CN103630571A - 一种微纳阵列传感器及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于原位定量测定单细胞及释放物质的微纳环形电极阵列传感器及其制备方法。所述微纳圆环阵列传感器包括：微纳圆环电极阵列，其为微纳圆环电极组成的阵列；定点纳米修饰层，其位于微纳环形电极的内表面，用于增加电极性能；特异选择反应修饰层，其通过在定点纳米修饰层的表面固定不同的特异性材料形成，用于对应检测不同细胞的不同神经递质；选择性细胞吸附层，其形成在特异选择反应修饰层表面，用于细胞的选择性吸附。本发明提出的上述微纳环形电极阵列传感器体积小、记录点多、对神经细胞无损伤、可以在二维尺度上同时检测多个记录点(同时检测多个细胞、多种神经递质)的微纳圆环电极阵列传感器。

Description

一种微纳阵列传感器及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物传感器、电分析化学微纳制备技术领域，特别是一种可以原位检测单细胞电生理和多种电化学神经递质信号的微纳阵列传感器及其制备方法。

背景技术

神经细胞之间的信息传递是通过神经元内部的化学神经递质和动作电位进行的。神经细胞中神经递质的释放，调节生命活动的正常进行。对神经细胞量子化神经递质释放进行实时记录是了解神经信号传导、作用机制的重要直接方式。细胞释放不正常将导致生物功能紊乱及各种疾病的产生，如老年痴呆、心血管及癌症等。因此神经递质量子释放在细胞和分子神经学、临床、病理及药理学等学科领域都具有十分重要的意义。监测细胞量子释放必须具备超高灵敏度、高选择性、高时间分辨、高空问分辨、超小体积的分析技术。对分析化学、微纳制备技术等提出了极大的挑战，也带来了机遇。因此，要开展单细胞水平的研究，分析方法须具有能处理极小体积、同时测定多种化合物，并能给出良好的定性定量的特点。

由于细胞的超微体积以及胞内单个囊泡量子释放发生的时间是毫秒级的，因此需要一种快速灵敏检测的手段才能对胞内释放情况进行实时监测。以往的研究均采用直径在微米量级的碳纤维电极或基于碳纤维的修饰电极，每次只能检测一个位点。碳纤维电极或基于碳纤维的修饰电极(CFE)由实验室人员自己制作，方法复杂，不易操作，电极质量也难以保证。CFE测量的只是直接与CFE电极尖端相接触或距离小于5μm范围内的那些小泡分泌，对于发生在细胞另一侧或距离大于5μm的小泡分泌事件CFE不能反应，不能同时检测多个细胞或多个位点。只能对细胞内单个囊泡进行分析研究。由于神经细胞直径约5～20μm，储存神经递质的囊泡直径在50～300nm之间，成千上万的囊泡在细胞内不均匀分布，而释放又是量子化的，细胞受激释放在其不同空间位点呈现不同的特性，传统的微米电极和碳纤维的修饰电极并不能检测到细胞释放的空间差异，对于尺寸更小突触间隙(＜100nm)的探测更是无能为力。超微米电极和纳米电极具有小的尺寸，使之能对更微小的生物微环境进行分析，如监测神经细胞突触间隙内的神经递质以及对细胞内单个囊泡的释放进行研究。随着微机电系统(MEMS)加工技术的发展，微电极阵列(microelectrode，MEA)提供了一种长期、多位点监测细胞的方法，常规的MEA电极直径在10～50μm，远大于囊泡和突触的量子释放尺寸，虽然可以定位到单个细胞，但是对于定位于检测突触囊泡的量子释放，在空间和时间分辨率上还是不足，不能区分单个电极上细胞不同位点释放的空间差异，难以测到实时的量子释放信号。因此需要研制尺寸更小的电极，以实现单细胞释放时空分辨监测以及深入到细胞突触间隙进行研究，在更深层次上探讨细胞释放机制。

发明内容

针对原位单细胞及释放微量物质的实时检测，为解决现有技术中存在的上述问题，即只能检测单个细胞或囊泡，一次只能检测一种神经递质、电极尺寸过大，难以在突触尺寸内进行检测，本发明提出了一种体积小、记录点多、对神经细胞无损伤、可以在二维尺度上同时检测多个记录点(同时检测多个细胞、多种神经递质)的微纳圆环电极阵列传感器。

本发明提出的一种用于同时检测多个神经细胞的神经递质的微纳圆环阵列传感器，其包括：

微纳圆环电极阵列，其为微纳圆环电极组成的阵列；

定点纳米修饰层，其位于微纳环形电极的内表面，用于增加电极性能；

特异选择反应修饰层，其通过在定点纳米修饰层的表面固定不同的特异性材料形成，用于对应检测不同细胞的不同神经递质；

选择性细胞吸附层，其形成在特异选择反应修饰层表面，用于细胞的选择性吸附。

其中，微纳圆环电极阵列是采用微机电系统技术制备的薄膜圆环电极，且微纳电极圆环电极的高度为20～500nm，周长为20～500μm.

其中，所述微纳圆环电极阵列采用多次光刻工艺制备。

其中，定点纳米修饰层采用金属或其它导电物质进行定点修饰。

其中，定点纳米修饰层采用电镀、电聚合、共聚合或微涂敷方式进行定点修饰。

其中，选择性细胞吸附层通过光刻工艺制备，通过在非电极位点上修饰憎水性硅烷材料、在微纳圆环电极的电极位点修饰亲水性氨基酸和多糖制成。

其中，其用于检测神经单细胞的电生理信号和电化学信号。

其中，其同时检测单个细胞的多种神经递质信号。

本发明还公开了一种用于同时检测多个神经细胞的神经递质的微纳圆环阵列传感器的制备方法，其包括：

步骤1、在绝缘基材上一次涂覆光刻胶，并采用光刻工艺在光刻胶上形成所需引线、触点和电极阵列图形；

步骤2、沉积金属薄膜、去胶后形成引线、触点和电极阵列，然后沉积绝缘层；

步骤3、在绝缘层上二次涂覆光刻胶，光刻显影形成面积更小的电极阵列图形；

步骤4、在所述面积更小的电极阵列图形上去除绝缘层和金属薄膜，形成微纳圆环电极表面；

步骤5、三次旋涂光刻胶形成，光刻显影形成触点图形，在所述触点图形上刻蚀去掉绝缘层，剥离光刻胶，形成最终的微纳环形电极阵列；

步骤6、在所述微纳圆环电极表面定点修饰形成定点纳米修饰层；

步骤7、在所述定点纳米修饰层上固定不同的特异性材料，形成特异选择反应修饰层；

步骤8、在传感器不同位置上通过光刻工艺分别制备选择性细胞吸收层，完成微纳圆环阵列传感器的制备。

本微纳圆环阵列传感器与现有阵列微电极比较具有如下优势：

1、微纳圆环阵列传感器电极位点更小，截面尺寸范围20nm-500nm，扩散迅速，利于单细胞释放的原位瞬态检测。

2、微纳圆环阵列传感器的制备工艺无需昂贵的深紫外光刻、电子束光刻、纳米压印设备。

3、通过光刻工艺在电极的不同位置分别修饰修饰憎水性硅烷材料和亲水性氨基酸和多糖等，可以形成单细胞生长位点，利于单细胞监测。

本发明的微纳圆环阵列传感器采用常规的微加工设备制备结合纳米修饰技术，可实现对细胞的无损实时检测，可用于多个位点的单细胞和单细胞多突触囊泡释放的多种物质的原位实时检测，并且可以实现对同一种细胞进行不同刺激的同时检测，进行同时对比检测和统计分析。

附图说明

图1是本发明中微纳环形电极阵列传感器的制备工艺流程图；

图2是本发明中微纳环形电极阵列传感器的剖面侧视图；

图3是本发明中微纳环形电极阵列传感器的局部放大平面图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

图1示出了本发明中微纳环形电极阵列传感器的剖面侧视图。如图1所示，本发明公开了一种微纳环形电极阵列传感器，其包括：微纳环形电极阵列、定点纳米修饰层、特异选择反应修饰层、选择性细胞吸附层、绝缘层和绝缘基材。该微纳环形电极阵列传感器用于检测神经单细胞的电生理信号和电化学信号，电生理信号主要是动作电位等信号；电化学信号主要指神经递质反应信号。

其中，所述微纳环形电极阵列是高度为20～500nm，周长为20～500μm的微纳圆环电极组成的阵列，其是采用微机电系统技术制备的薄膜圆环电极，电极的基底材料是玻璃或者硅等绝缘材料，电极的导电材料是铂、金等具有良好导电性能的金属等。

所述定点纳米修饰层位于微纳环形电极的内表面。该纳米修饰层是在微纳环形电极的金属表面通过电沉积纳米材料等方式固定形成高导电性纳米材料，用以增加电极性能，提高电极的电子传导能力、稳定性和固定吸附能力。定点纳米修饰层采用金属或其它优良导电物质进行定点修饰，主要是采用电镀、电聚合、共聚合和微涂敷等方式进行定点修饰形成的。定点修饰金属材料包括铂、金、钛、铑、锇等，其中优选铂黑、氮化钛。其它优良导电物质包括碳、聚吡咯等，优选碳纳米材料。

所述特异选择反应修饰层位于纳米修饰层外表面。该特异选择反应修饰层通过在纳米修饰层表面固定不同的特异性材料(如结构选择性修饰材料、酶等生物特异性修饰材料等)，以用于对应检测不同的神经递质等电化学信号。修饰组装成为微纳圆环电极阵列传感器。对于本发明中的环形电极阵列，不同的环形电极可以修饰不同的特异性反应材料，以检测不同的信号。特异选择反应修饰层包括媒介体类、生物活性物质类(酶或抗体或抗原)、结构分子类(包括高分子定向选择试剂等)和辅助试剂。其中，媒介体包括电子接受体由从铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物和铑/锇离子聚合物组成的组中选择出的一种；酶材料包括氧化酶、脂解酶、脱氢酶等，优选氧化酶，抗体包括单抗、多抗等；辅助试剂是由耦联试剂、酶/抗体激活剂、缓冲液和表面活性剂等组成。本发明优选实施例中特异反应修饰层包括新型电子媒介体和生物酶等，修饰顺序是先修饰电子媒介体，交联12小时后，再修饰生物酶和辅助试剂。

选择性细胞吸附层，其用于加强细胞的选择性吸附；其通过光刻工艺在传感器的不同位置分别修饰憎水性硅烷材料和亲水性氨基酸和多糖等形成。具体为，在非电极位点区域修饰憎水性硅烷材料，而在所述微纳环形电极及周围修饰亲水性氨基酸和多糖等制成选择性细胞吸附层。所述非电极位点指除电极外的绝缘区域。选择性细胞吸附层可以调整细胞液浓度，在传感器的电极位点上形成很多个生长的单细胞，有利于单细胞培养和监测。

所述微纳圆环阵列传感器需要在无尘环境下低温保存。

图2示出了本发明中微纳环形电极阵列传感器的制备工艺流程图。如图2所示，本发明公开了一种微纳环形电极阵列传感器的制备方法，其包括：

步骤1、基材进行清洗处理后，在绝缘基材上涂覆光刻胶。

步骤2、采用光刻工艺在光刻胶上形成所需的触点、引线和圆形电极阵列图形。其中，可以采用正胶，也可以采用负胶，根据不同制版方式可采用不同光刻胶。而所述基材为绝缘性基板材料，且其可以由玻璃、耐热玻璃或硅片等组成。该基材硬度与厚度适中，可溅射金属层，耐受一定高温，为下一步工艺奠定基础。

步骤3、在形成有触点、引线和圆形电极阵列图形的整个表面溅射或蒸镀电极金属层，并剥离光刻胶形成电极层。电极由两层结构组成，包括金属钛(Ti)或铬(Cr)制成的下层种子层和贵金属金、铂或钯中任一种制成的上层。绝缘层上预溅射的钛或铬金属层利于金或铂与电极表面的有效粘结。贵金属金和铂适合作电极，因为它们在电极表面区域的稳定性、电化学的还原性、抗氧化性等方面的电化学性质都非常好；并且加工简单，与玻璃/硅的粘接性好且导电率高，而且具有生物兼容性。本发明的一优选实施例中铂或金制成的电极厚度为20nm～500nm。

步骤4、在金属电极层表面上沉积氮化硅、氧化硅等绝缘层，并在绝缘层表面甩胶形成保护层。

步骤5、在所述保护层上二次光刻显影形成比第一次光刻形成的电极更小的圆形电极图形。

步骤6、采用反应离子刻蚀工艺，刻蚀所述更小的圆形电极图形，玻璃光刻胶，并去除更小的圆形电极图形上的绝缘层，进一步采用湿刻蚀，去除更小圆形电极表面金属材料，形成纳米级厚度金属侧面环形电极。刻蚀后的电极材料薄膜的侧面作为微纳环形电极表面，因此微纳环形电极的尺寸大小取决于溅射金属的厚度和圆环的周长。

步骤7、第三次甩胶；

步骤8、光刻显影形成触点图形；

步骤9、再采用干刻蚀法去除绝缘层并暴露出触点，形成环形超微电极。

步骤10、定点纳米修饰，形成纳米修饰层。在环形电极表面固定纳米材料，用以增加电极性能。纳米修饰层采用金属或其它优良导电物质进行定点修饰。修饰金属材料包括贵金属铂、金、钛、铑、锇及其贵金属化合物等，其中优选铂黑、氮化钛。其它优良导电物质包括碳、聚吡咯等，优选碳纳米材料。纳米修饰层定点修饰可采用电镀、电聚合、共聚合和微涂敷等方式。在电极表面形成纳米修饰层具体为通过在电极表面电镀铂黑或电聚、合聚吡咯，获得具有不同孔径的电极纳米层。通过在电极表面形成纳米修饰层进一步加强了电极表面的亲水性，增大了电极的有效表面积。不仅有利于酶试剂的固定化，而且增加了电极的电化学活性。

其中，该方法还包括特异性传感器修饰步骤：在环形微纳电极的纳米修饰层上进一步固定不同的特异性材料，形成特异选择反应修饰层。所述不同的特异性材料包括结构选择性修饰材料、酶等生物特异性修饰材料等，其用于对应检测不同的神经递质。

所述特异选择反应修饰层包括电子接受体、电子媒介体、酶试剂、缓冲液和表面活性剂等，所述电子接受体为与被分析物起反应且能产生与被分析物浓度相对应的电流的耦联反应的组合试剂。

起氧化还原作用的电子接受体由从氧化还原聚合物(Os、铑等)、铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中选择出的一种；通过电子介体将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使得电流型酶传感器的响应速度和检测灵敏度得到了提高，同时降低了反应的电压。所述电子接受体为Os氧化还原聚合物，可有效降低检测限，使工作电位降至0V左右，减少溶液中其它活性物质的干扰。

缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液和生理盐水组成的组中选择出的一种；所述缓冲液为磷酸缓冲液。缓冲液用于提供一个pH值稳定的反应环境，最佳pH反应为6～8。

所述表面活性剂为TritonX-100。添加0.01～1％非离子型的表面活性剂，提高了混合液与试条的亲和率，使混合试剂更容易迅速均匀涂覆在电极表面，形成的涂覆层薄而均匀，利于提高检测时电子传递速率。当表面活性剂浓度高于0.5％时，酶活性受到抑制和影响。因此选择0.01～0.1％浓度表面活性剂。

本发明中试剂组合所依据的反应原理如下：

其中，Glutamate：谷氨酸；GluOx：谷氨酸氧化酶；α-ketoglutarate：酮戊二酸；Os^2+/3+：新型媒介体离子。

在经过纳米修饰层的圆环微纳电极纳米颗粒上固定反应试剂形成特异选择反应修饰层具体包括：

首先，在电极表面修饰锇聚合物(Os^2+/3+)导电媒介体，常温放置12小时以上。然后将适当浓度的谷氨酸氧化酶、戊二醛和牛血清白蛋白等混合后，立即涂覆在电极表面，在35～37℃干燥箱中干燥20～25分钟后，去离子水冲洗去除未交联的戊二醛，常温干燥后，密封低温储藏。

该方法还包括制备选择性细胞吸收层，所述选择性细胞吸附层通过光刻工艺制备，在电极的非电极位点修饰憎水性硅烷材料；在电极的电极位点及周围修饰亲水性氨基酸和多糖等，调整细胞液浓度，在传感器的电极位点上形成很多个生长的单细胞，利于单细胞培养和监测。

这样就可以通过控制电极材料薄膜的厚度来控制微纳圆环电极的宽度。因为采用微纳加工技术易于可控性制备亚微米级和纳米级厚度的薄膜，所以，采用多层工艺可以在普通光刻技术条件下制备亚微米级微纳圆环电极阵列。采用PDMS或SU-8等形成分区结构。不同分区固定不同的纳米材料和特异性材料，用于检测不同的神经递质。由于一般微电极阵列电极位点尺寸是10～50μm，远大于囊泡和突触的释放尺寸，难以测到实时的释放信号。而常见的超微棒电极和碳纤电极都是单个电极，只能检测单个细胞的局部释放信号，无法实现单细胞的多个突触位点和囊泡的释放信号实时检测。深紫外光刻、电子束光刻和纳米压印等高精度光刻工艺制备微纳电极工艺时对设备要求高、相关工艺条件复杂。本方法采用常规的多层光刻工艺，既可以不受设备特定光刻仪器的限制，又可以实现微纳电极多阵列的制备，通过纳米材料和生物特异修饰，利于单细胞多突触位点分泌物高精度检测。该方法制备的体积小、记录点多、对神经细胞无损伤、可以在二维尺度上同时检测多个记录点，微纳圆环电极阵列传感器可用于多个神经细胞的神经递质释放同时检测。

本发明公开了制备微纳环形电极阵列传感器方法的另一优选实施例。

首先清洗绝缘基材玻璃片(厚度约1mm)，在绝缘层上涂覆光刻胶(正胶6130或2840或AZ1500)；采用光刻工艺在光刻胶上形成所需的触点、引线和圆形电极阵列图形；先后溅射贵金属电极薄膜Ti基底层(厚10～30nm)和Pt(10～500nm)，PECVD沉积绝缘层Si₃N₄(300～500nm)；二次光刻显影形成比第一次电极更小的圆形电极图形，采用反应离子刻蚀工艺在绝缘层和电极材料薄膜上形成更小圆形电极阵列图形，进一步采用湿刻蚀，去除小圆形电极面积的金属材料，形成纳米级厚度金属侧面环形电极，刻蚀后的电极材料薄膜的侧面作为微纳圆环的电极表面，因此圆环微纳电极的尺寸大小取决于溅射金属的厚度和圆环的周长；三次光刻显影形成触点图形，干刻蚀去除绝缘层暴露出触点

微纳电极阵列通过电镀形成纳米层。可以选择Na₃Au(SO₃)₂、H₂PtCl₆进行纳米金属材料(Au和Pt)的电镀。电镀后，在纳米材料表面固定媒介体：Os氧化还原聚合物，室温放置12小时以上使其充分交联固定。然后修饰酶层，例如谷氨酸检测区域：谷氨酸氧化酶：100U/ml；Triton X-100：0.01％，戊二醛：0.1％，牛血清白蛋白：5％。5-羟色胺检测区域则修饰0.1～1％Nafion，干燥形成Nafion膜。不同递质检测区修饰不同的酶或特异检测物质修饰完成后，密封低温保存。

图3示出了本发明中微纳环形电极阵列传感器的局部放大平面图。如图3所示，在不同的环形电极即不同的递质检测区修饰不同的酶或特异检测物质，A、B微纳环形电极分别固定不同物质。

在应用时，从冰箱中取出复温，紫外光灭菌后，接种形成单细胞培养体系，培养后进行单细胞的电化学/电生理监测。

本发明公开了制备微纳环形电极阵列传感器方法的另一优选实施例。

首先清洗绝缘基材玻璃片(厚度约1mm)，在绝缘层上涂覆光刻胶(正胶6130或2840或AZ1500)；采用光刻工艺在光刻胶上形成所需的触点、引线和方形电极阵列图形；溅射ITO(Indium tin oxide，氧化铟锡)透明导电层(50～200nm)，PECVD沉积绝缘层Si₃N₄(200～500nm)；二次光刻显影形成比第一次电极更小的方形电极图形，采用反应离子刻蚀工艺在绝缘层和电极材料薄膜上形成更小方形电极阵列图形，进一步采用湿刻蚀，去除小方形电极面积的金属材料，形成纳米级厚度ITO侧面环形电极，刻蚀后的电极材料薄膜的侧面作为微纳环形的电极表面，因此环形微纳电极的尺寸大小取决于溅射金属的厚度和圆环的周长；三次光刻显影形成触点图形，干刻蚀去除绝缘层暴露出触点。

微纳电极阵列通过电镀形成纳米层。可以选择Py(吡咯)和其它导电物质(如DNA、碳纳米材料、金溶胶等)进行纳米材料的电镀。电镀后，在纳米材料表面固定0.1～1％Nafion，干燥形成Nafion膜。主要用来进行儿茶酚胺类神经递质检测。

在电极表面进一步修饰多肽类和多糖类亲水层；采用光刻工艺制备，在电极位点及周围形成保护层；修饰硅烷类憎水层；去除光刻胶，形成亲水(电极位点处)/憎水(其他区域)分割区域，培养细胞时，通过调整细胞液浓度，可在电极位点上形成单细胞分布培养，利于单细胞培养和监测。

修饰完成后，密封低温保存。

在应用时，从冰箱中取出复温，紫外光灭菌后，接种形成单细胞培养体系，培养后进行单细胞的电化学/电生理监测。

本发明用了优选实施例进行说明，优选实施例只是为了说明的目的，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上可以对本发明作许多改进和改变。因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不是上述的其它实现方式。例如：电极形状的不同(如方框形等)、其它纳米颗粒和非纳米材料修饰的电极反应区、不同的试剂组合形式等。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于同时检测多个神经细胞的神经递质的微纳圆环阵列传感器，其包括： 

微纳圆环电极阵列，其为微纳圆环电极组成的阵列； 

定点纳米修饰层，其位于微纳环形电极的内表面，用于增加电极性能； 

特异选择反应修饰层，其通过在定点纳米修饰层的表面固定不同的特异性材料形成，用于对应检测不同细胞的不同神经递质； 

选择性细胞吸附层，其形成在特异选择反应修饰层表面，用于细胞的选择性吸附。 

2.如权利要求1所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，微纳圆环电极阵列是采用微机电系统技术制备的薄膜圆环电极，且微纳电极圆环电极的高度为20～500nm，周长为20～500μm。 

3.如权利要求2所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，所述微纳圆环电极阵列采用多次光刻工艺制备。 

4.如权利要求1所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，定点纳米修饰层采用金属或其它导电物质进行定点修饰。 

5.如权利要求5所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，定点纳米修饰层采用电镀、电聚合、共聚合或微涂敷方式进行定点修饰。 

6.如权利要求1所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，选择性细胞吸附层通过光刻工艺制备，通过在非电极位点区域修饰憎水性硅烷材料、在微纳圆环电极的电极位点修饰亲水性氨基酸和多糖制成。 

7.如权利要求1所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，其用于检测神经单细胞的电生理信号和电化学信号。 

8.如权利要求7所述的微纳圆环阵列传感器，其特征在于，其同时检测单个细胞的多种神经递质信号。 

9.一种用于同时检测多个神经细胞的神经递质的微纳圆环阵列传感器的制备方法，其包括： 

步骤1、在绝缘基材上一次涂覆光刻胶，并采用光刻工艺在光刻胶上形成所需引线、触点和电极阵列图形； 

步骤2、沉积金属薄膜、去胶后形成引线、触点和电极阵列，然后沉积绝缘层； 

步骤3、在绝缘层上二次涂覆光刻胶，光刻显影形成面积更小的电极阵列图形； 

步骤4、在所述面积更小的电极阵列图形上去除绝缘层和金属薄膜，形成微纳圆环电极表面； 

步骤5、三次旋涂光刻胶形成，光刻显影形成触点图形，在所述触点图形上刻蚀去掉绝缘层，剥离光刻胶，形成最终的微纳环形电极阵列； 

步骤6、在所述微纳圆环电极表面定点修饰形成定点纳米修饰层； 

步骤7、在所述定点纳米修饰层上固定不同的特异性材料，形成特异选择反应修饰层； 

步骤8、在传感器不同位置上通过光刻工艺分别制备选择性细胞吸收层，完成微纳圆环阵列传感器的制备。 

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