CN106796175A - 用于探测、检测和分析分子的光学系统和检测芯片 - Google Patents

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Abstract

用于分析单分子并执行核酸测序的装置和方法。该装置可以包括：包括具有用于接收样品的样品阱的多个像素的检测芯片，这些像素当被激发时发出发射能量；用于在特定的方向上引导发射能量的至少一个元件；和光路，发射能量沿该光路从样品阱朝向传感器行进。该装置还包括与检测芯片相互作用的仪器。该仪器包括：用于激发在各样品阱中的样品激发光源、与样品阱相对应的多个传感器。各传感器可检测来自在各自样品阱中的样品的发射能量。该仪器包括将发射能量从各样品阱朝向多个传感器的各个传感器引导的至少一个光学元件。

Description

用于探测、检测和分析分子的光学系统和检测芯片
相关申请
本申请权利要求于2014年8月8日提交的名称为“用于对分子进行探测、检测和分析的光学系统和检测芯片”的美国临时专利申请62/035,242的优先权，该专利申请的全部内容以参考的方式并入本文中。
本申请与下列美国专利申请有关：
于2015年5月20日提交的名称为“用于接收的光子的时间划分的集成装置”的美国临时专利申请62/164,506；
于2015年5月20日提交的名称为“脉冲激光器”的美国临时专利申请62/164,485；
于2015年5月20日提交的名称为“用于核酸测序的方法”的美国临时专利申请62/164,482；
于2015年5月20日提交的名称为“用于对分子进行探测、检测和分析的带外部光源的集成装置”的美国临时专利申请62/164,464；
于同一日期提交的律师案号R0708.70002US02、名称为“用于接收的光子的时间划分的集成装置”的美国非临时专利申请”；和
于同一日期提交的律师案号R0708.70004US02、名称为“用于对分子进行探测、检测和分析的带外部光源的集成装置”的美国非临时专利申请。
每个上面所列出的相关申请的全部内容以参考的方式并入本文中。
技术领域
本申请总体上涉及用于执行生物和/或化学样品的快速大规模并行定量分析的装置、方法和技术以及制造所述装置的方法。
背景技术
对生物样品的检测和分析可利用生物学测定(“生物测定”)而进行。生物测定通常涉及到大且高价的实验室设备，这要求对助理研究员进行培训以便操作该设备和进行生物测定。此外，生物测定通常是整批地进行，因此大量的特定类型的样品对于检测和定量而言是必需的。
一些生物测定是通过用具有发出特定波长光的发光标签为样品加标签而进行。用激发光源对这些标签进行照射从而导致发冷光，并且用光检测器对冷光进行检测以便对由标签所发出冷光的量进行定量。使用发光标签的生物测定通常涉及到用于照射样品的高价激光光源、和复杂的大体积检测光学装置、及收集来自被照射样品的发光的电子器件。
发明内容
本发明的一些实施方式涉及一种用于与包括多个样品阱的检测芯片相互作用的仪器。多个样品阱中的各样品阱可接收样品。该仪器包括用于激发多个样品阱的至少一部分样品阱中的样品的至少一个脉冲激发光源。该仪器还包括多个传感器，多个传感器的各传感器与多个样品阱的一个样品阱相对应。多个传感器的各传感器对来自在各个样品阱中的样品的发射能量进行检测。另外，多个传感器的各传感器能够对发射能量的检测时间进行检测。该仪器还包括用于将发射能量从多个样品阱的各样品阱朝向多个传感器的各个传感器引导的至少一个光学元件。
一些实施方式涉及一种包括检测芯片和仪器的装置。测定芯片包括多个像素。检测芯片的各像素包括接收样品的样品阱，该样品当被激发时发出发射能量。检测芯片的各像素还包括用于在特定方向上引导发射能量的至少一个元件。该至少一个元件可以是折射元件、衍射元件、等离子体激发元件或共振腔。检测芯片的各像素还包括光路，发射能量沿该光路从样品阱朝向仪器的传感器行进。该仪器与检测芯片相互作用，并且包括激发各样品阱中的样品的至少一个脉冲激发光源。该仪器还包括多个传感器，多个传感器的各传感器对应于各自的样品阱。多个传感器的各传感器对来自各自样品阱中的样品的发射能量进行检测，并且对发射能量的检测时间进行检测。该仪器还包括将发射能量从各样品阱朝向多个传感器的各自传感器进行引导的至少一个光学元件。
一些实施方式涉及一种对试样进行分析的方法。该方法包括：将试样设置在包括多个样品阱的检测芯片的上表面上。该方法还包括：使检测芯片与包括至少一个激发光源和至少一个传感器的仪器对准。该方法还包括：用来自至少一个脉冲激发光源的脉冲激发光对来自在多个样品阱的至少一个样品阱中的试样的样品进行激发。该方法还包括：利用至少一个传感器对响应于激发光的激发而由在至少一个样品阱中的样品所产生的发射能量进行检测。至少一个传感器能够确定由样品所产生发射能量的寿命。
一些实施方式涉及一种用于对靶核酸分子进行测序的方法。该方法包括：将芯片设置在与包括脉冲激发源和能够对光的至少一个时间特性进行检测的传感器的仪器相邻的位置。芯片包括至少一个阱，当所述芯片处在仪器的感测位置时该阱可操作地联接到所述激发源和所述传感器。该阱容纳所述靶核酸分子、聚合酶、及多种类型的核苷酸或核苷酸类似物。该方法还包括：利用在所述感测位置的所述芯片，在所述聚合酶存在下，在靶核酸分子的引发位置执行延伸反应，从而顺序地将核苷酸或核苷酸类似物并入与靶核酸分子为互补的生长链中。在并入和利用来自激发源的激发能量进行激发时，所述核苷酸或核苷酸类似物在所述阱中发出信号。该方法还包括：利用所述传感器对所述信号的空间和/或时间分布图形进行检测，这些分布图形对于所述多种类型的核苷酸或核苷酸类似物是可区分的。该方法还包括：基于所述信号的所述空间和/或时间分布图形来鉴定所述核苷酸或核苷酸类似物，由此对靶核酸分子进行测序。
一些实施方式涉及一种用于核酸测序的方法。该方法包括将芯片设置在与仪器相邻的位置。该芯片包括多个阱，当所述芯片处在所述仪器的感测位置时这些阱各自可操作地联接到所述仪器的脉冲激发源和传感器。所述多个阱的单独的阱容纳所述靶核酸分子、聚合酶、及多种类型的核苷酸或核苷酸类似物。该方法还包括：当芯片处在感测位置时，在所述核苷酸或核苷酸类似物及所述聚合酶的存在下，使所述靶核酸分子经历聚合反应，从而获得与所述靶核酸分子为互补的生长链。在并入期间，当被来自所述激发源的激发能量所激发时，在单独的阱中核苷酸或核苷酸类似物发出信号。该方法还包括：利用所述传感器来检测对于多种类型核苷酸或核苷酸类似物而言是可区分的所述信号的时间分布图形。该方法还包括：基于所述信号的所述空间和/或时间分布图形来鉴定所述靶核酸分子的序列。
基于以下的描述并结合附图，可以更充分地理解本公开的前述和其它的方面、实施方式、和特征。
本公开中所使用的术语“像素”可指代集成装置的一个单元体。该单元体可包括样品阱和传感器。该单元体还可包括激发源。该单元体还可包括至少一个激发耦合光学结构(该结构可被称为“第一结构”)，该结构是用于增强激发能量从激发源到样品阱的耦合。该单元体还可包括至少一个发射耦合结构，该结构是用于增强发射从样品阱到传感器的耦合。单元体还可包括集成电子器件(例如，CMOS器件)。可存在被布置于在集成器件上的阵列中的多个像素。
本公开中所使用的术语“光学”可指代可见、近红外、和短波长红外光谱带。
本公开中所使用的术语“标签”可指代附接到要被分析的样品或附接到可与样品发生反应的反应剂的标签、探针、标记、或报道基因。
本公开中所使用的短语“激发能量”可指代被传递至在样品阱内部的样品和/或标签的任何形式的能量(例如，辐射的或非辐射的)。辐射激发能量可包括在一个或多个特征波长处的光辐射。
本公开中所使用的短语“特征波长”可指代在辐射的有限带宽内的中心波长或主波长。在一些情况下，它可指代辐射的带宽中的峰值波长。荧光团的特征波长的例子为563nm、595nm、662nm、和687nm。
本公开中所使用的短语“特征能量”可指代与特征波长相关的能量。
本公开中所使用的术语“发射”可指代来自标签和/或样品的发射。这可包括辐射发射(例如，光发射)、或非辐射性能量传递(例如，Dexter能量传递或共振能量传递)。发射是由在样品阱内部的样品和/或标签的激发所导致。
本公开中所使用的术语“来自样品阱的发射”或“来自样品的发射”可指代来自在样品阱内部的标签和/或样品的发射。
本公开中所使用的术语“自对准”可指代其中可在不采用两个单独的光刻图案化步骤的情况下制造至少两个不同的元件(例如，样品阱和发射耦合结构、样品阱和激发源)并且彼此对准的微加工工艺，其中第一光刻图案化步骤(例如，光刻、离子束光刻、EUV光刻)印刷第一元件的图案并且第二光刻图案化步骤与第一光刻图案化步骤一致并印刷第二元件的图案。自对准工艺可包括在单一光刻图案化步骤中第一和第二元件的图案，或者可包括利用第一元件的加工结构的特征而形成第二元件。
本公开中所使用的术语“传感器”可指代用于感测自样品阱的发射并产生是所感测发射的代表的至少一个电信号的一个或多个集成电路器件。
本公开中所使用的术语“纳米尺度”可指代具有大约150纳米(nm)以下但不大于大约500nm的至少一个尺度或最小特征尺寸的结构。
本公开中所使用的术语“微米尺度”可指代具有在大约500nm和大约100微米之间的至少一个尺度或最小征尺寸的结构。
本公开中所使用的短语“增强激发能量”可指代增加在样品阱的激发区处的激发能量的强度。例如，可通过使入射到样品阱上的激发能量集中和/或共振而增加该强度。在一些情况下，可利用允许激发能量进一步穿透进入样品阱的激发区中的防反射涂层或损耗层来增加该强度。激发能量的增强可以是对不包括用于增强在样品阱激发区中的激发能量的结构的实施方式的比较性参考。
本公开中所使用的术语“约”、“大约”和“大致”可指代一个值，并且意图包括该引用值加上和减去可接受的变差。在一些实施方式中，变差的量可以是小于5％，在一些实施方式中小于10％，在一些实施方式中小于20％。在其中装置可在大范围的值中(例如，包括一个或多个数量级的范围)正确地起作用的实施方式中，变差的量可以是2倍。例如，如果装置对于在20至350的范围内的值而言可正确地起作用，那么“大约80”可包括在40和160之间的值。
本公开中所使用的术语“相邻”可指代被布置成相互非常靠近的两个元件(例如，在小于像素的横向或垂直尺度的约五分之一的距离内)。在一些情况下，在相邻的元件之间可存在介于中间的结构或层。在一些情况下，相邻的元件可相互紧邻并且没有介于中间的结构或元件。
本公开中所使用的术语“检测”可指代在传感器处接收来自样品阱的发射，并且产生是发射的代表或者与发射相关的至少一个电信号。本公开中所使用的术语“检测”也可指代基于来自样品阱的发射而确定在样品阱中的特定样品或标签的存在、或者鉴定其特性。
附图说明
本领域技术人员将理解的是，本文中所描述的附图只是用于说明的目的。应当理解的是，在一些情况下本发明的各种方面可放大或扩大地显示从而便于对本发明的理解。在附图中，类似的附图标记一般指代在全部各种附图中的类似的特征、功能上相似和/或结构上相似的元件。这些附图未必按比例绘制，相反重点是放在说明本公开的原理上。这些附图并非意图以任何方式限制本公开的范围。
图1-1示出了根据一些实施方式的用于两个不同标记的荧光寿命曲线。
图1-2A示出了根据一些实施方式的发射波长光谱。
图1-2B示出了根据一些实施方式的吸收波长光谱。
图1-2C示出了根据一些实施方式的发射波长光谱。
图1-3A示出了用于发射波长和发射寿命的相空间。
图1-3B示出了用于吸收波长和发射寿命的相空间。
图1-4示出了用于发射波长、吸收波长和发射寿命的相空间。
图2-1是根据一些实施方式的可用于生物和化学试样的快速、移动分析的装置的方框图。
图2-2是根据一些实施方式的传感器芯片的像素与检测芯片的像素之间的关系的示意图。
图2-3示出了根据一些实施方式的与检测芯片的单像素和传感器芯片的单像素相关的部件。
图2-4示出了根据一些实施方式的仪器的部件的一部分。
图3-1A是根据一些实施方式的检测芯片和芯片保持架的俯视透视图。
图3-1B是根据一些实施方式的检测芯片和芯片保持架的仰视透视图。
图3-1C是根据一些实施方式的检测芯片和芯片保持架的剖视图。
图3-2示出了根据一些实施方式的入射到样品阱上的激发能量。
图3-3示出了根据一些实施方式的沿着形成为零模式波导的样品阱的激发能量的衰减。
图3-4示出了在一些实施方式中的包括增加了在与样品阱相关的激发区处的激发能量的凹坑的样品阱。
图3-5对根据一个实施方式的具有凹坑的样品阱与没有凹坑的样品阱的激发强度进行了比较。
图3-6示出了根据一些实施方式的形成于突起部的样品阱和凹坑。
图3-7A示出了根据一些实施方式的具有锥形侧壁的样品阱。
图3-7B示出了根据一些实施方式的具有弯曲侧壁的样品阱和具有较小横向尺寸的凹坑。
图3-7C示出了由表面等离子激元结构所组成的样品阱的侧面正视图。
图3-7D示出了由表面等离子激元结构所组成的样品阱的平面视图。
图3-7E示出了根据一些实施方式的包括沿样品阱侧壁所形成的激发能量增强结构的样品阱。
图3-7F示出了根据一些实施方式的形成于多层堆中的样品阱。
图3-8示出了根据一些实施方式的形成于样品阱的表面上的表面涂层。
图3-9A至图3-9E示出了根据一些实施方式的与形成样品阱的剥离工艺相关的结构。
图3-9F示出了根据一些实施方式的与形成样品阱的替代剥离工艺相关的结构。
图3-10A至图3-10D示出了根据一些实施方式的与形成样品阱的直接蚀刻工艺相关的结构。
图3-11示出了根据一些实施方式的可利用剥离工艺或直接蚀刻工艺形成于多层中的样品阱。
图3-12示出了根据一些实施方式的与可用于形成凹坑的蚀刻工艺相关的结构。
图3-13A至图3-13C示出了根据一些实施方式的与形成凹坑的替代工艺相关的结构。
图3-14A至图3-14D示出了根据一些实施方式的与用于使粘附剂层和钝化层沉积的工艺相关的结构。
图3-15示出了根据一些实施方式的与用于使粘附剂中心地沉积于样品阱内部的工艺相关的结构。
图4-1A和图4-1B示出了根据仅一个实施方式的表面等离子激元结构。
图4-1C示出了根据一些实施方式的形成于与样品阱相邻位置的表面等离子激元结构。
图4-1D和图4-1E示出了根据一些实施方式的形成于样品阱中的表面等离子激元结构。
图4-2A至图4-2C示出了根据一些实施方式的周期性表面等离子激元结构的实例。
图4-2D示出了根据一些实施方式的在形成于与周期性表面等离子激元结构相邻位置的样品阱处的激发能量的数值模拟。
图4-2E至图4-2G示出了根据一些实施方式的周期性表面等离子激元结构。
图4-2H和图4-2I示出了根据一些实施方式的包括表面等离子激元结构的纳米天线。
图4-3A至图4-3E示出了根据一些实施方式的与用于形成表面等离子激元结构工艺步骤相关的结构。
图4-4A至图4-4G示出了根据一些实施方式的与用于形成表面等离子激元结构和自对准样品阱的工艺步骤相关的结构。
图4-5A至图4-5E示出了根据一些实施方式的与用于形成表面等离子激元结构和自对准样品阱的工艺步骤相关的结构。
图4-6A示出了根据一些实施方式的形成于与样品阱相邻位置的薄损耗膜。
图4-6B和图4-6C示出了根据一些实施方式的基于在样品阱和薄损耗膜附近的激发能量的数值模拟的结果。
图4-6D示出了根据一些实施方式的与样品阱间隔的薄损耗膜。
图4-6E示出了根据一些实施方式的形成于与样品阱相邻位置的薄损耗膜堆。
图4-7A示出了根据一些实施方式的可用于形成与样品阱相邻的共振腔的反射堆。
图4-7B示出了根据一些实施方式的可用于将激发能量集中在样品阱处的介电结构。
图4-7C和图4-7D示出了根据一些实施方式的可在与样品阱相邻位置被图案化的光子带隙结构。
图4-8A至图4-8G示出了根据一些实施方式的与用于形成介电结构和自对准样品阱的工艺步骤相关的结构。
图4-9A和图4-9B示出了根据一些实施方式的利用非辐射过程将激发能量耦合到样品的结构。
图4-9C示出了根据一些实施方式的利用多个非辐射过程将激发能量耦合到样品的结构。
图4-9D示出了根据一些实施方式的包含一个或多个能量转换颗粒以便利用辐射或非辐射过程将激发能量耦合到样品的结构。
图4-9E示出了根据一些实施方式的与激发能量向样品的下转换相关的光谱。
图4-9F示出了根据一些实施方式的与激发能量向样品的上转换相关的光谱。
图5-1示出了根据一些实施方式的同心等离子激元元圆光栅。
图5-2示出了根据一些实施方式的螺旋形等离子激元元光栅。
图5-3A示出了根据一些实施方式的来自同心等离子激元元圆光栅的发射空间分布形态。
图5-3B示出了根据一些实施方式的非周期性和周期性同心等离子激元元圆光栅的方向性。
图5-4A至图5-4B示出了根据一些实施方式的等离子激元元纳米天线。
图5-5A至图5-5B示出了根据一些实施方式的等离子激元元纳米天线。
图5-5C示出了根据一些实施方式的来自纳米天线阵列的发射能量的辐射图形。
图5-6A示出了根据一些实施方式的检测芯片的折射光学部件。
图5-6B示出了根据一些实施方式的检测芯片的菲涅耳透镜。
图6-1示出了根据一些实施方式的仪器的显微观测部件。
图6-2A示出了根据一些实施方式的传感器芯片的远场光谱分选元件。
图6-2B示出了根据一些实施方式的传感器芯片的远场过滤元件。
图6-3A和图6-3B示出了根据一些实施方式的传感器芯片的薄损耗膜。
图6-4A和图6-4B示出了根据一些实施方式的仪器的聚光装置。
图6-5示出了根据一些实施方式的经过光学系统的光路。
图7-1A示出了根据一些实施方式的在传感器芯片的像素内部的传感器的正视图。
图7-1B示出了根据一些实施方式的具有两个单独且同心的有效区域的牛眼传感器。
图7-1C示出了根据一些实施方式的具有四个单独的有效区域的条状传感器。
图7-1D示出了根据一些实施方式的具有四个单独有效区域的四区传感器。
图7-1E示出了根据一些实施方式的具有四个单独的有效区域的弧段传感器。
图7-1F示出了根据一些实施方式的堆叠段传感器。
图7-2A示出了根据一些实施方式的来自用于在第一波长处所发出能量的分选元件的发射分布。
图7-2B示出了根据一些实施方式的与图7-2A中所示发射分布相对应的由牛眼传感器所接收的辐射图形。
图7-2C示出了根据一些实施方式的来自用于在第二波长处所发出能量的分选元件的发射分布。
图7-2D示出了根据一些实施方式的与图7-2C中所示的发射分布相对应的由牛眼传感器所接收的辐射图形。
图7-2E示出了根据一些实施方式的基于用于具有用于来自样品的第一发射波长的两个有效区域的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-2F示出了根据一些实施方式的基于与用于来自样品的第二发射波长的图7-2E相关的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-2G示出了根据一些实施方式的基于用于与用于来自样品的第三发射波长的图7-2E相关的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-2H示出了根据一些实施方式的基于与用于来自样品的第四发射波长的图7-2E相关的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-2I示出了根据一些实施方式的基于具有用于来自样品的第一发射波长的四个有效区域的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-2J示出了根据一些实施方式的基于与用于来自样品的第二发射波长的图7-2I相关的牛眼传感器的信号检测的数值模拟的结果。
图7-3A示出了根据一些实施方式的在可用于读取来自包括两个有效区域的传感器的信号的仪器上的电路。
图7-3B示出了根据一些实施方式的可包括在传感器芯片处、用于信号累积和读出的三晶体管电路。
图7-3C示出了根据一些实施方式的在可用于读取来自包括四个有效区域的传感器的信号的仪器上的电路。
图7-4A示出了根据一些实施方式的可使用于样品分析的两个不同发射体的时间发射特性。
图7-4B示出了根据一些实施方式的激发源和来自样品的荧光时间演变。
图7-4C示出了根据一些实施方式的延时采样。
图7-4D示出了根据一些实施方式的用于两个不同发射体的时间发射特性。
图7-4E示出了根据一些实施方式的在传感器的电荷积累节点处的电压动态。
图7-4F示出了根据一些实施方式的在没有复位的情况下传感器段的双读取。
图7-4G和图7-4H示出了根据一些实施方式的与具有在时间上不同的发射特性的两个发射体相关的第一和第二读取信号电平。
图7-5示出了根据一些实施方式的具有时间分辨能力的像素的示意图。
图7-6示出了根据一些实施方式的具有时间分辨能力的像素的示意图。
图8-1A和图8-1B示出了根据一些实施方式的激发源的光谱激发带。
图8-2A是根据一些实施方式的相干光源的示意图。
图8-2B示出了根据一些实施方式的激发源的时间强度曲线。
图8-3示出了根据一些实施方式来自激发源的张弛振荡和光信号。
图8-4示出了根据一些实施方式的修整电脉冲用于减小输出光学脉冲中的尾部功率的应用。
图8-5和图8-6示出了根据一些实施方式的作为时间的函数的激发源的光学输出功率。
图8-7示出了根据一些实施方式的由于使用较大数量的引线接合所导致的在较高频率下的较高电流。
图8-8A是根据一些实施方式的传输线Pulsar的示意图。
图8-8B示出了根据一些实施方式的从传输线中所获得的光脉冲的时间波形。
图8-9和图8-10是根据一些实施方式的用于产生脉冲激发光的示范性电路的示意图。
图8-11A示出了根据一些实施方式的具有可用于产生修整电信号作为输出脉冲的一个RF放大器的示范性电路。
图8-11B示出了从图8-11A的电路中获得的电脉冲轮廓。
图8-12A示出了根据一些实施方式的具有可用于产生修整电信号作为输出脉冲的一个RF放大器的一个示范性电路。
图8-12B示出了从图8-12A的电路中所获得的电脉冲轮廓。
图8-13A示出了用于根据一些实施方式的将四个不同的激发源加以组合的示意图。
图8-13B示出了根据一些实施方式的作为阻抗的函数的四个激发源的电流、功率效率、和电压。
图9-1示出了根据一些实施方式的可用于生物和化学试样的快速移动分析的紧凑型装置的操作方法。
图9-2示出了根据一些实施方式的校准流程。
图9-3示出了根据一些实施方式的数据分析流程。
图10-1是根据一些实施方式的单分子核酸测序的示意图。
图10-2示意性地示出了随时间推移的在单样品阱中的测序过程。
图10-3示出了根据一些实施方式的用于制备样品阱表面的过程。
图10-4示出了根据一些实施方式的示范性寿命测量。
图10-5示出了根据一些实施方式的与传感器相结合的菲涅耳透镜。
图10-6示出了根据一些实施方式的四个标记的发光寿命。
图10-7示出了由传感器用来区分来自图10-6的各标记的16个时间元。
图10-8示出了根据一些实施方式的四个标记的发光寿命。
图10-9示出了由传感器用来区分来自图10-6的各标记的13个时间元。
图10-10示出了根据一些实施方式的寿命和光谱测量图解。
图10-11示出了根据一些实施方式的基于寿命和发射波长的在四个标记之间的分离。
图10-12示出了根据一些实施方式的三个标记的发射光谱。
图10-13示出了根据一些实施方式的四个标记的荧光寿命。
图10-14示出了根据一些实施方式的使用四段传感器的来自图10-12的三个标记的信号曲线。
图10-15示出了根据一些实施方式的四个标记的荧光寿命。
图10-16示出了根据一些实施方式的使用四段传感器的ATRho14的信号曲线。
图10-17示出了根据一些实施方式的寿命和吸收能量测量图解。
图10-18示出了根据一些实施方式的四个标记的吸收光谱。
图10-19示出了根据一些实施方式的两个标记的寿命测量。
图10-20示出了由传感器用来区分来自图10-19的标记的8个时间元。
图10-21示出了根据一些实施方式的四个标记的信号曲线。
图10-22示出了根据一些实施方式的四个标记的发射光谱。
图10-23示出了根据一些实施方式的计算环境。
图11-1示出了根据一些实施方式的制造样品阱的方法。
图11-2示出了根据一些实施方式的利用剥离方法制造样品阱的方法。
图11-3示出了根据一些实施方式的形成样品阱的方法。
图11-4示出了根据一些实施方式的形成同心光栅的方法。
图11-5示出了根据一些实施方式的形成同心光栅的方法。
图11-6示出了根据一些实施方式的定位纳米孔的方法。
图11-7示出了根据一些实施方式的透镜阵列制造的方法。
图11-8示出了根据一些实施方式的折射透镜阵列。
图11-9示出了根据一些实施方式的折射透镜阵列。
图11-10示出了根据一些实施方式的形成透镜的方法。
图11-11示出了根据一些实施方式的形成透镜的方法。
图11-12示出了根据一些实施方式的衍射光学元件。
图11-13示出了根据一些实施方式的用于形成衍射光学元件两个单元体层。
图11-14示出了根据一些实施方式的衍射透镜形式。
图11-15和图11-16示出了根据一些实施方式的制造衍射光学元件的方法。
图11-17和图11-18和图11-19示出了根据一些实施方式制造嵌入式菲涅耳透镜的方法。
基于下面所陈述的详细描述并结合附图，本申请的各实施方式的特征和优点将变得更加显而易见。
具体实施方式
本发明人已认识并意识到，用于执行生物测定的常规装置是大的、高价的并且需要先进的实验室技术而实施。许多类型的生物测定依赖于对试样中的单分子的检测。通常单分子检测会需要大的、笨重的激光系统，用于产生分子激发所需的高强度光。另外，可利用大体积光学部件将激光引导至试样，并且可利用其它光学部件将冷光从试样引导至传感器。这些常规的光学部件会要求精确的对准和稳定性。使用此常规设备所需要的常规实验室设备和培训会导致复杂的、高成本的生物测定。
本发明人已认识并意识到，对于可以简单地且低成本地对生物和/或化学试样进行分析以确定其各成分的特征的装置存在着需求。这种装置的一个应用可用于对生物分子进行测序，例如核酸分子或者具有多个氨基酸的多肽(例如，蛋白质)。用于执行单分子或颗粒的检测和定量的紧凑型高速装置可以降低执行生物和/或化学样品的复合物定量测量的成本并且迅速地推进生物化学技术发现的速度。此外，可容易地运输的高性价比的装置不仅可以转变在发达国家所执行的生物测定的方式，而且为发展中国家中的人们第一次提供对可以显著地改善他们的健康和福利的基本诊断测试的快速获取。例如，在一些实施方式中，用于执行生物测定装置是用于执行对生物样品(例如血液、尿液和/或唾液)的诊断测试。该装置可由个人在他们的家中使用、由在发展中国家的偏远诊所或任何其它位置(例如乡村医生的办公室)中的医生所使用。这种诊断测试可以包括对在受试对象的生物样品中的生物分子(例如核酸分子或蛋白质)的检测。在一些例子中，诊断测试包括对受试对象的生物样品中的核酸分子进行测序，例如对受试对象的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸分子或表达产物的测序。
本发明人也已认识并意识到，当用多个不同类型的发光标记物给样品加标签时，可利用发光标记物的任何合适的特性来鉴定存在于集成装置的特定像素中的标记的类型。例如，可利用由标记所发出荧光的特性和/或激发吸收的特性来鉴定标记。在一些实施方式中，可利用荧光的发射能量(与光的波长直接相关)对第一类型的标记与第二类型的标记加以区分。此外或可替代地，也可利用荧光寿命测量来鉴定存在于特定像素处的标记的类型。在一些实施方式中，荧光寿命测量可利用使用当以充分的分辨率检测光子时能够区分时间的传感器的脉冲激发源而进行，以便获得寿命信息。此外或可替代地，被不同类型标记所吸收的激发光的能量可用于鉴定存在于特定像素处的标记的类型。例如，第一标记可吸收第一波长的光，但不同样地吸收第二波长的光，而第二标记可吸收第二波长的光，但不同样地吸收第一波长的光。因此，当可使用多于一个的激发光源(各自具有不同的激发能量)以交错的方式来照射样品时，可以利用各标记的吸收能量来鉴定那种类型的标记存在于样品中。不同的标记也可具有不同的发光强度。因此，也可利用荧光的检测强度来鉴定存在于特定像素处的标记的类型。
本发明人所预计的装置的应用的一个非限制性例是能够执行生物分子(例如，核酸或者具有多个氨基酸的多肽(例如蛋白质))的测序的装置。可利用这种装置所执行的诊断测试包括对受试对象的生物样品中的核酸分子进行测序，例如对在受试对象的生物样品中的无细胞脱氧核糖核酸分子或表达产物的测序。
本申请提供用于对生物分子或其亚单位(例如核酸分子)进行检测的装置、系统和方法。这种检测可以包括测序。可从自受试对象中所获得的生物样品中提取该生物分子。可从受试对象的体液或组织(例如呼吸液、唾液、尿液或血液(例如，全血或血浆))中提取生物样品。受试对象可怀疑具有健康问题，如疾病(例如，癌症)。在一些例子中，从受试对象的体液或组织中提取一个或多个核酸分子。可从自受试对象(例如受试对象的组织的部分、或者从受试对象中获得的无细胞体液(例如全血))中所获得的一个或多个细胞中提取一个或多个核酸。
测序可以包括通过合成与模板为互补或相似的另一种生物分子，例如通过合成与模板核酸分子为互补的合成核酸分子并确定随时间推移的核苷酸的并入(即，利用合成进行测序)而对模板生物分子(例如，核酸分子)的单独亚单位的确定。作为一个替代，测序可以包括对生物分子的单独亚单位的直接鉴定。
在测序期间，可将是生物分子的单独亚单位的指示物的信号采集于存储器中并且实时地处理或者之后的时间点进行处理以确定该生物分子的序列。这种处理可以包括这些信号与使单独亚单位的鉴定成为可能的参考信号的比较，这在一些情况下获得读取信息。读取信息可以是充分长度(例如，至少约30个碱基对(bp))的序列，执行序列可以用于鉴定较大的序列或区域，例如可以与在染色体或基因组区段或基因上的位置对准。
可利用标记来鉴定生物分子的单独的亚单位。在一些例子中，利用发光标记物来鉴定生物分子的单独的亚单位。一些实施方式采用发光标记物(在本文中也被称为“标记”)，这些发光标记物可以是外源性或内源性的标记。外源性标记可以是用作报道基因的外部发光标记物和/或用于发光标记的标签。外源性标记的例子可包括但不限于：荧光分子、荧光团、荧光染料、荧光染色、有机染料、荧光蛋白质、参与荧光共振能量传递(FRET)的原子团、酶类、和/或量子点。其它外源性标记在本领域中是已知的。可将这种外源性标记偶联到与特定的靶或组分特异性地结合的探针或官能团(例如，分子、离子、和/或配体)。将外源性标签或报道基因附近到探针允许通过对外源性标签或报道基因的存在的检测而对靶进行鉴定。探针的例子可包括：蛋白质、核酸(例如，DNA、RNA)分子、脂类和抗体探针。外源性标记与官能团的组合可形成用于检测的任何合适的探针、标签、和/或标记，包括分子探针、标记的探针、杂交探针、抗体探针、蛋白质探针(例如，生物素结合探针)、酶标记、荧光探针、荧光标签、和/或酶报道基因。
尽管本公开提到的是发光标记物，但其它类型的标记也可使用于本文中所提供的装置、系统和方法。这种标记可以是质量标记、静电标签、或电化学标记。
虽然可将外源性标记加入样品中，但内源性标记可以已经是样品的一部分。内源性标记可包括可在激发能量存在下发冷光或“自发荧光”的任何所存在的发光标记物。内源性荧光团的自发荧光可提供无标签和无创性的加标记手段并且不需要外源性荧光团的导入。这种内源性荧光团的例子可包括例如但不限于：血红蛋白、氧合血红蛋白、脂类、胶原和弹性蛋白交联、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、氧化型黄素类(FAD和FMN)、脂褐素、角蛋白、和/或卟啉类。
虽然一些实施方式可涉及通过对试样中的单分子进行检测而进行诊断测试，但本发明人也已认识到本公开的单分子检测能力可用于执行多肽(例如，蛋白质)测序或者一个或多个核酸(例如基因段)的核酸(例如，DNA、RNA)测序。核酸测序技术可在用于确定核酸序列的方法中以及在速率、读取长度、和测序过程中的错误发生率方面有变化。例如，一些核酸测序方法是基于通过合成的测序，其中当把核苷酸并入与靶核酸为互补的新合成核酸链中时而确定该核苷酸的特征。
由于已认识到对用于执行单分子检测和/或核酸测序的简单且较不复杂的装置的需求，本发明人已设想出了利用发光标签的组来检测单分子的技术，从而利用标签的组例如光学(例如，发光)标签给不同的分子加标记，从而给不同的分子加标记。这种单分子可以是具有标签的核苷酸或氨基酸。可以在结合到单分子时、当从单分子中释放时、或者在结合到单分子和从单分子中释放时，对标签进行检测。在一些例子中，标签是发光标签。在所选择组中的各发光标签与各个分子相关。例如，可利用一组的四个标签给存在于DNA中的核碱基“加标记”，该组的各标签与不同的核碱基是相关的，例如，第一标签是与腺嘌呤(A)相关，第二标签是与胞嘧啶(C)相关，第三标签是与鸟嘌呤(G)相关，第四标签是与胸腺嘧啶(T)相关。此外，中该组的标签中的每个发光标签具有不同的特性，这可用于将该组的第一标签与该组中的其它标签加以区分。因此，可利用这些可区分特性中的一个或多个来唯一地鉴定各标签。例如但不限于，可用于将一个标签与另一个标签加以区分的标签的特性可包括：响应于激发能量由标签所发出光的发射能量和/或波长、和/或由特定的标签所吸收将标签置于激发状态的激发光的波长。
发光标记在它们所发出光的波长、它们所发出光的时间特性(例如，它们的发射延迟时间段)、和它们对激发能量的响应中有变化。因此，可基于对这些特性的检测，而将发光标记物与其它发光标记物加以鉴别或区分。这种鉴别或区分技术可单独使用或者在任何合适的组合中使用。
在一些实施方式中，如本申请中所描述的整体的光检测器可以测量或区分发光寿命，例如荧光寿命。寿命测量是基于对一个或多个标记(例如，荧光分子)的激发、和对在所发出荧光中的时间变化的测量。在标记达到激发状态后标记发射光子的概率随时间推移而以指数方式下降。概率下降的速率可以是标记的特性，并且对于不同的标记而言可以是不同的。对由标记所发出光的时间特性的检测可允许对标记进行相互地鉴别和/或对标记进行相互地区分。
在达到激发状态之后，标记可以某个概率在给定的时间发射光子。从被激发标记中发射光子的概率可在标记的激发后随时间推移而下降。随时间推移发射光子的概率下降可用指数衰减函数p(t)＝e^(-t/τ)来表示，其中(t)是在时间t光子发射的概率，τ是标记的时间参数。时间参数τ表示当标记发射光子的概率为某个值时在激发后的时间。时间参数τ是可不同于从其吸收和发射光谱特性的标记的一个特性。这种时间参数τ被称为标记的发光寿命、荧光寿命或者简单地被称为标记的“寿命”。
图1-1标绘了用于具有不同寿命的两个标记的、作为时间的函数的、发射光子的概率。由概率曲线B所代表的标记具有比由概率曲线A所代表的标记的发射概率更快地衰减的发射概率。由概率曲线B所代表的标记具有比由概率曲线A所代表的标记更短的时间参数τ或寿命。在一些实施方式中标记可具有在0.1-20ns范围内的寿命。然而，关于所采用标记的寿命，本文中所描述的技术并不受限制。
标记的寿命可用于在多于一个的标记中进行区分，并且/或者可用于鉴别标记。在一些实施方式中，可执行其中具有不同寿命的多个标记是由激发源所激发的寿命测量。作为一个例子，具有0.5、1、2和3纳秒的寿命的四个标记可分别由发出具有所选择波长(例如，635nm)的光的光源所激发。这些标记可以基于对由标记所发出光的寿命进行测量而相互鉴别或区别。
寿命测量可采用通过对强度如何随时间推移而变化进行比较的相对强度测量，这与绝对强度值相反。因此，寿命测量可避免绝对强度测量中的部分困难。绝对强度测量可取决于所存在标记的浓度，并且对于变化的标记浓度而言会需要校准步骤。相比之下，寿命测量对于标记的浓度会是不敏感的。
本发明的实施方式可利用任何合适的标签特性的组合将一组标签中的第一标签与相同组中的其它标签加以区分。例如，一些实施方式可仅利用来自标签的发射光的定时信息来鉴别标签。在这种实施方式中，在所选择组的标签中各标签具有不同于该组中的其它标签的发射寿命，并且这些发光标签都是由来自单个激发源的光所激发。图1-2A示出了根据一个实施方式的来自四个发光标签的发射定时，其中四个标签显示不同的平均发射寿命(τ)。标签被测量具有特定值的寿命的概率是本文中被称为该标签的“发射定时”。来自第一发光标签的第一发射定时1-101具有峰值概率，该概率具有在τ1处的寿命，来自第二发光标签的第二发射定时1-102具有峰值概率，该概率具有在τ2处的寿命，来自第三发光标签的第三发射定时1-103具有峰值概率，该功率具有在τ3处的寿命，并且来自第四发光标签的第四发射定时1-104具有峰值概率，该功率具有在τ4处的寿命。在此实施方式中，四个发光标签的寿命概率峰可具有满足关系τ1<τ2<τ3<τ4的任何合适的值。由于在特定发光标签的寿命中的略微差异，这四个定时发射图形可以或者可以不重叠，如图1-2A中所示。在此实施方式中，四个标签的每个标签最大地吸收来自激发源的光的激发波长大致相同的，但不必是这种情况。利用上述的标签组，可用来自该标签组的各自标签给四个不同的分子加标记，这些标签可利用单个激发源进行激发，并且这些标签可以通过利用光学系统和传感器来检测标签的发射寿命而相互区分。虽然图1-2A示出了四个不同的标签，但应当理解的是可使用任何合适数量的标签。
其它实施方式可利用任何合适的标签特性的组合来确定在一组标签内的标签的特征。可以采用的标签特性的例子包括但不限于：激发波长、发射波长、和发射寿命。该标签特性的组合形成相空间，并且可将各标签表示为在此相空间内部的一个点。应对一组标签内部的标签加以选择，使得该组内部的各标签之间的“距离”在是充分地大以便检测激机构可以将各标签与中该组中的其它标签加以区分。例如，在一些实施方式中，可对一组的标签进行选择，其中亚组的标签具有相同发射波长但具有不同的发射寿命和/或不同的激发波长。在其它实施方式中，可对一组的标签进行选择，其中一个亚组的标签具有相同的发射寿命但具有不同的发射波长和/或不同的激发波长。在其它实施方式中，可对一组的标签进行选择，其中一个亚组的标签具有相同的激发波长，但具有不同的发射波长和/或不同的发射寿命。
例如但非限制性地，图1-2B示出了根据一个实施方式的来自四个发光标签的发射光谱，其中这些标签中的两个具有第一峰值发射波长并且其它两个标签具有第二峰值发射波长。来自第一发光标签的第一发射光谱1-105具有在λ1处的峰值发射波长，来自第二发光标签的第二发射光谱1-106也具有在λ1处的峰值发射波长，来自第三发光标签的第三发射光谱1-107具有在λ2处的峰值发射波长，来自第四发光标签的第四发射光谱1-108也具有在λ2处的峰值发射波长。在此实施方式中，这四个发光标签的发射峰值可具有满足关系λ1<λ2的任何合适的值。在例如其中对于多于一个的发光标签而言峰值发射波长是相同的的实施方式中，具有相同发射波长的标签的各自特性必须是不同的。例如，在λ1处发出光的可两个标签具有不同的发射寿命。图1-3A示意性地示出了在利用发射波长和发射寿命所划分的相空间中的这种情况。第一标签具有发射波长λ1和发射寿命τ1，第二标签具有发射波长λ1和发射寿命τ4，第三标签具有发射波长λ2和发射寿命τ1，第四标签具有发射波长λ2和发射寿命τ4。因此，在图1-3A中所示的标签组中的所有四个标签可相互区分。利用这种标签组允许在四个标签之间进行区分，甚至当四种染料的吸收波长为相同时。能够使用可以检测光致发光的发射时间以及发射波长的传感器。
例如但不限于，图1-2C示出了根据另一个实施方式的来自四个发光标签的吸收光谱。在此实施方式中，两个标签具有第一峰值吸收波长并且其它两个标签具有第二峰值吸收波长。用于第一发光标签的第一吸收光谱1-109具有在λ3处的峰值吸收波长，用于第二发光标签的第二吸收光谱1-110具有在λ4处的峰值吸收波长，用于第三发光标签的第三吸收光谱1-111具有在λ3处的峰值吸收波长，用于第四发光标签的第四吸收光谱1-112具有峰值吸收波长在λ4。在图1-2C中共有一个吸收峰值波长的这些标签均不可利用其它标签特性(如发射寿命)加以区分。图1-3B示意性地示出了在利用吸收波长和发射寿命所划分的相空间中的这种情况。第一标签具有吸收波长λ3和发射寿命τ1，第二标签具有吸收波长λ3和发射寿命τ4，第三标签具有吸收波长λ4和发射寿命τ1，第四标签具有吸收波长λ4和发射寿命τ4。因此，在图1-3A中所示的标签组中的所有四个标签不能相互区分。
利用这种标签组允许在四个标签之间加以区分，甚至当四种染料的发射波长是不可区分时。能够使用在不同波长处发出光的两个激发源、或者能够在多个波长处发出光的单个激发源连同可以检测光致发光的发射时间的传感器。如果对于各检测的发射事件而言激发光的波长是已知的，那么可以确定哪个标签是存在的。激发源可在第一激发波长与第二激发波长之间变换，这被称为交错。可替代地，可使用第一激发波长的两个或更多的脉冲，然后使用第二激发波长的两个或更多的脉冲。
用于区分标签的激发源或激发波长的数量并不局限于两个，并且在一些实施方式中可利用于多于两个的激发波长或能量来区分各标签。在这种实施方式中，可利用响应于多个激发波长而发出的光子的强度或数量来区分各标签。通过对响应于使标签暴露于某个激发波长而发出的光子的量进行检测，可从多个标签中区分一个标签。在一些实施方式中，通过从多种激发能量中鉴定其中标签发出最高数量光子的激发能量，可区分标签。在其它实施方式中，响应于不同的激发能量而从标签中所发射光子的量可用于鉴定该标签。具有比第二激发能量较高的响应于第一激发能量而发射光子的概率的第一标签可与具有比第一激发能量更高的响应于第二激发能量而发射光子的概率的第二标签相区分。在此方式中，对于具有响应于不同激发能量而发出某些量的光子的可区分概率的标签，可通过测量发出的光子同时使未知的标签暴露于不同激发能量而加以鉴定。在这种实施方式中，可使标签暴露于多个激发能量，并且标签的鉴定可通过确定该标签是否发出任何光和/或发出的光子的量而实现。可使用任何合适数量的激发能量源。在一些实施方式中，可利用四种不同的激发能量在不同的标签(例如，四个不同的标签)中进行区分。在一些实施方式中，可利用三种不同的激发能量在不同的标签中进行区分。可利用标签的其它特性并结合响应于不同激发能量(包括发射寿命和发射光谱)而发出的光子的量，来区分标签的存在。
在其它实施方式中，在一个标签组中各标签的多于两个的特性可用于区分哪个标签是存在的。图1-4示出了利用标签的吸收波长、发射波长和发射寿命所划分的说明性的相空间。在图1-4中，八个不同的标签分布在相空间中。八个标签中的四个具有相同的发射波长，不同的四个标签具有相同的吸收波长并且不同的四个标签具有相同的发射寿命。然而，当对标签的所有三个特性加以考虑时，可将每个标签与每个其它标签加以区分。实施方式并不局限于任意数量的标签。这个概念可以延伸至包括可利用至少这三个标签特性相互区分的任意数量的标签。
虽然在附图中未图示说明，但其它实施方式可仅基于吸收频率来确定发光标签的特征。如果可以将激发光调整到与标签组中的标签的吸收光谱相匹配的特定波长，那么这种实施方式是可行的。在这种实施方式中，用于引导并检测从各标签中所发出光的光学系统和传感器无需能够检测所发出光的波长。在一些实施方式中这会是有利的，因为它降低了光学系统和传感器的复杂性，因为在这种实施方式中不要求检测发射波长。
如上所述，本发明人已认识并意识到能够利用标签的各种特性对不同的发光标签相互间进行区分的需要。用于确定标签特征的特性的类型影响到用于执行此分析的物理装置。本申请公开了用于执行这些不同实验的装置、装置、仪器和方法的若干实施方式。
简略地，本发明人已认识并意识到，具有相对较大数量的像素(例如，数百、数千、数百万或更多)的像素化传感装置使对多个单独分子或颗粒的并行检测成为可能。这种单分子可以是具有标签的核苷酸或氨基酸。在结合到单分子时、当从单分子中释放时、或者在结合到单分子和当从单分子中释放时，对标签进行检测。在一些实例中，标签是发光标签。例如但不限于，这些分子可以是蛋白质和/或核酸(例如，DNA、RNA)。此外，可以以每秒多于100个帧的速率获取数据的高速装置使对在正在进行分析的样品内部随时间推移而发生的动态过程或变化的检测和分析成为可能。
本发明人已认识并意识到，低成本、一次性使用的检测芯片可结合包括激发光源、光学部件和用于测量从生物样品中发出的光学信号(例如，冷光)的光传感器的仪器而使用。使用低成本检测芯片可降低执行给定的生物测定的成本。将生物样品置于检测芯片上，并且当单个生物测定完成时，可将该生物样品丢弃。在一些实施方式中，通过在相同时间将多个样品置于检测芯片的不同部分上，可同时地、并行地对多于一种类型的样品进行分析。检测芯片与更高价的多次使用的仪器相互作用，该仪器可重复地使用于许多不同的一次性检测芯片。可在世界上的任何地方使用与紧凑型便携仪器相互作用的低成本检测芯片，并且没有需要具备实验室专业技能对样品进行分析的高成本生物实验室的约束。因此，可将自动化生物分析带到以前不能执行生物样品的定量分析的世界上的地区。例如，婴儿的验血可通过将血液样品置于一次性检测芯片上，再将一次性检测芯片置于小型便携式仪器中进行分析，并且由连接到仪器的计算机处理结果以便用户立即查看而实施。也可将数据在数据网络上传输至远距离位置进行分析，并且/或者存档以便以后的临床分析。可替代地，该仪器可包括用于对从仪器的传感器中所获得数据进行分析的一个或多个处理器。
下面更详细地描述各种实施方式。
I.根据一些实施方式的装置的概述
图2-1中示出了装置2-100的示意性概略图。该系统包括：检测芯片2-110、及包括激发源2-121和至少一个传感器2-122的仪器2-120。检测芯片2-110利用任何合适的检测芯片接口与仪器2-120相互作用。例如，仪器2-120的检测芯片接口可包括插口(未图示)，该插口是用于接收检测芯片2-110并将芯片保持在与激发源2-110和至少一个传感器2-122精确的光学对准的状态。在仪器2-120中的外部激发源2-121是用于给检测芯片2-110提供激发能量，从而达到激发在检测芯片2-110的样品阱2-111中的样品的目的。在一些实施方式中，检测芯片2-110具有多个像素，各像素的样品阱2-111是用于独立于其它像素而接收分析中所使用的样品。检测芯片2-110的各像素包括样品阱2-211，该样品阱是用于接收、保持和分析来自正在进行分析的试样的样品。这种像素可称为“无源像素”，因为这些像素独立于该像素而接收来自激发源的激发能量。在一些实施方式中，在仪器2-120中存在与存在于检测芯片2-110上的各像素相对应的一个像素。仪器2-120的各像素包括至少一个传感器，该传感器是用于对响应于利用来自激发源2-121的激发能量照射样品而由样品所发出的发射能量。在一些实施方式中，各传感器可包括多个副传感器，各副传感器是用于对来自样品的不同波长的发射能量进行检测。虽然多于一个的副传感器可检测某个波长的发射能量，但各副传感器也可检测不同波长带的发射能量。
在一些实施方式中，用于将激发能量从激发源2-121引导并耦合至样品阱2-111的光学元件是位于检测芯片2-110和仪器2-120上，如图2-1中的箭头2-101所示。这种从激发源到阱的元件可包括：反射镜、透镜、介电涂层、和位于仪器2-120上用于将激发能量耦合到检测芯片2-110和透镜的束组合器、等离子激元元件、和用于将从仪器2-120中所接收的激发能量引导至样品阱2-111的在检测芯片1-110上的介电涂层。此外，在一些实施方式中，用于将发射能量从样品阱2-111引导至传感器2-122的光学元件是位于检测芯片2-110和仪器2-120上，如图2-1中的箭头2-102所示。这种从阱到样品的元件可包括：透镜、等离子激元元件、和用于将发射能量从检测芯片2-110引导至仪器2-120和透镜的位于检测芯片2-110上的介电涂层、反射镜、介电涂层、滤光器、和用于将从检测芯片2-110中所接收的发射能量引导至传感器2-111的在仪器1-120上的衍射光学部件。在一些实施方式中，单个部件可在将激发能量耦合至样品阱和将发射能量从样品阱传递至传感器中都发挥作用。
在一些实施方式中，检测芯片2-110包括多个像素，各像素与在仪器2-120上的其自己的单独样品阱2-111及其自己的相关传感器2-122相关。多个像素可被布置在阵列中，并且可具有任何合适数量的像素。例如，检测芯片可包括大约1,000个像素、10,000个像素、大约100,000个像素、大约1,000,000个像素、大约10,000,000个像素、或大约100,000,000个像素。
在一些实施方式中，仪器2-120包括传感器芯片，该传感器芯片包括被布置为多个像素的多个传感器2-122。传感器芯片的各像素与检测芯片2-110中的一个像素相对应。多个像素可被布置在一个阵列中，并且可具有任何合适数量的像素。在一些实施方式中，该传感器芯片具有与检测芯片2-110相同的数量的像素。例如，该传感器芯片可包括大约10,000个像素、大约100,000个像素、大约1,000,000个像素、大约10,000,000个像素、或大约100,000,000个像素。
仪器2-120经过检测芯片接口(未图示)与检测芯片2-110相互作用。检测芯片接口可包括用于将检测芯片2-110定位和/或对准到仪器2-120以改善激发能量从激发源2-121到检测芯片2-110的耦合的部件。在一些实施方式中，激发源2-121包括被组合到一起以便将激发能量传递至检测芯片2-110的多个激发源。多个激发源可用于产生与不同波长的光相对应的多种激发能量。
仪器2-120包括用于控制仪器操作的用户界面2-125。用户界面2-125是用于允许用户将信息(例如用于控制仪器的运行的命令和/或设置)输入仪器。在一些实施方式中，用户界面2-125可包括按键、开关、表盘、和用于语音命令的传声器。此外，用户界面2-125可允许用户接收关于仪器和/或检测芯片的性能的反馈，例如正确的对准和/或基于来自传感器芯片上的传感器的读出信号所获得的信息。在一些实施方式中，用户界面2-125可利用扬声器提供反馈从而提供听觉反馈，并且利用指示灯和/或显示屏而提供视觉反馈。在一些实施方式中，仪器2-120包括用于与计算装置2-130连接的计算机接口2-124。可使用任何合适的计算机接口2-124和计算装置2-130。例如，计算机接口2-124可以是USB接口或火线接口。计算装置2-130可以是任何通用计算机(例如笔记本电脑、桌上电脑、或平板电脑)、或者移动装置(例如蜂窝电话)。计算机接口2-124促成仪器2-120与计算装置2-130之间的信息通信。用于控制和/或设定仪器2-120的输入信息可经过连接到仪器的计算机接口2-124的计算装置2-130而提供。此外，可由计算装置2-130经过计算机接口2-124接收输出信息。这种输出信息可包括关于仪器2-120的性能的反馈、和基于传感器2-122的读出信号的信息。仪器2-120也可包括用于对从传感器2-122所接收的数据进行分析的处理装置2-123。在一些实施方式中，处理装置2-123可以是通用处理器(例如，中央处理单元(CPU)、现场可编程门阵列(FPGA)、或定制的集成电路(例如专用集成电路(ASIC))。在一些实施方式中，对来自传感器1-122的数据的处理可由处理装置2-123和外部计算装置2-130两者执行。在其它实施方式中，可将计算装置2-130省略，并且对来自传感器2-122的数据的处理可仅由处理装置2-123执行。
当激发源2-121利用激发能量照射检测芯片2-110时，可激发在检测芯片2-110的一个或多个像素内部的样品。在一些实施方式中，用多个标记给试样加标记，并且多个标记(各自与试样内部的不同样品相关)可由发射能量加以鉴别。从样品阱2-111到传感器2-122的路径可包括有助于基于发射能量鉴别多个标记的一个或多个部件。这些部件可使发射能量朝向传感器2-122集中，此外或可替代地可在空间上分离具有不同特征能量因此具有不同波长的发射能量。在一些实施方式中，检测芯片2-110可包括朝向传感器2-122引导发射能量的部件，并且仪器2-120可包括用于在空间上分离不同波长的发射能量的部件。例如，光纤或衍射光学部件可用于该波长的发射能量耦合到空间自由度。传感器或传感器区可容纳多个副传感器，用于检测取决于辐射图形的发射能量的空间分布。发出不同发射能量和/或光谱范围的发光标签可形成不同的辐射图形。传感器或传感器区可对关于可以用于鉴定多个标记中的一个标记的发射能量的空间分布的信息进行检测。
来自样品阱2-110中的样品的发射能量可由传感器2-122进行检测并且被转换成至少一个电信号。这些电信号可沿在仪器2-120的电路中的导线而传输并且由处理装置2-123和/或计算装置2-130进行处理和/或分析。
图2-2是检测芯片2-110的俯视图、和传感器芯片2-260的俯视图，并且示出了在两个芯片的各像素之间的对应性。检测芯片2-110包括多个像素，各像素包括形成于层2-221中的样品阱2-111。层2-221可包含导电材料，包括金属、高度退化掺杂半导体、和石墨烯。在一些实施方式中，层2-221可包括由一种或多种不同类型的材料(例如，金属、半导体、介电材料、绝缘体)所构成的多层。传感器芯片2-260还包括多个像素，各像素包括形成于衬底2-247中或上的传感器2-121。图2-2中的箭头说明了在检测芯片2-110的两个像素与传感器芯片2-260的两个像素之间的对应性。虽然为了清楚起见未图示，但检测芯片2-110的各像素与传感器芯片2-260的一个像素是相关的。
检测芯片2-110和传感器芯片2-260的像素可具有任何合适的尺寸、形状、和布置。在一些实施方式中，检测芯片2-100和传感器芯片2-260的各像素可以矩形或正方形的形状而布置，如图2-2中所示。
图2-3中示出了与检测芯片2-110的单像素和传感器芯片2-260的单像素相关的一些部件的概略图。装置2-100包括检测芯片2-110和仪器2-120两者。在一些实施方式中，检测芯片2-110是被设计用于对单个试样进行分析的一次性芯片。检测芯片2-110包括一层或多层的金属层2-221、一层或多层的介电层2-225、和聚焦元件2-227。在一些实施方式中，金属层2-221包括各层的堆，部分的这些层可包括吸收层。仪器2-120包括一个或多个激发源2-250、至少一个多色反射镜2-230、和传感器芯片2-260，该传感器芯片可包括过滤元件2-241、光谱分选元件2-243、聚焦元件2-245、和在衬底2-247中或上的至少一个传感器2-122。虽然图2-3只示出了检测芯片2-110的单像素和传感器芯片2-260的单像素，但仪器2-120的一些部件(例如激发源2-250、多色反射镜2-230和过滤元件2-241)对于多个像素会是共同的。例如，在一些实施方式中，单激发源2-250和多色反射镜2-230可将激发能量引导至检测芯片2-110的每个像素。
在金属层2-221内部的样品阱2-211形成用于来自试样的样品所进入的样品空间。在一些实施方式中，试样可包括体液，例如血液、尿液或唾液。在样品阱2-211端部的开口可被称为纳米孔。该纳米孔可具有小于由激发源2-250所发出激发能量2-251的波长的宽度。一部分的试样(被称为样品)可进入由样品阱2-211所限定的样品空间。样品可以是任何颗粒、分子、蛋白质、遗传物质或者存在于试样中的任何其它样品。
激发源2-250发出激发能量2-251，该激发能量2-251被朝向样品阱2-211引导以照射样品。在一些实施方式中，激发源2-251可以是为检测芯片2-110的所有像素提供激发能量的单光源。多色反射镜2-230反射来自激发源2-250的光，并且朝向检测芯片2-110的一个或多个样品阱2-211引导激发能量2-251。因此，在一些实施方式中，可只存在朝向所有样品阱引导激发能量的单个多色反射镜2-230，而不是各像素与其自己的多色反射镜相关。类似地，在用于朝向样品阱2-211引导激发能量的其它光学元件之间，可存在一对多的关系。
同心圆光栅2-223可形成于与样品阱2-211的底部纳米孔相邻的位置。该同心圆光栅2-223可从金属层2-221的底面突出。样品阱2-211可位于圆光栅2-223的中心处或附近。样品阱2-211的亚波长尺度的纳米孔和同心圆光栅2-223两者产生场增强效应，该效应增加在样品阱2-211中的激发能量的强度，从而导致激发能量向存在于样品阱2-211中的样品的耦合的增加。至少部分的时间，样品吸收来自激发能量的光子并且用小于激发能量2-251的能量的能量而发射光子(被称为“发射能量”2-253)。可在向下方向上发射发射能量2-253。圆光栅2-223起等离子激元元件的作用，该元件可用于减小发射能量2-253的扩散并且朝向相关的传感器引导发射能量2-253。
发射能量2-253行进经过介电层2-225，该介电层可以是用于使发射能量2-253能够传播一些距离的间隔层。介电层2-225也可为检测芯片2-110提供结构强度。然后，发射能量2-253行进经过一个或多个聚焦元件2-227，该聚焦元件2-227是用于将发射能量2-253进一步引导至在仪器2-120内部的传感器芯片2-2260的相关像素中的传感器2-122。
多色反射镜2-230可传输发射能量2-253并且/或者反射一部分的从检测芯片2-110中所反射的任何激发能量2-251。不被检测芯片2-110所反射的激发光的部分被传输经过检测芯片或者被检测芯片所吸收。为了进一步减小被检测芯片2-110所反射且不被多色反射镜2-230所反射的激发能量2-251的量，可将过滤元件2-241设置在朝向传感器芯片2-260的光学路径中。过滤部件2-241可减小被传感器2-122所检测的激发能量2-251。例如但不限于，过滤元件2-241可包括宽带滤光器、陷波滤光器或边缘滤光器，这些滤光器传输发射能量2-253但吸收和/或反射激发能量2-251。
在一些实施方式中，为了便于利用发射能量2-253的光谱特性来确定在样品阱2-211中的标记的特征，可将光谱分选元件2-243设置在传感器芯片2-260上用以将发射能量2-253的光谱自由度耦合到发射能量2-253行进的方向上。例如，可利用衍射光学元件在第一方向上引导第一波长的发射能量2-253和在第二方向上引导第二波长的发射能量2-253。可利用一个或多个聚焦元件2-245将光谱分选的光引导到传感器2-122上。传感器2-122可包括一个或多个副传感器(未图示)，基于光谱分选元件2-243对不同波长光的重定向每个副传感器与不同波长的发射能量2-253是相关的。在此方式中，一个或多个聚焦元件2-245可形成用于具有不同特征波长的发射能量的不同的分布图形，这些分布图形可使基于发射能量的特征波长对标记的鉴定成为可能。
在其中利用发射能量2-253的寿命来确定样品阱2-211中的标记的特征的实施方式中，传感器2-122可以能够检测何时发射能量的光子被传感器2-122吸收。传感器2-122可以是例如能够将被检测的光子分选入多个时间元中的CMOS器件。可通过检测由多个激发脉冲所导致的多个发射能量光子来确定寿命。
以上的图2-3的描述是根据一些实施方式的装置的部分的但未必是全部的部件的概述。在一些实施方式中，图2-3的一个或多个元件可不存在或者在不同的位置。下面对检测芯片2-210和仪器2-220的部件进行更详细的描述。
检测芯片2-110与仪器2-120可机械地对准、可拆卸地联接并且可相互分离。仪器2-120可包括仪器壳体，在该仪器内部设置安装板。图2-4示出了可被设置在仪器2-120的安装板2-405上的至少部分的部件。可包括印刷电路板的安装板2-405可具有传感器芯片2-260(在图2-4中不可见)、安装到该芯片的散热件2-407和光学壳体2-401。可以将仪器2-120的各种光学部件设置在光学壳体2-401的内部。在一些实施方式中，仪器壳体和安装板可具有任何合适的尺寸和形状。例如，安装板可大致呈圆形，并且具有大约7-8”的直径。检测芯片2-110联接到光学壳体2-401，以确保与光学壳体2-401内部的光学部件的对准。
可使芯片保持架3-102与光学壳体2-401的开口对准。可将检测芯片2-110容纳在芯片保持架2-401中。在一些实施方式中，检测芯片2-110可位于芯片保持架3-102的底侧上，使得芯片保持架3-102相对于仪器2-120的定位使检测芯片2-110位于靠近仪器2-120的芯片保持架3-102的一侧上。芯片保持架3-102可包含任何合适的材料。在一些实施方式中，芯片保持架3-102可包含铁磁性金属(例如，钢)，使得芯片保持架3-102可利用位于光学壳体2-401的表面上的作用是将芯片保持架3-102固定就位的一个或多个磁性部件而与光学壳体2-401的开口对准。
在一些实施方式中，检测芯片2-110可以可拆卸地联接到仪器2-120。可将一个或多个具有任何合适形状和尺寸的磁性部件2-403a、2-403b和2-403c(例如图2-4中所示的磁性滚筒)放置在光学壳体3-401的开口附近，激发能量经过该开口离开光学壳体2-401。此外，可对磁性部件2-403a、2-403b、和2-2-403c进行校准，以便将芯片保持架3-102保持在与该开口对准的状态。可利用磁性部件2-403a、2-403b、和2-2-403c以微米级精度使芯片保持架3-102定位。在一些实施方式中，利用磁性部件2-403a、2-403b、和2-2-403c导致芯片保持架对准。然而，实施方式并不受如此限制，并且可利用任何合适数量的磁性的、弹簧加载的、气动的或者其它这种部件在对准的形态中将芯片固定就位。例如，可利用非磁性元件(例如弹簧)、空气压力、或真空的吸力将芯片保持架3-102固定就位。任选地，芯片保持架3-102可由利用适合于将芯片定位在与聚光装置对准的状态的任何硬质材料所制成。
根据本申请的一些方面，当检测芯片2-110连接到仪器2-120时，在仪器2-120中在检测芯片2-110的样品阱与感器芯片2-260的传感器之间的距离可在期望的距离内，以获得充分水平的系统性能。在一些实施方式中，在样品阱与传感器之间的光学距离可小于30cm、小于10cm、小于5cm、或小于1cm。
II.检测芯片
在一些实施方式中，检测芯片2-110不包括任何有源电子部件。用于各像素的激发源2-250和传感器2-122两者是以芯片外的方式位于仪器2-120中。
在一些实施方式中，可将检测芯片2-110容纳于芯片保持架3-102中，如图3-1A中所示。芯片保持架3-102可以是一次性的，并且在一次使用后可连同检测芯片2-110一起丢弃。检测芯片2-110可位于芯片保持架3-102的底侧上，如图3-1B中所示。芯片保持架3-102可包含任何合适的铁磁性金属(例如钢)，使得被固定到光学壳体2-401的磁性部件2-403a、2-403b和2-403c将芯片保持架3-102和因此检测芯片2-110保持就位。在一些实施方式中，芯片保持架3-102可附接到光学壳体2-401的上表面，如图2-4中所示。
在图3-1C中所示的其它实施方式中，检测芯片2-110可附接到芯片保持架3-102的上表面。塑料盖3-103包围检测芯片2-110，以便利用塑料盖3-103中的开口使检测芯片2-110的像素阵列暴露。检测芯片2-110的用户可将试样置于塑料盖3-103的开口中。通过与检测芯片2-110的上表面接触，可将在试样内部的样品导入检测芯片2-110的多个像素中的一个或多个像素以便分析。在一些实施方式中，通过强制流体流动将样品的各部分传递至像素的流体通道或装置是不必要的。
在一些实施方式中，检测芯片可包括垂直堆叠部件的层。这些部件可包括光学、电、化学、生物化学、和结构元件。在一些实施方式中，对于各像素而言，检测芯片的各层是相同的。接下来的是对单个像素的描述，但根据一些实施方式在检测芯片上的像素阵列中的每个像素可具有完全相同的布置。
A.样品阱层
如在图2-3中和更详细地在图3-2中所示，一些实施方式包括形成于检测芯片2-110的一个或多个像素处的样品阱2-211。一个样品阱可包括形成于金属层2-221内部的小空间或区域，并且布置成使得样品可从沉积于检测芯片2-110的表面上的试样扩散进入样品阱和从样品阱中扩散出。在各种实施方式中，样品阱2-211可布置成接收来自激发源2-250的激发能量。可利用粘附剂3-211将扩散进入样品阱的样品暂时或永久地保持在样品阱的激发区3-215的内部。在激发区中，可利用激发能量(例如，激发光3-245)激发样品随后发出能量，可对该能量进行观察和评估以便鉴定样品。
在更详细的操作中，例如可从含有样品的流体悬浮液的试样(未图示)中，将至少一个被分析的样品3-101导入样品阱2-211。来自仪器2-120中的激发源2-250的激发能量3-245可激发样品或者附接到样品或与样品相联的同时样品是在在样品阱内部的激发区3-215内的至少一个标签(也被称为生物标记、报道基因、或探针)。根据一些实施方式，标签可以是发光分子(例如，发光标签或探针)或量子点。在一些实施例中，可存在用于对样品进行分析的多于一个的标签(例如，用于单分子基因测序的不同标签，如在J.Eid等人所发表的“基于单聚合酶分子的实时DNA测序”中所描述，Science 323，第133页(2009年)，该文献的内容以参考的方式并入本文中)。在激发期间和/或之后，样品或标签可发出发射能量。当使用多个标签时，它们可以不同的特征能量(因此具有不同的波长)发射并且/或者以不同的时间特性反射。在一些实施方式中，发射能量可包括任意数量的波长，例如两个、三个、四个、五个、六个、七个、或八个的不同波长。来自样品阱2-211的发射可辐射到在仪器2-120上的传感器2-122，其中这些发射被检测并被转换成可以用于鉴定样品的电信号。
根据一些实施方式，样品阱2-211可以是部分封闭的结构，如图3-2中所示。在一些实施例中，样品阱2-211包括形成于至少一层的材料2-221中的亚微米级的孔或开口(用至少一个横向尺寸Dsw表征)。根据一些实施方式该样品阱的横向尺寸可在大约20纳米和大约1微米之间，尽管在一些实施例中可采用更大和更小的尺寸。在一些实施例中，样品阱2-211的容积可在约10-21升和约10-15升之间。样品阱可形成为可或可以不支持传播模式的波导。在一些实施方式中，样品阱可形成为具有圆柱形形状(或类似形状)的零模式波导(ZMW)，该圆柱形具有直径(或最大横向尺度)Dsw。ZMW可以以纳米级孔的形式而形成于单金属层中，该纳米级孔不支持经过孔的传播光学模式。
因为样品阱2-211具有小容积，所以在各像素处对单样品事件(例如，单分子事件)的检测可以是可行的，即使可将样品以类似于在天然环境中所发现浓度的浓度集中在被检查试样中。例如，微摩尔浓度的样品可存在于被置于与检测芯片接触的试样中，但只在像素级附近。测定2-110的样品阱的尺寸被设计成使得在统计学上它们最有可能不容纳样品或者容纳一个样品，从而可执行单分子分析。例如，在一些实施方式中，30-40％的样品阱容纳单个样品。然而，样品阱可容纳多于一个的样品。因为可在各像素处对单分子或单样品事件进行分析，所以检测芯片能够检测在整体平均测量中会被忽视的罕见事件。
样品阱的横向尺寸Dsw在一些实施方式中可在约500纳米(nm)和约1微米之间，在一些实施方式中是在约250nm和约500nm之间，在一些实施方式中是在约100nm和约250nm之间，在一些实施方式中是在约20nm和约100nm之间。样品阱的横向尺寸可为大约100nm、大约130nm、或大约190nm。根据一些实施例，样品阱的横向尺寸是在大约80nm和大约180nm之间、或者在激发波长或发射波长的大约四分之一和八分之一之间。根据其它实施例，样品阱的横向尺寸是在大约120nm和大约170nm之间。在一些实施方式中，样品阱2-211的深度或高度可在约50nm和约500nm之间。在一些实施例中，样品阱2-211的深度或高度可在约80nm和约200nm之间。形成样品阱2-211的材料2-221的层可具有大约50nm、大约100nm、大约150nm、大约200nm、或大约250nm的厚度或高度。
具有亚波长横向尺寸的样品阱2-211可以以至少两种方式改进检测芯片2-110的像素2-100的操作。例如，与试样相对侧入射到样品阱上的激发能量3-245可用以指数方式减小的功率而耦合入激发区3-215中，并且不经过样品阱传播至试样。因此，激发能量在其中激发能量激发感兴趣样品的激发区中增加，并且在其中激发能量可以激发将会导致背景噪声的其它样品的试样中减小。另外，来自被保持在阱的基部的样品的发射优选地被朝向在仪器2-120上的传感器的而引导，因为发射不能经过样品阱向上传播。这两个效应都可以提高在像素处的信噪比。本发明人已认识到，可以改进样品阱的若干方面从而进一步提高在像素处的信噪比。这些方面与阱形状和结构、及相对于相邻的光学和等离子激元结构(下面描述)的放置有关，该等离子激元结构有助于将激发能量耦合到样品阱和来自样品阱的发出能量。
根据一些实施方式，样品阱2-211可形成为不支持传播模式的亚截止纳米孔(SCN)。例如，样品阱2-211可包括在导电层2-221中的圆柱形形状的孔或内孔。样品阱的截面无需是圆形的，在一些实施方式中可以是椭圆形、正方形、矩形、或多边形。激发能量3-245(例如，可见或近红外辐射)可经过在阱的第一端由样品阱2-211的壁3-214所限定的入口3-212而进入样品阱，如图3-2中所示。当形成为SCN时，激发能量3-245可沿SCN以以指数方式衰减。在一些实施例中，波导可包括用于从样品中所发出能量的SCN，但也可以不是用于激发能量的SCN。例如，孔口和由样品阱所形成的波导大到足以以支持用于激发能量的传播模式，因为该激发能量可具有比所发出能量更短的波长。在较长波长处的发射可超过用于在波导中的传播模式的截止波长。根据一些实施方式，样品阱2-211可包含用于激发能量3-245的SCN，使得最大强度的激发能量在样品阱2-211的入口被集中到样品阱的激发区3-215(例如，被集中于在层3-235和层2-221之间的界面附近，如图3-2中所示)。激发能量的这种集中可以增加来自样品的发射能量密度，并且进一步将激发能量局限在入口3-212附近，由此限制向单样品(例如，单分子)的被观察的发射。
图3-3中示出了在包括SCN的样品阱入口附近的激发集中的一个实例。执行数值模拟以确定在形成为SCN的样品阱2-211内部和附近的激发能量的强度。结果表明，激发能量的强度在样品阱的入口处约为入射能量的70％并且在样品阱中的约100nm内下降至入射强度的约20％。为了该模拟，激发能量的特征波长为633nm并且样品阱2-211的直径为140nm。样品阱2-211是形成于金金属的层中。在图形中的各水平部分为50nm。如该图形所示，多于一半的在样品阱中所接收激发能量被集中到在样品阱2-211的入口3-212内部的约50nm。
为了提高被集中在样品阱2-211处的激发能量的强度，本发明人开发并研究了其它样品阱结构。图3-4示出了包括在样品阱2-211的激发端的空腔或凹坑3-216的样品阱的一个实施方式。如在图3-3的模拟结果中可见，较高激发强度的区域存在于样品阱的入口2-212的前面。根据一些实施方式，将凹坑3-216加入到样品阱2-211允许样品移动进入较高激发强度的区域。在一些实施例中，该凹坑的形状和结构改变局部激发场(例如，由于在层3-235与样品阱中试样的流体之间的折射率的差异)，并且可以进一步增加在凹坑中激发能量的强度。
凹坑可具有任意合适的形状。凹坑可具有大致相当于样品阱的横向形状的横向形状，例如圆形、椭圆形、正方形、矩形、多边形等。在一些实施方式中，凹坑的侧壁可以是大体上平直且垂直的，类似于样品阱的壁。在一些实施例中，凹坑的侧壁可以是倾斜和/或弯曲的，如在附图中所示。凹坑的横向尺寸在一些实施方式中可以是与样品阱的横向尺寸大致相同的尺寸，在一些实施方式中可小于样品阱的横向尺寸，或者在一些实施方式中可大于样品阱的横向尺寸。凹坑3-216可延伸超过样品阱的金属层2-221达在大约10nm和大约200nm之间的距离。在一些实施例中，凹坑可延伸超过样品阱的金属层2-221达在大约50nm和大约150nm之间的距离。通过形成凹坑，激发区3-215可延伸到样品阱的金属层2-221的外部，如图3-4中所示。
图3-5示出了在包含凹坑的样品阱的激发区处的激发能量的提高(在左边的模拟图像中示出)。为了比较，也模拟了在右边所示出的没有凹坑的样品阱的激发场。场量值已从这些图中的显色指数中进行了转换，并且在凹坑的基部的暗区显示比在样品阱内部的光区更高的强度。在样品阱上方的暗区显示最低的强度。正如可以可见的，凹坑允许样品3-101移动到较高激发强度的区域，并且凹坑也增加在样品阱的激发端处最高强度区域的集中。应注意，就没有凹坑的样品阱而言，高强度的区域有更多的分布。在一些实施方式中，凹坑3-216提供达两倍以上的在激发区处的激发能量的增加。在一些实施例中，基于凹坑的形状和深度，可以获得多于两倍的增加。在这些模拟中，样品阱包括厚度为100nm的一层Al，具有深度为50nm的凹坑，具有在635nm波长处的激发能量。
图3-6示出了样品阱2-211的另一个实施方式，其中包括凹坑3-216的样品阱是形成于在衬底表面处的突起部3-615的上方。与图3-2中所示的样品阱相比，所形成的用于样品阱的结构可增加在样品处的激发能量达大于两倍，并且可将来自样品阱发射的朝向仪器2-120中的传感器引导。根据一些实施方式，在材料的第一层3-610中使突起部3-615图案化。在一些实施例中该突起部可形成为圆形的台基或者具有矩形截面的脊部，并且可使材料第二层3-620沉积在第一层和突起部的上方。在突起部处，第二层可在突起部上方形成近似于圆柱形部3-625的形状，如图中所示。在一些实施方式中，可使导电层3-230(例如，反射金属)沉积在第二层3-620的上方并且被图案化，从而在突起部上方的导电层中形成样品阱3-210。然后，可将凹坑3-216蚀刻入第二层中。该凹坑可在导电层3-230下面延伸达在约50nm和约150nm之间的距离。根据一些实施方式，第一层3-610和第二层3-620可以是光学透明的，并且可或可以不由相同的材料所构成。在一些实施例中，第一层3-610可由氧化物(例如，SiO2)或氮化物(例如，Si3N4)构成，第二层3-620可由氧化物或氮化物构成。
根据一些实施方式，在突起部3-625上方的导电层3-230的形状被设计成大致与球形反射器3-630相同。通过对突起部高度h、突起部的直径或横向尺寸w、和第二层3-620的厚度t的选择，可控制该球形部的形状。基于圆柱形反射器的光学焦点或者通过对凹坑深度d的选择，可以调整激发区的位置和样品的位置。可意识到，球形反射器3-630可以将激发能量集中在激发区3-215，并且也可以收集从样品中发出的能量并将辐射朝向传感器3-260反射和集中。
如上所述，样品阱可以任意合适的形状而形成，并且不只限于圆柱形形状。在一些实施例中，样品阱可以是圆锥形、四面体、五面体等。图3-7A至图3-7F示出了在一些实施方式中可采用的一些示范性样品阱形状和结构。根据一些实施方式，样品阱2-211可形成具有大于用于激发能量的第二孔口3-218的第一孔口3-212。样品阱的侧壁可以是锥形或弯曲的。以这种方式形成样品阱可以允许更多的激发能量进入激发区，但仍然明显地减小朝向试样行进的激发能量。此外，由于在该方向上的有利的能量传递。因而由样品所发射的辐射可优先地利用较大的孔口朝向样品阱的端部辐射。
在一些实施方式中，凹坑3-216可具有比样品阱基部更小的横向尺寸，如图3-7B中所示。在蚀刻凹坑随后去除牺牲层之前，可由带牺牲层的样品阱的涂层侧壁形成较小的凹坑。可形成较小的凹坑以便将样品保持在与样品阱的导电壁更加等距离的区域中。将样品保持在与样品阱的壁等距离可减小在辐射样品时对样品阱壁的不良作用，例如发射的淬灭和/或辐射寿命的改变。
图3-7C和图3-7D示出了样品阱的另一个实施方式。根据此实施方式，样品阱2-211可包括激发能量增强结构3-711、和形成于与该激发能量增强结构相邻位置的粘附剂3-211。根据一些实施方式，能量增强结构3-711可包括形成于在光学透明层3-235上的导电材料中的表面等离子激元元或纳米天线结构。图3-7C示出了样品阱2-211和附近结构的正视图，图3-7D示出了平面视图。激发能量增强结构3-711的形状可被设计并且被布置成增加在小集中存在区中的激发能量。例如，这些结构可包括在样品阱处具有锐角的尖的导体，这些导体增加在激发区3-215内部的激发能量的强度。在图示的实例中，激发能量增强结构3-711是采用蝴蝶结的形式。扩散进入该区域中样品3-101可暂时地或永久地被粘附剂3-211所保持并且被可从位于仪器2-120中的激发源2-250中传递出的激发能量所激发。根据一些实施方式，激发能量可驱动在能量增强结构3-711中的表面等离子激元元电流。所形成的表面等离子激元元电流可在结构3-711的尖锐点处产生高电场，并且这些高电场可激发被保持在激发区3-215中的样品。在一些实施方式中，图3-7C中所示的样品阱2-211可包括凹坑3-216。
图3-7E中示出了样品阱的另一个实施方式，并且示出了沿样品阱2-211的内壁所形成的激发能量增强结构3-720。激发能量增强结构3-720可包含金属或导体，并且利用倾斜(或阴影)定向沉积而形成，其中在沉积期间使在其上形成有样品阱的衬底发生旋转。在沉积期间，样品阱2-211的基部被阱的上壁所掩盖，使得沉积的材料不堆积在基部。所形成的结构3-720可在该结构的底部形成锐角3-722，并且导体的此锐角可以增加在样品阱内部的激发能量。
在如图3-7E中所示的实施方式中，其中构成样品阱的材料3-232无需是导体，并且可以是任何合适的材料，例如介电材料。根据一些实施例，样品阱2-211和激发能量增强结构3-720可形成于被蚀刻入介电层3-235中的盲孔处，并且无需使单独的层3-232沉积。
在一些实施例中，可随后在图3-7E中所示的结构上执行阴影蒸发从而使金属或导电能量增强结构(例如梯形结构或尖圆锥体)沉积在样品阱的基部，如由虚线所表示。该能量增强结构可利用表面等离子激元元增强阱内部的激发能量。在阴影蒸发之后，可执行平坦化工艺(例如，化学机械抛光步骤或者等离子体蚀刻工艺)以去除或回蚀在样品阱顶部的沉积材料，同时使能量增强结构留在在阱内部。
在一些实施方式中，样品阱2-211可由多于一层的金属层所形成。图3-7F示出了形成于多层结构中的样品阱，其中不同材料可用于不同的层。根据一些实施方式，样品阱2-211可形成于第一层3-232(该层可以是半导体或导电材料)、第二层3-234(该层可以是绝缘体或介电体)、和第三层2-221(该层可以是导体或半导体)中。在一些实施方式中，退化掺杂的半导体或石墨烯可用于样品阱的层。在一些实施例中，样品阱可形成于两层中，并且在其它实施例中样品阱可形成于中四个或更多的层中。在一些实施方式中，可对用于形成样品阱的多层材料进行选择，以增加在样品阱基部的表面等离子激元元产生或者抑制在阱顶部的表面等离子激元元辐射。在一些实施方式中，可对用于形成样品阱的多层材料进行选择，从而抑制激发能量传播超过样品阱和多层结构进入主体试样。
在一些实施方式中，可对用于形成样品阱的多层材料进行选择，以增加或抑制可利用入射到样品阱上的激发能量所产生的界面激子。例如，多激子例如双激子和三激子可在与样品阱相邻的两个不同的半导体层之间的界面处产生。样品阱可形成于金属层和第一半导体层两者中，使得在第一半导体层与第二半导体层之间的界面是在样品阱的激发区3-215处。界面激子可具有比在单半导体层的空间内部的激子更长的寿命，从而增加激子将利用FRET或DET而激发样品或标签的可能性。在一些实施方式中，可激发多激子的至少一个量子点可附接到样品阱的底部(例如，利用连接分子)。在量子点处所激发的激子也可具有比在单半导体层的空间内部的激子更长的寿命。根据一些实施方式，在量子点处所产生的界面激子或激子可增加FRET或DET的速率。
各种材料可用于形成在前述实施方式中所描述的样品阱。根据一些实施方式，样品阱2-211可以由至少一层的材料2-221所构成，该材料2-221可包括导电材料、半导体、和绝缘体中的任一个或组合。在一些实施方式中，样品阱2-211包括高导电金属层，例如金、银、铝、铜。在一些实施方式中，层2-221可包括包含金、银、铝、铜、钛、氮化钛、和铬中的任一个或组合的多层堆。在一些实施例中，此外或可替代地，可使用其它金属。根据一些实施方式，样品阱可包含合金，例如AlCu或AlSi。
在一些实施方式中，多层的不同的金属或合金可用于形成样品阱。在一些实施例中，其中构成样品阱2-211的材料可包括金属和非金属的交替层，例如金属与一种或多种介电体的交替层。在一些实施方式中，非金属可包括聚合物，例如聚乙烯基膦酸或者聚乙二醇(PEG)-巯基。
根据一些实施方式，可使其中形成样品阱的层2-221沉积在至少一个光学透明层3-235上或者与该光学透明层相邻，以便激发能量(例如，采用可见或近红外辐射的形式)和发射能量(例如，采用可见或近红外辐射的形式)可在没有明显衰减的情况下行进到样品阱2-211和从样品阱2-211中行进出。例如，来自激发源2-250的激发能量可通过至少一个光学透明层3-235到达激发区3-215，并且来自样品的发射可通过相同的一层或多层而到达传感器2-250。
在一些实施方式中，可用影响在样品阱内部的样品的作用的一个或多个层3-211、3-280的材料对样品阱2-211的至少一个表面进行涂布，如图3-8中所示。例如，可使薄介电层3-280(例如，氧化铝、氮化钛、或氧化硅)以钝化涂层的形式沉积在样品阱侧壁上。可应用这种涂层以减小样品在激发区3-215外部的样品粘附，或者减小在样品与其中构成样品阱2-211的材料2-221之间的相互作用。根据一些实施方式，在样品阱内部的钝化涂层的厚度可在约5nm和约50nm之间。
在一些实施例中，可基于用于该材料的化学剂的亲和性对用于涂层3-280的材料进行选择，以便可用化学或生物物质对层3-280进行处理从而进一步阻止样品原子团对该层的粘附。根据一些实施方式，例如，涂层3-280可包含氧化铝，可利用聚膦酸酯钝化层使该氧化铝钝化。在一些实施方式中，可使用另外的或替代的涂层和钝化剂。
根据一些实施方式，可用化学或生物粘附剂3-211(例如，生物素)对至少样品阱2-211和/或凹坑3-216的底面进行处理，从而促进样品的保持。可永久地或暂时地保持样品例如达至少在约0.5毫秒和约50毫秒之间的时间段。在另一实施方式中，粘附剂可促进于样品3-101的暂时保持达更长的时间段。在各种实施方式中可使用任何合适的粘附，并且不局限于生物素。
根据一些实施方式，可基于粘附剂对该层材料的亲和性，对与样品阱相邻的材料3-235的层进行选择。在一些实施方式中，样品阱侧壁的钝化可阻止粘附剂在侧壁上的涂布，以便粘附剂3-211优先地沉积在样品阱的基部。在一些实施方式中，粘附剂涂层可向上延伸到一部分的样品阱的侧壁。在一些实施例中，可利用各向异性物理沉积工艺(例如，蒸发、溅射)使粘附剂沉积，使得粘附剂堆积在样品阱或凹坑的基部并且不明显地形成于样品阱的侧壁上。
可草原各种制造技术来制造用于检测芯片的样品阱2-211。下面描述了几种示范性工艺，但本发明并不只局限于这些实例。
可利用任何合适的微米或纳米制造工艺形成样品阱2-211，该工艺可包括但不限于：与光刻、深紫外光刻、浸入式光刻、近场光学接触光刻、EUV光刻、X-射线光刻、纳米压印、干涉光刻、步进快闪式光刻、直接写入电子束光刻、离子束光刻、离子束铣、剥离工艺、反应性离子蚀刻、选择性外延、分子自组装、有机合成等相关的工艺步骤。根据一些实施方式，可利用光刻和剥离工艺形成样品阱2-211。图3-9A至图3-9E中示出了与样品阱的剥离工艺相关的示范性制造步骤。尽管通常在附图中示出了在一个像素处仅单个样品阱或结构的制造，但应当理解的是可在衬底上(例如，在各像素处)并行地制造大量的样品阱或结构。
根据一些实施方式，在衬底上的层3-235(例如，氧化物层)可用防反射涂层(ARC)层3-910和光刻胶3-920加以覆盖，如图3-9A中所示。可使光刻胶3-920暴露，并且利用光刻和抗蚀剂的显影使其图案化。可使光刻胶3-920显影以去除暴露部分或未暴露部分(基于抗蚀剂类型)，从而留下具有大致等于样品阱的期望直径的直径的柱3-922，如图3-9B中所示。柱3-922的高度可大于样品阱的期望深度。
可利用各向异性反应性离子蚀刻(RIE)将柱3-922的图案转移到ARC层3-910，例如图3-9C中所示。然后，可用至少一种材料2-221(例如导体或金属)对期望形成样品阱的区域进行涂布。一部分的沉积的一种或多种材料在柱3-922的上方形成盖3-232，如图3-9D中所示。然后，可利用选择性去除工艺(例如，在搅拌和不搅拌的情况下使用化学浴，该化学浴至少将抗蚀剂溶解并释放或“剥离”盖)，将光刻胶3-920和ARC层3-910从衬底上剥去。如果ARC层3-910仍然存在，则可利用选择性蚀刻将其从衬底上剥去，从而留下品阱3-210，如图3-9E中所示。根据一些实施方式，由于至少一种材料2-221的沉积的性质，因而样品阱的侧壁3-214可以是倾斜的。
本文中所使用的“选择性蚀刻”表示其中蚀刻剂选择性地以比蚀刻剂蚀刻不打算去除的其它材料更高的速率(例如，至少两倍的速率)蚀刻期望去除或蚀刻的一种材料的蚀刻工艺。
因为抗蚀剂和ARC层通常是基于聚合物的，所以一般认为它们是软质材料，该材料可能不适于形成具有高高宽比(例如，就高度/宽度而言大于约2：1的高宽比)的样品阱。就具有较高的高宽比的样品阱而言，在剥离工艺中可包括硬质材料。例如，在使ARC层和光刻胶沉积之前，可使硬质(例如，无机)材料的层沉积。在一些实施方式中，可以使一层的钛或氮化硅沉积。该硬质材料层应显示在其中构成样品阱的一种或多种材料2-221上方的优先蚀刻。在使光刻胶图案化之后，可将柱的图案转移进入ARC层和在下面的硬质材料3-930，从而获得如图3-9F中所示的结构。然后，可将光刻胶和ARC层剥去，使材料2-221沉积，并执行剥离步骤从而形成样品阱。
根据一些实施方式，可利用剥离工艺形成包括能量增强结构3-711的样品阱，如图3-7C和图3-7D中所示。
图3-10A至图3-10D中示出了用于形成样品阱的一个替代工艺。在此工艺中，可将样品阱直接地蚀刻入至少一种材料3-236中。例如，可使其中形成样品阱的至少一种材料3-236沉积在衬底3-325上。可用ARC层3-910和光刻胶3-920将该层覆盖，如图3-10A中所示。可使光刻胶图案化从而形成具有大致等于样品阱的期望直径的直径的孔，如图3-10B中所示。可利用各向异性反应性离子蚀刻将孔的图案转移到ARC层并且经过层3-230，如图3-10C中所示例如。可将抗蚀剂和ARC层剥去，从而获得样品阱，如图3-10D中所示。根据一些实施方式，通过蚀刻进入材料3-230的层所形成的样品阱的侧壁可比基于剥离工艺所形成的侧壁更加垂直。
在一些实施方式中，光刻胶和ARC层可用于在材料3-236上方形成硬掩膜(例如，氮化硅或氧化物层，未图示)。然后，可将图案化的孔转移到硬掩膜，然后利用该孔将图案转移进入材料2-221的层。硬掩膜可允许更大的进入材料2-221的层蚀刻深度，从而形成较高高宽比的样品阱。
应理解的是，当利用多层的不同材料而形成其中构成样品阱的材料的堆时，可利用上述的剥离工艺和直接蚀刻制造技术而形成样品阱。图3-11中示出了一个示范性堆。根据一些实施方式，材料的堆可用于形成样品阱，从而改进激发能量向样品阱激发区的耦合，或者减小激发能量进入主体试样的传输或再辐射。例如，可使吸收层3-942沉积在第一层3-940的上方。该第一层可包含金属或金属合金，吸收层可包含抑制表面等离子激元元的材料，例如非晶硅、TaN、TiN、或Cr。在一些实施例中，也可使表面层3-944沉积从而使在样品阱周围的表面钝化(例如，阻止分子的粘附)。
包括凹坑3-216的样品阱的形成可以任何合适的方式而完成。在一些实施方式中，通过进一步蚀刻进入相邻的层3-235、和/或与样品阱相邻的任何介于中间的一层或多层，可形成凹坑。例如，在材料2-221的层中形成样品阱之后，可将该层2-221用作用于使凹坑图案化的蚀刻掩膜，如图3-12中所示。例如，可使该衬底经历选择性各向异性反应性离子蚀刻，以便可将凹坑3-216蚀刻进入相邻的层3-235中。例如，在其中材料2-221是金属的且相邻的层3-235是氧化硅的一个实施方式中，具有包含CHF3或CF4的进料气体的反应性离子等离子体蚀刻可用于优先地去除在样品阱下方的暴露的氧化硅并形成凹坑3-216。本文中所使用的“氧化硅”通常是指SiOx并且可包括例如二氧化硅。
在一些实施方式中，可对在蚀刻期间在等离子体内部的状态(例如，向衬底的偏移和压力)加以控制以确定凹坑3-216的蚀刻曲线。例如，在低压(例如，小于约100mTorr)和高DC偏移(例如，大于约20V)下，蚀刻可以是高度各向异性的并且形成大致平直且垂直的凹坑侧壁，如附图中所示。在较高压力和较低偏移下，蚀刻会是更加各向同性的，从而获得凹坑的锥形和/或弯曲的侧壁。在一些实施例中，可利用湿法蚀刻形成凹坑，该凹坑可以是大体上各向同性的并且形成大致为球形的凹坑，该凹坑可在材料2-221下方侧向地延伸高达或超过样品阱的侧壁。
图3-13A至图3-13C示出了可用于形成具有比样品阱2-211更小的横向尺寸的凹坑3-216(例如，类似于图3-7B中所示的凹坑)的工艺步骤。在一些实施例中，在形成样品阱之后，可使共形的牺牲层3-960沉积在包括样品阱的区域的上方。根据一些实施方式，可利用气相沉积工艺(例如化学气相沉积(CVD)、等离子体增强CVD、或原子层沉积(ALD))使牺牲层3-960沉积。然后，可利用对于牺牲层3-960为选择性的第一各向异性蚀刻对牺牲层进行回蚀，从水平的表面去除该层，在样品阱的壁上留下侧壁涂层3-962，如图3-13B中所示。该回蚀在一些实施方式中可以是选择性的并且停留在材料2-221和相邻层3-235上，或者在一些实施方式中可以是非选择性的定时蚀刻。
可以执行对相邻层3-235为选择性的第二各向异性蚀刻，从而将凹坑3-216蚀刻进入相邻的层，如图3-13C中所示。然后，可任选地利用选择性湿法或干法蚀刻将牺牲侧壁涂层3-962去除。侧壁涂层的去除打开了样品阱从而具有比凹坑3-216更大的横向尺寸。
根据一些实施方式，牺牲层3-960可包含与相邻层3-235相同的材料。在这种实施方式中，当凹坑被蚀刻进入相邻的层3-235时，第二蚀刻可去除至少部分的侧壁涂层3-962。在一些实施方式中，这个侧壁涂层的回蚀可以形成凹坑的锥形侧壁。
在一些实施例中，牺牲层3-960可由形成或包括是用于使样品阱的侧壁钝化(例如，减小样品在样品阱侧壁处的粘附)的一层的材料。然后，在凹坑形成后，至少部分的层3-960可留在样品阱的壁上。
根据一些实施方式，侧壁涂层3-962的形成是发生在凹坑形成之后。在这种实施方式中，层3-960覆盖凹坑的侧壁。这种工艺可用于使凹坑的侧壁钝化并且使样品集中存在于凹坑的中心。
将与使粘附剂3-211沉积在品阱2-211的基部和钝化层3-280相关的工艺步骤示于图3-14A至3-14D。根据一些实施方式，样品阱可包括在样品阱壁上的第一钝化层3-280。例如，可以如上面结合图3-13B或图3-8所描述的方式而形成第一钝化层。在一些实施方式中，可利用任何合适的沉积工艺和回蚀而形成第一钝化层3-280。在一些实施方式中，通过将其中形成样品阱的材料3-230氧化，可形成第一钝化层。例如，样品阱可以由铝构成，可将该铝氧化从而在样品阱的侧壁上形成氧化铝的涂层。
可以利用各向异性物理沉积工艺(例如蒸发沉积)使粘附剂3-980或粘附剂前体(例如，优先地与粘附剂结合的材料)沉积在衬底上，如图3-14A中所示。粘附剂或粘附剂前体3-980可在样品阱的基部形成粘附层3-211，如图3-14B中所示，并且可涂覆其中形成样品阱的材料2-221的上表面。图3-14C中所示的随后的倾斜定向沉积(有时被称为阴影沉积或阴影蒸发工艺)可用于使第二钝化层2-280沉积在材料2-221的上表面上方并且不覆盖粘附层3-211。在阴影沉积工艺期间，可使衬底围绕垂直于衬底的轴线而旋转同时使钝化层前体3-990沉积，以便第二钝化层3-280更均匀地沉积在样品阱的上缘附近。图3-14D中示出了根据一些实施方式的所形成的结构。作为使第二钝化层沉积的替代，可利用平坦化蚀刻(例如，CMP步骤)从材料3-230的上表面去除粘附剂。
根据一些实施例，可使粘附层3-211中心地沉积在锥形样品阱的基部，如图3-15中所示。例如，可使粘附剂或粘附剂前体定向地沉积在以如上所述方式所形成的锥形样品阱中，如图3-14A中所示。在相邻层3-211的沉积之前或之后，可利用氧化工艺使样品阱的壁钝化。可以如结合图3-14D所描述的方式，使停留在材料2-221的表面上的粘附剂或前体钝化。在一些实施方式中，可利用化学机械抛光步骤去除在材料2-221的上表面上的粘附剂。通过中心地在样品阱的基部形成粘附层或粘附剂前体，可减小对来自样品的发射的有害作用(例如，对来自样品壁的样品辐射的抑制或淬灭、不利的来自样品的辐射分布因为样品并非相对于形成于样品阱周围的能量耦合结构中心地定位、对样品的发光寿命的负面影响)。
在一些实施方式中，用于形成样品阱和凹坑的剥离图案化、蚀刻和沉积工艺与用于在传感器芯片上形成CMOS集成电路的CMOS工艺可以是相容的。因此，利用常规的CMOS设备和制造技术来制造传感器，尽管在一些实施例中可使用定制的或专用的制造设备。
上述工艺步骤的变化可用于构成样品阱的替代实施方式。例如，如图3-7A或图3-7B中所示的锥形样品阱可利用图3-14C中所示的倾斜沉积工艺而形成。就图3-7B的样品阱而言，在沉积工艺期间可改变沉积的角度。就这种实施方式而言，可首先形成具有大体上平直且垂直侧壁的样品阱，然后利用倾斜沉积使另外的材料2-221沉积从而使形样品阱的侧壁形成锥形。
B.将激发能量耦合到样品阱
如图2-1和图2-3中所示，利用仪器2-120的部件和检测芯片2-110的部件，将来自激发源2-250的激发能量2-251引导至样品阱2-211。此段落描述了检测芯片2-110的部件，这些部件可有助于将激发能量2-251耦合到样品阱2-211。
通过在样品阱内部和/或与样品阱相邻的位置形成激发耦合结构，可改进或影响从激发源向样品阱的能量耦合。在一些实施方式中激发耦合结构可包括被制造在样品阱附近的微米或纳米尺度结构，或者在一些实施方式中可包括形成于样品阱处的结构或颗粒。激发耦合结构在一些实施例中会影响样品的辐射激发，并且在一些实施例中会影响样品的非辐射激发。在各种实施方式中，辐射激发耦合结构可增加在样品阱的激发区内部的激发能量的强度。非辐射激发耦合结构可改进和/或改变从激发源(可以是辐射性的或非辐射的)到样品的非辐射能量传递路径。
C.辐射激发耦合结构
存在一些不同类型的可用于影响从激发源向在样品阱内部的激发区的激发能量的耦合的辐射激发耦合结构。一些辐射耦合结构可由导体(例如，包括金属层)所构成，并且支持表面等离子激元元振荡，该振荡局部性地影响在样品阱附近和/或在样品阱内部的激发能量(例如，局部性地改变电磁场)。在一些情况下，表面等离子激元结构可增加在样品阱的激发区内部的激发能量达两倍以上。一些辐射耦合结构可改变激发场的相位和/或幅值，从而增加在样品阱内部的激发能量。在此段落中描述了辐射激发耦合结构的各种实施方式。
图4-1A仅示出了可用于增加激发能量进入样品阱的耦合的表面等离子激元结构4-120的一个实例。该附图示出了在表面等离子激元结构4-120附近的区域的平面视图，并且示出了在该结构附近电场强度的数值模拟的结果。附图示出了包括具有位于非常靠近样品阱(未图示)的尖锐顶点的三个三角形特征的表面等离子激元结构。根据一些实施方式，表面等离子激元结构可包含金属或导体(例如，以下金属或金属合金的任一个或组合的图案化薄膜：Al、Au、Ag、Ti、TiN)。在一些实施方式中，膜的厚度可在大约10nm和大约100nm之间，尽管在其它实施方式中可采用其它厚度。在一些实施方式中，表面等离子激元结构可包括位于非常靠近样品阱(例如，在约100nm内)的尖锐特征4-110。
图4-1B示出了在虚线处所截取的图4-1A的表面等离子激元结构的截面正视图。该模拟示出了与表面等离子激元结构的三角形顶点相邻的激发能量的集中的高强度区4-505。为了该模拟，使表面等离子激元结构4-120位于介电层4-135(二氧化硅)上。表面等离子激元结构汲取来自波导的消散场的，并且增加在样品阱处的强度。
在一些实施方式中，利用表面等离子激元结构对激发能量的增强可集中到一定程度使得无需深的样品阱2-211。例如，如果形成具有大约100nm的直径且具有比在该区域外部的强度大出约80％的峰值强度值的高强度区4-505，那么深的样品阱会是不需要的。仅在高强度区4-505内部的样品将会提供用于检测目的的可感知的发射。
当入射的电磁场与表面等离子激元结构相互作用时，在该结构中产生表面波电流。该结构的形状可以影响这些表面等离子激元元的强度和分布。这些集中的电流可以与紧邻表面等离子激元结构的入射电磁场相互作用并且显著地改变并增强该电磁场，例如，由图4-1B中的高强度区4-505所示。在一些实施方式中，在表面等离子激元结构附近发射能量的发射体(例如，荧光标签)可以使其其发射被该结构改变，从而改变来自发射体的远场辐射图形。
在图4-1C的平面视图中示出了表面等离子激元结构4-122的另一个实施方式。该图示的蝴蝶结结构包括位于与样品阱2-211相邻位置的两个三角形金属结构。例如，这些结构可形成于样品阱的下方、和/或与样品阱的激发区相邻的位置。在一些实施例中，在样品阱与表面等离子激元结构的尖锐特征4-125之间可存在间隙4-127。根据一些实施方式，该间隙4-127可在大约10nm和大约200nm之间。在一些实施例中，间隙4-127可在大约10nm和大约100nm之间。尖锐特征4-125可包括在表面等离子激元结构的边缘中的点或急弯，如附图中所示。这些尖锐特征可具有任何合适的形状。在一些实施方式中，尖锐特征4-125的弯曲半径可小于与入射激发能量相关的大约五个波长。在一些实施方式中，尖锐特征4-125的弯曲半径可小于与入射激发能量相关的大约两个波长。在一些实施方式中，尖锐特征4-125的弯曲半径可小于与被入射激发能量所激发的表面等离子激元元波相关的大约五个波长。在一些实施方式中，尖锐特征4-125的弯曲半径可小于与被入射激发能量所激发的表面等离子激元元波相关的大约两个波长。
根据一些实施方式，可使表面等离子激元结构4-122在样品阱2-211内部图案化，如图4-1D的正视图中所示。在一些实施方式中，在样品阱内部的表面等离子激元结构可包括图案化到样品阱侧壁上的一个或多个指状物(例如，金属指状物)，如附图中所示。图4-1E示出了样品阱2-211的平面视图，图中示出了形成于在样品阱内部的侧壁上的表面等离子激元结构4-122。在一些实施方式中，这些表面等离子激元结构4-122的下端形成其中电磁场被将增强的尖锐特征或弯曲。表面等离子激元结构4-122可以或可以不延伸至样品阱的基部。
在一些实施方式中，表面等离子激元结构4-122可布置成影响激发能量和/或从样品阱中所发出能量的偏振。例如，如图4-1E中所示的图案可用于影响线性或椭圆激发偏振的优选取向和/或来自在样品阱内部的发射体的线性或椭圆偏振的优选取向。
表面等离子激元结构可以不同于图4-1A至图4-1E中所示的形状而图案化。根据一些实施方式，例如，表面等离子激元结构可图案化为规则或周期性的结构，如图4-2A中所示。例如，可图案化的表面等离子激元结构是在其中构成样品阱2-211的材料2-221的底面上的突出特征4-210的阵列。周期性表面等离子激元结构可形成于规则的阵列中，例如光栅、网格、格子、圆光栅、螺旋形光栅、椭圆光栅、或者任何其它合适的结构。在表面等离子激元结构的各突起部4-210之间，可存在大致均匀的间距。在一些实施例中，间距可具有在大约40nm和大约250nm之间的任意值。根据一些实施方式，突起部可具有在大约20nm和大约100nm之间的高度h。在一些实施例中，间距可以是非均匀的或者可以是啁啾的(在较大的径向距离处具有逐渐减小的值)。在一些实施方式中，表面等离子激元结构的突起部4-210可图案化为菲涅耳波带片。根据一些实施方式，表面等离子激元结构4-210可形成于与透明层和/或介电层3-235相邻的位置。在一些实施方式中，在各突起部4-210之间的间距可以是周期性的，而在其它实施方式中各突起部4-210可以是非周期性的。
在一些实施例中，表面等离子激元结构4-212可与其中构成样品阱的材料2-221间隔，如图4-2B中所示。例如，在表面等离子激元结构4-212与材料4-230之间，可存在介于中间的介电层4-247。根据一些实施方式，表面等离子激元结构4-212可位于与样品阱的凹坑3-216相邻的位置，如图4-2B中所示。例如，表面等离子激元结构4-212可位于与凹坑3-216的侧壁相邻的位置，如图4-2B中所示。
图4-2C示出了形成为同心圆光栅的表面等离子激元结构4-214。根据一些实施方式，结构4-214可包括同心导电环4-215。这些环可隔开达规则的间距并且具有高度h，如结合图4-2A所描述。根据一些实施方式，带任选的凹坑的样品阱4-210可位于各环的中心。可在与样品阱的基部相邻的位置使圆光栅图案化。
根据一些实施方式，可对表面等离子激元结构的周期性进行选择从而形成共振结构。例如，可将表面等离子激元结构的间距选择为在该结构中利用激发能量所产生的表面等离子激元元波的大约一半波长。当形成为共振结构时，表面等离子激元结构可使激发能量沿周期性表面等离子激元结构的方向而堆积和共振。这种共振行为可以增强在样品阱内部或者与样品阱相邻位置的电磁能量，如图4-2D中所示。虽然在一些实施方式中各表面等离子激元结构的间距可以是周期性的，但在其它实施方式中该间距可以是非周期性的。采用非周期性间距允许场增强被特定地设计用于激发能量的波长和相关发射能量的波长。图4-2D示出了在样品阱的基部和周期性表面等离子激元结构附近的数字模拟的电磁场结果。表面等离子激元结构4-216是位于与其中构成样品阱的材料2-221相邻的位置，并且与样品阱2-211的基部相邻。该表面等离子激元结构可采用光栅或圆光栅的形式，该光栅在远离样品阱的区域和在模拟区的外部以规则或不规则的间距而重复。例如，可存在在3个和50个之间的重复的表面等离子激元结构4-216的光栅突起部。在样品阱2-211的基部，可以看见高强度4-240的区域。与表面等离子激元结构正下方的周围区域相比，在此区域内部的强度已被增加达2倍以上。
图4-2E示出了共振表面等离子激元结构4-218的一个替代实施方式的正视图。根据一些实施方式，表面等离子激元结构可形成为周期性或非周期性的光栅或网格图案，并且可以形成于多个层4-247中。根据一些实施方式，可经过多个层4-247并且在共振表面等离子激元结构4-218内部，使样品阱2-211图案化。在一些实施例中，共振表面等离子激元结构可包括分立导电元件4-222，如图4-2F的平面视图中所示。在一些实施例中，共振表面等离子激元结构可包括连续格图案4-250，如图4-2G中所示。介电填充剂4-252可位于导电材料4-250的空隙中，并且样品阱2-211可位于空隙内部。
可存在可用于增强进入样品阱的耦合或影响来自在样品阱内部的样品的发射的、多种不同的面等离子激元结构。图4-2H示出了表面等离子激元结构的又一个替代实施方式的平面视图。将经过图4-2H的线4-2I所截取的该结构的剖视图示于图4-2I。根据一些实施例，表面等离子激元结构可包括分布在样品阱2-211附近圆盘4-260的阵列。在一些实施方式中，各圆盘4-260可与样品阱2-211相隔大约距离R。然而，如图中所示，从各圆盘4-260到样品阱2-211的距离可变化。另外，各圆盘4-260的尺寸可以是不同的。在一些实施例中，代替使用导电盘4-260，表面等离子激元结构可包括导电层，经过该导电层形成分布的孔图案。这种结构可被称为“纳米天线”。
可利用多种不同工艺，在与样品阱相邻的位置使表面等离子激元结构图案化。图4-3A至图4-5E示出了根据一些实施方式的与可用于在与样品阱相邻位置形成表面等离子激元结构的工艺步骤相关的结构。现在参照图4-3A，用于形成表面等离子激元结构的工艺可包括在掩蔽层4-330上的防反射涂层(ARC)4-320上形成抗蚀剂层4-310。根据一些实施例，可将这些层设置在透明介电层3-235上。抗蚀剂层4-310可包括可用光刻法而图案化的光刻胶或者电子或离子束抗蚀剂。根据一些实施方式，掩蔽层4-330可包括由无机材料(例如，硅或氮化硅、或者任何其它合适的材料)所构成的硬掩膜。
在一些实施例中，可利用光刻工艺使抗蚀剂4-310图案化，如图4-3B中所示。所选择的图案可包括突起部或孔的布置，该布置将用于形成期望的表面等离子激元结构。在抗蚀剂4-310的显影之后，将使ARC的区域暴露，并且可将图案蚀刻入ARC层4-320然后进入掩蔽层4-330。可将抗蚀剂和ARC从衬底上剥去，所形成的结构可以是如图4-3C中所示。然后，可将掩蔽层4-330用作蚀刻掩膜，以便利用选择性各向异性蚀刻将图案转移进入下面的介电层3-235，如图4-3D中所示。
然后，可使导电材料2-221或者包含导体的材料层沉积在该区域的上方，如图4-3E中所示。任何合适的导电材料可用于形成表面等离子激元结构，无论该结构是否由材料2-221以单独的层的形式而沉积。例如，在一些情况下，第一导电材料可以其中构成表面等离子激元结构的材料2-221的基层形式而沉积。可用于形成表面等离子激元结构的材料的例子包括但不限于：Au、Al、Ti、TiN、Ag、Cu、及其合金或组合层。
可利用任何合适的沉积工艺，包括但不限于物理沉积工艺或化学气相沉积工艺，使材料2-221或材料的层沉积。在一些实施方式中，材料2-221可具有在大约80nm和大约300nm之间的厚度。在一些实施例中，可使材料2-221平坦化(例如，利用CMP工艺)，尽管平坦化是不必要的。可利用本文中所描述的任何合适的制造样品阱的工艺，使样品阱形成于材料2-221中。
本发明人已认识到，根据图4-3A至图4-3E中所示的步骤形成表面等离子激元结构会要求样品阱与表面等离子激元结构的精确对准。例如，包括同心光栅的表面等离子激元结构，如图4-2C中所示，会要求样品阱2-211与表面等离子激元结构4-214的中心的精确对准。为了避免与这种精确对准相关的制造困难，可采用图4-4A至图4-5E中所示的自对准工艺。
现在参照图4-4A，用于形成表面等离子激元结构和自对准到该表面等离子激元结构样品阱的工艺可包括：在透明的介电层3-235上形成遮蔽层4-410。根据一些实施方式，该掩蔽层可包括由无机材料(例如硅或氮化硅)所构成的硬掩膜。掩蔽层4-410的厚度可大致等于样品阱2-212的期望高度。根据一些实施方式，例如该掩蔽层的厚度可在大约50nm和大约200nm之间，尽管在其它实施方式中可采用其它厚度。
可使掩蔽层4-410图案化而形成空隙4-430，这些空隙具有将在介电层3-235中图案化的表面等离子激元结构的期望图案。可利用任何合适的光刻工艺(例如，光刻、电子束光刻、离子束光刻、EUV光刻、X-射线光刻)而完成遮蔽层4-410的图案化。所形成的结构可以是如图4-4B中所示。该结构可包括中心柱4-420，该中心柱随后将用于形成自对准样品阱。
然后，可在所形成的掩掩蔽层4-410上方形成抗蚀剂4-440(例如，光刻胶)，如图4-4C中所示。用于使抗蚀剂4-440图案化的对准(例如，掩膜与衬底的对准)无需是高度精确的，只要求抗蚀剂4-440覆盖中心柱4-420并且不覆盖将用于形成表面等离子激元结构的空隙4-430。
根据一些实施方式，然后可利用选择性各向异性蚀刻来蚀刻介电层3-235并且将表面等离子激元结构的图案转移入介电层中，如图4-4D中所示。然后，可利用选择性各向同性蚀刻来去除掩蔽层4-410的暴露部分。该各向同性蚀刻可以是例如湿法蚀刻，尽管在一些实施方式中可采用各向同性干法蚀刻。因为抗蚀剂4-440覆盖中心柱4-420，所以中心柱将不被蚀刻而仍然留在衬底上，如图4-4E中所示。然后，可将抗蚀剂4-440从衬底上剥去从而使柱4-420暴露，如图4-4F中所示。
根据一些实施方式，然后可使金属导电材料2-221或者包含导电材料的材料的堆沉积在该区域的上方，如图4-4G中所示。然后，通过柱的选择性湿法蚀刻和盖的剥离，可将中心柱4-420和在该柱上方的沉积材料的盖去除。中心柱的去除留下自对准到下面的表面等离子激元结构4-450的样品阱。
可利用一个替代工艺而形成自对准到表面等离子激元结构的样品阱，在图4-5A至图4-5E中示出了该替代工艺。根据一些实施方式，可利用任何合适的光刻工艺在透明介电层3-235上形成一个或多个导电层4-510、4-520，如图4-5A中所示。在一些实施例中，第一层4-510可包含铝，第二层4-520可包含氮化钛，尽管在各种实施方式中可采用其它材料组合。根据一些实施方式，一层或多层的总厚度可以是大致相当于样品阱的期望高度。图案化可形成样品阱2-211和与一个或多个金属层中的样品阱相邻的空隙4-525。可以期望的表面等离子激元结构的图案来布置这些空隙。
在一些实施例中，可对介电层3-235进行蚀刻，以便将表面等离子激元结构和样品阱2-211的图案转移到介电层中从而形成介电空隙4-530，如图4-5B中所示。根据一些实施方式，介电空隙4-530的蚀刻深度可在大约20nm和大约150nm之间。可使抗蚀剂4-440图案化从而覆盖样品阱，如图4-5C中所示。用于使抗蚀剂图案化的对准无需是高度精确的，而只需覆盖样品并且不覆盖与将用于形成表面等离子激元结构的介电层3-235的蚀刻区相邻的部位。
如图4-5D中所示，可利用任何合适的沉积工艺使导电材料4-512或者包含导体的材料层沉积在该区域的上方。材料4-512可填充介电层的蚀刻区，并且可在一个或多个层4-510、4-520上方延伸。然后，可根据剥离工艺将抗蚀剂4-440和覆盖该抗蚀剂的材料去除。图4-5E中所示的所形成的结构留下自对准到周围表面等离子激元结构的样品阱。该样品阱包括凹坑3-216。
在一些实施方式中，可利用图4-5A至图4-5E中所示的工艺而形成不具有凹坑3-216的样品阱。例如，在介电层3-235被蚀刻之前，可在样品阱2-211上方使抗蚀剂4-440图案化。然后，可对介电层3-235进行蚀刻，这将把表面等离子激元结构的图案转移到介电层，但不形成凹坑。然后，可利用如图4-5D和图4-5E中所示的工艺而形成不具有凹坑的自对准样品阱。
除了表面等离子激元结构以外或作为其一个替代，可使其它结构图案化在样品阱2-211的附近，以增加在样品阱内部的激发能量。例如，一些结构可改变入射激发场的相位和/或幅值，从而增加在样品阱内部的激发能量的强度。图4-6A示出了薄损耗膜4-610，该膜可用于改变入射激发能量的相位和幅值并且增加在样品阱内部的电磁辐射的强度。
根据一些实施方式，薄损耗膜4-610可引起激发能量的相长干涉，从而导致在样品阱的激发区内部的场增强。图4-6B示出了入射到样品阱上的激发能量的数值模拟，其中已在与样品阱紧邻的位置形成薄损耗膜4-610。为了该模拟，样品阱具有大约80nm的直径并且形成于厚度为大约200nm的金的金属层中。样品阱包括SCN，并且抑制激发能量经过样品阱的传播。薄损耗膜4-610的厚度为大约10nm，其是由锗构成，并且覆盖包含二氧化硅的下面的透明介电。薄损耗膜延伸经过样品阱的入口。该模拟表明激发能量的强度在样品阱的入口为最高值。在此亮区4-620中的激发能量的强度是向样品阱的左边和右边的激发能量强度的2倍以上。
薄损耗膜可以由任何合适的材料制成。例如，薄损耗膜可由其中折射率n是与该材料的消光系数k大致相同数量级的材料所制成。在一些实施方式中，薄损耗膜可由其中折射率n是与该材料的消光系数k的值相差大约两个数量级内的材料所制成。在可见波长处的这种材料的非限制性例子是锗和硅。
薄损耗膜可具有任何合适的厚度，该厚度可取决于与一个或多个激发源相关的一个或多个特征波长。在一些实施方式中，薄损耗膜的厚度可在大约1nm和大约45nm之间。在其它实施方式中，薄损耗膜的厚度可在大约15nm和大约45nm之间。在其它实施方式中，薄损耗膜的厚度可在大约1nm和大约20nm之间。
在图4-6C的图形中显示了薄损耗膜对其中构成样品阱的材料2-221的反射率、在薄损耗膜内部的激发能量损失、和在材料2-221内部的激发能量损失的影响。标绘于该图形中的一条曲线代表反射率曲线4-634，并且显示了当薄损耗膜的厚度从0nm变化到100nm时材料2-221和薄损耗膜4-610的反射率如何变化。根据该模拟的实施方式，在约25nm处反射率达到最小值。根据激发能量的特征波长及用于薄损耗膜的材料和材料2-221，反射率最小值将出现在不同厚度。在一些实施例中，对薄损耗膜的厚度进行选择，使得反射率大致是在其最小值。曲线4-632代表作为薄膜厚度的函数的膜中的损失，曲线4-636代表作为薄膜厚度的函数的金属中的损失。
在一些实施方式中，可以使薄损耗膜4-610与样品阱2-211和材料2-221间隔，如图4-6D中所示。例如，薄介电层4-620(例如，硅氧化物SiOx)可形成于薄损耗膜的上方，样品阱2-211可形成于与介电层4-620相邻的位置。根据一些实施方式，介电层4-620的厚度可在大约10nm和大约150nm之间，尽管在一些实施方式中可采用其它厚度。
尽管被图示为单层，但薄损耗膜可包括两种以上材料的多层。在一些实施例中，可使包括薄损耗膜4-610和介电层4-620的交替层的多层堆是形成于与样品阱2-211相邻的位置，如图4-6E中所示。根据一些实施方式，在各层的堆中的薄损耗膜4-610的厚度可在大约5nm和大约100nm之间，在堆内部的介电层4-620的厚度可在大约5nm和大约100nm之间。在一些实施例中，多层堆可包括一层的二氧化硅(厚度为4.2nm)、一层的硅(厚度为14.35nm)、和一层的锗(厚度为6.46nm)，尽管在其它实施方式中可采用其它厚度。在一些实施例中，多层堆可包括一层的二氧化硅(厚度为大约4.2nm)、一层的硅(厚度为大约14.4nm)、和一层的锗(厚度大约6.5nm)，尽管在其它实施方式中可采用其它厚度。
薄损耗膜可由至少显示针对入射辐射的一些损失的任何合适的材料所制成。在一些实施方式中，薄损耗膜可包含半导体材料，例如硅和锗，尽管可采用其它材料。在一些实施例中，薄损耗膜可包含无机材料或金属。在一些实施方式中，薄损耗膜可包含合金或者化合物半导体。例如，薄损耗膜可包含包括Si(57.4重量％)、Ge(25.8重量％)、和SiO2(16.8重量％)的合金，尽管在其它实施方式中可采用其它比率和组成。
根据一些实施方式，可利用任何合适的包层沉积工艺(例如物理沉积工艺、化学气相沉积工艺、旋涂工艺、或其组合)使薄损耗膜形成于衬底上。在一些实施方式中，在沉积后可以对薄损耗膜进行处理，例如烘烤、退火,和/或经历离子注入。
此外或可替代地，可利用其它相位/幅值改变结构增加在样品阱内部的激发能量。根据一些实施例并且如图4-7A中所示，反射堆4-705可与样品阱2-211间隔。在一些实施方式中，反射堆可包括具有交替的折射率的材料的介电堆。例如，第一介电层4-710可具有第一折射率，第二介电层4-720可具有不同于第一折射的第二折射率率。在一些实施方式中，反射堆4-705可显示激发能量的高反射率，并且显示对来自在样品阱内部的发射体的辐射发射的低反射率。例如，反射堆4-705可显示针对激发能量的大于大约80％的反射率、和针对来自样品的发射的低于大约40％的反射率，尽管在一些实施方式中可采用其它反射率值。传输激发能量的介电层4-730可位于反射堆和样品阱之间。
根据一些实施例，图4-7A中所示的反射堆4-705可利用其中构成样品阱2-211的材料2-221而形成共振腔。例如，该反射堆可与材料2-221间隔达大致等于在介电材料4-730内部的激发能量的一半波长或者其整数倍的距离。通过形成共振腔，激发能量可通过反射堆，发生共振，并且在材料2-221与反射堆4-705之间的空间中逐步增多。这可以提高在样品阱2-211内部的激发强度。例如，在共振结构内部的强度在一些实施方式中可增加达2倍以上，在一些实施方式增加达5倍以上，并且在一些实施方式中增加达10倍以上。
可在样品阱附近添加附加的结构，如图4-7B和图4-7C中所示。根据一些实施方式，具有高于介电层4-730的第二折射率的第一折射率的介电插塞4-740可形成于与样品阱2-211相邻的位置，如图4-7B中所示。该插塞可采用具有大致等于样品阱的直径的直径的圆柱体形状，尽管也可采用其它形状和尺寸。由于其具有较高的折射率，因而介电插塞4-740可集中激发能量并将激发能量朝向样品阱引导。
根据一些实施方式，可在有或没有反射堆4-705的情况下，采用介电结构，例如插塞4-740。这种介电结构可被称为介电共振天线。该介电共振天线可具有任何合适的形状，例如圆柱形、矩形、正方形、多边形、梯形、或锥体形。
图4-7C和图4-7D示出了根据一些实施方式的可形成于样品阱2-211附近的光子带隙(PBG)结构。光子带隙结构可包括光学对比结构4-750的规则的阵列或格子。根据一些实施方式，光学对比结构可包含具有不同于周围介电材料的折射率的折射率的材料。在一些实施例中，光学对比结构4-750可具有不同于周围介质的损失值。在一些实施例中，样品阱2-211可位于在格子中的缺陷处，如图4-7D中所示。根据各种实施方式，在光子晶格中的缺陷可将光子限制在缺陷区域的内部，从而可以增加在样品阱中的激发能量的强度。由于光子带隙结构的限制，可大致在与衬底的表面直交的两个维度中。当与反射堆4-705结合时，限制可以是在样品阱处在三个维度中。在一些实施方式中，可没有反射堆的情况下采用光子带隙结构。
已想到用于制造图4-6A至图4-7D中所示激发耦合结构的各种方法。根据一些实施方式，需要薄平面膜(例如，交替折射率的介电膜)的结构可利用平面沉积工艺而形成。平面沉积工艺可包括物理沉积(例如，电子束蒸发或溅射)或者化学气相沉积工艺。需要形成于三维形状中的分立嵌入式介电体的结构，例如图4-7B中所示的介电共振天线4-740或图4-7C中所述的光学对比结构4-750，例如可利用光刻图案化和将图案蚀刻进入衬底的蚀刻工艺并且利用随后的介电层沉积和衬底的平坦化而形成。也可以想到用于在样品阱2-211附近形成介电共振天线以及光子带隙结构的自对准处理技术。
图4-8A至图4-8G示出了与用于可用于形成如图4-7C中所示的光子带隙结构和自对准样品阱的仅一个自对准过程的工艺步骤相关的结构。根据一些实施方式，可首先使反射堆4-705形成于在介电层3-235上方的衬底上，如图4-8A中所示。然后，可使第二介电层4-730沉积在反射堆的上方。介电层4-730的厚度可大致等于材料中的激发能量的大约一半波长或者其整数倍。然后，可执行结合图4-4A至图4-4E所描述的工艺步骤，从而在介电层4-730和用于光子带隙结构的蚀刻特征4-810的图案上方形成柱4-420。蚀刻特征可延伸进入介电层4-730并且任选地进入反射堆4-705。所形成的结构可以是如图4-8A中所示。
可将覆盖柱4-420的抗蚀剂4-440从衬底上剥去，并且执行共形沉积以便用填充材料4-820填充蚀刻特征，如图4-8B中所示。根据一些实施方式，填充材料4-820可以是与用于形成柱4-420的材料相同的材料。例如，填充材料4-820和柱4-420可由氮化硅构成，介电层4-730可包含氧化物，例如SiO2。
然后，可执行各向异性蚀刻以便回蚀填充材料4-820。根据一些实施方式可对填充材料进行回蚀以使介电层4-730的表面暴露，从而形成如图4-8C中所示的结构。蚀刻可留下柱4-830，该柱4-830包括原来的柱4-420和由填充材料4-820残留下的侧壁4-822。
然后，可在衬底上方形成抗蚀剂4-440，如图4-8D中所示。例如，可将该抗蚀剂涂布到衬底、形成于抗蚀剂中的孔上，并且将抗蚀剂显影从而将在柱4-830附近的抗蚀剂中的区域打开。孔与柱的对准无需是高度精确的，只需使柱4-830暴露并且不使嵌入介电层4-730中的在下面的光子带隙结构暴露。
在使柱4-830暴露后，可利用各向同性蚀刻来减小柱的横向尺寸。根据一些实施方式，所形成的柱形状可以是如图4-8E中所示。然后，可将抗蚀剂4-440从衬底上剥去，并且可使材料2-221或各材料的层是沉积在该区域上方。在一些实施方式中，可利用CMP工艺对材料2-221进行回蚀，以使该区域平坦化，如图4-8F中所示。随后，可利用选择性干法或湿法蚀刻去除剩余的柱结构从而留下样品阱2-211，如图4-8G中所示。如附图中所示，样品阱2-211自对准到在介电层4-730中图案化的光子带隙结构。
作为一个替代工艺，填充材料4-820可包括不同于构成柱4-420的材料的材料。在此工艺中，可以将与图4-8D和图4-8E相关的步骤省略。如图4-8F中所示，在材料2-221的沉积和平坦化之后，可执行选择性蚀刻以去除柱4-420。这可留下给样品阱2-211做衬里的填充材料4-820的侧壁。
D.非辐射激发耦合结构
本公开提供了用于激发能量朝向样品阱内部的样品的非辐射性耦合的结构。图4-9A中仅示出了非辐射性耦合结构的一个实施方式。根据一些实施方式，非辐射性耦合结构可包括形成于与样品阱2-211紧邻位置的半导体层4-910。在一些实施方式中半导体层4-910可以是有机半导体，或者在一些实施方式中可以是无机半导体。在一些实施例中，凹坑3-216可以或者可以不形成于半导体层中。根据一些实施方式，半导体层4-910可具有在大约5nm和大约100nm之间的厚度，尽管在一些实施方式中可采用其它厚度。根据一些实施例，来自激发源的激发能量或光子4-930可撞击到半导体层4-910上并产生激子4-920。这些激子可扩散到样品阱的表面，其中它们可非辐射性地使能量重新结合并将能量传递至与样品阱的壁相邻的样品。
图4-9B示出了其中可利用半导体层4-912将能量非辐射性地从激发能量传递至样品的另一个实施方式。在一些实施方式中，半导体层4-912可形成于样品阱的底部、或者形成于样品阱2-211的凹坑中，如附图中所示。根据一些实施方式，可利用在本文中结合用于使粘附剂沉积在样品阱基部的工艺步骤所描述的定向沉积工艺，使半导体层4-912形成于样品阱中。根据一些实施方式半导体层4-912可具有在大约5nm和大约100nm之间的厚度，尽管在其它实施方式中可采用其它厚度。入射辐射可在半导体层内部产生激子，该激子然后可扩散到样品阱2-211的底面。然后。这些激子可将能量非辐射性地传递至在样品阱内部的样品。
本公开还提供用于将激发能量传递至样品的多非辐射路径。根据一些实施方式并且如图4-9C中所示，可使能量转换颗粒4-940沉积在样品阱的内部。在一些实施方式中能量转换颗粒可包括量子点，或者在一些实施方式中可包括分子，在一些实施例中可使能量转换颗粒4-940经过连接分子而官能化到样品阱的表面。可使薄半导体层4-910形成于与样品阱相邻的位置或者形成于样品阱的内部，并且可基于入射到半导体层上的激发能量在半导体层内部产生激子，如附图中所示。这些激子可扩散至样品阱的表面，并且将能量非辐射性地传递至能量转换颗粒4-940。然后，能量转换颗粒4-940可将能量非辐射性地传递至在样品阱内部的样品3-101。
根据一些实施例，在样品阱内部可存在多于一个的能量转换颗粒4-940。例如，可使一层的能量转换颗粒4-942沉积在样品阱(例如图4-9C中所示的样品阱)的内部。
在一些实施例中，可使能量转换颗粒4-942或单个能量转换颗粒4-940沉积在样品阱的基部，如图4-9D中所示。一个或多个能量转换颗粒可将激发能量辐射地或非辐射性地传递至在阱内部的样品3-101。例如，能量转换颗粒可吸收入射能量从而形成能量转换颗粒的激发状态，然后将能量辐射地或非辐射地传递至样品3-101。
在一些实施例中，能量转换颗粒可吸收入射激发能量，然后在不同于所吸收激发能量的波长的波长处再发出辐射能量。然后，可利用再发出的能量来激发在样品阱内部的样品。图4-9E示出了与下转换能量转换颗粒相关的光谱图。根据一些实施方式，下转换能量转换颗粒包括可吸收短波长辐射(较高的能量)并发出一个或多个较长波长辐射(较低能量)的量子点。在图形中以虚线的方式显示了用于具有在6至7nm之间的半径的量子点的示范性吸收曲线4-952。量子点可发出由曲线4-954所表示的第一辐射带、由曲线4-956所表示的第二辐射带、和由曲线4-958所表示的第三辐射带。
在一些实施例中，能量转换颗粒可上转来自激发源的能量。图4-9F示出了与来自能量转换颗粒的上转换相关的光谱。根据一些实施方式，可利用在大约980nm处的辐射来激发量子点，然后再发出进入如图形中所示的三个光谱带中的一个光谱带。第一带可定心在大约483nm处，第二带可定心在大约538nm处，第三带可定心在大约642nm处。从量子点中再发出的光子比用于激发量子点的辐射的光子更有能量。因此，来自激发源的能量被上转。一个或多个的发出光谱带可用于激发在样品阱内部的一个或多个样品。
E.朝向传感器引导将发射能量
检测芯片2-110可包括每个像素一个或多个部件，用以改进由在仪器上的传感器对反射能量的收集。这种部件可以是被设计成在空间上朝向传感器引导发射能量并提高来自样品阱2-211的发射能量的方向性。表面光学部件和远场光学部件两者可用于朝向传感器引导发射能量。
1.表面光学部件
在位于像素的样品阱附近的检测芯片2-110的像素内部的部件可用于与由样品所发出的发射能量耦合。这种部件可形成于在检测芯片的两个层之间的界面处。例如，一些发射能量耦合元件可形成于在样品阱层和与样品阱层相邻的层之间的界面处，与该样品阱层相对地形成样品阱。在一些情况下，在样品阱层下面的层是介电层，并且发射能量耦合元件可支撑表面等离子激元元。在其它实施方式中，样品阱层可以是与光学透明材料相邻的导电材料。表面能量耦合元件可以是表面光学结构，该结构被来自样品阱的辐射发射所激发并且与该辐射发射相互作用。
可对表面光学结构的特性尺寸例如光栅周期、特征尺寸、或与样品阱的距离进行选择，以便将发射能量动量矢量的平行分量最大地耦合进入表面等离子激元元的表面波动量矢量。根据一些实施方式，例如，发射能量动量矢量的平行分量可与由该结构所支撑的表面等离子激元元的表面波动量矢量匹配相匹配。在一些实施方式中，可对从样品阱到表面光学结构的边缘或特性特征的距离进行选择，以便在所选择的方向上引导来自样品阱的发射能量，例如垂直于表面或者以与垂直于表面方向所形成的角度θ而倾斜。例如，距离d可以是用于以垂直于表面的方式而引导发射的表面等离子激元元波长的整数倍。在一些实施方式中，可将距离d选择为表面等离子激元元波长的分数、或者其波长模数。
根据一些实施方式，表面光学结构可在垂直于样品阱层的方向上引导来自样品阱的辐射发射能量。可在法线方向中，以变窄的定向辐射图形引导耦合的能量。
表面光学结构的一个例子是同心光栅。同心光栅结构可形成于检测芯片的像素中，用以朝向像素的一个或多个传感器引导发射能量。该同心光栅结构可形成于样品阱的附近。将作为表面等离子激元结构的同心圆光栅表面5-102的一个实例示于图5-1。该圆光栅可包括任何合适数量的环并且在图10-1中所示的环的数量(六个)是非限制性例。该圆光栅可包括从导电层表面突出的环。例如，该圆光栅可形成于样品阱层与形成于品阱层下面的介电层之间的界面处。样品阱层可以是导电材料，并且可通过使光栅结构在导电材料与介电之间的界面处图案化而形成同心光栅。圆光栅的这些环可在规则的周期性间距上，或者在各环之间可具有不规则或非周期性的间距。样品阱可位于圆光栅的中心或附近。在一些实施方式中，样品阱可位于偏离圆光栅的中心处，并且可位于与光栅的中心相隔某个距离处。在一些实施方式中，光栅型表面能量耦合部件可包括螺旋形光栅。图5-2中示出了螺旋形光栅5-202的一个实例。该螺旋形光栅5-202可包括在导电膜中的螺旋形孔口。螺旋形光栅的任何合适尺寸可用于形成螺旋形光栅。
同心光栅可具有任意合适数量的环并且具有任何合适的尺寸，例如但不限于，同心光栅可包括具有大约234nm、大约606nm、大约1005nm、大约1397nm、大约1791nm、和大约2186nm的半径的六个环。在其它实施方式中，同心环可具有两个、三个、四个或八个环。
图5-3A示出了来自样品阱2-211的发射能量的辐射图形5-302。同心光栅结构2-223导致发射能量具有与在光栅结构2-223不存在情况下所形成的辐射图形相比更大的方向性。在一些实施方式中，以垂直于金属层2-221的方式，向下引导发射能量。辐射图形可使发射能量集中，使得大部分的光被集中在与朝向传感器为大致相同的方向上。在一些实施方式中，辐射图形可使荧光集中，使得大部分的荧光定心在靶空间下方形成狭窄的类似于柱的形状并且朝向传感器被向下引导。在一些实施方式中，同心光栅可为1个环提供多于10的方向性，为2个环提供多于15的方向性，为3个环提供多于18的方向性，为4个环提供多于20的方向性。，或者为1个环提供多于15的方向性，如图5-3B中的图表中所示。
表面光学或表面等离子激元结构的另一个例子是纳米天线结构。纳米天线结构可被设计成在空间上引导来自样品阱的发射能量。在一些实施方式中，对样品阱相对于纳米天线结构的位置进行选择，以便朝向一个或多个传感器在特定的方向上引导来自样品阱的发射能量。纳米天线可包括纳米尺度偶极子天线结构，该结构被设计用于当被发射能量激发时产生定向辐射图形。纳米天线可分布在样品阱附近。定向辐射图形可由天线的电磁场的总和所产生。在一些实施方式中，定向辐射图形可利用直接地从样品中所发出的电磁场而由天线的电磁场的总和所产生。在一些实施例中，直接地从样品中发出的场可在由在样品阱与纳米天线结构之间的表面等离子激元元所生成。
为了总体纳米天线结构产生特定分布图形的综合能力，可对形成纳米天线结构的单独纳米天线的尺寸进行选择。例如，单独纳米天线的直径可在纳米天线结构内部变化。然而，在一些情况下，在一组的纳米天线内部，直径可以是相同的。在其它实施例中，在整个总体纳米天线结构中，可采用数个所选择的直径。一些纳米天线可分布于半径为R的圆上，并且一些纳米天线可在径向方向上从该圆位移。一些纳米天线可同样地在半径为R的圆周围相互间隔(例如，定心在相等的极角增量上)，并且一些纳米天线可在该圆的周围以相等间距位移。在一些实施方式中，纳米天线可以螺旋形构型布置在样品阱附近。此外或可替代地，纳米天线的其它构型是可行的，例如在样品阱附近的矩阵阵列、十字形分布、和星形分布。单独的纳米天线可呈除圆以外的形状，例如正方形、矩形、十字形、三角形、蝴蝶结、环形环、五边形、六边形、多边形等。在一些实施方式中，孔口或圆盘的周长可大致为分数波长的整数倍，例如(N/2)λ。
纳米天线阵列可将来自样品的发射能量引导进入集中的辐射波瓣。当样品发出能量时，该能量可激发表面等离子激元元，这些表面等离子激元元从样品阱传播至分布于样品阱周围的纳米天线。然后，表面等离子激元元可在以垂直于品阱层表面的方式发出辐射的纳米天线处激发辐射模式或偶极子发射体。在纳米天线处的激发模式或偶极的相位将取决于纳米天线与样品阱的距离。对在样品阱与单独纳米天线之间的距离的选择控制从纳米天线所发出辐射的相位。在纳米天线处所激发的空间辐射模式将取决于纳米天线的几何形状和/或尺寸。对单独纳米天线的尺寸和/或几何形状的选择控制从纳米天线中发出的空间辐射模式。来自阵列中的纳米天线和在一些情况下来自样品阱的贡献可确定构成辐射图形的一个或多个总体辐射波瓣。正如可意识到，从单独纳米天线中发出的相位和空间辐射模式可取决于波长，因此构成辐射图形的一个或多个总体辐射波瓣也将依赖性波长。可利用电磁场的数值模拟来确定用于不同特征波长的发射能量的总体辐射波瓣图案。
纳米天线可包括在导电膜中的孔或孔口的阵列。例如，纳米天线结构可形成于在导电样品阱层与下面的介电层之间的界面处。这些孔可包括组分布于在中心点周围同心圆中的孔组。在一些实施方式中，样品阱位于阵列的中心点，同时在其它实施方式中样品阱可以是偏心的。各圆形分布的孔组可包括在圆形分布附近从最小到最大而布置的一组不同直径。在各组之间孔直径可以是不同的(例如，在一组中的最小孔可大于在另一组中的最小孔)，并且最小孔的位置可取向在各组的圆的不同极角上。在一些实施方式中，在纳米天线中，可存在1至7组的圆形分布孔。在其它实施方式中，可存在多于7的组。在一些实施方式中，这些孔可以不是圆形，但可以是任何合适的形状。例如，这些孔可以是椭圆形、三角形、矩形等。在其它实施方式中，这些孔的分布可以不是圆形，但可形成螺旋形形状。
图5-4A和图5-4B示出了由导电层中孔或孔口所组成的示例性纳米天线结构。图5-4A示出了具有被孔5-122包围的样品阱5-108的检测芯片的表面的俯视平面视图。这些纳米天线孔分布成它们的中心大致是在半径为R的圆的附近。在此非限制性实例中，孔直径通过在各孔的圆的周长周围逐步地增大而变化。图5-4B示出了沿直线B-B’的图5-4A中所示检测芯片的示意性剖视图。样品阱层5-116包括是纳米天线结构的一部分的样品阱5-108和孔口5-122。检测芯片的层5-118位于样品阱层5-116的下面。层5-118可以是介电材料和/或光学透明材料。
在一些实施方式中，纳米天线结构可包括多个圆盘。纳米天线结构的这些圆盘可形成为从导电材料的表面突出的导电盘。导电材料可与光学透明材料相邻。在一些实施方式中，纳米天线可分布于样品阱的周围。在一些情况下，纳米天线可分布于在半径为R的圆处的样品阱周围。纳米天线阵列可包括大致分布于在样品阱附近的不同半径的其它圆上的多组纳米天线。
图5-5A和图5-5B示出了包括从导电层中突出的圆盘的纳米天线结构的一个示例性实施方式。图5-5A示出了具有被圆盘5-224所包围的样品阱5-208的检测芯片表面的示意性俯视平面视图。纳米天线圆盘大致分布在半径为R的圆的周围。在此非限制性例中，将两个直径用于圆盘，并且在纳米天线的圆的周长附近这些圆盘在这两个直径之间变换。图5-5B示出了沿线C-C’的图5-5A中所示检测芯片的示意性剖视图。样品阱层5-216包括样品阱5-208，并且圆盘5-224是纳米天线结构的一部分。圆盘5-224从样品阱层5-216突出达某个距离。在一些实施方式中，圆盘从样品阱层中延伸的距离可在纳米天线结构的内部变化。检测芯片的层5-218位于样品阱层5-216的下面。层5-18可以是介电材料和/或光学透明材料。样品阱层5-216和突出的圆盘可以是导电材料。
在一些实施方式中，纳米天线结构可定心在靠近样品阱的位置。纳米天线可采用任何合适的形状。例如但不限于，纳米天线可以是对称的形状，例如圆柱体、圆盘或立方体。纳米天线可由任何合适的介电材料(例如氮化硅)制成。可替代地，可使用氧化钛。纳米天线的尺寸可取决于所使用的介电材料，并且可进行修整以便完成期望的增强。在一些实施方式中，纳米天线可具有大约800nm的宽度和大约1050nm的深度。纳米天线可采用从样品阱中发射能量的辐射图形，使得大部分的光倍集中在大致相同的方向上，例如在定心于靶空间和相应的纳米天线下面的狭窄的类似于柱的形状，并且朝向传感器向下引导光，如图5-5C中所示。在一些实施方式中，预计方向性为39.7。
除了将荧光朝向传感器聚焦外，纳米天线还可增加进入样品阱的激发能量。来自纳米天线下方且朝向靶空间引导的激发能量进入纳米天线，并且大部分被集中在靶空间处。在一些实施方式中，在用于具有400nm宽度和1050μm高度的纳米天线的样品阱处，预计增强为57.4。
2.远场光学部件
在一些实施方式中，在表面光学部件正下方的层可以是任何合适厚度的间隔层2-225，并且可由任何合适的介电材料制成。该间隔层可具有例如10μm的厚度并且可由二氧化硅制成。可替代地，此间隔层可具有48μm或50μm的厚度。在间隔层下方可以是具有另外的间隔层的一个或多个透镜层。例如，图5-6A中示出了可包括至少一个折射透镜的上透镜层5-601。在一些实施方式中，上透镜层可位于在样品阱层2-221下方的5μm处。可存在一个或多个与各样品阱相关的透镜。在一些实施方式中，可使用透镜阵列，例如折射透镜阵列。在一些实施方式中，上透镜层5-601的各透镜被定心在样品阱2-211的下方并且可具由例如小于10.5μm的半径。上透镜层可以由任何合适的介电材料制成，例如但不限于氮化硅。
在一些实施方式中，上透镜层的尺寸如下：d1可为大约12μm；d2可为大约2μm；在相邻透镜之间的距离d1可为大约20.966μm；透镜的曲率半径可为大约20.35μm。可替代地，d1可为大约8μm并且d2可为大约6μm。
在上透镜层正下方的层可以是由任何合适的介电材料所制成的结构和/或光学层5-605。此结构和/或光学层5-605可由采用熔融二氧化硅形式的二氧化硅所制成。在该结构层正下方的层可以是可包括至少一个附加透镜的下透镜层5-603。在一些实施方式中，在下透镜层5-603中的各透镜也可被定心在样品阱的下方。下透镜层5-603可由任何合适的介电材料制成，例如但不限于氮化硅。从上透镜层顶部到下透镜层底部的距离可为100-500μm。在下透镜层正下方的层可包括防反射层，该防反射层使激发能量和发射能量两者通过并且减小反射光的量。在防反射层正下方的层可包括允许芯片与仪器对准且被安装到仪器上的结构性部件。在芯片安装层正下方的层可包括防护罩，用以防止系统受到损坏和污染(包括灰尘)。
虽然图5-6A示出了使用折射透镜的两个透镜层，但也可使用任何合适的透镜。例如，可使用菲涅耳透镜、微透镜、折射透镜对和/或平面透镜。图5-6B示出了在被结构和/或光学层5-605所隔开的上透镜层5-611和下透镜层5-613两者中使用菲涅耳透镜的一个实施方式。
在一些实施方式中，在芯片中在上述各层之间的任何界面可包括防反射涂层或防反射层。可将上透镜和第二透镜层两者布置在样品阱下方，用以将从样品阱阵列中所发出的荧光集中到仪器的中继透镜中。从样品阱层的底部到来自靶空间的荧光焦点的距离可为例如大约30.3mm。此焦点可出现在中继透镜内部，例如在中继透镜的纵向中心处。
III.仪器部件
A.仪器的显微观测层
在一些实施方式中，仪器可包括显微观测层，该sub-layer可具有子层的，如图6-1中所示。具体地，显微观测层可包括子层，该子层包括以角度θ倾斜的多色反射镜2-230，用以朝向检测芯片引导激发能量。该多色反射镜可以是大体上介电的，并且反射激发能量同时充分地传输来自在检测芯片上的一个或多个样品阱中的样品的发射能量。任选地，可将包括另外的介电层像散补偿元件6-101设置在多色反射镜下面并且以相同的角度θ倾斜，但设置在垂直于多色反射镜的倾斜的轴线的周围，用以为由多色反射镜所导入的像散提供补偿。在图6-1中，将像散补偿元件6-101图示为在与顶部滤光器相同的平面中倾斜，但应当理解的是该图示是表示相对于顶部滤光器的倾斜而并非意图以任何方式限制像散补偿元件6-101的取向。该像散补偿元件6-101也可提供另外的过滤。例如，像散补偿元件6-101可以是另一个多色反射镜，该反射镜进一步过滤激发能量同时传输发射能量。可将透镜6-103设置在像散补偿元件6-101的下面，以便进一步帮助对来自样品阱的发射能量的处理。透镜6-103的直径可为例如25.4μm，但也可采用任何合适的直径。在一些实施方式中，透镜是包括多个透镜元件的中继透镜。例如，中继透镜可包括六个单独的透镜元件。在一些实施方式中，中继透镜的长度可为大约17.5mm。在透镜6-103的前面或后面可使用另外的过滤元件，以进一步排除激发能量以防止它从到达传感器。
B.传感器芯片
可以多种方式将由在样品阱中的样品所发出的发射能量传输至像素的传感器，下面详细描述了有关于此的一些例子。一些实施方式可利用光学和/或等离子激元元部件来提高将特定波长光引导至传感器中专用于检测该特定波长光的区域或部分的可能性。该传感器可包括用于同时地检测不同波长的发射能量的多个副传感器。
图6-2A是根据一些实施方式的传感器芯片的单像素的示意图，其中利用至少一个分选元件6-127将特定波长的发射能量引导至各自的副传感器6-111、6-112、6-113和6-114。发射能量2-253从样品阱行进经过检测芯片和仪器的光学系统，直到它到达传感器芯片的分选元件6-127。分选元件6-127将该波长的发射能量2-253耦合到空间自由度，由此separating将发射能量分离成其组成波长分量，这被称为分选的发射能量。图6-2A示意性地示出了被划分入经过介电材料6-129的四个分选的发射能量路径的发射能量2-253，四个路径的各自与像素的副传感器6-111至6-114相联。因此，各副传感器与光谱的不同部分是相关的，从而形成用于传感器芯片的各像素的光谱仪。
任何合适的分选元件6-127可用于将不同波长的发射能量加以分离。本发明的实施方式可采用光学或等离子激元元件。光学分选元件的例子包括但不限于：全息光栅、相位掩膜光栅、幅值掩膜光栅、和偏移菲涅耳透镜(offset Fresnel lens)。等离子激元元分选元件的例子包括但不限于：相控纳米天线阵列、和等离子激元元准晶体。
图6-2B是根据一些实施方式的传感器芯片的单像素的示意图，其中过滤元件6-121、6-122、6-123和6-124是用于将特定波长的发射能量引导至各自的副传感器并防止其它波长的发射能量到达其它副传感器。发射能量2-253从样品阱行进经过仪器的检测芯片和光学系统，直到它到达过滤元件6-121至6-124中的一个。过滤元件6-121至6-124(各自与特定的副传感器6-111至6-114相关)各自是用于传输各自波长的发射能量并且通过吸收发射能量(在图6-1B中未示出)和/或反射发射能量而排除其它波长的发射能量。在通过各自的过滤元件之后，经过滤的发射能量行进经过介电材料6-129并撞击在像素的相应的副传感器6-111至6-114上。因此，各副传感器是与光谱的不同部分是相关的，从而形成用于传感器芯片各像素的光谱仪。
任何合适的过滤元件可用于将不同波长发射能量加以分离。本发明的实施方式可使用光学或等离子激元元过滤元件。光学分选元件的例子包括但不限于：反射性多层介电滤光器或吸收性滤光器。等离子激元元分选元件的例子包括但不限于：被设计用于在特定波长处传输能量频率选择表面、和光子带隙晶体。
可替代地，或除上述分选元件和过滤元件外，可将另外的过滤元件放置在与各副传感器6-111至6-114相邻的位置。另外的过滤元件可包括薄损耗膜，该膜是用于形成特定波长的发射能量的相长干涉。薄损耗膜可以是单层或多层膜。薄损耗膜可由任何合适的材料制成。例如，薄损耗膜可是由其中折射率n与消光系数k大致为相同数量级的材料所制成。在其它实施方式中，薄损耗膜可由其中折射率n是在与材料消光系数k的值相差大约两个数量级内的材料所制成。在可见波长处的这种材料的非限制性例子是锗和硅。
薄损耗膜可具有任何合适的厚度。在一些实施方式中，薄损耗膜可具有1-45nm的厚度。在其它实施方式中，薄损耗膜可具有15-45nm的厚度。在其它实施方式中，薄损耗膜可具有1-20nm的厚度。图6-3A示出了一个实施方式其中薄损耗膜6-211至6-214各自具有至少部分地由与各副传感器6-11至6-114相关的波长所决定的不同厚度。该膜的厚度至少部分地决定将选择性地通过薄损耗膜而到达副传感器的不同波长。如图6-211中所示，薄损耗膜6-211具有厚度d1，薄损耗膜6-212具有厚度d2，薄损耗膜6-213具有厚度d3，薄损耗膜6-214具有厚度d4。各个后面的薄损耗膜的厚度小于前面的薄损耗膜，因此d1>d2>d3>d4。
此外或可替代地，薄损耗膜可由具有不同特性的不同材料所构成，以便不同波长的发射能量在各自的副传感器处积极地干涉。例如，可对折射率n和/或消光系数k进行选择，以优化特定波长的发射能量的传输。图6-3B示出了具有相同厚度的薄损耗膜6-221、6-222、6-223和6-224。但各薄损耗膜是由不同材料构成。在一些实施方式中，可对薄损耗膜的材料和薄损耗膜的厚度两者进行选择，使得期望波长的发射能量积极地干涉并且被传输经过膜。
图6-1示出了其中将衍射元件与透镜的组合用于基于波长对发射能量进行分选的一个实施方式。传感器芯片的第一层6-105可包括闪耀相位光栅。可使该闪耀光栅例如以大致等于40度的角度φ闪耀，并且闪耀光栅(Λ)的线间距可大致等于1.25μm。本领域技术人员将会理解的是，可利用不同的闪耀角和周期性来实现不同波长发射能量的光的分离。此外，可利用任何合适的衍射光学元件来分离不同波长的发射能量。例如，可使用相位掩膜、振幅掩膜、闪耀光栅或偏移菲涅耳透镜。
传感器芯片2-260的第二层6-106可包括设置在第一层6-105下面的一个或多个菲涅耳透镜，用以进一步将发射能量分选并引导至传感器6-107。此外，任何合适的透镜元件可用于进一步分离不同波长的发射能量。例如，可使用折射透镜代替菲涅耳透镜。
第三透镜层的菲涅耳透镜和闪耀相位光栅可共同地称为衍射光学元件(DOE)。在一些实施方式中，DOE具有在大约400至600μm范围内的厚度，其中宽度是在大约10微米至30微米的范围内。空气间隔层可位于DOE的正下方，并且可具有大约150μm的厚度，在一些实施方式中。可替代地，间隔层可具有与DOE焦距为相同的光学厚度，并且/或者由二氧化硅制成。
图6-1的各种部件可在任何合适的距离相互间隔。例如，传感器的表面可位于菲涅耳透镜层6-106下方5μm的距离；从显微观测层的透镜6-103的中心到菲涅耳透镜层6-106的距离可为50.6mm；闪耀相位光栅6-105可位于在传感器的表面上方大约100μm的距离处。可替代地，从检测芯片底部到光栅6-105顶部的距离可为大约53mm。传感器层的宽度可为大约10mm。菲涅耳透镜可以可在层内部彼此间隔达大约10微米、大约20微米、和大约30微米的距离。
在一些实施方式中，可使用偏移菲涅耳透镜，其中该菲涅耳透镜具有可从透镜(例如图6-1中所示的透镜6-103)的中心偏移的中心。偏移菲涅耳透镜的中心可偏移达大约50微米、大约60微米、大约70微米、或大约80微米，但其它距离也是可行的。在一些实施方式中，偏移菲涅耳透镜可具有第二偏移，该偏移从偏移菲涅耳透镜的中心向传感器的中心偏移，该偏移可以是例如大约10um或100um，但其它距离也是可行的。该偏移菲涅耳透镜可以任何合适的方式形成。例如，可将各自具有不同光栅间距的两个部分覆盖从而形成具有与二元偏移菲涅耳透镜结构相比提高的效率单偏移菲涅耳。在一些实施方式中，可将间距为220nm的“小”部分和间距为440nm的“大”部分加以覆盖从而形成图示的偏移菲涅耳透镜。偏移菲涅耳透镜阵列可位于传感器阵列的顶部上，可具有从偏移菲涅耳透镜元件中心向传感器中心的侧向偏移，并且可以是被设计成以在大约80微米至大约150微米范围内的焦距而运行并且被设计成用于625nm的波长。
在成像光学部件和空气间隔层正下方的层可以是传感器层。该传感器层可包括多个传感器，包括CMOS光敏传感器。该传感器层可具有任何合适的厚度，包括在大约6微米至大约8微米的范围内。可替代地，传感器层厚度可在2um至15um范围内。这些传感器可倍分离成多个段或像素，并且可具有大约21μm的宽度。从传感器层顶部到发射能量焦点的距离以可为大约30.3mm。
检测芯片和仪器的各种层无需是按上述的顺序。在一些实施方式中，聚焦和/或分选元件及仪器的成像光学部件可采用相反顺序。例如，可将闪耀相位光栅6-105置于菲涅耳透镜层6-106的后面。可替代地，可将聚焦和/或分选元件及成像光学部件并入单个衍射光学元件(DOE)中。另外，可将检测芯片和仪器的各种部件混合在一起使用，使得例如成像光学部件可出现在聚焦和/或分选元件的上方和下方。
在系统中在各层之间的任何界面，包括在空气与该系统的一层之间的界面，可包括防反射涂层。
C.仪器的聚光装置
在一些实施方式中，仪器1-120的聚光装置可包括部分或全部的上述光学部件。该聚光装置可提供以在图6-4A中的方式而布置的光学部件。图6-4A示出了通过图6-4A中所示光学部件的具有λ1和λ2波长的光。除了上述部件以外，该聚光装置还可包括：其中可连接传送第一波长λ1的激发能量的第一光纤的第一光纤连接器6-401、和其中可连接传送第二波长λ2的激发能量的第二光纤的第二光纤连接器6-402。例如但不限于，激发能量的第一激发波长可以是630-640nm。这些光学光纤连接器可以是任何合适的常规连接器，例如FC或LC连接器。如果两个不同的波长被输入，可利用波长合波器6-403(例如二色或多色反射镜)将这两个波长合并。第二激发波长可以是515-535nm。输入激发能量可以是任何合适的偏振，例如线性偏振。在一些实施方式中，传送激发能量的光纤可以是偏振保持光纤。任选地，可在光纤输入之后使用激发滤光器和偏振器(例如光纤-自由空间耦合器)，用以进一步过滤或改变激发能量的特性。
聚光装置可包括一个或多个金属壳体，用于保持透镜的和用于光学处理(例如光束整形)的其它光学部件。图6-4A示出了四个金属壳体6-405至6-408，各自保持透镜和/或其它光学部件。可存在用于准直和集中激发能量的任意数量的透镜。一个或多个反射镜6-411和6-412是位于用于朝向检测芯片2-110引导激发能量的部分金属壳体之间。在图6-4A中，第一反射镜6-411将激发能量从第二壳体6-406引导至第三壳体6-407，第二反射镜6-412将来自第四壳体6-408的激发能量反射至多色介质反射镜2-230。多色介质反射镜2-230朝向像散补偿滤光器6-601引导激发能量。
在一些实施方式中，可将圆偏振光引导入样品阱中从而导致发光标记物以相似的强度发出荧光。在线性偏振光到达检测芯片之前，可利用1/4波片将线性偏振光转换成圆偏振光。多色介质反射镜2-230将激发能量引导至1/4波片6-415。如图6-4A中所示，可将1/4波片6-415设置在像散补偿滤光器6-101和检测芯片2-110之间。然后，朝向在检测芯片上的多个像素引导圆偏振的激发能量。未被朝向像素引导的激发能量可被光束收集器部件6-417吸收。到达在一个或多个样品阱内部的样品的激发能量将导致样品发出发射能量，该发射能量被朝向传感器2-260引导。发射能量可通过光学部件，例如偏振光学部件、像散补偿元件6-101、多色反射镜2-230和中继透镜6-103。多色反射镜起滤光器的的作用，该滤光器可以是例如陷波滤光器、窄带滤光器或截止滤光器。中继透镜6-103可朝向传感器反映发射能量。然后，一部分的发射能量可通过位于传感器2-260上方的一个或多个发射滤光器6-421和6-422，这些滤光器可进一步过滤发射能量。在一些实施方式中，发射滤光器可以相对于入射发射能量传播方向的角度而倾斜从而调整滤光器的传输特性和/或减小由背反射所导致的干扰。如果使顶部滤光器6-421以角度θ倾斜，那么底部滤光器6-422可以相同的角度θ而倾斜，但围绕是垂直于顶部滤光器的倾斜的轴线的轴线，以确保没有像散被引入发射辐射光束路径。
图6-5示出了光线追迹的一个实例，该光线追迹代表经过装置从检测芯片2-110到传感器芯片2-260的光学路径。在检测芯片2-110中的各起点代表一个像素，该像素发出发射能量并且被系统反映至在传感器芯片2-260上的相应的像素。该路径可沿大约55.4mm的距离而存在，但也可采用任何合适的距离。在图示的实例中，利用上述光学元件对从样品阱阵列中所发出的射线进行过滤并将该射线朝向传感器集中。图6-5示出了包括六个单独透镜的一个可能的中继透镜6-103。应当认识到的是，可将任意数量的透镜和/或其它光学元件用作中继透镜。
IV.传感器
本公开提供了传感器、传感器操作、和信号处理方法的各种实施方式。根据一些实施方式，在传感器芯片2-260的一个像素处的传感器2-122可包括任何合适的传感器，该传感器能够接收来自样品阱中的一个或多个标签的发射能量并且产生是所接收发射能量的代表的一个或多个电信号。在一些实施方式中，传感器可包括至少一个光检测器(例如，形成于半导体衬底中的p-n结)。图7-1A和图7-1B示出了可倍制作在传感器芯片的像素2-100内部的传感器的一个实施方式。
根据一些实施方式，传感器2-122可形成于传感器芯片的各像素2-100处。该传感器可与检测芯片的样品阱2-211相联。在传感器的上方可存在一个或多个透明层7-110，使得来自样品阱的发射可在没有明显衰减的情况下行进至传感器。根据一些实施方式，传感器2-122可在像素的基部形成于半导体衬底7-120中，并且位于样品阱的与检测芯片(未图示)相同的一侧。
传感器可包括一个或多个半导体结光检测器段。各半导体结可包括第一导电类型的阱。例如，各半导体结可包括形成于p-型衬底中的n-型阱，如附图中所示。根据一些实施方式，可将传感器2-122布置为牛眼检测器7-162，如图7-1B的平面视图中所示。第一光检测器7-124可位于传感器的中心，并且第二环形光检测器7-122可包围中心光检测器。与这些阱的电接触可经过形成于第一或后面的金属化层中的导电迹线7-134并且经过导电通孔7-132而实现。在通孔的接触区，可存在高掺杂半导体材料7-126的区域。在一些实施方式中，场氧化层7-115可形成于在各光检测器之间的表面处，并且可覆盖各光检测器的一部分。在一些实施例中，可存在形成于与传感器2-122相邻的像素内部的另外的半导体装置7-125(例如，晶体管、放大器等)。在该像素内部，可存在另外的金属化层7-138、7-136。
在一些实施例中，金属化层7-136可延伸经过大部分的像素，并且具有定心在光检测器7-124上方的开口，以便来自样品阱的发射可以到达传感器。在一些情况下，金属化层7-136可起参考电位或接地平面的作用，此外起聚光装置的作用以防止至少一些背景辐射(例如，来自激发源或来自周围环境的辐射)到达传感器2-260。
如图7-1A和图7-1B中所示，可将传感器2-122再分成在空间上和电学上彼此分离的多个光检测器段7-122、7-124。在一些实施方式中，传感器2-122的各段可包括反掺杂半导体材料的区域。例如，用于第一传感器段的第一电荷累积阱7-124可通过掺杂衬底的第一区从而在第一阱内部具有第一导电类型(例如，n型)而形成。衬底可以是p-型。用于第二传感器段的第二电荷累积阱7-122可通过掺杂衬底的第二区从而在第二阱内部具有第一导电类型而形成。第一阱与第二阱可被衬底的p-型区隔开。
传感器2-122的多个段可以不同于牛眼布置任何合适方式而布置，并且在传感器中可存在多于两个的段。例如，在一些实施方式中，多个光检测器段7-142可以是侧向地相互单独隔离从而形成条状传感器7-164，如图7-1C中所示。在一些实施方式中，四(或象限)传感器7-166可通过以四型式来布置段7-144而形成，如图7-1D中所示。在一些实施例中，可以牛眼型式而形成弧段7-146，如图7-1E中所示，从而形成弧段传感器7-168。另一种传感器配置可包括饼形段部，这些部分可包括被布置在圆的分离部分中的单独传感器。在一些情况下，可将各传感器段对称地布置在样品阱2-211的周围或者对称地布置在样品阱的周围。各传感器段的布置并不只局限于前述布置，也可采用各传感器段的任何合适分布。
本发明人已发现四象限传感器7-166、饼形扇区传感器、或类似的扇区传感器可以比其它传感器配置更有利地按比例减小到较小的像素尺寸。四象限和扇区检测器可使用较小的用于一些检测波长和主动传感器区的像素面积。
可以以各种几何构型来布置传感器。在一些实例中，以正方形构型或六边形构型来布置传感器。
可以任何合适的方式来设计和定位传感器，以便俘获从样品阱中所发出的发射能量。例如，传感器可定心在样品阱下面，并且具有5um×5um的平面尺寸。可替代地，各副传感器可具有1.6um×10um的尺寸及4.6um的间距(即，在各副传感器之间有3um间隙)。
本公开的传感器可独立地(或单独地)可访问。可单独访问能够检测信号并且独立于其它传感器而提供输出。可单独访问的传感器可单独地读取。
在一些实施方式中，堆叠的传感器7-169可通过制作在垂直堆中的多个单独传感器段7-148而形成，如图7-1F中所示。例如，这些段可位于其它段的上方，并且在各堆叠的段之间可或可以不存在绝缘层。各垂直层可用于吸收特定能量的发射能量，并且使不同能量的发射通过。例如，第一检测器可吸收并检测较短波长辐射(例如，来自样品的波长小于约500nm的蓝色波长辐射)。第一检测器可使来自样品的绿色和红色波长发射通过。第二检测器可吸收并检测较短波长辐射(例如，波长在约500nm和约600nm之间)并且使红色发射通过。第三检测器可吸收并检测红色发射。在一些实施方式中，可将反射膜7-149并入该堆中，用以将所选择波长带的光反射经过一个段。例如，膜可将具有未被第二段所吸收的绿色波长辐射反射经过第二段，以提高其检测效率。
在具有垂直堆叠传感器段的一些实施方式中，可不将发射耦合部件包括在样品阱处，该发射耦合部件是用于产生取决于发射波长的样品发射的不同空间分布形态。根据一些实施方式，对光谱不同的发射的区分可利用垂直堆叠传感器7-169通过对来自其堆叠段的各信号的比率进行分析而实现。
在一些实施方式中，传感器2-122的各段是由硅构成，尽管可以使用任何合适的半导体(例如，Ge、GaAs、SiGe、InP等)。在一些实施方式中，传感器段可包括有机光导薄膜。在其它实施方式中，可将量子点光检测器用于传感器段。量子点光检测器可基于量子点的尺寸而对不同的发射能量作出响应。在一些实施方式中，可利用不同尺寸的多个量子点，在从样品阱中所接收的不同发射能量或波长之间进行区分。例如，第一段可由具有第一尺寸的量子点所构成，第二段可由具有第二尺寸的量子点所构成。在各种实施方式中，可利用常规的CMOS工艺形成传感器2-122。
如上所述，在一些实施方式中，可将发射耦合部件制作在与样品阱相邻的位置。分选元件2-243可以改变来自在样品阱内部2-211的样品的发射，从而产生取决于发射波长的样品发射的不同空间分布形态。图7-2A示出了可从第一样品中在第一波长处所产生的第一空间分布形态7-250的一个实例。第一空间分布形态7-250可具有指向牛眼传感器7-162的中心段的突出中心波瓣，例如如图7-2B中所示。当样品在约663nm波长处发射时，这种图形7-250可由任何合适的衍射元件所产生。入射到传感器上的突出的图形7-252可以是如图7-2B中所示。
图7-2C示出了根据一些实施方式的可从在相同样品阱中的在第二波长处发射的第二样品所产生的空间分布形态7-260。第二空间分布形态7-260可包括辐射的两个波瓣，并且不同于第一空间分布形态7-250。根据一些实施方式，第二空间分布形态7-260的突出形态7-262可以是如图7-2D中所示。当样品在约687nm的波长处发射时，可由任何合适的衍射元件产生第二空间分布形态7-260。
根据一些实施方式，传感器2-122的各段可布置成对特定的发射能量进行检测。例如，与样品阱和传感器的各段相邻的发射耦合结构可被设计成组合形式，以增加在各特定发射能量之间的信号差异。该发射能量可对将用于传感器芯片的所选择标签作出响应。作为一个例子，牛眼传感器7-162可以具有其各段，这些段的尺寸被设计成和/或定位成更好地匹配来自样品的突出形态7-260、7-262，以便较高强度的区域更加中心地落在传感器主动段的内部。可替代地或此外，衍射元件可以是被设计成改变突出形态7-260、7-262，以便强发生区更加中心地落在传感器的各段内部。
尽管传感器2-122可包括两个段，但在一些实施方式中能够区分多于两个的来自样品的光谱不同的发射带。例如，各发射带可在传感器段上产生不同的突出形态，并且获得来自各传感器段的信号的不同组合。可对信号的组合进行分析，从而区分和鉴别发射带。图7-2E至图7-2H示出了基于来自暴露于四种不同发射形态的两段传感器2-122的信号的数值模拟的结果。正如从图可见的，来自两个传感器段的各信号组合是不同的，并且可以用于在四个波长处的发射体之间进行区分。为了模拟，因为牛眼传感器7-162的外检测器段具有较大的面积，所以更多的该检测器的信号被整合。此外，撞击到在各检测器之间的区域的光产生了载流子，这些载流子可朝向任一检测器段转移并且导致来自两个段的信号。
在一些实施方式中，每个像素中可存在N个光检测器段，其中N可以是任意的整数值。在一些实施方式中，N可大于或等于1且小于或等于10。在其它实施方式中，N可以是大于或等于2且小于或等于5。可由N个检测器所检测的可区分样品发射(例如，来自不同发光标签的不同发射波长)的数量M可等于或大于N。根据一些实施方式，对M个样品发射的区分可通过对来自各传感器段的各信号的比率进行评估而实现。在一些实施例中，可对所接收信号的比率、和值和/或幅值进行测量并进行分析，以确定来自样品阱的发射的特征波长。
在一些实施方式中，多于一个的发射体可在不同特征波长处在给定的时间窗中在样品阱2-211内部发射。传感器2-122可同时地对来自在不同波长处的多个发射的信号进行检测，并且为数据处理提供和值信号。在一些实施例中，可将多波长发射区分为来自各传感器段的其它组的信号值(例如，不同于图7-2E至图7-2H中的信号值)。可对这些信号值进行分析，从而区分多波长发射已发生并且鉴定与发射相关的发射体的特定组合。
本发明人也已设想出具有四个同心段的牛眼传感器并且进行了分析。将用于分别与图7-2G和图7-2H相关的相同发射条件的、来自各段的信号绘制于图7-2I和图7-2J。四段牛眼传感器也显示可区分信号，可对这些信号进行分析以鉴定在样品阱内部的特定发射体。
当在各传感器段处采用波长过滤或者光谱分离较高时，传感器的各段可基本上只对所选择的发射带进行检测。例如，第一波长可由第一段进行检测，第二波长可由第二段进行检测，第三波长可由第三段进行检测。
再次参照图7-1A，在像素2-100内部可存在另外的电子电路7-125，该电路是用于采集并读出来自传感器2-122的各段的信号。图7-3A和图7-3D示出了根据一些实施方式的可结合多段传感器而使用的电路。作为一个例子，信号采集电路7-31可包括用于各传感器段的三个晶体管。根据一些实施例，将三个晶体管的布置示于图7-3B。可利用复位晶体管RST使在与各段相关的电荷累积结点7-311处的信号电平复位，并且可利用读取晶体管RD读出用于该段的信号电平(决定于在电荷累积结点处的电荷量)。
根据一些实施方式，像素电路还可包括放大与相关双采样电路7-320。该放大与双采样电路可包括：例如，用于将来自各传感器段的信号加以放大的晶体管、以及用于使在电荷累积结点处的电压电平复位并且读取背景，或者当在传感器上不存在发射能量时(例如，在样品阱处施加激发能量之前)使在结点处的信号“复位”并且读取后面的发射信号的晶体管。
根据一些实施方式，利用相关双采样，通过从所检测的发射信号电平中减去背景或复位信号电平而减小背景噪声。可将采集的发射信号和与传感器各段相关的背景信号读出到柱线7-330上。在一些实施方式中，发射信号电平和背景信号分时复用到共用的柱线上。可存在用于各传感器段的单独的柱线。可利用放大电路7-340(可位于有源像素阵列的外部)对来自各柱线的信号进行缓冲和/或放大，并且提供进一步的处理和分析。在一些实施方式中，双采样信号的减法是在芯片外进行计算，例如由系统处理器执行。在其它实施方式中，可在芯片上或者在仪器的电路中执行减法。
相关双采样的一些实施方式可通过选择一排的样品而实施，其中与这排样品相关的传感器在采样期中具有集成信号电荷并且包含信号电平。可将各信号电平同时地读出到各柱线上。在对集成信号电平进行采样之后，可使在所选择排的样品中的所有像素复位并立即采样。可将此复位电平与在复位被释放后开始累加的下一个集成信号联系起来，并且当再次选择同一排的样品时结束对将后面的帧时间进行积分计算。在一些实施方式中，可将帧的复位值可存储于芯片外以便当信号已完成积分计算并且已被采样时可以减去所存储的相关复位值。
在一些实施方式中，具有多于两个段的传感器2-122会需要另外的电路。图7-3C示出了与四段传感器相关的信号采集7-312、放大7-320、和双采样电路。根据一些实施方式，可将来自两个或更多段的信号分时复用到在像素处的共用信号通道，如附图中所示。经分时复用的信号可包括用于噪声消除的各段的采样的背景信号。此外，可将来自两个或更多段的信号分时复用到共用的柱线上。
根据一些实施方式，可利用时间信号采集技术来降低来自一个或多个激发源的背景信号电平，和/或区分来自与样品相关的不同发射体的不同发射。图7-4A示出了根据一些实施方式的来自可用于给样品加标签的两个不同发射体的荧光发射和衰减。这两个发射具有明显不同的时间衰减特性。来自第一发射体的第一时间衰减曲线7-410可对常用的荧光分子(例如罗丹明)作出响应。第二时间衰减曲线7-420可以是第二发射体(例如量子点或磷光发射体)的特性。两个发射体显示在发射体的初始激发后延续达一些时间的发射衰减拖尾。在一些实施方式中，可对在发射衰减拖尾期间所应用信号采集技术进行定时从而在一些实施方式中减小来自激发源的背景信号，并且在一些实施方式中在各发射体之间进行区分。
根据一些实施例，在发射衰减拖尾期间可利用时间延迟采样来减小由于来自激发源的辐射所产生的背景信号。图7-4B和图7-4C图示说明了根据一些实施方式的延时采样。图7-4B示出了来自激发源的激发能量的激发脉冲7-440、和随后的可从在样品阱内部被激发的样品中产生的发射脉冲7-450的时间演变。可通过用驱动信号7-442驱动激发源达短暂的时间段而产生激发脉冲7-440，如图7-4C中所示。例如，驱动信号可开始于第一时间t1并结束于第二时间t2。根据一些实施方式驱动信号的持续时间(t2–t1)可在约1皮秒和约50纳秒之间，尽管在一些实施例中可采用较短的持续时间。
在用于激发源的驱动信号终止之后的时间t3，可对在像素处的传感器2-260(或传感器段)加以控制，从而在从时间t3延续至时间t4的第二时间区间7-452期间使电荷累积在电荷累积结点7-311处。根据一些实施方式第二时间区间可在约1纳秒和约50微秒之间，尽管在一些实施例中可采用其它持续时间。如参照图7-4B可见，电荷累积结点将收集更多的由于发射样品然后由于激发源所产生的信号电荷。因此，可获得提高的信噪比。
再次参照图7-4A，由于各发射体具有不同的时间发射特性，因而在传感器处的相应的信号可在不同的时间达到峰值。在一些实施例中，在发射衰减拖尾期间所应用的信号采集技术可用于区分不同的发射体。在一些实施方式中，可结合空间与光谱技术(例如，如上面所述结合图7-2所描述)，利用时间检测技术来区分不同的发射体。
图7-4D至图7-4H图示说明了如何可以利用在传感器或传感器段处的双采样在具有不同时间发射特性的两个发射体之间进行区分。图7-4D示出了分别与第一发射体和第二发射体相关的的发射曲线7-470、7-475。作为一个例子，第一发射体可以是常用的荧光团(例如罗丹明)，第二发射体可以是量子点或磷光发射体。
图7-4E示出了可响应于图7-4D的两个不同发射特性而出现的、在电荷累积结点7-311处的动态电压电平。在该实例中，与荧光发射体相对应的第一电压曲线7-472由于较短的发射跨度因而可更快速地变化，并且在第一时间t1达到其最大值(或最小值，根据结点的极性)。第二电压曲线7-477由于第二发射体的更长的发射特性会更慢速地变化，并且在第二时间t2达到其最大值(或最小值)。
在一些实施方式中，电荷累积结点的采样可在样品激发后的两个时间t3、t4进行，如图7-4F中所示。例如，可施加第一读取信号7-481以便在第一时间t3从电荷累积结点中读出第一电压值。随后，可施加第二读取信号7-482以便在第二时间t4从电荷累积结点中读出第二电压值并且在第一次读取和第二此读取之间不使电荷累积结点复位。然后，可利用对两个采样信号值的分析来鉴别在两个发射体中哪个发射体提供了所检测的信号电平。
图7-4G示出了来自第一次读取和第二次读取的两个信号的一个实例，这两个信号可获得用于具有发射曲线7-470的第一发射体，如图7-4D中所示。图7-4H示出了来自第一次读取和第二次读取的两个信号的一个实例，这联合信号可获得用于具有发射曲线7-475的第二发射体，如图7-4D中所示。例如，在图7-4F中所示的第一发射体的采样序列将对曲线7-472进行采样并且在这两个读取时间获得大致相同的值。在第二发射体的情况下，图7-4F中所示的采样序列在两个读取时间对曲线7-477的两个不同值进行采样。所形成的来自两个读取时间的信号对在两个发射体之间进行区分，并且可以对信号对进行分析以鉴别各发射体。根据一些实施方式，也可执行用于背景减法的双采样，由此从第一和第二读取信号中减去背景信号。
在操作中，在来自被分析试样的数据采集之前，可对传感器芯片的传感器2-260实施波长校准程序。该波长校准程序可包括使传感器接收具有特征波长的不同的已知能量，该已知能量可以或可以不对可用于传感器芯片的荧光团波长作出响应的。在该序列中施加不同的能量，以便可以从传感器中记录用于各能量的校准信号。然后将将校准信号作为参考信号加以存储，这些参考信号可用于对实测数据采集进行处理级用于确定哪个或哪些发射波长被传感器所检测。
可将能够获取时间元信息的任何合适的传感器用于测量，以便检测发光标记物的寿命。使传感器对准，使得各样品阱具有用于检测来自样品阱的荧光的至少一个传感器区。在一些实施方式中，集成装置可包括盖革模式雪崩光电二极管阵列和/或单光子雪崩二极管阵列(SPAD)。该传感器可包括IR增强CMOS传感器，该传感器可包含Si-Ge材料和/或改性层，例如“黑硅”。这些材料可使传感器能够检测在红外波长中发射、和/或由非IR增强CMOS传感器不良检测的发光标记物。
本文中描述的是一种例如可以精确地测量或“时间元”入射光子到达的定时并且可用于多种用途例如核酸测序(例如，DNA测序)的集成光检测器。在一些实施方式中，该集成光检测器可以以纳秒或皮秒的分辨率测量光子的到达，这可以简化入射光子到达的时域分析。
一些实施方式涉及一种具有光检测器的集成电路，该光检测器响应于入射光子产生载流子并且能够区分相对于参考时间(例如，触发事件)由于入射光子的到达而产生载流子的定时。在一些实施方式中，载流子分离结构将在不同时间所产生的载流子加以分离，并且将载流子引导入一个或多个载流子存储区(称为“储仓”)，这些存储区中聚集了在不同时间段内所产生的载流子。各储仓存储在所选择时间区间内所产生的载流子。读出存储于各储仓中的电荷可以提供关于在各时间区间内所到达光子数量的信息。这种集成电路可以用于多种用途中的任意用途，例如本文中所描述的用途。
下面将对具有光检测区和载流子分离结构的集成电路的一个例子进行描述。在一些实施方式中，集成电路可包括像素的阵列，各像素可包括一个或多个光检测区和一个或多个载流子分离结构，如下所述。
图7-5示出了根据一些实施方式的像素100的图示。像素100包括：光子吸收/载流子产生区102(也被称为光检测区)、载流子行进/俘获区106、具有一个或多个载流子存储区的载流子存储区108，该载流子存储区在本文中也被称为“载流子存储仓”或简单地“仓”、和用于读出来自载流子存储仓的信号的读出电路110。
光子吸收/载流子产生区102可以是可以将入射光子转换成光生载流子的半导体材料(例如，硅)的区域。光子吸收/载流子产生区102可暴露于光并且可接收入射光子。当光子被光子吸收/载流子产生区102吸收时，该区102可产生光生载流子，例如电子/空穴对。在本文中，光生载流子也简称为“载流子”。
可在光子吸收/载流子产生区102中形成电场。在一些实施方式中，电场可以是“静止的”，通过改变载流子行进/俘获区106中的电场而区分。在光子吸收/载流子产生区102中的电场可包括侧向分量、垂直分量，或者同时包括侧向分量和垂直分量。电场的侧向分量可以是在图7-5的向下方向上，如用箭头表示，该侧向分量产生作用于光生载流子的力，该力朝向载流子行进/俘获区106驱动光生载流子。该电场可以多种方式而形成。
在一些实施方式中，一个或多个电极可形成于光子吸收/载流子产生区102的上方。电极可具有施加到其上面的电压，从而在光子吸收/载流子产生区102中建立电场。这种电极可称为“光门”。在一些实施方式中，光子吸收/载流子产生区102可以是完全耗尽载流子的硅的区域。
在一些实施方式中，在光子吸收/载流子产生区102中的电场可由结(例如PN结)所建立。可对光子吸收/载流子产生区102的半导体材料进行掺杂从而形成具有产生电场的取向和/或形状的PN结，该电场产生作用于光生载流子的力从而朝向载流子行进/俘获区106驱动光生载流子。在一些实施方式中，PN结二极管的P端子可连接到设定其电压的端子。这种二极管可被称为“钳位”光电二极管。钳位光电二极管可有助于在表面的载流子复合，因为端子设定其电压并且吸引载流子，由此可以减小暗电流。期望被俘获的光生载流子可在表面的复合区下放通过。在一些实施方式中，可利用在半导体材料中的梯度掺杂浓度而建立侧向电场。
如图7-5中所示，可俘获光子并且可在时间t1产生载流子101A(例如，电子)。在一些实施方式中，可沿光子吸收/载流子产生区102和载流子行进/俘获区106建立电位梯度，该电位梯度导致载流子101A在图7-5的向下方向上行进(如由在图7-5中所示的箭头所示)。响应于电位梯度，载流子101A可从在时间t1处其位置移动至在时间t2处的第二位置、在时间t3处的第三位置、在时间t4处的第四位置、和在时间t5处的第五位置。因此，载流子101A响应于该电位梯度而移动进入载流子行进/俘获区106。
载流子行进/俘获区106可以是半导体区。在一些实施方式中，载流子行进/俘获区106可以是与光子吸收/载流子产生区102(例如，硅)相同材料的半导体区，除了可将载流子行进/俘获区106屏蔽入射光(例如，利用覆盖的不透明材料，例如金属层)。
在一些实施方式中并且如下面进一步的论述，可在光子吸收/载流子产生区102和载流子行进/俘获区106中，由位于这些区域上方的电极建立电位梯度。然而，本文中所描述的技术并不局限于用于产生电位梯度的电极的特定位置。本文中所描述的技术也不局限于利用电极建立电位梯度。在一些实施方式中，可利用空间梯度掺杂曲线建立电位梯度。可利用任何合适的技术建立导致载流子沿光子吸收/载流子产生区102和载流子行进/俘获区106行进的电位梯度。
载流子分离结构可形成于像素中，从而能够将在不同时间所产生的载流子加以分离。在一些实施方式中，至少一部分的载流子分离结构可形成于载流子行进/俘获区106的上方。如将在下面所描述的，该载流子分离结构可包括形成于载流子行进/俘获区106上方的一个或多个电极，可利用控制电路控制电极的电压从而改变载流子行进/俘获区106中的电位。
可改变载流子行进/俘获区106中的电位，从而能够俘获载流子。可通过如下方法来改变电位梯度：改变在覆盖载流子行进/俘获区106的一个或多个电极上的电压，从而产生可以在预定的空间区内部限制载流子的势垒。例如，可在时间t5改变在覆盖图7-5的载流子行进/俘获区106中的虚线的电极上的电压，从而提高沿图7-5的载流子行进/俘获区106中的虚线的势垒，由此俘获载流子101A。如图7-5中所示，可将在时间t5所俘获的载流子可转移至载流子存储区108的一个仓“仓0”。可通过改变在载流子行进/俘获区106和/或载流子存储区108中的电位(例如，通过改变覆盖这些区域电极的电压)从而导致载流子行进进入载流子存储仓，而执行载流子向载流子存储仓的转移。
在某个时间点改变在载流子行进/俘获区106的预定空间区内部的电位，可使对通过在特定时间区间内所发生的光子吸收而产生的载流子的捕获成为可能。通过在不同的时间和/或位置捕获光生载流子，可以区分通过光子吸收而产生载流子的时间。从这个意义上讲，可通过在触发事件发生后的某个时间点和/或空间捕获载流子，而对载流子进行“时间分级”。在特定的仓内部对载流子的时间分级提供关于通过入射光子的吸收相对于触发事件而产生光生载流子的时间、和因此同样地“时间元”、产生光生载流子的入射光子的到达的信息。
图7-6示出了在不同的时间点和空间对载流子的俘获。如图7-6中所示，可时间t9改变在覆盖载流子行进/俘获区106中的虚线的电极上的电压从而提高沿图7-6的载流子行进/俘获区106中的虚线的势垒，由此俘获载流子101B。如图7-6中所示，可将在时间t9所俘获的载流子转移到载流子存储区108的一个仓“仓1”。因为载流子101B是在时间t9被捕获，所以它代表在与载流子101A的光子吸收事件(即，在t1)不同的时间(即，时间t6)所发生的光子吸收事件，该载流子101A是在时间t5倍俘获。
执行多次测量和基于载流子被俘获的时间而使载流子聚集在载流子存储区108的载流子存储仓中，可以提供关于光子被俘获在光子吸收/载流子产生区102中的时间的信息。这种信息可以用于如上所述的多种用途。
在一些实施方式中，在激发脉冲后的各时间元的时间段可变化。例如，较短的时间元可用于紧接在激发脉冲后检测荧光，而在激发脉冲后的更长时间可采用较长的时间元。通过改变时间元区间，可提高给定传感器的对与各时间元相关的电信号的测量的信噪比。因为紧接在激发脉冲之后光子发射事件的概率较高，所以在此时间内部的时间元可具有较短的时间区间从而导致更多光子的电位被检测。虽然在更长的时间，但光子发射的概率可以是较小并且在此时间内进行检测的时间元可更长从而补偿较少数量的光子的电位。在一些实施方式中，具有显著更长时间段的时间元可用于在多个寿命中进行区分。例如，大部分的时间元可俘获在大约0.1-0.5ns范围内的时间区间，同时时间元可俘获在大约2-5ns范围内的时间区间。时间元的数量和/或各时间元的时间区间可取决于用于检测从样品物体中所发射光子的传感器。确定各时间元的时间区间可包括对用于由用于在用于样品分析的发光标记物中进行区分的传感器所提供的时间元的数量所需的时间区间进行鉴定。可对所记录直方图的分布与在类似条件和时间元下的已知的标记的直方图进行比较，从而鉴定样品阱中标记的类型。本申请的不同实施方式可测量标记的寿命，但在用于激发标记的激发能量、各像素中传感器区的数量、和/或由传感器所检测的波长的方面有变化。
V.激发源
激发源2-250可以是布置成将激发能量传递至检测芯片的至少一个样品阱2-111的任何合适的激发源。在检测芯片上的像素可以是无源像素。术语“无源像素”是用于指代其中将激发能量从在检测芯片的像素或像素阵列外部的区域传递至像素的像素，例如，激发可以是在仪器中。
根据一些实施方式，激发源可利用辐射过程激发样品。例如，激发源可将可见辐射(例如，具有在约350nm和约750nm之间波长的辐射)、近红外辐射(例如，具有在约0.75微米和约1.4微米之间波长的辐射)、和/或短波长红外辐射(例如，具有在约1.4微米和约3微米之间波长的辐射)提供至检测芯片的至少一个样品阱的至少一个激发区3-215。在一些实施方式中，辐射激发源可提供能量以便激发与样品阱的激发区紧邻的中介体(例如，分子、量子点、或者包含所选择的分子和/或量子点的一层的材料)。该中介体可通过非辐射过程(例如，利用FRET或DET)将其能量转移至样品。
在一些实施方式中，激发源可提供多于一个的激发能量源。例如，辐射激发源可传递具有两个或更多的不同光谱特性的激发能量。作为一个例子，多颜色LED可发出中心在两个或更多的波长处的能量，并且这些能量可被传递至样品阱的激发区。
在概述中并且根据一些实施方式，仪器可包括至少一个激发源2-250，用以将激发能量提供至检测芯片的至少一个样品阱的至少一个激发区或者提供至至少一个中介体，该中介体将激发能量转移或耦合到在一个或多个激发区内部的至少一个样品。如图2-3中所示，例如来自激发源2-250的辐射激发能量2-251可撞击到在样品阱2-211附近的区域上。在一些实施方式中，可存在激发耦合结构2-223，该结构有助于入射激发能量集中在样品阱的激发区2-215内部。
激发源可用各自具有特征波长的一个或多个不同的光谱带来表征。仅为了说明的目的，将来自激发源的光谱发射的一个例子示于图8-1A的光谱图中。激发能量可大致包括在光谱激发带8-110内。光谱激发带的峰值波长8-120可用于表征激发能量。激发能量也可用光谱分布表征，例如如附图中所示全宽度半最大(FWHM)值。如图8-1A所示的产生能量的激发源可被表征为在大约540nm的辐射波长处传递能量并且具有大约55nm的FWHM带宽度。
图8-1B示出了可以为一个或多个样品阱提供两个激发能量带的一个激发源(或多个激发源)的光谱特性。根据一些实施方式，第一激发带8-112是在大约532nm处，第二激发带8-114是在大约638nm处，如附图中所示。在一些实施方式中，第一激发带可是在大约638nm处，第二激发带可在大约650nm处。在一些实施方式中，第一激发带可在大约680nm处，第二激发带可在大约690nm处。根据一些实施方式，激发带的峰值可在这些值的±5nm内。
在一些情况下，辐射激发源可产生宽的激发带，如图8-1A中所示。根据一些实施方式，宽激发带8-110可具有大于大约20nm的带宽度。例如，该宽激发带可由发光二极管(LED)产生。在一些实施例中，辐射激发源可产生狭窄的激发带，如图8-1B中所示。该狭窄激发带例如可由激光二极管产生，或者可通过光谱地过滤来自LED的输出而产生。
在一些实施方式中，激发源可以是光源。可使用任何合适的光源。一些实施方式可使用非相干光源，其它实施方式可使用相干光源。例如但不限于，根据一些实施方式的非相干光源可包括不同类型的发光二极管(LED)，例如有机LED(OLED)、量子点(QLED)、纳米线LED、和(无机)有机半导体LED。例如但不限于，根据一些实施方式的相干光源可包括不同类型的激光器，例如有机激光器、量子点激光器、垂直腔面发射激光器(VCSEL)、边缘发射激光器、和分布反馈(DFB)激光二极管。此外或可替代地，可使用板条式耦合光波导激光器(SCOWL)或者其它不对称的单模波导结构。此外或可替代地，可使用固态激光器，例如利用激光二极管抽运的Nd：YAG或Nd：玻璃，或者闪光灯。此外或可替代地，可使用激光二极管抽运光纤激光器。在一些实施方式中，可在非线性晶体、或周期偏振铌酸锂(PPLN)或者其它相似的周期性极化非线性晶体中，将激光激发源的输出的频率加倍到一半波长。此倍频过程可允许使用高效率激光器而产生更适用于激发的波长。可存在多于一种类型的用于像素阵列的激发源。在一些实施方式中，可将不同类型的激发源组合到一起。可根据用于制造所选择类型激发源的常规技术来制造激发源。
可基于对在测定分析中所采用发光标记的选择，对激发能量源的特征波长进行选择。在一些实施例中，将激发能量源的特征波长选择成用于所选择荧光团的直接激发(例如，单光子激发)。在一些实施例中，将激发能量源的特征波长选择成用于间接激发(例如，多光子激发或谐波转换至将提供直接激发的波长)。在一些实施方式中，激发能量可由用于在特定波长处产生施加给样品阱的激发能量的光源所产生。在一些实施方式中，激发源的特征波长可小于来自样品的相应发射的特征波长。在一些实施例中，激发源的特征波长可大于来自样品的发射的特征波长，并且样品的激发可通过多光子吸收而发生。
激发源可包括可位于不同于集成生物分析装置的位置的电池或任何其它电源。例如，激发源可位于仪器中，并且可利用导线和连接器将功率耦合到集成生物分析装置。
根据一些实施方式，一个或多个激发源可位于集成装置的外部，并且可布置成将光的脉冲传递至具有样品阱的集成装置。例如，光的脉冲可联接到多个样品阱并且用于激发在阱内部的一个或多个标记。根据一些实施例，一个或多个激发源可在一个或多个特征波长处传递光的脉冲。在一些情况下，可将激发源封装成安装或联接到仪器基部的可交换模块，可将集成装置装载入该模块中。可将来自激发源的能量辐射地或非辐射地传递至至少一个样品阱或者在至少一个样品阱中的至少一个样品。在一些实施例中，具有可控强度的激发源可布置成将激发能量传递至集成装置的多个像素。可将像素布置在线性阵列中(例如，行或列)、或者布置在二维阵列中(例如，像素阵列的亚区或全部的像素阵列)。
任何合适的光源可用于激发源。一些实施方式可使用非相干光源，其它实施方式可使用相干光源。通过举出非限制性例，根据一些实施方式的非相干光源可包括不同类型的发光二极管(LED)，例如有机LED(OLED)、量子点(QLED)、纳米线LED、和(无机)有机半导体LED。通过举出非限制性例，根据一些实施方式的相干光源可包括不同类型的激光器，例如半导体激光器(例如，垂直腔表面发射激光器(VCSEL)、边缘发射激光器、和分布反馈(DFB)激光二极管)。此外或可替代地，可使用板条式耦合光波导激光器(SCOWL)或者其它不对称的单模波导结构。在一些实施例中，相干光源可包括有机激光器、量子点激光器、和固态激光器(例如，利用激光二极管抽运的Nd：YAG或ND：玻璃激光器或者闪光灯)。在一些实施方式中，可使用激光器二极管抽运纤维激光器。相干光源可以是用于产生超短脉冲的被动锁定模式。可存在多于一种类型的用于在集成装置上的像素阵列的激发源。在一些实施方式中，可将不同类型激发源加以组合。可根据用于制造所选择类型激发源的常规技术来制造激发源。
通过介绍并且不限制本发明，图8-2A中示出了相干光源的示范性布置。该附图示出了分析仪器8-200，该仪器可包括超短脉冲激光激发源8-210作为激发源。超短脉冲激光器8-210可包括：增益介质8-205(在一些实施方式可以是固态材料)、用于激发增益介质(未图示)的泵浦源、和限定光学激光器腔端部的至少两个空腔反射镜8-202、8-204。在一些实施方式中，在激光器腔中可存在一个或多个另外的光学元件，用于光束整形、波长选择、和/或脉冲形成的目的。当正在操作时，脉冲激光激发源8-210可产生超短光学脉冲8-220，该光学脉冲在腔的端部反射镜8-202、8-204之间在激光器腔中来回循环并且经过增益介质8-205。空腔反射镜8-204中的一个可部分地传输一部分的循环脉冲，以便从脉冲激光器8-210中发出一连串的光学脉冲8-222。发出的脉冲可扫描用束腰w所表征的光束(用虚线表示)。
发出脉冲8-222的测量的时间强度曲线8-224可以是如图8-2中所示B。在一些实施方式中，各发出脉冲的峰值强度值可为大致相等的，曲线8-224可具有高斯时间波形，尽管其它曲线(例如sech曲线)也是可行的。在一些情况下，这些脉冲可以不具有对称的时间波形，并且可具有其它时间形状。在一些实施方式中，增益和/或损失动力学可产生具有不对称轮廓的脉冲。各脉冲的持续时间可用全宽度半最大(FWHM)值来表征，如图8-2B中所示。超短光学脉冲可具有小于100皮秒的FWHM值。
从激光激发源中发出的各脉冲可分隔达有规律间隔T。在一些实施方式中，T可由激光器中的主动增益和/或损失调整速率所决定。就锁模激光器而言，T可由在空腔端部反射镜8-202、8-204之间的往返行进时间所决定。根据一些实施方式，脉冲分离时间T可在约1ns和约100ns之间。在一些情况下，脉冲分离时间T可在约0.1ns和约1ns之间。在一些实施例中，脉冲分离时间T可be在约100ns和约2s之间。
在一些实施方式中，光学系统8-240可通过来自激光激发源8-210的脉冲8-222的光束进行操作。例如，该光学系统可包括用于对光束进行整形和/或改变光束发散角的一个或多个透镜。光束的整形可包括增加或减小束腰的值和/或改变的截面形状(例如，从椭圆形到圆形、从圆形到椭圆形，等)。改变光束的发散角可包括使光束通量会聚或发散。在一些实施例中，光学系统8-240可包括衰减器或放大器，用于改变光束能量的量。在一些情况下，该光学系统可包括波长滤波元件。在一些实施例中，该光学系统可包括脉冲整形元件，例如脉冲展宽器和/或脉冲压缩器。在一些实施方式中，该光学系统可包括一个或多个非线性光学元件，例如用于减小脉冲长度的可饱和吸收器。根据一些实施方式，光学系统8-240可包括改变来自激光激发源8-210的脉冲的偏振的一个或多个元件。
在一些实施例中，光学系统8-240可包括非线性晶体用于利用倍频将来自激发源8-210的输出波长转换成较短波长或者利用参量放大而转换成较长波长。例如，可在非线性晶体中(例如，周期极化铌酸锂(PPLN))或其它非极化非线性晶体中，使激光器的输出倍频率。这种倍频过程可允许更高效率的激光器产生更适用于所选择荧光团的激发的波长。
短语“特征波长”或“波长”可指代在由激发源所产生辐射的有限带宽度内的中心波长或主波长。在一些情况下，它可指代在由激发源所产生辐射的带宽度内的峰值波长。例如，可基于在生物分析装置中所使用发光标记物或探针的选择，而对激发源的特征波长进行选择。在一些实施例中，将激发能量源的特征波长选择用于所选择荧光团的直接激发(例如，单光子激发)。在一些实施例中，将激发源的特征波长选择用于间接激发(例如，多光子激发或谐波转换成将提供直接激发的波长)。在一些实施方式中，可利用用于在特定波长处产生用于施加给样品阱的发能量的光源而产生激发辐射。在一些实施方式中，激发源的特征波长可小于来自样品的相应发射的特征波长。例如，激发源可发出具有在500nm和700nm之间(例如，515nm、532nm、563nm、594nm、612nm、632nm、647nm)的特征波长的辐射。在一些实施方式中，激发源可提供中心是在两个不同波长(例如532nm和593nm)处的激发能量。
在一些实施方式中，可利用脉冲激发源激发发光标记物，从而测量发光标记物的发射寿命。这可用于基于发射寿命而不是基于发射颜色或波长来区分发光标记物。作为一个例子，脉冲激发源可周期性地激发发光标记物，从而产生并检测随后用于确定标记寿命的光子发射事件。当来自激发源的激发脉冲在小于发光标记物寿命的时间段中从峰值脉冲功率或强度转变到降低的(例如，几乎被熄灭)功率或强度时，发光标记物的寿命测量可以是可能的。有利的是激发脉冲迅速地终止，以便当对发光标记物寿命进行评估时在激发后相位期间激发脉冲不重新激发发光标记物。例如但不限于，脉冲功率在250皮秒后可下降至小于峰值功率大约20dB、大约40dB、大约80dB、或大约120dB。在一些实施例中，脉冲功率在100皮秒后可下降至小于峰值功率大约20dB、大约40dB、大约80dB、或大约120dB。
利用超短激发脉冲激发发光标记物的另一个优点是减小标记的光褪色。将连续的激发能量施加给标记可随时间推移而使发光标记物褪色和/或受损。即使激发源的峰值脉冲功率可显著地高于将会在连续暴露中快速地损伤标记的水平，但超短脉冲的使用可增加在标记由于激发能量而变得受损之前的有用测量的时间量和数量。
当利用脉冲激发源来区分发光标记物的寿命时，在激发能量的各脉冲之间的时间可与最长标记寿命一样长或更长，以便观察并评估在各激发脉冲之后的发射事件。例如，在各激发脉冲之间的时间间隔T(参见图8-2B)可长于被检查荧光团的任何发射寿命。在此情况下，在被以前脉冲所激发的荧光团已具有合理量的时间发荧光之前，随后的脉冲不会到达。在一些实施方式中，间隔T需要足够长以便确定在激发荧光团的激发脉冲与在激发脉冲终止之后和在下一个激发脉冲之前由荧光团所发出的以后的光子之间的时间。
尽管在各激发脉冲之间的间隔T应足够长以便观察荧光团的衰减特性，但也理想的是T是足够短从而允许在短时间段中完成许多次测量。例如但不限于，在一些应用中所使用荧光团的发射寿命可在约100皮秒至约10纳秒的范围内。因此，用于检测和/或区分这种寿命的激发脉冲可具有在约25皮秒至约2纳秒范围内的持续时间(FWHM)，并且可一在约20MHz至约1GHz范围内的脉冲重复速率而提供这些激发脉冲。
更详细地，可采用用于调整激发能量以形成用于寿命测量的脉冲激发源的任何合适的技术。激发源(例如激光器)的直接调制可包括调整激发源的电驱动信号使得发出的功率是采用脉冲的形式。可对光源的输入功率包括光抽运功率、和激发状态载流子注入和/或从一部分的增益区中的载流子去除进行调制以影响增益介质的增益，从而允许经过动态增益成形而形成激发能量的脉冲。此外，可利用各种方式来调制光学谐振腔的品质因子(Q)从而利用Q开关技术形成脉冲。这种Q开关技术可以是主动的和/或被动的。可对激光器的共振腔纵模进行锁相以产生通过锁模所发出光的一系列脉冲。这种锁模技术可以是主动的和/或被动的。激光器腔可包括单独的吸收区从而允许载流子密度的调制和该吸收区的吸收损耗的控制，因此为激发脉冲的整形提供另外的机制。在一些实施方式中，可利用光调制器将连续波(CW)光束调制成采用激发能量的脉冲形式。在其它实施方式中，可利用被发送至联接到激发源的声光调制器(AOM)的信号来改变用于产生脉冲激发能量的输出光的偏转、强度、频率、相位、和/或偏振。AOM也可用于连续波束扫描、Q-开关、和/或锁模。尽管以上技术被描述用于形成脉冲激发源，但制造脉冲激发源的任何合适方法可用于测量发光标记物的寿命。
在一些实施方式中，用于形成适用于寿命测量的脉冲激发源的技术可包括驱动光子发射的输入电信号的调制。一些激发源(例如，二极管激光器和LED)将电信号(例如输入电流)转换成光信号。该光信号的特性可依赖于电信号的特性。在产生脉冲光信号的过程中，电信号可随时间推移而变化从而产生可变光信号。通过将电信号调制成具有特定波形，可产生具有特定波形的光学信号。该电信号可具有某个频率的正弦波形，并且所形成的光脉冲可出现在与该频率相关的时间区间内。例如，具有500MHz频率的电信号可产生具有每2纳秒脉冲的光信号。由不同脉冲激发源所产生的混合光束，无论彼此是相似的还是不同的，都可具有低于1mm的相对路径差。
在一些激发源(例如激光二极管)中，电信号改变载流子密度并且通过电子与空穴对的复合而产生光子。载流子密度与光信号有关，因此当载流子密度超过阈值时，利用模拟的发射而产生大量的相干光子。提供给激光二极管的电流可将电子或载流子注入装置，由此增加载流子密度。当载流子密度超过阈值时，可以比提供载流子的电流更快的速率产生光子，因此载流子密度可下降低至于阈值并且光子产生减小。随着光子产生减少，由于连续的电流注入和光子的吸收因而载流子密度开始再次增加，并且最终增加到再次超过阈值。此循环导致载流子密度在用于光子产生的阈值附近振荡，从而导致震荡的光信号。由于载流子密度的振荡，这些动力学(被称为张弛振荡)可以导致光信号中的伪像。当把电流最初地提供给激光器时，由于载流子密度的振荡，在光信号达到稳定功率之前可存在振荡。当形成脉冲激发源时，载流子密度的振荡会导入脉冲光信号中的伪迹。例如，图8-3中的图表图示说明了载流子密度如何可通过增益开关的调制而具有张弛振荡和具有震荡功率的相应的光信号。来自这种张弛振荡的伪迹可使脉冲光信号变宽并且/或者产生在光信号中的拖尾，从而限制可以被这种脉冲光源所检测的寿命，因为激发信号会与由发光标记物所发出的光子并合。
在一些实施方式中，用于缩短激发脉冲的持续时间的技术可用于减小检测发光标记物所需的激发能量并由此减小或延迟褪色和对发光标记物的其它损害。用于缩短激发脉冲的持续时间的技术可用于减小在激发脉冲的最大值或峰值之后激发能量的功率和/或强度，从而允许较短寿命的检测。这种技术可电驱动激发源从而减小在峰值功率之后的激发功率。由此可抑制脉冲的拖尾，如图8-4的图表8-401中所示。可对电驱动信号进行修整从而在峰值脉冲之后尽可能迅速地将激发能量的脉冲强度驱动到零。将与增益开关结合的修整电驱动信号的一个实例示于图8-4的图表8-402中。这种技术可包括在产生峰值功率之后使电驱动信号的标志反转。这种修整的电驱动信号可产生在图8-4的图表8-403中所示的光学输出。可对该电信号进行修整，以便在光学信号的第一张弛振荡或第一振荡之后迅速地减小载流子密度。通过在第一振荡之后减小载流子密度，可仅产生第一振荡的光脉冲。该电信号可以用于产生短脉冲，该短脉冲通过减少在信号中的峰值之后所发射光子的数量而迅速地关闭光信号，例如显示这种电信号的光学输出的图8-5中的图表所示。根据一些实施方式，皮秒激光二极管系统可被设计成发出光脉冲。图8-6示出了具有985mW的峰值、84.3皮秒的宽度的示例性光脉冲、和在峰值的大约250皮秒后减小大约24.3dB的信号的图表。在一些实施方式中，可饱和吸收器，包括半导体可饱和吸收器(SESAM)可用于抑制光学拖尾。在这种实施方式中，利用可饱和吸收器可抑制光学拖尾达3-5dB，或者在一些情况下大于5dB。减小激发脉冲中的拖尾的影响可减小和/或排除对激发能量的额外过滤的任何要求，延长可一测量的寿命的范围，并且/或者使更快的脉冲速率成为可能。增加激发脉冲速率可使在给定的时间中进行更多的实验成为可能，由此可缩短获取足够的统计数据以便对给样品物体加标记的标记的寿命进行鉴定所需的时间。
此外，可将这些技术中的两种以上共同地用于产生脉冲激发能量。例如，可利用光学调制技术对从直接调制源中所发出的脉冲激发能量作进一步的调整。可以任何合适的方式将用于调制激发脉冲和修整电脉冲驱动信号的各技术加以组合，以便优化用于执行寿命测量的脉冲激发能量。可将修整的电驱动信号从直接调制源施加给脉冲激发能量。
在一些实施方式中，可将具有某个数量的引线接合的激光二极管用作脉冲激发源。具有更多引线接合的激光二极管可减小激发源的电感。具有较低电感的激光二极管(由图8-7的电感器8-701所代表)可使进入激光器的电流能够以较高频率操作。如图8-7中所示，当在50欧姆传输线中被18V脉冲驱动时，具有3欧姆串联电阻(由电阻器8-702所代表)和36引线接合的Oclaro激光源8-700在较高频率下具有比具有较少引线接合的激光源更高的电流。选择封装方法以使电感最小化，可提高以较高频率提供给激发源的功率，从而使更短的激发脉冲、在峰值后更快的光学功率减小、和/或增加的用于检测发光标记物的脉冲重复速率成为可能。
在一些实施方式中，传输线连同激发源可用于产生光脉冲。该传输线可与激光二极管的阻抗相匹配，从而改进光脉冲的性能和/或品质。在一些实施方式中，传输线的阻抗可以是50欧姆。在一些情况下，端接电阻可类似于传输线的电阻值从而避免反射。可替代地或另外，端接阻抗可类似于传输线的电阻从而避免反射。端接阻抗可小于传输线的阻抗以便反射负脉冲。在其它实施方式中，端接阻抗可具有电容或电感分量以便控制负反射脉冲的形状。在其它实施方式中，传输线可允许较高频率的脉冲。图8-8A示出了传输线脉冲星的的一个示范性原型，图8-8B示出了利用这种传输线所获得光脉冲的示例性时间波形。利用传输线可产生具有在40MHz至500MHz范围内的频率的电脉冲。传输线可结合上述修整电信号而使用，从而制造形成具有某个持续时间和特定时间区间的光脉冲的脉冲光源。
用于修整电信号以改进光脉冲的产生的技术可包括将激发源连接到具有负偏压能力的电路。在一些实施方式中，可在光脉冲发射之后给激发源提供将负偏压从而减少在光脉冲中拖尾的发射。图8-9示出了示例性的电路8-900；该电路包括电流源8-901、二极管激光器8-902、电阻器8-903、电容器8-904、和可用于减小光脉冲中拖尾的存在的开关8-905。这种电路8-900可产生恒电流，当开关8-905被闭合时或处于导电状态中时该恒电流绕过二极管激光器8-902。当开关8-905是打开时，开关8-905可具有高电阻并且电流可流动经过二极管激光器8-902。可通过打开和闭合开关8-905而产生光脉冲，从而给二极管激光器8-902提供断续电流。在一些情况下，电阻器8-903可以是充分地高并且电容器8-904充分地小，使得当开关8-905打开并且二极管激光器8-902发出光时在电容器8-904中存在电压。当开关8-905倍闭合时，经过电容器8-904的电压将使二极管激光器8-902反向偏置。这种反向偏置可减小或排除在光脉冲中拖尾的存在。在这种情况下，开关8-905可构造成在光脉冲的峰值后闭合从而在峰值光脉冲之后立即减小激光器功率。可对在电路8-900中的电阻器8-903的值进行选择，使得在开关随后被打开和/或以随后由激光二极管8-902产生光脉冲之前电容器8-904上的电荷将放电。
可提供另外的电路部件用以修整激光二极管的电信号从而产生光脉冲。在一些实施方式中，可将多个电容器、电阻器、和电压以网络电路的形式而连接，以便控制提供给激光二极管的电信号的波形。当存在N个电容器子电路时，通过用相应的信号S1、S2、…、SN切换一些电压V1、V2、…、VN可产生受控制的波形。将四个电容器子电路的一个示例性网络电路是示于图8-10中，其中通过分别用信号S1、S2、S3和S4切换电压V1、V2、V3和V4可产生受控制的电波形。在一些实施方式中，电压V1、V2、V3和V4可以是可变的。在图8-10中所示的实例中，V4相对于激光器是负的，并且基于信号S4可引起反向偏置。可利用信号输入S1、S2、S3和S4，对由激光器所发出光脉冲的频率的定时、各光脉冲的持续时间、和各光脉冲的特征进行调整。在一些实施方式中，可加入另外的电阻用以降低峰值电流。在这种情况下，可在开关S1、S2、S3、S4中的一个或多个之后加入电阻。尽管图8-10示出具有四个电容器和四个电压的一个配置，但可提供任何合适配置和任何合适数量的其它电路部件用以产生修整电信号以便激光二极管产生用于寿命测量的光脉冲。
在一些实施方式中，用于产生光脉冲的电信号可利用具有分立部件量的电路，包括射频(RF)和/或微波部件。可以被包括在这种电路中的分立部件是：直流隔断器、适配器、逻辑门、端接器、移相器、延迟、衰减器、合波器、和/或RF放大器。这种部件可用于形成具有某个幅值的正电信号接着形成具有其它幅值的负电信号。在正电信号与负电信号之间可存在延迟。图8-11A示出了具有一个RF放大器的一个示例性电路，该RF放大器可用于以输出脉冲(例如图8-11B中所示的脉冲轮廓)的形式而产生修整电信号，可将该修整电信号提供给激发源(例如激光二极管)以便发出光脉冲。在其它实施方式中，电路可产生多个电信号，将这些电信号加以组合而形成用于驱动激发源的电脉冲信号。这种电路可产生差分输出，该差分输出可用于增加光脉冲的功率。通过调整该电路的各分立部件，可对电输出信号进行调整从而产生适用于寿命测量的光脉冲。在图8-12A中所示的一个实例中，利用两个RF放大器产生具有在图8-12B中所示轮廓的输出脉冲信号，该脉冲信号是由组成正电信号脉冲和相应的负电信号脉冲所组成，其中正和负电信号脉冲重叠并且具有相似的宽度。
在一些实施方式中，可将各激发源加以组合以产生用于寿命测量的光脉冲。同步脉冲源可联接到在某个距离处的电路或负载。在一些实施方式中，激发源可并行地联接到电路。这些激发源可以是来自相同的源或来自多个激发源。在使用多个激发源的一些实施方式中，多个激发源可具有不同的类型。当把各激发源加以组合时，重要的是考虑阻抗电路和激发源的阻抗从而具有提供给激发源的充分的功率。可利用用于制造脉冲激发源的一种或多种上述技术而实现各激发源的组合。图8-13A示出了用于将具有一个或多个阻抗值的四个不同的激发源加以组合的示意图。图8-13B示出了作为阻抗的函数的电流、功率效率、和电压的图表。此示例性实施方式示出了4个激发源，这些激发源将功率传递至50欧姆传输线，并且当负载的阻抗使单独传输线的阻抗与激发源的数量的比率相等时出现最优功率传递。
激发源可包括电池或者用于成给激发源提供电力的任何其它电源。例如，激发源可位于仪器基部并且其操作功率可经过该仪器所联接(例如，利用导电电力线)的集成生物分析装置而接收。可独立于对集成生物分析装置的控制或者与之合作，而对激发源进行控制。仅作为一个例子，可将用于激发源的控制信号以无线方式或者与个人计算机和/或集成生物分析装置的有线互连(例如，USB互连)而提供给激发源。
在一些实施例中，激发源可以时间控制和/或与集成装置的一个或多个传感器同步的方式而操作。例如，可开启激发源以激发发光标记物然后关闭。可关闭传感器同时将开启激发源，然后在激发源被关闭后可开启达采样区间。在一些实施方式中，可开启传感器达采样区间同时开启激发源。
在一些实施方式中，作为一个例子，使用Osram PL50mW激光器提供520nm的激发光。可替代地，使用30nm或532nm的激发光。可替代地和/或此外，作为一个例子，使用Thorlabs LP637-SF7070mW激光器来提供637nm的激发光。另一个例子是在638nm处提供激发的Oclaro HL63133激光二极管。这些激光源或其它合适的激光源可单独地使用或者组合地使用。使用一个或多个激光源，将来自各激发源的激发光在光束合波器中合并然后引导至检测芯片。各光源可联接到光纤，然后可将全部的光纤捆在一起。可利用光学整形元件(OSE)对离开光纤束的光的光学特性进行控制。任选地，可使用复用器，其中利用偏振、波长和/或空间参数对来自多个光源的激光进行多路复用并经由单个光纤发送激发。可利用衍射光学元件(DOE)对不同波长的激光进行光谱分离，以便朝向四个副传感器中的一个副传感器引导不同波长的激光。
A.多个激发源
多个激发源可将具有不同能量或波长的光提供给多个样品阱。多个激发源各自可提供具有不同特征波长或能量的光。可基于来自激发源的光是否激发标记使得该标记发射光子，对一个或多个标记进行鉴定。在此方式中，可基于标记的吸收光谱，通过测量用来自不同激发源的光照射样品之后样品的响应，而对标记进行鉴定。例如，可利用来自第一激发源的光接着利用来自第二激发源的光照射具有标记的样品。如果该标记响应于被由来自第一激发源的光所照射而发出荧光，那么标记可具有与第一激发源的特征波长重叠的吸收光谱。
在一些实施方式中，能够将多个激发源用于激发能量。这些多个激发源可例如具体化为包括多个二极管激光发射体的二极管激光器棒。在激光二极管的制造中，通常将多个发射体以光刻方式制作在单个衬底上，然后切成单发射体件以便单独封装。但也可以将衬底切成具有多个发射体的各件。在一些实施方式中，发射体几乎是相同的，并且彼此可均等地间隔达光刻公差，通常为大约0.1微米。
VI.使用方法、仪器操作和用户界面
可利用软件和/或硬件来控制仪器2-120。例如，可利用处理装置1-123，(例如ASIC、FPGA)和/或执行软件的通用处理器来控制该仪器。
图9-1示出了根据一些实施方式的仪器2-120的操作的流程图。在用户已获得进行分析的试样之后，在步骤9-101用户开始新的分析。此可通过经由用户界面2-125例如通过按下按键以向仪器2-120提供指示而完成。在步骤9-103，仪器2-120检查来自以前所执行分析的检测芯片2-110是否仍然被插入仪器2-120中。如果确定原来的检测芯片还存在，那么可在步骤9-105将提供给激发源的功率关闭，在步骤9-107利用用户界面2-125的指示器提示用户推出以前的检测芯片，在步骤9-109仪器2-120等待原来的检测芯片被推出。
当以前的检测芯片倍用户推出时，或者如果仪器2-120在步骤9-103确定以前的检测芯片已被取出，则在步骤9-111提示用户插入新的检测芯片2-110进行新的分析。然后，在步骤9-113仪器2-120等待新的检测芯片2-110被插入。当用户插入新的检测芯片时，在步骤9-115由用户界面2-125的指示器提示用户将要被分析的试样置于检测芯片2-110的暴露上表面上并且也提示用户将在仪器2-120上的盖子闭合。然后，在步骤9-117仪器2-120等待盖子被闭合。当用户将盖子闭合时，在步骤9-119可驱动激发源产生激发能量，该激发能量是用于激发存在于检测芯片2-110的样品阱中的试样的样品部分的。在步骤9-121，传感器2-122对来自样品的发射能量进行检测，使来自传感器2-122的数据流动到处理装置2-123进行分析。在一些实施方式中，可使数据流动到外部计算装置2-130。在步骤2-123，仪器2-120检查数据采集是否完成。可在特定长度的时间之后完成数据采集，来自激发源或一个特定靶的特定数量的激发脉冲已被鉴定。当数据采集完成时，在步骤9-125结束数据分析。
图9-2示出了根据一些实施方式的一个示范性自校准程序。可在试样分析前的任何适当时间执行该校准程序。例如，该程序可在装运至终端用户之前由各仪器的制造商完成。可替代地，终端用户可在任意适宜的时间执行校准。如上所述，仪器2-120能够在具有从不同样品中所发出不同波长的发射能量之间进行区分。可利用与各特定颜色光(与例如用于正在进行分析的试样的标签分子的发光标签相关的光)对相关的校准仪器2-120和/或计算装置2-130进行校准。因此，可确定与特定颜色相关的精确的输出信号。
为了校准装置，在一个时间将一个与单发光标签相关的校准试样提供给仪器2-120。在步骤9-201，当用户把包含发出单波长发射能量的发光标签的试样置于检测芯片2-110上并把检测芯片2-110插入仪器2-120中时，自我校准开始。利用用户界面2-125，用户指示仪器2-12开始自校准。作为响应，在步骤9-203，仪器2-120通过用激发能量注射检测芯片2-110并测量来自校准试样的单波长发射能量而执行校准分析。然后，在步骤9-205，仪器2-120可保存在用于传感器阵列各像素的传感器2-122的副传感器阵列上所测量的检测样式。用于各发光标签的检测形式可看作是与发光标签相关的检测特征。因此，可将这些性质用作用于对在随后的分析运行中被分析的未知样品中所接收的数据进行分析的训练数据集。
然后，可为与单发光标签相关的每个校准试样执行上述校准程序。因此，像素阵列的各传感器2-122与可用于在校准程序完成后在步骤9-207所实施的随后的分析期间确定发光标签存在于样品阱中的校准数据是相关的。
图9-3还示出了根据一些实施方式如何可获取校准数据并将其用于对数据进行分析。在步骤9-301，从传感器获得校准数据。这可利用前述自校准程序而完成。在步骤9-303，基于校准数据生成变换矩阵。该变换矩阵将传感器数据映射至样品发射波长并且是m×n矩阵，其中m是具有不同发射波长的发光标签的数量，n是用于检测每个像素的发射能量的副传感器的数量。因此，变换矩阵的各列代表传感器的校准值。例如，如果每个像素存在四个副传感器和五个不同的发光标签，那么变换矩阵是4×5矩阵(即，4行和5列)并且各列与不同的发光标签是相关的，在列中的值与在自校准程序期间从副传感器所获得的测量值相对应。在一些实施方式中，各像素可具有其自己的变换矩阵。在其它实施方式中，可对来自至少部分像素的校准数据进行平均值计算，然后所有像素可基于平均的数据而利用相同的变换矩阵。
在步骤9-305，从各传感器获得与生物测定相关的分析数据。这可以任何的上述方式而完成。在步骤9-307，可利用变换矩阵和分析数据来确定发光标签的发射能量的波长和/或特征。这可以任何合适的方式而完成。在一些实施方式中，将分析数据乘以变换矩阵的伪逆，从而形成m×l向量。然后，可将与具有最大值的该向量或分量相关的发光标签鉴定为存在于样品阱中的发光标签。本发明的实施方式并不局限于此技术。在一些实施方式中，为了防止在获得逆矩阵逆时可能的病态，可执行约束最优化例程，例如最小二乘法或最大似然技术，以确定发光标签存在于样品阱中。
利用校准数据对来自传感器的数据进行分析的前述方法可由任何合适的处理器而实施。例如，仪器2-120的处理装置2-123可执行分析，或者计算装置2-130可执行分析。
VII.使用检测芯片和仪器的示范性测量
用于对样品中的分子进行检测、分析、和/或探测的测量，可利用本申请中所描述的检测芯片和仪器的任意组合而实现。激发源可以是脉冲激发源，或者在一些情况下是连续波源。给特定样品加标签的发光标记物可指示样品的存在。可利用由标记所发出的激发能量、发射能量、和/或发射能量的寿命来区分各发光标记物。通过确定各标记的寿命，可对具有相似荧光发射波长的标记进行鉴定。此外，可利用各标记的荧光发射波长，来鉴定具有相似寿命的标记。通过使用标记，其中各标记是利用发出荧光的时间和/或光谱特性的组合而鉴定，可以执行对标记和相关样品的定量分析和/或鉴定。
寿命测量可用于确定标记存在于样品阱中。通过执行其中发光标记物被激发成为激发状态然后测量光子发射的时间的多次实验，可以鉴定各发光标记物的寿命。给激发源施以脉冲从而产生激发能量的脉冲并使其指向标记。对激发脉冲与随后的来自发光标记物的光子发射事件之间的时间进行测量。通过利用多个激发脉冲来重复这种实验，可确定在特定时间区间内光子发射的情况的数量。这种结果可占据表示在一系列单独时间区间或时间元内所发生光子发射事件的数量的直方图。可对时间元和/或各元的时间区间的数量进行调整，以鉴定特定组的寿命和/或标记。
接下来描述的是在一些实施方式中可用来鉴定发光标记物的示范性测量。具体地，对仅利用发光寿命测量、联合的光谱与发光寿命测量、和仅发光寿命测量但使用两种不同的激发能量来区分发光标记物的实例进行论述。实施方式并不局限于下面详细描述的实例。例如，一些实施方式可仅利用光谱测量来鉴定发光标记物。
可采用任何合适的发光标记物。在一些实施方式中，可采用市场上了买到的荧光团。例如但不限于，可使用以下荧光团：Atto Rho14(“ATRho14”)、Dylight650(“D650”)、SetaTau647(“ST647”)、CF633(“C633”)、CF647(“C647”)、Alexa fluor647(“AF647”)、BODIPY630/650(“B630”)、CF640R(“C640R”)和/或Atto647N(“AT647N”)。
此外和/或任选地，可以任何合适的方式来改变发光标记物，以提高样品分析过程的速度和准确度。例如，可将光稳定剂偶联到发光标记物。光稳定剂的例子包括但不限于：除氧剂或三重态猝灭剂。通过将光稳定剂偶联到发光标记物可增加发射光子的速率并且也可减小其中发光标记物不发射光子的“闪烁”效应。在一些实施方式中，当生物事件以毫秒级发生时，增加的光子发射速率可提高生物事件的检测的概率。增加的光子事件速率可随后增加荧光信号的信噪比并且增加在进行寿命测量的速率，从而导致更快且更精确的样品分析。
此外，视需要，可对在集成装置的样品阱中的环境进行调整从而设计这些标记的寿命。这可以通过确认标记寿命受到标记的状态密度的影响而实现，该标记的状态密度可以利用环境进行调整。例如，标记与样品阱的金属底层的距离越远，则寿命越长。因此，为了增加标记的寿命，样品阱的底面(例如凹坑)的深度可从金属层延伸达某个距离。另外，用于构成样品阱的材料会影响标记的寿命。虽然不同的标记通常具有它们的在相同方向上位移的寿命(例如，更长或者更短)，但就不同的标记而言该效应可不同地缩放。因此，可对在自由空间中不能利用寿命测量加以区分的两个标记进行设计，以便可通过制作样品阱环境从而调整各种标记的寿命而加以区分。
A.单分子检测和测序
根据本申请的一个方面，当单分子暴露于多个单独的光脉冲时，可以基于从分子中所发出一系列光子的一种或多种特性对单分子进行鉴定(例如，与反应样品中其它可能分子加以区分)。在一些实施方式中，用发光标记物给该分子加标记。在一些实施方式中，发光标记物是荧光团。在一些实施方式中，可以基于发光标记物的特性来鉴别或区分发光标记物。发光标记(例如，荧光团)的特性包括但不限于：发光寿命、吸收光谱、发射光谱、荧光量子产率、和发光强度、及其中两个以上的组合。
在检测(例如，测序)的准备中，可对生物样品进行处理。这种处理可以包括生物分子(例如，核酸分子)从生物样品中的分离和/或纯化、及产生生物分子的更多拷贝。在一些实例中，从受试对象的体液或组织中分离并纯化一个或多个核酸分子，并且经过核酸扩增(例如聚合酶链反应(PCR))而扩增。然后，可以鉴定一个或多个核酸分子或其亚单位，例如通过测序。然而，在一些实施方式中，可以不要求扩增的情况下以本申请中所描述的方式来评估核酸样品(例如，测序)。
测序可以包括：通过合成出与模板互为互补或类似的另一种生物分子，例如通过合成与模板核酸分子为互补的核酸分子而确定模板生物分子(例如，核酸分子)的单独的亚单位；以及鉴定随时间推移核苷酸的并入(例如，通过合成的测序)。作为一个替代，测序可以包括生物分子的单独亚单位的直接鉴定。
在测序期间，聚合酶可偶联(例如，附接)到靶核酸分子的引发位置。该引发位置可以是与靶核酸分子为互补的引物。作为一个替代，引发位置是在靶核酸分子的双链段内部所提供的缺口或切口。缺口或切口的长度可以是从0到至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30或40个核苷酸。切口可以提供在双链序列的一条链中的断裂，该断裂可以提供用于聚合酶(例如链置换聚合酶)的引发位置。
在一些情况下，测序引物可以退火到可以或可以不被固定化到固体载体(例如样品阱)的靶核酸分子。在一些实施方式中，可将测序引物固定化到固体载体，靶核酸分子的杂交也将靶核酸分子固定化到固体载体。通过酶(例如，聚合酶)的作用能够将核苷酸加入或并入引物，可以将核苷酸以5’到3’的模板结合方式加入到引物。这种核苷酸向引物的并入(例如，利用聚合酶的作用)通常可以被称为引物延伸反应。可以将各核苷酸与可以被检测且用于确定并入引物的各核苷酸和因此新合成核酸分子的序列的可检测标签相联。利用新合成核酸分子的序列互补性，也可以确定靶核酸分子的序列。在一些情况下，将测序引物退火到靶核酸分子和将核苷酸并入测序引物可以在相似的反应条件下(例如，相同或相似的反应温度)或者在不同的反应条件下(例如，不同的反应温度)发生。此外，一些通过合成进行测序的方法可以包括在一群靶核酸分子(例如，靶核酸的拷贝)存在下和/或利用靶核酸的扩增步骤而获得靶核酸的群体。
本发明的实施方式能够以高准确度和长读取长度对单核酸分子进行测序。在一些实施方式中，单分子测序中所使用的靶核酸分子是单链靶核酸(例如，脱氧核糖核酸(DNA)、DNA衍生物、核糖核酸(RNA)、RNA衍生物)模板；该模板被加到或固定化到容纳被固定化或附接到固体载体(例如样品阱的底部)的测序反应的至少一个其它组分(例如，聚合酶，例如DNA聚合酶、测序引物)的样品阱。靶核酸分子或聚合酶可以直接地或经过接头而附接到样品壁，例如在样品阱的底部。样品阱也可以容纳利用引物延伸反应而合成核酸所需的任何其它试剂，例如合适的缓冲剂、辅因子、酶(例如，聚合酶)、及脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸，包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，这些试剂包括发光标签，例如荧光团。将各类型的dNTP(例如，含腺嘌呤的dNTP(例如，dATP)、含胞嘧啶的dNTP(例如，dCTP)、含鸟嘌呤的dNTP(例如，dGTP)、含尿嘧啶的dNTP(例如，dUTP)、和含胸腺嘧啶的dNTP(例如，dTTP))偶联到不同的发光标签，使得从标签中所发出光的检测可表示被并入新合成核酸的dNTP的特征。利用任何合适的装置和/或方法，包括本文中其它地方所描述的用于检测的装置和方法，可以对从发光标签中所发出的光进行检测，并且所发出的光是归因于其适当的发光标签(和因此，相关的dNTP)。可将发光标签在任何位置偶联到dNTP，使得发光标签的存在不阻止dNTP被并入新合成核酸链或聚合酶的活性。在一些实施方式中，将发光标签偶联到dNTP的末端磷酸(γ磷酸酯)。
单链靶核酸模板可以与测序引物、dNTP、聚合酶和核酸合成所必需的其它试剂接触。在一些实施方式中，所有合适的dNTP可以同时地与单链靶核酸模板接触(例如，所有的dNTP同时地存在)使得dNTP的并入可以连续地发生。在其它实施方式中，各dNTP可以顺序地与单链靶核酸模板接触，其中使单链靶核酸模板单独地与各合适的dNTP接触，并且在单链靶核酸模板与不同的dNTP接触之间具有清洗步骤。使单链靶核酸模板单独地与各dNTP接触接着清洗的这种循环可以重复，以便对单链靶核酸模板的各相继的碱基位置进行鉴定。
测序引物退火到单链靶核酸模板，并且聚合酶利用单链靶核酸模板连续地将dNTP(或其它脱氧核糖核苷多磷酸)并入引物。可以在将dNTP并入引物期间或之后，可以用合适的激发光来激发与各并入的dNTP相关的唯一发光标签，随后可以利用任何合适的装置和/或方法，包括在本文中其它地方所描述的用于检测的装置和方法对其发射进行检测。对特定光发射的检测可以归因于特定的并入的dNTP。然后，可以将基于对检测发光标签的收集所获得的序列用于利用序列互补性来确定单链靶核酸模板的序列。
虽然本公开提到了dNTP，但本文中所提供的装置、系统和方法也可以用于各种类型的核苷酸，例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(例如，具有至少4、5、6、7、8、9或10个磷酸基的脱氧核糖核苷多磷酸)。这种核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸可以包括各种类型的标签(或标记)和接头。
可将在核苷并入时所发出的信号存储于存储器并且以后的时间点检测处理以确定靶核酸模板的序列。这可包括对这些信号与参考信号进行比较以确定作为时间的函数的所并入核苷的特性。可替代地或另外，可以将在核苷并入时所发出的信号加以收集并实时地进行处理(即，在核苷并入时)从而实时地确定靶核酸模板的序列。
如果多个样品阱是可利用的，则可以完成多个单链靶核酸模板的核酸测序，正如在本文中其它地方所描述装置中的情况。可以给各样品阱提供单链靶核酸模板，并且可以在各样品阱中完成测序反应。在引物延伸反应期间可时每个样品阱与核酸合成所必需的适当试剂(例如，dNTP、测序引物、聚合酶、辅因子、合适的缓冲剂等)接触，并且测序反应可以在各样品阱中进行。在一些实施方式中，使各样品阱同时地与所有合适的dNTP接触。在其它实施方式中，使多个样品阱单独地与各合适的dNTP接触，并且在与不同的dNTP接触之间进行清洗。可以在各样品阱中对并入的dNTP进行检测，并且在各样品阱中确定单链靶核酸的序列，如上所述。
针对单分子RNA测序的实施方式可使用能够基于RNA模板板合成互补DNA(cDNA)的任何逆转录酶。在这种实施方式中，逆转录酶可以以类似于该cDNA中的聚合酶的方式而发挥作用，该cDNA可以基于RNA模板利用将dNTP并入退火到RNA模板的逆转录引物而合成。然后，cDNA可以参与测序反应并且以如上所述的方式确定其序列。然后，可以应用所确定的cDNA的序列并利用序列互补性来确定原来的RNA模板的序列。逆转录酶的例子包括：莫洛尼氏鼠白血病病逆转录酶(M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1)、和端粒酶逆转录酶。
序列读取可以用于重构受试对象的基因组的更长区域(例如，通过对准)。读取可以用于重构染色体区、整个染色体、或者整个基因组。序列读取或者基于这种读取所产生的较大序列可以用于对受试对象的基因组进行分析，例如以鉴定变异体或多态性。变异体的例子包括但不限于：单核苷酸多态性(SNP)包括串联SNPs、小规模多碱基缺失或插入，也被称为插入缺失或缺失插入多态性(DIP)、多核苷酸多态性(MNP)、短串联重复序列(STR)、缺失(包括微缺失)、插入(包括微插入)、结构变异(包括复制、倒位、易位、增殖、复杂多位变异、拷贝数变异(CNV)。基因组序列可以包括各变异的组合。例如，基因组序列可以包括一个或多个SNP与一个或多个CNV的组合。
在一些实施方式中，基于发光寿命对分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于发光强度对这些进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于观察所发出光子所必需的传递激发能量的波长对分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于所发射光子的波长对分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于观察所发出光子所必需的传递激发能量的发光寿命和波长两者对分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于观察所发出光子所必需的所传递激发能量的发光强度和波长两者，对这些分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于观察所发出光子所必需的发光寿命、发光强度、和所传递激发能量的波长，对这些分子进行鉴别或区分。在一些实施方式中，基于发光寿命和所发射光子的波长来鉴别或区分各分子。在一些实施方式中，基于所发射光子的发光强度和波长，对分子进行鉴定或区分。在一些实施方式中，基于所发射光子的发光寿命、发光强度和波长，对分子进行鉴别或区分。
在某些实施方式中，用不同的发光标记物给在反应混合物或实验中的不同类型的分子加标记。在一些实施方式中，不同的标记具有可以区分的不同发光特性。在一些实施方式中，利用具有不同发光寿命、不同发光强度、所发射光子的不同波长、或者其组合对不同的标记进行区分。具有不同发光标记物的多种类型分子的存在可允许对复杂反应的不同步骤进行监测，或者允许对复杂反应产物的不同组分进行鉴定。在一些实施方式中，可以确定其中不同类型分子发生反应或相互作用的顺序。
在某些实施方式中，利用具有不同发光标记物的多种类型分子的发光特性来鉴定生物分子(例如核酸或蛋白质)的序列。在一些实施方式中，在生物分子的合成期间当单分子被并入时，利用具有不同发光标记物的多种类型分子的发光特性来鉴定单分子。在一些实施方式中，当在测序反应期间单核苷酸被并入时，利用具有不同发光标记物的多种类型核苷酸的发光特性来鉴定单核苷酸。在一些实施方式中，可以利用在本申请中所描述的方法、组成、和装置来鉴定被并入由聚合酶所合成的模板依赖性核酸测序反应产物的一系列的核苷酸。
在某些实施方式中，模板依赖性核酸测序产品是利用天然存在的核酸聚合酶而实施。在一些实施方式中，聚合酶是天然存在聚合酶的突变体或修改的变体。在一些实施方式中，模板依赖性核酸序列产物将包括与模板核酸链为互补的一个或多个核苷酸段。在一个方面，本申请提供一种通过确定其互补核酸链的序列而确定模板(或靶)核酸链的序列的方法。
在另一个方面中，本申请提供通过对多个核酸片段进行测序而对靶核酸进行测序的方法，其中靶核酸包括片段。在某些实施方式中，该方法包括将多个片段序列加以组合从而提供亲体母靶核酸的序列或部分序列。在一些实施方式中，组合的步骤是由计算机硬件和软件所执行。本文中所描述的方法可允许对一组的相关的靶核酸，例如整个染色体或基因组进行测序。
术语“基因组”通常是指全部的生物体的遗传信息。可以将基因组编码于DNA或RNA中。基因组可以包括为蛋白质进行编码的编码区以及非编码区。基因组可以包括在生物体中的所有染色体的序列。例如，人类基因组具有总共46个染色体。全部的这些序列共同地组成人类基因组。在一些实施方式中，确定整个基因组的序列。然而，在一些实施方式中，用于基因组的一个亚组(例如，一个或数个染色体、或其区域)或用于一个或数个基因(或其片段)的序列信息对于诊断、预后、和/或治疗用途而言是充分的。
在一些情况下，可以将测序引物退火到可以或可以不被固定化到固体载体(例如样品阱(如，纳米孔))的靶核酸分子。在一些实施方式中，可将测序引物固定化到固体载体，并且靶核酸分子的杂交也将靶核酸分子固定化到固体载体。在一些实施方式中，将聚合酶固定化到固体载体，并且使可溶性引物和靶核酸与聚合酶接触。然而，在一些实施方式中，在溶液中形成包括聚合酶、靶核酸和引物的复合物，并且将该复合物固定化到固体载体(例如，利用聚合酶、引物、和/或靶核酸的固定化)。
在适当的条件下，与退火的引物/靶核酸接触的聚合酶可以将一个或多个核苷酸加大或并入到引物上，并且可以将核苷酸以5’至3’模板结合方式加入引物中。这种核苷酸并入到引物上(例如，利用聚合酶的作用)通常可以被称为引物延伸反应。各核苷酸与可检测标签可以是相关的，该可检测标签可以被检测和鉴别(例如，基于其发光寿命、发射光谱、吸收光谱、和/或其它特性)并且是用于确定并入引物中的各核苷酸和因此新合成核酸分子的序列。也可以利用新合成核酸分子的序列互补性来确定靶核酸分子的序列。在一些实施方式中，通过合成进行测序的方法可以包括靶核酸分子的群体(例如，靶核酸的拷贝)的存在、和/或用于获得靶核酸群体的靶核酸的扩增步骤。然而，在一些实施方式中，通过合成进行测序是用于在正在进行评估的各反应中确定单分子的序列(并且不要求核酸扩增来制备用于测序的靶模板)。在一些实施方式中，根据本申请的各方面，并行地执行多个单分子测序反应(例如，在单个整体装置或芯片上)。
实施方式能够以高准确度和长读取长度(例如至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％、99.999％、或99.9999％的准确度，和/或大于或等于约10个碱基对(bp)、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、1000bp、10,000bp、20,000bp，30,000bp、40,000bp、50,000bp、或100,000bp的读取长度)对单核酸分子进行测序。
靶核酸分子或聚合酶可以直接地或经过接头而附接到样品壁，例如在样品阱的底部。该样品阱(例如，纳米孔)也可以容纳利用引物延伸反应合成核酸所需的任何其它试剂，例如适的缓冲剂、辅因子、酶类(例如，聚合酶)、及脱氧核糖核苷多磷酸，例如脱氧核糖核苷三磷酸，包括脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，这种试剂包括发光标签，例如荧光团。在一些实施方式中，将各类型的dNTP(例如含腺嘌呤的dNTP(例如，dATP)、含胞嘧啶的dNTP(例如，dCTP)、含鸟嘌呤的dNTP(例如，dGTP)、含尿嘧啶的dNTP(例如，dUTP)和含胸腺嘧啶的dNTP(例如，dTTP))偶联到不同的发光标签，使得对从标签中发出光的检测可表示被并入新合成核酸中的dNTP的特征。可以利用任何合适的装置和/或方法，包括在本文中其它部分所描述的用于检测的装置和方法，对从发光标签中所发出的光进行检测，并且归因于其适当的发光标签(和，因此相关的dNTP)。发光标签可在任何位置偶联到dNTP，使得发光标签的存在不阻止dNTP并入新合成的核酸链或者聚合酶的活性。在一些实施方式中，将发光标签偶联到dNTP的末端磷酸(γ-磷酸酯)。
在一些实施方式中，测序引物退火到单链靶核酸模板并且聚合酶利用单链靶核酸模板将dNTP(或其它脱氧核糖核苷多磷酸)连续地并入引物。在将dNTP并入引物的期间或之后可以利用合适的激发光来激发与各并入的dNTP相关的唯一发光标签，随后可以利用任何合适的装置和/或方法)，包括在本文中的其它部分所描述的用于检测的装置和方法，对其发射进行检测。对特定光发射的检测(例如，具有特定的发射寿命、强度、和/或其组合)可以归因于特定的并入的dNTP。然后，可以利用基于对检测发光标签的收集所获得的序列，并利用序列互补性来确定单链靶核酸模板的序列。
虽然本公开提到了dNTP，但本文中所提供的装置、系统和方法也使用用各种类型的核苷酸，例如核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸(例如，具有至少4、5、6、7、8、9或10个磷酸基的脱氧核糖核苷多磷酸)。这种核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸可以包括各种类型的标签(或标记)和接头。
作为一个例子，图10-1示意性地示出了单分子核酸测序方法的准备。该实例并非意图以任何方式限制本发明。610是样品阱(例如，纳米孔)，用于容纳包括核酸聚合酶601、被测序的靶核酸602、和引物604的单复合物。在此实例中，样品阱610的底部区域倍图示为靶空间620。在图10-1中，包含聚合酶601的复合物倍限制在靶空间620中。任选地，可通过附接到样品阱的表面而将该复合物固定化。在此实例中，利用包括适用于将接头附接到聚合酶601的一个或多个生物分子(例如，生物素)的接头603将复合物固定化。
样品阱的该空间也容纳反应混合物以及合适的溶剂、缓冲剂、和用于聚合酶复合物合成核酸链所必需的其它添加剂。反应混合物也包含多种类型的发光标记物核苷酸。各类型的核苷酸是用符号*-A、@-T、$-G、#-C所代表，其中A、T、G和C表示核苷酸碱基，符号*、@、$和#表示经过接头附接到各核苷酸的唯一发光标记。在图10-1中，利用电流将#-C核苷酸并入互补链602。所并入的核苷酸位于靶空间620的内部。
图10-1也用箭头表示将激发能量传递至靶空间的附近并且朝向检测器发射荧光的概念。箭头是示意性的，而并非意图表示激发能量传递或荧光的具体取向。一些荧光可在载体上发出，这些荧光不被引导至检测器(例如，朝向样品阱的侧壁)并且不可检测。
图10-2示意性地示出了随时间推移在单样品阱中的测序过程。阶段A至D示出了具有聚合酶复合物的样品阱，如图10-1中所示。阶段A示出了在任何核苷酸已倍加入到引物之前初始状态。阶段B示出了发光标记物核苷酸(#-C)的并入事件。阶段C示出了在各并入事件之间的时段。在此实例中，核苷酸C已被加入到引物中，并且以前附接到发光标记物核苷酸(#-C)的具标记和接头已被切断。阶段D示出了发光标记物核苷酸(*-A)的第二并入事件。在阶段D之后，该互补链是由引物、C核苷酸、和A核苷酸所组成。
阶段A和阶段C两者示出了在各并入事件之前或之间的时段，该时段在此实例中被图示为延续达大约10毫秒。在阶段A和C中，因为不存在并入的核苷酸，所以在靶空间中不存在发光标记物核苷酸(在图10-2中未示出)，尽管来自不被并入的发光标记物核苷酸的背景荧光或杂散荧光可被检测。阶段B和D示出了不同核苷酸(分别是#-C、和*-A)的并入时间。在此实例中这些事件也被图示为延续达约10毫秒。
被标注为“原始元数据”的行示出了在各阶段期间所产生的数据。在整个示范性实验中，多个光脉冲被传递至靶空间的附近。就各脉冲而言，检测器是用于对由检测器所接收的任何发出光子进行记录，并且基于从激发能量的最后脉冲开始的持续时间将该检测光子分配至时间元。在此实例中存在3个元，并且“原始元数据”记录1(最短的棒)、2(中间的棒)、或3(最长的棒)的值，分别对应于最短的、中间和最长的元。各棒表示对发射光子的检测。
因为在阶段A或C中在靶空间中不存在发光标记物核苷酸，所以不存在倍检测的光子。就每个阶段B和D而言，在并入事件期间检测到多个荧光。发光标记#具有比发光标记*更短的荧光寿命。因此，阶段B的数据倍图示为具有与其中元值为较高的阶段D相比较低的记录平均元值。
被标注为“阱处理的数据”的行显示原始数据，该原始数据已被处理以表示在相对于各脉冲的时间所发出光子的数量(计数)。在此实例中，仅对数据进行处理以确定发光寿命，但也可对用于其它发光特性的数据进行评估，例如被吸收或发出光子的发光强度或波长。示例性的经处理数据近似用于在靶空间中的发光标记物的荧光寿命的指数衰减曲线特性。因为发光标记#具有比发光标记*更短的荧光寿命，所以用于阶段B的经处理数据在更长的持续时间中具有较少的计数，同时用于阶段D经处理数据在更长的持续时间中具有相对地较多的计数。
图10-2的示范性实验将会把加到互补链中的前两个核苷酸鉴定为CA。就DNA而言，因此紧接在退火到引物的区域后面的靶链的序列将会倍鉴定为GT。在此实例中，可以单独地基于发光寿命，在多个C、G、T和A中区分核苷酸C和A。在一些实施方式中，被吸收或发出光子的其它特性(例如发光强度或波长)对于区分一个或多个特定的核苷酸会是必需的。
B.发光特性
如本文中所描述，发光分子是吸收一个或多个光子并且随后在一个或多个持续时间之后可发出一个或多个光子的分子。分子的荧光是利用若干参数进行描述，包括但不限于：发光寿命、吸收和/或发射光谱、发光量子产率、和发光强度。
从发光发射事件中所发出的光子将在可能的波长的光谱范围内的波长处发射光子。通常，发出的光子与激发光子的波长相比具有更长的波长(例如，具有较少的能量或发生红移)。在某些实施方式中，通过测量所发射光子的波长对分子进行鉴定。在某些实施方式中，通过测量多个发射光子的波长而对分子进行鉴定。在某些实施方式中，通过测量发射光谱而对分子进行鉴定。
发光寿命是指与激发事件和发射事件相关的持续时间(例如，发射衰减时间)。在一些实施方式中，在指数衰减的方程式中将发光寿命表示常数。在其中存在用于传递激发能量的一个或多个脉冲事件的一些实施方式中，持续时间是在脉冲与随后发射事件之间的时间。
发光量子产率是指在导致发射事件的给定波长处或给定光谱范围内的激发事件中的部分，并且通常小于1。在一些实施方式中，本文中所描述分子的发光量子产率是在0和约0.001之间、在约0.001和约0.01之间、在约0.01和约0.1之间、在约0.1和约0.5之间、在约0.5和0.9之间、或者在约0.9和1之间。在一些实施方式中，通过确定或估计发光量子产率而鉴定分子。
本文中所使用的单分子发光强度是指每单位时间由通过脉冲激发能量的传递而激发的分子所发出的发射光子的数量。在一些实施方式中，发光强度是指每单位时间由通过脉冲激发能量的传递而激发的分子所发出的发射光子的检测数量，并且是由特定的传感器或传感器组所检测。
在一个方面，本申请提供一种确定单个发光分子的发光寿命的方法。该方法包括：将发光分子提供至靶空间中；将激发能量的多个脉冲传递至靶空间的附近；和检测来自发光分子的多个荧光。在一些实施方式中，该方法还包括记录在各对的脉冲和荧光之间的多个持续时间，并且评估在各对的脉冲和荧光之间的多个持续时间的分布。
C.发光标记物核苷酸
在一个方面，本文中所描述的方法和组合物包括一个或多个发光标记物核苷酸。在某些实施方式中，一个或多个核苷酸包括脱氧核糖核苷。在一些实施方式中，所有核苷酸包括脱氧核糖核苷。在某些实施方式中，一个或多个核苷酸包括核糖核苷。在一些实施方式中，所有核苷酸包括核糖核苷。在一些实施方式中，一个或多个核苷酸包括修改的核糖或核糖类似物(例如，锁定核酸)。在一些实施方式中，一个或多个核苷酸包括天然存在的碱基(例如，胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶)。在一些实施方式中，一个或多个核苷酸包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、胸腺嘧啶、或尿嘧啶的衍生物或类似物。
在某些实施方式中，方法包括使聚合酶复合物暴露于多个发光标记核苷酸的步骤。在某些实施方式中，组合物或装置包括包含多个发光标记核苷酸的反应混合物。在一些实施方式中，多个核苷酸包括四种类型的核苷酸。在一些实施方式中，四种类型的核苷酸各自包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、和胸腺嘧啶中的一个。在一些实施方式中，四种类型的核苷酸各自包括胞嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤、和尿嘧啶中的一个。
本文中所使用的术语“核酸”通常是指包括一个或多个核酸亚单位的分子。核酸可包括选自腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)、或其变体的一个或多个亚单位。在一些实例中，核酸是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、或其衍生物。核酸可以是单链或双链。核酸可呈圆形。
本文中所使用的术语“核苷酸”通常是指核酸亚单位，该核酸亚单位可以包括A、C、G、T或U或者其变体或类似物。苷酸可以包括可以被并入生长的核酸链中的任何亚单位。这种亚单位可以是A、C、G、T或U，或者对一个或多个互补的A、C、G、T或U为特异性或者与嘌呤(即，A或G，或者其变体或类似物)或嘧啶(即，C、T或U，或者其变体或类似物)为互补的任何其它亚单位。亚单位可以使单独的核酸碱基或碱基组(例如，AA、TA、AT、GC、CG、CT、TC、GT、TG、AC、CA、或其尿嘧啶对应物)能够被分解。
核苷酸一般包括1个核苷和至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的磷酸(PO3)基。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或者脱氧核糖)、和一个或多个磷酸基。核糖核苷酸是其中糖是核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸是其中糖是脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷单磷酸或核苷多磷酸。核苷酸可以是脱氧核糖核苷多磷酸，例如，脱氧核糖核苷三磷酸，其可以是选自脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧尿苷三磷酸(dUTP)和脱氧胸苷三磷酸(dTTP)dNTP，这些核苷酸包括可检测标签，例如发光标签或标记(例如，荧光团)。
一个核苷多磷酸可以具有“n”个磷酸基，其中“n”为大于或等于2、3、4、5、6、7、8、9、或10的数字。核苷多磷酸的例子包括核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸可以是末端磷酸标记的核苷，例如末端磷酸标记的核苷多磷酸。这种标记可以是发光(例如，荧光或化学发光)标记、发光标记物、着色标记、显色标记、质量标签、静电标记、或电化学标记。标记(或标记)可经过接头而联接到末端磷酸。该接头可以包括例如至少一个或多个羟基、巯基、胺基或卤代烷基，这些基可适用于在天然或修改核苷酸的末端磷酸处形成例如磷酸酯、硫酯、氨基磷酸酯或烷基膦酸酯连接。接头可以是可断裂的，以便将标记与末端磷酸分离，例如借助于聚合酶。美国专利7,041,812中提供了核苷酸和接头的例子，该专利的全部内容以参考的方式并入本文中。
D.标记
在某些实施方式中，并入的分子是发光分子，例如，没有不同发光标记物的附接。典型的核苷酸和氨基酸在激发和发射能量的合适范围内部不发光或者不发冷光。在某些实施方式中，并入的分子包括发光标记。在某些实施方式中，并入的分子是发光标记物核苷酸。在某些实施方式中，并入的分子是发光标记物氨基酸或发光标记物tRNA。在一些实施方式中，发光标记物核苷酸包括核苷酸和发光标记物。在一些实施方式中，发光标记物核苷酸包括核苷酸、发光标记物、和接头。在一些实施方式中，发光标记物是荧光团。
就核苷酸测序而言，发光标记物核苷酸的某些组合可以是优选的。在一些实施方式中，至少一个的发光标记物核苷酸包含菁染料或其类似物。在一些实施方式中，至少一个发光标记物核苷酸包含罗丹明染料或其类似物。在一些实施方式中，至少一个的发光标记物核苷酸包含菁染料或其类似物，并且至少一个发光标记物核苷酸包含罗丹明染料或其类似物。
在某些实施方式中，发光标记物是选自表FL-1的染料。表FL-1中所列出的染料是非限制性的，并且本申请的发光标记物可包括表FL-1中未列出的染料。在某些实施方式中，一个或多个发光标记物核苷酸的发光标记物是选自表FL-1。在某些实施方式中，四个或更多的发光标记物核苷酸的是发光标记物选自表FL-1。
表FL-1.示例性的荧光团
在某些实施方式中，发光标记物可以是化学式
的(染料101)或(染料102)或者其类似物。在一些实施方式中，任选地各磺酸盐或羧酸盐倍独立地质子化。在一些实施方式中，通过在图示的附接点处形成酰胺键，而将上述染料附接到接头或核苷酸。
在某些实施方式中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型、或者至少四种类型的发光标记物核苷酸包括发光标记物，该发光标记物是选自由6-TAMRA、5/6-羧基罗丹明6G、Alex Fluor546、Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor610、AlexaFluor647、Aberriorstar635、ATTO647N、ATTO Rho14、Chromis630、Chromis654A、Chromeo642、CF514、CF532、CF543、CF546、CF546、CF555、CF568、CF633、CF640R、CF660C、CF660R、CF680R、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Dyomics-530、Dyomics-547P1、Dyomics-549P1、Dyomics-550、Dyomics-554、Dyomics-555、Dyomics-556、Dyomics-560、Dyomics-650、Dyomics-680、Dylight554-R1、Dylight530-R2、Dylight594、Dylight635-B2、Dylight650、Dylight655-B4、Dylight675-B2、Dylight675-B4、Dylight 680、HiLyte Fluor532、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 594、LightCycler 640R、seta555、seta670、seta700、setau647、和setau 665所组成的组群、或者属于化学式(染料101)或(染料102)，如本文中所描述。
在一些实施方式中，至少一种类型、至少两种类型、至少三种类型、或至少四种类型的发光标记物核苷酸包括发光标记物，该发光标记物是选自由Alexa Fluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、CF532、CF543、CF555、CF594、Cy3、Dylight 530-R2、Dylight 554-R1、Dylight 590-R2、Dylight 594、和Dylight610-B1所组成的组群，或者属于化学式(染料101)或(染料102)。
在一些实施方式中，第一和第二类型的发光标记物核苷酸包括发光标记物，该发光标记物是选自由Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、CF 532、CF543、CF 555、Cy3、Dylight 530-R2、和Dylight 554-R1所组成的组群，并且第三和第四类型的发光标记物核苷酸包括发光标记，该发光标记是选自由Alexa Fluor594、AlexaFluor610、CF594、Dylight590-R2、Dylight 594、和Dylight 610-B1所组成的组群，或者属于化学式(染料101)或(染料102)。
E.接头
发光标记物可直接地附接到分子(例如通过键)，或者可利用接头而附接。在某些实施方式中，接头包括一个或多个磷酸酯。在一些实施方式中，利用包括一个或多个磷酸酯的接头将核苷连接到发光标记物。在一些实施方式中，利用包括三个或四个磷酸酯接头将核苷连接到发光标记物。在一些实施方式中，利用包括四个或更多的磷酸酯的接头将核苷连接到发光标记物。
在某些实施方式中，接头包括脂肪族链。在一些实施方式中接头包括-(CH2)n-，其中n为1至20的整数，包含性的。在一些实施方式中，n为1至10的整数，包含性的。在某些实施方式中，接头包括杂脂肪族链。在一些实施方式中，接头包括聚乙二醇基团。在一些实施方式中，接头包括聚乙二醇基团。在一些实施方式中，接头包括-(CH2CH2O)n-，其中n为从1到20的整数，包含性的。在一些实施方式中，接头包括-(CH2CH2O)n-，其中n为1至10的整数，包含性的。在某些实施方式中，接头包括-(CH2CH2O)4-。在某些实施方式中，接头包括一个或多个arylenes。在一些实施方式中，接头包括一个或多个亚苯基(例如，对位取代的亚苯基)。在某些实施方式中，接头包括手性中心。在一些实施方式中，接头包括脯氨酸或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括脯氨酸六聚体、或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括香豆素或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括萘或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括蒽或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括聚苯基酰胺或其衍生物。在一些实施方式中，接头包含色满酮或其衍生物。在一些实施方式中，接头包括4-氨基炔丙基-L-苯丙氨酸或其衍生物。在某些实施方式中，接头包括多肽。
在一些实施方式中，接头包括寡核苷酸。在一些实施方式中，接头包括两个退火的寡核苷酸。在一些实施方式中，寡核苷酸或寡核苷酸包括脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或锁定核糖核苷酸。在某些实施方式中，接头包含光稳定剂。
F.样品阱表面制备
在某些实施方式中，一种利用被限制在靶空间中的分子对一个或发光标记物分子进行检测的方法。在一些实施方式中，该靶空间是在样品阱(例如，纳米孔)内部的区域。在某些实施方式中，样品阱包括包含第一材料的底面及由多个金属或金属氧化物层所形成的侧壁。在一些实施方式中，第一材料是透明材料或玻璃。在一些实施方式中，底面是平坦的。在一些实施方式中，底面是弯曲的阱。在一些实施方式中，底面包括在侧壁下方一部分的侧壁s形成由多个金属或金属氧化物层。在一些实施方式中，第一材料是熔融二氧化硅或二氧化硅。在一些实施方式中，多个层各自包含金属(例如，Al、Ti)或者金属氧化物(例如，Al2O3、TiO2、TiN)。
G.钝化
在一些实施方式中当使一个或多个分子或复合物被固定化在表面上时，理想的是能够使装置的其它表面钝化以防止在不希望位置的固定化。在一些实施方式中，将分子或复合物固定化于样品阱的底面上并且使样品阱的侧壁钝化。在一些实施方式中，通过以下步骤使侧壁钝化：使金属或金属氧化物阻挡层沉积于侧壁表面上；并且将涂层涂布到阻挡层上。在一些实施方式中，金属氧化物阻挡层包含氧化铝。在一些实施方式中，沉积的步骤包括使金属或金属氧化物阻挡层沉积在侧壁表面和底面上。在一些实施方式中，沉积的步骤还包括将金属或金属氧化物阻挡层从底面蚀刻掉。
在一些实施方式中，阻挡层涂层包含膦酸酯基。在一些实施方式中，阻挡层涂层包含带烷基链的膦酸酯基。在一些实施方式中，阻挡层涂层包含聚合的膦酸酯。在一些实施方式中，阻挡层涂层包含聚乙烯基膦酸(PVPA)。在一些实施方式中，阻挡层涂层包括具有取代的烷基链的膦酸酯基。在一些实施方式中，烷基链包括一个或多个酰胺。在一些实施方式中，烷基链包括一个或多个聚乙二醇链。在一些实施方式中，涂层包含化学式的膦酸酯基：
其中n为在0和100之间的整数，包含性的，并且是氢或与表面的附接点。在一些实施方式中n为在3和20之间的整数，包含性的。在一些实施方式中，阻挡层涂层包含不同类型的膦酸酯基的混合物。在一些实施方式中，阻挡层涂层包含包括不同PEG分子量的聚乙二醇链的膦酸酯基的混合物。
在某些实施方式中，阻挡层包含硝基多巴基。在某些实施方式中，the阻挡层涂层包括化学式的基团：
其中RN是任选地取代的烷基链并且是氢或与表面的附接点。在一些实施方式中，RN包括聚合物。在一些实施方式中，RN包括聚赖氨酸或聚乙二醇。在一些实施方式中，阻挡层包含包括赖氨酸单体的聚赖氨酸的共聚物，其中赖氨酸单体独立地包括PEG、硝基多巴基、膦酸酯基、或伯胺类。在某些实施方式中，阻挡层包含用于化学式(P)的聚合物：
在一些实施方式中，X是-OMe、生物素基、膦酸酯、或硅烷。在一些实施方式中，i、j、k和l各自独立地是在0和100之间的整数，包含性的。
H.聚合酶固定化
在一些实施方式中，当把一个或多个分子或复合物是固定化在表面上时该表面被官能化，从而允许一个或多个分子或复合物的附接。在一些实施方式中，官能化表面是样品阱的底面。在某些实施方式中，官能化表面包括透明的玻璃。在某些实施方式中，官能化表面包含熔融二氧化硅或二氧化硅。在一些实施方式中，官能化表面用硅烷而官能化。在一些实施方式中，官能化表面是用离子电荷聚合物官能化。在一些实施方式中，离子电荷聚合物包括聚赖氨酸。在一些实施方式中，用聚赖氨酸-聚乙二醇接枝聚合物使官能化表面官能化。在一些实施方式中，用生物素化牛血清白蛋白(BSA)使官能化表面官能化。
在某些实施方式中，用包含硝基多巴基的涂层使官能化表面官能化。在某些实施方式中，该涂层包含化学式的基团：
其中RN是任选地取代的烷基链并且是氢或与表面的附接点。在一些实施方式中，RN包括聚合物。在一些实施方式中，RN包括聚赖氨酸或聚乙二醇。在一些实施方式中，RN包括生物素化聚乙二醇。在一些实施方式中，涂层包含包括赖氨酸单体的聚赖氨酸的共聚物，其中赖氨酸单体独立地包括PEG、生物素化PEG、硝基多巴基、膦酸酯基、或硅烷。在某些实施方式中，涂层包含化学式(P)的聚合物：
在一些实施方式中，X是-OMe、生物素基团、磷酸基、或硅烷。在一些实施方式中，i、j、k和l各自独立地是在0和100之间的整数，包含性的。
在一些实施方式中，官能化表面是用包含烷基链的硅烷而官能化。在一些实施方式中，官能化表面是用包含任选地取代的烷基链的硅烷而官能化。在一些实施方式中，表面是用包含聚乙二醇链的硅烷而官能化。在一些实施方式中，官能化表面是用包含耦合基团的硅烷而官能化。例如，耦合基可包括化学基团，例如氨基、羧基、羟基、巯基、金属、螯合剂等。可替代地，它们可包括特定的结合元件，例如生物素、抗生物素蛋白、链霉亲和素、中性抗生物素蛋白、凝集素、SNAP-标签TM或衬底，因此缔合型或结合肽或蛋白质、多抗体或单抗体片段、核酸或核酸类似物，等。此外或可替代地，耦合基可用于耦合用于与感兴趣分子偶联或结合的另一个基，该基在一些情况下可包括化学官能团和特定的结合元件两者。通过举例，可使耦合基(例如生物素)沉积到衬底上表面，并且在给定的区域中被选择性地激活。然后可将中间结合剂(例如链霉亲和素)联接到第一耦合基。然后，将感兴趣的分子(在此具体实施例中将会是生物素化)联接到链霉亲和素。
在一些实施方式中，用包含生物素或其类似物的硅烷使官能化表面是官能化。在一些实施方式中，用包含聚乙二醇链的硅烷使表面官能化，其中聚乙二醇链包括生物素。在某些实施方式中，用硅烷的混合物使官能化表面是官能化，其中至少一种类型的硅烷包括生物素并且至少一种类型的硅烷不包括生物素。在一些实施方式中，混合物包括不包含生物素的硅烷少约10倍、约25倍、约50倍、约100倍、约250倍、约500倍、或约1000倍的生物素化硅烷。
图10-3示出了用于从制作的芯片(例如，集成装置)来制备用于启动测序反应的样品阱表面的非限制性示例性工艺。该样品阱被图示具有底面(无阴影矩形)和侧壁(有阴影的垂直矩形)。侧壁可由多层组成(例如，Al、Al2O3、Ti、TiO2、TiN)。在步骤(a)用Al2O3的阻挡层使侧壁沉积。然后涂布该Al2O3阻挡层，在步骤(b)用PEG磷酸基，例如用一个或多个PEG-膦酸对表面进行处理。在步骤(c)例如用PEG-硅烷与生物素化-PEG-硅烷的混合物使底面官能化。各椭圆代表单独的生物素基，可提供用于单分子或复合物(例如聚合酶复合物)的附接的部位。在步骤(d)，将聚合酶复合物附接到在底面上的生物素基。该聚合酶可利用结合剂(例如链霉亲和素和生物素标签)附接到聚合酶复合物上。该聚合酶复合物还可包括模板核酸和引物(未图示)。步骤(e)示出了通过使固定化聚合酶复合物暴露于发光标记物核苷酸而启动测序反应。
I.聚合酶
本文中所使用的术语“聚合酶”一般是指能够催化聚合反应的任何酶(或聚合酶)。聚合酶的例子包括但不限于：核酸聚合酶、转录酶或连接酶。聚合酶可以是聚合化酶。
针对单分子核酸延伸(例如，用于核酸测序)的实施方式可使用能够合成与靶核酸分子为互补的核酸的任何聚合酶。在一些实施方式中，聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、和/或其突变体或改变形式。
针对单分子核酸测序的实施方式可使用是能够合成与靶核酸为互补的核酸的任何聚合酶。聚合酶的例子包括但不限于：DNA聚合酶、RNA聚合酶、热稳定聚合酶、野生型聚合酶、改造的聚合酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、噬菌体T4DNA聚合酶、(psi29)DNA聚合酶、Taq聚合酶、Tth聚合酶、Tli聚合酶、Pfu聚合酶、Pwo聚合酶、VENT聚合酶、深的VENT聚合酶、EX-Taq聚合酶、LA-Taq聚合酶、Sso聚合酶、Poc聚合酶、Pab聚合酶、Mth聚合酶、ES4聚合酶、Tru聚合酶、Tac聚合酶、Tne聚合酶、Tma聚合酶、Tca聚合酶、Tih聚合酶、Tfi聚合酶、Platinum Taq聚合酶、Tbr聚合酶、Tfl聚合酶、Tth聚合酶、Pfutubo聚合酶、Pyrobest聚合酶、Pwo聚合酶、KOD聚合酶、Bst聚合酶、Sac聚合酶、Klenow片段、具有3’至5’核酸外切酶活性的聚合酶，及其变体、改性产物和衍生物。在一些实施方式中，聚合酶是单亚单位聚合酶。DNA聚合酶的非限制性例子和它们的特性详细描述于，DNA Replication，第2版，Kornberg和Baker，W.H.Freeman，纽约市，N.Y.(1991年)。
基于在靶核酸的核碱基与互补的dNTP之间的碱基，聚合酶通过在新合成链的3’羟基端与dNTP的α-磷酸酯之间形成磷酸二酯键而将dNTP并入新合成核酸链。在其中偶联到dNTP的发光标签是荧光团的实例中，其存在是通过激发而发信号并且发射的脉冲是在并入步骤期间或之后进行检测。就偶联到dNTP的端子(γ)磷酸酯的检测标记而言，将dNTP并入新合成的链导致β和γ磷酸酯及检测标记的释放，该检测标记在样品阱中自由扩散，从而导致从荧光团中所检测发射的下降。
在一些实施方式中，聚合酶是具有高延续性的聚合酶。然而，在一些实施方式中，聚合酶是具有减小的延续性的聚合酶。聚合酶延续性通常是指聚合酶在不释放核酸模板的情况下将dNTP连续地并入核酸模板的能力。
在一些实施方式中，聚合酶是具有低5′-3′核酸外切酶活性的聚合酶和/或3′-5′核酸外切酶。在一些实施方式中，对聚合酶进行修改(例如，通过氨基酸取代)从而相对于相应的野生型聚合酶而具有减小的5′-3′核酸外切酶活性和/或3′-5′活性。DNA聚合酶的其它非限制性例包括9°NmTMDNA聚合酶(New England Biolabs)、和Klenow外切聚合酶的P680G突变体(Tuske等人(2000)JBC275(31)：23759-23768)。在一些实施方式中，具有减小的延续性的聚合酶为含有核苷酸重复的一个或多个伸延的测序模板提供增加的准确度(例如，两个或更多的相同类型的顺序基部)。
针对单分子RNA延伸(例如，用于RNA测序)的实施方式可使用是能够基于RNA模板合成出互补DNA(cDNA)的任何逆转录酶。在这种实施方式中，逆转录酶可以以类似于聚合酶的方式而起作用，可以基于RNA模板通过将dNTP并入并退火到RNA模板的逆转录引物中而合成cDNA。然后，cDNA可以参与测序反应并且以如上面和本文中其它地方所描述的方式来确定其序列。然后，可以利用cDNA的所确定序列并利用序列互补性来确定原来的RNA模板的序列。逆转录酶的例子包括：莫洛尼氏鼠白血病病逆转录酶(M-MLV)、禽成髓细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶、人免疫缺陷病毒逆转录酶(HIV-1)和端粒酶逆转录酶。
本领域技术人员可以通过相对于相应的野生型聚合酶的突变或其它修饰而提高或降低不同类型核酸的延续性、核酸外切酶活性、相对亲和性或者核酸聚合酶的其它特性。
J.寿命测量
寿命测量可以提供利用一个激发能量波长来激发样品阱中的标记而执行。对具有不同寿命的标记组合进行选择以便基于寿命测量在各单独标记中进行区分。此外，当被所使用的发源照射时，各标记的组合能够达到激发状态。可使用任何组或数量的具有可区分寿命的合适标记。例如，可使用三个、四个或六个不同的标记。这些发光标记物可在相同的激发波长或者两个或四个不同的激发波长处激发。
脉冲激发源可以是采用上述技术的脉冲激发源中的一个。在一些情况下，脉冲激发源可以是是通过激光二极管的直接调制电抽运而发出脉冲的半导体激光二极管。在峰值后的大约250皮秒处，这些脉冲的功率是小于脉冲峰值功率的20dB。用于各激发脉冲的时间区间是在20-200皮秒的范围内。在各激发脉冲持续时间是在1-50纳秒的范围内。将如何可以执行示范性测量的示意图示于图10-4，该图示出了以有规律间隔所产生的激发脉冲10-401的定时。图10-4的底部行表示当激发脉冲10-401到达时那个标记是存在的。有时，将不存在标记。此外，图10-4的中间行示出了所存在标记的发射概率分布10-402。中间行中也示出了矩形10-403，该矩形表示来自标记的光子的检测。如图10-4中所示，存在由于损失或检测器低效率因而光子不发出或发射的光子不被检测的时间。
用于各像素的传感器具有每个像素至少一个的光敏区。在一些实施方式中，传感器芯片可包括每个像素单个传感器区。该光敏区可具有5微米×5微米的尺寸。在当光子到达传感器时的时间区间内对光子进行检测。增加时间元数量可提高在一系列时间元中所收集光子的记录直方图的分辨率并且改善不同发光标记中的差异。在一些实施方式中，可将聚焦元件与传感器结合，从而改进对由在相关样品阱中的标记所发射光子的收集。这种聚焦元件可包括菲涅耳透镜10-500，如图10-5中所示。当利用传感器是来检测特定的波长时，四个发光标记物可发出类似于特定波长的荧光。可替代地，四个发光标记物可在不同的波长处发出荧光。
在一些实施方式中，可用多种不同类型标记中的一种给样品物体加标记，各标记与相互排斥的样品物体组是相关的。多个标记的每个标记发出具有不同寿命的发射能量。当利用该传感器来自检测特定波长时，多个标记可发出类似于特定波长的发射能量。可替代地，多个标记可在不同波长处发出发射能量。可采用本文中所描述的用于确定标记寿命的技术。响应于来自激发源的激发能量的脉冲，给样品加标签的多个标记中的一个标记可发射光子。对在激发脉冲之后的光子时间进行记录。激发能量的重复的脉冲可导致多个光子发射事件，这些事件然后是用于确定标记的寿命。然后，可将所确定的寿命用于从多个标记中鉴定样品阱中的标记。
可基于寿命测量而区分的四个发光标记物的一个示范性组是ATRho14、Cy5、AT647N、和CF633，如图10-6的图表中所示。这四个标记具有不同的的寿命，并且当使用至少四个时间元时产生可区分的直方图。图10-7概述了在16个时间元中用于这些标记的各标记的信号曲线。为各标记对该信号曲线进行归一化。这些时间元时间区间中变化，从而为每个标记提供唯一信号曲线。如图10-7中所示，具有由具有可变间距的时间界限所限定的16个时间元的传感器可以用于利用光子计数在16个时间元的一个或多个中的分布而在ATTORho14、Cy5、ATTO647N、和CF633中进行区分。例如，传感器检测11％的在时间界限0.692ns和0.792ns之间从标记ATTORho14中所检测的总检测光。作为另一个例子，传感器检测10％的从在时间界限1.991ns和2.507ns之间从标记CF633中所检测的总检测光。以此方式，可利用在一个或多个时间元中的总检测光对各标记进行区分。图10-8和10-9示出了另一个示例性标记组ATTO Rho14、D650、ST647、和CF633的信号曲线，两者分别是连续的和分立的，这些标记可基于寿命测量进行区分。其它的标记组包括：ATTO Rho14、C647、ST647、CF633；Alexa Fluor647、B630、C640R、CF633；及ATTO Rho14、ATTO647N、AlexaFluor647、CF633。
K.光谱寿命测量
寿命测量与一个或多个发光标记物的光谱测量相结合。光谱测量可取决于用于单独标记的发射能量的波长，并且利用每个像素至少两个传感器区而俘获。传感器是用于检测从样品阱中所发出发射能量的光谱特性。集成装置的一个示例结构包括像素，各像素具有包括两个不同区的传感器，各区是用于检测不同的波长。一些标记可具有大致重叠并且/或者具有相差大约5nm或更小(例如，难以单独基于光谱检测技术进行区分)的峰值发射波长的光谱。然而，这些标记可具有不同的寿命，并且用于执行寿命测量的技术可用于在各标记中进行区分。
将两个寿命测量与光谱测量结合可利用激发在样品阱中的标记的一个激发能量波长而执行，尽管在一些实施方式中可采用多于一个的激发能量波长。将标记的组合选择成具有至少两个不同的发射波长，其中基于寿命和光谱测量对在具有不同寿命的波长处发射的标记进行选择，以便在各单独标记中进行区分。此外，将标记的组合是选择成当被所使用激发源照射时能够达到激发状态。可以使用任何组或数量的具有不同发射波长和/或不同寿命的合适的标记。
激发源是脉冲激发源，并且可以是采用上述技术的激发源中的一个。在一些情况下，脉冲激发源可以是构造成通过激光二极管的直接调制电抽运而发出脉冲的半导体激光二极管。在峰值后的250皮秒后，这些脉冲的功率是比峰值功率小20dB。各激发脉冲的持续时间是在20-200皮秒的范围内。在各激发脉冲之间时间间隔是在1-50纳秒的范围内。将如何可以执行示范性测量的示意图示于图10-10。在一些实施方式中，激发源提供具有大约640nm波长的激发能量。在一些实施方式中，激发源提供具有在大约515nm至535nm范围内的波长的激发能量。
传感器是用于对来自多个标记的发射能量的时间和光谱特性两者进行检测。各像素的传感器具有每个像素至少两个光敏区。在一些实施方式中，每个像素存在两个光敏区。在其它实施方式中，存在每个像素四个光敏区。各光敏区是用于检测不同的波长或波长的范围。当光子到达传感器时，在时间区间内对光子进行检测。增加时间元的数量可提高光在一系列时间元中所收集光子的记录直方图的分辨率，并且改进由于它们的单独寿命而在不同发光标记物中的差异。在一些实施方式中，在传感器的每个区中存在两个时间元。在其它实施方式中，在传感器的每个区中存在四个时间元。
在一些实施方式中，传感器包括用于检测四个不同标记的两个副传感器。第一副传感器可与由两个标记所发出的第一发射波长是相关的。第一副传感器也可与在第一发射波长处发射的两个标记的两个不同的寿命是相关的。第二副传感器可与由其它两个标记所发出的第二波长是相关的。该第二副传感器也可与在第二发射波长处发射的两个标记的两个不同寿命是相关的。四个发光标记物中的差异可可基于检测波长与检测寿命的组合而出现。两个副传感器的每个副传感器可对从标记中所发出发射能量的单个光子进行检测。
可基于寿命测量而区分的四个发光标记物的一个示范性组是ATTO Rho14、AS635、Alexa Fluor647、和ATTO 647N。这四个标记中的两个是在一个相似波长和另一个相似的波长处发射。在相似波长处发射的各对标记内，标记的对具有不同的寿命并且当使用至少四个时间元时产生可区分的直方图。在此实例中，ATTO Rho14和AS635发出相似的荧光波长并且具有不同的寿命。Alexa Fluor647和ATTO647N发出相似的荧光波长，不同于由ATTORho14和AS635发出的波长并且具有不同的寿命。图10-11示出了此标记组的作为发射波长的函数的寿命的图表，从而说明如何基于寿命与发射波长的组合对这些标记的各标记进行区分。如图10-11中所示，ATTO Rho14可在645nm附近发射，AS635可在653nm附近发射，AlexaFluor647可在665nm附近发射，ATTO Fluor647N可在669nm附近发射。AS635和ATTO647N具有相似的寿命在大约1.2ns，并且ATTO Rho14和Alexa Fluor647具有比AS635和ATT0647更低的寿命。这些标记可以基于它们的特征发射波长和发射寿命而区分。例如，ATTO 647N和Alexa Fluor 647具有相似的峰值发射波长，但具有可区分的寿命。AS635和ATTO647N具有相似的寿命，但具有大致不同的峰值发射波长。
这些标记可在相同的激发波长或者两个或更多的不同激发波长处激发。当利用传感器来检测两个波长的发射能量时，四个标记中的两个可在第一波长处发射同时其它两个标记可在第二波长处发射。可替代地，当传感器是用于检测四个波长的发射时，各标记可在不同的波长处发射并且/或者可具有不同的发射概率密度和寿命。图10-12示出了ATTRho14、Alexa Fluor647、和ATT)647N的作为波长的函数的功率的图表。
图10-13示出了当存在于具有135nm的直径的样品阱时这些标记的每个标记的随时间推移的荧光信号的图表，说明了这些标记的不同的时间衰减和因此寿命。
图10-14示出了在四个传感器区域中的这些标记的信号曲线，并且各区俘获四个时间元。这些信号曲线被归一化，并且是用于利用四个时间元的每个时间元的由光敏区所俘获光子的相对数量在不同标记中进行区分。从第一标记(Alexa Fluor647)中发出的第一发射波长的光被朝向第一传感器区引导。然而，光的方向性并不是完善的，并且部分的光是由第二传感器区、第三传感器区和第四传感器区所检测。因此，从第一标记中发出的光与第一传感器检测器信号是相关的，如在图10-14的中间示意图中利用在四个时间元中由四个传感器区域所检测的总检测光的百分率统计所表示。在1.184ns和2.069ns之间的第二时间元中，第一传感器区检测4.2％的来自第一标记的总检测光，第二传感器区检测11.7％的来自第一标记的总检测光，第三传感器区检测18.6％的来自第一标记的总检测光，第四传感器区检测14.6％的来自第一标记的总检测光。用于一个或多个时间元的该检测的传感器形式构成了与第一标记相关的第一检测信号。图10-14示出了用于ATRho14和ATTO647N标记的传感器和时间元形式，这导致在在至少这三个标记中的可区分检测信号。例如，在0.25ns和1.184ns之间的第一时间元中，第二传感器检测12.3％的来自标记ATTORho14的总检测光。在此方式中，各标记可基于其发射光谱和寿命而区分。
用于这种光谱寿命测量的其它组的四个荧光团是ATRho14、D650、ST647、CF633；ATTO Rho14、C647、ST647、CF633；Alexa Fluor647、B630、C640R、CF633；及ATTO Rho14、ATTO647N、Alexa Fluor647、CF633。图10-15示出了ATRho14、D650、ST647、和C633的随时间推移强度的信号曲线的图表。图10-16示出了ATRho14的信号曲线。
L.寿命激发能量测量
寿命测量结合使用至少两个激发能量波长可用于在多个标记中进行区分。当使用一个激发波长而不使用另一个激发波长时，一些标记可激发。将具有不同寿命各标记的组合选择用于各激发波长，以便基于寿命测量在各单独的标记中进行区分。在此实施方式中，传感器芯片可构造成具有各像素并且传感器具有一个区，该仪器可构造成例如由具有时间交错的电调制脉冲二极管激光器提供至少两个激发能量波长。
这些标记可在不同的激发波长处激发。当光源构造成传递两个波长的激发能量时，一些标记可在激发的第一波长处激发并且不在激发的第二波长处激发，同时其它标记在激发的第二波长处激发并且大体上不在激发的第一波长处激发。在一些实施方式中，两个标记在第一激发波长处激发并且在第二激发波长处基本上不激发，但以不同的发射概率密度和寿命而发射。两个不同的标记在第二激发波长处激发并且在第一激发波长处基本上不激发，但具有不同的发射概率密度和寿命。
该激发源是至少两种激发能量的组合。该激发源是脉冲激发源，并且可以是采用上述技术的一个或多个的激发源。在一些情况下，脉冲激发源可以是构造成通过激光二极管的直接调制电抽运而发出脉冲的两个半导体激光二极管。在峰值后的250皮秒处，脉冲的功率比脉冲峰值功率小20dB。用于各激发脉冲的时间区间在20-200皮秒的范围内。在各激发脉冲之间的时间间隔是在1-50纳秒的范围内。每个脉冲发射一个激发波长，并且通过了解激发波长而唯一地鉴定具有不同寿命的标记的亚组。在一些实施方式中，激发的脉冲在不同的波长中变换。例如，当采用两个激发波长时，随后的脉冲在一个波长和其它波长之间变换。将如何可以执行示范性测量的示意图示于图10-17。可采用用于将多个激发源与具有不同波长的交错脉冲加以组合的任何合适技术。
各像素的传感器具有每个像素至少一个的光敏区。该光敏区可具有5微米×5微米的尺寸。当光子到达传感器时，在时间区间内对光子进行检测。增加时间元的数量可提高在一系列时间元中所收集的光子的记录直方图的分辨率并且改善在不同发光标记物中的差异。传感器具有至少两个时间元。在一些实施方式中，传感器可具有用于鉴定来自标记的发射能量的寿命的四个时间元。
可基于寿命测量而区分的四个发光标记物的示范性组是Alexa Fluor 546、Cy3B、Alexa Fluor 647、和ATTO647N。如图10-18中所示，Alexa Fluor 546和Cy3B在一个波长处(例如532nm)激发，并且具有不同的寿命。Alexa Fluor 647和ATTO 647N在另一波长640nm处激发，并且具有不同的寿命，如图10-19中所示。例如，将ATTO 647N和Alexa Fluor 647的曲线示于图10-19中，该图说明了具有不同寿命的这两个标记。将在用于ATTO647N和CF633(两者均在640nm处被激发)的16个时间元中的可区分的归一化信号曲线示于图10-20中。例如，传感器检测12％的在时间界限0.629ns和0.997ns之间来自标记ATTO647N的总检测光。通过检测在已知激发波长后的光子，可基于以前的激发波长确定这两个标记对中的一个，并且基于寿命测量来鉴定一对的各标记。
M.光谱测量
一个或多个传感器是构造成通过包括用于在它们到达传感器之前分选波长的一层或多层的检测芯片或传感器芯片检测光谱特性。一层或多层可包括用于光谱分选从样品阱中发出的发射能量的至少一个结构部件。至少一个结构部件可包括偏移菲涅耳透镜、闪耀相位光栅、或者用于为光谱分布发射能量提供期望的方向性的任何其它合适的结构。
传感器芯片的一个像素可包括多个副传感器，这些副传感器是用于从在检测芯片上的相应的样品阱中被引导出的检测发射能量的光谱分布。传感器芯片和在传感器芯片上的多个副传感器的构造可尺寸、形状可被设计成，并且布置成用于在给样品加标记的不同标记中充分地区分。
在发光标记物中的区别可基于所检测的波长而进行。
在一些实施方式中，可将传感器分段成四个副传感器，用于对四个不同的发光标记物进行检测。传感器的尺寸可以任何合适的方式被设计成和定位成俘获从样品阱中发出的发射能量。
在一些实施方式中，各副传感器与不同的荧光波长是相关的。从第一发光标记物(例如，Alexa Fluor555)中发出的第一荧光波长的光被朝向第一副传感器而引导。然而，光的方向性并不是完善的并且部分的光是由副传感器、第三副传感器和第四副传感器所检测。因此，从第一发光标记物中发出的光与第一传感器检测器信号是相关的，如图10-21中所示。当在传感器的积分时间期间收集光子时，第一副传感器检测42％的来自第一发光标记物的总检测光，副传感器检测39％的来自第一发光标记物的总检测光，第三副传感器检测15％的来自第一发光标记物的总检测光，第四副传感器检测4％的来自第一发光标记物的总检测光。该经检测的副传感器形式产生与第一发光标记物相关的第一检测信号。不同的副传感器形式与来自不同发光标记物的不同荧光波长是相关的，这导致可区分的检测信号，如图10-21中所示。
类似地，第二副传感器与第二荧光波长是相关的，第三副传感器与第三荧光波长是相关，第四副传感器与第四荧光波长是相关的。在此方式中，可基于发射能量进行区分的示例性的标记是Alexa Fluor555、Alexa Fluor568、Alexa Fluor647、和Alexa Fluor660，这些标记具有图10-22中所示的发射光谱。
VII.计算装置
图10-23示出了可实施本发明的实施方式的合适的计算系统环境1000的一个实例。例如，图2-1的计算装置2-130可根据计算系统环境1000而实施。此外，计算系统环境1000可起控制系统的作用，该控制系统被编程以控制仪器执行测定。例如，控制系统可控制激发源发出光并朝向检测芯片的样品阱引导光；控制传感器从而允许对来自样品阱中的一个或多个样品的发射光的检测；和对来自传感器的信号进行分析从而对存在于样品阱中的样品加以鉴定，例如通过对发射能量的空间分布进行分析。计算系统环境1000只是合适的计算环境的一个实例，并非意图提示关于本发明的应用范围和功能的任何限制。计算环境1000也不应看作是具有与在示例性操作环境1000中所示出部件的任何一个或组合有关的任何依赖性或要求。
实施方式是利用许多其它通用或专用计算系统环境或配置而操作。可适用于本发明的熟知的计算系统、环境、和/或配置的例子包括但不限于：个人计算机、服务器计算机、手提式或笔记本电脑、多处理器系统、基于微处理器的系统、机顶盒、可编程消费电子产品、网络PC、微型计算机、大型计算机、包括任何上述方系统或装置的分布式计算环境，等。
计算环境可执行计算机可执行指令，例如程序模块。通常，程序模块包括程序、程序、对象、部件、数据结构等，这些执行特定的任务或实施特定的抽象数据类型的。本发明也可在分布式计算环境中实施，其中任务是由经过通信网络连接的远程处理装置而执行。在分布式计算环境中，程序模块可位于包括存储装置的本地和远程计算机存储介质中。
参照图10-23，用于实施本发明的示例性系统包括采用计算机1010形式的通用计算装置。计算机1010的部件可包括但不限于：处理单元1020、系统存储器1030、和联接各种系统部件(包括从系统存储器到处理单元1020)的系统总线1021。系统总线1021可以是任何的若干类型的总线结构该结构包括存储器总线或存储器控制器、外设总线、和采用任何多种总线结构的局部总线。例如但不限于，这种结构包括工业标准结构(ISA总线、微通道结构(MCA)总线、增强的ISA(EISA)总线、视频电子标准协会(VESA)局部总线、和外部设备互连(PCI)总线(也被称为Mezzanine总线)。
计算机1010通常包括多种计算机可读介质。计算机可读介质可以是可以由计算机1010访问的任何可利用介质，并且包括易失性和非易失性介质、可移动和非可移动介质两者。例如但不限于，计算机可读介质可包括计算机存储介质和通信介质。计算机存储介质包括在用于信息的存储的任何方法或技术(例如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其它数据中)所应用的易失性和非易失性、可移动和非可移动介质两者。计算机存储介质包括但不限于：RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或其它存储技术、CD-ROM、数字通用光盘(DVD)或其它光盘存储器、磁带盒、磁带、磁盘存储器或其它磁存储装置、或者可以用于存储期望的信息并且可以由计算机1010访问的任何其它介质。通信介质通常包含计算机可读指令、数据结构、程序模块或在调制数据信号(例如载流子波或其它传输机制中)的其它数据，并且包括任何信息传递介质。术语“调制数据信号”表示具有一个或多个的其特性组或者在编码信号的信息的方式中改变的信号。例如但不限于，通信介质包括有线介质，例如有线网络或直接有线连接、和无线介质，例如声学、RF、红外和其它无线介质。任何上述的组合也应包括在计算机可读介质的范围内。
系统存储器1030包括采用易失性和/或非易失性存储器形式的计算机存储介质，例如只读存储器(ROM)1031和随机存取存储器(RAM)1032。基本输入/输出系统1033(BIOS)含有通常存储于ROM1031中的有助于在计算机1010内部的各元件之间交换信息(例如在启动期间)的基本例程。RAM 1032通常容纳可由处理单元1020立即访问和/或现在正在由处理单元1020操作的数据和/或程序模块。例如但不限于，图10-23示出了操作系统1034、应用程序1035、其它程序模块1036、和程序数据1037。
计算机1010也可包括其它可移动/非可移动、易失性/非失性计算机存储介质。仅通过举例，图10-23示出了读取或写入非可移动非易失性磁性介质的硬盘驱动器1041、读取或写入可移动易失性磁盘1052的磁盘驱动器1051、和读取或写入可移动非易失性光盘1056(例如CD-ROM或其它光学介质)的光盘驱动器1055。可以在示例性的操作环境使用的其它可移动/非可移动、易失性/非易失性计算机存储介质包括但不限于：磁带盒、闪速存储卡、数字通用光盘、数字视频磁带、固态RAM、固态ROM等。硬盘驱动器1041通常经过非可移动存储器接口(例如接口1040)而连接到系统总线1021，磁盘驱动器1051和光盘驱动器1055通常利用可移动存储器接口(例如接口1050)而连接到系统总线1021。
上面所描述且在图10中示出的驱动器和它们的相关计算机存储介质，提供计算机可读指令、数据结构、程序模块和用于计算机1010的其它数据的存储。在图10-23中，例如硬盘驱动器1041被图示为存储操作系统1044、应用程序1045、其它程序模块1046、和程序数据1047。应注意这些部件可以与操作系统1034、应用程序1035、其它程序模块1036、和程序数据1037是相同的或不同的。这里给出了不同数量的操作系统1044、应用程序1045、其它程序模块1046、和程序数据1047，从而说明至少它们们是不同的拷贝。用户可经过输入装置将命令和信息输入计算机1010，例如键盘1062和定点装置1061(通常被称为鼠标)、轨迹球或触控板。其它输入装置(未图示)可包括传声器、操纵杆、游戏手柄、碟形卫星天线、扫描仪等。这些和其它输入装置常常经过联接到系统总线的用户输入界面1060而连接到处理单元1020，但也可利用其它接口和总线结构而连接，例如并行端口、游戏端口或通用串行总线(USB)。监视器1091或其它类型的显示装置也可利用接口(例如视频接口1090)而连接到系统总线1021。除了监视器外，计算机也可包括其它外部输出装置，例如扬声器1097和打印机1096，这些可经过输出外设接口1095而连接。
计算机1010可利用与一个或多个远程计算机(例如远程计算机1080)的逻辑连接而在网络化环境中操作。远程计算机1080可以是个人计算机、服务器、路由器、网络PC、对等装置或其它普通网络节点，并且通常包括许多或全部的关于计算机1010的上述元件，尽管在图10-23只示出了存储装置1081。图10-23中所示的逻辑连接包括局域网(LAN)1071和广域网(WAN)1073，但也可包括其它网络。这种网络化环境在办公室、企业计算机网络、内联网和互联网中是常见的。
当在LAN网络化环境中使用时，计算机1010经过网络接口或适配器1070而连接到LAN 1071。当在WAN网络化环境中使用时，计算机1010通常包括调制解调器1072或用于在WAN 1073中建立通信的其它装置，例如互联网。调制解调器1072(可以是内部或外部)可经由用户输入界面1060、或者其它合适的机制而连接到系统总线1021。在网络化环境中，关于计算机1010而示出的程序模块或者其各部分可被存储于远程存储装置中。例如但不限于，图10-23示出了存在于存储装置1081中的远程应用程序1085。应当理解的是，图示的网络连接是示例性的，可采用在各计算机之间建立通信链路的其它装置。
IX.制造步骤
上述集成装置可以任何合适的方式制造。以下描述的是集成装置的各种部件的制造，可利用在本领域中为已知的以任何方式将这些部件加以组合从而形成合适的集成装置。
A.纳米孔制造工艺
可以任何合适的方式制作样品阱(例如，纳米孔)。在一些实施方式中，可利用标准光刻工艺和蚀刻技术制造样品阱。可将具有金属(例如，Al、TiN)或者与光刻工艺相容的任何合适材料的样品阱形成于一层中。图11-1示出了用于制造集成装置的一个示例性方法。样品阱层11-112形成样品阱并且可包含金属，例如Al或TiN。层11-110可起介电层的作用并且可任何合适的介电衬底，例如SiO2或氮化硅而形成。该方法的一个步骤包括使层11-112直接地沉积在衬底11-110上。在一些实施方式中，可使附加的层沉积于层11-112和层11-110之间。可以任何合适的厚度使层11-112沉积，并且在一些实施方式中，该厚度可决定所形成样品阱的高度。层11-112的厚度可为大约50nm、大约100nm、或大约150nm。然后，使防反射涂层(ARC)11-122沉积到层11-112的顶部上。使蚀刻掩膜11-120(例如，光刻胶蚀刻掩膜)沉积在ARC11-122上。利用的光刻技术在蚀刻掩膜11-120和ARC11-122中形成孔。通过蚀刻掩膜11-120所形成的孔可具有大约50nm、大约100nm、或大约150nm的直径。然后，利用蚀刻(例如反应性离子蚀刻技术)将孔图案转移到在下面的层11-112，从而形成样品阱。蚀刻可停止于层11-110的表面，或者蚀刻可在位于层11-112中的孔下方的层11-110中形成凹坑。利用常规技术将蚀刻掩膜11-120和ARC11-122从层11-112上剥去。该样品阱可具有大约50nm、大约100nm、或大约150nm的直径。
可替代地，可利用标准的光刻工艺和剥离技术来制造样品阱。图11-2示出了利用剥离技术形成样品阱的一个示例性方法。样品阱是形成于层11-212中，该层11-212可包含金属(例如，Al、Au、Cr)。层11-212是形成于衬底层11-210上方，该衬底层可包含任何合适材料，例如介电材料(例如，SiO2)。层11-212的沉积可独立于光刻工艺或者在光刻工艺后进行。图11-2中所示的在剥离制造工艺中的第一步骤可包括使防反射涂层(ARC)11-222沉积在衬底11-210上，接着使光刻胶蚀刻掩膜11-220直接地沉积在衬底11-210的顶部上。利用常规的光刻技术形成光刻胶，使得抗蚀剂的柱11-230留在左边。该柱可具有对所形成样品阱作出响应的任何合适的尺寸和形状。该柱可具有大约50nm、大约100nm、或大约150nm的直径。这种技术可包括将在柱附近的抗蚀剂和ARC层从衬底上溶解掉。接下来的步骤可包括使层11-212直接地沉积在抗蚀剂的柱的顶部和衬底上，从而形成加盖的柱。在其它实施方式中，在层11-212的沉积之前或之后可使其它层沉积。作为一个非限制性的例子，可使TiN沉积在由Al所构成的层11-212上，任选地接着是Al2O3的沉积。层11-212可以任何合适的厚度而沉积，并且在一些实施方式中可具有大约50nm、大约100nm、或大约150nm的厚度。为了形成样品阱，在使用光刻胶的情况下可利用溶剂将加盖柱剥去或者在使用二氧化硅或氮化硅硬蚀刻掩膜的情况下利用选择性蚀刻而剥去。样品阱可具有大约50nm、大约100nm、或大约150nm的直径。
可替代地，可利用标准光刻工艺和变换剥离技术来制作样品阱。图11-3示出了形成集成装置的样品阱的一个示例性实施方式。使硬蚀刻掩蔽层11-314沉积于衬底11-310上。硬蚀刻掩蔽层11-314可包含Ti或者任何其它合适材料。衬底11-310可包含介电材料(例如，SiO2)或者任何其它合适材料。然后，使一层的ARC 11-322沉积到硬蚀刻掩蔽层11-314上，接着使光刻胶层11-320沉积。利用常规的光刻技术形成光刻胶，从而形成抗蚀剂的柱11-320。此光刻胶柱图形是用作用于蚀刻ARC层11-322和硬蚀刻掩蔽层11-314的蚀刻掩膜。然后，将光刻胶层11-320和ARC11-322剥去，并且使硬蚀刻掩膜的柱11-33留在后面。可利用常规技术将剩余的光刻胶和ARC层从柱上溶解掉。接下来的步骤可包括使层11-312直接地沉积在柱11-330的顶部上，从而形成加盖柱。为了形成样品阱，利用过氧化氢蚀刻或者其它合适的蚀刻将加盖柱剥去，由此服饰层11-314，将盖“剥离”并且在层11-312中形成样品阱。
在一些实施方式中，可以任何合适的方式制作样品阱，以减小经过样品阱的等离子激元元传输。例如，可在多层堆中制作样品阱。该多层堆可包括但不限于：沉积于衬底上的金属层、吸收层和/或表面层。该表面层可以是钝化层。该多层堆可以任何合适的方式而制作。可采用常规的图案化和蚀刻技术。可使金属层沉积到衬底上。可替代地，可使吸收层沉积到该金属层上。可替代地，可使表面钝化层沉积到吸收层/金属层堆上。可使光刻胶和防反射层沉积到多层堆的顶部层上。可使光刻胶层图案化具有样品阱的尺寸。可对多层堆直接地蚀刻，从而形成品阱。
吸收层可包含任何适的吸收材料。非限制性的例子包括氮化硅、TiN、Si、TaN、Ge和/或Cr。所述材料的变体也是可行的，例如Si3N4。金属层和表面层可由任何合适的材料制成。例如，可将Al、AlSi、或AlCu使用与金属层。例如，表面层可由Al或Al2O3制成。在多层堆中的样品阱可利用上述工艺制作。
此外和/或可替代地，在使多层堆沉积之前可使反射层直接地到衬底的顶部上，以控制在光刻期间光束的聚焦。可使反射层直接地沉积到衬底的顶部上并且图案化具有样品阱的尺寸。任选地，可使一层防反射涂层接着使一层光刻胶沉积在图案化反射涂层的顶部上，并且图案化从而使ARC的柱和光刻胶留在衬底上的位置。然后，可使多层堆沉积在柱的顶部、反射层、和衬底上。可利用剥离工艺将加盖的柱去除，如上所述，从而在其中柱曾经所在的衬底位置形成样品阱。
类似地，可利用Ti柱形成样品阱。第一步骤可包括使一层的Ti沉积在衬底上，接着使一层的防反射涂层和一层光刻胶沉积。可使Ti层图案化并蚀刻而形成Ti柱。可使多层堆沉积在Ti柱的顶部和衬底上。最后，可将Ti柱去除，从而与其中Ti柱曾经所在位置相对应于的衬底的位置形成样品阱。
可采用任何合适的沉积方法。例如，可利用PVD、CVD、溅射、ALD、电子束沉积和/或热蒸发使一个或多个层沉积。可对该沉积环境加以控制，以防止在沉积之间的各层的氧化。例如，在一个或多个层的沉积期间和之间，可将该环境保持在高真空/或低氧状态。
B.同心光栅(牛眼)制造工艺
可以以任何合适的方式制作同心光栅或牛眼。在一些实施方式中，可利用标准的光刻工艺和蚀刻技术来制作同心光栅。可将任何合适的介电材料，例如SiO2或氮化硅用于形成同心光栅。在图11-4中所示的实施方式中，利用SiO2层11-1010来形成同心光栅。制造工艺中的第一步骤可包括使硬蚀刻掩膜11-1014直接地沉积到SiO2层的顶部上。在制造工艺中的下一个步骤(步骤11-1001)可包括使光刻胶层11-1020直接地沉积在防反射涂层层11-1022的顶部上的硬蚀刻掩膜上。利用常规的光刻技术在硬蚀刻掩膜中形成牛眼图案(步骤11-1003和步骤11-1005)。然后，利用蚀刻(例如反应性离子蚀刻技术)将牛眼图案转移(11-1007)到下面的SiO2层从而形成同心光栅。同心光栅的厚度可以是任何合适的厚度。在图11-4中图示说明的实施方式，蚀刻深度为大约80nm。利用常规的技术将抗蚀剂剥去(步骤11-1009)并且蚀刻掩膜残留物并清洗同心光栅的表面。可利用剥离或蚀刻工艺，将在层11-1012中的纳米孔(步骤11-1011)直接地制作在同心光栅的顶部上。在其它实施方式中，可时其它层沉积在同心光栅与纳米孔之间。
可替代地，在一些实施方式中，纳米孔可定位在同心光栅的中心。纳米孔的该精确对准可以任何合适的方式而实现。在图11-5中所示的实施方式中，利用自对准制造工艺实现纳米孔的定位。第一步骤可包括根据上述技术形成同心光栅。然而，在图11-5中，使Ti硬蚀刻掩膜11-1114沉积(步骤11-1101)在SiO2衬底11-1110的顶部上。利用蚀刻例如反应性离子蚀刻，将牛眼形式转移到Ti层(步骤11-1103和步骤11-1105)。使一层的抗蚀剂11-1120和一层的防反射涂层11-1122沉积在Ti层中的两个中心缺口的上方从而覆盖缺口和中心Ti柱。然后，利用常规的蚀刻技术将牛眼图案转移到SiO2衬底，从而形成同心光栅(步骤11-1107)。然后，利用各向同性湿法蚀刻去除Ti层(步骤11-1109)，例如，利用过氧化物，但使中心Ti柱11-1116留下。然后，利用常规技术将抗蚀剂层剥去。然后，使金属纳米孔层沉积(步骤11-1111)在同心光栅和Ti柱的顶部上。最后，利用剥离工艺去除金属加盖Ti柱，从而使纳米孔相对于同心光栅精确地定心。
可以以各种其它方式而实现纳米孔的精确对准。在图11-6中所示的实施方式中，纳米孔的定位是是利用变换自对准制造工艺而实现。第一步骤(11-1201)可包括使Al纳米孔层11-1212直接地沉积在SiO2同心光栅衬底11-1210的顶部上。然后，可使硬蚀刻掩膜11-1214沉积在Al层的顶部上。在图11-6中所示的实施方式中，使用Ti但也可使用适合于光刻工艺的任何材料。利用常规蚀刻技术将牛眼图案转移(步骤11-1203和11-1205)到Ti和Al层。使一层的抗蚀剂11-1220和一层的防反射涂层11-1222沉积在Ti和Al层中的的中心缺口的上方从而覆盖其中形成纳米孔的位置。然后，利用常规蚀刻技术将牛眼图案转移(步骤11-1207)到SiO2衬底从而形成同心光栅。使另一个金属层沉积(步骤11-1209)在Ti和第一Al层的顶部上，使得金属填充在SiO2层中的空腔并且覆盖Ti层和抗蚀层。在图11-6中所示的实施方式中，Al是用作另外的金属层，但可使用与光刻工艺相容的其它合适的金属。最后，利用剥离工艺去除金属加盖抗蚀柱11-1230(步骤11-1211)，从而使纳米孔相对于同心光栅精确地定心。
C.透镜制造工艺：折射透镜
可以任何合适的方式形成折射透镜阵列，以改进激发进入纳米孔的聚焦效率和对来自纳米孔的发射光的收集。在一些实施方式中，折射透镜阵列可以是“无间隙”阵列，从而使透镜阵列上的“死区”最小化。在图11-7中所示的实施方式中，折射微透镜阵列倍图示为单独透镜之间没有间隙。在一些实施方式中，制造“无间隙”阵列可包括两个蚀刻步骤。第一蚀刻(步骤11-1801)可建立微透镜形貌的深度。第二蚀刻(步骤11-1803)可接在第一蚀刻之后以消除在单独微透镜之间的平面间隙，使得一个透镜停留在其中其它透镜开始的边缘。第一蚀刻与第二蚀刻的和值限定焦距。在图11-8中所示的实施方式中，微透镜阵列的俯视图被图示为在第一HF蚀刻(1)之后，在第二次HF蚀刻(2)之后、用较高折射率材料氮化硅(3)涂布微透镜阵列之后，在将高折射率材料抛光并平坦化(4)之后。
可以以任何合适的方式制造折射透镜阵列中的各折射透镜。图11-9中示出了示范性的折射透镜阵列，其中纳米孔层11-2007被制作在透明间隔层11-2001的顶部上，该透明间隔层11-2001是在介电透镜层11-2003的顶部上，该介电透镜层11-2003是在衬底11-2005的顶部上。在一些实施方式中，可利用标准光刻工艺和蚀刻技术制造折射透镜。任何合适的介电材料，例如SiO2或氮化硅，可用于形成折射透镜。在图11-10中所示的实施方式中，可用氮化硅填充在SiO2衬底形貌中。在制造工艺中的第一步骤11-2101可包括使硬蚀刻掩膜直接地沉积在SiO2衬底11-2110的顶部上。可将在用于SiO2层的相同蚀刻工艺期间不溶解的任何合适的金属使用于硬蚀刻掩膜11-2114。例如，在图11-10中使用用Cr，但其它金属是可行的。下一步骤可包括将光刻胶层11-2120施加在Cr硬蚀刻掩膜的顶部上。利用常规光刻技术在硬蚀刻掩膜中形成圆形图案。然后，例如利用常规蚀刻技术(例如反应性离子蚀刻技术)将圆形图案转移到在下面的Cr层。利用任何可以蚀刻SiO2但不蚀刻硬蚀刻掩膜的合适选择性蚀刻技术，对SiO2层进行蚀刻。例如，将使用HF的各向同性湿法蚀刻用于在SiO2层中形凹形表面。然后，利用常规蚀刻技术将Cr层去除。任选地，执行使用HF的第二湿法蚀刻，以排除在之间透镜之间的缺口。为了形成折射透镜，用高折射率材料层11-2118(例如氮化硅)填充在SiO2层中的空腔。最后，例如利用常规技术(例如化学机械抛光)使透镜的上表面平坦化。可使间隔层11-2124沉积在氮化硅层的顶部上。例如，可将由ORMOCERTM制成的间隔层旋涂于氮化硅层的顶部上。可替代地，可使SiO2的层沉积。可将纳米孔直接地制作在折射透镜的顶部上。在其它实施方式中，可使其它层沉积在折射透镜与纳米之间孔。
可替代地，各折射透镜可包括防反射层，用以进一步提高光学效率。在一些实施方式中，防反射层可覆盖透镜的底部、顶部、或所有侧面。首先，将SiO2空腔11-2210蚀刻(步骤11-2201)入SiO2层。在图11-11中所示的实施方式中，在用氮化硅层11-2218填充空腔(步骤11-2205)之前，使防反射层11-2222沉积(步骤11-2203)于经蚀刻的SiO2空腔11-2210。利用CMP将氮化硅层抛光(步骤11-2207)，并且使第二防反射层11-2226沉积(步骤11-2209)在经抛光氮化硅层的顶部上。可使附加的层沉积在防反射层的顶部上，例如上面所描述且在图11-11中被图示为层11-2224的间隔层。防反射层可具有以下参数：折射率，nC＝sqrt(氧化物、氮化物)＝sqrt(1.46*1.91)＝1.67；折射率，在从1.67至1.75的范围内；和，厚度t＝λ/(4*nC)＝675nm/(1.670*4)＝101.1nm。可以任何合适的方式使防反射层沉积。例如，可利用PECVD。可替代地，可利用LPCVD。
D.透镜制造工艺：菲涅耳透镜
衍射光学元件(DOE)可具有任何合适的形状并且可以以任何合适的方式是制造以改进荧光在CMOS传感器上的聚焦和荧光光子的分选。在一些实施方式中，DOE可包括菲涅耳透镜的部分。如图11-12至图11-19中所示，DOE11-2301的特征是从菲涅耳透镜的中心偏移的正方形部分。如图11-13中所示，DOE可包括两个单元体层，其中第一层11-2401容纳“小”的特征而第二层11-2403容纳“大”的特征。单元体层可具有任何合适的间距，并且根据菲涅耳透镜的光学设计还可具有变化的间距。如图11-13中的实例中所示，小DOE层具有220nm的间距而大DOE层具有440nm的间距。可将DOE层可覆盖在小DOE层(反之亦然)上从而形成多层衍射光学部件。图11-13示出了偏移菲涅耳阵列11-2405的一个实例，其中大框标包围偏移菲涅耳透镜。此外，偏移菲涅耳阵列可位于传感器的顶部上，用以提供进入传感器的荧光的聚焦和光谱分离。
可替代地，可将衍射光学元件(DOE)嵌入到纳米孔的下面，用以改进激发能量进入纳米孔的聚焦和对来自纳米孔的荧光的收集。在一些实施方式中，位于纳米孔下面的嵌入式菲涅耳透镜和位于传感器上方的偏移菲涅耳透镜可包括具有可变栅距和可变步长的层叠结构。在其它实施方式中，仅位于传感器上方的偏移菲涅耳透镜可具有可变栅距和可变步长。可利用标准的光刻工艺和蚀刻技术来自制作这些衍射透镜。如图11-14中所示，衍射透镜形式11-2501的特征是具有包括大阶梯(大图案)和在大阶梯上的小阶梯(小团)的层叠结构，大图案和小图案两者具有当从左边向右边看时逐渐减小的栅距。用于可变栅距阶梯形衍射透镜的制造工艺可包括首先蚀刻大阶梯，接着蚀刻小阶梯如图11-16中所示，由此在第二蚀刻期间可保护大阶梯的角。替代的方法是首先蚀刻在平坦衬底上的小阶梯，接着蚀刻大阶梯，如图11-15中所示。任何合适的介电材料(例如SiO2或氮化硅、TiO2或Ta2O5)可用于形成用于衍射透镜的填充层和层叠层。在图11-15中所示的实施方式中，氮化硅是用于制作填充层并且SiO2是用于制作层叠层。
在层叠SiO2层的制造工艺中的第一步骤可包括使硬蚀刻掩膜11-2614直接地沉积在SiO2层11-2610的顶部上，接着使防反射层11-2622接着使光刻胶层11-2620沉积。任何合适的材料可用于硬蚀刻掩膜。例如，a-Si可用于图11-15中所示的硬蚀刻掩膜，但其它材料也是可行的。下一步骤可包括将ARC和/或光刻胶层施加在a-Si硬蚀刻掩膜的顶部上。可利用常规的光刻技术而形成可变栅距二元图案。例如，利用常规的蚀刻技术(例如反应性离子蚀刻技术)将图案转移到在下面的Si层。
大衍射透镜步骤的蚀刻深度可以是可获得期望焦距的任何合适的深度。在图11-16中所示的实施方式中，就大阶梯而言进入SiO2层的此蚀刻深度是大约684nm。然后，利用常规技术剥去(步骤11-2605)抗蚀剂和蚀刻掩膜残留物并清洗SiO2层表面。下一个步骤可包括蚀刻在各大阶梯上的小阶梯。在图11-图16中所示的实施方式中，各大阶梯包括四个较小的阶梯。
然后，使硬蚀刻掩膜11-2644沉积在所形成的SiO2层11-2610上。然后，使ARC层11-2642沉积在Si层11-2610的顶部上接着使光刻胶蚀刻掩蔽层11-2640沉积。将第二可变栅距小二元图案转移到光刻胶和/或ARC层。在图11-16中所示的实施方式中，制造步骤类似于图11-15中所示，然而对每个大阶梯的两个小阶梯进行蚀刻从而总共留下四个阶梯。在其它实施方式中，可采用任何数量的阶梯。然后，将小阶梯蚀刻入SiO2层11-2710。小衍射透镜步骤的厚度可以是任何合适的厚度。在图11-16中所示的实施方式中就小阶梯而言，进入SiO2层的蚀刻深度为大约342nm。然后，利用常规技术剥去抗蚀剂并清洗SiO2层的表面。
在形成层叠SiO2层11-2810之后的在制造工艺中的另外阶段可包括用任何合适的高折算率透镜材料11-2818，例如氮化硅来填充空腔，从而例如形成“嵌入式菲涅耳透镜”，如图11-17至图11-18中所示。用于“嵌入式菲涅耳透镜”的层叠结构可具有与用于的偏移菲涅耳透镜层叠结构大致相同和/或较小的尺寸特征。例如，可采用使氮化硅沉积的任何方法，例如PECVD。任选地，可对氮化硅层均匀地向下抛光，直到SiO2材料顶部阶梯被暴露。可替代地，对氮化硅层11-2818均匀地抛光，但不使SiO2材料暴露。在图11-18中所示的实施方式中，然后利用PECVD使SiO2的第二层11-2928沉积在经抛光氮化硅层11-2918的顶部上并利用CMP进行抛光。在一些实施方式中，间隔层11-2928可具有等于在该间隔层材料中的焦距的厚度。此外，可使其它合适的透明间隔层沉积在氮化硅层的顶部上。然后，可将纳米孔层制作在透明间隔层的顶部和/或其它层上。
可替代地，在图11-19中图示的实施方式中，用于衍射透镜的层叠层11-3018是由氮化硅制成。可以任何合适的厚度使氮化硅层11-3018沉积在在衬底11-3010的顶部上接着对掩膜11-3014、ARC层11-3022和光刻胶层11-3020进行蚀刻。在图11-19中所示的实施方式中，氮化硅层的厚度为大约1um。该制造工艺可类似于上面关于以SiO2形成层叠可变栅距衍射透镜层的所描述的制造工艺。任选地，不同的硬掩膜可用于形成氮化硅层叠层。该氮化硅层叠层可具有与SiO2层叠层大致相同和/或较小的尺寸特征。在形成氮化硅层叠层之后，可用任何合适的介电材料11-3028涂布氮化硅层。在图11-19中所示的实施方式中，用SiO2层11-3028涂布氮化硅层。例如，可利用常规的沉积工艺(例如PECVD)使SiO2层沉积。然后，可将SiO2层抛光而形成平坦的平面表面。然后，可在SiO2层和/或另外层的顶部上制作纳米孔层。
衍射光学部件的某些特征会要求在制造工艺期间某种程度的均匀性和/或准确度，以便获得具有期望光学特性的结构。例如，大和小阶梯的蚀刻深度会要求某种程度的准确度。在一些实施方式中，会要求在靶的50或10％内部的蚀刻深度从而实现进入焦斑纳米孔的期望的功率效率。此外，这些透镜特征的蚀刻会要求某种程度的均匀性。例如，要求在5％(或50nm)内的蚀刻均匀性，以便实现期望的焦距。
可利用任何合适的沉积和蚀刻工艺来制造任何上述透镜，从而获得改进的光学特性。例如但不限于，可采用PECVD。可以任何合适的方式对沉积参数进行调整，以减小自发光、减少对荧光的透镜吸收、和/或形成高折射率。例如，可通过减小Si-Si键的密度而实现减小的自发光荧光和透镜吸收，由此在氮化硅的沉积期间可形成硅纳米晶体。在一些实施方式中，可改变输入气体及它们的比率，从而减小Si-Si键和硅纳米晶体的密度。例如，可使用SiH4和N2以任何合适的方式对它们的比率进行调整，以减小Si纳米晶体的密度。在其它实施方式中，可使用SiH4和NH3以任何合适的方式调整它们的比率，以减小Si-Si键和硅纳米晶体的密度。例如，NH3与SiH4的比率可以是至少10：1。此外，在PECVD期间调整控制等离子体的频率可用于提高光学性能。例如，低频率(例如低于0.5MHz)与高频率(例如超过10MHz)比率可以s1至少1：1。
此外，上述沉积参数可调整透镜折射率从而改善光学特性。在一些实施方式中，氮化硅透镜的折射率可小于n＝1.92并且与633nm的波长相关，以便获得合适的低自发光效果和/或合适的低吸收损耗。上述的调整品质可彼此有关、成比例，相关、相关和/或彼此依赖。例如，n＝1.92的折射率是低荧光和低吸收损耗的指示物，就由氮化硅制成的透镜而言该低吸收损耗与低密度的Si-Si键和硅纳米晶体有关。
X.结论
因此已描述了本发明的至少一个实施方式的若干方面，但应理解的是本领域技术人员将任意地想到各种改变、修改和改进。
这种改变、修改和改进意图是本公开的一部分，并且意图是在本发明的精神和范围内。此外，尽管指出了本发明的优点，但应当理解的是并非本发明的每个实施方式将包括每个所描述的优点。一些实施方式可不应用在本文中和在一些情况下被描述为有利的任何特征。因此，前面的描述和附图仅仅是举例。
本发明的上述实施方式可以许多方式中的任一方式而实施。例如，实施方式可利用硬件、软件或其组合而实施。当在软件中实施时，可在任何合适的处理器或一系列处理器中执行软件编码，无论是设置在单计算机中或者分布于多个计算机中。这种处理器可具体化为集成电路，并且在集成电路部件中具有一个或多个处理器，包括在本领域为已知的可从市场上买到的集成电路部件，例如CPU芯片、GPU芯片、微处理器、微控制器、或协处理器。可替代地，处理器可具体化为定制电路(例如ASIC)，或者通过设置可编程逻辑装置所形成的半定制电路。作为又一个替代，处理器可以是较大电路或半导体装置的一部分，无论是可从市场上买到、半定制或者定制的。作为一个具体例子，一些市场上了买到的微处理器具有多个芯，使得一个或亚组的芯可构成处理器。尽管，处理器可利用采用任何合适格式的电路而应用。
此外，应当理解的是，计算机可具体化为一些形式中的任何形式，例如安装在机架上的计算机、台式计算机、l笔记本电脑、或平板电脑计算机。此外，可将计算机嵌入到通常被认为是计算机但具有合适的处理能力的一个装置中，包括个人数字助理(PDA)、智能手机或者任何其它合适的便携式或固定的电子装置。
另外，计算机可具有一个或多个输入和输出装置。可以利用这些装置而提供用户界面。可以用于提供用户界面的输出装置的例子包括用于输出的视觉显示的打印机或显示屏、及用于输出的听觉显示的扬声器或其它声音产生装置。可以使用于用户界面的输入装置的例子包括键盘、和定点装置，例如鼠标、触控板、和数字化板。作为另一个例子，计算机可通过语音识别或采用其它上声音格式而接收输入信息。
这种计算机可利用采用任何合适形成的一个或多个网络而互连，包括局域网或广域网(例如企业网或互联网)。这种网络可基于任何合适的技术，并且可根据任何合适的协议而操作，并且可包括无线网络、有线网络或光纤网络。
另外，本文中所概述的各种方法或工艺可编码成在采用多种操作系统或平台中的任一个的一个或多个处理器上所执行的软件。此外，这种软件可利用一些合适的编程语言和/或编程或脚本工具中的任一种而编写，并且也可被编译成在框架或虚拟机上所执行的可执行机器语言代码或中间代码。
在此方面，本发明可具体化为计算机可读存储介质(或多个计算机可读介质)(例如，计算机储存器、一个或多个软磁盘、光盘(CD)、光盘、数字视频磁盘(DVD)、磁带、闪速存储器、在现场可编程门阵列或其它半导体器件中的电路排列、或用一个或多个程序编码的其它有形的计算机存储介质，这些程序当在上一个或多个计算机或其它处理器中执行时，执行实施上述本发明各种实施方式的方法。正如基于前述实例显而易见的，计算机可读存储介质可保持信息达充分的时间，从而以非暂时的形式提供计算机可执行指令。这种计算机可读存储介质可以是可移动的，一件可以将存储于其中的程序或程序加载到一个或多个不同的计算机或其它处理器上从而实施如上所述的本发明的各种方面。本文中所使用的术语“计算机可读存储介质”只包括可以被认为是制造(即，制品)或机器的计算机可读介质。可替代地或此外，本发明可具体化为除计算机可读存储介质以外的计算机可读介质，例如传播信号。
本文中所使用的术语“程序”或“软件”通常指代可以用于给计算机或其它处理器编程从而实施如上所述本发明各种方面的任何类型的计算机代码或计算机可执行指令阻。此外，应当理解的是，根据本实施方式的一个方面、一个或多个计算机程序当执行本发明的方法时无需存在于单个计算机或处理器上，但可以模块化格式分布于一些不同的计算机或处理器中一般实施本发明的各种方面。
计算机可执行指令可采用由一个或多个计算机或其它装置所执行的许多形式，例如程序模块。通常，程序模块包括执行特定的任务或实施特定的抽象数据类型的例程、程序、对象、部件、数据结构，等。通常，在各种实施方式中，可根据需要将程序模块的功能加以组合或分布。
另外，可将数据结构存储于采用任何合适形式的计算机可读介质中。为了说明的简单性，可将数据结构图示为具有与在该数据结构中的位置有关的场。这种关系可同样地通过用在表达各场之间的关系的计算机可读介质中的位置为场指定存储而实现。然而，任何合适的机制可用于建立在数据结构的各场中的信息之间的关系，包括通过使用指针、标签或者建立在各数据元素之间关系的其它机制。
本发明的各种方面可单独地、组合地、或者在前面所描述实施方式中未具体描述的多种布置而应用，因此本发明的应用并不局限于在前面描述中所陈述或者在各附图中所示出的细节和部件的布置。例如，在一个实施方式中所描述的方面可以任何方式与在其它实施方式中所描述的方面相结合。
另外，本发明可具体化为方法，说明已提供了该方法的一个实例。作为该方法的一部分而执行的步骤可以任何合适的方式来安排顺序。因此，实施方式可以其中各步骤是按不同与所描述的步骤而构成，这可包括同时地执行一些步骤，即使在说明性实施方式中被图示为相继的步骤。
在权利要求中用序数术语例如“第一”、“第二”、“第三”等来修饰权利要求要素本身不暗示一个权利要求要素相对于另一个要素的任何优先级、位次、或顺序，或者其中执行方法的步骤的时间顺序，但仅仅是用作标记以便将具有某个名称的一个权利要求要素与具有相同名称的另一个元件(但用于序数用词的使用)加以区分从而区分个权利要求要素。
另外，本文中所使用的用语和术语是为了描述的目的，而不应认为是限制性的。在本文中“包含”、“包括”、或“具有”、“包含”、“包括”及其变体的使用意图包括列在其后的项及其等同物以及其它的项。

Claims (60)

1.一种用于与包括多个样品阱的检测芯片相互作用的仪器，所述多个样品阱的各样品阱用于接收样品，所述仪器包括：
至少一个脉冲激发光源，用于激发所述多个样品阱的至少一部分的所述样品；
多个传感器，所述多个传感器的各传感器相应于所述多个样品阱中的一个样品阱，其中所述多个传感器的各传感器用于检测来自在各自的样品阱中的样品的发射能量，其中所述多个传感器的各传感器能够检测所述发射能量的检测时间；和
至少一个光学元件，用于将来自所述多个样品阱的各样品阱的所述发射能量朝向所述多个传感器中各自的传感器引导。
2.如权利要求1所述的仪器，还包括：
多色反射镜，用于将来自所述至少一个激发光源的激发光朝向所述检测芯片反射并且将来自多个样品的所述发射能量朝向所述多个传感器传输。
3.如权利要求1所述的仪器，其中所述至少一个光学元件包括中继透镜。
4.如权利要求1所述的仪器，其中所述至少一个激发光源包括多个光源，所述多个光源的各光源发出在一个或多个波长处的激发光。
5.如权利要求4所述的仪器，还包括波长合波器，用于将来自所述多个光源各自发出的光在空间上叠加。
6.如权利要求1所述的仪器，还包括至少一个光谱滤光器，用于传输所述发射能量并且吸收和/或反射来自所述至少一个激发光源的激发光。
7.如权利要求1所述的仪器，还包括至少一个光谱分选元件，用于第一波长的发射能量与第二波长的发射能量的空间上分离。
8.如权利要求8所述的仪器，其中所述至少一个光谱分选元件包括衍射光学元件。
9.如权利要求9所述的仪器，其中所述衍射光学元件既从颜色上分散所述发射能量又集中所述发射能量。
10.如权利要求9所述的仪器，其中所述衍射光学元件包括偏移菲涅耳透镜。
11.如权利要求8所述的仪器，其中所述至少一个光谱分选元件是光过滤元件。
12.如权利要求1所述的仪器，还包括控制系统，所述控制系统被编程为：(i)将激发光引导至所述多个样品阱、(ii)在所述多个传感器处对来自所述多个样品阱的信号进行检测、和(iii)利用所述信号的时间分布来鉴定所述样品或其亚单位。
13.一种装置，包括：
包括多个像素的检测芯片，每个所述多个像素包括：
用于接收样品的样品阱，所述样品当被激发时发出发射能量；
用于在特定方向上引导所述发射能量的至少一个元件，其中所述至少一个元件选自由折射元件、衍射元件、等离子激元元件和共振腔所组成的组群；
光路，所述发射能量从所述样品阱沿所述光路朝向传感器行进；和
仪器，用于与所述检测芯片相互作用，所述仪器包括：
至少一个脉冲激发光源，用于激发在各样品阱中的样品；
多个传感器，所述多个传感器的各传感器相应于各自的样品阱，其中所述多个传感器的各传感器是用于检测来自在各自的样品阱中的样品的发射能量，其中所述多个传感器的各传感器能够检测所述发射能量的所述检测时间；和
至少一个光学元件，用于将所述发射能量从各样品阱朝向所述多个传感器中各自的传感器引导。
14.如权利要求14所述的装置，其中所述检测芯片用于连接到所述仪器和从所述仪器中取出。
15.如权利要求15所述的装置，其中当把所述检测芯片连接到所述仪器时，所述多个样品阱中的一个样品阱与所述多个传感器中相应的传感器之间的光学距离小于30cm。
16.如权利要求15所述的装置，其中当所述检测芯片连接到所述仪器时，所述多个样品阱中的一个样品阱与所述多个传感器中相应的传感器之间的所述光学距离小于5cm。
17.如权利要求15所述的装置，其中当所述检测芯片连接到所述仪器时，所述多个样品阱中的一个样品阱与所述多个传感器中相应的传感器之间的光学距离小于1cm。
18.所述如权利要求14所述的装置，其中，
各样品包括在多个波长带的一个波长带内发出所述发射能量的发光标签；并且
所述多个传感器的各传感器包括副传感器，用于检测所述多个波长带的各波长带处的所述发射能量。
19.如权利要求19所述的装置，其中所述多个传感器的各传感器包括至少两个副传感器。
20.如权利要求20所述的装置，其中所述多个传感器的各传感器包括至少四个副传感器。
21.如权利要求20所述的装置，其中所述仪器还包括至少一个波长依赖性元件，其朝向所述至少两个副传感器的第一副传感器引导第一波长的发射能量并且朝向所述至少两个副传感器的第二副传感器引导第二波长的发射能量。
22.如权利要求22所述的装置，其中所述至少一个波长依赖性元件是衍射光学元件。
23.如权利要求22所述的装置，其中所述至少一个波长依赖性元件是光谱滤光器。
24.如权利要求14所述的装置，其中各样品包括发光标签，其寿命不同于另一样品的至少一个其它发光标签的寿命。
25.如权利要求19所述的装置，其中：
与第一样品相关的第一发光标签是由第一波长的光所激发但不是由第二波长的光所激发；和
与第二样品相关的第二发光标签是由所述第二波长的光所激发但不是由所述第一波长的光所激发。
26.一种对试样进行分析的方法，所述方法包括：
将所述试样放置在包括多个样品阱的检测芯片的上表面上；
使所述芯片与包括至少一个激发光源和至少一个传感器的仪器对准；
用来自所述至少一个脉冲激发光源的脉冲激发光，激发来自所述多个样品阱的至少一个中的所述试样的样品；和
利用所述至少一个传感器检测由所述至少一个样品阱中的所述样品响应于激发光的激发所产生的发射能量，其中所述至少一个传感器能够确定由所述样品所产生的发射能量的寿命。
27.如权利要求28所述的方法，还包括：
基于对所述发射能量的检测来确定发出所述发射能量的分子的类型。
28.如权利要求29所述的方法，其中确定所述分子的类型包括：测量所述发射能量的光谱特性和/或时间特性。
29.如权利要求29所述的方法，其中确定所述分子的类型还包括：
确定激发所述样品的所述激发光的波长。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述至少一个激发光源包括多个激发光源，所述多个激发光源的各激发光源发出不同波长的光。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述样品包括附接到荧光团的至少一个核苷酸。
32.一种用于对靶核酸分子进行测序的方法，包括：
(a)提供芯片，使其与包括脉冲激发源和能够检测光的至少一个时间特性的传感器的仪器相邻，其中所述芯片包括至少一个阱，当所述芯片处在所述仪器的感测位置时所述至少一个阱可操作地联接到所述激发源和所述传感器，并且其中所述阱容纳所述靶核酸分子、聚合酶和多种类型的核苷酸或核苷酸类似物；
(b)当所述芯片在所述感测位置时，在所述聚合酶存在下在所述靶核酸分子的引发位置执行延伸反应从而将所述核苷酸或核苷酸类似物顺序地并入与所述靶核酸分子为互补的生长链中，其中在并入和用来自所述激发源的激发能量激发时，在所述阱中的所述核苷酸或核苷酸类似物发出信号；
(c)利用所述传感器来检测所述信号的空间和/或时间分布图形，对于所述多种类型的核苷酸或核苷酸类似物而言所述图形是可区分的；和
(d)基于所述信号的空间和/或时间分布图形来鉴定所述核苷酸或核苷酸类似物，由此对所述靶核酸分子进行测序。
33.如权利要求34所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物包括当并入所述生长链中时发出所述信号的标签。
34.如权利要求35所述的方法，其中所述标签是发光标签。
35.如权利要求34所述的方法，其中在对所述信号的空间和/或时间分布图形进行检测之后，鉴定所述核苷酸或核苷酸类似物。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述多种类型的核苷酸或核苷酸类似物包括四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物，并且其中与所述四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物相关的所述信号的空间和/或时间分布图形是可相互区分的。
37.如权利要求34所述的方法，其中与所述四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物相关的所述信号的空间和/或时间分布图形相互独立地检测。
38.如权利要求34所述的方法，其中所述信号的空间和/或时间分布图形可基于每个所述空间和/或时间分布图形的形状和/或强度分布而相互区分。
39.如权利要求34所述的方法，其中所述引发位置包括与所述靶核酸分子是互补的引物。
40.如权利要求34所述的方法，其中(b)包括利用杂交到所述靶核酸分子的所述引物执行引物延伸反应从而获得所述生长链。
41.如权利要求42所述的方法，其中所述靶核酸分子是双链的。
42.如权利要求43所述的方法，其中所述引发位置是在所述靶核酸分子中的缺口或切口。
43.如权利要求34所述的方法，其中所述聚合酶被固定化在所述阱中。
44.如权利要求45所述的方法，其中所述聚合酶被固定化在所述阱的底部。
45.如权利要求46所述的方法，其中利用附接到所述阱的表面的接头将所述聚合酶固定化。
46.如权利要求34所述的方法，其中所述聚合酶显示链置换活性。
47.如权利要求34所述的方法，其中所述阱属于所述芯片中的多个阱。
48.如权利要求34所述的方法，其中所述仪器包括可操作地联接到所述多个阱的多个激发源。
49.一种用于核酸测序的方法，包括：
(a)提供芯片至与仪器相邻，其中所述芯片包括多个阱，当所述芯片处在所述仪器的感测位置时所述阱各自可操作地联接到所述仪器的(i)脉冲激发源和(ii)传感器，并且其中所述多个阱的各个阱容纳靶核酸分子、聚合酶、及多种类型的核苷酸或核苷酸类似物；
(b)当所述芯片在所述感测位置时，在所述核苷酸或核苷酸类似物和所述聚合酶的存在下使所述靶核酸分子经历聚合反应以获得与所述靶核酸分子为互补的生长链，其中当在并入期间利用来自所述激发源的激发能量激发时所述核苷酸或核苷酸类似物在各个阱中发出信号；
(c)利用所述传感器来检测所述信号的时间分布图形，就所述多种类型的核苷酸或核苷酸类似物而言所述时间分布图形是可区分的；和
(d)基于所述信号的空间和/或时间分布图形来鉴定所述靶核酸分子的序列。
50.如权利要求51所述的方法，其中所述核苷酸或核苷酸类似物包括当并入所述生长链时发出信号的标签。
51.如权利要求52所述的方法，其中所述标签是发光标签。
52.如权利要求51所述的方法，其中在对所述信号的空间和/或时间分布图形进行检测之后对所述序列进行鉴定。
53.如权利要求51所述的方法，其中所述多种类型的核苷酸或核苷酸类似物包括四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物，并且其中与所述四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物相关的所述信号的空间和/或时间分布图形是可相互区分的。
54.如权利要求55所述的方法，其中与所述四种不同类型的核苷酸或核苷酸类似物相关的所述信号的空间和/或时间分布图形是相互独立地检测。
55.如权利要求51所述的方法，其中(b)包括利用杂交到所述靶核酸分子的引物执行引物延伸反应从而获得所述生长链。
56.如权利要求51所述的方法，其中所述靶核酸分子是单链。
57.如权利要求51所述的方法，其中所述聚合酶被固定化于所述阱中。
58.如权利要求51所述的方法，其中所述激发源可操作地联接到所述多个阱。
59.如权利要求51所述的方法，其中所述仪器包括可操作地联接到所述多个阱的多个激发源。
60.如权利要求51所述的方法，其中所述仪器包括可操作地联接到所述多个阱的多个传感器。
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