BR112019027625A2 - dispositivo para chamada de base, biossensor deste, método deste e sistema - Google Patents

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BR112019027625A2
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Dietrich Dehlinger
Ali Agah
Tracy Helen Fung
Emrah Kostem
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Illumina, Inc.
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Abstract

  É provido um biossensor (300) para chamada de base. O biossensor (300) compreende um dispositivo de amostragem, que inclui uma superfície de amostra (334) que tem uma matriz de áreas de pixel (306?, 308?, 310?, 312?, 314?) e um gerador de imagens de estado sólido (322) que tem uma matriz de sensores (306, 308, 310, 312, 314). Cada sensor (306, 308, 310, 312, 314) gera sinais de pixel em cada ciclo de chamada de base. Cada sinal de pixel representa a luz reunida em um ciclo de chamada de base de um ou mais agrupamentos (306A, 306B; 308A, 308B; 310A, 310B; 312A, 312B; 314A, 314B) em uma área de pixel (306?, 308?, 310?, 312?, 314?) correspondente da superfície de amostra (334). O biossensor (300) compreende adicionalmente um processador de sinal configurado para conexão ao dispositivo de amostragem. O processador de sinal recebe e processa os sinais de pixel dos sensores (306, 308, 310, 312, 314) para chamada de base em um ciclo de chamada de base e usa os sinais de pixel de poucos sensores (306, 308, 310, 312, 314) do que um número de base de agrupamentos (306A, 306B; 308A, 308B; 310A, 310B; 312A, 312B; 314A, 314B) chamado no ciclo de chamada de base. Os sinais de pixel a partir dos poucos sensores (306, 308, 310, 312, 314) incluem pelo menos um sinal de pixel que representa a luz reunida de pelo menos dois agrupamentos (306A, 306B; 308A, 308B; 310A, 310B; 312A, 312B; 314A, 314B) na área de pixel (306?, 308?, 310?, 312?, 314?) correspondente.

Description

DISPOSITIVO PARA CHAMADA DE BASE, BIOSSENSOR DESTE, MÉTODO DESTE E SISTEMA PEDIDOS PRIORITÁRIOS
[0001] Este pedido reivindica prioridade ou o benefício dos seguintes pedidos: Pedido de Patente Provisória dos EUA Nº. 62/614.934, intitulado “SYSTEMS AND DEVICES FOR HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION,” depositado em 8 de janeiro de 2018, (Atty. Docket No. ILLM 1003-2/IP-1656-PRV); O Pedido de Patente Provisória dos EUA Nº. 62/614.930, intitulado "HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION,", depositado em 8 de janeiro de 2018 (Atty. Docket No. ILLM 1003-1 / IP-1653-PRV); e O Pedido da Holanda Nº. 2020758, intitulado “HIGH-THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION”, depositado em 12 de abril de 2018 (Atty. Boletim nº ILLM 1003-6 / IP-1653- NL).
[0002] Os pedidos prioritários são incorporados por referência neste documento para todos os fins.
REFERÊNCIA CRUZADA A OUTROS PEDIDOS
[0003] Os seguintes pedidos de patente são incorporados neste documento na íntegra para todos os fins: O Pedido de Patente Não Provisória dos EUA, intitulado "HIGH- THROUGHPUT SEQUENCING WITH SEMICONDUCTOR-BASED DETECTION,", depositado contemporaneamente (Atty. Docket No. ILLM 1003-3/IP-1653-PRV); e Pedido de Patente Provisório nos EUA intitulado “MULTIPLEXING OF
AN ACTIVE SENSOR DETECTOR USING STRUCTURED ILLUMINATION”, depositado em 8 de janeiro de 2018 (Atty. Docket No. IP- 1623-PRV);
Pedido de Patente Não Provisória dos EUA Nº. 13/833.619, intitulado
BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR SAME”, depositado em 15 de março de 2013 (Atty. Docket No. IP-0626-US); Pedido de Patente Não Provisória dos EUA Nº. 15/175.489, intitulado “BIOSENSORS FOR BIOLOGICAL OR CHEMICAL ANALYSIS AND METHODS OF MANUFACTURING THE SAME”, depositado em 7 de junho de 2016 (Atty. Docket No. IP-0689-US); Pedido de Patente Não Provisória dos EUA Nº. 13/882.088, intitulado
MICRODEVICES AND BIOSENSOR CARTRIDGES FOR BIOLOGICAL OR
CHEMICAL ANALYSIS AND SYSTEMS AND METHODS FOR THE SAME”, depositado em 26 de abril de 2013 (Atty. Docket No. IP-0462-US); O Pedido de Patente Não Provisória dos EUA Nº. 13/624.200, intitulado "METHODS AND COMPOSITIONS FOR NUCLEIC ACID SEQUENCING", depositado em 21 de setembro de 2012 (Atty. Docket No. IP-0538-US).
CAMPO DA TECNOLOGIA DIVULGADA
[0004] Modalidades da tecnologia divulgada referem-se geralmente ao sequenciamento com detecção baseada em CMOS e, mais particularmente, a sistemas e métodos para aumentar o rendimento do sequenciamento com detecção baseada em CMOS.
FUNDAMENTOS
[0005] Vários protocolos em pesquisas biológicas ou químicas envolvem a realização de um grande número de reações controladas em superfícies de suporte local ou dentro de câmaras (ou poços) de reação predefinidas. As reações desejadas podem então ser observadas ou detectadas e a análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar propriedades dos produtos químicos envolvidos na reação. Por exemplo, em alguns ensaios multiplex, um analito desconhecido (por exemplo, agrupamentos de ácidos nucleicos amplificados por clonagem) com uma etiqueta identificável (por exemplo, etiqueta fluorescente) pode ser exposto a milhares de sondas conhecidas sob condições controladas. Cada sonda conhecida pode ser depositada em um poço correspondente de uma microplaca ou célula de fluxo. Observar quaisquer reações químicas que ocorram entre as sondas conhecidas e o analito desconhecido dentro dos poços pode ajudar a identificar ou revelar propriedades do analito. Outros exemplos de tais protocolos incluem processos conhecidos de sequenciamento de DNA, como sequenciamento por síntese (SBS) ou sequenciamento de matriz cíclica.
[0006] Em alguns protocolos convencionais de detecção de fluorescência, um sistema óptico é usado para direcionar uma luz de excitação para os analitos marcados com fluorescência e também para detectar os sinais fluorescentes que podem emitir a partir dos analitos. No entanto, esses sistemas ópticos podem ser relativamente caros e exigir uma maior pegada de benchtop. Por exemplo, o sistema óptico pode incluir uma disposição de lentes, filtros e fontes de luz. Em outros sistemas de detecção propostos, as reações controladas ocorrem imediatamente em um gerador de imagens de estado sólido (por exemplo, dispositivo acoplado à carga (CCD) ou um sensor complementar de metal-óxido-semicondutor (CMOS)) que não requer um conjunto óptico grande para detectar as emissões fluorescentes.
[0007] No entanto, os sistemas de imagem de estado sólido propostos podem ter algumas limitações. Por exemplo, os geradores de imagens de estado sólido são limitados a uma chamada de base de agrupamento (cluster) por sensor (ou pixel) e sua taxa de transferência depende da densidade de pixels dos sensores, que é uma função do espaçamento entre pixels. Como existem limitações na redução significativa do espaçamento entre pixels, torna-se desejável explorar outras soluções para aumentar a taxa de transferência de geradores de imagens em estado sólido.
[0008] Surge uma oportunidade para aumentar a taxa de transferência de sistemas de imagem em estado sólido chamando vários agrupamentos por sensor (ou pixel) e fornecer sistemas e dispositivos que facilitam a chamada básica de vários agrupamentos por sensor (ou pixel).
[0009] Modalidades da presente divulgação referem-se geralmente a análises biológicas ou químicas e, mais particularmente, a sistemas e métodos que utilizam dispositivos de detecção para análises biológicas ou químicas.
[0010] Vários protocolos em pesquisas biológicas ou químicas envolvem a realização de um grande número de reações controladas em superfícies de suporte local ou dentro de câmaras de reação predefinidas. As reações desejadas podem então ser observadas ou detectadas e a análise subsequente pode ajudar a identificar ou revelar propriedades dos produtos químicos envolvidos na reação. Por exemplo, em alguns ensaios multiplex, analitos desconhecidos com marcadores identificáveis (por exemplo, etiqueta fluorescente) podem ser expostos a milhares de sondas conhecidas sob condições controladas. Cada sonda conhecida pode ser depositada em um local correspondente em uma superfície. Observar quaisquer reações químicas que ocorrem entre as sondas conhecidas e o analito desconhecido na superfície pode ajudar a identificar ou revelar propriedades do analito. Outros exemplos de tais protocolos incluem processos conhecidos de sequenciamento de DNA, como sequenciamento por síntese (SBS) ou sequenciamento de matriz cíclica.
[0011] Em alguns protocolos convencionais de detecção de fluorescência, um sistema óptico é usado para direcionar uma luz de excitação para os analitos marcados com fluorescência e também para detectar os sinais fluorescentes que podem emitir a partir dos analitos. A taxa de transferência de técnicas de imagiologia padrão é limitada pelo número de pixels disponível no dispositivo de detecção, entre outras coisas. Como tal, esses sistemas ópticos podem ser relativamente caros e exigir uma pegada de benchtop relativamente grande ao detectar superfícies com grandes coleções de analitos. Por exemplo, matrizes de ácido nucleico usadas em análises de genotipagem, expressão ou sequenciamento podem exigir a detecção de milhões de locais diferentes na matriz por centímetro quadrado. Os limites na taxa de transferência aumentam o custo e diminuem a precisão dessas análises.
[0012] Assim, existe a necessidade de aparelhos e métodos de maior rendimento, por exemplo, para detectar matrizes de ácidos nucleicos. A presente divulgação trata dessa necessidade e também oferece outras vantagens.
BREVE DESCRIÇÃO DA TECNOLOGIA DIVULGADA
[0013] De acordo com uma modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base que compreende um receptáculo configurado para reter um biossensor. O biossensor possui (a) uma superfície de amostra que mantém uma pluralidade de agrupamentos durante uma sequência de eventos de amostragem, (b) uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel e (c) uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel. A matriz possui um número N de sensores ativos e os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um processador de sinal acoplado ao receptáculo. O processador de sinal é configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo.
[0014] Os resultados da sequência de eventos de amostragem podem corresponder a bases nucleotídicas nos agrupamentos.
[0015] Os eventos de amostragem podem compreender dois estágios de iluminação em sequência de tempo, e sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel podem incluir um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação.
[0016] O processador de sinal pode incluir lógica para classificar os resultados para dois agrupamentos a partir das sequências de sinais de pixel de um único sensor na matriz de sensores. A lógica para classificar resultados para dois agrupamentos pode incluir mapear um primeiro sinal de pixel do conjunto de amostras de sinal para um evento de amostragem de um sensor específico em pelo menos quatro compartimentos e mapear um segundo sinal de pixel do conjunto de amostras de sinais para o evento de amostragem em pelo menos quatro compartimentos, e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para classificar os resultados para dois agrupamentos.
[0017] Os sensores na matriz de sensores podem compreender detectores de luz.
[0018] Os eventos de amostragem podem compreender dois estágios de iluminação em sequência de tempo, e sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel podem incluir um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação. O primeiro estágio de iluminação pode induzir a iluminação de um determinado agrupamento indicando bases nucleotídicas A e T e o segundo estágio de iluminação pode induzir a iluminação de um determinado agrupamento indicando bases nucleotídicas C e T, e os referidos resultados de classificação podem compreender chamar uma das bases nucleotídicas A, C, T ou G.
[0019] Agrupamentos podem ser distribuídos de forma desigual ao longo das áreas de pixel da superfície de amostra, e o processador de sinal pode executar análise de sequência temporal e espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais na superfície de amostra e para classificar os resultados dos eventos de amostragem para agrupamentos individuais. A pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual sobre as áreas de pixel.
[0020] A superfície de amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel, os dois poços por área de pixel podem incluir um poço dominante e um poço subordinado, o poço dominante pode ter uma seção transversal maior ao longo da área de pixel do que o poço subordinado.
[0021] A superfície da amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, e os eventos de amostragem podem incluir pelo menos um estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K podem iluminar as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel podem incluir um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo o número K de sinais de pixel para pelo menos um estágio químico dos eventos de amostragem.
[0022] A superfície da amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, e os eventos de amostragem podem incluir um primeiro estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K podem iluminar as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e um segundo estágio químico com um número J de estágios de iluminação, onde J é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K no primeiro estágio químico e dos estágios de iluminação J no segundo estágio químico podem iluminar os poços na matriz de poços com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel podem incluir um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo o número K de sinais de pixel para o primeiro estágio químico mais o número J de sinais de pixel para o segundo estágio químico dos eventos de amostragem.
[0023] Em outra modalidade, é fornecido um biossensor para chamada de base. O biossensor compreende um dispositivo de amostragem. O dispositivo de amostragem inclui uma superfície de amostra que tem uma matriz de áreas de pixel e um gerador de imagens de estado sólido que tem uma matriz de sensores. Cada sensor gera sinais de pixel em cada ciclo de chamada de base. Cada sinal de pixel representa a luz reunida a partir de uma área de pixel correspondente da superfície de amostra. O biossensor compreende adicionalmente um processador de sinal configurado para conexão ao dispositivo de amostragem. O processador de sinal recebe e processa os sinais de pixel dos sensores para chamada de base em um ciclo de chamada de base e usa os sinais de pixel de menos sensores do que um número de base de agrupamentos chamado no ciclo de chamada de base.
[0024] Uma área de pixel pode receber luz de um poço na superfície de amostra e o poço pode reter mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada de base.
[0025] Um agrupamento pode compreender uma pluralidade de fragmentos de ácido desoxirribonucleico de fita simples (DNA abreviado) que possuem uma sequência de ácido nucleico idêntica.
[0026] Em outra modalidade, é fornecido um método de chamada de base. Para um ciclo de chamada de base de uma sequência de execução por síntese (SBS abreviada), o método inclui detectar: (1) um primeiro sinal de pixel que representa a luz coletada a partir de uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base e (2) um segundo sinal de pixel que representa luz coletada a partir da primeira área de pixel durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base. A primeira área de pixel é subjacente a uma pluralidade de agrupamentos que compartilha a primeira área de pixel. O método inclui usar uma combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas incorporadas em cada agrupamento da pluralidade de agrupamentos durante o ciclo de chamada de base.
[0027] O método também pode incluir mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e combinar o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas.
[0028] O método também pode incluir aplicar o método para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixel durante o ciclo de chamada de base.
[0029] O método também pode incluir repetir o método ao longo de sucessivos ciclos de chamada de base para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base.
[0030] Para cada um dos ciclos de chamada de base, o método também pode incluir detecção e armazenamento do primeiro e do segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel e após os ciclos de chamada de base, o uso da combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixels durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
[0031] A primeira área de pixel pode receber luz de um poço associado em uma superfície de amostra. A primeira área de pixel pode receber luz de mais de um poço associado em uma superfície de amostra. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser reunidos por um primeiro sensor da primeira área de pixel. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser detectados por um processador de sinal configurado para processar sinais de pixel reunidos pelo primeiro sensor. O primeiro estágio de iluminação pode induzir iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir de bases nucleotídicas marcadas A e T, e o segundo estágio de iluminação pode induzir iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases nucleotídicas marcadas C e T.
[0032] Em outra modalidade, é provido um método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas. O método inclui executar uma pluralidade de ciclos de chamada de base, cada ciclo de chamada de base com um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação; O método inclui capturar, em um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra, (1) um primeiro conjunto de valores de intensidade gerado durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada base e (2) um segundo conjunto de valores de intensidade gerado durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base. O método inclui ajustar dezesseis distribuições para o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento. Para um ciclo de chamada de base sucessivo, o método inclui detectar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixels usando o processador de sinal e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos. A distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamento.
[0033] O método pode incluir ajuste que compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de meio k, um algoritmo de agrupamento similar a meio k, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.
[0034] O método pode incluir a normalização dos valores de intensidade.
[0035] A primeira área de pixel pode receber luz de um poço associado na superfície de amostra.
[0036] Em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um receptáculo configurado para reter um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel que subjazem uma pluralidade de agrupamentos durante uma sequência de eventos de amostragem, de modo que os agrupamentos são distribuídos de maneira desigual sobre as áreas de pixel, O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um processador de sinal acoplado ao receptáculo. O processador de sinal é configurado para executar análise da sequência temporal e espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a um número N + M de agrupamentos individuais na superfície da amostra a partir do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo, e para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem para o número N + M de agrupamentos individuais. A pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual sobre as áreas de pixel.
[0037] O processador de sinal pode usar os padrões de iluminação detectados para localizar o número N + M de agrupamentos individuais na superfície da amostra a partir do número N de sensores ativos.
[0038] Em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel e uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel. Os dois poços por área de pixel incluem um poço dominante e um poço subordinado. O poço dominante tem uma seção transversal maior sobre a área de pixel do que o poço subordinado.
[0039] Os dois poços podem ter deslocamentos diferentes em relação ao centro da área de pixel. Durante um evento de amostragem, a área de pixel pode receber quantidades diferentes de iluminação dos dois poços. Cada um dos dois poços pode reter pelo menos um agrupamento durante o evento de amostragem. Durante o evento de amostragem, a área de pixel pode receber uma quantidade de iluminação de um agrupamento brilhante no poço dominante que é maior que uma quantidade de iluminação recebida de um agrupamento escuro no poço subordinado.
[0040] O biossensor pode ser acoplado a um processador de sinal. O processador de sinal pode ser configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas presentes em um número N + M de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos. Para o agrupamento brilhante e escuro, isso pode incluir mapear em pelo menos quatro compartimentos um primeiro sinal de pixel gerado por um sensor correspondente à área de pixels durante um primeiro estágio de iluminação do evento de amostragem, mapear em pelo menos quatro compartimentos um segundo sinal de pixel gerado pelo sensor durante um segundo estágio de iluminação do evento de amostragem e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas presentes no agrupamento brilhante e no agrupamento escuro.
[0041] O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel.
[0042] Ainda em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel e uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um sistema de iluminação. O sistema de iluminação ilumina as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação durante uma sequência de eventos de amostragem, incluindo, para um evento de amostragem na sequência de eventos de amostragem,
iluminar cada um dos poços com iluminação fora do eixo para produzir regiões de poço assimetricamente iluminadas em cada um dos poços.
[0043] As regiões assimetricamente iluminadas de um poço podem incluir pelo menos uma região de poço dominante e uma região de poço subordinado, de modo que durante o evento de amostragem a região de poço dominante é iluminada mais do que a região de poço subordinado. O poço pode reter mais de um agrupamento durante o evento de amostragem, com cada uma das regiões dominante e subordinado do poço incluindo um agrupamento. Durante o evento de amostragem, uma área de pixel sobrepondo o poço pode receber uma quantidade de iluminação de um agrupamento brilhante na região de poço dominante que é maior que uma quantidade de iluminação recebida de um agrupamento escuro na região de poço subordinado.
[0044] A iluminação fora do eixo pode estar em um ângulo de quarenta e cinco graus. Em algumas modalidades, um poço se sobrepõe por área de pixel. Em outras modalidades, dois poços se sobrepõem por área de pixel.
[0045] O biossensor pode ser acoplado a um processador de sinal. O processador de sinal pode ser configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas presentes em um número N + M de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos. Para o agrupamento brilhante e escuro, isso pode incluir mapear em pelo menos quatro compartimentos um primeiro sinal de pixel gerado por um sensor correspondente à área de pixels durante um primeiro estágio de iluminação do evento de amostragem, mapear em pelo menos quatro compartimentos um segundo sinal de pixel gerado pelo sensor durante um segundo estágio de iluminação do evento de amostragem e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas presentes no agrupamento brilhante e no agrupamento escuro.
[0046] O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel.
[0047] De acordo com outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base que compreende um receptáculo configurado para reter um biossensor. O biossensor possui (a) uma superfície de amostra que mantém uma pluralidade de agrupamentos durante uma sequência de eventos de amostragem, (b) uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel e (c) uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel. Cada sensor na matriz detecta informações de um ou mais agrupamentos dispostos nas áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para gerar um sinal de pixel em um evento de amostragem. A matriz possui um número N de sensores ativos e os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um processador de sinal acoplado ao receptáculo. O processador de sinal está configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos. O sinal de pixel para cada evento de amostragem em pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel representa informações detectadas a partir de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente. O processador de sinal usa a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo.
[0048] Os resultados da sequência de eventos de amostragem podem corresponder a bases nucleotídicas nos agrupamentos.
[0049] Os eventos de amostragem podem compreender dois estágios de iluminação em sequência de tempo, e referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel pode incluir um sinal de pixel incluindo informações de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente de cada um dos dois estágios de iluminação.
[0050] O processador de sinal pode incluir lógica para classificar os resultados para dois agrupamentos a partir das sequências de sinais de pixel de referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel. A lógica para classificar resultados para dois agrupamentos pode incluir mapear um primeiro sinal de pixel em referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel de um sensor específico em pelo menos quatro compartimentos, e mapear um segundo sinal de pixel em referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel em pelo menos quatro compartimentos, e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para classificar os resultados para dois agrupamentos.
[0051] Os sensores na matriz de sensores podem compreender detectores de luz.
[0052] Os eventos de amostragem podem compreender dois estágios de iluminação em sequência de tempo, e sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel incluem pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação. O primeiro estágio de iluminação pode induzir a iluminação a partir de um ou mais agrupamentos nas áreas de pixel dos sensores indicando as bases nucleotídicas A e T e o segundo estágio de iluminação induz a iluminação de um ou mais agrupamentos nas áreas de pixel dos sensores indicando as bases nucleotídicas C e T, e os referidos resultados de classificação compreendem a chamada de uma das bases nucleotídicas A, C, T ou G para pelo menos dois agrupamentos usando a referida pelo menos uma sequência.
[0053] Agrupamentos podem ser distribuídos de forma desigual ao longo das áreas de pixel da superfície de amostra, e o processador de sinal pode executar análise de sequência temporal e espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais na superfície de amostra e para classificar os resultados dos eventos de amostragem para agrupamentos individuais. A pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual sobre as áreas de pixel.
[0054] A superfície de amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel, os dois poços por área de pixel podem incluir um poço dominante e um poço subordinado, o poço dominante pode ter uma seção transversal maior ao longo da área de pixel do que o poço subordinado.
[0055] A superfície da amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, e os eventos de amostragem podem incluir pelo menos um estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K podem iluminar as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel podem incluir o número K de sinais de pixel para pelo menos um estágio químico dos eventos de amostragem.
[0056] A superfície da amostra pode compreender uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, e os eventos de amostragem podem incluir um primeiro estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K podem iluminar as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e um segundo estágio químico com um número J de estágios de iluminação, onde J é um número inteiro positivo. Os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K no primeiro estágio químico e dos estágios de iluminação J no segundo estágio químico podem iluminar os poços na matriz de poços com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel podem incluir o número K de sinais de pixel para o primeiro estágio químico mais o número J de sinais de pixel para o segundo estágio químico dos eventos de amostragem.
[0057] Ainda em outra modalidade, é fornecido um biossensor para chamada de base. O biossensor compreende um dispositivo de amostragem. O dispositivo de amostragem inclui uma superfície de amostra que tem uma matriz de áreas de pixel e um gerador de imagens de estado sólido que tem uma matriz de sensores. Cada sensor gera sinais de pixel em cada ciclo de chamada de base. Cada sinal de pixel representa a luz reunida em um ciclo de chamada de base de um ou mais agrupamentos em uma área de pixel correspondente da superfície de amostra. O biossensor compreende adicionalmente um processador de sinal configurado para conexão ao dispositivo de amostragem. O processador de sinal recebe e processa os sinais de pixel dos sensores para chamada de base em um ciclo de chamada de base e usa os sinais de pixel de menos sensores do que um número de base de agrupamentos chamado no ciclo de chamada de base. Os sinais de pixel dos menos sensores incluem pelo menos um sinal de pixel que representa a luz reunida de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente.
[0058] Uma área de pixel pode receber luz de um poço na superfície de amostra e o poço pode reter mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada base.
[0059] Um agrupamento pode compreender uma pluralidade de fragmentos de fita simples que possuem uma sequência de base idêntica.
[0060] Em outra modalidade, é fornecido um método de chamada de base. Para que seja executado um ciclo de chamada de base de uma sequência por síntese (SBS abreviada), o método inclui detectar: (1) um primeiro sinal de pixel que representa a luz reunida a partir de pelo menos dois agrupamentos em uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base e (2) um segundo sinal de pixel que representa luz reunida a partir de referidos pelo menos dois agrupamentos na primeira área de pixel durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base. A primeira área de pixel é subjacente a uma pluralidade de agrupamentos que compartilha a primeira área de pixel. O método inclui usar uma combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas incorporadas em cada agrupamento dos pelo menos dois agrupamentos durante o ciclo de chamada de base.
[0061] O método também pode incluir mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e combinar o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas.
[0062] O método também pode incluir aplicar o método para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixel durante o ciclo de chamada de base.
[0063] O método também pode incluir repetir o método ao longo de sucessivos ciclos de chamada de base para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base.
[0064] Para cada um dos ciclos de chamada de base, o método também pode incluir detecção e armazenamento do primeiro e do segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel e após os ciclos de chamada de base, o uso da combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixels durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
[0065] A primeira área de pixel pode receber luz de um poço associado em uma superfície de amostra. A primeira área de pixel pode receber luz de mais de um poço associado em uma superfície de amostra. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser reunidos por um primeiro sensor da primeira área de pixel. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser detectados por um processador de sinal configurado para processar sinais de pixel reunidos pelo primeiro sensor. O primeiro estágio de iluminação pode induzir iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir de bases nucleotídicas marcadas A e T, e o segundo estágio de iluminação pode induzir iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases nucleotídicas marcadas C e T.
[0066] Em outra modalidade, é provido um método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas. O método inclui executar uma pluralidade de ciclos de chamada de base, cada ciclo de chamada de base com um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação. O método inclui capturar, em um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra, (1) um primeiro conjunto de valores de intensidade gerado durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada base e (2) um segundo conjunto de valores de intensidade gerado durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base. O método inclui ajustar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento. Para um ciclo de chamada de base sucessivo, o método inclui detectar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixels usando o processador de sinal e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos. A distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamento.
[0067] O método pode incluir ajuste que compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de meio k, um algoritmo de agrupamento similar a meio k, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.
[0068] O método pode incluir a normalização dos valores de intensidade.
[0069] A primeira área de pixel pode receber luz de um poço associado na superfície de amostra.
[0070] Em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um receptáculo configurado para reter um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel que subjazem uma pluralidade de agrupamentos durante uma sequência de eventos de amostragem, de modo que os agrupamentos são distribuídos de maneira desigual sobre as áreas de pixel, O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. Cada sensor na matriz detecta informações de um ou mais agrupamentos dispostos nas áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para gerar um sinal de pixel em um evento de amostragem. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um processador de sinal acoplado ao receptáculo. O processador de sinal é configurado para executar análise da sequência temporal e espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a um número N + M de agrupamentos individuais na superfície da amostra a partir do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo, e para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem para o número N + M de agrupamentos individuais. O sinal de pixel para cada evento de amostragem em pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel representa informações detectadas de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente e a pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica diafonia diferencial entre os pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual nas áreas de pixel.
[0071] O processador de sinal pode usar os padrões de iluminação detectados para localizar o número N + M de agrupamentos individuais na superfície da amostra a partir do número N de sensores ativos.
[0072] Em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel e uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, o biossensor incluindo dois poços e dois agrupamentos por área de pixel. Os dois poços por área de pixel incluem um poço dominante e um poço subordinado. O poço dominante tem uma seção transversal maior sobre a área de pixel do que o poço subordinado.
[0073] O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. Cada sensor na matriz detecta informações dos dois agrupamentos dispostos nas áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para gerar um sinal de pixel em um evento de amostragem. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel.
[0074] Os dois poços podem ter deslocamentos diferentes em relação ao centro da área de pixel. Durante um evento de amostragem, a área de pixel pode receber quantidades diferentes de iluminação dos dois poços. O sinal de pixel para cada evento de amostragem em pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel representa informações detectadas a partir dos dois agrupamentos na área de pixel correspondente. Cada um dos dois poços pode reter pelo menos um agrupamento durante o evento de amostragem. Durante o evento de amostragem, a área de pixel pode receber uma quantidade de iluminação de um agrupamento brilhante no poço dominante que é maior que uma quantidade de iluminação recebida de um agrupamento escuro no poço subordinado.
[0075] O biossensor pode ser acoplado a um processador de sinal. O processador de sinal pode ser configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas presentes em um número N + M de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos. Para o agrupamento brilhante e escuro, isso pode incluir mapear em pelo menos quatro compartimentos um primeiro sinal de pixel gerado por um sensor correspondente à área de pixels durante um primeiro estágio de iluminação do evento de amostragem, mapear em pelo menos quatro compartimentos um segundo sinal de pixel gerado pelo sensor durante um segundo estágio de iluminação do evento de amostragem e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas presentes no agrupamento brilhante e no agrupamento escuro.
[0076] Ainda em outra modalidade, é fornecido um dispositivo para chamada de base. O dispositivo compreende um biossensor. O biossensor possui uma superfície de amostra. A superfície de amostra inclui áreas de pixel e uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, com pelo menos dois poços por área de pixel. O dispositivo compreende adicionalmente um sistema de iluminação. O sistema de iluminação ilumina as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação durante uma sequência de eventos de amostragem, incluindo, para um evento de amostragem na sequência de eventos de amostragem, iluminar cada um dos poços com iluminação fora do eixo para produzir regiões de poço assimetricamente iluminadas em cada um dos poços.
[0077] As regiões assimetricamente iluminadas de um poço podem incluir pelo menos uma região de poço dominante e uma região de poço subordinado, de modo que durante o evento de amostragem a região de poço dominante é iluminada mais do que a região de poço subordinado. O poço pode reter mais de um agrupamento durante o evento de amostragem, com cada uma das regiões dominante e subordinado do poço incluindo um agrupamento. Durante o evento de amostragem, uma área de pixel sobrepondo o poço pode receber uma quantidade de iluminação de um agrupamento brilhante na região de poço dominante que é maior que uma quantidade de iluminação recebida de um agrupamento escuro na região de poço subordinado.
[0078] A iluminação fora do eixo pode estar em um ângulo de quarenta e cinco graus. Em algumas modalidades, um poço se sobrepõe por área de pixel. Em outras modalidades, dois poços se sobrepõem por área de pixel.
[0079] O biossensor também possui uma matriz de sensores configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. Cada sensor na matriz detecta informações dos pelo menos dois agrupamentos dispostos nas áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para gerar um sinal de pixel em um evento de amostragem. A matriz possui um número N de sensores ativos. Os sensores na matriz são dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel. O biossensor também tem uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel.
[0080] O biossensor pode ser acoplado a um processador de sinal. O processador de sinal pode ser configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para identificar bases nucleotídicas presentes em um número N + M de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos. Para o agrupamento brilhante e escuro, isso pode incluir mapear em pelo menos quatro compartimentos um primeiro sinal de pixel gerado por um sensor correspondente à área de pixels durante um primeiro estágio de iluminação do evento de amostragem, mapear em pelo menos quatro compartimentos um segundo sinal de pixel gerado pelo sensor durante um segundo estágio de iluminação do evento de amostragem e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas presentes no agrupamento brilhante e no agrupamento escuro.
[0081] Outras características e aspectos da tecnologia divulgada tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada a seguir, tomada em conjunto com os desenhos anexos, que ilustram, a título de exemplo, as características de acordo com modalidades da tecnologia divulgada. Esta breve descrição não se destina a limitar o escopo de quaisquer invenções aqui descritas.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0082] A presente divulgação, de acordo com uma ou mais modalidades, é descrita em detalhes com referência às figuras a seguir. As figuras são fornecidas apenas para fins ilustrativos e meramente representam exemplos de modalidades. Além disso, deve-se notar que, para maior clareza e facilidade de ilustração, os elementos nas figuras não foram necessariamente desenhados em escala.
[0083] Algumas das figuras aqui incluídas ilustram várias modalidades da tecnologia divulgada a partir de diferentes ângulos de visão. Embora o texto descritivo anexo possa se referir a visualizações como vistas “superior”, “inferior” ou “lateral”, essas referências são meramente descritivas e não implicam ou exigem que a tecnologia divulgada seja implementada ou usada em uma orientação espacial específica, a menos que explicitamente indicado de outra forma.
[0084] A Fig. 1 é um diagrama em blocos de um sistema de chamada de base de acordo com uma modalidade.
[0085] A Fig. 2 é um diagrama de blocos de um controlador de sistema que pode ser usado no sistema da Fig. 1.
[0086] A Fig. 3 ilustra uma seção transversal de um biossensor que pode ser usado em várias modalidades. O biossensor da Fig. 3 possui áreas de pixels que podem reter mais de um agrupamento durante um ciclo de chamada de base (por exemplo, 2 agrupamentos por área de pixels).
[0087] A Fig. 4 mostra uma seção transversal de um biossensor que pode ser usado em várias modalidades. O biossensor da Fig. 4 possui poços que podem reter mais de um agrupamento durante um ciclo de chamada base (por exemplo, 2 clusters por poço).
[0088] As Fig. 5A e 5B são gráficos de dispersão que representam chamadas de base de agrupamentos brilhantes e escuros de um par de agrupamentos usando seus respectivos sinais de pixel detectados por um sensor compartilhado (ou pixel) de acordo com uma modalidade.
[0089] A Fig. 6 é um gráfico de dispersão que representa dezesseis distribuições produzidas por valores de intensidade de agrupamentos brilhantes e escuros de um par de agrupamentos, de acordo com uma modalidade.
[0090] A Fig. 7A é uma tabela de detecção que ilustra um esquema de chamada de base para um protocolo de sequenciamento de um corante e dois estágios de iluminação, de acordo com uma modalidade.
[0091] A Fig. 7B é uma tabela de chamada de base que mostra um esquema de classificação para classificar sinais de pixel combinados de agrupamentos brilhantes e escuros de um par de agrupamentos em um dos dezesseis compartimentos de acordo com uma modalidade.
[0092] A Fig. 8 mostra um método de chamada de base analisando os sinais de pixel emitidos por uma pluralidade de agrupamentos que compartilha uma área de pixel de acordo com uma modalidade.
[0093] A Fig. 9 representa um método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas, de acordo com uma modalidade.
[0094] A Fig. 10 ilustra uma vista plana superior de uma superfície de amostra com áreas de pixel nas quais uma pluralidade de agrupamentos é desigualmente distribuída de acordo com uma modalidade.
[0095] A Fig. 11A ilustra uma vista lateral de uma superfície de amostra tendo dois poços por área de pixel, incluindo um poço dominante e um poço subordinado, de acordo com uma modalidade.
[0096] A Fig. 11B representa uma vista superior plana da superfície da amostra da Fig. 11A.
[0097] As Fig. 12A e 12B mostram iluminação fora do eixo de um poço sobrepondo uma área de pixel de uma superfície de amostra.
[0098] A Fig. 12C ilustra regiões de poço assimetricamente iluminadas produzidas pela iluminação fora do eixo das Fig. 12A e 12B de acordo com uma modalidade.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0099] As modalidades aqui descritas podem ser usadas em vários processos e sistemas biológicos ou químicos para análise acadêmica ou comercial. Mais especificamente, as modalidades descritas neste documento podem ser usadas em vários processos e sistemas onde é desejado detectar um evento, propriedade, qualidade ou característica que seja indicativa de uma reação desejada. Por exemplo, modalidades descritas neste documento incluem cartuchos, biossensores e seus componentes, bem como sistemas de bioensaio que operam com cartuchos e biossensores. Em modalidades particulares, os cartuchos e biossensores incluem uma célula de fluxo e um ou mais sensores, pixels, detectores de luz ou fotodiodos que são acoplados juntos em uma estrutura substancialmente unitária.
[00100] Os sistemas de bioensaio podem ser configurados para executar uma pluralidade de reações desejadas que podem ser detectadas individual ou coletivamente. Os sistemas de biossensores e bioensaios podem ser configurados para executar numerosos ciclos nos quais a pluralidade de reações desejadas ocorre em paralelo. Por exemplo, os sistemas de bioensaio podem ser usados para sequenciar uma matriz densa de características de DNA através de ciclos iterativos de manipulação enzimática e aquisição de dados. Como tal, os cartuchos e biossensores podem incluir um ou mais canais microfluídicos que entregam reagentes ou outros componentes de reação a um sítio de reação. Em algumas modalidades, os sítios de reação são desigualmente distribuídos através de uma superfície substancialmente plana. Em outras modalidades, os sítios de reação são padronizados através de uma superfície substancialmente plana de uma maneira predeterminada. Cada um dos sítios de reação pode estar associado a um ou mais sensores, pixels, detectores de luz ou fotodiodos que detectam luz do sítio de reação associado. Ainda em outras modalidades, os sítios de reação estão localizados em câmaras (ou poços) de reação que compartimentam as reações desejadas nas mesmas.
[00101] A seguinte descrição detalhada pode ser melhor compreendida quando lida em conjunto com os desenhos anexos. Na medida em que as figuras ilustram diagramas dos blocos funcionais de várias modalidades, os blocos funcionais não são necessariamente indicativos da divisão entre os circuitos de hardware. Assim, por exemplo, um ou mais dos blocos funcionais (por exemplo, processadores ou memórias) podem ser implementados em uma única peça de hardware (por exemplo, um processador de sinal de uso geral ou memória de acesso aleatório, disco rígido ou semelhante). Da mesma forma, os programas podem ser programas independentes, podem ser incorporados como sub- rotinas em um sistema operacional, podem ser funções em um pacote de software instalado e similares. Deve ser entendido que as várias modalidades não são limitadas aos arranjos e à instrumentalidade mostrados nos desenhos.
[00102] Como usado aqui, um elemento ou etapa recitado no singular e prosseguido com a palavra "um" ou "uma" deve ser entendido como não excluindo o plural dos referidos elementos ou etapas, a menos que tal exclusão seja explicitamente declarada. Além disso, as referências a "uma modalidade" não se destinam a ser interpretadas como excluindo a existência de modalidades adicionais que também incorporam os recursos recitados. Além disso, a menos que seja declarado explicitamente o contrário, as modalidades "compreendendo" ou "tendo" ou "incluindo" um elemento ou uma pluralidade de elementos com uma propriedade específica podem incluir elementos adicionais, independentemente de terem ou não essa propriedade.
[00103] Como aqui utilizado, uma "reação desejada" inclui uma alteração em pelo menos uma das propriedades químicas, elétricas, físicas ou ópticas (ou qualidade) de um analito de interesse. Em modalidades particulares, a reação desejada é um evento de ligação positiva (por exemplo, incorporação de uma biomolécula marcada com fluorescência com o analito de interesse). Mais geralmente, a reação desejada pode ser uma transformação química, alteração química ou interação química. A reação desejada também pode ser uma alteração nas propriedades elétricas. Por exemplo, a reação desejada pode ser uma alteração na concentração de íons dentro de uma solução. As reações exemplares incluem, mas não se limitam a, reações químicas como redução, oxidação, adição, eliminação, rearranjo, esterificação, amidação, eterificação, ciclização ou substituição; interações de ligação nas quais um primeiro produto químico se liga a um segundo produto químico; reações de dissociação nas quais dois ou mais produtos químicos se destacam um do outro; fluorescência; luminescência; bioluminescência;
quimioluminescência; e reações biológicas, tais como replicação de ácido nucleico, amplificação de ácido nucleico, hibridação de ácido nucleico, ligação de ácido nucleico, fosforilação, catálise enzimática, ligação a receptor ou ligação a ligante. A reação desejada também pode ser uma adição ou eliminação de um próton, por exemplo, detectável como uma alteração no pH de uma solução ou ambiente circundante. Uma reação adicional desejada pode ser a detecção do fluxo de íons através de uma membrana (por exemplo, membrana de camada dupla natural ou sintética), por exemplo, quando os íons fluem através de uma membrana, a corrente é interrompida e a interrupção pode ser detectada.
[00104] Em modalidades particulares, a reação desejada inclui a incorporação de uma molécula marcada com fluorescência a um analito. O analito pode ser um oligonucleotídeo e a molécula marcada com fluorescência pode ser um nucleotídeo. A reação desejada pode ser detectada quando uma luz de excitação é direcionada para o oligonucleotídeo com o nucleotídeo marcado, e o fluoróforo emite um sinal fluorescente detectável. Em modalidades alternativas, a fluorescência detectada é resultado de quimioluminescência ou bioluminescência. Uma reação desejada também pode aumentar a transferência de energia de ressonância de fluorescência (ou Förster) (FRET), por exemplo, aproximando um fluoróforo doador de um fluoróforo aceptor, diminuir a FRET separando fluoróforos doadores e aceptores, aumentar a fluorescência separando um extintor de um fluoróforo ou diminuir a fluorescência co-localizando um extintor e fluoróforo.
[00105] Como usado aqui, um "componente de reação" ou "reagente" inclui qualquer substância que possa ser usada para obter a reação desejada. Por exemplo, os componentes da reação incluem reagentes, enzimas, amostras, outras biomoléculas e soluções tampão. Os componentes da reação são tipicamente entregues a um sítio de reação em uma solução e/ou imobilizados em um sítio de reação. Os componentes da reação podem interagir direta ou indiretamente com outra substância, tal como o analito de interesse.
[00106] Como usado aqui, o termo "sítio de reação" é uma região localizada onde uma reação desejada pode ocorrer. Um sítio de reação pode incluir superfícies de suporte de um substrato onde uma substância pode ser imobilizada no mesmo. Por exemplo, um sítio de reação pode incluir uma superfície substancialmente plana em um canal de uma célula de fluxo que possui uma colônia de ácidos nucleicos no mesmo. Tipicamente, mas nem sempre, os ácidos nucleicos da colônia têm a mesma sequência, sendo, por exemplo, cópias clonais de um modelo de fita simples ou dupla. No entanto, em algumas modalidades, um sítio de reação pode conter apenas uma molécula de ácido nucleico única, por exemplo, em uma forma de fita simples ou dupla. Além disso, uma pluralidade de locais de reação pode ser desigualmente distribuída ao longo da superfície de suporte ou disposta de uma maneira predeterminada (por exemplo, lado a lado em uma matriz, tal como em micromatrizes). Um sítio de reação também pode incluir uma câmara de reação (ou poço) que pelo menos parcialmente define uma região ou volume espacial configurado para compartimentar a reação desejada.
[00107] Este pedido usa os termos "câmara de reação" e "poço" de forma intercambiável. Como usado aqui, o termo "câmara de reação" ou "poço" inclui uma região espacial que está em comunicação fluida com um canal de fluxo. A câmara de reação pode ser pelo menos parcialmente separada do ambiente circundante ou de outras regiões espaciais. Por exemplo, uma pluralidade de câmaras de reação pode ser separada umas das outras por paredes compartilhadas. Como um exemplo mais específico, a câmara de reação pode incluir uma cavidade definida pelas superfícies interiores de um poço e ter uma abertura ou orifício para que a cavidade possa estar em comunicação fluida com um canal de fluxo. Os biossensores, incluindo tais câmaras de reação, são descritos em mais detalhes no pedido internacional no. PCT/US2011/057111, depositado em 20 de outubro de 2011, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
[00108] Em algumas modalidades, as câmaras de reação são dimensionadas e modeladas em relação aos sólidos (incluindo semissólidos) para que os sólidos possam ser inseridos, total ou parcialmente, nas mesmas. Por exemplo, a câmara de reação pode ser dimensionada e modelada para acomodar apenas uma esfera de captura. O cordão de captura pode ter DNA amplificado clonicamente ou outras substâncias nele. Alternativamente, a câmara de reação pode ser dimensionada e moldada para receber um número aproximado de esferas ou substratos sólidos. Como outro exemplo, as câmaras de reação também podem ser preenchidas com um gel ou substância porosa que está configurada para controlar a difusão ou filtrar fluidos que podem fluir para a câmara de reação.
[00109] Em algumas modalidades, sensores (por exemplo, detectores de luz, fotodiodos) estão associados às áreas de pixel correspondentes de uma superfície de amostra de um biossensor. Como tal, uma área de pixel é uma construção geométrica que representa uma área na superfície de amostra do biossensor para um sensor (ou pixel). Um sensor que está associado a uma área de pixel detecta emissões de luz coletadas da área de pixel associada quando uma reação desejada ocorre em um sitio de reação ou em uma câmara de reação sobre a área de pixel associada. Em uma modalidade de superfície plana, as áreas de pixel podem se sobrepor. Em alguns casos, uma pluralidade de sensores pode estar associada a um único sítio de reação ou a uma única câmara de reação. Em outros casos, um único sensor pode estar associado a um grupo de locais de reação ou a um grupo de câmaras de reação.
[00110] Como usado neste documento, um "biossensor" inclui uma estrutura que possui uma pluralidade de locais de reação e/ou câmaras de reação (ou poços). Um biossensor pode incluir um dispositivo gerador de imagens de estado sólido (por exemplo, imageador CCD ou CMOS) e, opcionalmente, uma célula de fluxo montada no mesmo. A célula de fluxo pode incluir pelo menos um canal de fluxo que está em comunicação fluida com os locais de reação e/ou as câmaras de reação. Como um exemplo específico, o biossensor é configurado para se acoplar fluida e eletricamente a um sistema de bioensaio. O sistema de bioensaio pode entregar reagentes aos locais de reação e/ou às câmaras de reação de acordo com um protocolo predeterminado (por exemplo, sequenciamento por síntese) e realizar uma pluralidade de eventos de imagiologia. Por exemplo, o sistema de bioensaio pode direcionar soluções para fluir ao longo dos locais de reação e/ou câmaras de reação. Pelo menos uma das soluções pode incluir quatro tipos de nucleotídeos com os mesmos ou diferentes marcadores fluorescentes. Os nucleotídeos podem se ligar aos oligonucleotídeos correspondentes localizados nos locais de reação e/ou nas câmaras de reação. O sistema de bioensaio pode então iluminar os locais de reação e/ou as câmaras de reação usando uma fonte de luz de excitação (por exemplo, fontes de luz de estado sólido, como diodos emissores de luz ou LEDs). A luz de excitação pode ter um comprimento de onda, ou comprimentos de onda, predeterminado(s), incluindo uma gama de comprimentos de onda. Os marcadores fluorescentes excitados fornecem sinais de emissão que podem ser capturados pelos sensores.
[00111] Em modalidades alternativas, o biossensor pode incluir eletrodos ou outros tipos de sensores configurados para detectar outras propriedades identificáveis. Por exemplo, os sensores podem ser configurados para detectar uma mudança na concentração de íons. Em outro exemplo, os sensores podem ser configurados para detectar o fluxo de corrente de íons através de uma membrana.
[00112] Conforme usado neste documento, um "cartucho" inclui uma estrutura que está configurada para reter um biossensor. Em algumas modalidades, o cartucho pode incluir características adicionais, como a fonte de luz (por exemplo, LEDs), que são configuradas para fornecer luz de excitação aos sítios de reação e/ou às câmaras de reação do biossensor. O cartucho também pode incluir um sistema de armazenamento fluídico (por exemplo, armazenamento de reagentes, amostra e tampão) e um sistema de controle fluídico (por exemplo, bombas, válvulas e similares) para transportar fluidamente componentes de reação, amostra e similares para os sítios de reação e/ou câmaras de reação. Por exemplo, depois que o biossensor é preparado ou fabricado, o biossensor pode ser acoplado a um alojamento ou recipiente do cartucho. Em algumas modalidades, os biossensores e os cartuchos podem ser unidades descartáveis independentes. No entanto, outras modalidades podem incluir uma montagem com peças removíveis que permitem ao usuário acessar um interior do biossensor ou cartucho para manutenção ou substituição de componentes ou amostras. O biossensor e o cartucho podem ser acoplados ou acoplados de maneira removível a sistemas de bioensaios maiores, tais como um sistema de sequenciamento, que conduz reações controladas no mesmo.
[00113] Conforme usado aqui, quando os termos "removível" e "acoplado" (ou "engatado") são usados juntos para descrever uma relação entre o biossensor (ou cartucho) e um receptáculo do sistema ou interface de um sistema de bioensaio, o termo se destina a significa que uma conexão entre o biossensor (ou cartucho) e o receptáculo do sistema é facilmente separável sem destruir ou danificar o receptáculo do sistema e/ou o biossensor (ou cartucho). Os componentes são facilmente separáveis quando os componentes podem ser separados um do outro sem esforço indevido ou uma quantidade significativa de tempo gasto na separação dos componentes. Por exemplo, o biossensor (ou cartucho)
pode ser acoplado de forma removível ou engatado ao receptáculo do sistema de maneira elétrica, de modo que os contatos correspondentes do sistema de bioensaio não sejam destruídos ou danificados. O biossensor (ou cartucho) também pode ser acoplado de forma removível ou engatado ao receptáculo do sistema de maneira mecânica, de modo que as características que retêm o biossensor (ou cartucho) não sejam destruídas ou danificadas. Por exemplo, o biossensor (ou cartucho) também pode ser acoplado de forma removível ou engatado ao receptáculo do sistema de maneira fluídica, de tal modo que as portas do receptáculo do sistema não sejam destruídas ou danificadas. O receptáculo do sistema ou um componente não é considerado destruído ou danificado se, por exemplo, apenas um simples ajuste no componente (por exemplo, realinhamento) ou uma substituição simples (por exemplo, a substituição de um bocal) for necessário.
[00114] Como usado neste documento, um "agrupamento" é uma colônia de moléculas semelhantes ou idênticas ou sequências nucleotídicas ou fitas de DNA. Por exemplo, um agrupamento pode ser um oligonucleotídeo amplificado ou qualquer outro grupo de um polinucleotídeo ou polipeptídeo com uma sequência igual ou semelhante. Em outras modalidades, um agrupamento pode ser qualquer elemento ou grupo de elementos que ocupam uma área física em uma superfície de amostra. Em modalidades, os agrupamentos são imobilizados em um sítio de reação e/ou em uma câmara de reação durante um ciclo de chamada de base.
[00115] Como usado aqui, o termo "imobilizado", quando usado em relação a uma biomolécula ou substância biológica ou química, inclui anexar substancialmente a biomolécula ou substância biológica ou química em nível molecular a uma superfície. Por exemplo, uma biomolécula ou substância biológica ou química pode ser imobilizada em uma superfície do material do substrato usando técnicas de adsorção, incluindo interações não covalentes (por exemplo, forças eletrostáticas, van der Waals e desidratação de interfaces hidrofóbicas) e técnicas de ligação covalente onde grupos funcionais ou ligantes facilitam a fixação das biomoléculas na superfície. A imobilização de biomoléculas ou substâncias biológicas ou químicas em uma superfície de um material de substrato pode ser baseada nas propriedades da superfície do substrato, no meio líquido que transporta a biomolécula ou substância biológica ou química, e nas propriedades das biomoléculas ou nas próprias substâncias biológicas ou químicas. Em alguns casos, uma superfície do substrato pode ser funcionalizada (por exemplo, quimicamente ou fisicamente modificada) para facilitar a imobilização das biomoléculas (ou substâncias biológicas ou químicas) na superfície do substrato. A superfície do substrato pode ser modificada primeiro para ter grupos funcionais ligados à superfície. Os grupos funcionais podem então se ligar a biomoléculas ou substâncias biológicas ou químicas para imobilizá-las sobre eles. Uma substância pode ser imobilizada em uma superfície através de um gel, por exemplo, como descrito na Patent Publ. dos EUA US 2011/0059865 A1, que é incorporada neste documento por referência.
[00116] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos podem ser ligados a uma superfície e amplificados usando a amplificação em ponte. Métodos úteis de amplificação em ponte são descritos, por exemplo, na Patente dos EUA Nº. 5.641.658; WO 2007/010251, Pat. Nº. 6.090.592; Publ. de Patentes dos EUA Nº. 2002/0055100 A1; Patente dos EUA Nº.
7.115.400; Publ. de Patentes dos EUA Nº. 2004/0096853 A1; Publ. de Patentes dos EUA Nº. 2004/0002090 A1; Publ. de Patentes dos EUA Nº. 2007/0128624 A1; e Publ. de Patentes dos EUA Nº. 2008/0009420 A1, cada um dos quais é incorporado neste documento na sua totalidade. Outro método útil para amplificar ácidos nucleicos em uma superfície é a amplificação por círculo rolante (RCA), por exemplo, usando métodos descritos em detalhes adicionais abaixo. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos podem ser ligados a uma superfície e amplificados usando um ou mais pares de primers. Por exemplo, um dos primers pode estar em solução e o outro primer pode ser imobilizado na superfície (por exemplo, fixado em 5'). A título de exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode hibridar com um dos primers na superfície, seguida por extensão do primer imobilizado para produzir uma primeira cópia do ácido nucleico. O primer em solução então hibridiza-se com a primeira cópia do ácido nucleico que pode ser estendida usando a primeira cópia do ácido nucleico como molde. Opcionalmente, após a produção da primeira cópia do ácido nucleico, a molécula original de ácido nucleico pode hibridizar-se com um segundo primer imobilizado na superfície e pode ser estendida ao mesmo tempo ou após o primer da solução ser estendido. Em qualquer modalidade, rodadas repetidas de extensão (por exemplo, amplificação) usando o primer imobilizado e o primer em solução fornecem várias cópias do ácido nucleico.
[00117] Em modalidades particulares, os protocolos de ensaio executados pelos sistemas e métodos descritos neste documento incluem o uso de nucleotídeos naturais e também enzimas que são configuradas para interagir com os nucleotídeos naturais. Os nucleotídeos naturais incluem, por exemplo, ribonucleotídeos (RNA) ou desoxirribonucleotídeos (DNA). Os nucleotídeos naturais podem estar na forma mono-, di- ou tri-fosfato e podem ter uma base selecionada de adenina (A), timina (T), uracila (U), guanina (G) ou citosina (C). Deverá entender-se, contudo, que podem ser utilizados nucleotídeos não naturais, nucleotídeos modificados ou análogos dos nucleotídeos acima mencionados. Alguns exemplos de nucleotídeos não naturais úteis são apresentados abaixo em relação ao sequenciamento reversível baseado em terminador por métodos de síntese.
[00118] Em modalidades que incluem câmaras de reação, itens ou substâncias sólidas (incluindo substâncias semissólidas) podem ser dispostos dentro das câmaras de reação. Quando descartado, o item ou sólido pode ser fisicamente retido ou imobilizado dentro da câmara de reação através de um ajuste de interferência, adesão ou aprisionamento. Itens ou sólidos exemplares que podem ser dispostos dentro das câmaras de reação incluem esferas de polímero, pellets, gel de agarose, pós, pontos quânticos ou outros sólidos que podem ser comprimidos e/ou retidos dentro da câmara de reação. Em modalidades particulares, uma superestrutura de ácido nucleico, como uma bola de DNA, pode ser disposta dentro ou em uma câmara de reação, por exemplo, por ligação a uma superfície interior da câmara de reação ou por residência em um líquido dentro da câmara de reação. Uma bola de DNA ou outra superestrutura de ácido nucleico pode ser pré-formada e então descartada na câmara de reação. Alternativamente, uma bola de DNA pode ser sintetizada in situ na câmara de reação. Uma bola de DNA pode ser sintetizada por amplificação por círculo rolante para produzir um concatâmero de uma sequência específica de ácido nucleico e o concatâmero pode ser tratado com condições que formam uma bola relativamente compacta. As esferas de DNA e os métodos para sua síntese são descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente dos EUA Nº. 2008/0242560 A1 ou 2008/0234136 A1, cada uma das quais é incorporada neste documento na sua totalidade. Uma substância que é mantida ou descartada em uma câmara de reação pode estar no estado sólido, líquido ou gasoso.
[00119] Conforme usado neste documento, "chamada de base" identifica uma base de nucleotídeo em uma sequência de ácido nucleico. A chamada de base refere-se ao processo de determinação de uma chamada de base (A, C, G, T) para cada agrupamento em um ciclo específico. Como exemplo, a chamada de base pode ser realizada utilizando métodos e sistemas de quatro canais, dois canais ou um canal descritos nos materiais incorporados da Publicação de Pedido de Patente dos EUA Nº. 2013/0079232. Em modalidades particulares, um ciclo de chamada de base é referido como um "evento de amostragem". Em um protocolo de sequenciamento de um corante e dois canais, um evento de amostragem compreende dois estágios de iluminação em sequência de tempo, de tal modo que um sinal de pixel seja gerado em cada estágio. O primeiro estágio de iluminação induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando bases nucleotídicas A e T em um sinal de pixel AT e o segundo estágio de iluminação induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando bases nucleotídicas C e T em um sinal de pixel CT. Sistema de Chamada de Base
[00120] A Fig. 1 é um diagrama em blocos de um sistema de chamada de base 100, de acordo com uma modalidade. O sistema de chamada de base 100 pode operar para obter qualquer informação ou dados que se relacionem com pelo menos um dentre uma substância biológica ou química. Em algumas modalidades, o sistema de chamada de base 100 é uma estação de trabalho que pode ser semelhante a um dispositivo de bancada ou computador de mesa. Por exemplo, a maioria (ou todos) dos sistemas e componentes para conduzir as reações desejadas pode estar dentro de um alojamento comum 116.
[00121] Em modalidades particulares, o sistema de chamada de base 100 é um sistema de sequenciamento de ácido nucleico (ou sequenciador) configurado para várias aplicações, incluindo, mas não limitado a sequenciamento de novo, ressequenciamento de genomas inteiros ou regiões genômicas alvo e metagenômica. O sequenciador também pode ser usado para análise de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o sistema de chamada de base 100 também pode ser configurado para gerar locais de reação em um biossensor. Por exemplo, o sistema de chamada de base 100 pode ser configurado para receber uma amostra e gerar agrupamentos ligados à superfície de ácidos nucleicos amplificados por clonagem derivados da amostra. Cada agrupamento pode constituir ou fazer parte de um sitio de reação no biossensor.
[00122] O sistema de chamada de base exemplar 100 pode incluir um receptáculo do sistema ou interface 112 que é configurado para interagir com um biossensor 102 para executar reações desejadas dentro do biossensor 102. Na descrição a seguir em relação à Fig. 1, o biossensor 102 é carregado no receptáculo do sistema 112. No entanto, entende-se que um cartucho que inclui o biossensor 102 pode ser inserido no receptáculo do sistema 112 e em alguns estados o cartucho pode ser removido temporariamente ou permanentemente. Como descrito acima, o cartucho pode incluir, entre outras coisas, componentes de armazenamento fluídico e controle fluídico.
[00123] Em modalidades particulares, o sistema de chamada de base 100 é configurado para executar um grande número de reações paralelas dentro do biossensor 102. O biossensor 102 inclui um ou mais sítios de reação onde podem ocorrer as reações desejadas. Os sítios de reação podem ser, por exemplo, imobilizados em uma superfície sólida do biossensor ou imobilizados em esferas (ou outros substratos móveis) que estão localizadas dentro das câmaras de reação correspondentes do biossensor. Os sítios de reação podem incluir, por exemplo, agrupamentos de ácidos nucleicos amplificados por clonagem. O biossensor 102 pode incluir um dispositivo gerador de imagens de estado sólido (por exemplo, imageador CCD ou CMOS) e, opcionalmente, uma célula de fluxo montada no mesmo. A célula de fluxo pode incluir um ou mais canais de fluxo que recebem uma solução do sistema de chamada de base 100 e direcionam a solução para os sítios de reação. Opcionalmente, o biossensor 102 pode ser configurado para engatar um elemento térmico para transferir energia térmica para dentro ou fora do canal de fluxo.
[00124] O sistema de chamada de base 100 pode incluir vários componentes, conjuntos e sistemas (ou subsistemas) que interagem entre si para executar um método ou protocolo de ensaio predeterminado para análise biológica ou química. Por exemplo, o sistema de chamada de base 100 inclui um controlador de sistema 104 que pode se comunicar com os vários componentes, conjuntos e subsistemas do sistema de chamada de base 100 e também o biossensor 102. Por exemplo, além do receptáculo do sistema 112, o sistema de chamada de base 100 pode também incluir um sistema de controle fluídico 106 para controlar o fluxo de fluido através de uma rede de fluido do sistema de chamada de base 100 e do biossensor 102; um sistema de armazenamento de fluido 108 que é configurado para reter todos os fluidos (por exemplo, gás ou líquidos) que podem ser utilizados pelo sistema de bioensaio; um sistema de controle de temperatura 110 que pode regular a temperatura do fluido na rede de fluidos, o sistema de armazenamento de fluido 108 e/ou o biossensor 102; e um sistema de iluminação 109 que está configurado para iluminar o biossensor 102. Como descrito acima, se um cartucho com o biossensor 102 for carregado no receptáculo do sistema 112, o cartucho também pode incluir componentes de armazenamento fluídico e de controle fluídico.
[00125] Também mostrado, o sistema de chamada de base 100 pode incluir uma interface de usuário 114 que interage com o usuário. Por exemplo, a interface do usuário 114 pode incluir uma tela 113 para exibir ou solicitar informações de um usuário e um dispositivo de entrada de usuário 115 para receber entradas do usuário. Em algumas modalidades, a tela 113 e o dispositivo de entrada do usuário 115 são o mesmo dispositivo. Por exemplo, a interface de usuário 114 pode incluir uma tela sensível ao toque configurada para detectar a presença do toque de um indivíduo e também identificar um local do toque na tela. No entanto, outros dispositivos de entrada do usuário 115 podem ser utilizados, como mouse, touchpad, teclado, teclado numérico, scanner portátil, sistema de reconhecimento de voz, sistema de reconhecimento de movimento e similares. Como será discutido em mais detalhes abaixo, o sistema de chamada de base 100 pode se comunicar com vários componentes, incluindo o biossensor 102 (por exemplo, na forma de um cartucho), para realizar as reações desejadas. O sistema de chamada de base 100 também pode ser configurado para analisar dados obtidos do biossensor para fornecer a um usuário as informações desejadas.
[00126] O controlador de sistema 104 pode incluir qualquer sistema baseado em processador ou microprocessador, incluindo sistemas usando microcontroladores, computadores com conjunto de instruções reduzido (RISC), circuitos integrados específicos de aplicação (ASICs), matriz de portas programáveis em campo (FPGAs), circuitos lógicos e qualquer outro circuito ou processador capaz de executar as funções descritas neste documento. Os exemplos acima são apenas exemplares e, portanto, não pretendem limitar de forma alguma a definição e/ou significado do termo controlador de sistema. Na modalidade exemplar, o controlador de sistema 104 executa um conjunto de instruções que são armazenadas em um ou mais elementos, memórias ou módulos de armazenamento, a fim de pelo menos um dentre obter e analisar dados de detecção. Os dados de detecção podem incluir uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, de tal modo que uma sequência de sinais de pixel de cada um dos milhões de sensores (ou pixels) possa ser detectada ao longo de muitos ciclos de chamada de base. Os elementos de armazenamento podem estar na forma de fontes de informação ou elementos de memória física dentro do sistema de chamada base 100.
[00127] O conjunto de instruções pode incluir vários comandos que instruem o sistema de chamada de base 100 ou biossensor 102 a executar operações específicas, como os métodos e processos das várias modalidades descritas neste documento. O conjunto de instruções pode estar na forma de um programa de software, que pode fazer parte de uma mídia ou mídia tangível e não transitória legível por computador. Conforme usado neste documento, os termos "software" e "firmware" são intercambiáveis e incluem qualquer programa de computador armazenado na memória para execução por um computador, incluindo memória RAM, memória ROM, memória EPROM, memória EEPROM e RAM não memória volátil (NVRAM). Os tipos de memória acima são apenas exemplares e, portanto, não limitam os tipos de memória utilizáveis para armazenamento de um programa de computador.
[00128] O software pode estar em várias formas, como software de sistema ou software de aplicativo. Adicionalmente, o software pode estar na forma de uma coleção de programas separados ou de um módulo de programa dentro de um programa maior ou de uma parte de um módulo de programa. O software também pode incluir programação modular na forma de programação orientada a objetos. Após a obtenção dos dados de detecção, os dados de detecção podem ser processados automaticamente pelo sistema de chamada de base 100, processados em resposta às entradas do usuário ou processados em resposta a uma solicitação feita por outra máquina de processamento (por exemplo, uma solicitação remota através de um link de comunicação). Na modalidade ilustrada, o controlador do sistema 104 inclui o processador de sinal 138. Em outras modalidades, o controlador de sistema 104 não inclui o processador de sinal 138 e, em vez disso, tem acesso ao processador de sinal 138 (por exemplo, o processador de sinal 138 pode ser hospedado separadamente na nuvem).
[00129] O controlador de sistema 104 pode ser conectado ao biossensor 102 e aos outros componentes do sistema de chamada de base 100 via links de comunicação. O controlador de sistema 104 também pode ser conectado de forma comunicativa a sistemas ou servidores externos. Os links de comunicação podem ser conectados, com fio ou sem fio. O controlador de sistema 104 pode receber entradas ou comandos do usuário, a partir da interface do usuário 114 e do dispositivo de entrada do usuário 115.
[00130] O sistema de controle fluídico 106 inclui uma rede de fluidos e está configurado para direcionar e regular o fluxo de um ou mais fluidos através da rede de fluidos. A rede de fluido pode estar em comunicação fluida com o biossensor 102 e o sistema de armazenamento de fluido 108. Por exemplo, fluidos selecionados podem ser retirados do sistema de armazenamento de fluido 108 e direcionados para o biossensor 102 de maneira controlada, ou os fluidos podem ser retirados do biossensor 102 e direcionados para, por exemplo, um reservatório de resíduos no sistema de armazenamento de fluidos 108. Embora não mostrado, o sistema de controle fluídico 106 pode incluir sensores de fluxo que detectam uma taxa de fluxo ou pressão dos fluidos dentro da rede de fluidos. Os sensores podem se comunicar com o controlador do sistema
104.
[00131] O sistema de controle de temperatura 110 está configurado para regular a temperatura dos fluidos em diferentes regiões da rede de fluidos, do sistema de armazenamento de fluidos 108 e/ou do biossensor 102. Por exemplo, o sistema de controle de temperatura 110 pode incluir um termociclador que faz interface com o biossensor 102 e controla a temperatura do fluido que flui ao longo dos locais de reação no biossensor 102. O sistema de controle de temperatura 110 também pode regular a temperatura de elementos sólidos ou componentes do sistema de chamada de base 100 ou do biossensor 102. Embora não mostrado, o sistema de controle de temperatura 110 pode incluir sensores para detectar a temperatura do fluido ou outros componentes. Os sensores podem se comunicar com o controlador do sistema 104.
[00132] O sistema de armazenamento de fluido 108 está em comunicação fluida com o biossensor 102 e pode armazenar vários componentes de reação ou reagentes que são utilizados para conduzir as reações desejadas no mesmo. O sistema de armazenamento de fluido 108 também pode armazenar fluidos para lavar ou limpar a rede de fluidos e o biossensor 102 e para diluir os reagentes. Por exemplo, o sistema de armazenamento de fluido 108 pode incluir vários reservatórios para armazenar amostras, reagentes, enzimas, outras biomoléculas, soluções tampão, soluções aquosas e não polares e similares. Além disso, o sistema de armazenamento de fluido 108 pode também incluir reservatórios de resíduos para receber produtos residuais do biossensor 102. Nas modalidades que incluem um cartucho, o cartucho pode incluir um ou mais de um sistema de armazenamento de fluido, sistema de controle fluídico ou sistema de controle de temperatura. Por conseguinte, um ou mais dos componentes estabelecidos neste documento, relacionados a esses sistemas, podem estar contidos dentro de um alojamento de cartucho. Por exemplo, um cartucho pode ter vários reservatórios para armazenar amostras, reagentes, enzimas, outras biomoléculas, soluções tampão, soluções aquosas e não polares, dejetos e similares. Como tal, um ou mais dentre um sistema de armazenamento de fluido, sistema de controle fluídico ou sistema de controle de temperatura podem ser acoplados de forma removível a um sistema de bioensaio por meio de um cartucho ou outro biossensor.
[00133] O sistema de iluminação 109 pode incluir uma fonte de luz (por exemplo, um ou mais LEDs) e uma pluralidade de componentes ópticos para iluminar o biossensor. Exemplos de fontes de luz podem incluir lasers, lâmpadas de arco, LEDs ou diodos a laser. Os componentes ópticos podem ser, por exemplo, refletores, dicroicos, separadores de feixes, colimadores, lentes, filtros, cunhas, prismas, espelhos, detectores e similares. Em modalidades que usam um sistema de iluminação, o sistema de iluminação 109 pode ser configurado para direcionar uma luz de excitação para os locais de reação. Como um exemplo, os fluoróforos podem ser excitados por comprimentos de onda verdes da luz, assim, o comprimento de onda da luz de excitação pode ser de aproximadamente 532 nm. Em uma modalidade, o sistema de iluminação 109 é configurado para produzir iluminação que é paralela a uma superfície normal de uma superfície do biossensor 102. Em outra modalidade, o sistema de iluminação 109 é configurado para produzir iluminação fora do ângulo em relação à superfície normal da superfície do biossensor 102. Em ainda outra modalidade, o sistema de iluminação 109 é configurado para produzir iluminação que tem ângulos plurais, incluindo alguma iluminação paralela e alguma iluminação fora do ângulo.
[00134] O receptáculo ou interface do sistema 112 está configurado para engatar o biossensor 102 de pelo menos um dentre uma maneira mecânica, elétrica e fluídica. O receptáculo do sistema 112 pode reter o biossensor 102 em uma orientação desejada para facilitar o fluxo de fluido através do biossensor 102. O receptáculo do sistema 112 também pode incluir contatos elétricos que são configurados para engatar o biossensor 102, de modo que o sistema de chamada de base 100 possa se comunicar com o biossensor 102 e/ou fornecer energia ao biossensor 102. Além disso, o receptáculo do sistema 112 pode incluir portas fluídicas (por exemplo, bocais) que são configuradas para engatar no biossensor 102. Em algumas modalidades, o biossensor 102 é acoplado de forma removível ao receptáculo do sistema 112 de maneira mecânica, elétrica e também fluídica.
[00135] Além disso, o sistema de chamada de base 100 pode se comunicar remotamente com outros sistemas ou redes ou com outros sistemas de bioensaio 100. Os dados de detecção obtidos pelo (s) sistema (s) de bioensaio 100 podem ser armazenados em um banco de dados remoto.
[00136] A Fig. 2 é um diagrama de blocos de um controlador de sistema 104 que pode ser usado no sistema da Fig. 1. Em uma modalidade, o controlador de sistema 104 inclui um ou mais processadores ou módulos que podem se comunicar entre si. Cada um dos processadores ou módulos pode incluir um algoritmo (por exemplo, instruções armazenadas em um meio de armazenamento legível por computador tangível e/ou não transitório) ou sub-algoritmos para executar processos específicos. O controlador de sistema 104 é ilustrado conceitualmente como uma coleção de módulos, mas pode ser implementado utilizando qualquer combinação de placas de hardware, DSPs, processadores, etc. Alternativamente, o controlador de sistema 104 pode ser implementado utilizando um PC pronto para uso com um único processador ou múltiplos processadores, com as operações funcionais distribuídas entre os processadores. Como uma opção adicional, os módulos descritos abaixo podem ser implementados utilizando uma configuração híbrida na qual certas funções modulares são executadas utilizando hardware dedicado, enquanto as demais funções modulares são executadas utilizando um PC pronto para uso e similares. Os módulos também podem ser implementados como módulos de software dentro de uma unidade de processamento.
[00137] Durante a operação, uma porta de comunicação 120 pode transmitir informações (por exemplo, comandos) ou receber informações (por exemplo, dados) do biossensor 102 (Fig. 1) e/ou dos subsistemas 106, 108, 110 (Fig. 1). Em modalidades, a porta de comunicação 120 pode emitir uma pluralidade de sequências de sinais de pixel. Um link de comunicação 122 pode receber entrada do usuário da interface de usuário 114 (Fig. 1) e transmitir dados ou informações para a interface de usuário 114. Dados do biossensor 102 ou subsistemas 106, 108, 110 podem ser processados pelo controlador de sistema 104 em tempo real durante uma sessão de bioensaio. Adicionalmente ou alternativamente, os dados podem ser armazenados temporariamente na memória do sistema durante uma sessão de bioensaio e processados em uma operação mais lenta que em tempo real ou off-line.
[00138] Como mostrado na Fig. 2, o controlador de sistema 104 pode incluir uma pluralidade de módulos 131-139 que se comunicam com um módulo de controle principal 130. O módulo de controle principal 130 pode se comunicar com a interface de usuário 114 (Fig. 1). Embora os módulos 131-139 sejam mostrados como se comunicando diretamente com o módulo de controle principal 130, os módulos 131-139 também podem se comunicar diretamente entre si, a interface de usuário 114 e o biossensor
102. Além disso, os módulos 131-139 podem se comunicar com o módulo de controle principal 130 através dos outros módulos.
[00139] A pluralidade de módulos 131-139 inclui módulos de sistema 131-133, 139 que se comunicam com os subsistemas 106, 108, 110 e 111, respectivamente. O módulo de controle fluídico 131 pode se comunicar com o sistema de controle fluídico 106 para controlar as válvulas e sensores de fluxo da rede de fluidos para controlar o fluxo de um ou mais fluidos através da rede de fluidos. O módulo de armazenamento de fluido 132 pode notificar o usuário quando os líquidos estiverem baixos ou quando o reservatório de resíduos estiver na capacidade ou próximo a ela. O módulo de armazenamento de fluido 132 também pode se comunicar com o módulo de controle de temperatura 133, para que os fluidos possam ser armazenados a uma temperatura desejada. O módulo de iluminação 139 pode se comunicar com o sistema de iluminação 109 para iluminar os locais de reação em momentos designados durante um protocolo, tal como após as reações desejadas (por exemplo, eventos de ligação) terem ocorrido. Em algumas modalidades, o módulo de iluminação 139 pode se comunicar com o sistema de iluminação 109 para iluminar os locais de reação em ângulos designados.
[00140] A pluralidade de módulos 131-139 também pode incluir um módulo de dispositivo 134 que se comunica com o biossensor 102 e um módulo de identificação 135 que determina informações de identificação relacionadas ao biossensor 102. O módulo de dispositivo 134 pode, por exemplo, se comunicar com o receptáculo do sistema 112 para confirmar que o biossensor estabeleceu uma conexão elétrica e fluídica com o sistema de chamada de base 100. O módulo de identificação 135 pode receber sinais que identificam o biossensor 102. O módulo de identificação 135 pode usar a identidade do biossensor 102 para fornecer outras informações ao usuário. Por exemplo, o módulo de identificação 135 pode determinar e, em seguida, exibir um número de lote, uma data de fabricação ou um protocolo recomendado para ser executado com o biossensor 102.
[00141] A pluralidade de módulos 131-139 também pode incluir um módulo de processamento de sinal ou processador de sinal 138 que recebe e analisa os dados de sinal (por exemplo, dados de imagem) do biossensor 102. O processador de sinal 138 inclui memória 140 (por exemplo, RAM ou Flash) para armazenar dados de detecção. Os dados de detecção podem incluir uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, de tal modo que uma sequência de sinais de pixel de cada um dos milhões de sensores (ou pixels) possa ser detectada ao longo de muitos ciclos de chamada de base. Os dados de sinal podem ser armazenados para análise subsequente ou podem ser transmitidos para a interface do usuário 114 para exibir a informação desejada para o usuário. Em algumas modalidades, os dados de sinal podem ser processados pelo gerador de imagens de estado sólido (por exemplo, sensor de imagem CMOS) antes que o processador de sinal 138 receba os dados de sinal.
[00142] Os módulos de protocolo 136 e 137 se comunicam com o módulo de controle principal 130 para controlar a operação dos subsistemas 106, 108 e 110 ao conduzir protocolos de ensaio predeterminados. Os módulos de protocolo 136 e 137 podem incluir conjuntos de instruções para instruir o sistema de chamada de base 100 para executar operações específicas de acordo com protocolos predeterminados. Como mostrado, o módulo de protocolo pode ser um módulo de sequenciamento por síntese (SBS) 136 que está configurado para emitir vários comandos para executar processos de sequenciamento por síntese. No SBS, a extensão de um primer de ácido nucleico ao longo de um modelo de ácido nucleico é monitorada para determinar a sequência de nucleotídeos no modelo. O processo químico fundamental pode ser polimerização (por exemplo, como catalisada por uma enzima polimerase) ou ligação (por exemplo, catalisada por uma enzima ligase). Em uma modalidade específica de SBS à base de polimerase, os nucleotídeos marcados com fluorescência são adicionados a um primer (deste modo estendendo o primer) de maneira dependente do modelo, de modo que a detecção da ordem e do tipo de nucleotídeos adicionados ao primer possa ser usada para determinar a sequência de o modelo.
Por exemplo, para iniciar um primeiro ciclo SBS, podem ser dados comandos para entregar um ou mais nucleotídeos marcados, DNA polimerase, etc., para / através de uma célula de fluxo que abriga uma matriz de modelos de ácidos nucleicos.
Os moldes de ácido nucleico podem estar localizados nos locais de reação correspondentes.
Os locais de reação em que a extensão do primer faz com que um nucleotídeo marcado seja incorporado podem ser detectados através de um evento de imagiologia.
Durante um evento de geração de imagens, o sistema de iluminação 109 pode fornecer uma luz de excitação para os locais de reação.
Opcionalmente, os nucleotídeos podem incluir ainda uma propriedade de terminação reversível que termina outra extensão do primer uma vez que um nucleotídeo foi adicionado a um primer.
Por exemplo, um análogo de nucleotídeo possuindo uma fração terminadora reversível pode ser adicionado a um primer de modo que a extensão subsequente não possa ocorrer até que um agente de desbloqueio seja entregue para remover a fração.
Assim, para modalidades que usam terminação reversível, um comando pode ser dado para fornecer um reagente de desbloqueio à célula de fluxo (antes ou depois da detecção). Um ou mais comandos podem ser dados para efetuar lavagem(ns) entre as várias etapas de entrega.
O ciclo pode então ser repetido n vezes para estender o primer por n nucleotídeos, detectando assim uma sequência de comprimento n.
Técnicas de sequenciamento exemplares são descritas, por exemplo, em Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 2004/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 2007/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, e US 2008/0108082, cada um dos quais é incorporado aqui por referência.
[00143] Para a etapa de entrega de nucleotídeos de um ciclo SBS, um único tipo de nucleotídeo pode ser entregue de cada vez, ou vários tipos diferentes de nucleotídeos (por exemplo, A, C, T e G juntos) podem ser entregues. Para uma configuração de entrega de nucleotídeos em que apenas um único tipo de nucleotídeo está presente de cada vez, os diferentes nucleotídeos não precisam ter marcadores distintos, já que podem ser distinguidos com base na separação temporal inerente à entrega individualizada. Por conseguinte, um método ou aparelho de sequenciamento pode usar detecção de cor única. Por exemplo, uma fonte de excitação precisa fornecer apenas excitação em um único comprimento de onda ou em uma única faixa de comprimentos de onda. Para uma configuração de entrega de nucleotídeos em que a entrega resulta na presença de múltiplos nucleotídeos diferentes na célula de fluxo ao mesmo tempo, os locais que incorporam diferentes tipos de nucleotídeos podem ser distinguidos com base em diferentes marcadores fluorescentes que são anexados aos respectivos tipos de nucleotídeos na mistura. Por exemplo, podem ser utilizados quatro nucleotídeos diferentes, cada um com um de quatro fluoróforos diferentes. Numa modalidade, os quatro fluoróforos diferentes podem ser distinguidos usando excitação em quatro regiões diferentes do espectro. Por exemplo, quatro fontes diferentes de radiação de excitação podem ser usadas. Alternativamente, podem ser usadas menos de quatro fontes de excitação diferentes, mas a filtragem óptica da radiação de excitação de uma única fonte pode ser usada para produzir diferentes faixas de radiação de excitação na célula de fluxo.
[00144] Em algumas modalidades, menos de quatro cores diferentes podem ser detectadas em uma mistura com quatro nucleotídeos diferentes. Por exemplo, pares de nucleotídeos podem ser detectados no mesmo comprimento de onda, mas distinguidos com base na diferença de intensidade de um membro do par em comparação com o outro, ou com base na alteração de um membro do par (por exemplo, por modificação química, modificação fotoquímica ou modificação física) que faz com que o sinal aparente apareça ou desapareça em comparação com o sinal detectado para o outro membro do par. Aparelhos e métodos exemplares para distinguir quatro nucleotídeos diferentes usando detecção de menos de quatro cores são descritos, por exemplo, no Pedido de Patente US Num. de série 61/538.294 e 61/619.878, que são incorporados aqui por referência em sua totalidade. O Pedido US de número 13/624.200, que foi depositado em 21 de setembro de 2012, é relevante neste contexto e também incorporado por referência em sua totalidade.
[00145] A pluralidade de módulos de protocolo também pode incluir um módulo de preparação de amostra (ou geração) 137 que é configurado para emitir comandos para o sistema de controle fluídico 106 e o sistema de controle de temperatura 110 para amplificar um produto dentro do biossensor 102. Por exemplo, o biossensor 102 pode ser engatado no sistema de chamada de base 100. O módulo de amplificação 137 pode emitir instruções para o sistema de controle fluídico 106 para fornecer componentes de amplificação necessários para as câmaras de reação dentro do biossensor 102. Em outras modalidades, os locais de reação já podem conter alguns componentes para amplificação, como o DNA modelo e / ou primers. Depois de entregar os componentes de amplificação às câmaras de reação, o módulo de amplificação 137 pode-se instruir o sistema de controle de temperatura 110 a percorrer diferentes estágios de temperatura de acordo com protocolos de amplificação conhecidos. Em algumas modalidades, a amplificação e / ou incorporação de nucleotídeos é realizada de maneira isotérmica.
[00146] O módulo SBS 136 pode emitir comandos para executar a PCR de ponte, onde agrupamentos de amplicons clonais são formados em áreas localizadas dentro de um canal de uma célula de fluxo. Depois de gerar os amplicons através de PCR de ponte, os amplicons podem ser "linearizados" para produzir DNA modelo de cadeia simples, ou sstDNA, e um primer de sequenciamento pode ser hibridizado com uma sequência universal que flanqueia uma região de interesse. Por exemplo, um sequenciamento reversível baseado em terminador pelo método de síntese pode ser usado como estabelecido acima ou como a seguir.
[00147] Cada ciclo de chamada ou sequenciamento de bases pode estender um sstDNA por uma única base que pode ser realizada, por exemplo, usando uma polimerase de DNA modificada e uma mistura de quatro tipos de nucleotídeos. Os diferentes tipos de nucleotídeos podem ter marcadores fluorescentes exclusivos e cada nucleotídeo pode ainda ter um terminador reversível que permite que apenas uma incorporação de base única ocorra em cada ciclo. Depois que uma única base é adicionada ao sstDNA, a luz de excitação pode ser incidente nos locais de reação e as emissões fluorescentes podem ser detectadas. Após a detecção, o marcador fluorescente e o terminador podem ser quimicamente clivados a partir do sstDNA. Outro ciclo de chamada ou sequenciamento de base semelhante pode ser seguido. Em tal protocolo de sequenciamento, o módulo SBS 136 pode instruir o sistema de controle fluídico 106 a direcionar um fluxo de soluções de reagentes e enzimas através do biossensor 102. Exemplos de métodos SBS baseados em terminador reversível que podem ser utilizados com o aparelho e métodos aqui descritos são descritos na Publicação do Pedido de Patente US No. 2007/0166705 A1, Publicação do Pedido de Patente US No 2006/0188901 A1, Patente US No 7.057.026, Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. 2006/0240439 A1, Publicação do Pedido de Patente dos EUA No. 2006/0281109 A1, Publicação do PCT Nº WO 2005/065814, Publicação do Pedido de Patente dos EUA Nº 2005/0100900 A1, Publicação PCT Nº WO 2006/064199 e Publicação PCT No. WO 2007/010251, cada uma das quais é incorporada aqui por referência na sua totalidade. Reagentes exemplares para SBS baseado em terminador reversível são descritos nos documentos US 7.541.444; US 7.057.026; US 7.414.116; US 7.427.673; US 7.566.537;
US 7.592.435 e WO 2007/135368, cada um dos quais é incorporado aqui por referência na sua totalidade.
[00148] Em algumas modalidades, os módulos de amplificação e SBS podem operar em um único protocolo de ensaio em que, por exemplo, o ácido nucleico modelo é amplificado e subsequentemente sequenciado dentro do mesmo cartucho.
[00149] O sistema de chamada de base 100 também pode permitir ao usuário reconfigurar um protocolo de ensaio. Por exemplo, o sistema de chamada de base 100 pode oferecer opções ao usuário através da interface do usuário 114 para modificar o protocolo determinado. Por exemplo, se for determinado que o biossensor 102 deve ser usado para amplificação, o sistema de chamada de base 100 pode solicitar uma temperatura para o ciclo de recozimento. Além disso, o sistema de chamada de base 100 pode emitir avisos para um usuário se um usuário tiver fornecido entradas de usuário que geralmente não são aceitáveis para o protocolo de ensaio selecionado.
[00150] Nas modalidades, o biossensor 102 inclui milhões de sensores (ou pixels), cada um dos quais gera uma pluralidade de sequências de sinais de pixel ao longo de sucessivos ciclos de chamada de base. O processador de sinal 130 detecta a pluralidade de sequências de sinais de pixel e os atribui aos sensores (ou pixels) correspondentes de acordo com a localização em linha e / ou coluna dos sensores em uma matriz de sensores. Biossensores
[00151] A Fig. 3 ilustra uma seção transversal de um biossensor 300 que pode ser usado em várias modalidades. O biossensor 300 possui áreas de pixels 306', 308', 310 ', 312' e 314 'que podem conter mais de um agrupamento durante um ciclo de chamada de base (por exemplo, 2 agrupamentos por área de pixel). O biossensor 300 pode ter características semelhantes ao biossensor 102 (Fig. 1) descrito acima e pode ser usado,
por exemplo, no cartucho. Como mostrado, o biossensor 300 pode incluir uma célula de fluxo 302 que é montada em um dispositivo de amostragem
304. Na modalidade ilustrada, a célula de fluxo 302 é fixada diretamente no dispositivo de amostragem 304. No entanto, em modalidades alternativas, a célula de fluxo 302 pode ser acoplada de forma removível ao dispositivo de amostragem 304. O dispositivo de amostragem 304 tem uma superfície de amostra 334 que pode ser funcionalizada (por exemplo, quimicamente ou fisicamente modificada de uma maneira adequada para conduzir as reações desejadas). Por exemplo, a superfície de amostra 334 pode ser funcionalizada e pode incluir uma pluralidade de áreas de pixels 306', 308', 310', 312' e 314' que podem, cada uma, conter mais de um agrupamento durante um ciclo de chamada de base (por exemplo, cada tendo um par de agrupamentos correspondente 306AB, 308AB, 310AB, 312AB e 314AB imobilizados no mesmo). Cada área de pixel é associada a um sensor correspondente (ou pixel ou fotodiodo) 306, 308, 310, 312 e 314, de modo que a luz recebida pela área de pixel seja capturada pelo sensor correspondente. Uma área de pixel 306' também pode ser associada a um local de reação 306'' correspondente na superfície da amostra 334 que contém um par de agrupamentos, de modo que a luz emitida pelo local de reação 306'' seja recebida pela área de pixel 306' e capturada pelo sensor correspondente 306. Como resultado dessa estrutura de detecção, no caso em que dois ou mais agrupamentos estão presentes em uma área de pixel de um sensor específico durante um ciclo de chamada de base (por exemplo, cada um com um par de agrupamento correspondente), o sinal de pixel nesse ciclo de chamada de base carrega informações com base em todos os dois ou mais agrupamentos. Como resultado, o processamento de sinal, conforme descrito aqui, é usado para distinguir cada agrupamento, onde há mais agrupamentos do que sinais de pixel em um dado evento de amostragem de um ciclo de chamada de base específico.
[00152] Na modalidade ilustrada, a célula de fluxo 302 inclui as paredes laterais 338, 340 e uma tampa de fluxo 336 que é suportada pelas paredes laterais 338, 340. As paredes laterais 338, 340 são acopladas à superfície da amostra 334 e se estendem entre a tampa de fluxo 336 e as paredes laterais 338, 340. Em algumas modalidades, as paredes laterais 338, 340 são formadas a partir de uma camada adesiva curável que liga a tampa de fluxo 336 ao dispositivo de amostragem 304.
[00153] As paredes laterais 338, 340 são dimensionadas e modeladas de modo que exista um canal de fluxo 344 entre a tampa de fluxo 336 e o dispositivo de amostragem 304. Como mostrado, o canal de fluxo 344 pode incluir uma altura H1 que é determinada pelas paredes laterais 338, 340. A altura H1 pode estar entre cerca de 50-400 µm (micrômetro) ou, mais particularmente, cerca de 80-200 µm. Na modalidade ilustrada, a altura H1 é de cerca de 100 µm. A tampa de fluxo 336 pode incluir um material que é transparente à luz de excitação 301 que se propaga a partir de um exterior do biossensor 300 para o canal de fluxo
344. Como mostrado na Fig. 3, a luz de excitação 301 se aproxima da cobertura de fluxo 336 em um ângulo não ortogonal. No entanto, isso se dá apenas para fins ilustrativos, pois a luz de excitação 301 pode se aproximar da cobertura de fluxo 336 de diferentes ângulos.
[00154] Também mostrada, a tampa de fluxo 336 pode incluir portas de entrada e saída 342, 346 que são configuradas para engatar-se fluidamente a outras portas (não mostradas). Por exemplo, as outras portas podem ser do cartucho ou da estação de trabalho. O canal de fluxo 344 é dimensionado e configurado para direcionar um fluido ao longo da superfície da amostra 334. A altura H1 e outras dimensões do canal de fluxo 344 podem ser configuradas para manter um fluxo substancialmente uniforme de um fluido ao longo da superfície da amostra 334. As dimensões do canal de fluxo 344 também podem ser configuradas para controlar a formação de bolhas.
[00155] Como mostrado na Figura 3 exemplificativa, as paredes laterais 338, 340 e a tampa de fluxo 336 são componentes separados que são acoplados um ao outro. Em modalidades alternativas, as paredes laterais 338, 340 e a tampa de fluxo 336 podem ser integralmente formadas de modo que as paredes laterais 338, 340 e a tampa de fluxo 336 sejam formadas a partir de uma peça contínua de material. A título de exemplo, a cobertura de fluxo 336 (ou a célula de fluxo 302) pode compreender um material transparente, como vidro ou plástico. A tampa de fluxo 336 pode constituir um bloco substancialmente retangular com uma superfície externa plana e uma superfície interna plana que define o canal de fluxo 344. O bloco pode ser montado nas paredes laterais 338, 340. Alternativamente, a célula de fluxo 302 pode ser gravada para definir a cobertura de fluxo 336 e as paredes laterais 338, 340. Por exemplo, um recesso pode ser gravado no material transparente. Quando o material gravado é montado no dispositivo de amostragem 304, o recesso pode se tornar o canal de fluxo
344.
[00156] O dispositivo de amostragem 304 pode ser semelhante a, por exemplo, um circuito integrado compreendendo uma pluralidade de camadas de substrato empilhadas 320-326. As camadas de substrato 320- 326 podem incluir um substrato base 320, um gerador de imagens de estado sólido 322 (por exemplo, sensor de imagem CMOS), um filtro ou camada de gerenciamento de luz 324 e uma camada de passivação 326. Deve-se notar que o acima exposto é apenas ilustrativo e que outras modalidades podem incluir menos ou camadas adicionais. Além disso, cada uma das camadas de substrato 320-326 pode incluir uma pluralidade de subcamadas. Como será descrito em mais detalhes abaixo, o dispositivo de amostragem 304 pode ser fabricado usando processos semelhantes aos utilizados na fabricação de circuitos integrados, como sensores de imagem CMOS e CCDs. Por exemplo, as camadas de substrato 320-326 ou porções das mesmas podem ser crescidas, depositadas, gravadas e processos semelhantes para formar o dispositivo de amostragem 304.
[00157] A camada de passivação 326 é configurada para proteger a camada de filtro 324 do ambiente fluídico do canal de fluxo 344. Em alguns casos, a camada de passivação 326 também é configurada para fornecer uma superfície sólida (isto é, a superfície da amostra 334) que permite que biomoléculas ou outros analitos de interesse sejam imobilizados nela. Por exemplo, cada um dos locais de reação pode incluir um agrupamento de biomoléculas que são imobilizadas na superfície da amostra 334. Assim, a camada de passivação 326 pode ser formada de um material que permite que os locais de reação sejam imobilizados nela. A camada de passivação 326 também pode compreender um material que é pelo menos transparente a uma luz fluorescente desejada. A título de exemplo, a camada de passivação 326 pode incluir nitreto de silício (Si3N4) e / ou sílica (SiO2). No entanto, outros materiais adequados podem ser utilizados. Na modalidade ilustrada, a camada de passivação 326 pode ser substancialmente plana. No entanto, em modalidades alternativas, a camada de passivação 326 pode incluir recessos, tais como cavidades, poços, ranhuras e similares. Na modalidade ilustrada, a camada de passivação 326 tem uma espessura que é de cerca de 150-200 nm e, mais particularmente, cerca de 170 nm.
[00158] A camada de filtro 324 pode incluir vários recursos que afetam a transmissão de luz. Em algumas modalidades, a camada de filtro 324 pode executar múltiplas funções. Por exemplo, a camada de filtro 324 pode ser configurada para (a) filtrar sinais de luz indesejados, como sinais de luz de uma fonte de luz de excitação; (b) direcionar sinais de emissão dos locais de reação em direção aos sensores correspondentes 306, 308, 310, 312 e 314 que são configurados para detectar os sinais de emissão dos locais de reação; ou (c) bloquear ou impedir a detecção de sinais de emissão indesejados de locais de reação adjacentes. Como tal, a camada de filtro 324 também pode ser referida como uma camada de gerenciamento de luz. Na modalidade ilustrada, a camada de filtro 324 tem uma espessura que é de cerca de 1-5 µm e, mais particularmente, cerca de 3-4 µm. Em modalidades alternativas, a camada de filtro 324 pode incluir uma matriz de microlentes ou outros componentes ópticos. Cada uma das microlentes pode ser configurada para direcionar sinais de emissão de um local de reação associado para um sensor.
[00159] Em algumas modalidades, o gerador de imagens de estado sólido 322 e o substrato de base 320 podem ser fornecidos juntos como um dispositivo de imagiologia de estado sólido construído anteriormente (por exemplo, chip CMOS). Por exemplo, o substrato de base 320 pode ser uma bolacha de silício e o gerador de imagens de estado sólido 322 pode ser montado no mesmo. O gerador de imagens de estado sólido 322 inclui uma camada de material semicondutor (por exemplo, silício) e os sensores 306, 308, 310, 312 e 314. Na modalidade ilustrada, os sensores são fotodiodos configurados para detectar luz. Em outras modalidades, os sensores compreendem detectores de luz. O gerador de imagens de estado sólido 322 pode ser fabricado como um único chip através de processos de fabricação baseados em CMOS.
[00160] O gerador de imagens de estado sólido 322 pode incluir uma matriz densa de sensores 306, 308, 310, 312 e 314 que são configurados para detectar atividade indicativa de uma reação desejada de dentro ou ao longo do canal de fluxo 344. Em algumas modalidades, cada sensor possui uma área de pixel (ou área de detecção) que é de cerca de 1-3 micrômetros quadrados (µm²). A matriz pode incluir 500.000 sensores, 5 milhões de sensores, 10 milhões de sensores ou até 130 milhões de sensores. Os sensores 306, 308, 310, 312 e 314 podem ser configurados para detectar um comprimento de onda de luz predeterminado que é indicativo das reações desejadas.
[00161] Em algumas modalidades, o dispositivo de amostragem 304 inclui um arranjo de microcircuito, como o arranjo de microcircuito descrito na Patente US No. 7.595.883, que é incorporada aqui por referência na totalidade. Mais especificamente, o dispositivo de amostragem 304 pode compreender um circuito integrado com uma matriz plana dos sensores 306, 308, 310, 312 e 314. A matriz dos sensores 306, 308, 310, 312 e 314 pode ser acoplada comunicativamente a um decodificador de linha e um amplificador ou decodificador de coluna. O amplificador de coluna também pode ser acoplado de forma comunicativa a um conversor de analógico para digital de coluna (coluna ADC/Mux). Outros circuitos podem ser acoplados aos componentes acima, incluindo um processador de sinal digital e memória. O circuito formado dentro do dispositivo de amostragem 304 pode ser configurado para pelo menos um dentre amplificação, digitalização, armazenamento e processamento de sinal. O circuito pode coletar e analisar a luz fluorescente detectada e gerar sinais de pixel (ou sinais de detecção) para comunicar dados de detecção ao processador de sinal 138. O circuito também pode executar processamento de sinal analógico e / ou digital adicional no dispositivo de amostragem 304. O dispositivo de amostragem 304 pode incluir vias condutoras 330 que executam o roteamento de sinal (por exemplo, transmitem os sinais de pixel para o processador de sinal 138). Os sinais de pixel também podem ser transmitidos através de contatos elétricos 332 do dispositivo de amostragem 304.
[00162] No entanto, o dispositivo de amostragem 304 não é limitado às construções ou usos acima, como descrito acima. Em modalidades alternativas, o dispositivo de amostragem 304 pode assumir outras formas. Por exemplo, o dispositivo de amostragem 304 pode compreender um dispositivo CCD, como uma câmera CCD, que é acoplada a uma célula de fluxo ou é movida para interagir com uma célula de fluxo com locais de reação nela. Em outras modalidades, o dispositivo de amostragem 304 pode ser um sensor fabricado por CMOS, incluindo transistores de efeito de campo quimicamente sensíveis (chemFET), transistores de efeito de campo sensíveis a íons (ISFET) e / ou transistores de efeito de campo semicondutores de óxido de metal (MOSFET). Tais modalidades podem incluir uma matriz de transistores de efeito de campo (FET) que podem ser configurados para detectar uma alteração nas propriedades elétricas dentro das câmaras de reação. Por exemplo, os FET podem detectar pelo menos uma alteração na presença e concentração de vários analitos. A título de exemplo, a matriz de FETs pode monitorar alterações na concentração de íons hidrogênio. Tais dispositivos de amostragem são descritos em mais detalhes é a Publicação de Pedido de Patente US No. 2009/0127589, que é incorporada por referência em sua totalidade para o uso da compreensão de tais matrizes FET.
[00163] A Fig. 4 mostra uma seção transversal de um biossensor 400 que pode ser usado em várias modalidades. O biossensor 400 possui poços 406, 408, 410, 412 e 414 que podem conter mais de um agrupamento durante um ciclo de chamada de base (por exemplo, 2 agrupamentos por poço). A superfície da amostra 334 pode ser substancialmente plana, como mostrado na Fig. 3. No entanto, em modalidades alternativas, a superfície da amostra 334 pode ser configurada para definir poços (ou câmaras de reação) onde cada poço tem um ou mais locais de reação. Os poços podem ser definidos por, por exemplo, paredes do poço que efetivamente separam os locais de reação de um poço dos locais de reação de um poço adjacente.
[00164] Como mostrado na Fig. 4, os poços 406, 408, 410, 412 e 414 podem ser distribuídos em um padrão ao longo da superfície da amostra 334. Por exemplo, os poços 406, 408, 410, 412 e 414 podem estar localizados em linhas e colunas ao longo da superfície da amostra 334 de uma maneira semelhante a uma micro matriz. No entanto, entende-se que vários padrões dos poços 406, 408, 410, 412 e 414 podem ser utilizados.
Em modalidades particulares, cada um dos poços 406, 408, 410, 412 e 414 inclui mais de um agrupamento de biomoléculas (por exemplo, oligonucleotídeos) que são imobilizados na superfície da amostra 334. Por exemplo, o poço 406 possui o par de agrupamento 306AB, o poço 408 possui o par de agrupamento 308AB, o poço 410 possui o par de agrupamento 310AB, o poço 412 possui o par de agrupamento 312AB e o poço 414 possui o par de agrupamento 314AB.
[00165] Os sensores são configurados para detectar sinais de luz que são emitidos de dentro dos poços. Em modalidades particulares, as áreas de pixel 306', 308', 310', 312' e 314' também podem ser associadas aos poços correspondentes 406, 408, 410, 412 e 414 na superfície da amostra 334, de modo que a luz emitida pela os poços 406, 408, 410, 412 e 414 são recebidos pelas áreas de pixel associadas 306', 308', 310', 312' e 314' e capturados pelos sensores correspondentes 306, 308, 310, 312 e
314.
[00166] Nas modalidades, a superfície da amostra 334 tem uma posição fixa em relação ao dispositivo de amostragem 304, de modo que os poços 406, 408, 410, 412 e 414 tenham localizações espaciais conhecidas em relação a pelo menos um sensor (ou pixel) predeterminado. O pelo menos um sensor predeterminado detecta a atividade das reações desejadas do poço de sobreposição. Como tal, os poços 406, 408, 410, 412 e 414 podem ser atribuídos a pelo menos um dos sensores 306, 308, 310, 312 e 314. Para este fim, o circuito do dispositivo de amostragem 304 pode incluir núcleos que associam automaticamente sinais de pixel (ou sinais de detecção) fornecidos pelos sensores predeterminados 306, 308, 310, 312 e 314 com os poços atribuídos 406, 408, 410, 412, e 414. A título de exemplo, quando os sinais de pixel são gerados pelo sensor 306 mostrado na FIG. 4, os sinais de pixel serão automaticamente associados ao poço 406 mostrado na FIG. 4. Essa configuração pode facilitar o processamento e a análise dos dados de detecção. Por exemplo, os sinais de pixel de um poço podem ser localizados automaticamente em uma determinada posição na matriz, com base na decodificação em linhas e / ou em colunas.
[00167] Em algumas modalidades, os sensores (ou pixels) estão subjacentes ou abaixo dos agrupamentos. Em outras modalidades, os sensores (ou pixels) estão sobrepostos ou no topo dos agrupamentos. Em ainda outras modalidades, os sensores (ou pixels) estão ao lado dos agrupamentos (por exemplo, à direita e / ou à esquerda). Chamada de base de agrupamento múltiplo por sensor (ou pixel)
[00168] Nas modalidades, a tecnologia divulgada aumenta a taxa de transferência do biossensor 300 usando sinais de pixel de menos sensores (ou pixels) do que um número de agrupamentos de base chamado em um ciclo de chamada de base. Em modalidades particulares, se o biossensor 300 possui N sensores ativos, a tecnologia divulgada usa sinais de pixel dos N sensores ativos para basear os agrupamentos N + M de chamada, em que M é um número inteiro positivo. Nas modalidades, isso é alcançado chamando vários agrupamentos por sensor (ou pixel), como descrito abaixo.
[00169] Nas modalidades, um sensor (ou pixel) na superfície da amostra 334 é configurado para receber emissões de luz de pelo menos dois agrupamentos. Em algumas modalidades, o sensor recebe simultaneamente as emissões de luz de pelo menos dois agrupamentos.
[00170] Em modalidades particulares, a intensidade das respectivas emissões de luz dos dois agrupamentos é significativamente diferente, de modo que um dos dois agrupamentos é um agrupamento "brilhante" e o outro é um agrupamento "escuro". Nas modalidades, os valores de intensidade variam entre os ciclos de chamada de base e, portanto, a classificação de brilhante e escuro também pode mudar entre os ciclos. Em outras modalidades, um agrupamento brilhante é referido como um agrupamento "principal" ou "dominante" e um agrupamento escuro é referido como um agrupamento "menor" ou "subordinado". Alguns exemplos de proporções de valores de intensidade de emissões entre agrupamentos brilhantes e escuros incluem 0,55: 0,45, 0,60: 0,40, 0,65: 0,35, 0,70: 0,30, 0,75: 0,25, 0,80: 0,20, 0,85: 0,15, 0,90: 0,10 e 0,95: 0,05 .
[00171] Em ainda outras modalidades, os pelo menos dois agrupamentos não são agrupamentos brilhantes e escuros, mas agrupamentos com intensidades diferentes ou agrupamentos que geram tipos diferentes de sinais.
[00172] Durante cada evento de amostragem (por exemplo, cada estágio de iluminação ou cada estágio de aquisição de imagem), o processador de sinal 138 recebe um sinal comum de pixel único para pelo menos dois agrupamentos (por exemplo, os agrupamentos brilhantes e escuros). O pixel comum e único gerado em cada evento de amostragem inclui / representa / reflete / transmite emissões de luz / sinais de intensidade / informações capturadas / detectadas pela luz para ou a partir de pelo menos dois agrupamentos (por exemplo, os agrupamentos brilhantes e escuros). Em outras palavras, os pelo menos dois agrupamentos (por exemplo, os agrupamentos brilhantes e escuros) contribuem para o pixel único e comum gerado em cada evento de amostragem. Consequentemente, as emissões de luz de pelo menos dois agrupamentos (por exemplo, os agrupamentos brilhante e escuro) são detectadas simultaneamente em cada evento de amostragem e o pixel comum, único, reflete as emissões de luz dos pelo menos dois agrupamentos (por exemplo, o brilhante e o escuro) agrupamentos).
[00173] Por exemplo, nas Figs. 3 e 4, o par de agrupamento 306AB inclui dois agrupamentos 306A e 306B que compartilham um sensor
306. Como tal, o agrupamento 306A pode ser o agrupamento escuro e o agrupamento 306B pode ser o agrupamento brilhante, dependendo de seus respectivos valores de intensidade. O processador de sinal 138 usa então um algoritmo de chamada de base para classificar os sinais de pixel dos agrupamentos brilhantes e escuros em uma das dezesseis distribuições,
como descrito abaixo. Em modalidades particulares, o agrupamento brilhante e escuro co-ocupam um poço, como o poço 406. Assim, o emparelhamento de agrupamento pode ser definido com base em uma área de pixel compartilhada ou em um poço compartilhado, ou em ambos.
[00174] As Figs. 5A e 5B são gráficos de dispersão 500A e 500B que representam chamadas de base dos agrupamentos brilhantes e escuros usando seus respectivos sinais de pixel detectados pelo sensor compartilhado de acordo com uma modalidade. O eixo X dos gráficos de dispersão 500A e 500B representa os sinais de pixel AT detectados durante um segundo estágio de iluminação do evento de amostragem que induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando as bases nucleotídicas A e T. O eixo Y dos gráficos de dispersão 500A e 500B representa os sinais de pixel do CT detectados durante um primeiro estágio de iluminação de um evento de amostragem que induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando as bases C e T dos nucleotídeos.
[00175] O gráfico de dispersão 500A mostra quatro distribuições 502, 504, 506 e 508 nas quais o processador de sinal 138 classifica os sinais de pixel do agrupamento brilhante. Na modalidade ilustrada, a distribuição 502 representa a base nucleotídica C no agrupamento brilhante, a distribuição 504 representa a base nucleotídica T no agrupamento brilhante, a distribuição 506 representa a base nucleotídica G no agrupamento brilhante e a distribuição 508 representa a base nucleotídica A no agrupamento brilhante.
[00176] O gráfico de dispersão 500B mostra dezesseis subdistribuições (ou distribuições) 502A-D, 504A-D, 506A-D e 508A-D, com quatro subdistribuições para cada uma das quatro distribuições 502, 504, 506 e 508 do gráfico de dispersão 500A), ao qual o processador de sinal 138 classifica os sinais de pixel do agrupamento escuro. Na modalidade ilustrada, subdistribuições anotadas com a letra "A" representam a base nucleotídica C no agrupamento escuro, subdistribuições anotadas com a letra "B" representam a base nucleotídica T no agrupamento escuro, subdistribuições anotadas com a letra "C" representam a base nucleotídica G no agrupamento escuro e as subdistribuições anotadas com a letra "D" representam a base nucleotídica A no agrupamento escuro. Em outras modalidades, diferentes codificações das bases podem ser usadas. Quando o processador de sinal classifica sinais de pixel de um agrupamento escuro em uma das dezesseis subdistribuições, a classificação do agrupamento brilhante correspondente é determinada pela distribuição que inclui a subdistribuição do agrupamento escuro. Por exemplo, se um agrupamento escuro é classificado como subdistribuição 508B (base de nucleotídeo T), a distribuição para o agrupamento brilhante correspondente é 508 (base de nucleotídeo A). Como resultado, a base do processador de sinal 138 chama o agrupamento brilhante como A e o agrupamento escuro como T.
[00177] A Fig. 6 é um gráfico de dispersão 600 que representa dezesseis distribuições (ou compartimentos) reproduzidas por valores de intensidade de agrupamentos brilhantes e escuros de um par de agrupamentos, de acordo com uma modalidade. Nas modalidades, as dezesseis caixas são produzidas ao longo de uma pluralidade de ciclos de chamada de base. O processador de sinal 138 combina sinais de pixel dos agrupamentos brilhantes e escuros e os mapeia em um dos dezesseis compartimentos. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 612 para um ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como C e o agrupamento escuro como C. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 614 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como C e o agrupamento escuro como T. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 616 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como C e o agrupamento escuro como G. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 618 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como C e o agrupamento escuro como A.
[00178] Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 622 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como T e o agrupamento escuro como C. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 624 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como T e o agrupamento escuro como T. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 626 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como T e o agrupamento escuro como G. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 628 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como T e o agrupamento escuro como A.
[00179] Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 632 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como G e o agrupamento escuro como C. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 634 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como G e o agrupamento escuro como T. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 636 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como G e o agrupamento escuro como G. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 638 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como G e o agrupamento escuro como A
[00180] Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 642 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como A e o agrupamento escuro como C. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 644 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como A e o agrupamento escuro como T. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 646 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como A e o agrupamento escuro como G. Quando os sinais de pixel combinados são mapeados para o compartimento 648 para o ciclo de chamada de base, o processador de sinal 138 basicamente chama o agrupamento brilhante como A e o agrupamento escuro como A.
[00181] A Fig. 7A é uma tabela de detecção 700A que ilustra um esquema de chamada de base para um protocolo de sequenciamento de um corante e dois estágios de iluminação, de acordo com uma modalidade. Uma via de diferenciação entre as diferentes estratégias para detectar a incorporação de nucleotídeos em uma reação de sequenciamento usando um corante fluorescente (ou dois ou mais corantes dos mesmos ou semelhantes espectros de excitação / emissão) é caracterizando as incorporações em termos de presença ou ausência relativa, ou níveis intermediários de transição de fluorescência que ocorre durante um ciclo de sequenciamento. Como tal, as estratégias de sequenciamento podem ser exemplificadas pelo seu perfil fluorescente para um ciclo de sequenciamento. Para estratégias aqui divulgadas, "1" e "0" denotam um estado fluorescente no qual um nucleotídeo está em um estado de sinal (por exemplo, detectável por fluorescência) ou se um nucleotídeo está em um estado escuro (por exemplo, não detectado ou minimamente detectado em uma etapa de imagem). Um estado "0" não se refere necessariamente a uma falta total ou ausência de sinal. O sinal de fluorescência mínimo ou diminuído (por exemplo, sinal de fundo) também é contemplado para ser incluído no escopo de um estado "0", desde que uma alteração na fluorescência do primeiro para o segundo evento de iluminação (ou vice- versa) possa ser distinguida com segurança. Em uma modalidade, uma estratégia exemplar para detectar e determinar a incorporação de nucleotídeos em uma reação de sequenciamento usando um corante fluorescente (ou dois corantes do mesmo ou similar espectro de excitação / emissão) e dois eventos de iluminação é exemplificado pela tabela de detecção 700A.
[00182] Na modalidade ilustrada, durante o primeiro estágio de iluminação (sinal AT), a base nucleotídica A é marcada ou ativada (representada pelo bit 1), a base nucleotídica C é desmarcada ou desativada (representada pelo bit 0), a base nucleotídica G é marcada ou desativada (representado pelo bit 0), e a base nucleotídica T está marcada ou ligada (representada pelo bit 1). Durante o segundo estágio de iluminação (sinal de CT), a base nucleotídica A é desmarcada ou desativada (representada pelo bit 0), a base nucleotídica C é marcada ou ativada (representada pelo bit 1), a base nucleotídica G é marcada ou desativada (representada pelo bit 0 ) e a base nucleotídica T está marcada ou ligada (representada pelo bit 1).
[00183] A Fig. 7B é uma tabela de chamada de base 700B que mostra um esquema de classificação para classificar sinais de pixel combinados, cada sinal de pixel incluindo informações dos agrupamentos brilhantes e escuros de um par de agrupamentos, em um dos dezesseis compartimentos de acordo com uma modalidade.
[00184] A tecnologia divulgada gera um sinal de pixel que representa a informação detectada em todos os agrupamentos múltiplos em uma área de pixel de um sensor compartilhado. Uma sequência desses sinais de pixel de pan-agrupamento é mapeada para compartimentos para fazer chamada de base a todos os agrupamentos. Assim, um sinal de pixel separado e discreto para cada agrupamento não é gerado. Isso tem a vantagem de uma redução múltipla na aquisição de imagens, reduzindo o tempo de sequenciamento e acelerando o processamento da sequência.
[00185] Considere a FIG. 7B em que um agrupamento brilhante e um agrupamento escuro em uma área de pixel são basicamente chamados. Em cada ciclo, são amostrados dois sinais de pixels: um sinal AT e um sinal CT. Durante o primeiro evento de amostragem, as emissões de luz dos agrupamentos brilhantes e escuros das adeninas marcadas com fluorescência (A) e das timinas (T) são registradas no sinal AT, em oposição a dois sinais AT separados, ou seja, um para o agrupamento brilhante e outro para o agrupamento escuro. Da mesma forma, durante o segundo evento de amostragem, as emissões de luz dos agrupamentos brilhantes e escuros para citosinas marcadas com fluorescência (C) e timinas (T) são registradas no sinal do CT, em oposição a dois sinais de TC separados, ou seja, um para o agrupamento brilhante e outro para o agrupamento escuro.
[00186] Dessa forma, as emissões de luz de ambos os agrupamentos são recebidas durante um único evento de amostragem e produzem um sinal comum de pixel único. Portanto, para cada evento de amostragem, as emissões dos agrupamentos brilhantes e escuros são representadas em conjunto em um sinal comum de pixel único.
[00187] Além disso, uma sequência única e comum de sinais de pixel é usada para fazer chamada de base juntamente tanto dos agrupamentos brilhantes como escuros de cada ciclo. Na FIG. 7B, os sinais AT e CT juntos formam a sequência única e comum de sinais de pixel. Assim, a tecnologia divulgada não utiliza duas sequências separadas de sinais de pixel, ou seja, uma para o agrupamento brilhante e outra para o agrupamento escuro, para chamar separadamente os agrupamentos brilhantes e escuros. Isso tem a vantagem da redução múltipla no processamento do sinal e, assim, reduz o tempo de sequenciamento e acelera o processamento da sequência.
[00188] A chamada de base divulgada envolve o mapeamento da sequência única e comum de sinais de pixel para os compartimentos. Por exemplo, na FIG. 7B, com os valores 1 e 0, a sequência dos sinais AT e CT é mapeada para o compartimento 1 e os agrupamentos brilhantes e escuros recebem as chamadas de base A e A, respectivamente.
[00189] No exemplo mostrado na FIG. 7B, é usada uma razão determinística de intensidade de agrupamento brilhante para escuro de 0,7: 0,3. Nas modalidades, a taxa de intensidade é indeterminada, como tal, produz agrupamentos brilhantes e escuros detectáveis que compartilham uma área de pixel ou compartilham um poço, ou ambos.
[00190] Como o índice de intensidade é de 0,7: 0,3 (ou seja, os valores de intensidade das emissões de luz dos agrupamentos brilhantes e escuros são significativamente diferentes), os sinais de pixel são lidos pelo sensor compartilhado durante os dois estágios de iluminação em uma pluralidade de ciclos de chamada de base produz dezesseis caixas 701 (caixas 1-16). Cada compartimento possui um par exclusivo de valores de sinal de pixel (por exemplo, par exclusivo 710 para o compartimento 1), o par compreende um primeiro valor de sinal de pixel 706 para os dois agrupamentos no primeiro estágio de iluminação (sinal AT) e um segundo valor de sinal de pixel 708 para os dois agrupamentos no segundo estágio de iluminação (sinal de TC).
[00191] Cada valor de sinal de pixel 706 ou 708 é, por sua vez, composto por duas porções de sinal 706A e 706B ou 708A e 708B, que são combinadas de maneira aditiva para produzir os correspondentes valores de sinal de pixel 706 ou 708. Assim, um sinal comum de pixel único é gerado nos agrupamentos brilhantes e escuros.
[00192] Para cada valor de sinal de pixel 706 ou 708, uma primeira porção de sinal 706A ou 708A é determinada a partir do valor de intensidade das emissões de luz pelo primeiro agrupamento e uma segunda porção de sinal 706B ou 708B é determinada a partir do valor de intensidade de emissões de luz pelo segundo agrupamento. No exemplo mostrado na tabela de chamada de base 700B, o primeiro agrupamento é o agrupamento brilhante 702 e o segundo agrupamento é o agrupamento escuro 704.
[00193] Como a taxa de intensidade é de 0,7: 0,3, o primeiro e o segundo sinais de pixel podem assumir um dos quatro valores possíveis - 1, 0, 0,7 ou 0,3. Além disso, quando o agrupamento brilhante produz um bit "on", sua porção de contribuição ou sinal (706A, 708A) é 0,7. Por outro lado, quando o agrupamento escuro produz um bit "on", sua porção de contribuição ou sinal (706B, 708B) é de 0,3. Uma porção de contribuição ou sinal representando um bit "off" é identificada por 0 para ambos os agrupamentos. Dezesseis combinações únicas dos quatro valores possíveis 1, 0, 0,7 e 0,3 produzem os dezesseis compartimentos 701.
[00194] Uma vez que os dezesseis compartimentos 701 são identificados pelo processador de sinal 138 para um par de agrupamento brilhante-escuro sobrejacente a um sensor compartilhado ou bem ao longo de uma pluralidade de ciclos de chamada de base, o processador de sinal 138 usa a tabela de chamada de base 700B para fazer chamada de base do agrupamento brilhante e escuro em ciclos sucessivos de chamadas de base. Em uma modalidade, a identificação resulta na classificação do poço e na retenção de mais de um agrupamento (isto é, o agrupamento brilhante e o agrupamento escuro). Assim, em um ciclo de chamada de base sucessivo, o processador de sinal executa uma primeira leitura de pixel do sensor compartilhado para o primeiro estágio de iluminação (sinal AT). Essa primeira leitura de pixel produz um primeiro sinal de pixel. Da mesma forma, uma segunda leitura de pixel para o segundo estágio de iluminação
(sinal CT) produz um segundo sinal de pixel. O primeiro e o segundo sinais de pixel produzem valores de intensidade que são combinados para formar um par de valores. Este par de valores pode ser comparado com um dos dezesseis pares de valores exclusivos na tabela de chamada de base 700B. Com base na comparação, um dos dezesseis compartimentos é selecionado. A chamada de base para os agrupamentos brilhantes e escuros é feita de acordo com as bases de nucleotídeos atribuídas à posição selecionada. Este processo é repetido para ciclos subsequentes de chamada de bases para identificar bases nucleotídicas presentes nas respectivas sequências nucleotídicas do agrupamento brilhante e escuro.
[00195] Portanto, a tecnologia divulgada trata as emissões de todos os agrupamentos como úteis para chamadas de base, independentemente de sua força relativa. Isso ocorre porque os agrupamentos que possuem emissões mais fracas (por exemplo, agrupamento escuro) não são basicamente chamados em separado; em vez disso, são denominados conjuntamente com agrupamento que possuem emissões mais fortes (por exemplo, agrupamento brilhante), usando uma sequência única e comum de sinais de pixel, transmitindo as emissões mais fortes e mais fracas.
[00196] Como discutido acima, o sensor compartilhado captura fótons de dois agrupamentos diferentes (por exemplo, um agrupamento brilhante e um agrupamento escuro). Em algumas modalidades, as porções de sinal são detectadas deconvoluindo as leituras de sinal do sensor compartilhado para distinguir as porções de sinal individuais geradas por cada um dos agrupamentos.
[00197] A Fig. 8 mostra um método 800 de chamada de base analisando os sinais de pixel emitidos por uma pluralidade de agrupamentos que compartilha uma área de pixel de acordo com uma modalidade. Na ação 802, um primeiro sinal de pixel que representa a luz coletada de vários agrupamentos em uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base é detectado. Em algumas modalidades, a primeira área de pixel recebe luz de um poço associado na superfície da amostra 334. Em outras modalidades, a primeira área de pixel recebe luz de mais de um poço associado na superfície da amostra 334.
[00198] Na ação 804, um segundo sinal de pixel que representa a luz coletada de vários agrupamentos na primeira área de pixel durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base é detectado.
[00199] Nas modalidades, a primeira área de pixel é subjacente a uma pluralidade de agrupamentos que compartilham a primeira área de pixel. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser reunidos por um primeiro sensor da primeira área de pixel. O primeiro e o segundo sinais de pixel podem ser detectados pelo processador de sinal 138, que está configurado para processar sinais de pixel reunidos pelo primeiro sensor.
[00200] Em algumas modalidades, o primeiro estágio de iluminação pode induzir a iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases de nucleotídeos A e T, e o segundo estágio de iluminação pode induzir a iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases de nucleotídeos C marcadas e T.
[00201] Na ação 806, uma combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel é usada para identificar bases nucleotídicas incorporadas em cada agrupamento da pluralidade de agrupamentos durante o ciclo de chamada da base. Nas modalidades, isso inclui mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e combinar o mapeamento do primeiro e segundo sinais de pixel para a chamada de base.
[00202] Nas modalidades, o método 800 é aplicado para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixels durante o ciclo de chamada da base. Nas modalidades, o método 800 é repetido ao longo de ciclos sucessivos de chamada de base para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base.
[00203] Em algumas modalidades, para cada um dos ciclos de chamada de base, o primeiro e o segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixels são detectados e armazenados. Após os ciclos de chamada de base, a combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel é usada para identificar as bases de nucleotídeo incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
[00204] A Fig. 9 representa um método 900 para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento na superfície 334 do biossensor 300 e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas, de acordo com uma modalidade. Na ação 902, uma pluralidade de ciclos de chamada de base é realizada. Cada ciclo de chamada de base tem um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação.
[00205] Na ação 904, um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra 334 captura - (a) um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base e (b) um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base. Nas modalidades, os valores de intensidade são normalizados. Ainda em algumas modalidades, a primeira área de pixel recebe luz de um poço associado na superfície da amostra 334.
[00206] Na ação 906, o processador de sinal 138 ajusta (mostrado na Fig. 6) aos primeiro e segundo conjuntos de valores de intensidade a um de um conjunto de distribuições (onde uma distribuição é uma área no gráfico bidimensional da Figura 6), incluindo dezesseis distribuições neste exemplo. E, com base no ajuste, classifica a área de pixel como tendo mais de um agrupamento. Nas modalidades, o processador de sinal 138 usa um ou mais algoritmos para ajustar as dezesseis distribuições. Exemplos de algoritmos incluem algoritmo de agrupamento média-k, algoritmo de agrupamento média-k-, algoritmo de maximização de expectativa e algoritmo baseado em histograma.
[00207] Na ação 908, para um ciclo de chamada de base sucessivo, o processador de sinal 138 detecta o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixels. Na ação 910, o processador de sinal 138 seleciona uma distribuição para o grupo de agrupamentos dentre as dezesseis distribuições. A distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamento.
[00208] Em algumas modalidades, as proporções de intensidade são uma propriedade inerente dos agrupamentos brilhantes e escuros que produzem emissões de luz significativamente diferentes. Em outras modalidades, a intensidade e os coeficientes significativamente diferentes de luz de emissões entre os agrupamentos são acionados pelas seguintes modalidades, tais como distribuição desigual de agrupamentos em uma superfície plana, poços duplos por sensor (ou pixel), e fora do eixo iluminação. Análise espacial de Superfície Plana dos agrupamentos Distribuídos de Forma Desigual
[00209] A Fig. 10 ilustra uma vista plana superior 1000 da superfície de amostra 334 com áreas de pixels (representadas como retângulos) nas quais uma pluralidade de agrupamentos (representados como círculos) é distribuída de maneira desigual de acordo com uma modalidade. As posições dos agrupamentos no poço de superfície 334 não podem ser confinadas pelos poços em relação às localizações dos sensores (ou pixels). Esse arranjo de agrupamentos na superfície da amostra 334 é referido como distribuição desigual. Em modalidades particulares, os agrupamentos são distribuídos desigualmente em uma configuração "plana" da superfície de amostra 334 que não inclui poços. Em uma modalidade de superfície plana, as áreas de pixel podem se sobrepor.
[00210] Na modalidade ilustrada, considere dois agrupamentos exemplares 1002 e 1004 que compartilham quatro áreas de pixel A, B, C e D. Dependendo da posição relativa do agrupamento em relação aos centros das áreas de pixel A, B, C e D, os sensores (ou pixels) correspondentes recebem quantidades diferentes de emissões de luz. Isso produz padrões de iluminação que criam interferência diferencial entre os agrupamentos 1002 e 1004 ao longo de uma pluralidade de ciclos de chamada de base de uma execução de sequenciamento, que podem ser usados para construir um mapa de locais de agrupamento na superfície da amostra 334, como descrito abaixo. A interferência diferencial é incorporada nos sinais de pixel como informação de dois ou mais agrupamentos em um sinal de pixel.
[00211] O processador de sinal 138 executa a sequência temporal e a análise espacial de uma pluralidade de sequências de sinais de pixel para os agrupamentos para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais desigualmente distribuídos na superfície da amostra 334. A pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual sobre as áreas de pixel.
[00212] A análise espacial inclui o uso das sequências de sinais de pixel coletadas de um grupo de áreas de pixel para determinar características espaciais de um determinado agrupamento, incluindo a localização do determinado agrupamento na superfície de amostra 334. Depois que as localizações do agrupamento e seus padrões de iluminação são identificados ao longo da pluralidade de ciclos de chamada de base, os agrupamentos podem ser basicamente chamados pelo processador de sinal 138 usando um dos protocolos de sequenciamento discutidos acima.
[00213] Na modalidade de análise espacial, a tecnologia divulgada aumenta a taxa de transferência do biossensor 300 usando sensores N (ou pixels) para localizar e fazer chamada base dos agrupamentos N + M desigualmente distribuídos na superfície da amostra 334, onde M é um número inteiro positivo. Em algumas modalidades, M é igual a N ou quase igual a N. Em outras modalidades, quando dois agrupamentos, que compartilham (ou co-ocupam) uma área de pixel e / ou poço, não são detectáveis separadamente devido à diferença inadequada nos valores de intensidade, M pode não ser igual a N ou até menor que N. Poços duplos por sensor (ou pixel)
[00214] A Fig. 11A ilustra uma vista lateral 1100A de uma superfície de amostra tendo dois poços por área de pixel, incluindo um poço dominante (ou maior) e um poço subordinado (ou menor), de acordo com uma modalidade. A Fig. 11B representa uma vista superior plana 1100B da superfície da amostra da Fig. 11A.
[00215] Na modalidade ilustrada, o sensor compartilhado 1106 (ou pixel) corresponde a dois poços 1102 e 1104 na superfície de amostra
334. O poço dominante tem uma seção transversal maior sobre a área de pixel do que o poço subordinado. O poço 1104 é o poço dominante e o poço 1102 é o poço subordinado porque o poço 1104 tem uma seção transversal maior em relação ao sensor 1106.
[00216] Nas modalidades, os dois poços têm deslocamentos diferentes em relação a um centro da área de pixel 1106'. Na modalidade ilustrada, o poço dominante 1104 é mais próximo ao centro da área de pixel 1106A do que o poço subordinado 1102 (isto é, o poço dominante 1104 tem um deslocamento menor em relação ao centro da área de pixel 1106A do que o poço subordinado 1102).
[00217] Devido ao resultado da cobertura da seção transversal diferencial e dos desvios relativos, o sensor 1106 recebe quantidades diferentes de iluminação dos dois poços durante os estágios de iluminação do ciclo de chamada de base (ou evento de amostragem). Uma vez que cada um dos poços 1102 e 1104 contém um agrupamento correspondente 1102A e 1104A, as diferentes quantidades de iluminação permitem a identificação de um dos agrupamentos como brilhante (ou maior) e o outro como escuro (ou menor). Na modalidade ilustrada, o agrupamento 1102A dentro do poço dominante 1102 é identificado como o agrupamento brilhante e o agrupamento 1104A dentro do poço subordinado 1104 é identificado como o agrupamento escuro. Nas modalidades, o sensor 1106 recebe uma quantidade de iluminação do agrupamento brilhante 1102A que é maior que uma quantidade de iluminação recebida do agrupamento escuro 1104A no poço subordinado 1104.
[00218] Depois que os agrupamentos brilhantes e escuros são identificados, eles podem ser chamados pelo processador de sinal 138 usando um dos protocolos de sequenciamento discutidos acima. Em algumas modalidades de poço duplo por sensor (ou pixel), a tecnologia divulgada aumenta a taxa de transferência do biossensor 300 por fazer chamada de base de dois agrupamentos 1102A e 1102B mantidos por dois poços correspondentes 1102 e 1104 usando um sensor compartilhado
1106. Em outras modalidades de poço duplo por sensor (ou pixel), a tecnologia divulgada aumenta a taxa de transferência do biossensor 300 usando sensores N para fazer chamada de base de agrupamentos N + M nos poços N + M correspondentes da superfície da amostra 334, onde M é um número inteiro positivo. Em algumas modalidades, M é igual a N ou quase igual a N. Em outras modalidades, M pode não ser igual a N ou mesmo ser menor que N. Iluminação Fora do Eixo
[00219] As Figs. 12A e 12B mostram iluminação fora do eixo 1200A e 1200B de um poço sobrepondo uma área de pixel de uma superfície de amostra. O sistema de iluminação 109 é configurado para iluminar as áreas de pixel 1204 'e 1214' (associadas aos sensores 1204 e 1214) com diferentes ângulos dos sinais de iluminação 1201 e 1211 durante os estágios de iluminação de um ciclo de chamada de base. Como resultado, os poços 1202 e 1212 são iluminados com sinais de iluminação fora do eixo ou não ortogonais. Isso produz regiões de poço iluminadas assimetricamente em cada um dos poços 1202 e 1212, representados nas Figs. 12A e 12B com áreas sombreadas claras e escuras em cada poço. As regiões de poço iluminadas assimetricamente de um poço incluem pelo menos uma região de poço dominante 1202B' ou 1212A' (representada em tom mais brilhante) e uma região de poço subordinada 1202A' ou 1212 B' (representada em tom mais escuro), de modo que durante a chamada de base ciclo, a região dominante do poço é iluminada mais do que a região subordinada do poço.
[00220] Cada poço é configurado para armazenar mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada de base, com as regiões dominantes e subordinadas do poço, cada uma incluindo um agrupamento. Na modalidade ilustrada, o poço 1202 contém dois agrupamentos 1202A e 1202B, com o agrupamento 1202A dentro da região subordinada do poço 1202A 'e o agrupamento 1202B dentro da região dominante do poço 1202B'. O poço 1212 contém dois agrupamentos 1212A e 1212B, com o agrupamento 1212A na região dominante do poço 1212A' e o agrupamento 1212B dentro da região subordinada do poço 1202B'.
[00221] Devido à iluminação fora do eixo, as áreas de pixel 1204' e 1214' dos poços 1202 e 1212 recebem quantidades diferentes de iluminação das regiões dominantes e subordinadas de um poço. Como resultado, durante o ciclo de chamada de base, os agrupamentos nas regiões dominantes do poço produzem maiores quantidades de iluminação do que os agrupamentos nas regiões subordinadas do poço. Para cada poço, isso permite a identificação de um dos agrupamentos como brilhante (ou maior) e o outro como escuro (ou menor). Na modalidade ilustrada, para o poço 1202, o agrupamento 1202B dentro da região dominante do poço 1202B' é identificado como o agrupamento brilhante e o agrupamento 1202A dentro da região subordinada do poço 1202A' é identificado como o agrupamento escuro. Para o poço 1212, o agrupamento 1212A na região dominante do poço 1212A' é identificado como o agrupamento brilhante e o agrupamento 1212B dentro da região subordinada do poço 1212B' é identificado como o agrupamento escuro.
[00222] Depois que os agrupamentos brilhantes e escuros são identificados para cada poço, eles podem ser chamados pelo processador de sinal 138 usando um dos protocolos de sequenciamento discutidos acima. Na modalidade de iluminação fora do eixo, a tecnologia divulgada aumenta a taxa de transferência do biossensor 300 usando N sensores (ou pixels) para fazer chamada de base de N + M dentro de poços iluminados não ortogonais N na superfície da amostra 334, onde M é um positivo inteiro. Em algumas modalidades, M é igual a N ou quase igual a N. Em outras modalidades, quando dois agrupamentos, que compartilham (ou co- ocupam) uma área de pixel e / ou poço, não são detectáveis separadamente devido à diferença inadequada nos valores de intensidade, M pode não ser igual a N ou até menor que N.
[00223] Em uma modalidade, a iluminação fora do eixo está em um ângulo de 45 graus. Em algumas modalidades, um poço se sobrepõe por área de pixel. Em outras modalidades, dois poços se sobrepõem por área de pixel.
[00224] A Fig. 12C ilustra regiões de poço assimetricamente iluminadas 1200C produzidas pela iluminação fora do eixo das Figs. 12A e 12B de acordo com uma modalidade. Como mostrado na Fig. 12C, a região do poço 1220 é mais iluminada do que a região do poço 1230.
Cláusulas
[00225] A divulgação também inclui as seguintes cláusulas:
1. Dispositivo para chamada de base, em que compreende: um receptáculo e um biossensor, o receptáculo segurando o biossensor, o biossensor com uma superfície de amostra que retém uma pluralidade de agrupamentos (agrupamentos) durante uma sequência de eventos de amostragem, uma matriz de sensores configurados para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, a matriz tendo um número N de sensores ativos, os sensores na matriz dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N das áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel, e uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel; e um processador de sinal acoplado ao receptáculo e configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo.
2. O dispositivo da cláusula 1, em que os resultados da sequência de eventos de amostragem correspondem a bases nucleotídicas nos agrupamentos.
3. O dispositivo da cláusula 1 ou cláusula 2, em que os eventos de amostragem compreendem dois estágios de iluminação na sequência de tempo e as sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel incluem um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação.
4. O dispositivo da cláusula 3, em que o processador de sinal inclui lógica para classificar resultados para dois agrupamentos a partir das sequências de sinais de pixel de um único sensor na matriz de sensores.
5. O dispositivo da cláusula 4, em que a lógica para classificar os resultados para dois agrupamentos inclui o mapeamento de um primeiro sinal de pixel do conjunto de amostras de sinal para um evento de amostragem de um sensor específico em pelo menos quatro compartimentos e o mapeamento de um segundo sinal de pixel do conjunto de amostras de sinal para o evento de amostragem em pelo menos quatro compartimentos e combinando logicamente o mapeamento dos primeiro e segundo sinais de pixel para classificar os resultados para dois agrupamentos.
6. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 1 a 5, em que os sensores na matriz de sensores compreendem detectores de luz.
7. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 1 a 6, em que os eventos de amostragem compreendem dois estágios de iluminação na sequência de tempo e as sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel incluem um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação, e em que o primeiro estágio de iluminação induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando as bases de nucleotídeos A e T e o segundo estágio de iluminação induz a iluminação de um determinado agrupamento indicando as bases de nucleotídeos C e T, e os referidos resultados de classificação compreendem a chamada de uma das bases nucleotídicas A, C, T ou G.
8. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas de 1 a 7, em que a superfície de amostra retém agrupamentos que são distribuídos de forma desigual ao longo das áreas de pixel, e o processador de sinal executa a sequência de tempo e a análise espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais na superfície de amostra e para classificar os resultados dos eventos de amostragem para os agrupamentos individuais, em que a pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual ao longo das áreas de pixel.
9. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 1 a 8, em que a superfície da amostra compreende uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel, os dois poços por área de pixel, incluindo um poço dominante e um poço subordinado, o poço dominante tendo uma seção transversal maior sobre a área de pixel do que o poço subordinado.
10. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 1 a 9, em que a superfície da amostra compreende uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel e os eventos de amostragem incluem pelo menos um estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo, em que os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K iluminam as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação e as sequências de sinais de pixel incluem um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo o número K de sinais de pixel para pelo menos um produto químico estágio dos eventos de amostragem.
11. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 1 a 10, em que a superfície da amostra compreende uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, e os eventos de amostragem incluem um primeiro estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo, em que estágios de iluminação dos estágios de iluminação K iluminam as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e um segundo estágio químico com um número J de estágios de iluminação onde J é um número inteiro positivo, onde os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K no primeiro estágio químico e dos estágios de iluminação J no segundo estágio químico iluminam os poços na matriz de poços com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel incluem um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo o número K de sinais de pixel para o primeiro estágio químico mais o número J de sinais de pixel para o segundo estágio químico dos eventos de amostragem.
12. Um biossensor para chamada de base que compreende: um dispositivo de amostragem, o dispositivo de amostragem incluindo uma superfície de amostra com uma matriz de áreas de pixel e um gerador de imagens de estado sólido com uma matriz de sensores, cada sensor gerando sinais de pixel em cada ciclo de chamada de base, cada sinal de pixel representando luz reunida a partir de uma área de pixel correspondente da superfície de amostra; e um processador de sinal configurado para conexão com o dispositivo de amostragem que recebe e processa os sinais de pixel dos sensores para chamada de base em um ciclo de chamada de base e usa os sinais de pixel de menos sensores do que um número de agrupamentos de base chamados no ciclo de chamada de base.
13. O biossensor, de acordo com a cláusula 12, em que uma área de pixel recebe luz de um poço na superfície de amostra e o poço é configurado para reter mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada de base.
14. O biossensor da cláusula 13, em que um agrupamento compreende uma pluralidade de fragmentos de ácido desoxirribonucleico
(DNA abreviado) de cadeia simples com uma sequência de ácido nucleico idêntica.
15. Método implementado por computador de chamada de base, incluindo: para um ciclo de chamada de base de um sequenciamento por síntese (abreviado como SBS) executar e receber de uma porta de comunicação uma pluralidade de sequências de sinais, a pluralidade de pluralidade de sequências de sinais de pixel sendo gerada por uma matriz de sensores, a matriz tendo um número N de sensores ativos, os sensores na matriz dispostos em relação à superfície da amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N das áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel, e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos , incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos a partir do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo.
16. O método da cláusula 15, incluindo ainda: mapear um primeiro sinal de pixel, que representa a luz coletada de uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base, em pelo menos quatro compartimentos e mapear um segundo sinal de pixel, que representa a luz coletada da primeira área de pixel durante uma segunda fase de iluminação do ciclo de chamada de base, em pelo menos quatro posições, e combinar o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas.
17. O método da cláusula 15 ou cláusula 16, incluindo ainda a aplicação do método para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixel durante o ciclo de chamada de base.
18. O método, da cláusula 17, incluindo adicionalmente repetir o método ao longo de sucessivos ciclos de chamada de base nucleotídica para identificar as bases incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base.
19. O método da cláusula 18, incluindo adicionalmente: para cada um dos ciclos de chamada de base, detectar e armazenar o primeiro e o segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel, e após os ciclos de chamada de base, usar a combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
20. O método de qualquer uma das cláusulas 16 a 19, em que a primeira área de pixel recebe luz de um poço associado em uma superfície de amostra.
21. O método, da cláusula 20, em que a primeira área de pixel recebe luz de mais de um poço associado em uma superfície de amostra.
22. O método de qualquer uma das cláusulas 16 a 21, em que o primeiro e o segundo sinais de pixel são reunidos por um primeiro sensor da primeira área de pixel.
23. O método, da cláusula 22, em que o primeiro e o segundo sinais de pixel são detectados por um processador de sinal configurado para processar sinais de pixel reunidos pelo primeiro sensor.
24. O método de qualquer uma das cláusulas 15 a 23, em que o primeiro estágio de iluminação induz a iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases nucleotídicas marcadas A e T e o segundo estágio de iluminação induz a iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases nucleotídicas C e T.
25. O método de qualquer uma das cláusulas 15 a 24, em que a chamada de base inclui o uso de um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 1 a 11.
26. O método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas, incluindo adicionalmente: executar uma pluralidade de ciclos de chamada de base, cada ciclo de chamada de base com um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação; capturar em um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra, um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base, e um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base; ajustar dezesseis distribuições ao primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento; e para um ciclo de chamada de base sucessivo,
detectar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixel usando o processador de sinal e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos, em que a distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamentos.
27. O método, de acordo com a cláusula 26, em que o ajuste compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de k-médias, um algoritmo de agrupamento similar a k- médias, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.
28. O método da cláusula 26 ou 27, incluindo adicionalmente a normalização dos valores de intensidade.
29. O método de qualquer uma das cláusulas 26 a 28, em que a área de pixel recebe luz de um poço associado na superfície da amostra.
30. O método de qualquer uma das cláusulas 26 a 29, em que a referida identificação e chamada de base inclui o uso de um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 1 a 11 ou um biossensor conforme definido em qualquer uma das cláusulas 12 a 14.
31. Um método implementado por computador de chamada de base que compreende: fornecer um primeiro sinal de pixel que representa a luz coletada de uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação de um ciclo de chamada de base de um sequenciamento por síntese (abreviado SBS) e um segundo sinal de pixel que representa a luz coletada da referida primeira área de pixel durante uma segundo estágio de iluminação do referido ciclo de chamada de base da referida execução do SBS, em que a primeira área de pixel está subjacente ao primeiro e segundo agrupamentos que compartilham a primeira área de pixel;
prover um processador de sinal configurado para processar pelo menos os referidos primeiro e segundo sinais de pixel; mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos usando o referido processador de sinal; e combinar logicamente o mapeamento dos primeiro e segundo sinais de pixel para identificar a base nucleotídica incorporada em cada um dos referidos primeiro e segundo agrupamentos durante o referido ciclo de chamada de base.
32. Método implementado por computador para identificar áreas de pixels com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixels identificadas, compreendendo: fornecer um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante um primeiro estágio de iluminação de um ciclo de chamada de base e um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base, em que o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade representam a intensidade de luz reunida em um sensor associado a uma área de pixel da superfície da amostra; ajustar dezesseis distribuições ao primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento; e para um ciclo de chamada de base sucessivo, prover o primeiro e segundo conjuntos de valores de intensidade para um agrupamento de agrupamentos na área de pixels usando o processador de sinal, e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos, em que a distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamentos.
33. O método implementado por computador, de acordo com a cláusula 32, em que o ajuste compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de k-médias, um algoritmo de agrupamento similar a k-médias, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.
34. Um dispositivo para chamada de base que compreende: um receptáculo e um biossensor, o receptáculo segurando o biossensor, o biossensor com uma superfície de amostra configurada para reter uma pluralidade de agrupamentos durante uma sequência de eventos de amostragem, a superfície de amostra compreendendo um número N de áreas de pixel e os eventos de amostragem compreendendo dois estágios de iluminação na sequência de tempo, uma matriz de sensores compreendendo detectores de luz configurados para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, incluindo pelo menos um sinal de pixel para cada área de pixel e estágio de iluminação, a matriz tendo um número N de sensores ativos, cada um associado a uma área de pixel correspondente do N áreas de pixel e configuradas para detectar emissões de luz coletadas da área de pixel associada, para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem representando as emissões de luz coletadas da área de pixel correspondente para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel, em que a amostra a superfície é configurada de modo que pelo menos um sensor ativo detecte emissões de luz de pelo menos dois agrupamentos, formando um par de agrupamentos da pluralidade de agrupamentos, em que a intensidade das respectivas emissões de luz dos dois agrupamentos é significativamente diferente, e uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel; e um processador de sinal acoplado ao receptáculo e configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo, classificando os resultados para os dois agrupamentos que formam um par de agrupamentos a partir das sequências de sinais de pixel de pelo menos um sensor ativo na matriz de sensores.
35. O dispositivo da cláusula 34, em que os resultados da sequência de eventos de amostragem correspondem a bases nucleotídicas nos agrupamentos, de preferência em que o primeiro estágio de iluminação induz a iluminação de um determinado agrupamento, indicando as bases de nucleotídeos A e T e o segundo estágio de iluminação induz iluminação de um dado agrupamento indicando as bases nucleotídicas C e T, e os referidos resultados de classificação compreendem a chamada de uma das bases nucleotídicas A, C, T ou G.
36. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 34 a 35, em que a lógica para classificar os resultados para dois agrupamentos inclui o mapeamento de um primeiro sinal de pixel do conjunto de amostras de sinal para um evento de amostragem de um sensor específico em pelo menos quatro compartimentos e o mapeamento de um segundo sinal de pixel do conjunto de amostras de sinal para o evento de amostragem em pelo menos quatro compartimentos e combinando logicamente o mapeamento dos primeiro e segundo sinais de pixel para classificar os resultados para dois agrupamentos.
37. O dispositivo de acordo com qualquer uma das cláusulas 34 a 36, em que a superfície de amostra retém agrupamentos que são distribuídos de forma desigual ao longo das áreas de pixel, e o processador de sinal executa a sequência de tempo e a análise espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais na superfície de amostra e para classificar os resultados dos eventos de amostragem para os agrupamentos individuais, em que a pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual ao longo das áreas de pixel.
38. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 34 a 37, em que a superfície da amostra compreende uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel, os dois poços por área de pixel, incluindo um poço dominante e um poço subordinado, o poço dominante tendo uma seção transversal maior sobre a área de pixel do que o poço subordinado.
39. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 34 a 38, em que a superfície da amostra compreende uma matriz de poços que cobrem as áreas de pixel e os eventos de amostragem incluem pelo menos um primeiro estágio químico com um número K de estágios de iluminação em que K é um número inteiro positivo, em que os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K iluminam as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação e as sequências de sinais de pixel incluem um conjunto de amostras de sinal para cada evento de amostragem, o conjunto incluindo o número K de sinais de pixel para pelo menos um produto químico estágio dos eventos de amostragem; em que preferencialmente os eventos de amostragem incluem ainda um segundo estágio químico com um número J de estágios de iluminação em que J é um número inteiro positivo, onde os estágios de iluminação dos estágios de iluminação K no primeiro estágio químico e dos estágios de iluminação J no segundo estágio químico iluminar os poços na matriz de poços com diferentes ângulos de iluminação, e o conjunto de amostras de sinal inclui ainda o número J de sinais de pixel para o segundo estágio químico dos eventos de amostragem.
40. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 34 a 39, em que a matriz de sensores é incluída em um gerador de imagens de estado sólido.
41. O dispositivo de qualquer uma das cláusulas 34 a 40, em que uma área de pixel recebe luz de um poço na superfície da amostra e o poço é configurado para reter mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada de base, em que um agrupamento compreende preferencialmente uma pluralidade de fragmentos de ácido desoxirribonucleico (DNA abreviado) com uma sequência de ácido nucleico idêntica.
42. Um método implementado por computador de chamada de base, incluindo: para um ciclo de chamada de base de um sequenciamento por síntese (abreviado como SBS) executar e receber de uma porta de comunicação uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, sendo a pluralidade de sequências de sinais de pixel gerada, para uma sequência de eventos de amostragem compreendendo dois estágios de iluminação na sequência de tempo, com base na luz emitida por uma pluralidade de agrupamentos mantidos por um número N de áreas de pixels de uma superfície de amostra por uma matriz de sensores compreendendo detectores de luz, a matriz tendo um número N de sensores ativos, cada um associado a uma área de pixel correspondente das áreas de N pixels e configurado para detectar emissões de luz coletadas a partir da área de pixel associada, os sensores sendo configurados gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N das áreas de pixel correspondentes da superfície da amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel, as sequências de sinais de pixel incluindo pelo menos um sinal de pixel para cada área e iluminação de pixel estágio, em que pelo menos um sensor ativo detecta emissões de luz de pelo menos dois agrupamentos que formam um par de agrupamentos do pluralidade de agrupamentos, em que a intensidade das respectivas emissões luminosas dos dois agrupamentos é significativamente diferente; e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos , incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo, classificando os resultados para os dois agrupamentos que formam um par de agrupamentos a partir das sequências de sinais de pixel de pelo menos um sensor ativo na matriz de sensores.
43. O método implementado por computador da cláusula 42, incluindo ainda: mapear um primeiro sinal de pixel, que representa a luz reunida de uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base, em pelo menos quatro compartimentos e mapear um segundo sinal de pixel, que representa a luz reunida da primeira área de pixel durante um segundo fase de iluminação do ciclo de chamada de base, em pelo menos quatro posições, e combinar o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas.
44. O método implementado por computador de qualquer uma das cláusulas 42 a 43, incluindo ainda a aplicação do método para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixels durante o ciclo de chamada de base, de preferência incluindo ainda a repetição do método em bases sucessivas ciclos de chamada para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base, mais preferencialmente incluindo ainda: para cada um dos ciclos de chamada de base, detectar e armazenar o primeiro e o segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel, e após os ciclos de chamada de base, usar a combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases nucleotídicas incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
45. O método implementado por computador de qualquer uma das cláusulas 42 a 44, em que pelo menos um dos seguintes se aplica: a primeira área de pixel recebe luz de um poço associado em uma superfície de amostra; de preferência luz de mais de um poço associado na superfície da amostra; o primeiro e o segundo sinais de pixel são coletados por um primeiro sensor da primeira área de pixel, em que o primeiro e o segundo sinais de pixel são preferencialmente detectados por um processador de sinal configurado para processar sinais de pixel coletados pelo primeiro sensor, e o primeiro estágio de iluminação induz iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir de bases nucleotídicas marcadas A e T, e o segundo estágio de iluminação induz iluminação a partir do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases nucleotídicas marcadas C e T.
46. O método implementado por computador de qualquer uma das cláusulas 42 a 45, no qual a chamada de base inclui o uso de um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 34 a 41.
47. Método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas, preferencialmente o método de qualquer uma das cláusulas 34-46, incluindo: executar uma pluralidade de ciclos de chamada de base, cada ciclo de chamada de base com um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação; capturar em um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra, um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base, e um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada de base; ajustar dezesseis distribuições ao primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento; e para um ciclo de chamada de base sucessivo, detectar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixel usando o processador de sinal e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos, em que a distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamentos em que preferencialmente pelo menos um dos seguintes se aplica:
o método pode incluir ajuste que compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de k-médias, um algoritmo de agrupamento similar a k-médias, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma; o método compreende ainda normalizar os valores de intensidade; a área de pixel recebe luz de um poço associado na superfície da amostra; e a referida identificação e chamada de base inclui o uso de um dispositivo como definido em qualquer uma das cláusulas 34 a 41.
48. Um método implementado por computador para chamada de base, de preferência o método de acordo com qualquer uma das cláusulas 42-46, em que o método compreende: fornecer um primeiro sinal de pixel que representa a luz coletada de uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação de um ciclo de chamada de base de um sequenciamento por síntese (abreviado SBS) e um segundo sinal de pixel que representa a luz coletada da referida primeira área de pixel durante uma segundo estágio de iluminação do referido ciclo de chamada de base da referida execução do SBS, em que a primeira área de pixel está subjacente ao primeiro e segundo agrupamentos que compartilham a primeira área de pixel; prover um processador de sinal configurado para processar pelo menos os referidos primeiro e segundo sinais de pixel; mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos usando o referido processador de sinal; e combinar logicamente o mapeamento dos primeiro e segundo sinais de pixel para identificar a base nucleotídica incorporada em cada um dos referidos primeiro e segundo agrupamentos durante o referido ciclo de chamada de base, ou ser um método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensores e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixels identificadas, compreendendo: fornecer um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante um primeiro estágio de iluminação de um ciclo de chamada de base e um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base, em que o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade representam a intensidade de luz reunida em um sensor associado a uma área de pixel da superfície da amostra; ajustar dezesseis distribuições ao primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento; e para um ciclo de chamada de base sucessivo, prover o primeiro e segundo conjuntos de valores de intensidade para um agrupamento de agrupamentos na área de pixels usando o processador de sinal, e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos, em que a distribuição identifica uma base nucleotídica presente em cada agrupamento do grupo de agrupamentos, em que o acessório compreende preferencialmente o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de k-médias, um algoritmo de agrupamento do tipo de k- médias, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Dispositivo para chamada de base, caracterizado pelo fato de que compreende: um receptáculo configurado para reter um biossensor, o biossensor com uma superfície de amostra que retém uma pluralidade de agrupamentos (cluster) durante uma sequência de eventos de amostragem, uma matriz de sensores, em que cada sensor na matriz detecta informações de um ou mais agrupamentos dispostos em áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para gerar um sinal de pixel em um evento de amostragem, a matriz configurada para gerar uma pluralidade de sequências de sinais de pixel, a matriz com um número N de sensores ativos, os sensores na matriz dispostos em relação à superfície de amostra para gerar os respectivos sinais de pixel durante a sequência de eventos de amostragem a partir do número N de áreas de pixel correspondentes da superfície de amostra para produzir a pluralidade de sequências de sinais de pixel e uma porta de comunicação que emite a pluralidade de sequências de sinais de pixel; e um processador de sinal acoplado ao receptáculo e configurado para receber e processar a pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em agrupamentos na pluralidade de agrupamentos, em que o sinal de pixel para cada evento de amostragem em pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel representa informações detectadas de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente e incluindo o uso da pluralidade de sequências de sinais de pixel para classificar os resultados da sequência de eventos de amostragem em um número N + M de agrupamentos na pluralidade de agrupamentos do número N de sensores ativos, em que M é um número inteiro positivo.
2. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os resultados da sequência de eventos de amostragem correspondem a bases nos agrupamentos.
3. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os eventos de amostragem compreendem dois estágios de iluminação na sequência de tempo, e referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel inclui um sinal de pixel incluindo informações de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente de cada um dos dois estágios de iluminação.
4. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o processador de sinal inclui lógica para classificar resultados para dois agrupamentos a partir de referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel.
5. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a lógica para classificar resultados para dois agrupamentos inclui mapear um primeiro sinal de pixel em referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel de um sensor específico em pelo menos quatro compartimentos e mapear um segundo sinal de pixel em referida pelo menos uma sequência de sinais de pixel em pelo menos quatro compartimentos, e combinar logicamente o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para classificar os resultados para dois agrupamentos.
6. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os sensores na matriz de sensores compreendem detectores de luz.
7. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os eventos de amostragem compreendem dois estágios de iluminação na sequência de tempo, e as sequências de sinais de pixel na pluralidade de sequências de sinais de pixel incluem pelo menos um sinal de pixel de cada um dos dois estágios de iluminação e em que o primeiro estágio de iluminação induz a iluminação de um ou mais agrupamentos nas áreas de pixel dos sensores indicando as bases A e T e o segundo estágio de iluminação induz a iluminação de um ou mais agrupamentos nas áreas de pixel dos sensores indicando as bases C e T, e os referidos resultados de classificação compreendem chamar uma das bases A, C, T ou G para pelo menos dois agrupamentos usando referida pelo menos uma sequência.
8. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície de amostra retém agrupamentos que são distribuídos de forma desigual ao longo das áreas de pixel, e o processador de sinal executa a sequência de tempo e a análise espacial da pluralidade de sequências de sinais de pixel para detectar padrões de iluminação correspondentes a agrupamentos individuais na superfície de amostra e para classificar os resultados dos eventos de amostragem para os agrupamentos individuais, em que a pluralidade de sequências de sinais de pixel codifica interferência diferencial entre pelo menos dois agrupamentos resultantes de sua distribuição desigual ao longo das áreas de pixel.
9. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície de amostra compreende uma matriz de poços sobrepondo as áreas de pixel, incluindo dois poços por área de pixel, os dois poços por área de pixel incluindo um poço dominante e um poço subordinado, o poço dominante com uma seção transversal maior ao longo da área de pixel do que o poço subordinado.
10. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície de amostra compreende uma matriz de poços que cobre as áreas de pixel e os eventos de amostragem incluem pelo menos um estágio químico com um número K de estágios de iluminação, em que K é um número inteiro positivo, em que os estágios de iluminação dos K estágios de iluminação iluminam as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel incluem o número K de sinais de pixel para pelo menos um estágio químico dos eventos de amostragem.
11. Dispositivo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a superfície de amostra compreende uma matriz de poços que cobre as áreas de pixel, e os eventos de amostragem incluem um primeiro estágio químico com um número K de estágios de iluminação, em que K é um número inteiro positivo, em que os estágios de iluminação dos K estágios de iluminação iluminam as áreas de pixel com diferentes ângulos de iluminação, e um segundo estágio químico com um número J de estágios de iluminação, em que J é um número inteiro positivo, em que os estágios de iluminação dos K estágios de iluminação no primeiro estágio químico e dos J estágio de iluminação no segundo estágio químico iluminam os poços na matriz de poços com diferentes ângulos de iluminação, e as sequências de sinais de pixel incluem o número K de sinais de pixel para o primeiro estágio químico mais o número J de sinais de pixel para o segundo estágio químico dos eventos de amostragem.
12. Biossensor para chamada de base, caracterizado pelo fato de que compreende: um dispositivo de amostragem, o dispositivo de amostragem incluindo uma superfície de amostra com uma matriz de áreas de pixel e um gerador de imagens de estado sólido com uma matriz de sensores, cada sensor gerando sinais de pixel em cada ciclo de chamada de base, cada sinal de pixel representando luz reunida em um ciclo de chamada de base de um ou mais agrupamentos em uma área de pixel correspondente da superfície de amostra; e um processador de sinal configurado para conexão com o dispositivo de amostragem que recebe e processa os sinais de pixel dos sensores para chamada de base em um ciclo de chamada de base e usa os sinais de pixel de poucos sensores do que um número de base de agrupamentos chamado no ciclo de chamada de base, os sinais de pixel dos poucos sensores incluindo pelo menos um sinal de pixel que representa a luz reunida de pelo menos dois agrupamentos na área de pixel correspondente.
13. Sistema, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que uma área de pixel recebe luz de um poço na superfície de amostra e o poço é configurado para reter mais de um agrupamento durante o ciclo de chamada base.
14. Sistema, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que um agrupamento compreende uma pluralidade de fragmentos com uma sequência de bases idênticas.
15. Método para chamada de base, caracterizado pelo fato de que inclui: para um ciclo de chamada de base de um sequenciamento por síntese (abreviado como SBS) executado, detectar um primeiro sinal de pixel que representa a luz reunida de pelo menos dois agrupamentos em uma primeira área de pixel durante um primeiro estágio de iluminação do ciclo de chamada de base, um segundo sinal de pixel que representa a luz reunida de referidos pelo menos dois agrupamentos na primeira área de pixel durante um segundo estágio de iluminação do ciclo de chamada de base; e usar uma combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar bases incorporadas em cada agrupamento dos pelo menos dois agrupamentos durante o ciclo de chamada de base.
16. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente: mapear o primeiro sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos e mapear o segundo sinal de pixel em pelo menos quatro compartimentos, e combinar o mapeamento do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases incorporadas.
17. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente aplicar o método para identificar as bases incorporadas na pluralidade de agrupamentos em uma pluralidade de áreas de pixel durante o ciclo de chamada de base.
18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente repetir o método ao longo de sucessivos ciclos de chamada de base para identificar as bases incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base.
19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente: para cada um dos ciclos de chamada de base, detectar e armazenar o primeiro e o segundo sinais de pixel emitidos pela pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel, e após os ciclos de chamada de base, usar a combinação do primeiro e do segundo sinais de pixel para identificar as bases incorporadas na pluralidade de agrupamentos na pluralidade de áreas de pixel durante cada um dos ciclos de chamada de base anteriores.
20. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a primeira área de pixel recebe luz de um poço associado em uma superfície de amostra.
21. Método, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a primeira área de pixel recebe luz de mais de um poço associado em uma superfície de amostra.
22. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo sinais de pixel são reunidos por um primeiro sensor da primeira área de pixel.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo sinais de pixel são detectados por um processador de sinal configurado para processar sinais de pixel reunidos pelo primeiro sensor.
24. Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o primeiro estágio de iluminação induz iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases marcadas A e T e o segundo estágio de iluminação induz iluminação do primeiro e do segundo agrupamentos para produzir emissões a partir das bases marcadas C e T.
25. Método para identificar áreas de pixel com mais de um agrupamento em uma superfície de amostra de um biossensor e agrupamentos de chamada de base nas áreas de pixel identificadas, caracterizado pelo fato de que inclui: executar uma pluralidade de ciclos de chamada de base, cada ciclo de chamada de base com um primeiro estágio de iluminação e um segundo estágio de iluminação; capturar em um sensor associado a uma área de pixel da superfície de amostra, um primeiro conjunto de valores de intensidade gerados durante o primeiro estágio de iluminação dos ciclos de chamada base, e um segundo conjunto de valores de intensidade gerados durante o segundo estágio de iluminação dos ciclos de chamada base; ajustar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade a um conjunto de distribuições usando um processador de sinal e, com base no ajuste, classificar a área de pixel como tendo mais de um agrupamento; e para um ciclo de chamada de base sucessivo,
detectar o primeiro e o segundo conjuntos de valores de intensidade para um grupo de agrupamentos na área de pixel usando o processador de sinal e selecionar uma distribuição para o grupo de agrupamentos, em que a distribuição identifica uma base presente em cada agrupamento do grupo de agrupamentos.
26. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o ajuste compreende o uso de um ou mais algoritmos, incluindo um algoritmo de agrupamento de k-médias, um algoritmo de agrupamento similar a k-médias, um algoritmo de maximização de expectativa e um algoritmo baseado em histograma.
27. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que inclui adicionalmente a normalização dos valores de intensidade.
28. Método, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a área de pixel recebe luz de um poço associado na superfície de amostra.
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