de desprendimento ou gravação. Em outras modalidades, outras camadas podem ser depositadas entre a grade concêntrica e a nanopassagem.
[000633] Alternativamente, em algumas modalidades, a nanopassagem pode ser posicionada de modo central à grade concêntrica. Esse alinhamento preciso da nanopassagem pode ser alcançado de qualquer maneira adequada. Na modalidade ilustrada na Figura 11-5, o posicionamento da nanopassagem é alcançado com uso de um processo de fabricação autoalinhado. A primeira etapa pode envolver formar a grade concêntrica de acordo com os conjuntos de procedimentos descritos acima. No entanto, na Figura 11-5, uma máscara de gravação dura de Ti 11-1114 é depositada (ato 11-1101) no topo do substrato de SiO2 11-1110. O padrão de alvo é transferido para a camada de Ti com uso de gravação, por exemplo gravação de íon reativa (ato 11-1103 e ato 11-1105). Uma camada de resistência 111120 e uma camada de revestimento de antirreflexo 11-1122 são depositadas sobre os dois vãos de centro na camada de Ti para cobrir os vãos e o pilar de Ti central. O padrão de alvo é, então, transferido para o substrato de SiO2 com uso de conjuntos de procedimentos de gravação convencionais para formar a grade concêntrica (ato 11-1107). A camada de Ti é, então, removida com uso de uma gravação úmida isotrópica (ato 11-1109), por exemplo, com uso de peróxido, porém deixando o pilar de Ti central 11-1116 no lugar. A camada de resistência é, então, removida com uso de conjuntos de procedimentos convencionais. A camada de nanopassagem de metal é, então, depositada (ato 11-1111) no topo da grade concêntrica e do pilar de Ti. Por último, o pilar de Ti coberto com metal é removido com uso de um processo de desprendimento que deixa uma nanopassagem precisamente centrada em relação à grade concêntrica.
[000634] O alinhamento preciso da nanopassagem pode ser alcançado de várias outras maneiras. Na modalidade ilustrada na Figura 11-6, o posicionamento da nanopassagem é alcançado com uso de um processo de fabricação autoalinhado alternativo. A primeira etapa (111201) pode envolver depositar a camada de nanopassagem de Al 111212 diretamente no topo do substrato de grade concêntrica de SiO2 111210. Uma máscara de gravação dura 11-1214 pode, então, ser depositada no topo da camada de Al. na modalidade ilustrada na Figura 11-6, Ti é usado, porém qualquer material compatível com processos fotolitográficos pode ser usado. O padrão de alvo é transferido (ato 111203 e 11-1205) para as camadas de Ti e Al com uso de conjuntos de procedimentos de gravação convencionais. Uma camada de resistência 11-1220 e uma camada de revestimento de antirreflexo 11-1222 são depositadas sobre o vão central nas camadas de Ti e Al para cobrir a posição onde a nanopassagem deve ser formada. O padrão de alvo é, então, transferido (ato 11-1207) para o substrato de SiO2 com uso de conjuntos de procedimentos de gravação convencionais para formar a grade concêntrica. Uma camada de metal adicional é depositada (ato 11-1209) no topo da primeira camada de Ti e Al de modo que o metal preencha as cavidades na camada de SiO2 e cubra a camada de Ti e a camada de resistência. Na modalidade ilustrada na Figura 11-6, Al é usado como a camada de metal adicional porém outros metais adequados compatíveis com processos fotolitográficos podem ser usados. Por último, o pilar de resistência coberto com metal 11-1230 é removido (ato 11-1211) com uso de um processo de desprendimento que deixa uma nanopassagem precisamente centrada em relação à grade concêntrica.
C. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE LENTE: LENTE REFRATIVA
[000635] Uma matriz de lentes refrativas pode ser criada de qualquer maneira adequada para aprimorar a eficiência de foco da excitação na nanopassagem e coleta de luz de emissão da mesma. Em algumas modalidades, uma matriz de lentes refrativas pode ser uma matriz "sem vão" para minimizar "zonas mortas" na matriz de lente. Na modalidade ilustrada na Figura 11-7, uma matriz de microlentes refrativas é mostrada sem vãos entre lentes individuais. Em algumas modalidades, fabricar uma matriz "sem vão" pode envolver duas etapas de gravação. Uma primeira etapa (ato 11-1801) pode estabelecer a profundidade da topografia de microlente. Uma segunda gravação (ato 11-1803) pode seguir a primeira gravação para eliminar os vãos planares entre as microlentes individuais de modo que uma lente pare na borda de onde outra lente começa. A soma da primeira e da segunda gravação define o comprimento focal. Na modalidade ilustrada na Figura 11-8, uma vista de topo de uma matriz de microlentes é mostrada após a primeira gravação HF (1), após a segunda gravação HF (2), após a matriz de microlentes ser revestida com um nitreto de silício de material de índice refrativo mais alto (3), e após o material de índice refrativo alto ser polido e planarizado (4).
[000636] Cada lente refrativa na matriz de lente refrativa pode ser fabricada de qualquer maneira adequada. Uma matriz de lentes refrativas exemplificativa é ilustrada na Figura 11-9 onde uma camada de nanopassagem 11-2007 é fabricada no topo de uma camada espaçadora transparente 11-2001, que é no topo de uma camada de lente dielétrica 11-2003, que é no topo de um substrato 11-2005. Em algumas modalidades, uma lente refrativa pode ser fabricada com uso de processos de fotolitografia padrão e conjuntos de procedimentos de gravação. Qualquer material dielétrico adequado, tal como SiO2 ou nitreto de silício, pode ser usado para formar a lente refrativa. Na modalidade ilustrada na Figura 11-10, nitreto de silício é usado para preencher a topografia de substrato de SiO2. A primeira etapa 11-2101 no processo de fabricação pode envolver depositar uma máscara de gravação dura diretamente no topo de um substrato de SiO2 11-2110. Qualquer metal adequado pode ser usado para a máscara de gravação dura 11-2114 que não dissolve durante o mesmo processo de gravação usado para a camada de SiO2. Por exemplo, Cr é usado na Figura 1110, porém outros metais são possíveis. A próxima etapa pode envolver aplicar uma camada fotorresistente 11-2120 no topo da máscara de gravação dura de Cr. Conjuntos de procedimentos fotolitográficos convencionais são usados para criar um padrão circular na máscara de gravação dura. O padrão circular é transferido, então, para a camada subjacente de Cr com uso de conjuntos de procedimentos de gravação convencionais, tais como conjuntos de procedimentos de gravação de íon reativa, por exemplo. A camada de SiO2 é gravada com uso de qualquer conjunto de procedimentos de gravação seletivo adequado que possa gravar o SiO2 porém não a máscara de gravação dura. Por exemplo, uma gravação úmida isotrópica com uso de HF é usada para criar uma superfície côncava na camada de SiO2. A camada de Cr é, então, removida, com uso de conjuntos de procedimentos de gravação convencionais. Opcionalmente, uma segunda gravação úmida com uso de HF é realizada para eliminar os vãos entre lentes. Para criar a lente refrativa, a cavidade na camada de SiO2 é preenchida com uma camada de material de índice refrativo alto 11-2118, tal como nitreto de silício. Finalmente, a superfície de topo da lente é planarizada com conjuntos de procedimentos convencionais, tal como polimento mecânico químico, por exemplo. Uma camada espaçadora 11-2124 pode ser depositada no topo da camada de nitreto de silício. Por exemplo, uma camada espaçadora feita de ORMOCERTM pode ser revestida por fiação contínua no topo da camada de nitreto de silício. Alternativamente, uma camada de SiO2 pode ser depositada. A nanopassagem pode ser fabricada diretamente no topo da lente refrativa. Em outras modalidades, outras camadas podem ser depositadas entre a lente refrativa e a nanopassagem.
[000637] Alternativamente, cada lente refrativa pode incluir uma camada de antirreflexo para aprimorar adicionalmente a eficiência óptica. Em algumas modalidades, uma camada de antirreflexo pode revestir um fundo, um topo ou todos os lados de uma lente. Primeiramente, uma cavidade de SiO2 11-2210 é gravada (ato 11-2201) em uma camada de SiO2. Na modalidade ilustrada na Figura 11-11, uma camada de antirreflexo 11-2222 é depositada (ato 11-2203) na cavidade de SiO2 gravada 11-2210 antes de a cavidade ser preenchida (ato 112205) com uma camada de nitreto de silício 11-2218. A camada de nitreto de silício é polida (ato 11-2207) por meio de CMP e uma segunda camada de antirreflexo 11-2226 é depositada (ato 11-2209) no topo da camada de nitreto de silício polida. As camadas adicionais podem ser depositadas no topo da camada de antirreflexo, tal como a camada espaçadora descrita acima e mostrada como a camada 11-2224 na Figura11-11. As camadas de antirreflexo podem ter os seguintes parâmetros: índice de refração, nC = sqrt(nóxido, nnitreto)= sqrt(1,46*1,91) =1,67; faixa de índice refrativo de 1,67 a 1,75; e, espessura t = À/(4*nc) = 675 nm/(1,670*4) =101,1 nm. A camada de antirreflexo pode ser depositada de qualquer maneira adequada. Por exemplo, PECVD pode ser usado. Alternativamente, LPCVD pode ser usado.
D. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DE LENTE: LENTE DE FRESNEL
[000638] Um elemento óptico difrativo (DOE) pode ter qualquer formato adequado e pode ser fabricado de qualquer maneira para aprimorar o foco de luminescência nos sensores de CMOS e a classificação dos fótons de luminescência. Em algumas modalidades, o DOE pode incluir uma seção de uma lente de Fresnel. Conforme ilustrado in as Figuras 11-12 a 11-19, o DOE 11-2301 é distinguido como um deslocamento de seção quadrada do centro de uma lente de Fresnel. Conforme ilustrado na Figura 11-13, o DOE pode compreender duas camadas de célula unitária onde a primeira camada 11-2401 contém "pequenos" recursos e a segunda camada 11-2403 contém "grandes" recursos. As camadas de célula unitária podem ter qualquer afastamento adequado, e podem ter adicionalmente afastamento variável de acordo com o design óptico da lente de Fresnel. Conforme ilustrado no exemplo na Figura 11-13, a camada de DOE pequeno tem um afastamento de 220 nm e a camada de DOE grande tem um afastamento de 440 nm. A camada de DOE grande pode ser sobreposta na camada de DOE pequeno (ou vice-versa) para criar uma óptica difrativa de múltiplos níveis. A Figura 11-13 ilustra um exemplo de uma matriz de Fresnel deslocada 11-2405 onde marcadores fiduciais grandes circundam a lente de Fresnel deslocada. Adicionalmente, a matriz de Fresnel deslocada pode ser posicionada no topo do sensor para fornecer separação espectral e foco de luminescência no sensor.
[000639] Alternativamente, um elemento óptico difrativo (DOE) pode ser embutido sob a nanopassagem para melhorar a focalização da energia de excitação na e a coleta de luminescência da nanopassagem. Em algumas modalidades, a lente de Fresnel embutida posicionada sob a nanopassagem e a lente de Fresnel deslocada posicionada sobre o sensor podem ter uma estrutura escalonada com um período variável e tamanho de degrau variável. Em outras modalidades, apenas a lente de Fresnel deslocada posicionada sobre o sensor pode ter um período variável e tamanho de degrau variável. Essas lentes difrativas podem ser fabricadas com o uso de processos de fotolitografia padrões e conjuntos de procedimentos de gravação. Conforme ilustrado na Figura 11-14, a estampa de lente difrativa 11-2501 é caracterizada como tendo uma estrutura em fases que compreende degraus grandes (estampa grande) e degraus pequenos (estampa pequena) em cada degrau maior, em que ambos têm um período decrescente quando visualizados da esquerda para a direita. O processo de fabricação para a lente difrativa escalonada de período variável pode envolver a gravação os degraus grandes primeiro, seguido por gravação os degraus pequenos, conforme ilustrado na Figura 11-16, que podem proteger os cantos dos degraus grandes durante a segunda gravação. Uma abordagem alternativa é gravar os degraus pequenos primeiro em um substrato plano, seguido pela gravação dos degraus grandes, conforme ilustrado na Figura 11-15. Qualquer material dielétrico adequado, tal como SiO2 ou nitreto de silício, TiO2 ou Ta2O5, pode ser usado para formar a camada de preenchimento para a lente difrativa e a camada escalonada. Na modalidade ilustrada na Figura 11-15, nitreto de silício é usado para fazer a camada de preenchimento e SiO2 é usado para fazer a camada escalonada.
[000640] A primeira etapa no processo de fabricação da camada de SiO2 escalonada pode envolver depositar uma máscara de gravação dura 11-2614 diretamente na parte superior de uma camada de SiO2 112610 seguida por uma camada antirreflexão 11-2622 seguida por uma camada fotorresistente 11-2620. Qualquer material adequado pode ser usado para a máscara de gravação dura. Por exemplo, a-Si pode ser usado para a máscara de gravação dura mostrada na Figura 11-15, mas outros materiais são possíveis. A próxima etapa pode envolver a aplicação de um ARC e/ou uma camada fotorresistente na parte superior da máscara de gravação dura de a-Si. Conjuntos de procedimentos fotolitográficos convencionais podem ser usados para criar a estampa binária grande de período variável. As estampas são transferidas para a camada de Si subjacente com o uso de conjuntos de procedimentos convencionais de gravação, tais como conjuntos de procedimentos de gravação com íon reativo, por exemplo.
[000641] A profundidade de gravação de um degrau grande de lente difrativa pode ser qualquer profundidade adequada que atinja o comprimento focal desejado. Na modalidade ilustrada na Figura 11-16, essa profundidade de gravação na camada de SiO2 é aproximadamente 684 nm para o degrau grande. Conjuntos de procedimentos convencionais são, então, usados para decapar (ação 11-2605) os resíduos de resistente e de máscara de gravação e limpar a superfície da camada de SiO2. A próxima etapa pode envolver gravar os degraus pequenos em cada degrau grande. Na modalidade ilustrada na Figura 11-16, cada um dos degraus grandes compreende quatro degraus menores.
[000642] Uma segunda máscara de gravação dura de Si 11-2644 é, então, depositada na camada de SiO2 padronizada 1-2610. Uma camada ARC 11-2642 é, então, depositada na parte superior da camada de Si 11-2610 seguida por uma camada de máscara de gravação fotorresistente 11-2640. O segundo binário padrão pequeno de período variável é transferido ao fotorresistente e/ou a camada de ARC. Na modalidade ilustrada na Figura 11-16, as etapas de fabricação são similares às descritas na Figura 11-15, no entanto, dois degraus pequenos são gravados por degrau grande deixando um total de quatro degraus. Em outras modalidades, qualquer número de etapas pode ser usado. Os degraus pequenos são, então, gravados na camada de SiO2 11-2710. A espessura de um degrau pequeno de lente difrativa pode ser qualquer espessura adequada. Na modalidade ilustrada na Figura 1116, essa profundidade de gravação na camada de SiO2 é aproximadamente 342 nm para o degrau grande. Conjuntos de procedimentos convencionais são, então, usados para decapar a resistência e limpar a superfície da camada de SiO2.
[000643] Os estágios adicionais no processo de fabricação após a criação da camada de SiO2 em fases 11-2810 pode envolver o preenchimento das cavidades com qualquer material de lente de índice alto adequado 11-2818, como nitreto de silício, por exemplo, para criar uma "lente de Fresnel incorporada", conforme ilustrado nas Figuras 11- 17 a 11-18. A estrutura em fases usada para a "lente de Fresnel incorporada" pode ter recursos de aproximadamente o mesmo tamanho e/ou recursos de tamanho menor do que a estrutura em fases usada para a lente de Fresnel deslocada. Qualquer método de depósito de nitreto de silício pode ser usado como PECVD, por exemplo. Opcionalmente, a camada de nitreto de silício pode ser polida de modo uniforme até o nível superior do material SiO2 ser exposto. Alternativamente, a camada de nitreto de silício 11-2818 é polida de modo uniforme, porém o material de SiO2 não é exposto. Em uma modalidade ilustrada na Figura 11-18, uma segunda camada 11-2928 de SiO2 é, então, depositada por meio de PECVD sobre a camada de nitreto de silício polida 11-2918 e polida por meio de CMP. Em algumas modalidades, a camada de espaçador 11-2928 pode ter uma espessura igual ao comprimento focal naquele material de camada de espaçador. Adicionalmente, outras camadas de espaçador transparentes adequadas podem ser depositadas sobre a camada de nitreto de silício. Uma camada de nanopassagem pode, então, ser fabricada sobre a camada de espaçador transparente e/ou camadas adicionais.
[000644] Alternativamente, em uma modalidade ilustrada na Figura 11-19, a camada em fases 11-3018 para a lente difrativa é produzir a partir de nitreto de silício. A camada de nitreto de silício 11-3018 pode ser depositada em qualquer espessura adequada sobre o substrato 113010 seguido pela máscara de gravação 11-3014, camada de ARC 113022 e camada fotorresistente 11-3020. Em uma modalidade ilustrada na Figura 11-19, a camada de nitreto de silício tem aproximadamente 1 um de espessura. Os processos de fabricação podem ser semelhantes àquele descrito acima em relação à criação da camada de lente difrativa de período variável em fases em SiO2. Opcionalmente, uma máscara rígida diferente pode ser usada para criar a camada em fases de nitreto de silício. A camada em fases de nitreto de silício pode ter recursos de aproximadamente o mesmo tamanho e/ou recursos de tamanho menor que a camada em fases de SiO2. Após a camada em fases de nitreto de silício ser produzida, a camada de nitreto de silício camada pode ser revestida em qualquer material dielétrico adequado 11-3028. Em uma modalidade ilustrada em uma Figura 11-19, o nitreto de silício camada é revestido com a camada de SiO2 11-3028. A camada de SiO2 pode ser depositada com o uso de processos de deposição convencionais como PECVD, por exemplo. A camada de SiO2 pode, então, ser polida para criar uma superfície plana achatada. Uma camada de nanopassagem pode, então, ser fabricada sobre a camada de SiO2 e/ou camadas adicionais.
[000645] Determinados recursos da óptica difrativa exigem um determinado grau de uniformidade e/ou precisão durante o processo de fabricação para proporcionar uma estrutura com as propriedades ópticas desejadas. Por exemplo, a profundidade de gravação dos níveis grandes e pequenos pode exigir um determinado grau de precisão. Em algumas modalidades, uma profundidade de gravação dentro de 50 ou 10% da meta pode ser necessária para alcançar a eficácia de potência desejada na nanopassagem de ponto focal. Adicionalmente, a gravação dos recursos de lente pode exigir um determinado grau de uniformidade. Por exemplo, uniformidade de gravação dentro de 5% (ou 50 nm) é necessária para alcançar o comprimento focal desejado.
[000646] Qualquer uma das lentes descritas acima pode ser fabricada com o uso de quaisquer processos de gravação e deposição adequados para criar propriedades ópticas aprimoradas. A título de exemplo e não limitação, PECVD pode ser usado. Os parâmetros de deposição podem ser ajustados de qualquer maneira adequada para reduzir autoluminescência, reduzir absorção de lente de luminescência e/ou criar um índice alto de refração. Por exemplo, uma autoluminescência e absorção de lente reduzidas podem ser alcançadas reduzindo-se a densidade de ligações Si-Si, que podem formar nanocristais de silício, durante a deposição de nitreto de silício. Em algumas modalidades, os gases de entrada e suas razões podem ser modificados para reduzir a densidade de ligações Si-Si e nanocristais de silício. Por exemplo, SiH4 e N2 podem ser usados e suas razões ajustadas de qualquer maneira adequada para reduzir a densidade de nanocristais de Si. Em outras modalidades, SiH4 e NH3 podem ser usados e suas razões ajustadas de qualquer maneira adequada para reduzir a densidade de ligações Si-Si e nanocristais de silício. Por exemplo, a razão de NH3 para SiH4 pode ser pelo menos 10:1. Adicionalmente, ajustar as frequências que controlam o plasma durante PECVD pode ser usado para melhorar propriedades ópticas. Por exemplo, a razão de frequência baixa (por exemplo, abaixo de 0,5 MHz) para frequência alta (por exemplo, acima de 10 MHz) pode ser pelo menos 1:1.
[000647] Adicionalmente, os parâmetros de deposição descritos acima podem ajustar o índice de lente de refração para melhorar as propriedades ópticas. Em algumas modalidades, o índice de refração para um nitreto de silício lente pode ser menor que n=1,92 e associado a um comprimento de onda de 633 nm para um efeito de autoluminescência baixo adequado e/ou um perda de absorção baixa adequada. As qualidades ajustadas descritas acima podem ser relacionadas, proporcionais, correlacionas, associadas e/ou dependentes umas das outras. Por exemplo, um índice de refração de n=1,92 é indicativo de uma luminescência baixa e perda de absorção baixa que está relacionada a uma densidade baixa de ligações Si-Si e nanocristais de silício para uma lente produzida a partir de nitreto de silício.
X. CONCLUSÃO
[000648] Desse modo, tendo descrito diversos aspectos de pelo menos uma modalidade desta invenção, deve ser verificado que diversas alterações, modificações e melhoramentos irão prontamente ocorrer para aqueles versados na técnica.
[000649] Tais alterações, modificações e melhoramentos se destinam a ser parte desta descrição e se destinam a estar dentro do espírito e do escopo da invenção. Adicionalmente, embora as vantagens da presente invenção sejam indicadas, deve ser verificado que nem toda modalidade da invenção irá incluir cada vantagem descrita. Algumas modalidades podem não implantar quaisquer recursos descritos como vantajosos no presente documento e em alguns casos. Consequentemente, a descrição anterior e os desenhos são apenas a título de exemplificação.
[000650] As modalidades descritas acima da presente invenção podem ser implantadas em qualquer uma das diversas maneiras. Por exemplo, as modalidades podem ser implantadas com o uso de hardware, software ou uma combinação dos mesmos. Quando implantado em software, o código de software pode ser executado em qualquer processador ou coleta adequados de processadores, se fornecidos em um único computador ou distribuídos dentre múltiplos computadores. Tais processadores podem ser implantados como circuitos integrados, com um ou mais processadores em um componente de circuito integrado, incluindo componente de circuito integrado comercialmente disponível conhecido na técnica por nomes como chips de CPU, chips de GPU, microprocessador, microcontrolador ou coprocessador. Alternativamente, um processor pode ser implantado em conjunto de circuitos dedicados, como um ASIC ou semiconjunto de circuitos dedicado que resulta da configuração de um dispositivo lógico programável. Ainda como uma alternativa adicional, um processor pode ser uma porção de um dispositivo de circuito ou semicondutor maior, se comercialmente disponível, semidedicados ou dedicados. Como um exemplo específico, alguns microprocessadores comercialmente disponíveis têm múltiplos núcleos de modo que um núcleo ou um subconjunto desses núcleos possam constituir um processor. Não obstante, um processor pode ser implantado com o uso de conjunto de circuitos em qualquer formato adequado.
[000651] Adicionalmente, deve ser notado que um computador pode ser incorporado em qualquer número de formas, como um computador montado em rack, um computador do tipo desktop, um computador do tipo laptop, ou um computador do tipo tablet. Adicionalmente, um computador pode ser incorporado em um dispositivo não geralmente considerado como um computador, mas com capacidades de processamento adequadas, incluindo um Assistente Digital Pessoal (PDA), um telefone inteligente ou qualquer outro dispositivo eletrônico portátil ou fixado adequado.
[000652] Adicionalmente, um computador pode ter um ou mais dispositivos de entrada e de saída. Esses dispositivos podem ser usados, entre outras coisas, para apresentar uma interface de usuário. Os exemplos de dispositivos de saída que podem ser usados para fornecer uma interface de usuário incluem impressoras ou telas de exibição para apresentação visual de saída e alto-falantes ou outros dispositivos de geração de som para apresentação audível de saída. Exemplos de dispositivos de entrada que podem ser usados para uma interface de usuário incluem teclados, e dispositivos indicadores, como mouses, teclados sensíveis ao toque, e tablets digitais. Como outro exemplo, um computador pode receber informações de entrada através de reconhecimento por fala ou em outro formato audível.
[000653] Tais computadores podem ser interconectados por uma ou mais redes em qualquer forma adequada, incluindo como uma rede de área local ou uma rede de área ampla, como uma rede de empresa ou a Internet. Tais redes podem ter base em qualquer tecnologia adequada e podem operar de acordo com qualquer protocolo adequado e podem incluir redes sem fio, redes com fio ou redes de fibra óptica.
[000654] Adicionalmente, os vários métodos ou processos destacados no presente documento podem ser convertidos em código como software que é executável em um ou mais processadores que empregam qualquer um dentre uma variedade de sistemas ou plataformas de operação. Adicionalmente, tal software pode ser gravado com uso de qualquer um dentre várias linguagens de programação adequada e/ou ferramentas de programação ou de script, e também pode ser compilado como código de linguagem de máquina executável ou código intermediário que é executado em uma estrutura ou máquina virtual.
[000655] Nesse aspecto, a invenção pode ser incorporada como um meio legível por computador (ou múltiplos meios legíveis por computador) (por exemplo, uma memória de computador, um ou mais disquetes, discos compactos (CD), discos ópticos, discos de vídeo digital (DVD), fitas magnéticas, memórias flash, configurações de circuito em Matriz de Porta Programável em campo ou outros dispositivos semicondutores, ou outro meio de armazenamento de computador tangível) codificado com um ou mais programas que, quando executados em um ou mais computadores ou outros processadores, realizam métodos que implantam as várias modalidades da invenção discutida acima. Conforme é notado a partir dos exemplos supracitados, um meio de armazenamento legível por computador pode reter informações durante um tempo suficiente para fornecer instruções executáveis por computador em uma forma não transitória. Tal meio ou meios de armazenamento legível por computador podem ser transportáveis, de modo que o programa ou programas armazenados nos mesmos possam ser carregados em um ou mais computadores diferentes ou outros processadores para implantar vários aspectos da presente invenção, conforme discutido acima. Conforme usado no presente documento, o termo "meio de armazenamento legível por computador" abrange apenas um meio legível por computador que pode ser considerado como uma manufatura (isto é, artigo de manufatura) ou uma máquina. Alternativa ou adicionalmente, a invenção pode ser incorporada como um meio legível por computador diferente de um meio de armazenamento legível por computador, como um sinal de propagação.
[000656] Os termos "programa" ou "software" são usados no presente documento em um sentido genérico para se referir a qualquer tipo de código de computador ou conjunto de instruções executáveis por computador que podem ser empregados para programar um computador ou outro processador para implantar vários aspectos da presente invenção, conforme discutido acima. Adicionalmente, deve-se observar que, de acordo com um aspecto dessa modalidade, um ou mais programas de computador que, quando executados realizam métodos da presente invenção, não precisam residir em um único computador ou processador, mas podem ser distribuídos de uma maneira modular entre inúmeros computadores ou processadores diferentes para implantar vários aspectos da presente invenção.
[000657] As instruções executáveis por computador podem estar em muitas formas, como módulos de programa, executados por um ou more computadores ou outros dispositivos. Em geral, os módulos de programa incluem rotinas, programas, objetos, componentes, estruturas de dados, etc. que realizam tarefas específicas ou implantam tipos de dados abstratos específicos. Tipicamente, a funcionalidade dos módulos de programa pode ser combinada ou distribuída conforme desejado em várias modalidades.
[000658] Também, as estruturas de dados podem ser armazenadas em mídia legível por computador de qualquer forma adequada. Por questão de simplicidade de ilustração, as estruturas de dados podem ser mostradas para ter campos que se relacionam através do local na estrutura de dados. Tais relações podem ser, igualmente, obtidas atribuindo-se o armazenamento para os campos com locais em um meio legível por computador que conduz a relação entre os campos. No entanto, qualquer mecanismo adequado pode ser usado para estabelecer uma relação entre as informações em campos de uma estrutura de dados, incluindo através do uso de apontadores, etiquetas ou outros mecanismos que estabelecem a relação entre os elementos de dados.
[000659] Vários aspectos da presente invenção podem ser usados por si só ou em combinação, ou em uma variedade de disposições não especificamente discutidas nas modalidades descritas no que foi anteriormente mencionado e, portanto, não se limita a sua aplicação aos detalhes e à disposição dos componentes estabelecidos na descrição anterior ou ilustrada nos desenhos. Por exemplo, os aspectos descritos em uma modalidade podem ser combinados de qualquer maneira com os aspectos descritos em outras modalidades.
[000660] Também, uma invenção pode ser incorporada como um método, do qual um exemplo foi fornecido. As ações realizadas como parte do método podem ser ordenadas de qualquer modo adequado. Dessa maneira, as modalidades podem ser construídas, nas quais as ações são realizadas em uma ordem diferente daquela ilustrada, que pode incluir realizar algumas ações simultaneamente, muito embora sejam mostradas como ações sequenciais nas modalidades ilustrativas.
[000661] O uso de termos ordinais como "primeiro", "segundo", "terceiro" etc., nas reivindicações para modificar um elemento da reivindicação não conota, por si só, qualquer prioridade, precedência ou ordem de um elemento da reivindicação sobre um outro ou a ordem temporal na qual as ações de um método são realizadas, mas são usados meramente como indicadores para distinguir um elemento da reivindicação que tem um determinado nome de um outro elemento que tem um nome igual (mas, para uso do termo ordinal) para distinguir os elementos da reivindicação.
[000662] Também, a fraseologia e terminologia no presente documento são para o propósito de descrição e não devem ser entendidos como limitantes. O uso de "incluindo", "compreendendo" ou "tendo", "contendo", "envolvendo" e variações dos mesmos no presente documento é destinado a abranger os itens listados, daí em diante, e os equivalentes dos mesmos, assim como os itens adicionais.

Claims (36)

1. Instrumento (2-120) configurado para fazer interface com um chip de teste (2-110) que compreende uma pluralidade de cavidades de amostra (2-211), em que cada cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2-211) é configurada para receber uma amostra, o instrumento (2-120) caracterizado pelo fato de que compreende: pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada configurada para emitir energia de excitação que excita a amostra; uma pluralidade de sensores (2-122), sendo que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) corresponde a uma cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2211), em que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) é configurado para detectar a energia de emissão da amostra em uma respectiva cavidade de amostra, em que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) tem capacidade para detectar o tempo de detecção da energia de emissão e configurado para gerar pelo menos um sinal agregando em pelo menos dois recipientes, portadores de carga produzidos por fótons incidentes; e pelo menos um elemento óptico configurado para direcionar a energia de emissão de cada cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2-211) em direção a um respectivo sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122).
2. Instrumento (2-120) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: um alojamento óptico (2-401) que possui uma abertura; e pelo menos um componente configurado para posicionar mecanicamente o chip de teste (2-110) em uma superfície fora do alojamento óptico (2-401) e para sobrepor com a abertura quando o chip de teste (2-110) faz interface com o instrumento (2-120).
3. Instrumento (2-120) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma fonte de luz de excitação é configurada para emitir energia de excitação através da abertura do alojamento óptico (2-401).
4. Instrumento (2-120) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente é posicionado na superfície fora do alojamento óptico (2-401).
5. Instrumento (2-120) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente inclui uma pluralidade de componentes posicionados ao redor da abertura.
6. Instrumento (2-120) de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um componente inclui pelo menos um componente magnético, pelo menos um componente carregado por mola, e/ou pelo menos um componente pneumático.
7. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: um espelho policroico (2-230) configurado para refletir luz de excitação da pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada em direção ao chip de teste (2-110) e transmitir a energia de emissão da pluralidade de cavidades de amostra (2-211) em direção à pluralidade de sensores (2-122).
8. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um elemento óptico compreende uma lente de relé.
9. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada compreende uma pluralidade de fontes de luz, sendo que cada fonte de luz dentre a pluralidade de fontes de luz emite luz de excitação em um ou mais dentre uma pluralidade de comprimentos de onda.
10. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um combinador de comprimento de onda (6-403) para sobrepor espacialmente a luz de excitação emitida de cada uma dentre a pluralidade de fontes de luz.
11. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um filtro espectral configurado para transmitir a energia de emissão e absorver e/ou refletir energia de excitação da pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada.
12. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos um elemento de classificação espectral (2-243) para separar espacialmente a energia de emissão de um primeiro comprimento de onda da energia de emissão de um segundo comprimento de onda.
13. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um elemento de classificação espectral (2-243) compreende um elemento óptico difrativo.
14. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o elemento óptico difrativo tanto dispersa de modo cromático a energia de emissão quanto focaliza a energia de emissão.
15. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o elemento óptico difrativo compreende uma lente Fresnel (10-500) de compensação.
16. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um elemento de classificação espectral (2-243) é um elemento de filtração de luz.
17. Instrumento (2-120), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda um sistema de controle que é programado para (i) direcionar a luz de excitação à pluralidade de cavidades de amostra (2-211), (ii) detectar sinais da pluralidade de sensores (2-122) associados com a pluralidade de cavidades de amostra (2-211), e (iii) usar uma distribuição de tempo dos sinais para identificar a amostra ou subunidade da mesma.
18. Aparelho (2-100) caracterizado pelo fato de que compreende: um chip de teste (2-110) que compreende uma pluralidade de pixels, sendo que cada um dentre a pluralidade de pixels compreende: uma cavidade de amostra configurada para receber uma amostra, que, quando excitada, emite energia de emissão; e pelo menos um elemento para direcionar a energia de emissão em uma direção particular, em que o pelo menos um elemento é selecionado dentre o grupo que consiste em um elemento refrativo, um elemento difrativo, um elemento plasmônico e um ressonador; e uma trajetória de luz ao longo da qual a energia de emissão se desloca da cavidade de amostra em direção a um sensor; e um instrumento (2-120) configurado para fazer interface com o chip de teste (2-110), sendo que o instrumento (2-120) compreende: pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada configurada para emitir energia de excitação que excita a amostra em cada cavidade de amostra; uma pluralidade de sensores (2-122), sendo que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) corresponde a uma respectiva cavidade de amostra, em que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) é configurado para detectar a energia de emissão da amostra na respectiva cavidade de amostra, em que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) tem capacidade para detectar o tempo de detecção da energia de emissão e configurado para gerar pelo menos um sinal agregando em pelo menos dois recipientes, portadores de carga produzidos por fótons incidentes; e pelo menos um elemento óptico configurado para direcionar a energia de emissão de cada cavidade de amostra em direção a um respectivo sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122).
19. Aparelho (2-100) de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o instrumento (2-120) compreende ainda: um alojamento óptico (2-401) que tem uma abertura; e pelo menos um componente de alinhamento configurado para posicionar mecanicamente o chip de teste (2-110) no exterior do alojamento óptico (2-401) para sobrepor a abertura quando o chip de teste (2-110) faz interface com o instrumento (2-120).
20. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o chip de teste (2-110) é configurado para ser conectado ao instrumento (2-120) e removido do mesmo.
21. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que, quando o chip de teste (2-110) é conectado ao instrumento (2-120), uma distância óptica entre uma cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2211) e seu sensor correspondente dentre a pluralidade de sensores (2122) é menor do que 30 cm.
22. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que, quando o chip de teste (2-110) é conectado ao instrumento (2-120), uma distância óptica entre uma cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2211) e seu sensor correspondente dentre a pluralidade de sensores (2122) é menor do que 5 cm.
23. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que, quando o chip de teste (2-110) é conectado ao instrumento (2-120), uma distância óptica entre uma cavidade de amostra dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2211) e seu sensor correspondente dentre a pluralidade de sensores (2122) é menor do que 1 cm.
24. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: a amostra compreende uma etiqueta luminescente que emite energia de emissão dentro de uma banda de comprimento de onda de uma pluralidade de bandas de comprimento de onda; e cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) compreende um subsensor configurado para detectar a energia de emissão em cada uma dentre a pluralidade de bandas de comprimento de onda.
25. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) compreende pelo menos dois subsensores.
26. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que cada sensor dentre a pluralidade de sensores (2-122) compreende pelo menos quatro subsensores.
27. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o instrumento (2-120) compreende ainda pelo menos um elemento dependente de comprimento de onda configurado para direcionar a energia de emissão de uma primeira banda de comprimento de onda em direção a um primeiro subsensor dos pelo menos dois subsensores e direciona a energia de emissão de uma segunda banda de comprimento de onda em direção a um segundo subsensor dos pelo menos dois subsensores.
28. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um elemento dependente de comprimento de onda é um elemento óptico difrativo.
29. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um elemento dependente de comprimento de onda é um filtro espectral.
30. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que a amostra compreende uma etiqueta luminescente com um tempo de vida que é diferente de um tempo de vida de pelo menos uma outra etiqueta luminescente de outra amostra.
31. Aparelho (2-100), de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que: uma primeira etiqueta luminescente associada a uma primeira amostra é excitada por luz de um primeiro comprimento de onda, mas não é excitada por luz de um segundo comprimento de onda; e uma segunda etiqueta luminescente associada a uma segunda amostra é excitada pela luz do segundo comprimento de onda, mas não é excitada pela luz do primeiro comprimento de onda.
32. Método de análise de um espécime, sendo que o método é caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer o espécime sobre uma superfície de topo de um chip de teste (2-110) que compreende uma pluralidade de cavidades de amostra (2-211); alinhar o chip de teste (2-110) com um instrumento (2-120) que compreende pelo menos uma fonte de luz de excitação e pelo menos um sensor; excitar uma amostra do espécime em pelo menos uma dentre a pluralidade de cavidades de amostra (2-211) com luz de excitação pulsada a partir da pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada; e detectar, com o pelo menos um sensor, a energia de emissão gerada pela amostra na pelo menos uma cavidade de amostra em resposta à excitação pela luz de excitação pulsada, em que cada um dentre o pelo menos um sensor tem capacidade para determinar o tempo de vida da energia de emissão gerado pela amostra e configurado para gerar pelo menos um sinal agregando em pelo menos dois recipientes, portadores de carga produzidos por fótons incidentes.
33. Método para sequenciar uma molécula-alvo de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um chip adjacente a um instrumento (2-120) que inclui uma fonte de excitação (2-121) pulsada e um sensor com capacidade para detectar pelo menos uma propriedade temporal de luz e configurado para gerar pelo menos um sinal agregando em pelo menos dois recipientes, portadores de carga produzidos por fótons incidentes, em que o dito chip inclui pelo menos uma cavidade que é acoplada de modo operativo à dita fonte de excitação (2-121) e ao dito sensor quando o dito chip está em uma posição de captação do dito instrumento (2-120), e em que a dita cavidade contém a dita molécula- alvo de ácido nucleico, uma enzima de polimerização e uma pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo; (b) com o dito chip na dita posição de captação, realizar uma reação de extensão em um local de preparação da dita molécula-alvo de ácido nucleico na presença da dita enzima de polimerização para incorporar sequencialmente os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo em um filamento crescente que é complementar à dita molécula-alvo de ácido nucleico, em que, mediante incorporação e excitação por energia de excitação da dita fonte de excitação (2-121), os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeos emitem sinais na dita cavidade; (c) usar o dito sensor para detectar padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais que são distinguíveis pela dita pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo; e (d) identificar os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo com base nos ditos padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais, sequenciando, assim, a dita molécula-alvo de ácido nucleico.
34. Método para sequenciamento de ácido nucleico caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer um chip adjacente a um instrumento (2-120), em que o dito chip inclui uma pluralidade de cavidades que são, cada uma, acopladas de modo operativo a (i) uma fonte de excitação (2-121) pulsada e (ii) um sensor do dito instrumento (2-120) quando o dito chip está em uma posição de captação do dito instrumento (2-120), e em que uma cavidade individual da dita pluralidade contém a dita molécula-alvo de ácido nucleico, uma enzima de polimerização e uma pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo; (b) com o dito chip na dita posição de captação, submeter a dita molécula-alvo de ácido nucleico a uma reação de polimerização para render um filamento crescente que é complementar à dita molécula-alvo de ácido nucleico na presença dos ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo e a dita enzima de polimerização, em que os ditos nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo emitem sinais na dita cavidade individual mediante excitação por energia de excitação a partir da dita fonte de excitação (2-121) durante a incorporação; (c) usar o dito sensor para detectar padrões de distribuição temporal dos ditos sinais que são distinguíveis pela dita pluralidade de tipos de nucleotídeos ou análogos de nucleotídeo, em que o dito sensor é configurado para gerar pelo menos um sinal agregando em pelo menos dois recipientes, portadores de carga produzidos por fótons incidentes; e (d) identificar uma sequência da dita molécula-alvo de ácido nucleico com base nos ditos padrões de distribuição espacial e/ou temporal dos ditos sinais.
35. Instrumento (2-120) configurado para fazer interface com um chip de teste (2-110), o instrumento (2-120) caracterizado pelo fato de que compreende: um alojamento óptico (2-401) que possui uma abertura; e pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada configurada para emitir pulsos de energia de excitação, em que pelo menos uma porção dos pulsos de energia de excitação é direcionado para a abertura do alojamento óptico (2-401); e pelo menos um componente de alinhamento configurado para posicionar mecanicamente o chip de teste (2-110) no exterior do alojamento óptico (2-401) em relação à abertura tal que o chip de teste (2-110) recebe pelo menos uma porção da energia de excitação que sai da abertura quando o chip deteste faz interface com o instrumento (2120).
36. Instrumento configurado para fazer interface com um chip de teste (2-110) caracterizado pelo fato de que compreende: um alojamento óptico (2-401) que possui uma abertura; e pelo menos uma fonte de luz de excitação pulsada posicionada dentro do alojamento óptico (2-401) e configurada para emitir pulsos de energia de excitação; pelo menos um componente óptico posicionado dentro do alojamento óptico (2-401) e configurado para direcionar pelo menos uma porção dos pulsos emitidos de energia de excitação em direção à abertura; e pelo menos um componente de alinhamento posicionado em uma superfície do alojamento óptico (2-401).
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