CN109085224B - 用于细胞表面区域atp检测的敏感微电极 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞表面区域ATP检测的敏感微电极。它包括绝缘层、第一导电层和开孔层；所述的第一导电层设置于绝缘层上表面，第一导电层中包含一组或多组电极、信号线和焊盘，电极通过信号线与焊盘相连；所述的开孔层覆盖于第一导电层的上方，且在所述的电极上方位置开设有通孔，所述通孔的孔壁与下方的电极上表面构成敞口的槽腔；所述槽腔内设有与下方电极接触的第二导电层，第二导电层上表面与通孔的孔壁共同围合成不透水的液体盛装凹槽，且第二导电层的上表面分布有若干个百纳米级凹坑。本发明的敏感微电极实现了单细胞表面区域的ATP释放的检测，且响应速率快，灵敏度高，在研究单细胞ATP释放机理方面有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种敏感微电极，更具体的说是一种用于细胞表面区域ATP检测的敏感微电极结构。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)不仅是生物细胞内储能供能的重要物质，也是细胞内或细胞间不可或缺的信息递质,在神经信息调控、抑郁样行为调节、凋亡细胞清除等生理过程中有重要意义，因此对细胞释放的ATP进行快速高效的检测分析及释放机制的研究是十分必要的。然而，细胞表面单次burst释放时间在毫秒级别，单次释放ATP浓度在nM量级甚至更低，因此只有快速响应、高灵敏度的ATP传感器才能准确监测单个细胞表面ATP的受激释放行为和动力学过程，才能实现对ATP释放机制的研究。
传统测定细胞释放ATP的方法主要有荧光法、电泳法、高效液相色谱法、比色法等。这些方法响应速度慢，灵敏度不高，只能检测溶液中的ATP浓度，无法对细胞表面ATP的释放过程进行检测，更难以用于细胞ATP释放机制研究。核酸适配体ATP传感器可达较高的灵敏度，但电极表面的适配体互补链释放后难以回收利用，因此在动态监测和研究ATP释放机制方面有较大困难。
目前，利用ATP酶传感器检测ATP的相关研究已有报道。此类传感器一般采用双酶竞争反应体系，在ATP存在下己糖激酶(HEX)与葡萄糖氧化酶(GOx)竞争消耗葡萄糖，使得GOx催化葡萄糖分解产生H2O2的量发生变化，通过测量H2O2电化学响应电流的变化测得ATP浓度。现有技术中，ATP酶传感器只能对溶液中以及组织中ATP累积释放浓度进行检测，难以对贴近细胞表面区域的ATP释放过程进行研究。其次，普遍存在的微电极结构几乎都是针状微电极的截面或1mm左右的微电极，此类结构只能针对局部区域的ATP进行检测，测试结果与实验人员放置微电极的位置有较大关系，重复性不好，且无法避免因ATP扩散导致的检测灵敏度和响应速率下降。同时，ATP酶传感器虽然实现了溶液中以及组织中ATP积累释放浓度的监测，但其响应灵敏度和响应速度仍然较低，检测浓度一般在uM以上，响应速度为秒级，依旧很难满足单细胞表面ATP的受激释放行为的监测需求。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种能实现单细胞表面区域ATP快速响应、高灵敏度检测的敏感微电极结构。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
一种用于细胞表面区域ATP检测的敏感微电极，它包括绝缘层、第一导电层和开孔层；所述的第一导电层设置于绝缘层上表面，第一导电层中包含一组或多组电极、信号线和焊盘，电极通过信号线与焊盘相连；所述的开孔层覆盖于第一导电层的上方，且在所述的电极上方位置开设有通孔，所述通孔的孔壁与下方的电极上表面构成敞口的槽腔；所述槽腔内设有与下方电极接触的第二导电层，第二导电层上表面与通孔的孔壁共同围合成不透水的液体盛装凹槽，且第二导电层的上表面分布有若干个百纳米级凹坑。
本发明中，百纳米级凹坑一般是指直径d1在数百纳米(100nm<d1<1000nm)的半球形凹坑，该凹坑尺寸与ATP囊泡尺寸相匹配。当然凹坑的形态也可以是其他异型形状，但其基本要求是凹坑的大小能够容纳ATP囊泡。由于ATP囊泡一般呈球形，因此百纳米级凹坑的形态优选为半球形(也包括近似半球形)。
进一步地，所述的百纳米级凹坑表面还分布有若干个十纳米级孔洞。
本发明中，十纳米级孔洞一般是指表面开口处横截面直径d2在数十纳米(10nm<d2<100nm)的孔洞，该孔洞尺寸与酶生物分子空间结构相匹配，可以将酶生物分子固定于孔洞内。孔洞的形态可以是半球形、半椭球型、圆柱形、倒锥形等形式，只要能够容纳酶生物分子并实现固定即可。
进一步地，上述两种方案中，所述的百纳米级凹坑表面覆盖有修饰层，所述修饰层由催化金属纳米颗粒层和导电聚合物层组成，催化金属纳米颗粒层位于第二导电层和导电聚合物层之间。需要注意的是，由于十纳米级孔洞也是位于百纳米级凹坑表面的，因此当百纳米级凹坑表面覆盖修饰层后，十纳米级孔洞也将被修饰层覆盖。在两层修饰层中，催化金属纳米颗粒层的主要作用是增强酶生物分子的催化活性，以提高电极的检测灵敏度而导电聚合物层的作用是为酶生物分子的附着固定提供条件，以更好地提高电极选择性、保持酶的活性。
更进一步地，所述的催化金属纳米颗粒层材料为铂纳米颗粒或金纳米颗粒，所述导电聚合物层材料为聚邻苯二胺或聚苯胺。这几种材料能够较好地实现各自的功能，但假如其他的金属纳米颗粒或者导电聚合物也能够实现相应的技术效果，也可应用至本发明中。
进一步地，所述的第一导电层材料为导体电极材料(如金、铂等)或半导体电极材料(如氧化锌等)。
进一步地，所述的第一导电层中，电极和焊盘均有多个，且每个电极均通过信号线连接有焊盘。多组电极和焊盘可以同时对不同的细胞进行表面ATP检测，提高检测效率和电极利用率。
更进一步地，所述的焊盘沿绝缘层的边缘周向均匀分布，所述电极分布于焊盘构成的环形区域内。将焊盘分布在绝缘层的边缘，可以方便电极与外部电化学检测装置的连接。
进一步地，所述的绝缘层和第一导电层分别为ITO导电玻璃中的基底层和ITO膜层，ITO膜层通过光刻形成电极、信号线和焊盘。
进一步地，所述的液体盛装凹槽的尺寸能够容纳一个或多个待检测的细胞。当用于检测单细胞时，凹槽的尺寸应略大于细胞尺寸，使得液体盛装凹槽中可以容纳一个单细胞，将目标单细胞培养于该凹槽中，即可实现对单细胞表面区域的ATP检测；当用于检测多细胞时，其凹槽尺寸应当按比例扩大。
进一步地，所述的开孔层不覆盖所述焊盘，以便于焊盘的接线。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过多层结构复合叠加，设计了与待测细胞尺寸相匹配的敏感微电极，可将待测细胞直接培养于检测电极上方，实现对贴近细胞表面区域的ATP检测。
(2)本发明在电极上制备与ATP囊泡相匹配的导体层或半导体层凹坑阵列，可高效收集培养于其上方的待测细胞受激释放的ATP，优化ATP传质途径，实现对单细胞表面毫秒级的ATP受激释放的快速响应。
(3)本发明在凹坑阵列的微孔内壁制备与酶生物分子空间结构相匹配的十纳米级孔洞，可在最大程度保持酶生物活性的同时完成酶的固定化，减少因纳米界面效应导致酶的构形变化，提高检测灵敏度。
(4)本发明对纳米孔洞表面进行催化金属纳米颗粒和导电聚合物层的修饰，提高电极灵敏度、电极选择性的同时，为酶生物分子和固态纳米电极之间提供缓冲和桥接作用，实现对单细胞表面ATP释放nM级浓度的高灵敏度检测。
附图说明
图1是敏感微电极中绝缘层和导电层的电气结构示意图。
图2是图1沿A-A的剖视图。
图3是敏感微电极绝缘层、导电层、开孔层整体结构俯视图。
图4是图3沿A-A的剖视图。
图5是电极孔内嵌有与ATP囊泡尺寸相匹配的凹坑阵列结构图。
图6是图5沿B-B的剖视图。
图7是凹坑内嵌有纳米孔洞阵列的电极中，与图6相同视角下沿B-B的剖视图。
图8是复合聚苯乙烯PS微纳米球的过球心剖面图。
图9是附有修饰层的纳米孔洞在与图6相同视角下沿B-B的剖视图。
图中附图标记：绝缘层1、第一导电层2、开孔层3、电极21、信号线22、焊盘23、通孔31、密实层体32、导电基底层41、大尺寸PS微球42、小尺寸PS微球43、葡萄糖氧化酶GOx 61和己糖激酶HEX 62。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
图1到图4出示了与待测细胞尺寸相匹配的敏感微电极的结构示意图，所述结构可实现微电极对贴近细胞表面区域的ATP检测。本发明用于细胞表面区域ATP检测的敏感微电极，包括绝缘层1、第一导电层2、开孔层3，其中第一导电层2固定贴合于绝缘层1上表面，第一导电层2是由电极21、信号线22和焊盘23组成的，电极21和焊盘23由信号线22相连。开孔层3覆盖于第一导电层2的上方，它是由一层不透水的密实层体32上开设若干通孔31而成的。在每个电极21上方位置均开设有通孔31，通孔31的横截面应当小于电极21上表面，使得通孔31的底部边缘均在电极21上表面边缘内，由此通孔31的孔壁与下方的电极21上表面可以构成一个敞口的槽腔，该槽腔能够用于培养待测细胞。电极21、焊盘23、通孔壁31的形状可以是圆形、椭圆形、长方形、三角形，图1是以电极21和通孔壁31的形状为圆形、焊盘23的形状为长方形给出的一种实现方式示意图。
图1出示了本发明ATP微电极结构的电气图，包括绝缘层1、电极21、导线22和焊盘23。ATP信号于电极21处检测得到，经由导线22传至焊盘23，焊盘23处可连接外部的电化学检测装置，由外部电化学检测装置从焊盘23处检测得到电流信号，通过电流信号强度即可换算出ATP浓度。电极21和槽腔的大小，可以根据检测要求变化，可适配单个待测试细胞，也可适配多个待测试细胞的大小。电极21的个数从1开始，无上限。电极21的排列方式不限，可以为矩形阵列、菱形阵列、圆形阵列、三角形阵列等。电极21与焊盘23可以一对一，也可以一对多。导线22的走线可以多样且无相交，只要保证电极21和焊盘23相连即可。电极21和焊盘23的形状可以是圆形、椭圆形、长方形、三角形等。图1是以电极21的形状为圆形、个数为16个、排列方式为矩形阵列、焊盘23的形状为长方形给出的示意图。16个电极21分布于由16个焊盘23构成的环形区域内，焊盘23在边缘可以便于接线。图2是图1沿A-A的剖视图。
图3出示了本发明开孔层3覆盖电极第一导电层2后的结构示意图。开孔层3包括通孔31和通孔壁外侧的密实层体32，层体所采用的材料不限，但考虑到细胞培养需要，应当尽可能防水。开孔层3除了不覆盖电极21上表面的槽腔区域之外，还应当尽量不覆盖焊盘23位置。开孔层3的区域可大到与绝缘层1的尺寸，也可小至只覆盖在电极21附近，只要保证通孔31与电极21可以组成不泄露可盛装液体的空间即可。图3以开孔层3覆盖电极21整个阵列为例。通孔31的孔壁与下方的电极21上表面构成的敞口槽腔，用于培养、分隔、固定待测细胞，以实现微电极对贴近细胞表面区域的ATP检测，同时对ATP的扩散起一定的减缓作用，提高ATP的检测灵敏度和响应速率。图4是图3沿A-A的剖视图。
本发明的制备过程举例，采用复合了不导电的基底层和导电的ITO膜层的ITO导电玻璃作为ATP敏感微电极的制备基底，基底层作为前述的绝缘层1，ITO膜层作为前述的第一导电层2。该ATP敏感微电极的具体制备过程如下：在ITO膜层上涂覆一层光刻胶，使用掩模板曝光显影后，使光刻胶层形成电极21，导线22和焊盘23的形状，然后用氢氟酸对没有光刻胶层的ITO膜层的其他区域进行腐蚀，最后清洗去除光刻胶层，使ITO膜层上留下电极21，导线22和焊盘23的形状。电极、导线和焊盘制作完成之后，在其上再一次涂覆光刻胶，使用掩模板曝光显影后，得到开孔层3，在电极21对应之处形成通孔31，且通孔孔径略小于电极21的直径。
图1～4以及前述内容描述了本发明的ATP敏感微电极中绝缘层1、第一导电层2和开孔层3的具体设置方式，但为了实现细胞表面区域ATP检测，在通孔31的孔壁与电极21构成的敞口槽腔内，还应当针对细胞的空间结构特性设置第二导电层4。第二导电层4具有不同的设置形式，下面结合附图进行详述。
图5出示了本发明的第一种实施方式，即在电极21上固定有第二导电层4，第二导电层4填充通孔31的孔壁与电极21构成的敞口槽腔底面，第二导电层4上表面与通孔31的孔壁共同围合成不透水的液体盛装凹槽。第二导电层4的主体是导电基底层41，其上表面嵌有与ATP囊泡尺寸相匹配的凹坑阵列结构。该凹坑阵列结构中，每个凹坑的尺寸为几百纳米。图6是图5沿B-B的剖视图。这种百纳米级凹坑，由于尺寸与ATP囊泡尺寸相当，因此可高效收集培养于其上方的待测细胞受激释放的ATP，优化ATP的传质途径。
另外，上述导电基底层41的材料可以是金属材料，如Au，或半导体材料，如ZnO。而凹坑阵列结构可以采用与ATP囊泡尺寸相近的聚苯乙烯(PS)微球为模板沉积导电基底层41后，将PS微球模板清除后制备而成。本发明中的孔洞阵列结构示意图只限于描述该结构，对凹坑阵列中的凹坑数量、凹坑之间的距离不限制，实际中的凹坑数量由电极孔径、待测细胞孔径、选取的聚苯乙烯微球尺寸、聚苯乙烯微球模板的加工参数共同决定。
设置有上述带凹坑阵列的第二导电层4的ATP敏感微电极，可高效收集待测细胞表面受激释放的ATP，大大优化了传质速率，能够实现微电极对单细胞表面毫秒级的ATP受激释放的快速响应。
为进一步实现单细胞表面ATP释放nM级浓度的高检测灵敏度检测，在尽可能保持酶分子活性的同时，还需引入催化修饰以提高酶的催化特性。基于此，本发明提出了第二种实施方式作为本发明的优选实施方式，采用纳米孔洞匹配酶分子空间结构以最大限度保持酶活性的同时，对纳米孔洞电极表面进行特定修饰以提高酶的催化特性。
图7以与图6相同的剖面视角出示了本发明的第二种实施方式，即在所述与ATP囊泡尺寸相匹配的凹坑内嵌有与酶生物分子空间结构相匹配的带修饰层5的纳米孔洞阵列结构，以实现单细胞表面ATP释放nM级浓度的高检测灵敏度检测。在结构上，其与图5的差异主要在百纳米级凹坑表面结构上，在本实施方式中，参见图7，百纳米级凹坑表面还满布有一系列的十纳米级孔洞(以下简称纳米孔洞)，这些孔洞的尺寸在几十纳米。这些纳米孔洞的大小与酶生物分子空间结构处于同一量级，能够匹配酶生物分子空间结构，将一个或多个酶生物分子固定在孔洞内，减少因纳米界面效应导致酶的构形变化，提高酶生物活性，从而提高电极灵敏度。这些纳米孔洞的制备，可以采用与第一种实施方式类似的制备方法，只是将沉积导电基底层41时所用的PS微球模板改进为复合PS微纳米球模板，即选取不同尺寸(直径10-30nm，300-500nm)PS微球通过表面自组装制备复合PS微纳米球。图8为所述复合PS微纳米球的过球心剖面图，大尺寸PS微球42为与ATP囊泡尺寸相近的300-500nm PS纳米球，小尺寸PS微球43为与酶生物分子尺寸相近的10-30nm PS纳米球，小尺寸PS微球43组装于大尺寸PS微球42外壁上。以该复合PS微纳米球模板进行导电基底层41沉积时，小尺寸PS微球43可以形成纳米孔洞，而大尺寸PS微球42可以形成百纳米级凹坑。
另外，在本实施方式中，除了对百纳米级凹坑表面设置孔洞外，还需要对表面进行修饰。由于纳米孔洞的表面与凹坑表面是连续的，因此对凹坑表面进行修饰过程中，在纳米孔洞的表面也会一并得到修饰。而由于酶生物分子主要是被固定在纳米孔洞中，因此起作用的修饰层也主要是纳米孔洞内的修饰层。纳米孔洞的修饰层5分为两层，分别为催化金属纳米颗粒层和导电聚合物层，催化金属纳米颗粒层位于第二导电层和导电聚合物层之间。其中第一层为催化金属纳米颗粒层，即利用电化学沉积法在纳米孔洞内修饰一层催化金属纳米颗粒，如铂纳米金属颗粒。该修饰层可增强酶生物分子的催化活性，以提高电极的检测灵敏度。第二层为导电聚合物层，如聚邻苯二胺、聚苯胺等，也可采用电化学沉积法在已修饰有催化金属纳米颗粒的纳米孔洞表面继续进行电化学修饰导电聚合物层。该层可为酶生物分子和固态纳米电极之间提供缓冲和桥接作用，以更好地提高电极选择性、保持酶的活性。图9出示了带修饰层5的更加细致的纳米孔洞结构示意图，但为了显示清晰起见，该图中对纳米孔洞进行了简化，没有明显示出，但实际的结构中是存在的。
需要指出的是，在本发明的微电极结构中，考虑到酶生物分子的时效性，可以不用预制在电极上，在使用时向修饰层5表面添加含有酶生物分子的溶液即可。ATP的检测一般采用双酶竞争反应体系，在ATP存在下己糖激酶(HEX)与葡萄糖氧化酶(GOx)竞争消耗葡萄糖，使得GOx催化葡萄糖分解产生H2O2的量发生变化，通过测量H2O2电化学响应电流的变化测得ATP浓度。因此，以此为例，利用本发明的微电极检测细胞表面区域ATP时，可以通过滴加含酶溶液，将葡萄糖氧化酶GOx 61和己糖激酶HEX 62固定到带修饰层的纳米孔洞内，然后在第二导电层4上表面与通孔31的孔壁共同围合成的液体盛装凹槽中培养待检测细胞，细胞表面的ATP可参与双酶竞争反应，并产生电化学响应电流被第二导电层4传导至电极21上，再通过导线22和焊盘23被外部的电化学检测仪所检测。根据电流与ATP浓度的相关性，即可计算ATP浓度大小。
因此，上述纳米孔洞可最大程度保持酶分子的空间结构和生物活性，而孔洞表面的修饰层则可提高酶的催化活性，两者协同作用可实现对单细胞表面释放的nM级浓度ATP的高灵敏度检测。
当然，在实际使用时，也可以根据检测要求适当调整液体盛装凹槽的大小，使得一个凹槽中能够同时培养多个细胞，实现对多细胞的ATP浓度检测，对此不做限定。
另外，本发明的第一种实施方式中也可以进行上述修饰层5的修饰，提高检测灵敏度。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
Claims (6)
1.一种用于细胞表面区域ATP检测的敏感微电极，其特征在于：包括绝缘层（1）、第一导电层（2）和开孔层（3）；所述的第一导电层（2）设置于绝缘层（1）上表面，第一导电层（2）中包含一组或多组电极（21）、信号线（22）和焊盘（23），电极（21）通过信号线（22）与焊盘（23）相连；所述的开孔层（3）覆盖于第一导电层（2）的上方，且在所述的电极（21）上方位置开设有通孔（31），所述通孔（31）的孔壁与下方的电极（21）上表面构成敞口的槽腔；所述槽腔内设有与下方电极（21）接触的第二导电层（4），第二导电层（4）上表面与通孔（31）的孔壁共同围合成不透水的液体盛装凹槽，且第二导电层（4）的上表面分布有若干个百纳米级凹坑；所述的百纳米级凹坑表面还分布有若干个十纳米级孔洞；所述的百纳米级凹坑为半球形；所述的百纳米级凹坑表面覆盖有修饰层（5），所述修饰层（5）由催化金属纳米颗粒层和导电聚合物层组成，催化金属纳米颗粒层位于第二导电层（4）和导电聚合物层之间；
所述的催化金属纳米颗粒层材料为铂纳米颗粒或金纳米颗粒，所述导电聚合物层材料为聚邻苯二胺或聚苯胺。
2.如权利要求1所述的敏感微电极，其特征在于：所述的第一导电层（2）中，电极（21）和焊盘（23）均有多个，且每个电极（21）均通过信号线（22）连接有焊盘（23）。
3.如权利要求2所述的敏感微电极，其特征在于：所述的焊盘（23）沿绝缘层（1）的边缘周向均匀分布，所述电极（21）分布于焊盘（23）构成的环形区域内。
4.如权利要求1所述的敏感微电极，其特征在于：所述的绝缘层（1）和第一导电层（2）分别为ITO导电玻璃中的基底层和ITO膜层，ITO膜层通过光刻形成电极（21）、信号线（22）和焊盘（23）。
5.如权利要求1所述的敏感微电极，其特征在于：所述的液体盛装凹槽的尺寸能够容纳一个或多个待检测的细胞。
6.如权利要求1所述的敏感微电极，其特征在于：所述的开孔层（3）不覆盖所述焊盘（23）。
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