CN110832305A - 利用基于半导体的检测的高通量测序系统和设备 - Google Patents

Abstract

在一个实施方案中，生物传感器的样本表面包括像素区域并且在采样事件序列期间保持多个簇，使得簇在像素区域上不均匀分布。在另一个实施方案中，生物传感器具有样本表面，该样本表面包括像素区域和覆盖像素区域的阱阵列，该生物传感器的每个像素区域包括两个阱和两个簇。每个像素区域的两个阱包括一个主阱和一个副阱。主阱在像素区域上的横截面大于副阱。在另一个实施方案中，照明系统耦合到生物传感器，该照明系统在采样事件序列期间以不同的照明角度(1201，1211)照明像素区域(1204’，1214’)，包括对于采样事件，用离轴照明(1200A，1200B)来照明每个阱(1202，1212)，以在每个阱(1202，1212)中产生不对称照明的阱区域。

Description

利用基于半导体的检测的高通量测序系统和设备

优先权申请

本申请要求以下申请的优先权或权益：

2018年1月8日提交的发明名称为“SYSTEMS AND DEVICES FOR HIGH-THROUGHPUTSEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION”的第62/614,934号美国临时专利申请(代理人案卷号ILLM 1003-2/IP-1656-PRV)；

2018年1月8日提交的发明名称为“HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITHSEMICONDUCTOR-BASED DETECTION”的第62/614,930号美国临时专利申请(代理人案卷号ILLM 1003-1/IP-1653-PRV)；以及

2018年4月12日提交的发明名称为“HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITHSEMICONDUCTOR-BASED DETECTION”的第2020758号荷兰申请(代理人案卷号ILLM 1003-6/IP-1653-NL)。

出于所有目的，优先权申请在此通过引用并入。

其它申请的交叉引用

出于所有目的，以下专利申请全文并入本文：

同时提交的发明名称为“HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION”的美国非临时专利(代理人案卷号ILLM 1003-4/IP-1653-US)；

2018年1月8日提交的发明名称为“MULTIPLEXING OF AN ACTIVE SENSORDETECTOR USING STRUCTURED ILLUMINATION”的美国临时专利申请(代理人案卷号IP-1623-PRV)；

2013年3月15日提交的发明名称为“BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICALANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR SAME”的第13/833,619号美国非临时专利申请(代理人案卷号IP-0626-US)；

2016年6月7日提交的发明名称为“BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICALANALYSIS AND METHODS OF MANUFACTURING THE SAME”的第15/175,489号美国非临时专利申请(代理人案卷号IP-0689-US)；

2013年4月26日提交的发明名称为“MICRODEVICES AND BIOSENSOR CARTRIDGESFOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR THE SAME”的第13/882,088号美国非临时专利申请(代理人案卷号IP-0462-US)；以及

2012年9月21日提交的发明名称为“METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEICACID SEQUENCING”的第13/624,200号美国非临时专利申请(代理人案卷号IP-0538-US)。

技术领域

所公开的技术的实施方案通常涉及利用基于CMOS的检测进行测序，并且更具体地，涉及用于增大利用基于CMOS的检测进行测序的通量的系统和方法。

背景技术

生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支撑表面上或在预定的反应室(或阱)内进行大量受控反应。然后可以观察或检测期望的反应，并且随后的分析可以有助于识别或揭示参与反应的化学物质的性质。例如，在一些多重测定中，具有可识别标记(例如荧光标记)的未知分析物(例如克隆扩增核酸簇)可以在受控条件下暴露于数以千计的已知探针。每个已知的探针可以沉积到微孔板或流动池的相应阱中。观察阱内已知探针与未知分析物之间发生的任何化学反应有助于识别或揭示分析物的性质。这种方案的其它示例包括已知的DNA测序过程，诸如边合成边测序(SBS)或循环阵列测序。

在一些常规的荧光检测方案中，使用光学系统将激发光引导到荧光标记的分析物上，并且还检测分析物可能发出的荧光信号。然而，这种光学系统可能相对昂贵并且需要更大的台式占地面积。例如，光学系统可以包括透镜、滤光器和光源的布置。在其它提出的检测系统中，受控反应直接发生在固态成像器(例如，电荷耦合设备(CCD)或互补金属氧化物半导体(CMOS)传感器)上，不需要大的光学部件来检测荧光发射。

然而，所提出的固态成像系统可能有一些限制。例如，固态成像器限于每个传感器(或像素)一个簇碱基识别，并且它们的通量取决于传感器的像素密度(像素密度是像素间距的函数)。由于在显著减小像素间距方面存在限制，因此需要探索其它解决方案来提高固态成像器的通量。

出现了这样的机会，即通过每个传感器(或像素)碱基识别多个簇来增大固态成像系统的通量，并且提供了便于每个传感器(或像素)多个簇碱基识别的系统和设备。

本公开的实施方案总体上涉及生物或化学分析，并且更具体地说，涉及使用检测设备进行生物或化学分析的系统和方法。

生物或化学研究中的各种方案涉及在局部支撑表面上或在预定的反应室内进行大量受控反应。然后可以观察或检测期望的反应，并且随后的分析可以有助于识别或揭示参与反应的化学物质的性质。例如，在一些多重测定中，具有可识别标记(例如荧光标记)的未知分析物可以在受控条件下暴露于数以千计的已知探针。每个已知的探针可以沉积在表面上的相应位置。观察表面上已知探针与未知分析物之间发生的任何化学反应有助于识别或揭示分析物的性质。这种方案的其它示例包括已知的DNA测序过程，诸如边合成边测序(SBS)或循环阵列测序。

在一些常规的荧光检测方案中，使用光学系统将激发光引导到荧光标记的分析物上，并且还检测分析物可能发出的荧光信号。标准成像技术的通量尤其受到检测设备中可用像素的数量的限制。因此，当检测具有大量分析物集合的表面时，这些光学系统可能相对昂贵，并且需要相对较大的台式占地面积。例如，用于基因分型、表达或测序分析的核酸阵列可能需要检测每平方厘米阵列上数百万个不同的位点。通量的限制增加了成本，并且降低了这些分析的准确性。

因此，需要更高通量的装置和方法，以例如检测核酸阵列。本公开解决了这一需求，并且还提供了其它优点。

发明内容

根据一个实施方案，提供了一种用于碱基识别的设备，该设备包括配置为容纳生物传感器的容器。该生物传感器具有(a)在采样事件序列期间保持多个簇的样本表面，(b)配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列，以及(c)输出多个像素信号序列的通信端口。阵列具有数量为N的有源传感器，并且阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。该设备还包括耦合到容器的信号处理器。信号处理器配置为接收和处理多个像素信号序列，以对多个簇中的簇上的采样事件序列的结果进行分类，包括使用多个像素信号序列对来自数量为N的有源传感器的多个簇中的数量为N+M的簇上的采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数。

采样事件序列的结果可以对应于簇中的核苷酸碱基。

采样事件可以包括时间序列中的两个照明阶段，并且多个像素信号序列中的像素信号序列可以包括用于每个采样事件的一组信号样本，该组信号样本包括来自两个照明阶段中的每一个的至少一个像素信号。

信号处理器可以包括对来自传感器阵列中单个传感器的像素信号序列的两个簇的结果进行分类的逻辑。对两个簇的结果进行分类的逻辑可以包括将来自特定传感器的采样事件的该组信号样本的第一像素信号映射到至少四个区段(bin)中，并且将采样事件的该组信号样本的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合第一像素信号和第二像素信号的映射以对两个簇的结果进行分类。

传感器阵列中的传感器可以包括光检测器。

采样事件可以包括时间序列中的两个照明阶段，并且多个像素信号序列中的像素信号序列可以包括用于每个采样事件的一组信号样本，该组信号样本包括来自两个照明阶段中的每一个的至少一个像素信号。第一照明阶段可以诱导来自指示核苷酸碱基A和T的给定簇的照明，并且第二照明阶段可以诱导来自指示核苷酸碱基C和T的给定簇的照明，并且所述分类结果可以包括识别核苷酸碱基A、C、T或G中的一个。

簇可以不均匀地分布在样本表面的像素区域上，并且信号处理器可以对多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以检测对应于样本表面上的各个簇的照明模式，并且对各个簇的采样事件的结果进行分类。多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在像素区域上的不均匀分布造成的差分串扰。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，包括每个像素区域两个阱，每个像素区域两个阱可以包括主阱和副阱，主阱在像素区域上的横截面可以大于副阱。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，并且采样事件可以包括具有数量为K的照明阶段的至少一个化学阶段，其中K是正整数。K个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明像素区域，并且像素信号序列可以包括用于每个采样事件的一组信号样本，该组信号样本包括用于采样事件的至少一个化学阶段的数量为K的像素信号。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，并且采样事件可以包括具有数量为K的照明阶段的第一化学阶段，其中K是正整数。K个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明像素区域，并且第二化学阶段具有数量为J的照明阶段，其中J是正整数。第一化学阶段中的K个照明阶段中的照明阶段和第二化学阶段中的J个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明阱阵列中的阱，并且像素信号序列可以包括用于每个采样事件的一组信号样本，该组信号样本包括用于采样事件的第一化学阶段的K个像素信号加上第二化学阶段的J个像素信号。

在另一实施方案中，提供了用于碱基识别的生物传感器。生物传感器包括采样设备。采样设备包括具有像素区域阵列的采样表面和具有传感器阵列的固态成像器。每个传感器在每个碱基识别循环中生成像素信号。每个像素信号代表从样本表面的相应像素区域收集的光。生物传感器还包括配置为连接到采样设备的信号处理器。信号处理器接收并且处理来自传感器的像素信号，用于在碱基识别循环中进行碱基识别，并且使用来自比在碱基识别循环中识别的多个簇碱基少的传感器的像素信号。

像素区域可以接收来自样本表面上的阱的光，并且该阱可以在碱基识别循环期间容纳多于一个簇。

一个簇可以包括多个具有相同核酸序列的单链脱氧核糖核酸片段(缩写为DNA)。

在另一实施方案中，提供了一种碱基识别的方法。对于边合成边测序(缩写为SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环，该方法包括检测：(1)代表在碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域收集的光的第一像素信号，以及(2)代表在碱基识别循环的第二照明阶段期间从第一像素区域收集的光的第二像素信号。第一像素区域位于共享第一像素区域的多个簇之下。该方法包括使用第一像素信号和第二像素信号的组合在碱基识别循环期间识别并入到多个簇中的每个簇上的核苷酸碱基。

该方法还可以包括将第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将第二像素信号映射到至少四个区段中，并且组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别并入的核苷酸碱基。

该方法还可以包括应用该方法在碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

该方法还可以包括在连续的碱基识别循环中重复该方法，以在碱基识别循环中的每一个期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

对于每个碱基识别循环，该方法还可以包括检测和存储由多个像素区域处的多个簇发射的第一像素信号和第二像素信号，并且在碱基识别循环之后，使用第一像素信号和第二像素信号的组合来识别在先前的碱基识别循环中的每一个期间并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

第一像素区域可以接收来自样本表面上的相关联的阱的光。第一像素区域可以接收来自样本表面上的多于一个相关联的阱的光。第一像素信号和第二像素信号可以由第一传感器从第一像素区域收集。第一像素信号和第二像素信号可以由信号处理器检测，该信号处理器配置为处理由第一传感器收集的像素信号。第一照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基A和T的发射，并且第二照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基C和T的发射。

在另一实施方案中，提供了一种识别在生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所识别的像素区域处碱基识别簇的方法。该方法包括执行多个碱基识别循环，每个碱基识别循环具有第一照明阶段和第二照明阶段。该方法包括在与样本表面的像素区域相关联的传感器处捕获(1)在碱基识别循环的第一照明阶段期间生成的第一组强度值，以及(2)在碱基识别循环的第二照明阶段期间生成的第二组强度值。该方法包括使用信号处理器将十六个分布拟合到第一组强度值和第二组强度值，并且基于该拟合，将像素区域分类为具有多于一个簇。对于连续的碱基识别循环，该方法包括使用信号处理器在像素区域处检测簇群的第一组强度值和第二组强度值，并且选择簇群的分布。该分布识别簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基。

该方法可以包括使用一种或多种算法(包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法)进行拟合。

该方法可以包括标准化强度值。

像素区域可以接收来自样本表面上的相关联的阱的光。

在另一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括配置为保持生物传感器的容器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域，该像素区域在采样事件序列期间位于多个簇的之下，使得簇在像素区域上分布不均匀。生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。该设备还包括耦合到容器的信号处理器。信号处理器配置为对多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以从数量为N的有源传感器中检测对应于样本表面上数量为N+M的各个簇的照明模式(其中M是正整数)，并且针对数量为N+M的各个簇对采样事件序列的结果进行分类。多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在像素区域上的不均匀分布造成的差分串扰。

信号处理器可以使用从数量为N的有源传感器检测到的照明模式来定位样本表面上数量为N+M的各个簇。

在另一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括生物传感器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域和覆盖像素区域的阱阵列，每个像素区域包括两个阱。每个像素区域的两个阱包括一个主阱和一个副阱。主阱在像素区域上的横截面比副阱大。

这两个阱可以相对于像素区域的中心具有不同的偏移。在采样事件期间，像素区域可以从两个阱接收不同量的照明。在采样事件期间，两个阱的每一个都可以容纳至少一个簇。在采样事件期间，像素区域可以从主阱中的亮簇接收的照明量大于从副阱中的暗簇接收的照明量。

生物传感器可以耦合到信号处理器。信号处理器可以配置为接收和处理多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别数量为N+M的簇中存在的核苷酸碱基。对于亮簇和暗簇，这可以包括将在采样事件的第一照明阶段期间由对应于像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，将在采样事件的第二照明阶段期间由传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别亮簇和暗簇中存在的核苷酸碱基。

生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。

在又一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括生物传感器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域和覆盖像素区域的阱阵列。该设备还包括照明系统。照明系统在采样事件序列期间以不同的照明角度照明像素区域，包括对于采样事件序列中的采样事件，用离轴照明来照明每个阱，以在每个阱中产生不对称照明的阱区域。

阱的不对称照明的区域可以包括至少主阱区域和副阱区域，使得在采样事件期间，主阱区域比副阱区域被更多地照明。在采样事件期间，该阱可以容纳多于一个簇，主阱区域和副阱区域各包括一个簇。在采样事件期间，覆盖阱的像素区域可以从主阱区域中的亮簇接收的照明量大于从副阱区域中的暗簇接收的照明量。

离轴照明可以以四十五度角进行。在一些实施方案中，每个像素区域覆盖一个阱。在其它实施方案中，每个像素区域覆盖两个阱。

生物传感器可以耦合到信号处理器。信号处理器可以配置为接收和处理多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别数量为N+M的簇中存在的核苷酸碱基。对于亮簇和暗簇，这可以包括将在采样事件的第一照明阶段期间由对应于像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，将在采样事件的第二照明阶段期间由传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别亮簇和暗簇中存在的核苷酸碱基。

生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。

根据另一实施方案，提供了一种用于碱基识别的设备，该设备包括配置为容纳生物传感器的容器。该生物传感器具有(a)在采样事件的序列期间保持多个簇的样本表面，(b)配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列，以及(c)输出多个像素信号序列的通信端口。阵列中的每个传感器感测来自设置在样本表面的相应像素区域中的一个或多个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号。阵列具有数量为N的有源传感器，并且阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。该设备还包括耦合到容器的信号处理器。信号处理器配置为接收和处理多个像素信号序列，以对多个簇中的簇上的采样事件序列的结果进行分类。多个像素信号序列中的至少一个像素信号序列中的每个采样事件的像素信号代表来自相应像素区域中的至少两个簇的感测的信息。信号处理器使用多个像素信号序列对来自数量为N的有源传感器的多个簇中的数量为N+M的簇上的采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数。

采样事件序列的结果可以对应于簇中的核苷酸碱基。

采样事件可以包括时间序列中的两个照明阶段，并且多个像素信号序列中的所述至少一个像素信号序列可以包括一个像素信号，该像素信号包括来自两个照明阶段中的每一个的相应像素区域中的至少两个簇的信息。

信号处理器可以包括对来自所述至少一个像素信号序列的像素信号序列的两个簇的结果进行分类的逻辑。对两个簇的结果进行分类的逻辑可以包括将来自特定传感器的所述至少一个像素信号序列中的第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将所述至少一个像素信号序列中的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑组合第一像素信号和第二像素信号的映射以对两个簇的结果进行分类。

传感器阵列中的传感器可以包括光检测器。

采样事件可以包括时间序列中的两个照明阶段，并且多个像素信号序列中的像素信号序列包括来自两个照明阶段中的每一个的至少一个像素信号。第一照明阶段可以诱导来自传感器像素区域中指示核苷酸碱基A和T的一个或多个簇的照明，并且第二照明阶段诱导来自传感器像素区域中指示核苷酸碱基C和T的一个或多个簇的照明，并且所述分类结果包括使用所述至少一个序列为至少两个簇识别核苷酸碱基A、C、T或G中的一个。

簇可以不均匀地分布在样本表面的像素区域上，并且信号处理器可以对多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以检测对应于样本表面上的各个簇的照明模式，并且对各个簇的采样事件的结果进行分类。多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在像素区域上的不均匀分布造成的差分串扰。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，包括每个像素区域两个阱，每个像素区域两个阱可以包括主阱和副阱，主阱在像素区域上的横截面可以大于副阱。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，并且采样事件可以包括具有数量为K的照明阶段的至少一个化学阶段，其中K是正整数。K个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明像素区域，并且像素信号序列可以包括用于采样事件的至少一个化学阶段的数量为K的像素信号。

样本表面可以包括覆盖像素区域的阱阵列，并且采样事件可以包括具有数量为K的照明阶段的第一化学阶段，其中K是正整数。K个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明像素区域，并且第二化学阶段具有数量为J的照明阶段，其中J是正整数。第一化学阶段中的K个照明阶段中的照明阶段和第二化学阶段中的J个照明阶段中的照明阶段可以用不同的照明角度照明阱阵列中的阱，并且像素信号序列可以包括用于采样事件的第一化学阶段的K个像素信号加上第二化学阶段的J个像素信号。

在又一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的生物传感器。生物传感器包括采样设备。采样设备包括具有像素区域阵列的采样表面和具有传感器阵列的固态成像器。每个传感器在每个碱基识别循环中生成像素信号。每个像素信号代表在一个碱基识别循环中从样本表面的相应像素区域中的一个或多个簇中收集的光。生物传感器还包括配置为连接到采样设备的信号处理器。信号处理器接收并且处理来自传感器的像素信号，用于在碱基识别循环中进行碱基识别，并且使用来自比在碱基识别循环中识别的多个簇碱基少的传感器的像素信号。来自较少传感器的像素信号包括至少一个像素信号，该像素信号代表从相应像素区域中的至少两个簇收集的光。

像素区域可以接收来自样本表面上的阱的光，并且该阱可以在碱基识别循环期间容纳多于一个簇。

一个簇可以包括多个具有相同碱基序列的单链片段。

在进一步的实施方案中，提供了一种碱基识别的方法。对于边合成边测序(缩写为SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环，该方法包括检测：(1)代表在碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域中的至少两个簇收集的光的第一像素信号，以及(2)代表在碱基识别循环的第二照明阶段期间从第一像素区域中的所述至少两个簇收集的光的第二像素信号。第一像素区域位于共享第一像素区域的多个簇之下。该方法包括使用第一像素信号和第二像素信号的组合在碱基识别循环期间识别并入到至少两个簇中的每个簇上的核苷酸碱基。

该方法还可以包括将第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将第二像素信号映射到至少四个区段中，并且组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别并入的核苷酸碱基。

该方法还可以包括应用该方法在碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

该方法还可以包括在连续的碱基识别循环中重复该方法，以在碱基识别循环中的每一个期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

对于每个碱基识别循环，该方法还可以包括检测和存储由多个像素区域处的多个簇发射的第一像素信号和第二像素信号，并且在碱基识别循环之后，使用第一像素信号和第二像素信号的组合来识别在先前的碱基识别循环中的每一个期间并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

第一像素区域可以接收来自样本表面上的相关联的阱的光。第一像素区域可以接收来自样本表面上的多于一个相关联的阱的光。第一像素信号和第二像素信号可以由第一传感器从第一像素区域收集。第一像素信号和第二像素信号可以由信号处理器检测，该信号处理器配置为处理由第一传感器收集的像素信号。第一照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基A和T的发射，并且第二照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基C和T的发射。

在另一实施方案中，提供了一种识别在生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所识别的像素区域处碱基识别簇的方法。该方法包括执行多个碱基识别循环，每个碱基识别循环具有第一照明阶段和第二照明阶段。该方法包括在与样本表面的像素区域相关联的传感器处捕获(1)在碱基识别循环的第一照明阶段期间生成的第一组强度值，以及(2)在碱基识别循环的第二照明阶段期间生成的第二组强度值。该方法包括使用信号处理器将第一组强度值和第二组强度值拟合到一组分布，并且基于该拟合，将像素区域分类为具有多于一个簇。对于连续的碱基识别循环，该方法包括使用信号处理器在像素区域处检测簇群的第一组强度值和第二组强度值，并且选择簇群的分布。该分布识别在簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基。

该方法可以包括使用一种或多种算法(包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法)进行拟合。

该方法可以包括标准化强度值。

像素区域可以接收来自样本表面上的相关联的阱的光。

在另一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括配置为保持生物传感器的容器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域，该像素区域在采样事件序列期间位于多个簇的之下，使得簇在像素区域上分布不均匀。生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。阵列中的每个传感器感测来自设置在样本表面的相应像素区域中的一个或多个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。该设备还包括耦合到容器的信号处理器。信号处理器配置为对多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以从数量为N的有源传感器中检测对应于样本表面上数量为N+M的各个簇的照明模式(其中M是正整数)，并且针对数量为N+M的各个簇对采样事件序列的结果进行分类。多个像素信号序列中的至少一个像素信号序列中的每个采样事件的像素信号代表来自相应像素区域中的至少两个簇的感测的信息，并且多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在像素区域上的不均匀分布导致的差分串扰。

信号处理器可以使用从数量为N的有源传感器检测到的照明模式来定位样本表面上数量为N+M的各个簇。

在另一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括生物传感器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域和覆盖像素区域的阱阵列，生物传感器包括每个像素区域两个阱和两个簇。每个像素区域的两个阱包括一个主阱和一个副阱。主阱在像素区域上的横截面比副阱大。

生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。阵列中的每个传感器感测来自设置在样本表面的相应像素区域中的两个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。

这两个阱可以相对于像素区域的中心具有不同的偏移。在采样事件期间，像素区域可以从两个阱接收不同量的照明。多个像素信号序列中的至少一个像素信号序列中的每个采样事件的像素信号代表来自相应像素区域中的两个簇的感测的信息。在采样事件期间，两个阱的每一个都可以容纳至少一个簇。在采样事件期间，像素区域可以从主阱中的亮簇接收的照明量大于从副阱中的暗簇接收的照明量。

生物传感器可以耦合到信号处理器。信号处理器可以配置为接收和处理多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别数量为N+M的簇中存在的核苷酸碱基。对于亮簇和暗簇，这可以包括将在采样事件的第一照明阶段期间由对应于像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，将在采样事件的第二照明阶段期间由传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别亮簇和暗簇中存在的核苷酸碱基。

在又一实施方案中，提供了一种用于碱基识别的设备。该设备包括生物传感器。生物传感器具有样本表面。样本表面包括像素区域和覆盖像素区域的阱阵列，每个像素区域有至少两个簇。该设备还包括照明系统。照明系统在采样事件序列期间以不同的照明角度照明像素区域，包括对于采样事件序列中的采样事件，用离轴照明来照明每个阱，以在每个阱中产生不对称照明的阱区域。

阱的不对称照明的区域可以包括至少主阱区域和副阱区域，使得在采样事件期间，主阱区域比副阱区域被更多地照明。在采样事件期间，该阱可以容纳多于一个簇，主阱区域和副阱区域各包括一个簇。在采样事件期间，覆盖阱的像素区域可以从主阱区域中的亮簇接收的照明量大于从副阱区域中的暗簇接收的照明量。

离轴照明可以以四十五度角进行。在一些实施方案中，每个像素区域覆盖一个阱。在其它实施方案中，每个像素区域覆盖两个阱。

生物传感器还具有配置为生成多个像素信号序列的传感器阵列。阵列中的每个传感器感测来自设置在样本表面的相应像素区域中的至少两个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号。该阵列具有数量为N的有源传感器。阵列中的传感器相对于样本表面设置，以在采样事件序列期间从样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，从而产生多个像素信号序列。生物传感器还具有输出多个像素信号序列的通信端口。

生物传感器可以耦合到信号处理器。信号处理器可以配置为接收和处理多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别数量为N+M的簇中存在的核苷酸碱基。对于亮簇和暗簇，这可以包括将在采样事件的第一照明阶段期间由对应于像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，将在采样事件的第二照明阶段期间由传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合第一像素信号和第二像素信号的映射以识别亮簇和暗簇中存在的核苷酸碱基。

结合附图，根据以下详细描述，所公开的技术的其它特征和方面将变得显而易见，附图以示例的方式示出根据所公开的技术的实施方案的特征。此简要描述并不旨在限制本文描述的任何发明的范围。

附图说明

根据一个或多个实施方案，参考以下附图详细描述本公开。提供附图仅仅是为了说明的目的，并且仅仅描述了示例实施方案。此外，应当注意，为了清楚和便于说明，附图中的元件不一定按比例绘制。

本文包括的一些附图从不同的视角示出所公开的技术的各种实施方案。尽管所附的描述性文本可以将这些视图称为“顶视图”、“底视图”或“侧视图”，但是这些引用仅仅是描述性的，并不意味着或要求所公开的技术在特定的空间方向上实现或使用，除非明确地另外声明。

图1是根据一个实施方案的碱基识别系统的框图。

图2是可以在图1的系统中使用的系统控制器的框图。

图3示出可以在各种实施方案中使用的生物传感器的横截面。图3的生物传感器具有像素区域，每个像素区域在碱基识别循环期间可以容纳多于一个簇(例如，每个像素区域2个簇)。

图4示出可以在各种实施方案中使用的生物传感器的横截面。图4的生物传感器具有阱，每个阱在碱基识别循环期间可以容纳多于一个簇(例如，每个阱2个簇)。

图5A和图5B是描绘根据一个实施方案的使用由共享传感器(或像素)检测到的簇对的亮簇和暗簇的相应像素信号对亮簇和暗簇的碱基识别散点图。

图6是描绘根据一个实施方案的由来自簇对的亮簇和暗簇的强度值产生的十六个分布的散点图。

图7A是示出根据一个实施方案的一种染料和两种照明阶段测序方案的碱基识别方案的检测表。

图7B是示出根据一个实施方案的用于将来自簇对的亮簇和暗簇的组合像素信号分类到十六个区段中的一个中的分类方案的碱基识别表。

图8示出根据一个实施方案的通过分析由共享像素区域的多个簇发射的像素信号进行碱基识别的方法。

图9描绘根据一个实施方案的识别生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所识别的像素区域处碱基识别簇的方法。

图10示出根据一个实施方案的具有像素区域的样本表面的顶视平面图，其中像素区域上不均匀地分布有多个簇。

图11A示出根据一个实施方案的每个像素区域具有包括主阱和副阱的两个阱的样本表面的侧视图。

图11B描绘图11A的样本表面的顶视平面图。

图12A和图12B示出覆盖样本表面像素区域的阱的离轴照明。

图12C示出根据一个实施方案的由图12A和图12B的离轴照明产生的不对称照明的阱区域。

具体实施方式

本文描述的实施方案可以用于各种生物或化学过程和系统，用于学术或商业分析。更具体地，本文所描述的实施方案可以用于期望检测指示期望反应的事件、性质、质量或特性的各种过程和系统中。例如，本文描述的实施方案包括盒、生物传感器及其组件，以及用盒和生物传感器进行操作的生物测定系统。在特定实施方案中，盒和生物传感器包括以基本单一的结构耦合在一起的流动池和一个或多个传感器、像素、光检测器或光电二极管。

生物测定系统可以配置为执行多个期望的反应，这些反应可以单独地或共同地检测。生物传感器和生物测定系统可以配置为执行多个循环，其中多个期望的反应并行发生。例如，生物测定系统可以用于通过酶操作和数据采集的迭代循环对密集阵列的DNA特征进行测序。因此，盒和生物传感器可以包括将试剂或其它反应组分输送到反应位点的一个或多个微流体通道。在一些实施方案中，反应位点不均匀地分布在基本平面的表面上。在其它实施方案中，反应位点以预定方式在基本平面的表面上形成图案。反应位点中的每一个可以与检测来自相关联的反应位点的光的一个或多个传感器、像素、光检测器或光电二极管相关联。然而，在其它实施方案中，反应位点位于反应室(或阱)中，反应室(或阱)将期望的反应分隔开。

当结合附图阅读时，将更好地理解以下对特定实施方案的详细描述。就附图示出各种实施方案的功能块的图而言，功能块不一定表示硬件电路之间的划分。因此，例如，一个或多个功能块(例如，处理器或存储器)可以在单个硬件(例如，通用信号处理器或随机存取存储器、硬盘等)中实现。类似地，程序可以是独立的程序，可以作为子程序并入操作系统中，可以是安装的软件包中的功能等。应当理解，各种实施方案不限于附图中示出的布置和手段。

如本文所使用，以单数叙述并且以单词“一”或“一个”开头的元件或步骤应该理解为不排除多个所述元件或步骤，除非明确声明了这种排除。此外，对“一个实施方案”的引用并不旨在解释为排除也并入所叙述特征的附加实施方案的存在。此外，除非明确声明相反，否则实施方案“包括”或“具有”或“包括”具有特定性质的一个元素或多个元素可以包括附加元素，无论它们是否具有此性质。

如本文所使用，“期望的反应”包括感兴趣的分析物的化学、电学、物理或光学性质(或质量)中的至少一种的变化。在特定实施方案中，期望的反应是阳性结合事件(例如，将荧光标记的生物分子并入感兴趣的分析物)。更一般地，期望的反应可以是化学转化、化学变化或化学相互作用。期望的反应也可以是电性质的改变。例如，期望的反应可以是溶液中离子浓度的变化。示例性反应包括但不限于化学反应，例如还原、氧化、加成、消除、重排、酯化、酰胺化、醚化、环化或取代；其中第一种化学物质与第二种化学物质结合的结合相互作用；两种或多种化学物质相互分离的离解反应；荧光；发光；生物发光；化学发光；和生物反应，诸如核酸复制、核酸扩增、核酸杂交、核酸连接、磷酸化、酶催化、受体结合或配体结合。期望的反应也可以是添加或消除质子，例如，可以随着周围溶液或环境的pH变化来检测。附加的期望的反应可以是检测离子流过膜(例如，天然或合成双层膜)，例如在离子流过膜时，电流中断，并且中断可以检测到。

在特定的实施方案中，期望的反应包括将荧光标记的分子并入到分析物中。分析物可以是寡核苷酸，并且荧光标记的分子可以是核苷酸。当将激发光被朝向具有标记核苷酸的寡核苷酸引导，并且荧光团发射可检测的荧光信号时，可以检测到期望的反应。在替代实施方案中，检测到的荧光是化学发光或生物发光的结果。期望的反应还可以例如通过使供体荧光团靠近受体荧光团来增加荧光(或

)共振能量转移(FRET)，通过分离供体荧光团和受体荧光团来减少FRET，通过从荧光团中分离淬灭剂来增加荧光，或者通过淬灭剂和荧光团共同定位来减少荧光。

如本文所使用，“反应组分”或“反应物”包括可用于获得期望的反应的任何物质。例如，反应组分包括试剂、酶、样本、其它生物分子和缓冲溶液。反应组分通常被输送到溶液中的反应位点和/或固定在反应位点处。反应组分可以直接或间接地与诸如感兴趣的分析物的另一物质相互作用。

如本文所使用，术语“反应位点”是可能发生期望反应的局部区域。反应位点可以包括基质的支撑表面，物质可以固定在该支撑表面上。例如，反应位点可以包括位于流动池通道中的其上具有核酸群体的基本为平面的表面。通常，但不总是，群体中的核酸具有相同的序列，例如，单链或双链模板的克隆拷贝。然而，在一些实施方案中，反应位点可以仅包含单个核酸分子，例如单链或双链形式。此外，多个反应位点可以沿着支撑表面不均匀地分布或者以预定的方式排列(例如在矩阵中并排排列，诸如在微阵列中)。反应位点还可以包括反应室(或阱)，该反应室至少部分地限定了配置为分隔期望反应的空间区域或容积。

本申请交替使用术语“反应室”和“阱”。如本文所使用，术语“反应室”或“阱”包括与流动通道流体连通的空间区域。反应室可以至少部分地与周围环境或其它空间区域分离。例如，多个反应室可以通过共享的壁彼此分离。作为更具体的示例，反应室可以包括由阱的内表面限定的空腔，并且具有开口或孔，使得空腔可以与流动通道流体连通。包括这种反应室的生物传感器在2011年10月20日提交的国际申请第PCT/US2011/057111号中进行了更详细的描述，该申请通过引用全文并入本文。

在一些实施方案中，反应室的尺寸和形状是相对于固体(包括半固体)设计的，使得固体可以全部或部分地插入其中。例如，反应室的尺寸和形状设计为可以仅容纳一个捕获珠。捕获珠上可以有克隆扩增的DNA或其它物质。可替代地，反应室的尺寸和形状设计为可以容纳近似数量的珠或固体基质。作为另一示例，反应室也可以填充有配置为控制扩散或过滤可能流入反应室的流体的多孔凝胶或物质。

在一些实施方案中，传感器(例如，光检测器、光电二极管)与生物传感器的样本表面的相应像素区域相关联。因此，像素区域是代表一个传感器(或像素)的生物传感器的样本表面上的区域的几何构造。与像素区域相关联的传感器检测当在相关联的像素区域上方的反应位点或反应室发生期望的反应时从相关联的像素区域收集的光发射。在平坦表面实施方案中，像素区域可以重叠。在一些情况下，多个传感器可以与单个反应位点或单个反应室相关联。在其它情况下，单个传感器可以与一组反应位点或一组反应室相关联。

如本文所使用，“生物传感器”包括具有多个反应位点和/或反应室(或阱)的结构。生物传感器可以包括固态成像设备(例如，CCD或CMOS成像器)以及可选地安装在其上的流动池。流动池可以包括与反应位点和/或反应室流体连通的至少一个流动通道。作为一个具体示例，生物传感器配置为流体地和电地耦合到生物测定系统。生物测定系统可以根据预定方案(例如，边合成边测序)将反应物输送到反应位点和/或反应室，并且执行多个成像事件。例如，生物测定系统可以引导溶液沿着反应位点和/或反应室流动。至少一种溶液可以包括具有相同或不同荧光标记的四个类型的核苷酸。核苷酸可以结合位于反应位点和/或反应室处的相应寡核苷酸。生物测定系统然后可以使用激发光源(例如固态光源，诸如发光二极管或LED)照明反应位点和/或反应室。激发光可以具有预定的一个或多个波长，包括一个波长范围。激发的荧光标签提供可以由传感器捕获的发射信号。

在替代实施方案中，生物传感器可以包括配置为检测其它可识别性质的电极或其它类型的传感器。例如，传感器可以配置为检测离子浓度的变化。在另一示例中，传感器可以配置为检测流过膜的离子电流。

如本文所使用的，“盒”包括配置为保持生物传感器的结构。在一些实施方案中，盒可以包括附加特征，诸如光源(例如LED)，该光源配置为向生物传感器的反应位点和/或反应室提供激发光。盒还可以包括流体存储系统(例如，用于存储试剂、样本和缓冲液)和流体控制系统(例如，泵、阀等)，用于将反应组分、样本等流体运输到反应位点和/或反应室。例如，在制备或制造了生物传感器之后，可以将生物传感器耦合到盒的外壳或容器。在一些实施方案中，生物传感器和盒可以是自容式(self-contained)的一次性单元。然而，其它实施方案可以包括具有可移除零件的部件，这些零件允许用户进入生物传感器或盒的内部，用于维护或更换组件或样本。生物传感器和盒可以可移除地耦合或接合到较大的生物测定系统(诸如测序系统)，该较大的生物测定系统在盒内进行受控反应。

如本文所使用，当术语“可移除地”和“耦合的”(或“接合的”)一起用于描述生物传感器(或盒)与生物测定系统的系统容器或界面之间的关系时，该术语旨在表示生物传感器(或盒)与系统容器之间的连接是容易分离的，而不会破坏或损坏系统容器和/或生物传感器(或盒)。当组件可以彼此分离而不需要过多的努力或花费大量的时间来分离组件时，组件是容易分离的。例如，生物传感器(或盒)可以以电气方式可移除地耦合或接合到系统容器，使得生物测定系统的配合触点不会被破坏或损坏。生物传感器(或盒)也可以以机械方式可移除地联接或接合到系统容器，使得保持生物传感器(或盒)的特征不会受破坏或损坏。生物传感器(或盒)也可以以流体方式可移除地耦合或接合到系统容器，使得系统容器的端口不会受破坏或损坏。例如，如果仅需要对组件进行简单的调整(例如，重新对准)或简单的更换(例如，更换喷嘴)，则系统容器或组件不被视为破坏或损坏。

如本文所使用，“簇”是相似或相同分子或核苷酸序列或DNA链的群体。例如，簇可以是扩增的寡核苷酸或具有相同或相似序列的多核苷酸或多肽的任何其它组。在其它实施方案中，簇可以是占据样本表面上物理区域的任何元素或元素组。在实施方案中，在碱基识别循环期间，簇固定到反应位点和/或反应室。

如本文所使用，术语“固定的”在用于生物分子或生物或化学物质时，包括在分子水平上将生物分子或生物或化学物质基本附着到表面上。例如，可以使用吸附技术(包括非共价相互作用(例如静电力、范德华力和疏水界面脱水)和共价结合技术将生物分子或生物或化学物质固定到基质材料的表面，其中官能团或连接物有助于将生物分子附着到表面。将生物分子或生物或化学物质固定到基质材料的表面可以基于基质表面的性质、携带生物分子或生物或化学物质的液体介质以及生物分子或生物或化学物质本身的性质。在一些情况下，基质表面可以功能化(例如，化学或物理改性)，以便于将生物分子(或生物或化学物质)固定到基质表面。基质表面可以首先改性以使官能团结合到表面上。然后官能团可以结合生物分子或生物或化学物质，以将它们固定在其上。物质可以通过凝胶固定在表面上，例如，如美国专利公开第US 2011/0059865 A1号中所描述的，该专利公开通过引用并入本文。

在一些实施方案中，核酸可以附着于表面，并且使用桥扩增进行扩增。有用的桥扩增方法在例如美国专利第5,641,658号、WO 2007/010251、美国专利第6,090,592号、美国专利公开第2002/0055100 A1号、美国专利第7,115,400号、美国专利公开第2004/0096853 A1号、美国专利公开第2004/0002090 A1号、美国专利公开第2007/0128624 A1号以及美国专利公开第2008/0009420 A1号中进行了描述，其中的每一个都全文并入本文。用于在表面扩增核酸的另一种有用方法是滚环扩增(RCA)，例如，使用下面更详细阐述的方法。在一些实施方案中，核酸可以附着于表面，并且使用一对或多对引物进行扩增。例如，其中一个引物可以在溶液中，而另一个引物可以固定在表面上(例如，5’-附着)。举例来说，核酸分子可以与表面上的引物之一杂交，接下来延伸固定的引物以产生核酸的第一拷贝。然后，溶液中的引物与核酸的第一拷贝杂交，其可以使用核酸的第一拷贝作为模板进行延伸。可选地，在核酸的第一拷贝产生后，原始核酸分子可以与表面上的第二固定引物杂交，并且可以在溶液中的引物延伸的同时或之后延伸。在任何实施方案中，使用溶液中的固定引物和引物的重复轮延伸(例如扩增)提供了核酸的多个拷贝。

在特定实施方案中，由本文所描述的系统和方法执行的测定方案包括使用天然核苷酸以及还有配置为与天然核苷酸相互作用的酶。天然核苷酸包括例如核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。天然核苷酸可以是单磷酸、二磷酸或三磷酸形式，并且可以具有选自腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、尿嘧啶(U)、鸟嘌呤(G)或胞嘧啶(C)的碱基。然而，应当理解，可以使用非天然核苷酸、修饰的核苷酸或前述核苷酸的类似物。下面阐述了一些有用的非天然核苷酸的示例，关于通过合成方法进行可逆的基于终止子的测序。

在包括反应室的实施方案中，物品或固体物质(包括半固体物质)可以设置在反应室内。当设置时，物品或固体可以通过干涉配合、粘附或截留而物理地保持或固定在反应室内。可以设置在反应室内的示例性物品或固体包括聚合物珠、小球、琼脂糖凝胶、粉末、量子点或可被压缩和/或保持在反应室内的其它固体。在特定的实施方案中，例如通过附着到反应室的内表面或通过停留在反应室内的液体中，诸如DNA的核酸超结构可以设置在反应室中或反应室处。可以预先形成DNA球或其它核酸超结构，并且然后将其设置在反应室中或反应室处。可替代地，可以在反应室处原位合成DNA球。可以通过滚环扩增合成DNA球，以产生特定核酸序列的串联体，并且可以用形成相对紧密的球的条件处理该串联体。例如，美国专利公开第2008/0242560 A1号或第2008/0234136 A1号中描述了DNA球和其合成方法，这两个专利公开的每一个都全文并入本文。保持或设置在反应室内的物质可以是固态、液态或气态。

如本文所使用，“碱基识别”识别核酸序列中的核苷酸碱基。碱基识别是指在特定循环内为每个簇确定碱基识别(A、C、G、T)的过程。作为示例，可以利用美国专利申请公开号2013/0079232的并入材料中描述的四通道、两通道或一通道方法和系统来执行碱基识别。在特定实施方案中，碱基识别循环被称为“采样事件”在一种染料和双通道测序方案中，采样事件包括时间序列中的两个照明阶段，使得在每个阶段生成像素信号。第一照明阶段诱导来自指示AT像素信号中的核苷酸碱基A和T的给定簇的照明，并且第二照明阶段诱导来自指示CT像素信号中的核苷酸碱基C和T的给定簇的照明。

碱基识别系统

图1是根据一个实施方案的碱基识别系统100的框图。碱基识别系统100可以操作以获得与生物或化学物质中的至少一种相关的任何信息或数据。在一些实施方案中，碱基识别系统100是类似于台式设备或台式计算机的工作站。例如，用于进行期望反应的大部分(或全部)系统和组件可以位于公共外壳116内。

在特定实施方案中，碱基识别系统100是为各种应用配置的核酸测序系统(或测序仪)，包括但不限于从头测序、整个基因组或目标基因组区域的再测序以及宏基因组学。测序仪也可用于DNA或RNA分析。在一些实施方案中，碱基识别系统100还可以配置为在生物传感器中生成反应位点。例如，碱基识别系统100可以配置为接收样本并且生成源自样本的表面附着的克隆扩增核酸的簇。每个簇可以构成生物传感器中的反应位点或者是其一部分。

示例性碱基识别系统100可以包括系统容器或界面112，其配置为与生物传感器102交互，以在生物传感器102内执行期望的反应。在以下关于图1的描述中，生物传感器102被装载到系统容器112中。然而，应当理解，包括生物传感器102的盒可以插入系统容器112中，并且在一些状态下，盒可以被暂时或永久移除。如以上所描述，盒可以尤其包括流体控制和流体存储组件等。

在特定实施方案中，碱基识别系统100配置为在生物传感器102内执行大量并行反应。生物传感器102包括一个或多个可以发生期望反应的反应位点。反应位点可以例如固定在生物传感器的固体表面上，或者固定在位于生物传感器的相应反应室内的珠(或其它可移动的基质)上。反应位点可以包括例如克隆扩增的核酸的簇。生物传感器102可以包括固态成像设备(例如，CCD或CMOS成像器)和安装在其上的流动池。流动池可以包括从碱基识别系统100接收溶液并且将溶液朝向反应位点的一个或多个流动通道引导。可选地，生物传感器102可以配置为接合热元件，用于将热能传递到流动通道中或从流动通道中传递出去。

碱基识别系统100可以包括各种组件、部件和系统(或子系统)，它们相互作用以执行用于生物或化学分析的预定方法或测定方案。例如，碱基识别系统100包括系统控制器104，其可以与碱基识别系统100的各种组件、部件和子系统以及还有生物传感器102通信。例如，除了系统容器112之外，碱基识别系统100还可以包括：流体控制系统106，用于控制流体在碱基识别系统100和生物传感器102的流体网络中的流动；流体存储系统108，配置为保持生物测定系统可以使用的所有流体(例如，气体或液体)；温度控制系统110，可以调节流体网络、流体存储系统108和/或生物传感器102中的流体的温度；和照明系统109，配置为照明生物传感器102。如以上所描述，如果具有生物传感器102的盒装载到系统容器112中，则该盒还可以包括流体控制和流体存储组件。

还示出碱基识别系统100可以包括与用户交互的用户界面114。例如，用户界面114可以包括显示或请求来自用户的信息的显示器113以及接收用户输入的用户输入设备115。在一些实施方案中，显示器113和用户输入设备115是相同的设备。例如，用户界面114可以包括触敏显示器，其配置为检测个体的触摸的存在，并且还识别触摸在显示器上的位置。然而，可以使用其它用户输入设备115，诸如鼠标、触摸板、键盘、小键盘、手持扫描仪、语音识别系统、运动识别系统等。如下面将更详细讨论的，碱基识别系统100可以与各种组件通信，包括生物传感器102(例如，以盒的形式)，以执行期望的反应。碱基识别系统100还可以配置为分析从生物传感器获得的数据，以向用户提供期望的信息。

系统控制器104可以包括任何基于处理器或基于微处理器的系统，包括使用微控制器、精简指令集计算机(RISC)、专用集成电路(ASIC)、现场可编程门阵列(FPGA)、逻辑电路以及能够执行本文描述的功能的任何其它电路或处理器的系统。以上示例仅是示例性的，并且因此并不旨在以任何方式限制术语系统控制器的定义和/或含义。在示例性实施方案中，系统控制器104执行存储在一个或多个存储元件、存储器或模块中的一组指令，以便获得检测数据和分析检测数据中的至少一个。检测数据可以包括多个像素信号序列，使得来自数百万个传感器(或像素)中的每一个的像素信号序列可以在许多碱基识别循环中检测到。存储元件可以是碱基识别系统100内的信息源或物理存储元件的形式。

指令集可以包括各种命令，这些命令指示碱基识别系统100或生物传感器102执行特定操作，例如本文描述的各种实施方案的方法和过程。指令集可以是软件程序的形式，其可以形成有形的、非暂时性的计算机可读介质的一部分。如本文所使用的，术语“软件”和“固件”是可互换的，并且包括存储在存储器中由计算机执行的任何计算机程序，包括RAM存储器、ROM存储器、EPROM存储器、EEPROM存储器和非易失性RAM(NVRAM)存储器。以上存储器类型仅是示例性的，并且因此不限制可用于存储计算机程序的存储器的类型。

软件可以是各种形式，诸如系统软件或应用软件。进一步，软件可以是单独的程序的集合的形式，或者是较大程序中的程序模块或程序模块的一部分的形式。该软件还可以包括面向对象编程形式的模块化编程。在获得检测数据之后，检测数据可以由碱基识别系统100自动处理，响应于用户输入而处理，或者响应于另一处理机做出的请求(例如，通过通信链路的远程请求)而处理。在示出的实施方案中，系统控制器104包括信号处理器138。在其它实施方案中，系统控制器104不包括信号处理器138，而是可以访问信号处理器138(例如，信号处理器138可以单独地托管在云上)。

系统控制器104可以通过通信链路连接到生物传感器102和碱基识别系统100的其它组件。系统控制器104也可以通信连接到场外系统或服务器。通信链路可以是硬连线的、有线的或无线的。系统控制器104可以从用户界面114和用户输入设备115接收用户输入或命令。

流体控制系统106包括流体网络，并且配置为引导和调节一种或多种流体通过流体网络的流动。流体网络可以与生物传感器102和流体存储系统108流体连通。例如，选择的流体可以从流体存储系统108中抽取并且以受控的方式引导至生物传感器102，或者流体可以从生物传感器102中抽取并且引导至例如流体存储系统108中的废物储存器。尽管未示出，流体控制系统106可以包括检测流体网络内流体的流速或压力的流量传感器。传感器可以与系统控制器104通信。

温度控制系统110配置为调节流体网络、流体存储系统108和/或生物传感器102的不同区域处的流体的温度。例如，温度控制系统110可以包括热循环器，该热循环器与生物传感器102对接，并且控制沿着生物传感器102中的反应位点流动的流体的温度。温度控制系统110还可以调节碱基识别系统100或生物传感器102的固体元件或组件的温度。尽管未示出，温度控制系统110可以包括传感器，以检测流体或其它组件的温度。传感器可以与系统控制器104通信。

流体存储系统108与生物传感器102流体连通，并且可以存储用于在其中进行期望反应的各种反应组分或反应物。流体存储系统108还可以存储用于清洗或清洁流体网络和生物传感器102以及用于稀释反应物的流体。例如，流体储存系统108可以包括各种储存器，以储存样本、试剂、酶、其它生物分子、缓冲溶液、水溶液和非极性溶液等。此外，流体存储系统108还可以包括废物储存器，用于接收来自生物传感器102的废物产品。在包括盒的实施方案中，盒可以包括流体存储系统、流体控制系统或温度控制系统中的一个或多个。因此，本文阐述的与那些系统相关的一个或多个组件可以包含在盒外壳内。例如，盒可以具有各种储存器，以储存样本、试剂、酶、其它生物分子、缓冲溶液、水溶液和非极性溶液、废物等。这样，流体存储系统、流体控制系统或温度控制系统中的一个或多个可以通过盒或其它生物传感器与生物测定系统可移除地接合。

照明系统109可以包括光源(例如，一个或多个LED)和多个光学组件来照明生物传感器。光源的示例可以包括激光器、弧光灯、LED或激光二极管。光学组件可以是例如反射器、二向色器、分束器、准直器、透镜、滤光器、楔形物、棱镜、反射镜、检测器等。在使用照明系统的实施方案中，照明系统109可以配置为将激发光朝向反应位点引导。作为一个示例，荧光团可以被绿色波长的光激发，因此激发光的波长可以是大约532nm。在一个实施方案中，照明系统109配置为产生平行于生物传感器102表面的表面法线的照明。在另一实施方案中，照明系统109配置为产生相对于生物传感器102表面的表面法线偏角的照明。在又一实施方案中，照明系统109配置为产生具有多个角度的照明，包括一些平行照明和一些偏角照明。

系统容器或界面112配置为以机械、电气和流体方式中的至少一种方式接合生物传感器102。系统容器112可以将生物传感器102保持在期望的方向，以便于流体流过生物传感器102。系统容器112还可以包括电触点，该电触点配置为接合生物传感器102，使得碱基识别系统100可以与生物传感器102通信和/或向生物传感器102供电。此外，系统容器112可以包括配置为与生物传感器102的流体端口(例如喷嘴)接合。在一些实施方案中，生物传感器102以机械方式、电气方式以及流体方式可移除地耦合到系统容器112。

另外，碱基识别系统100可以与其它系统或网络或其它生物测定系统100远程通信。由生物测定系统100获得的检测数据可以存储在远程数据库中。

图2是可以在图1的系统中使用的系统控制器104的框图。在一个实施方案中，系统控制器104包括可以相互通信的一个或多个处理器或模块。每个处理器或模块可以包括执行特定过程的算法(例如，存储在有形和/或非暂时性计算机可读存储介质上的指令)或子算法。系统控制器104在概念上示出为模块的集合，但是可以利用专用硬件板、DSP、处理器等的任何组合来实现。可替代地，系统控制器104可以利用具有单个处理器或多个处理器的现成的PC来实现，功能操作分布在处理器之间。作为进一步的选择，下面描述的模块可以利用混合配置来实现，其中某些模块功能利用专用硬件来执行，而剩余的模块功能利用现成的PC等来执行。这些模块也可以实现为处理单元内的软件模块。

在操作期间，通信端口120可以向生物传感器102(图1)和/或子系统106、108、110(图1)发送信息(例如命令)或从其接收信息(例如数据)。在实施方案中，通信端口120可以输出多个像素信号序列。通信链路122可以从用户界面114(图1)接收用户输入，并且将数据或信息传输到用户界面114。来自生物传感器102或子系统106、108、110的数据可以由系统控制器104在生物测定会话期间实时处理。附加地或可替代地，数据可以在生物测定会话期间临时存储在系统存储器中，并且以比实时或离线操作慢的速度处理。

如图2中所示，系统控制器104可以包括与主控制模块130通信的多个模块131-139。主控制模块130可以与用户界面114(图1)通信。尽管模块131-139示出为直接与主控制模块130通信，但是模块131-139也可以彼此、与用户界面114和生物传感器102直接通信。此外，模块131-139可以通过其它模块与主控制模块130通信。

多个模块131-139包括分别与子系统106、108、110和111通信的系统模块131-133、139。流体控制模块131可以与流体控制系统106通信，以控制流体网络的阀和流量传感器，用于控制通过流体网络的一种或多种流体的流量。流体储存模块132可以在流体低或废物储存器达到或接近容量时通知用户。流体存储模块132也可以与温度控制模块133通信，使得流体可以存储在期望的温度下。照明模块139可以与照明系统109通信，以在方案期间的指定时间(诸如在期望的反应(例如，结合事件)已经发生之后)照明反应位点。在一些实施方案中，照明模块139可以与照明系统109通信，以指定的角度照明反应位点。

多个模块131-139还可以包括与生物传感器102通信的设备模块134和确定与生物传感器102相关的识别信息的识别模块135。设备模块134可以例如与系统容器112通信，以确认生物传感器已经与碱基识别系统100建立了电和流体连接。识别模块135可以接收识别生物传感器102的信号。识别模块135可以使用生物传感器102的身份来向用户提供其它信息。例如，识别模块135可以确定并且随后显示批号、制造日期或推荐与生物传感器102一起运行的方案。

多个模块131-139还可以包括接收和分析来自生物传感器102的信号数据(例如，图像数据)的信号处理模块或信号处理器138。信号处理器138包括存储检测数据的存储器140(例如RAM或闪存)。检测数据可以包括多个像素信号序列，使得可以在许多碱基识别循环中检测到来自数百万个传感器(或像素)中的每一个的像素信号序列。信号数据可以存储用于随后的分析，或者可以传输到用户界面114以向用户显示期望的信息。在一些实施方案中，信号数据可以在信号处理器138接收信号数据之前由固态成像器(例如，CMOS图像传感器)处理。

方案模块136和137与主控制模块130通信，以在进行预定的测定方案时控制子系统106、108和110的操作。方案模块136和137可以包括用于指示碱基识别系统100按照预定方案执行特定操作的指令集。如所示，方案模块可以是边合成边测序(SBS)模块136，其配置为发出用于执行边合成边测序过程的各种命令。在SBS中，监测核酸引物沿核酸模板的延伸，以确定模板中核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合(例如由聚合酶催化)或连接(例如由连接酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，荧光标记的核苷酸以模板依赖的方式添加到引物中(从而延伸引物)，使得添加到引物中的核苷酸的顺序和类型的检测可以用于确定模板的序列。例如，为了启动第一SBS循环，可以给出命令以输送一个或多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等进入/通过容纳核酸模板阵列的流动池。核酸模板可以位于相应的反应位点。引物延伸导致标记的核苷酸并入的那些反应位点可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统109可以向反应位点提供激发光。可选地，核苷酸可以还包括可逆终止性质：一旦核苷酸添加到引物中，终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子基团的核苷酸类似物添加到引物中，使得在输送去封闭试剂以去除该基团之前，不会发生后续延伸。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可以给出命令以将解封闭试剂输送到流动池(在检测发生之前或之后)。可以给出一个或多个命令以在不同的输送步骤之间进行清洗。然后可以重复该循环n次，以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。示例性测序技术例如在Bentley等人的Nature 456:53-59(2008)、WO 2004/018497、US 7,057,026、WO 91/06678、WO 2007/123744、US 7,329,492、US 7,211,414、US 7,315,019、US 7,405,281和US 2008/0108082中进行了描述，其中每一个都通过引用并入本文。

对于SBS循环的核苷酸输送步骤，可以一次输送单个类型的核苷酸，也可以输送多种不同的核苷酸类型(例如，A、C、T和G一起)。对于一次仅存在单个类型的核苷酸的核苷酸输送构型，不同的核苷酸不需要具有不同的标记，因为它们可以基于个体化输送中固有的时间分离来区分。因此，测序方法或装置可以使用单色检测。例如，激发源只需要在单个波长或单个波长范围内提供激发。对于其中输送导致流动池中同时存在多个不同核苷酸的核苷酸输送构型，可以基于附着于混合物中相应核苷酸类型的不同荧光标记来区分并入不同核苷酸类型的位点。例如，可以使用四种不同的核苷酸，每种都具有四种不同荧光团中的一种。在一个实施方案中，可以使用光谱的四个不同区域中的激发来区分四种不同的荧光团。例如，可以使用四种不同的激发辐射源。可替代地，可以使用少于四种不同的激发源，但是来自单个源的激发辐射的光学滤波可以用于在流动池产生不同范围的激发辐射。

在一些实施方案中，在具有四种不同核苷酸的混合物中可以检测到少于四种不同的颜色。例如，核苷酸对可以在相同的波长下检测，但是基于该对中一个成员与另一个成员的强度差异来进行区分，或者基于对该对中一个成员的改变(例如，通过化学修饰、光化学修饰或物理修饰)来区分，与针对该对中另一个成员检测到的信号相比，该改变导致明显的信号出现或消失。例如在美国专利申请(序列号为61/538,294和61/619,878)中描述了使用少于四种颜色的检测来区分四种不同核苷酸的示例性装置和方法，这些美国申请通过引用全文并入本文。2012年9月21日提交的第13/624,200号美国申请与本文相关，并且也通过引用全文并入本文。

多个方案模块还可以包括样本制备(或生成)模块137，其配置为向流体控制系统106和温度控制系统110发出命令，用于扩增生物传感器102内的产品。例如，生物传感器102可以与碱基识别系统100接合。扩增模块137可以向流体控制系统106发出指令，以将必要的扩增成分输送到生物传感器102内的反应室。在其它实施方案中，反应位点可能已经包含一些用于扩增的组分，诸如模板DNA和/或引物。在将扩增组分输送到反应室之后，扩增模块137可以指示温度控制系统110根据已知的扩增方案循环通过不同的温度阶段。在一些实施方案中，扩增和/或核苷酸并入等温进行。

SBS模块136可以发出命令以执行桥PCR，其中克隆扩增子簇形成在流动池通道内的局部区域上。在通过桥PCR生成扩增子后，扩增子可以被“线性化”以产生单链模板DNA(或sstDNA)，并且测序引物可以与位于感兴趣区域两侧的通用序列杂交。例如，如以上或如以下所阐述，可以使用通过合成方法的基于可逆终止子的测序。

每个碱基识别或测序循环可以通过单个碱基来延长sstDNA，这可以通过例如使用修饰的DNA聚合酶和四种核苷酸的混合物来完成。不同类型的核苷酸可以具有独特的荧光标记，并且每个核苷酸可以进一步具有可逆终止子，该终止子仅允许在每个循环中发生单碱基并入。在单个碱基添加到sstDNA后，激发光可以入射到反应位点上，并且可以检测到荧光发射。检测后，荧光标记和终止子可以从sstDNA上化学裂解。接下来可能会有另一类似的碱基识别或测序循环。在这样的测序方案中，SBS模块136可以指示流体控制系统106引导试剂和酶溶液流通通过生物传感器102。美国专利申请公开第2007/0166705 A1号、美国专利申请公开第2006/0188901 A1号、美国专利第7,057,026号、美国专利申请公开第2006/0240439 A1号、美国专利申请公开第2006/0281109 A1号、PCT申请第WO 2005/065814号、美国专利公开第2005/0100900 A1号、PCT申请第WO 2006/064199号和PCT申请第WO 2007/010251号中描述了可以与本文所阐述的装置和方法一起使用的示例性的基于可逆终止子的SBS方法，这些专利申请通过引用全文并入本文。US 7,541,444、US 7,057,026、US 7,414,116、US 7,427,673、US 7,566,537、US 7,592,435和WO 2007/135368中描述了基于可逆终止子的SBS的示例性试剂，这些申请中的每一个都通过引用全文并入本文。

在一些实施方案中，扩增模块和SBS模块可以在单个测定方案中操作，其中例如模板核酸在同一盒中扩增并且随后测序。

碱基识别系统100还可以允许用户重新配置测定方案。例如，碱基识别系统100可以通过用户界面114向用户提供用于修改所确定的方案的选项。例如，如果确定生物传感器102将用于扩增，则碱基识别系统100可以请求退火循环的温度。此外，如果用户已经提供了对于所选择的测定方案通常不可接受的用户输入，碱基识别系统100可以向用户发出警告。

在实施方案中，生物传感器102包括数百万个传感器(或像素)，其中每个都在连续的碱基识别循环内生成多个像素信号序列。信号处理器130检测多个像素信号序列，并且根据传感器阵列上传感器的逐行方向和/或逐列方向的位置将它们赋予相应的传感器(或像素)。

生物传感器

图3示出可以在各种实施方案中使用的生物传感器300的横截面。生物传感器300具有像素区域306’、308’、310’、312’和314’，每个像素区域可以在碱基识别循环期间容纳多于一个簇(例如，每个像素区域2个簇)。生物传感器300可以具有与以上描述的生物传感器102(图1)相似的特征，并且可以用于例如盒中。如所示，生物传感器300可以包括安装在采样设备304上的流动池302。在示出的实施方案中，流动池302直接固定在采样设备304上。然而，在替代实施方案中，流动池302可以可移除地耦合到采样设备304。采样设备304具有样本表面334，该样本表面可以功能化(例如，以合适的方式进行化学或物理地改性以进行期望的反应)。例如，样本表面334可以被功能化，并且可以包括多个像素区域306’、308’、310’、312’和314’，每个像素区域可以在碱基识别循环期间保持多于一个簇(例如，每个像素区域具有固定到其上的相应簇对306AB、308AB、310AB、312AB和314AB)。每个像素区域与相应的传感器(或像素或光电二极管)306、308、310、312和314相关联，使得由像素区域接收的光由相应的传感器捕获。像素区域306’也可以与保持簇对的样本表面334上的相应反应位点306”相关联，使得从反应位点306”发射的光由像素区域306’接收并且由相应的传感器306捕获。作为这种感测结构的结果，在碱基识别循环期间，在特定传感器的像素区域中存在两个或更多个簇的情况下(例如，每个簇具有相应的簇对)，此碱基识别循环期间的像素信号携带基于所有两个或更多个簇的信息。结果，本文所描述的信号处理用于区分每个簇，其中在特定碱基识别循环的给定采样事件中，存在比像素信号更多的簇。

在示出的实施方案中，流动池302包括侧壁338、340和由侧壁338、340支撑的流动盖336。侧壁338、340耦合到样本表面334，并且在流动盖336与侧壁338、340之间延伸。在一些实施方案中，侧壁338、340由将流动盖336结合到采样设备304的可固化粘合剂层形成。

侧壁338、340的尺寸和形状设计为使得流动通道344存在于流动盖336与采样设备304之间。如所示，流动通道344可以包括由侧壁338、340确定的高度H₁。高度H₁可以在约50-400μm(微米)之间，或者更具体地，约80-200μm。在示出的实施方案中，高度H₁约为100μm。流动盖336可以包括对从生物传感器300的外部传播到流动通道344中的激发光301透明的材料。如图3中所示，激发光301以非正交角度接近流动盖336。然而，这仅仅是为了说明的目的，因为激发光301可以从不同的角度接近流动盖336。

还示出，流动盖336可以包括入口342和出口346，它们配置为流体接合其它端口(未示出)。例如，其它端口可能来自盒或工作站。流动通道344的尺寸和形状设计为沿着样本表面334引导流体。流动通道344的高度H₁和其它尺寸可以配置为维持流体沿着样本表面334基本均匀地流动。流动通道344的尺寸也可以配置为控制气泡的形成。

如图3中所示，侧壁338、340和流动盖336是彼此耦合的单独的组件。在替代实施方案中，侧壁338、340和流动盖336可以一体形成，使得侧壁338、340和流动盖336由连续的材料片形成。举例来说，流动盖336(或流动池302)可以包括透明材料，诸如玻璃或塑料。流动盖336可以构成大致矩形的块，该块具有平面的外表面和限定流动通道344的平面的内表面。该块可以安装在侧壁338、340上。可替代地，流动池302可以蚀刻以限定流动盖336和侧壁338、340。例如，可以在透明材料中蚀刻凹陷。当将蚀刻的材料安装到采样设备304上时，凹陷可以成为流动通道344。

采样设备304可以类似于例如包括多个堆叠的衬底层320-326的集成电路。衬底层320-326可以包括衬底320、固态成像器322(例如，CMOS图像传感器)、滤光器或光管理层324以及钝化层326。应当注意，以上仅是说明性的，并且其它实施方案可以包括更少或附加的层。此外，衬底层320-326中的每一个可以包括多个子层。如下面将更详细描述的，采样设备304可以使用与制造集成电路(诸如CMOS图像传感器和CCD)中使用的工艺类似的工艺来制造。例如，衬底层320-326或其部分可以生长、沉积、蚀刻等以形成采样设备304。

钝化层326配置为保护滤光层324免受流动通道344的流体环境的影响。在一些情况下，钝化层326还配置为提供固体表面(即，样本表面334)，其允许生物分子或其它感兴趣的分析物固定在其上。例如，反应位点中的每一个可以包括固定到样本表面334的生物分子簇。因此，钝化层326可以由允许反应位点固定于其上的材料形成。钝化层326还可以包括至少对期望的荧光透明的材料。举例来说，钝化层326可以包括氮化硅(Si₃N₄)和/或二氧化硅(SiO₂)。然而，也可以使用其它合适的材料。在示出的实施方案中，钝化层326可以基本上是平面的。然而，在替代实施方案中，钝化层326可以包括凹陷，诸如凹坑、阱、凹槽等。在示出的实施方案中，钝化层326具有约150-200nm的厚度，并且更具体地，约170nm。

滤光层324可以包括影响光的透射的各种特征。在一些实施方案中，滤光层324可以执行多种功能。例如，滤光层324可以配置为(a)滤除不想要的光信号，诸如来自激发光源的光信号；(b)将来自反应位点的发射信号朝向相应的传感器306、308、310、312和314引导，这些传感器配置为检测来自反应位点的发射信号；或者(c)阻止或防止检测来自相邻反应位点的不想要的发射信号。这样，滤光层324也可以称为光管理层。在示出实施方案中，滤光层324具有约为1-5μm的厚度，并且更具体地，约3-4μm。在替代实施方案中，滤光层324可以包括微透镜阵列或其它光学组件。微透镜中的每一个可以配置为将发射信号从相关联的反应位点引导到传感器。

在一些实施方案中，固态成像器322和衬底320可以一起作为先前构造的固态成像设备(例如，CMO芯片)提供。例如，基础衬底320可以是硅晶片，并且固态成像器322可以安装在其上。固态成像器322包括半导体材料层(例如硅)和传感器306、308、310、312和314。在示出的实施方案中，传感器是配置为检测光的光电二极管。在其它实施方案中，传感器包括光检测器。固态成像器322可以通过基于CMOS的制造工艺制造为单个芯片。

固态成像器322可以包括配置为从流动通道344内部或沿着该流动通道检测指示期望反应的活动的传感器306、308、310、312和314的密集阵列。在一些实施方案中，每个传感器具有约1-3平方微米(μm²)的像素面积(或检测面积)。该阵列可以包括50万个传感器、5百万个传感器、1千万个传感器，或者甚至1.3亿个传感器。传感器306、308、310、312和314可以配置为检测指示期望反应的预定波长的光。

在一些实施方案中，采样设备304包括微电路布置，诸如美国专利第7,595,883号中描述的微电路布置，该专利通过引用全文并入本文。更具体地，采样设备304可以包括具有传感器306、308、310、312和314的平面阵列的集成电路。传感器306、308、310、312和314的阵列可以通信地耦合到行解码器和列扩增器或解码器。列扩增器也可以通信地耦合到列模数转换器(列ADC/Mux)。其它电路可以耦合到以上组件，包括数字信号处理器和存储器。采样设备304内形成的电路可以配置用于信号扩增、数字化、存储和处理中的至少一个。该电路可以收集和分析检测到的荧光，并且生成像素信号(或检测信号)，用于将检测数据传送给信号处理器138。该电路还可以在采样设备304中执行附加的模拟和/或数字信号处理。采样设备304可以包括执行信号路由(例如，将像素信号传输到信号处理器138)的导电通孔330。像素信号也可以通过采样设备304的电触点332传输。

然而，采样设备304不限于以上结构或用途。在替代实施方案中，采样设备304可以采取其它形式。例如，采样设备304可以包括耦合到流动池或者移动到与其中具有反应位点的流动池界面的CCD设备，诸如CCD照相机。在其它实施方案中，采样设备304可以是CMOS制造的传感器，包括化学敏感场效应晶体管(chemFET)、离子敏感场效应晶体管(ISFET)和/或金属氧化物半导体场效应晶体管(MOSFET)。这样的实施方案可以包括场效应晶体管(FET)阵列，其可以配置为检测反应室内的电性质的变化。例如，FET可以检测各种分析物的存在和浓度的变化中的至少一种。举例来说，FET阵列可以监测氢离子浓度的变化。美国专利申请公开第2009/0127589号中更详细地描述了这种采样设备，该专利申请通过引用全文并入本文，用于理解这种FET阵列。

图4示出可以在各种实施方案中使用的生物传感器400的横截面。生物传感器400具有阱406、408、410、412和414，每个阱可以在碱基识别循环期间容纳多于一个簇(例如，每个阱2个簇)。如图3中所示，样本表面334可以基本为平面。然而，在替代实施方案中，样本表面334可以成形为限定阱(或反应室)，其中每个阱具有一个或多个反应位点。阱可以由例如有效地将一个阱的反应位点与相邻阱的反应位点分开的阱壁来限定。

如图4中所示，阱406、408、410、412和414可以沿着样本表面334以图案分布。例如，阱406、408、410、412和414可以以类似于微阵列的方式沿着样本表面334以行和列定位。然而，应当理解，可以使用阱406、408、410、412和414的各种模式。在特定实施方案中，阱406、408、410、412和414中的每一个包括固定在样本表面334上的多于一个簇的生物分子(例如寡核苷酸)。例如，阱406保持簇对306AB，阱408保持簇对308AB，阱410保持簇对310AB，阱412保持簇对312AB，以及阱414保持簇对314AB。

传感器配置为检测从阱内发射的光信号。在特定实施方案中，像素区域306’、308’、310’、312’和314’也可以与样本表面334上的相应阱406、408、410、412和414相关联，使得从阱406、408、410、412和414发射的光由相关联的像素区域306’、308’、310’、312’和314’接收并且由相应的传感器306、308、310、312和314捕获。

在实施方案中，样本表面334相对于采样设备304具有固定位置，使得阱406、408、410、412和414相对于至少一个预定传感器(或像素)具有已知的空间位置。该至少一个预定传感器检测来自覆盖阱的期望反应的活动。这样，阱406、408、410、412和414可以被分配给传感器306、308、310、312和314中的至少一个。为此，采样设备304的电路可以包括内核，该内核自动将由预定传感器306、308、310、312和314提供的像素信号(或检测信号)与分配的阱406、408、410、412和414相关联。举例来说，当像素信号由图4中示出的传感器306生成时，像素信号将自动与图4中示出的阱406相关联。这种配置可以便于处理和分析检测数据。例如，基于逐行和/或逐列解码，来自一个阱的像素信号可以自动位于阵列上的某个位置处。

在一些实施方案中，传感器(或像素)位于簇之下或下面。在其它实施方案中，传感器(或像素)覆盖簇或在簇的顶部。在又一些实施方案中，传感器(或像素)在簇的一侧(例如，在右侧和/或左侧)。

每个传感器(或像素)多个簇碱基识别

在实施方案中，所公开的技术通过使用来自比碱基识别循环中识别的多个簇碱基更少的传感器(或像素)的像素信号来增加生物传感器300的通量。在特定实施方案中，如果生物传感器300具有N个有源传感器，则所公开的技术使用来自N个有源传感器的像素信号来碱基识别N+M个簇，其中M是正整数。在实施方案中，如下面所描述的，这通过碱基识别每个传感器(或像素)多个簇来实现。

在实施方案中，样本表面334上的传感器(或像素)配置为接收来自至少两个簇的光发射。在一些实施方案中，传感器同时接收来自至少两个簇的光发射。

在特定实施方案中，两个簇的相应的光发射强度显著不同，使得两个簇中的一个是“亮”簇，并且另一个是“暗”簇。在实施方案中，强度值在碱基识别循环之间变化，并且因此亮和暗的分类也可以在循环之间变化。在其它实施方案中，亮簇称为“主要”或“主”簇，暗簇称为“次要”或“副”簇。亮簇和暗簇之间发射的强度值比率的一些示例包括0.55：0.45、0.60：0.40、0.65：0.35、0.70：0.30、0.75：0.25、0.80：0.20、0.85：0.15、0.90：0.10和0.95：0.05。

在又一些实施方案中，至少两个簇不是亮簇和暗簇，而是具有不同强度的簇或生成不同类型的信号的簇。

在每个采样事件期间(例如，每个照明阶段或每个图像采集阶段)，信号处理器138接收用于至少两个簇(例如，亮簇和暗簇)的公共的单个像素信号。在每个采样事件中生成的公共的单个像素包括/代表/反射/携带用于或来自至少两个簇(例如，亮簇和暗簇)的光发射/强度信号/捕获的光/感测信息。换句话说，至少两个簇(例如亮簇和暗簇)有助于在每个采样事件中生成公共的单个像素。因此，在每个采样事件中同时检测来自至少两个簇(例如，亮簇和暗簇)的光发射，并且公共的单个像素反射来自至少两个簇(例如，亮簇和暗簇)的光发射。

例如，在图3和图4中，簇对306AB包括共享传感器306的两个簇306A和306B。这样，簇306A可以是暗簇，簇306B可以是亮簇，这取决于它们相应的强度值。如下面所描述，然后信号处理器138使用碱基识别算法将来自亮簇和暗簇的像素信号分类成十六个分布中的一个。在特定实施方案中，亮簇和暗簇共同占据阱，诸如阱406。因此，可以基于共享像素区域或共享阱、或两者来限定簇配对。

图5A和图5B是描绘根据一个实施方案的使用由共享传感器检测的亮簇和暗簇的相应像素信号对亮簇和暗簇的碱基识别的散点图500A和500B。散点图500A和500B的X轴代表在采样事件的第二照明阶段期间检测到的AT像素信号，该第二照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基A和T的给定簇的照明。散点图500A和500B的Y轴代表在采样事件的第一照明阶段期间检测到的CT像素信号，该第一照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基C和T的给定簇的照明。

散点图500A示出四种分布502、504、506和508，信号处理器138将来自亮簇的像素信号分类到这四种分布。在示出的实施方案中，分布502代表亮簇中的核苷酸碱基C，分布504代表亮簇中的核苷酸碱基T，分布506代表亮簇中的核苷酸碱基G，并且分布508代表亮簇中的核苷酸碱基A。

散点图500B示出十六个子分布(或分布)502A-D、504A-D、506A-D和508A-D，其中散点图500A的四个分布502、504、506和508中的每一个都具有四个子分布)，信号处理器138将来自暗簇的像素信号分类到这些子分布。在示出的实施方案中，用字母“A”标注的子分布代表暗簇中的核苷酸碱基C，用字母“B”标注的子分布代表暗簇中的核苷酸碱基T，用字母“C”标注的子分布代表暗簇中的核苷酸碱基G，以及用字母“D”标注的子分布代表暗簇中的核苷酸碱基A。在其它实施方案中，可以使用碱基的不同编码。当信号处理器将来自暗簇的像素信号分类为十六个子分布中的一个时，相应亮簇的分类由包括暗簇的子分布的分布确定。例如，如果一个暗簇被分类为子分布508B(核苷酸碱基T)，则相应亮簇的分布是508(核苷酸碱基A)。结果，信号处理器138将亮簇碱基识别为A并且将暗簇碱基识别为T。

图6是描绘根据一个实施方案的由来自簇对的亮簇和暗簇的强度值产生的十六个分布(或区段)的散点图600。在实施方案中，在多个碱基识别循环中产生十六个区段。信号处理器138组合来自亮和暗簇的像素信号，并且将它们映射到十六个区段中的一个。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段612时，信号处理器138碱基识别亮簇为C以及暗簇为C。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段614时，信号处理器138碱基识别亮簇为C以及暗簇为T。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段616时，信号处理器138碱基识别亮簇为C以及暗簇为G。当组合的像素信号映射到基识别循环的区段618时，信号处理器138碱基识别亮簇为C以及暗簇为A。

当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段622时，信号处理器138碱基识别亮簇为T以及暗簇为C。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段624时，信号处理器138碱基识别亮簇为T以及暗簇为T。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段626时，信号处理器138碱基识别亮簇为T以及暗簇为G。当组合的像素信号映射到基识别循环的区段628时，信号处理器138碱基识别亮簇为T以及暗簇为A。

当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段632时，信号处理器138碱基识别亮簇为G以及暗簇为C。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段634时，信号处理器138碱基识别亮簇为G以及暗簇为T。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段636时，信号处理器138碱基识别亮簇为G以及暗簇为G。当组合的像素信号映射到基识别循环的区段638时，信号处理器138碱基识别亮簇为G以及暗簇为A。

当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段642时，信号处理器138碱基识别亮簇为A以及暗簇为C。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段644时，信号处理器138碱基识别亮簇为A以及暗簇为T。当组合像素信号映射到碱基识别循环的区段646时，信号处理器138碱基识别亮簇为A以及暗簇为G。当组合的像素信号映射到基识别循环的区段648时，信号处理器138碱基识别亮簇为A以及暗簇为A。

图7A是示出根据一个实施方案的一种染料和两种照明阶段测序方案的碱基识别计划的检测表700A。使用一种荧光染料(或两种或多种具有相同或相似激发/发射光谱的染料)在测序反应中检测核苷酸并入的不同策略之间进行区分的一种途径是，根据测序循环期间发生的荧光转变的存在或相对不存在，或两者之间的水平来表征并入。因此，测序策略可以通过其对于测序循环的荧光图谱来举例说明。对于本文公开的策略，“1”和“0”表示荧光状态，其中核苷酸处于信号状态(例如，可通过荧光检测)，或者核苷酸是否处于黑暗状态(例如，在成像步骤中未检测到或最低限度地检测到)。“0”状态不一定指信号完全缺失或不存在。最低限度的或减弱的荧光信号(例如背景信号)也被认为包括在“0”状态的范围内，只要能够可靠地区分从第一照明事件到第二照明事件(反之亦然)的荧光变化便可。在一个实施方案中，使用一种荧光染料(或两种具有相同或相似激发/发射光谱的染料)和两个照明事件来检测和确定测序反应中核苷酸并入的示例性策略由检测表700A举例说明。

在示出的实施方案中，在第一照明阶段(AT信号)，核苷酸碱基A标记或开启(由位1描绘)，核苷酸碱基C未标记或关闭(由位0描绘)，核苷酸碱基G未标记或关闭(由位0描绘)，并且核苷酸碱基T标记或开启(由位1描绘)。在第二照明阶段(CT信号)，核苷酸碱基A未标记或关闭(由位0描绘)，核苷酸碱基C标记或打开(由位1描绘)，核苷酸碱基G未标记或关闭(由位0描绘)，并且核苷酸碱基T标记或打开(由位1描绘)。

图7B是示出根据一个实施方案的用于将组合像素信号分类为十六个区段中的一个的分类计划，每个像素信号包括来自簇对的亮和暗簇的信息的碱基识别表700B。

所公开的技术生成像素信号，该像素信号代表从共享传感器的像素区域中的所有多个簇感测的信息。然后，这种泛簇像素信号的序列映射到区段，以碱基识别所有簇。因此，不会为每个簇生成单独的离散像素信号。其优点是图像采集多倍减少，从而减少了测序时间并加速序列处理。

考虑图7B，在图7B中，碱基识别像素区域中亮簇和暗簇。在每个循环，采样两个像素信号：AT信号和CT信号。在第一采样事件期间，来自荧光标记的腺嘌呤(A)和胸腺嘧啶(T)的亮簇和暗簇的光发射记录在AT信号中，而不是两个单独的AT信号，即一个用于亮簇，而另一个用于暗簇。类似地，在第二次采样事件期间，来自荧光标记的胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)的亮簇和暗簇的光发射记录在CT信号中，这与两个单独的CT信号相反，即一个用于亮簇，而另一个用于暗簇。

这样，在单个采样事件期间接收来自两个簇的光发射，并且产生公共的单个像素信号。因此，对于每个采样事件，来自亮簇和暗簇的发射共同表示在一个公共的单个像素信号中。

此外，一个公共的、单个像素信号序列用于在每个循环共同碱基识别亮簇和暗簇。在图7B中，AT和CT信号一起形成公共的、单个像素信号序列。因此，所公开的技术不使用两个单独的像素信号序列，即一个用于亮簇而另一个用于暗簇，以分别碱基识别亮簇和暗簇。其优点是信号处理多倍减少，从而减少了测序时间并加速序列处理。

所公开的碱基识别涉及将公共的单个像素信号序列映射到区段。例如，在图7B中，值为1和0时，AT和CT信号序列映射到区段1，并且亮簇和暗簇分别分配碱基识别A和A。

在图7B中示出的示例中，使用0.7：0.3的确定性亮对暗簇强度比。在实施方案中，强度比是不确定的，因此，其产生可检测的亮簇和暗簇，这些簇共享像素区域或共享阱，或者共享两者。

作为强度比是0.7：0.3(即，来自亮簇和暗簇的光发射的强度值显著不同)的结果，在多个碱基识别循环的两个照明阶段期间从共享传感器读出的像素信号产生十六个区段701(区段1-16)。每个区段具有唯一的一对像素信号值(例如，区段1的唯一对710)，该对包括第一照明阶段中两个簇的第一像素信号值706(AT信号)和第二照明阶段中两个簇的第二像素信号值708(CT信号)。

每个像素信号值706或708又由两个信号部分706A和706B或708A和708B组成，它们相加组合以产生相应的像素信号值706或708。因此，亮簇和暗簇两者都产生公共的单个像素信号。

对于每个像素信号值706或708，第一信号部分706A或708A由第一簇的光发射的强度值确定，并且第二信号部分706B或708B由第二簇的光发射强度值确定。在碱基识别表700B中示出的示例中，第一簇是亮簇702，第二簇是暗簇704。

因为强度比是0.7：0.3，所以第一像素信号和第二像素信号可以采用四个可能值–1、0、0.7或0.3中的一个。附加地，当亮簇产生“开”位时，其贡献或信号部分(706A、708A)是0.7。相反，当暗簇产生“开”位时，其贡献或信号部分(706B、708B)是0.3。对于两个簇，代表“关”位的贡献或信号部分由0标识。四个可能值1、0、0.7和0.3的十六个唯一组合产生十六个区段701。

一旦信号处理器138在多个碱基识别循环中为覆盖共享传感器或阱的亮-暗簇对识别出十六个区段701，信号处理器138就使用碱基识别表700B在连续的碱基识别循环中碱基识别亮-暗簇。在一个实施方案中，该识别导致阱被分类为保持多于一个簇(即亮簇和暗簇)。因此，在连续的碱基识别循环中，信号处理器为第一照明阶段(AT信号)执行共享传感器的第一像素读出。此第一像素读出产生第一像素信号。类似地，第二照明阶段的第二像素读出(CT信号)产生第二像素信号。第一像素信号和第二像素信号产生强度值，这些强度值组合形成值对。此值对可以与碱基识别表700B中的十六个唯一值对中的一个进行比较。基于该比较，选择十六个区段中的一个。根据分配给所选择的区段的核苷酸碱基对亮簇和暗簇进行碱基识别。对随后的碱基识别循环重复此过程，以识别亮簇和暗簇的相应核苷酸序列中存在的核苷酸碱基。

因此，所公开的技术将来自所有簇的发射视为对碱基识别有用，而不管它们的相对强度如何。这是因为不是单独地碱基识别具有较弱发射的簇(例如，暗簇)；而是使用携带更强发射和更弱发射的公共的、单个像素信号序列一起碱基识别具有较弱发射的簇(例如，暗簇)和具有较强发射的簇(例如，亮簇)。

如以上所描述，共享传感器捕获来自两个不同簇(例如亮簇和暗簇)的光子。在一些实施方案中，通过解卷积来自共享传感器的信号读数来检测信号部分，以区分由每个簇产生的各个信号部分。

图8示出根据一个实施方案的通过分析由共享像素区域的多个簇发射的像素信号进行碱基识别的方法800。在动作802处，检测代表在碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域中的多个簇收集的光的第一像素信号。在一些实施方案中，第一像素区域接收来自样本表面334上的相关阱的光。在其它实施方案中，第一像素区域接收来自样本表面334上多于一个相关阱的光。

在动作804处，检测代表在碱基识别循环的第二照明阶段期间从第一像素区域中的多个簇收集的光的第二像素信号。

在实施方案中，第一像素区域位于共享第一像素区域的多个簇之下。第一像素信号和第二像素信号可以由第一传感器从第一像素区域收集。第一像素信号和第二像素信号可以由信号处理器138检测，该信号处理器配置为处理由第一传感器收集的像素信号。

在一些实施方案中，第一照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基A和T的发射，并且第二照明阶段可以诱导来自第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基C和T的发射。

在动作806处，使用第一像素信号和第二像素信号的组合在碱基识别循环期间识别并入到多个簇的每个簇上的核苷酸碱基。在实施方案中，这包括将第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将第二像素信号映射到至少四个区段中，并且组合第一像素信号和第二像素信号的映射用于碱基识别。

在实施方案中，使用方法800在碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。在实施方案中，在连续的碱基识别循环中重复方法800，以在每个碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

在一些实施方案中，对于碱基识别循环中的每一个，检测并且存储在由多个像素区域处的多个簇发射的第一像素信号和第二像素信号。在碱基识别循环之后，第一像素信号和第二像素信号的组合用于识别在先前碱基识别循环中的每一个期间并入到多个像素区域处的多个簇上的核苷酸碱基。

图9描绘根据一个实施方案的识别生物传感器300的样本表面334上具有多于一个簇的像素区域以及在所识别的像素区域处碱基识别簇的方法900。在动作902处，执行多个碱基识别循环。每个碱基识别循环具有第一照明阶段和第二照明阶段。

在动作904处，与样本表面334的像素区域相关联的传感器捕获–(a)在碱基识别循环的第一照明阶段期间生成的第一组强度值以及(b)在碱基识别循环的第二照明阶段期间生成的第二组强度值。在实施方案中，归一化强度值。此外，在一些实施方案中，像素区域接收来自样本表面334上的相关阱的光。

在动作906处，信号处理器138将第一组强度值和第二组强度值拟合(如图6中所示)到一组分布(在这个示例中包括十六个分布)中的一个(其中分布是图6的二维图中的区域)，并且基于该拟合，将像素区域分类为具有多于一个簇。在实施方案中，信号处理器138使用一个或多个算法来拟合十六个分布。算法的示例包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法。

在动作908处，对于连续的碱基识别循环，信号处理器138在像素区域处检测簇群的第一组强度值和第二组强度值。在动作910处，信号处理器138从十六个分布中为簇群选择分布。该分布识别在簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基。

在一些实施方案中，强度比是产生显著不同的光发射的亮簇和暗簇的固有性质。在其它实施方案中，簇之间的强度比和显著不同的光发射由以下实施方案实现，诸如簇在平坦表面上的不均匀分布、每个传感器(或像素)的双阱以及离轴照明。

基于平坦表面的不均匀分布簇的空间分析

图10示出根据一个实施方案的具有像素区域(描绘为矩形)的样本表面334的俯视平面图1000，其中像素区域上不均匀地分布有多个簇(描绘为圆形)。相对于传感器(或像素)的位置，表面阱334上的簇的位置可以不受阱的限制。样本表面334上的这种簇的排列称为不均匀分布。在特定实施方案中，簇不均匀地分布在样本表面334的不包括阱的“平坦”构型上。在这种平坦表面实施方案中，像素区域可以重叠。

在示出的实施方案中，考虑共享四个像素区域A、B、C和D的两个示例簇1002和1004。根据簇相对于像素区域A、B、C和D的中心的相对位置，相应的传感器(或像素)接收不同量的光发射。这产生了照明模式，照明模式在测序单次上机测序反应的多个碱基识别循环中在簇1002和1004之间产生差分串扰，如下面所描述，其可用于在样本表面334上构建簇位置的地图。差分串扰体现在像素信号中，作为来自一个像素信号中的两个或多个簇的信息。

信号处理器138对簇的多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以检测对应于样本表面334上不均匀分布的各个簇的照明模式。多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在像素区域上的不均匀分布造成的差分串扰。

空间分析包括使用从一组像素区域收集的像素信号序列来确定给定簇的空间特征，包括给定簇在样本表面334上的位置。在多个碱基识别循环中识别出簇位置及其照明模式之后，簇可以由信号处理器138使用以上讨论的测序方案中的一个进行碱基识别。

在空间分析实施方案中，所公开的技术通过使用N个传感器(或像素)以定位和碱基识别样本表面334上的N+M个不均匀分布的簇来增加生物传感器300的通量，其中M是正整数。在一些实施方案中，M等于或几乎等于N。在其它实施方案中，当共享(或共同占据)像素区域和/或阱的两个簇由于强度值的差异不够大而不能被单独检测时，M可能不等于N或者甚至小于N。

每个传感器(或像素)双阱

图11A示出根据一个实施方案的每个像素区域具有包括主(主要)阱和副(次要)阱的两个阱的样本表面的侧视图1100A。图11B描绘图11A的样本表面的顶视平面图1100B。

在示出的实施方案中，共享传感器1106(或像素)对应于样本表面334上的两个阱1102和1104。主阱在像素区域上的横截面比副阱大。阱1104是主阱，阱1102是副阱，因为阱1104在传感器1106上具有更大的横截面。

在实施方案中，两个阱相对于像素区域1106’的中心具有不同的偏移。在示出实施方案中，主阱1104比副阱1102更靠近像素区域中心1106A(即，主阱1104相对于像素区域中心1106A的偏移比副阱1102小)。

由于不同的横截面覆盖和相对偏移结果，传感器1106在碱基识别循环(或采样事件)的照明阶段期间从两个阱接收不同量的照明。由于阱1102和1104中的每一个都保持相应的簇1102A和1104A，不同的照明量允许将簇中的一个识别为亮(或主要)，而另一个为暗(或次要)。在示出的实施方案中，主阱1102内的簇1102A被识别为亮簇，并且副阱1104内的簇1104A被识别为暗簇。在实施方案中，传感器1106从亮簇1102A接收的照明量大于从副阱1104中的暗簇1104A接收的照明量。

在识别亮簇和暗簇后，可以由信号处理器138使用上面讨论的测序方案中的一种来对亮簇和暗簇进行碱基识别。在每个传感器(或像素)双阱的一些实施方案中，所公开的技术通过使用一个共享传感器1106碱基识别由两个相应阱1102和1104保持的两个簇1102A和1102B来增加生物传感器300的通量。在每个传感器(或像素)双阱的其它实施方案中，所公开的技术通过使用N个传感器在样本表面334的相应的N+M阱个上碱基识别N+M个簇来增加生物传感器300的通量，其中M是正整数。在一些实施方案中，M等于或几乎等于N。在其它实施方案中，M可能不等于N或者甚至小于N。

离轴照明

图12A和图12B示出覆盖样本表面像素区域的阱的离轴照明1200A和1200B。照明系统109配置为在碱基识别循环的照明阶段用不同角度的照明信号1201和1211来照明像素区域1204’和1214’(与传感器1204和1214相关联)。结果，阱1202和1212用离轴或非正交照明信号照明。这在阱1202和1212中的每一个中产生不对称照明的阱区域，如图12A和图12B中所描述，每个阱中有亮阴影区域和暗阴影区域。阱的不对称照明的阱区域至少包括主阱区域1202B’或1212A’(以较亮的阴影描绘)和副阱区域1202A’或1212B’(以较暗的阴影描绘)，使得在碱基识别循环期间主阱区域比副阱区域被更多地照明。

每个阱配置为在碱基识别循环期间容纳多于一个簇，其中主阱区域和副阱区域的每一个都包括一个簇。在示出的实施方案中，阱1202保持两个簇1202A和1202B，簇1202A在副阱区域1202A’内，簇1202B在主阱区域1202B’内。阱1212保持两个簇1212A和1212B，其中簇1212A在主阱区域1212A’内，簇1212B在副阱区域1202B’内。

由于离轴照明，阱1202和1212的像素区域1204’和1214’从阱的主区域和副区域接收不同量的照明。结果，在碱基识别循环期间，主阱区域中的簇比副阱区域中的簇产生更大的照明量。对于每个阱，这允许将一个簇识别为亮(或主要)，而另一个为暗(或次要)。在示出实施方案中，对于阱1202，主阱区域1202B’内的簇1202B被识别为亮簇，而副阱区域1202A’内的簇1202A被识别为暗簇。对于阱1212，主阱区域1212A’内的簇1212A被识别为亮簇，而副阱区域1212B’内的簇1212B被识别为暗簇。

在为每个阱识别亮簇和暗簇后，可以由信号处理器138使用上面讨论的测序方案中的一种对亮簇和暗簇进行碱基识别。在离轴照明实施方案中，所公开的技术通过使用N个传感器(或像素)以在样本表面334上的N个非正交照明阱内碱基识别N+M个簇来增加生物传感器300的通量，其中M是正整数。在一些实施方案中，M等于或几乎等于N。在其它实施方案中，当共享(或共同占据)像素区域和/或阱的两个簇由于强度值的差异不够大而不能被单独检测时，M可能不等于N或者甚至小于N。

在一个实施方案中，离轴照明以四十五度角进行。在一些实施方案中，每个像素区域覆盖一个阱。在其它实施方案中，每个像素区域覆盖两个阱。

图12C示出根据一个实施方案的由图12A和图12B的离轴照明产生的不对称照明的阱区域1200C。如图12C中所示，阱区域1220比阱区域1230被更多地照明。

条款

本公开还包括以下条款：

1.一种用于碱基识别的设备，包括：

容器和生物传感器，所述容器保持所述生物传感器，所述生物传感器具有：

样本表面，在采样事件序列期间保持多个簇，

传感器阵列，配置为生成多个像素信号序列，所述阵列具有数量为N的有源传感器，所述阵列中的所述传感器相对于所述样本表面设置，以在所述采样事件序列期间从所述样本表面的所述数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，以及

通信端口，其输出所述多个像素信号序列；以及

信号处理器，其耦合到所述容器，并且配置为接收和处理所述多个像素信号序列，以对所述多个簇中的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，包括使用所述多个像素信号序列对来自所述数量为N的有源传感器的所述多个簇中的数量为N+M的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数。

2.根据条款1所述的设备，其中所述采样事件序列的所述结果对应于所述簇中的核苷酸碱基。

3.根据条款1或条款2所述的设备，其中所述采样事件包括时间序列中的两个照明阶段，并且所述多个像素信号序列中的像素信号序列包括用于每个采样事件的一组信号样本，所述组包括来自所述两个照明阶段中的每一个的至少一个像素信号。

4.根据条款3所述的设备，其中所述信号处理器包括对来自所述传感器阵列中单个传感器的所述像素信号序列的两个簇的结果进行分类的逻辑。

5.根据条款4所述的设备，其中对两个簇的结果进行分类的所述逻辑可以包括将来自特定传感器的采样事件的所述一组信号样本的第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将所述采样事件的所述一组信号样本的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以对两个簇的所述结果进行分类。

6.根据条款1至5中任一项所述的设备，其中所述传感器阵列中的所述传感器包括光检测器。

7.根据条款1至6中任一项所述的设备，其中所述采样事件包括时间序列中的两个照明阶段，并且所述多个像素信号序列中的像素信号序列包括用于每个采样事件的一组信号样本，所述组包括来自所述两个照明阶段中的每一个的至少一个像素信号，并且其中所述第一照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基A和T的给定簇的照明，并且所述第二照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基C和T的给定簇的照明，并且所述分类结果包括识别所述核苷酸碱基A、C、T或G中的一个。

8.根据条款1至7中任一项所述的设备，其中所述样本表面保持在所述像素区域上不均匀分布的簇，并且所述信号处理器对所述多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以检测对应于所述样本表面上的各个簇的照明模式，并且对所述各个簇的所述采样事件的所述结果进行分类，其中所述多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在所述像素区域上的不均匀分布导致的差分串扰。

9.根据条款1至8中任一项所述的设备，其中所述样本表面包括覆盖所述像素区域的阱阵列，包括每个像素区域两个阱，所述每个像素区域两个阱包括主阱和副阱，所述主阱在所述像素区域上的横截面大于所述副阱。

10.根据条款1至9中任一项所述的设备，其中所述样本表面包括覆盖所述像素区域的阱阵列，并且所述采样事件包括具有数量为K的照明阶段的至少一个化学阶段，其中K是正整数，其中所述K个照明阶段的所述照明阶段以不同的照明角度照明所述像素区域，并且所述像素信号序列包括用于每个采样事件的一组信号样本，所述组包括用于所述采样事件的所述至少一个化学阶段的数量为K的像素信号。

11.根据条款1至10中任一项所述的设备，其中所述样本表面包括覆盖像所述素区域的阱阵列，并且所述采样事件包括具有数量为K的照明阶段的第一化学阶段，其中K是正整数，其中所述K个照明阶段的所述照明阶段以不同的照明角度照明所述像素区域，以及具有数量为J的照明阶段的第二化学阶段，其中J是正整数，其中所述第一化学阶段中的所述K个照明阶段和所述第二化学阶段中的所述J个照明阶段的所述照明阶段以不同的照明角度照明所述阱阵列中的所述阱，并且所述像素信号序列包括用于每个采样事件的一组信号样本，所述组包括用于所述第一化学阶段的数量为K的像素信号加上用于所述采样事件的所述第二化学阶段的数量为J的像素信号。

12.一种用于碱基识别的生物传感器，包括：

采样设备，包括具有像素区域阵列的样本表面和具有传感器阵列的固态成像器，每个传感器在每个碱基识别循环中生成像素信号，每个像素信号代表从所述样本表面的相应像素区域收集的光；以及

信号处理器，配置为连接到所述采样设备，所述采样设备接收并且处理来自所述传感器的所述像素信号，用于在碱基识别循环中进行碱基识别，并且使用来自比在所述碱基识别循环中识别的多个簇碱基少的传感器的所述像素信号。

13.根据条款12的所述生物传感器，其中像素区域接收来自所述样本表面上的阱的光，并且所述阱配置为在所述碱基识别循环期间保持多于一个簇。

14.根据条款13所述的生物传感器，其中簇包括具有相同核酸序列的多个单链脱氧核糖核酸(缩写为DNA)片段。

15.一种计算机实现的碱基识别方法，包括：

对于边合成边测序(缩写为SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环，从通信端口接收

多个像素信号序列，所述多个像素信号序列由传感器阵列生成，所述阵列具有数量为N的有源传感器，所述阵列中的所述传感器相对于所述样本表面设置，以在所述采样事件序列期间从所述样本表面的所述数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列；以及

处理所述多个像素信号序列，以对所述多个簇中的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，包括使用所述多个像素信号序列以对所述多个簇中的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，包括使用所述多个像素信号序列对来自所述数量为N的有源传感器中的所述多个簇中的数量为N+M的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数。

16.根据条款15所述的方法，还包括：

将代表在所述碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域收集的光的第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将代表在所述碱基识别循环的第二照明阶段期间从所述第一像素区域收集的光的第二像素信号映射到至少四个区段中，以及

组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以识别所述并入的核苷酸碱基。

17.根据条款15或条款16所述的方法，还包括应用所述方法在所述碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的所述多个簇上的所述碱基。

18.根据条款17所述的方法，还包括在连续的碱基识别循环中重复所述方法，以在所述碱基识别循环中的每一个期间识别并入到所述多个像素区域处的所述多个簇上的所述核苷酸碱基。

19.根据条款18所述的方法，还包括：

对于所述碱基识别循环中的每一个，检测并且存储在所述多个像素区域处由所述多个簇发射的所述第一像素信号和第二像素信号，以及

在所述碱基识别循环之后，使用所述第一像素信号和第二像素信号的组合来识别在所述先前碱基识别循环中的每一个期间并入到所述多个像素区域处的所述多个簇上的所述核苷酸碱基。

20.根据条款16至19中任一项所述的方法，其中所述第一像素区域接收来自样本表面上的相关联的阱的光。

21.根据条款20所述的方法，其中所述第一像素区域接收来自所述样本表面上的多于一个相关联的阱的光。

22.根据条款16至21中任一项所述的方法，其中所述第一像素信号和第二像素信号由第一传感器从所述第一像素区域收集。

23.根据条款22所述的方法，其中所述第一像素信号和第二像素信号由信号处理器检测，所述信号处理器配置为处理由所述第一传感器收集的像素信号。

24.根据条款15至23中任一项所述的方法，其中所述第一照明阶段诱导来自所述第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基A和T的发射，并且所述第二照明阶段诱导来自所述第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基C和T的发射。

25.根据条款15至24中任一项所述的方法，其中所述碱基识别包括使用如条款1至11中任一项中限定的设备。

26.一种识别生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所述识别的像素区域处碱基识别簇的方法，包括：

执行多个碱基识别循环，每个碱基识别循环具有第一照明阶段和第二照明阶段；

在与所述样本表面的像素区域相关联的传感器处捕获，

在所述碱基识别循环的所述第一照明阶段期间生成的第一组强度值，以及

在所述碱基识别循环的所述第二照明阶段期间生成的第二组强度值；

使用信号处理器将十六个分布拟合到所述第一组强度值和第二组强度值，并且基于所述拟合，将所述像素区域分类为具有多于一个簇；以及

对于连续的碱基识别循环，

使用所述信号处理器检测所述像素区域处的簇群的所述第一组强度值和第二组强度值，以及

选择所述簇群的分布，其中所述分布识别所述簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基。

27.根据条款26所述的方法，其中所述拟合包括使用一种或多种算法，包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法。

28.根据条款26或27所述的方法，还包括标准化所述强度值。

29.根据条款26至28中任一项所述的方法，其中所述像素区域接收来自所述样本表面上的相关联的阱的光。

30.根据条款26至29中任一项的方法，其中所述识别和碱基识别包括使用条款1至11中任一项中限定的设备或条款12至14中任一项中限定的生物传感器。

31.一种计算机实现的碱基识别方法，包括：

提供第一像素信号和第二像素信号，所述第一像素信号代表在边合成边测序(缩写为SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域收集的光，所述第二像素信号代表在所述SBS单次上机测序反应的所述碱基识别循环的第二照明阶段期间从所述第一像素区域收集的光，其中所述第一像素区域位于共享所述第一像素区域的第一簇和第二簇之下；

提供信号处理器，配置成处理至少所述第一像素信号和第二像素信号；

使用所述信号处理器将所述第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将所述第二像素信号映射到至少四个区段中；以及

逻辑地组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射，以在所述碱基识别循环期间识别并入到所述第一簇和第二簇中的每一个簇上的所述核苷酸碱基。

32.一种计算机实现的识别生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所述识别的像素区域处碱基识别簇的方法，包括：

提供在碱基识别循环的第一照明阶段期间生成的第一组强度值和在所述碱基识别循环的第二照明阶段期间生成的第二组强度值，其中第一组强度值和第二组强度值代表在与所述样本表面的像素区域相关联的传感器处收集的光的所述强度；

使用信号处理器将十六个分布拟合到所述第一组强度值和第二组强度值，并且基于所述拟合，将所述像素区域分类为具有多于一个簇；以及

对于连续的碱基识别循环，

使用所述信号处理器提供所述像素区域处的簇群的第一组强度值和第二组强度值，以及

选择所述簇群的分布，其中所述分布识别所述簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基。

33.根据条款32所述的计算机实现的方法，其中所述拟合包括使用一种或多种算法，包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法。

34.一种用于碱基识别的设备，包括：

容器和生物传感器，所述容器保持所述生物传感器，所述生物传感器具有：

样本表面，配置为在采样事件序列期间保持多个簇，所述样本表面包括数量为N的像素区域，并且所述采样事件包括时间序列中的两个照明阶段，

传感器阵列，包括光检测器，所述光检测器配置为生成多个像素信号序列，所述像素信号序列包括用于每个像素区域和照明阶段的至少一个像素信号，所述阵列具有数量为N的有源传感器，每个有源传感器与所述N个像素区域中的相应像素区域相关联，并且配置为检测从所述相关联的像素区域收集的光发射，以在代表从所述相应像素区域收集的所述光发射的所述采样事件序列期间生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，其中所述采样表面配置为使得至少一个有源传感器检测来自形成所述多个簇的簇对的至少两个簇的光发射，其中所述两个簇的相应光发射的所述强度显著不同，以及

通信端口，输出所述多个像素信号序列；以及

信号处理器，耦合到所述容器，并且配置为接收和处理所述多个像素信号序列，以对所述多个簇中的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，包括使用所述多个像素信号序列对来自所述数量为N的有源传感器的所述多个簇中的数量为N+M的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数，通过对来自所述传感器阵列中的所述至少一个有源传感器的所述像素信号序列的形成簇对的所述两个簇的结果进行分类。

35.根据条款34所述的设备，其中所述采样事件序列的所述结果对应于所述簇中的核苷酸碱基，优选地，其中所述第一照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基A和T的给定簇的照明，并且所述第二照明阶段诱导来自指示核苷酸碱基C和T的给定簇的照明，并且所述分类结果包括识别所述核苷酸碱基A、C、T或G中的一个。

36.根据条款34至35中任一项所述的设备，其中对两个簇的结果进行分类的所述逻辑可以包括将来自特定传感器的采样事件的所述一组信号样本的第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将所述采样事件的所述一组信号样本的第二像素信号映射到至少四个区段中，并且逻辑地组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以对两个簇的所述结果进行分类。

37.根据条款34至36中任一项所述的设备，其中所述样本表面保持在所述像素区域上不均匀分布的簇，并且所述信号处理器对所述多个像素信号序列执行时间序列和空间分析，以检测对应于所述样本表面上的各个簇的照明模式，并且对所述各个簇的所述采样事件的所述结果进行分类，其中所述多个像素信号序列编码至少两个簇之间的由于其在所述像素区域上的不均匀分布导致的差分串扰。

38.根据条款34至37中任一项所述的设备，其中所述样本表面包括覆盖所述像素区域的阱阵列，包括每个像素区域两个阱，所述每个像素区域两个阱包括主阱和副阱，所述主阱在所述像素区域上的横截面大于所述副阱。

39.根据条款34至38中任一项所述的设备，其中所述样本表面包括覆盖所述像素区域的阱阵列，并且所述采样事件包括具有数量为K的照明阶段的至少第一化学阶段，其中K是正整数，其中所述K个照明阶段的所述照明阶段以不同的照明角度照明所述像素区域，并且所述像素信号序列包括用于每个采样事件的一组信号样本，所述组包括用于所述采样事件的所述至少一个化学阶段的数量为K的像素信号；其中优选地，所述采样事件还包括具有数量为J的照明阶段的第二化学阶段，其中J是正整数，其中所述第一化学阶段中的所述K个照明阶段的照明阶段和所述第二化学阶段中的所述J个照明阶段的照明阶段以不同的照明角度照明所述阱阵列中的所述阱，并且所述一组信号样本还包括所述采样事件的所述第二化学阶段的数量为J的像素信号。

40.根据条款34至39中任一项所述的设备，其中所述传感器阵列包括在固态成像器中。

41.根据条款34至40中任一项所述的设备，其中像素区域接收来自所述样本表面上的阱的光，并且所述阱配置为在所述碱基识别循环期间保持多于一个簇，其中簇优选包括具有相同核酸序列的多个单链脱氧核糖核酸(缩写为DNA)片段。

42.一种计算机实现的碱基识别方法，包括：

对于边合成边测序(SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环，从通信端口接收

多个像素信号序列，所述多个像素信号序列是基于由包括光检测器的传感器阵列保持在样本表面的数量为N的像素区域中的多个簇发射的光，针对包括时间序列中的两个照明阶段的采样事件序列而生成的，所述阵列具有数量为N的有源传感器，每个有源传感器与所述N个像素区域中的相应像素区域相关联并且配置为检测从所述相关联的像素区域收集的光发射，所述传感器配置为在所述采样事件序列期间从所述采样表面的所述N个相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，所述像素信号序列包括用于每个像素区域和照明阶段的至少一个像素信号，其中至少一个有源传感器检测来自形成所述多个簇的簇对的至少两个簇的光发射，其中所述两个簇的相应光发射的所述强度显著不同；以及

处理所述多个像素信号序列以对所述多个簇中的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，包括使用所述多个像素信号序列对来自所述数量为N的有源传感器的所述多个簇中的数量为N+M的簇上的所述采样事件序列的结果进行分类，其中M是正整数，通过对来自所述传感器阵列中的所述至少一个有源传感器的所述像素信号序列的形成簇对的所述两个簇的结果进行分类。

43.根据条款42所述的计算机实现的方法，还包括：

将代表在所述碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域收集的光的第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将代表在所述碱基识别循环的第二照明阶段期间从所述第一像素区域收集的光的第二像素信号映射到至少四个区段中，以及

组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以识别所述并入的核苷酸碱基。

44.根据条款42至43中任一项所述的计算机实现的方法，还包括应用所述方法在所述碱基识别循环期间识别并入到多个像素区域处的所述多个簇的所述核苷酸碱基，优选还包括在连续的碱基识别循环中重复所述方法以在所述碱基识别循环中的每一个期间识别并入到所述多个像素区域处的所述多个簇的所述核苷酸碱基，更优选还包括：

对于所述碱基识别循环中的每一个，检测并且存储在由所述多个像素区域处的所述多个簇发射的所述第一像素信号和第二像素信号，以及

在所述碱基识别循环之后，使用所述第一像素信号和第二像素信号的所述组合在所述先前碱基识别循环中的每一个期间识别并入到所述多个像素区域处的所述多个簇上的所述核苷酸碱基。

45.根据条款42至44中任一项所述的计算机实现的方法，其中以下至少一项适用：

所述第一像素区域接收来自样本表面上的相关联的阱的光；优选来自所述样本表面上的多于一个相关联的阱的光；

由第一传感器从所述第一像素区域收集所述第一像素信号和第二像素信号，其中所述第一像素信号和第二像素信号优选地由信号处理器检测，所述信号处理器配置用于处理由所述第一传感器收集的像素信号，以及

所述第一照明阶段诱导来自所述第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基A和T的发射，并且所述第二照明阶段诱导来自所述第一簇和第二簇的照明以产生来自标记的核苷酸碱基C和T的发射。

46.根据条款42至45中任一项所述的计算机实现的方法，其中所述碱基识别包括使用如条款34至41中任一项中限定的设备。

47.一种识别生物传感器的样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所述识别的像素区域处碱基识别簇的方法，优选条款34至46中任一项所述的方法，包括：

执行多个碱基识别循环，每个碱基识别循环具有第一照明阶段和第二照明阶段；

在与所述样本表面的像素区域相关联的传感器处捕获，

在所述碱基识别循环的所述第一照明阶段期间生成的第一组强度值，以及

在所述碱基识别循环的所述第二照明阶段期间生成的第二组强度值；

使用信号处理器将十六个分布拟合到所述第一组强度值和第二组强度值，并且基于所述拟合，将所述像素区域分类为具有多于一个簇；以及

对于连续的碱基识别循环，

使用所述信号处理器检测所述像素区域处的簇群的所述第一组强度值和第二组强度值，以及

选择所述簇群的分布，其中所述分布识别所述簇群的每个簇中存在的核苷酸碱基

其中优选地，以下至少一项适用：

所述拟合包括使用一种或多种算法，包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法；

所述方法还包括归一所述化强度值；

所述像素区域接收来自所述样本表面上的相关联的阱的光；以及

所述识别和碱基识别包括使用如条款34至41中任一项中限定的设备。

48.一种计算机实现的碱基识别方法，优选根据条款42-46中任一项所述的方法，所述方法包括：

提供第一像素信号和第二像素信号，所述第一像素信号代表在边合成边测序(缩写为SBS)单次上机测序反应的碱基识别循环的第一照明阶段期间从第一像素区域收集的光，所述第二像素信号代表在所述SBS单次上机测序反应的所述碱基识别循环的第二照明阶段期间从所述第一像素区域收集的光，其中所述第一像素区域位于共享所述第一像素区域的第一簇和第二簇之下；

提供信号处理器，配置用于处理至少所述第一像素信号和第二像素信号；

使用所述信号处理器将所述第一像素信号映射到至少四个区段中，并且将所述第二像素信号映射到至少四个区段中；以及

逻辑地组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射，以在所述碱基识别循环期间识别并入到所述第一簇和第二簇中的每一个上的所述核苷酸碱基，或者是一种识别生物传感器样本表面上具有多于一个簇的像素区域以及在所述识别的像素区域处碱基识别簇的方法，包括：

提供在碱基识别循环的第一照明阶段期间生成的第一组强度值和在所述碱基识别循环的第二照明阶段期间生成的第二组强度值，其中第一组强度值和第二组强度值代表在与所述样本表面的像素区域相关联的传感器处收集的光的所述强度；

使用信号处理器将十六个分布拟合到所述第一组强度值和第二组强度值，并且基于所述拟合，将所述像素区域分类为具有多于一个簇；以及

对于连续的碱基识别循环，

使用所述信号处理器提供所述像素区域处的簇群的第一组强度值和第二组强度值，以及

选择所述簇群的分布，其中所述分布识别所述簇群中的每个簇中存在的核苷酸碱基，其中所述拟合优选包括使用一种或多种算法，包括k-均值聚类算法、k-均值类聚类算法、最大期望算法和基于直方图的算法。

Claims (18)

1.一种用于碱基识别的设备，包括：

容器，其被配置为保持生物传感器，所述生物传感器具有

样本表面，包括像素区域并且在采样事件序列期间保持多个簇，使得所述簇在所述像素区域上不均匀分布，

传感器阵列，其中所述阵列中的每个传感器感测来自设置在所述样本表面的相应像素区域中的一个或多个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号，所述阵列被配置为生成多个像素信号序列，所述阵列具有数量为N的有源传感器，所述阵列中的所述传感器相对于所述样本表面设置，以在所述采样事件序列期间从所述样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，以及

通信端口，输出所述多个像素信号序列；以及

信号处理器，所述信号处理器耦合到所述容器，并且被配置为执行所述多个像素信号序列的时间序列和空间分析，以从所述数量为N的有源传感器中检测对应于所述样本表面上的数量为N+M的各个簇的照明模式，其中M是正整数，并且针对数量为N+M的各个簇对所述采样事件序列的结果进行分类，其中所述多个像素信号序列中的至少一个像素信号序列中的每个采样事件的所述像素信号表示来自所述相应像素区域中的至少两个簇的感测信息，并且所述多个像素信号序列编码由其在所述像素区域上的不均匀分布导致的所述至少两个簇之间的差分串扰。

2.根据权利要求1所述的设备，其中所述信号处理器使用从所述数量为N的有源传感器检测到的所述照明模式来定位所述样本表面上所述数量为N+M的各个簇。

3.一种用于碱基识别的设备，包括：

生物传感器，其具有包括像素区域和覆盖所述像素区域的阱阵列的样本表面，所述生物传感器包括每个像素区域的两个阱和两个簇，所述每个像素区域的两个阱包括主阱和副阱，所述主阱在所述像素区域上的横截面大于所述副阱。

4.根据权利要求3所述的设备，其中所述生物传感器包括

传感器阵列，其中所述阵列中的每个传感器感测来自设置在所述样本表面的相应像素区域中的所述两个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号，所述阵列被配置为生成多个像素信号序列，所述阵列具有数量为N的有源传感器，所述阵列中的所述传感器相对于所述样本表面设置，以在所述采样事件序列期间从所述样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，以及

通信端口，输出所述多个像素信号序列。

5.根据权利要求3所述的设备，其中所述两个阱相对于所述像素区域的中心具有不同的偏移。

6.根据权利要求5所述的设备，其中在采样事件期间，所述像素区域从所述两个阱接收不同量的照明，以及

其中多个像素信号序列中的至少一个像素信号序列中的每个采样事件的所述像素信号代表来自相应像素区域中的所述两个簇的感测信息。

7.根据权利要求6所述的设备，其中在所述采样事件期间，所述两个阱中的每一个都保持至少一个簇。

8.根据权利要求7所述的设备，其中在所述采样事件期间，所述像素区域从所述主阱中的亮簇接收的照明量大于从所述副阱中的暗簇接收的照明量。

9.根据权利要求8所述的设备，其中所述生物传感器耦合到信号处理器，所述信号处理器被配置为接收并且处理所述多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别存在于数量为N+M的簇中的碱基，包括对于所述亮簇和暗簇

将在所述采样事件的第一照明阶段期间由对应于所述像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，

将在所述采样事件的第二照明阶段期间由所述传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，以及

逻辑组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以识别所述亮簇和所述暗簇中存在的所述碱基。

10.一种用于碱基识别的设备，包括：

生物传感器，具有包括像素区域和覆盖所述像素区域的阱阵列的样本表面，每个像素区域有至少两个簇；以及

照明系统，耦合到所述生物传感器并且在采样事件序列期间以不同的照明角度照明所述像素区域，包括对于所述采样事件序列中的采样事件，用离轴照明来照明阱中的每一个阱，以在所述阱中的每一个阱中产生不对称照明的阱区域。

11.根据权利要求10所述的设备，其中所述生物传感器包括

传感器阵列，其中所述阵列中的每个传感器感测来自设置在所述样本表面的相应像素区域中的所述至少两个簇的信息，以在采样事件中生成像素信号，所述阵列被配置为生成多个像素信号序列，所述阵列具有数量为N的有源传感器，所述阵列中的所述传感器相对于所述样本表面设置，以在所述采样事件序列期间从所述样本表面的数量为N的相应像素区域生成相应的像素信号，以产生所述多个像素信号序列，以及

通信端口，输出所述多个像素信号序列。

12.根据权利要求10所述的设备，其中所述不对称照明的阱区域至少包括主阱区域和副阱区域，使得在所述采样事件期间，主阱区域比副阱区域被更多地照明。

13.根据权利要求12所述的设备，其中在所述采样事件期间，所述阱保持多于一个簇，所述主阱区域和副阱区域各包括一个簇。

14.根据权利要求13所述的设备，其中在所述采样事件期间，覆盖所述阱的像素区域从所述主阱区域中的亮簇接收的照明量大于从所述副阱区域中的暗簇接收的照明量。

15.根据权利要求14所述的设备，其中所述生物传感器耦合到信号处理器，所述信号处理器被配置为接收并且处理多个像素信号序列，以从数量为N的有源传感器中识别存在于数量为N+M的簇中的碱基，包括对于所述亮簇和暗簇

将在所述采样事件的第一照明阶段期间由对应于所述像素区域的传感器生成的第一像素信号映射到至少四个区段中，

将在所述采样事件的第二照明阶段期间由所述传感器生成的第二像素信号映射到至少四个区段中，以及

逻辑组合所述第一像素信号和第二像素信号的所述映射以识别所述亮簇和所述暗簇中存在的所述碱基。

16.根据权利要求10所述的设备，其中所述离轴照明以四十五度角进行。

17.根据权利要求10所述的设备，其中每个像素区域覆盖有一个阱。

18.根据权利要求10所述的设备，其中每个像素区域覆盖有两个阱。

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