JP2002503954A - 核酸増幅法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 核酸分子は適当な固定化プライマーとアニーリングさせることができる。その後、このプライマーを伸長させ、この分子とプライマーとを互いに分離することができる。伸長したプライマーを別の固定化プライマーとアニーリングさせることができ、他のプライマーを伸長させることができる。その後、伸長した双方のプライマーを互いに分離することができ、これを用いてさらなる伸長プライマーを提供することができる。この方法を繰り返すと、増幅・固定化核酸分子を提供することができる。これらは、配列決定、スクリーニング、診断、in situ核酸合成、遺伝子発現のモニタリング、核酸のフィンガープリンティングなどをはじめとする多くの異なる目的に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸増幅法 本発明は、特に核酸の増幅法に関する。 現在、分子生物学および医薬の開発においては、核酸解析が集中的に利用され ている(Friedrich，G.A.Moving beyond the genome project,Nature Biotechnol ogy 14,1234(1996))。最も挑戦的な領域としては、全ゲノムの配列決定、単一ヌ クレオチドの多形性の検出、スクリーニングおよび遺伝子発現のモニタリングが ある。現在のところ、単一ＤＮＡ配列決定プロジェクトでは１０万までのサンプ ルが扱われる(Venter,J.C.,H.O Smith,L.Hood,ゲノム配列決定のための新しい戦 略,Nature 381,364(1996))。この能力は利用できる技術により制限される。「ヒ トゲノムプロジェクト」（遺伝子マッピングおよびＤＮＡ配列決定）や一般的な 疾病に関わる発現遺伝子における総ての多形性の同定のようなプロジェクトは、 数１００万のＤＮＡサンプルの配列決定を含む。 これまでのＤＮＡ配列決定技術の大部分では、１つのサンプルを処理するのに 要される時間を無期限に短縮することは容易ではない。処理量を増やす方法は、 並行して多くの処理を行うことである。ロボットによるサンプル調製および送達 、９６および３８４穴プレート、高密度グリッディング機の導入(Maier,E.,S.Me ierewer,A.R.Ahmadi,J.Curtis,H.Lehrach，オリゴヌクレオチドハイブリダイゼ ーションによる自動配列フィンガープリント分析へのロボット技術の応用,Journ al of Biotechnology 35，191(1994))および最近の高密度オリゴヌクレオチド列 の開発(Chee,M.,R.Yang,E.Hubbell,A.Berno,X.C.Huang,D.Stern,J.Winkler,D.J. Lockhart,M.S.Morris,and S.P.A.Fodor，高密度ＤＮＡ列を用いる遺伝情報への アクセス,Science 274(5287):610-614,(1996))が、これまでのより高い処理量と いう要 求に対する応答を得るために始まっている。かかる技術により、数日内また数時 間内でさえも、同時に50,000〜100,000までのサンプルを処理することが可能と なる(Maier,E.,ライブラリースクリーニングにおけるロボット技術,Laboratory Robotics and Automation 7，123(1995))。 核酸解析を行うための最もよく知られた方法では、まず注目する核酸（例えば 、ゲノムまたはミトコンドリアＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ(ｍＲＮＡ)） を生物から抽出する必要がある。次いで総ての核酸の混合物から注目する核酸を 単離して、大抵はそれらの同定および／または検出に適した量を得るためにこれ らの核酸を増幅する必要がある。ランダムではあるが代表的な種々の核酸の総て のセット、例えば、細胞中に存在する総てのｍＲＮＡの、またはゲノムＤＮＡを ランダムにカットして小片にした後に得られる総ての断片の代表的なセットにお いてあるものが注目される場合でさえ、核酸断片を単離することは必要であると 考えられている。 いくつかの方法を用いて、生物学的手段でＤＮＡを増幅させることができ、そ れらは当業者に十分に公知である。一般に、まずＤＮＡの断片を、制限酵素およ びＤＮＡリガーゼを使用してベクター中に挿入する。次いで注目する断片を含有 するベクター生物学的宿主に導入し、十分に確立されたプロトコールにより増幅 させることができる。通常、宿主は増殖培地（例えば寒天プレート）にランダム に広げる。その後それらは複製して、個々の宿主細胞に起源するコロニーとなる 。 かかる宿主内では、クローン化されたＤＮＡ断片の数百万までの同時増幅を一 度に行うことができる。コロニー密度は、１コロニー／ｍｍ²のオーダーである 。かかるコロニーからＤＮＡを得るための１つの選択として、コロニーを膜に転 移させ、次いで生物学的宿主内からのＤＮＡを直接膜に固定化することがある(G runstein,M.and D.S.Hogness，コロニーハイブリダイゼーション：特異的遺伝子 を含むクローン化ＤＮＡの単離方法,Proeeeding of the National Academy of S cience, USA ,72:3961(1975))。しかしながらこれらの選択では、転移されるＤＮＡの量が 制限され、非放射性検出のためには不十分であることがしばしばである。 もう１つの選択としては、無菌技術によって各コロニーを個々に容器（例えば 、９６穴プレート）に移し、ここでさらに宿主細胞の複製が起こり、その結果、 コロニーからさらなるＤＮＡが得られる。増幅した核酸は、適当な方法で宿主細 胞から回収する。しかしながらかかる方法には一般に時間と労力がかかり、しか も自動化が困難である。 １９８５年、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いるＤＮＡ増幅という革命 的技術がMullis et al.(Asiki,R.,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.Erli ch and N.Arnheim，Science 230，1350-1354(1985))により提案され、これは今 や当業者に十分公知である。この増幅法では、注目するＤＮＡ断片は、増幅すべ き領域をフランクする、通常「プライマー」と呼ばれる２つの短い（典型的には 約２０塩基の長さ）オリゴヌクレオチドを用いて増幅することができる。増幅は ＰＣＲサイクル中に起こり、これには二本鎖ＤＮＡ分子を変性させる工程（典型 的には、二本鎖ＤＮＡ分子を分離して２本の一本鎖断片とするために、反応混合 物を例えば９５℃に加熱する）、アニーリング工程（ここでは、プライマーを一 本鎖の鋳型とアニーリングさせるために、反応混合物を例えば４５℃にする）、 および伸長工程（ＤＮＡポリメラーゼ酵素を用い、プライマーの末端に一連のヌ クレオチドを組込むことにより、本鎖断片に相補的なＤＮＡを合成する）を含む 。 前記方法は通常は溶液中で行い、従ってプライマーも鋳型もいずれの固体マト リックスにも結合しない。 しかしながらより最近では、表面でのＰＣＲ産物の増幅および移植を同時に行 うため、溶液中の遊離プライマーと組み合わせて表面に移植したあるプライマー を用いることが提案されている(Oroskar,A.A.,S.E.Rasmussen,H.N.,Rasmussen,S .R.,Rasmussen,B.M.,Sullivan,and A.Johansson，ＥＬＩＳＡ類似技術による固 定 化アンプリコンの検出,Clinical Chemistry 42:1547(1996))。（本明細書では、 「移植」とは、ある部分を表面に付着させ、それを除去することが望まれない限 り、またはそれを除去することが望まれるまで留まるということを表すために用 いる。）増幅は一般に容器内（例えば、９６穴形式のプレート内）で、各々の容 器が１つの反応のＰＣＲ産物を含むようにして行う。かかる方法では、ＰＣＲサ イクル中に反応物と接触していたＰＣＲ産物のいくつかは、その中にプライマー を有する容器の表面に移植されるようになる。表面への移植は次のアッセイを簡 略にし、有効な自動化を可能にする。 ＤＮＡサンプルの配列はより慣例的には膜（例えば、ナイロンまたはニトロセ ルロース膜）上で行われる。好適なロボット工学（例えば、Ｑ−ｂｏｔ(商標)、 Genetix 1td，Dorset BH23 3TG UK）の使用により、１０サンプル／ｍｍ²までの 密度を達成することができる。ここで、ＤＮＡは物理化学的手段（例えば、ＵＶ 照射）により膜に共有結合している。これらの技術により、大きなＤＮＡ分子（ 例えば、１００ヌクレオチド長を越える分子）、ならびにより小さなＤＮＡ分子 の配列が可能となる。このようにして鋳型およびプローブ双方が配列できる。 プレアレイドスライドガラスに基づく新しいアプローチ（インクジェット技術 によって得た反応性領域列(Blanchard,A.P.and L.Hood，インクジェットを用い るオリゴヌクレオチド列の合成,Comparative Genomics，1:225(1996))または反 応性ポリアクリルアミドゲル列(Yershov，G.et al.,オリゴヌクレオチドマイク ロチップにおけるＤＮＡ解析および診断,Proceeding of the National Academy of science,USA ,93:4913-4918(1996))により、１００サンプル／ｍｍ²までの配 列が可能となる。これらの技術では、プローブ（オリゴヌクレオチド）の移植が 報告されているに過ぎない。報告されているサンプル数／ｍｍ²は依然としてか なり低いものである(２５〜６４)。 より高いサンプル密度は、ＤＮＡチップの使用により達成でき、これは表面に 共有結合したオリゴヌクレオチド列であってもよいし、マイクロリトグラフ技術 (Fodor,S.P.A.et al.,光により指示される、空間的に呼び出し可能な並行化学合 成，Science 251:767(1991))の使用により得てもよい。現在のところ、分子生物 学用途には、６２５プローブ／ｍｍ²を有するチップが使用されている(Lockhart ,D.J.et al.,高密度オリゴヌクレオチド列とのハイブリダイゼーションによる発 現のモニタリング,Nature Biotechnology 14:1675(1996))。２５００００サンプ ル／ｃｍ²までのプローブ密度が達成可能であるとの主張がなされている(Chee,M .et al.,高密度ＤＮＡ列を用いる遺伝情報へのアクセス,Science 274:610(1996) )。現在のところ、およそ２．５ｃｍ²のチップ１つにつき１３２０００までの異 なるオリゴヌクレオチドが配列できる。現在、これらのチップは、表面に付着し たオリゴ３’ＯＨ末端を用いる直接的固相オリゴヌクレオチド合成により製造さ れている。このようにこれらのチップを用いて、ＤＮＡポリメラーゼが介在する 伸長工程ではプライマーとして機能できないオリゴヌクレオチドプローブが提供 されている。 ＰＣＲ産物が、ＰＣＲ増幅が起こる容器に結合している場合、これは直接的配 列法であるとみなすことができる。従って、得られるＰＣＲ産物列の密度は、利 用できる容器により制限される。現在利用可能な容器は９６穴マイクロタイター プレート形式のものだけである。これらでは約〜０．０２ＰＣＲ増幅サンプル／ ｍｍ²表面しか得ることができない。 Nunc A/S(Roskilde，Denmark)から入手可能な市販のヌクレオリンク(Nucleoli nk)（商標）系を用いると、オリゴヌクレオチドプライマーが表面に移植された 容器内で、サンプルの増幅および配列を同時に達成することができる。しかしな がら、この場合、サンプル列の密度は容器の大きさにより固定される。現在、９ ６穴プレート形式については０．０２サンプル／ｍｍ²の密度が達成できる。こ の密度を引き上げることは困難である。例えば、ＰＣＲに適した３８４穴プレー トの有効 性（０．０８サンプル／ｍｍ²）は、技術上の問題（例えば、熱転移や充填中の 毛細管作用）により立ち後れているので、このことは明らかである。このように 、このアプローチにより配列されるサンプル密度における大きなオーダーでの改 良は予見できる将来に達成できる見込みはなさそうである。 本発明は、核酸増幅に関する先行技術の方法の不利な点のいくつかを解決する または少なくとも軽減することを目的とする。 本発明によれば、 Ａ．固定化されているがプライマーを伸長させるために一方の末端を露出させ ている複数のプライマーを準備し； Ｂ．一本鎖標的核酸分子を、その一本鎖核酸分子の長さの一部について複数の プライマーの１つとアニーリングさせ、次いでアニーリングした一本鎖核酸分子 を鋳型として用いてそのプライマーを伸長させて、伸長した固定化核酸鎖を提供 し； Ｃ．この伸長した固定化核酸鎖から標的核酸分子を分離し； Ｄ．伸長した固定化核酸鎖を工程Ａ）の複数のプライマーのうちの１つとアニ ーリングさせ、次いで伸長した固定化核酸鎖を鋳型として用いてそのプライマー を伸長させて、もう１つの伸長した固定化核酸鎖を提供し；所望により Ｅ．アニーリングした伸長した固定化核酸鎖を互いから分離する 工程を含んでなる核酸増幅法を提供する。 好ましくは本方法はまた、 Ｆ．少なくとも１つの伸長した固定化核酸鎖を用いて工程Ｄ）およびＥ）を繰 り返して、さらなる伸長した固定化核酸鎖を提供し、次いで所望により Ｇ．工程Ｆ）を１回以上繰り返す 工程を含んでなる。 望ましくは一本鎖標的核酸配列は、増幅すべき所定の核酸配列（この配列は既 知であっても未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２の核 酸配列を付加することによって一本鎖標的核酸配列を製造する方法により提供さ れ、ここで第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つとハイブリダイズし 、第２の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つとハイブリダイズする配列と 相補的である。 第２の核酸配列は、複数のプライマーのうちの１つの配列と同一の配列であっ てもよい。このように一本鎖標的核酸は、増幅すべき所定の核酸配列（この配列 は既知であっても未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２ の核酸配列を付加することによって提供する方法によって提供してもよく、ここ で第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つとハイブリダイズし、第２の 核酸配列は複数のプライマーのうちの１つの配列と同一である。 第１および第２の核酸配列は、一本鎖標的核酸の第１および第２の末端に提供 してもよいが、これは必須ではない。 所望により、所定の核酸配列の増幅産物の同定を可能にするためタグを提供し てもよい。コロニー 本発明の方法は１以上の異なる領域を提供することを可能し、各々の異なる領 域は複数の固定化核酸鎖（以後「コロニー」と呼ぶ）を含んでなる。これらの領 域は多数の増幅核酸分子を含んでいる。これらの分子はＤＮＡおよび／またはＲ ＮＡ分子であってもよく、また一本鎖または二本鎖形態で提供されてもよい。所 定の鎖およびその相補鎖は単一のコロニーにおいて増幅形態で提供され得る。 いずれの特定の大きさのコロニーでも提供できる。 しかしながら、好ましいコロニーはそれらの最長寸法の直径が１０ｎｍ〜１０ ０μｍ、さらに好ましくはそれらの最長寸法の直径が１００ｎｍ〜１０μｍであ る。表面に存在するコロニーの大部分（少なくともその５０％）は前記に与えら れた範囲内の大きさを有することが望ましい。 コロニーは所定の様式で配置することもできるし、または無作為に配置するこ ともできる。２または３次元のコロニー配置が可能である。この配置は規則的で あってもよいし(例えば、多角形外形を有するか、またはほぼ円形の外形を有す る)、あるいはそれらは不規則であってもよい。 コロニーは高密度で提供することができる。１コロニー／ｍｍ²表面を越える 密度が達成できる。実際には、本発明を用いて１０²コロニー／ｍｍ²を越える、 １０³コロニー／ｍｍ²を越える、または１０⁴コロニー／ｍｍ²を越える密度が達 成できる。好ましい具体例では、本発明は１０^{4 〜5}コロニー／ｍｍ²の密度、よ り好ましくは１０^{6 〜7}コロニー／ｍｍ²の密度を提供し、従って、先行技術の方 法の多くを用いて達成できる密度に対し３〜４オーダーの規模の改良をもたらす 。高密度のＤＮＡコロニーにより、多数の異なるＤＮＡ鋳型（１０^{6 〜7}コロニー ／ｍｍ²まで）を無作為に配列し増幅することが可能になるので、本発明のこと 特性は先行技術を越える大きな利点を可能にする。プライマー 本発明に使用される固定化プライマーは、遊離３’−ＯＨ末端がプライマー伸 長に利用可能である限り、好適な手段のいずれによっても提供できる。多くの異 なる核酸分子を増幅すべき場合は、多くの異なるプライマーを提供してもよい。 また、「万能」プライマーを用いてもよく、それによりただ１つまたは２つの異 なるタイプのプライマー（本発明の具体例による）だけを用いて種々の核酸分子 を増幅することができる。万能プライマーは、増幅すべき分子が前記した第１お よび第２の配列を含んでなる場合に使用できる。万能プライマーの供給は、増幅 すべき特定の配列の各々について特異的プライマーを調製しなければならない場 合に、ＷＯ９６／０４４０４(Mosaic Technology,Inc.)で開示されたものなどの 方法よりも有利である。 合成オリゴデオキシヌクレオチドプライマーは、多くの供給者（例えば、Micr osynth，Switzerland,Eurogentech,Belgium)から市販されている。 シランで処理したガラスまたは石英へのプライマーの移植、およびシリコーン ウェーハーまたは金表面へのプライマーの移植が記載されている(Maskos,U.and E.M.Southern,ガラス製支持体上でのオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーショ ン：オリゴヌクレオチド合成のための新規リンカーおよびin situで合成された オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション特性,Nucleic Acids Research 20 (7):1679-84，1992;Lamture,J.B.,et al.電荷結合素子の表面上での核酸ハイブ リダイゼーション直接検出,Nucleic Acids Research 22(11):2121-2125，1994;C hrisey,L.A.,G.U.Lee，and C.E.Ofcrrall，合成ＤＮＡのセルフアセンブル型単 層フィルムへの共有結合,Nucleic Acids Research 24(15):3031-3039，1996)。 ビオチニル化プライマーをストレプトアビジンで被覆した支持体へ移植するこ とがもう１つの選択肢である。この移植方法は一般に生体高分子について使用さ れている。 また本発明については、水相と疎水相の間の界面に疎水性アンカーを介してプ ライマーを非共有結合移植すことも可能である。かかるアンカリングは一般に生 体高分子についてよく使用されている(S.Terrettaz et al.:支持された脂質膜へ のタンパク質の結合,Lamgmuir 9，1361(1993))。かかる界面の好ましい形態には リポソーム、脂質小胞、エマルション、模様をつけた二層構造体、Ｌａｎｇｍｕ ｉｒまたはＬａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルムがあろう。このパター ンは鋳型上に指定の模様をつけることにより得てもよく、例えばマイクロリトグ ラフ法により模様をつけたシリコーンチップがある(Goves,J.T.et al.,固形支持 体における流動二層構造体のマイクロパターン化,Science 275,651(1997))。ま たこのパターンは「コロイド」、例えばエマルションまたはラテックス粒子の自 己集成特性により得てもよい(Larsen,A.E.and D.G.Grier，準安定性コロイド晶 子における好 電荷誘引,Nature 385,230(1997))。 前記の方法では、１以上の異なるプライマーを表面に移植することができる。 プライマーは表面にわたり均一、かつ同時に移植することができる。 マイクロリトグラフ法を用いれば、制御された様式で固定化プライマーを提供 することができる。遊離の３’−ＯＨ末端を有する固形支持体上へのオリゴヌク レオチドの直接合成が所望されるなら、マイクロリトグラフ法を用いて、多数の 異なるオリゴヌクレオチドプライマーを同時に合成することができる(Pirrung,M .C.and Bradley,J.C.光化学ホスホラミダイトに基づくＤＮＡ合成法の比較,Jour nal of Organic Chemistry 60(20):6270-6276，1995)。これらは形成されるコロ ニーと配置において対応するであろう異なる領域に提供してよい(例えば、それ らは数ナノメーターまたは数ミクロメーターの幅であってよい)。各領域内には 単一のプライマーオリゴヌクレオチド要求のみを示す。そうでなければ、複数の 異なるプライマーを含んでなる混合物を提供してもよい。いずれの場合でも、プ ライマーは各領域内に均一に分布させることができる。それらは規則的な列の形 で提供してもよい。 元の領域が１種の固定化プライマーのみを含んでなる場合、所望によりそれら を２種以上の異なるプライマーを持つよう改良してもよい。これを達成する１つ の方法は、元々存在している単一種のプライマーとハイブリダイズする３’末端 を有し、かつそのプライマーの３’末端を越えて伸長する５’末端を有する分子 をプライマー伸長用の鋳型として用いることである。互いに異なる配列を有する 鋳型の混合物を提供することにより、かかる鋳型の混合物を用いる１種のプライ マーのプライマー伸長、それに続く鎖の分離により、種々の改変プライマーが生 じるであろう。(この改変プライマーは本明細書では、元々表面に存在している 「最初の」プライマーから区別するために、「伸長」プライマーと呼ばれる。) このようにして最初のプライマーが元々位置しているいずれの領域にも、１、 ２またはそれ以上の種の伸長プライマーを提供することができる。所望により、 異なる鋳型の実質的に同じ部分を用いるて、所定の領域に実質的に同じ割合の異 なる種の固定化伸長プライマーを提供することができる。異なる割合の異なる固 定化伸長プライマーが望まれるなら、元々使用される種々の鋳型分子の割合をそ れに応じて調節することによりこれを達成することができる。 このプライマー内には制限エンドヌクレアーゼ切断部位が置かれてもよい。ま た、プライマーは、数塩基離れたＤＮＡ切断を指示する制限エンドヌクレアーゼ （II型制限エンドヌクレアーゼ）認識部位とともに提供されてもよい。(不確実 性を避けるためには、プライマーおよびその補体が、起こる認識および／または 切断のために二本鎖分子で提供される必要がある場合でも、かかる部位が提供す べきものと考えられる。)また、プライマーが伸長される際に切断部位および／ または認識部位が提供されてもよい。いずれにしても、制限エンドヌクレアーゼ は、コロニー内の固定化された核酸分子を切断し、少なくともその一部を遊離さ せることを可能にするのに有用であり得る。その他の制限エンドヌクレアーゼを 使用する代わりにリボザイムを用いて、核酸分子の少なくとも一部を表面から遊 離させることができる(かかる分子がＲＮＡ分子である場合)。その他の方法も可 能である。例えば、共有結合を用いてプライマーを表面に結合させれば、この結 合は破壊されてもよい（例えば、化学的、物理的または酵素的手段による）。 本発明で使用されるプライマーは、好ましくは少なくとも５塩基の長さである 。通常それらは１００未満、または５０未満の塩基長であろう。しかしながらこ れは必須ではない。天然に存在するおよび／または天然に存在しない塩基をプラ イマーとして提供してもよい。 標的核酸分子 次ぎに本発明の方法で使用される標的核酸分子（本明細書では「鋳型」ともい う）について考えてみると、これらは適当ないずれの手段によって提供されても よい。標的分子（一本鎖型の場合）は、第１のプライマーとアニーリングするこ とができる配列を有する第１の部分と、第２のプライマーとアニーリングするこ とができる配列と相補的な配列を有する第２の部分を含んでなる。好ましい具体 例では、第２の部分は第２のプライマーと同一の配列を有する。 第２のプライマーは、第１のプライマーの配列と同一の、または異なる配列を 有していてもよい。 標的核酸分子の第１および第２の部分は、それぞれその３’および５’末端に 位置することが好ましい。しかしながら、このことは必須ではない。また標的分 子は通常、第１の部分と第２の部分の間に位置する第３の部分も含むであろう。 分子のこの部分は複製すべき特定の配列を含んでなる。それは所望されるいずれ の供給源に由来してもよく、公知の配列を有していてもよいし、未知の（「無名 の」ともいわれることがある）配列を有していてもよい。それは例えば機械的手 段による、または核酸サンプルの限定された制限酵素消化による無作為な分画二 由来するものであってもよい。 所望により、さらなる標的分子の部分を提供してもよい。例えば、タグとして 機能するよう設計された部分を提供してもよい。「タグ」は、ある核酸分子（ま たはその補体）の同定を可能にするその機能により定義される。 いずれの部分が存在しようとも、標的核酸分子は、核酸製造の分野の熟練者に 公知の技術により提供することができる。例えば、連結反応により２以上の部分 をともに結合させることができる。必要であれば、連結反応に先立って適当な修 飾を行い、分子を連結反応のために準備が整った形態で提供することができる。 例えば、平滑末端連結が望まれるならば、Ｓ１ヌクレアーゼなどの一本鎖特異的 エキソヌクレアーゼを用いて、連結反応に先立って分子の一本鎖部分を除去する ことができよう。また、核酸の製造に、リンカーおよび／またはアダプターを用 いてもよい。（核酸の製造に有用な技術は、例えばSambrook et al,Molecular C loni ng，2^nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)に開示されてい る。） ひとたび鋳型分子が合成されれば、本発明で用いる前にそれをベクター中へク ローン化し、好適な宿主内で増幅させることができる。別法として、それをＰＣ Ｒにより増幅させてもよい。さらなる選択肢として、自動ＤＮＡシンセサイザー （例えば、Perkin-Elmer/Applied Biosystems,Foster City,CA製）を用いて、鋳 型分子のバッチを化学的に合成することもできる。 しかしながら、本発明は配列において同一である多数の核酸分子を、単一の鋳 型分子から生じるコロニー内に提供することを可能にすることに注目することが 重要である。さらに、この鋳型は再使用してさらなるコロニーを形成させること ができる。このように、コロニー形成に使用するために多数の鋳型分子を提供す ることは必ずしも必要でない。 鋳型は、本発明の方法にあずかり得るならば、いずれの所望の長さであっても よい。好ましくはそれは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０塩基の 長さである。さらに好ましくはそれは少なくとも１００、または少なくとも１０ ００塩基の長さである。本発明で使用されるプライマーについては、鋳型は天然 に存在する塩基および／または天然には存在しない塩基を含んでなってもよい。 反応条件 次ぎに本発明の方法に好適な反応条件について考えてみると、本発明では、プ ライマーの鋳型へのアニーリング、プライマー伸長、および伸長したプライマー の鋳型からの分離という反復工程が使用されることが理解されるであろう。これ らの工程は一般に、ＰＣＲ（または逆転写とＰＣＲ）技術における熟練者に公知 の試薬ならびに条件を用いて実施できる。ＰＣＲ技術は、例えば、１９９２年に Springer-Verlagにより刊行された"PCR:Clinical Diagnostics and Research"に 開示されている。 このように、ヌクレオシド三リン酸分子（または修飾ヌクレオシド三リン酸な ど、ＤＮＡ／ＲＮＡ中に存在するヌクレオチドの前駆体として機能する他の分子 ）の供給とともに核酸ポリメラーゼを使用して、好適な鋳型の存在下でプライマ ーを伸長させることができる。 所望により過剰なデオキシリボヌクレオシド三リン酸が提供される。好ましい デオキシリボヌクレオシド三リン酸としては、略号で示すと、ｄＴＴＰ（デオキ シチミジンヌクレオシド三リン酸）、ｄＡＴＰ（デオキシアデノシンヌクレオシ ド三リン酸）、ｄＣＴＰ（デオキシシトシンヌクレオシド三リン酸）およびｄＧ ＴＰ（デオキシグアノシンヌクレオシド三リン酸）がある。好ましいリボヌクレ オシド三リン酸としては、ＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰがある。しかし ながら代替物も可能である。これらは天然に存在するものであっても、天然には 存在しないものであってもよい。一般にＰＣＲ反応に使用される種の緩衝液も提 供されてよい。 プライマーの伸長中にヌクレオチドを組み込むために使用される核酸ポリメラ ーゼは、それが数回使用できる適した反応条件の下で安定であることが好ましい 。（これは、自動増幅法において特に有用である。）このように、新たに合成さ れた核酸鎖を鋳型から分離するのに加熱を用いる場合、核酸ポリメラーゼは使用 される温度において熱安定性があることが好ましい。かかる熱安定性のあるポリ メラーゼは当業者に公知である。それらは好熱性微生物から得ることができる。 それらには、ｔａｑポリメラーゼとして知られているＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメ ラーゼ、またそれらの熱安定性誘導体が含まれる。（しかしながら、核酸ポリメ ラーゼはＤＮＡ依存である必要はない。それはＲＮＡ依存であってもよい。従っ て、それは逆転写酵素、すなわちＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼであってもい。 ） 典型的には、プライマーのその鋳型とのアニーリングは２５〜９０℃の温度で 起こる。かかる温度範囲は通常、プライマー伸長の間維持される。一度、アニー リングさせるのに、また所望の程度のプライマー伸長が起こすのに十分な時間が 経過すると、所望により温度を上げて鎖を分離させることができる。この工程の 温度は６０〜１００℃まで上げることが典型的であろう。(また高温を用いて、 アニーリングに先立って非特異的プライミングの問題を軽減することもできる。 例えばいくつかのサンプルについてコロニー発生を同調させるため、それらを用 いてコロニー発生のタイミングを調節することができる。)別法として、おそら く鎖は、低塩かつ高ｐＨ（＞１２）の溶液による処理により、またはカオトロピ ック塩（例えば、塩酸グアニジニウム）の使用により、または有機溶媒（例えば 、ホルムアミド）の使用により分離されよう。 鎖の分離（例えば加熱による）の後、好ましくは洗浄工程が実施されよう。洗 浄工程は、同一の鋳型を固定化プライマーの付近に維持することが望ましければ 、初回のアニーリング、プライマー伸長、および鎖の分離の間では省略できる。 このことにより、数回使用される鋳型にコロニー形成を誘導することが可能とな る。（最初に高濃度の鋳型分子を提供し、一工程で多くのコロニーが誘導される ことが好ましい。） コロニーの大きさは、例えば実行するアニーリング、プライマー伸長、および 鎖の分離のサイクル数を制御することにより制御できる。コロニーの大きさに影 響を及ぼす他の因子も制御可能である。これらには、固定化プライマーの表面の 数および配置、プライマーが固定化される支持体の配置、鋳型および／またはプ ライマー分子の長さおよび剛性、前記のサイクルを実施可能な流体の温度および イオン強度および粘度が含まれる。 コロニーの使用 ひと度コロニーが形成すると、それらは所望の目的のいずれにも使用できる。 例えば、それらは核酸の配列決定（部分的配列でも、全配列でもよい）に、診 断に、スクリーニングに、他の成分のための支持体として、および／または研究 目的に使用してもよい(好ましい用途は後ほどさらに詳細に記載する)。所望によ り、コロニーを修飾して種々のコロニー（本明細書では、最初に生じた「一次コ ロニー」と区別するために「二次コロニー」という）を提供してもよい。 固定化核酸鎖を含んでなる表面 一本鎖核酸分子のコロニーの形態で固定化核酸鎖を含んでなる表面も、本発明 の範囲内にある。 通常、コロニー内の各固定化核酸鎖は、それに固定化された、また相補的な核 酸鎖が、固定化核酸鎖の長さの距離内で（すなわち１つの分子の長さ内で）表面 に位置するよう、表面に置かれる。このことにより、極めて高密度の核酸鎖およ びそれら補体を固定化形態で提供することが可能となる。コロニー内に、実質的 に同じ割合の所定の核酸鎖とその補体があることが好ましい。核酸鎖およびその 補体はコロニー内に実質的に均一に分布していることが好ましいであろう。 一本鎖核酸鎖をコロニーの形態で含んでなる表面であって、各々のコロニーで はセンスおよびアンチセンス一本鎖が、２本の鎖がもはや全く相補的でないか、 または単純に部分的に相補的であるような形態で提供される表面を提供すること もできる。かかる表面も、本発明の範囲内にある。通常、かかる表面は、例えば 制限酵素による部分的消化により、または一本鎖ＤＮＡを消化する酵素による鎖 分離後の（例えば、加熱後の）部分的消化により、または化学的もしくは物理的 手段により（例えば、インターカレート染料、例えば臭化エチジウムで染色した コロニーに光を照射することにより）、一次コロニーを処理した後に得られる。 ひと度一本鎖コロニーが提供されれば、それらを使用して二本鎖分子を提供す ることができる。このことは、例えば、一本鎖の固定化分子の３’末端とハイブ リダイズする好適なプライマーを（好ましくは溶液として）提供し、次いで核酸 ポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸（または他のヌクレオチド前駆体）の 供給源を用いてプライマーを伸長させることにより実施できる。 このようにブリッジ構造がない二本鎖核酸分子のコロニーを含んでなる表面 も、本発明の範囲内にある。（「ブリッジ構造がない」とは、本明細書では、その 分子が、例えば図１ｈに示されているブリッジ様構造の形態にないことを表すた めに用いられる。） 本発明を用いると、多数の核酸分子（一本鎖であっても、二本鎖であってもよ い）を含む小コロニーが提供できる。従って小面積を有する表面上には多数のコ ロニーが配置できる。ゆえに、前記のように、得ることのできるコロニー密度は 極めて高い。 異なるコロニーは一般に、異なる増幅核酸鎖とそれに対する増幅相補鎖とを含 んでなると考えられる。このように、本発明により、多くの異なる集団の増幅核 酸分子およびそれらの補体が、比較的小さな表面積を有するある１つの表面上に 位置することが可能となる。この表面は通常は平面であろうが、これは必須では ない。装置 本発明はまた、前記で議論した固定化核酸分子のコロニーを含んでなる表面を 提供するための装置を提供する。 かかる装置は以下のうち１以上を含むことができる： ａ）表面にプライマーを固定化する手段（固定化プライマーがすでに準備され ていれば、これは必要でない）； ｂ）核酸ポリメラーゼの供給源； ｃ）核酸に組み込むべきヌクレオチド前駆体の供給源（例えば、ヌクレオシド 三リン酸の供給源）； ｄ）アニーリングした核酸を分離する手段（例えば、加熱手段）；および ｅ）本発明の方法に必要な種々の工程を統合する制御手段。 その他の装置も本発明の範囲内にある。これらにより、本発明の方法を通じて 生産された固定化核酸を解析することが可能となる。それらは反応物の供給源、 およびひと度１以上のが固定化核酸分子に適用されると生成し得るシグナルを検 出する手段を含み得る。それはまた、前記のようにコロニーの形態で固定化核酸 分子を含んでなる表面とともに提供されてもよい。 シグナル検出手段は、種々のコロニーから生じたシグナルを識別できるに十分 な分解能を持っていることが望ましい。 本発明の装置は（いずれの性質のものでも）、一度それらを作動させれば、個 々の処理工程が自動的に繰り返されるよう、自動化した形態で提供することが好 ましい。 以下、添付の図面を参照して本発明を下記のＡ〜Ｉの節で説明するが、限定を 意図するものでない。 これらの節に記載されるＤＮＡ分子を用いる手法は、特に断りのない限り、必 要な変更を加えてＲＮＡ分子に適用できることを理解すべきである。 また、以下の記載の中で配列が与えられる場合、特に断りのない限り、それら は５’から３’へ（左から右へ進む）と記載されていることも理解すべきである 。 提供する図面は以下に要約する通りである： 図１は、単一種のプライマーを用いる核酸分子の同時増幅・固定化法を示す。 図２は、本発明の方法を用いて、いかにしてコロニー増殖が起こり得るかを示 す。 図３は、本発明を用いてＤＮＡコロニーを産生するために用いられる方法の原 理を示す。またこれは、かかるコロニーを提供するために用いられるアニーリン グ、伸長、および変性工程も示す。 図４は、表面に移植された単一のプライマーを用い特異的鋳型の増幅によって 形成されたＤＮＡコロニーの例である。 図５は、２種のプライマーを用いる核酸分子の同時増幅・固定化法を示す。 図６は、本発明によって産生された実際のＤＮＡコロニーを示す。 図７は、標的分子を、プライマーとアニーリングする内部配列を有する鋳型と して使用する場合の、核酸分子の同時増幅・固定化法を示す。 図８は、コロニー中に存在する核酸鎖を用いて、元の核酸鎖のさらなるコピー を合成する方法を示す。新しく合成された鎖は溶液中で示されているが、所望に より、固定化形態で提供することもできる。 図９は、予め形成させたＤＮＡコロニー中に見られるＤＮＡに由来するＤＮＡ のＰＣＲ増幅を示す。 図１０は、いかにしてＤＮＡコロニーから二次プライマーを作出し得るかを示 す。 図１１は、いかにして二次プライマーから二次ＤＮＡコロニーを作出し得るか を示す。 図１２は、いかにして既存のプライマーで機能化された表面から種々の配列を 作出し得るかを示す。 図１３は、ＤＮＡコロニーを作出するのに適したＤＮＡ断片を調製する方法を 示す。 図１４は、ＲＮＡコロニーをＲＮＡポリメラーゼの基質として用いてｃＲＮＡ を合成する方法を示す。 図１５は、個々のコロニーに存在するＤＮＡのＤＮＡ配列を決定する好ましい 方法を示す。 図１６は、de novoにおいてＤＮＡコロニーの配列を決定する方法を示す。 図１７は、ｍＲＮＡ発現レベルのアッセイにおける二次ＤＮＡコロニーの利用 を示す。 図１８および１９は、新規かつまれにしか発現しない遺伝子の単離および同定 おける二次ＤＮＡコロニーの使用を示す。Ａ）単一種のプライマーを用いる核酸分子の同時増幅・固定化を示すスキーム 図１ａ）を参照すると、それに結合した複数のプライマーを有する表面が提供 される（簡略化のため、１つのプライマーのみが示されている）。各プライマー （１）が黒いブロックで示される結合によって表面と結合している。これは共有 結合であっても、非共有結合であってもよいが、表面上の所定の位置にプライマ ーを維持しておくに十分に強くなければならない。プライマーは短いヌクレオチ ド配列（５’−ＡＴＴ）を有すると示されている。しかしながら、実際には一般 により長い配列が提供されるであろう。 図１ｂ）は、プライマーとアニーリングした標的分子（II）を示す。標的分子 はその３’末端にプライマー配列（５’−ＡＴＴ）と相補的な配列（５’−ＡＴ Ｔ）を含んでなる。その５’末端において標的分子は（厳密な同一性は要求され ないが）プライマー配列と同一である配列（５’−ＡＴＴ）を含んでなる。 ２つの末端の間に、増幅すべきいずれの配列（または増幅すべきいずれの配列 の補体）をも提供することができる。例として、増幅すべき配列の一部が５’− ＣＣＧとして示されている。 図１ｃ）には、プライマー伸長が示されている。ここでは、標的分子を鋳型と して用い、ＤＮＡポリメラーゼをｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ とともに使用して、その３’末端からプライマー（５’−ＡＴＴ）を伸長させる 。 図１ｄ）に示すように、プライマー伸長が完了すると、標的分子と相補的な伸 長した固定化鎖（III）が提供されるとわかるであろう。次いで伸長した固定化 鎖から（例えば、図１ｅに示すような加熱によって）標的分子を分離することが できる。この分離工程は伸長した固定化鎖を遊離させ、その結果、図１ｆ）およ び１ｇ）に示すように、それは次いで、以後のラウンドのプライマー伸長を開始 させるために使用することができる。ここで伸長した固定化鎖は曲がっているた めに、図１ｆ）に示すように、（末端配列５’−ＡＴＴを有する）その鎖の一方 の末端がもう一方のプライマー（２，５’−ＡＴＴ）とアニーリングする。この 時に 鋳型として伸長した固定化鎖を用い、そのプライマーはそこからプライマー伸長 が起こり得る３’末端を提供する。図１ｇ）ではプライマー伸長が起こっている ことを示し、図１ｈ）ではそれが完了したことを示している。 図１ｉ）は、互いから（例えば、加熱によって）分離した後の図１ｈ）に示さ れた２本の伸長した固定化鎖を示している。次いでこれらの鎖の各々は、図１ｊ ）および１ｋ）に示すように、それら自身新しいプライマー（３および４）から 開始されるさらなるラウンドのプライマー伸長において鋳型として使用すること ができる。図１ｌ）に示すように、２ラウンドの増幅とそれに続く（例えば、加 熱による）鎖分離工程の後に４本の一本鎖の固定化鎖が提供できる。これらのう ちの２本は鋳型として最初に用いた標的分子の配列に相当する配列を有する。他 の２本は鋳型として最初に用いた標的分子の配列と相補的な配列を有する。(実 際には、所定の固定化鎖およびその固定化補体は１度アニーリングさせてもよい 。) 従って、所定の配列およびその補体は固定化形態で等しい数で提供され、コロ ニー内で実質的に均一に分布させ得ることが理解されるであろう。 もちろん図１に示すものを越えるさらなるラウンドの増幅を行うことはできる ので、多数の所定の一本鎖核酸分子およびそれに対する相補鎖を含んでなるコロ ニーを提供することができる。各コロニーを誘導するには単一の鋳型のみを使用 する必要があるが、所望により、鋳型を再使用していくつかのコロニーを誘導す ることができる。 本発明により、極めて高密度の固定化伸長核酸分子を提供することが可能とな ることが理解されるだろう。コロニー内において各々の伸長した固定化分子はも う１つの伸長した固定化分子の１分子長以内の表面に位置している。従って、図 １ｌ）に示されている位置３は位置１の１分子長内にあり、位置１は位置２の１ 分子長内にあり、また位置２は位置４の１分子長内にある。 図２は、(図１および図６を参照して記載された方法または固定化核酸分子を 提 供するための本発明の他のいずれかの方法を用いて)いかにしてコロニー増殖が 起こり得るかを示すために提供される。 平坦なプレートが、四角い格子パターン中の上に固定化されたプライマーを有 する平面図に模式的に示されている(プライマーは小さい点によって示されてい る)。簡略化のため規則的な格子を用いているに過ぎないが、実際の多くの場合 、プライマーの位置は実際にはあまり規則的でないかまたはランダムであろう。 矢印Ｘで示された位置において、鋳型分子をプライマーとアニーリングさせ、 初回のプライマー伸長が起こって固定化伸長核酸鎖が提供される。鎖分離の後、 その鎖の末端は遊離して、さらなるプライマーとアニーリングし、その結果、付 加的な固定化伸長核酸鎖が産生される。このことは文字Ｙで示される位置で引き 続いて起こっていることが示されている。簡略化のため、アニーリングのために 選択されたプライマーは核酸鎖を保持するプライマーの隣りに位置しているが、 実際の場合、核酸鎖はその最も近くに隣接しているのではないプライマーとアニ ーリングできる。しかしながら、このプライマーは明らかに核酸鎖の長さと等し い距離内にあると考えられる。 これらの位置の（総てではなく）１つだけでのアニーリングがコロニー細胞の 増殖が起こるために必要とされることが理解されるであろう。 固定化伸長一本鎖核酸分子が文字Ｙで示される位置で提供された後、その結果 生じた分子がそれ自身他のプライマーとアニーリングし、この工程を継続して比 較的小さな面積中に多数の固定化核酸分子を含んでなるコロニーを提供すること ができる。 図３はアニーリング、伸長および変性サイクルの簡略化バージョンを示してい る。図４および６で示された例において見ることができるように、それはまたな し得る典型的な観察を示している。固相プライマーを用いる核酸の同時増幅・固 定化は、下記の実施例１、２および３に記載された方法を用いて首尾よく達成さ れた。 実施例１ それらの５’末端でリン酸化したオリゴヌクレオチド(Microsynth GmbH,Switz erland)をヌクレオリンクプラスチックマイクロタイターウェル(Nunc,Roskilde, Denmark)上に移植した。オリゴヌクレオチドｐ５７の配列は配列５’−ＴＴＴＴ ＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣに相当し、ｐ５８は配 列５’−ＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧに相 当する。ｐ５７またはｐ５８を有するマイクロタイターウェルを、以下のように 調製した。各ヌクレオリンクウェルに、１０ｍＭ １−メチル−イミダゾール（ ｐＨ７．０）(Sigma Chemicals,St.Louis,MO)中のオリゴヌクレオチドの１６０ ｎＭ溶液を３０μｌ添加した。各ウェルに、１０ｍＭ １−メチル−イミダゾー ル中の４０ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジ イミド（ｐＨ７．０）(Sigma Chemicals)を１０μｌ添加してオリゴヌクレオチ ドの溶液とした。次いでウェルを密封し、５０℃で一晩中インキュベートした。 インキュベーションの後、ウェルを２００μｌのＲＳ（０．４Ｎ ＮａＯＨ，０ ．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０(Fluka Chemicals,Switzerland)）で２回すすぎ、２ ００μｌのＲＳとともに１５分間インキュベートし、２００μｌのＲＳで２回、 そして２００μのＴＮＴ（１００ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄した。管を５０℃で乾燥させ 、密封したプラスチックバッグ内で４℃にて保存した。 各ウェルにおいて１５μｌのプライミングミックス、すなわち１ナノグラムの 鋳型ＤＮＡ（ここで鋳型ＤＮＡは配列５’−ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧ ＧＧＡＡＡＧＧＧで開始し、配列ＣＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴ ＴＣＴ−３’を有する３’末端で終結する）、４つのｄＮＴＰ（０．２ｍＭ）、 ０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン，Boehringer-Mannheim,Germany)、０．１ ％ Ｔｗｅｅｎ ２０、８％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド，Fluka Chemicals,Swi tzerland)、１Ｘ Ａｍｐｌｉｔａｑ ＰＣＲ緩衝液および０．０２５単位／μｌ のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ(Perkin Elmer,Foster City,CA)でコロ ニー形成を開始させた。プライミング反応は、以下の条件下（サーモサイクラー (PTC 200,MJ Research,Watertown,MA)中にて９４℃で４分間、６０℃で３０秒間 および７２℃で４５秒間）での１回のＰＣＲであった。次いで１００μｌのＴＥ 緩衝液（１０ｍＭ トリスＨＣｌ，ｐＨ７．５，１ｍＭ ＥＤＴＡ）を用いて３回 連続して９４℃で１分間の洗浄を行った。次いで各ウェルに２０μｌの重合混合 物を添加することによってＤＮＡコロニーを形成させ、ここで重合混合物はプラ イミングミックスと同一であるが鋳型ＤＮＡを欠いている。次いでこのウェルを ＰＴＣ ２００サーモサイクラー中に置き、密封したウェルを９４℃で４分間イ ンキュベートし、以下の条件、すなわち９４℃で４５秒間、６５℃で２分間、７ ２℃で４５秒間を５０回繰り返して循環させることにより、コロニー増殖を実施 した。このプログラムの完了後、ウェルはさらに使用するまで８℃で保持した。 （５’−ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧ配列を含まない が）鋳型の主要配列に相当する６４０塩基対の断片をＰＣＲにより増幅させ。Ｐ ｒｉｍｅ−ｉｔ ＩＩラベリングキット(Stratagene,San Diego，CA)を用いて単 離した断片をビオチン−Ｎ’−ｄＣＴＰ(NEN Life Sciences,Boston,MA)および 微量の［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ(Amersham,UK)で標識してビオチニル化プローブを 作製した。 ビオチニル化プローブをＥａｓｙＨｙｂ(Boehringer-Mannheim,Germany)中で ２．５ｎＭの濃度に希釈し、以下の温度スキーム(ＰＴＣ ２００サーモサイクラ ー）、すなわち９４℃で５分間、続いて１２秒ごとに温度を０．１℃下げること を５００工程（換言すれば、温度を１００分間に４５℃下げる）で１５μｌを各 サンプルとハイブリダイズさせた。次いでサンプルを以下のように洗浄した。室 温 にて２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ（２ＸＳＳＣ；０．３Ｍ ＮａＣｌ／０．０ ３Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ７．０／０．００１ｍｇ／ｍｌドデシル硫酸ナトリ ウム）で１回、３７℃にて２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで１回、および５０℃ にて２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳで１回。次いでウェルを５０μｌのＴＮＴ／ ０．１％ ＢＳＡ中の赤色蛍光剤ヌートラビジン(Neutravidin)で被覆した４０ｎ ｍフルオスフェア(FluoSpheres)（登録商標）（５８０ｎｍ励起および６０５ｎ ｍ発光，Molecular Probes Inc.,Eugens,OR）とともに３０分間インキュベート した。（微小球の溶液は２μｌの微小球原液を１ｍｌ ＴＮＴ／０．１％ ＢＳＡ に希釈して作製し、次いでそれを５分間５０Ｗの超音波水浴(Elgasonic,Switzer land)中で音波処理し、その後、０．２２μｍのフィルター(Millex GV4)を通し て濾過した。次いでウェルをミクロベータ(Microbeta)プレートシンチレーショ ンカウンター(WALLAC,Turku,Finland)で計数した(Cherenkov)。 室温で３０分間、ＴＮＴ／０．１％ ＢＳＡ中で洗浄して過剰のフルオスフェ ア（登録商標）を除去した。Ｍｉｃｒｏｍａｘ ５１２ｘ７６８ ＣＣＤカメラ(P rinceton instruments,Trenton,NJ)を備えた倒立顕微鏡(Axiovert 5100TV,Carl Zeiss AG,Oberkochen,Germany)で２０倍の対物レンズを用い、ＸＦ４３フィルタ ーセット(PB546/FT580/LP590,Omega Optical,Brattleboro,VT)を用い、５秒間露 光して染色したサンプルの像を観察する。 図４は、（ａ）オリゴヌクレオチドｐ５７または（ｂ）オリゴヌクレオチドｐ ５８のいずれかで機能化した管におけるコロニー形成に関するハイブリダイゼー ションの結果を示している。鋳型上のフランキング領域の配列はウェル上に移植 したプライマー配列に相当しないので、対照反応は極少ない蛍光スポットしか示 さない。これに対し、図４ｂは、プライマーをウェルに移植した際に検出された 蛍光スポットの数が開始しているＤＮＡ鋳型上のフランキング配列と適合するこ とを示している。検出された蛍光スポットの数を算出して倍率を考慮して、発明 者 らは３〜５ｘ１０⁷コロニー／ｃｍ²の間であると評価できた。同じ値に対して標 準化された背景および強度を有するプログラム、Ｗｉｎｖｉｅｗ １．６．２(pr inceton Instruments,Trenton,NJ)より写真を撮った。Ｂ）異なる２種のプライマーを用いる核酸分子の同時増幅・固定化を示すスキー ム 図５を参照すると、本発明のもう１つの具体例が示されている。ここでは２つ の異なる固定化プライマーを用いてプライマー伸長をもたらす。 この具体例において、示された標的分子は第１のプライマー（５’−ＡＴＴ， Ｉ）の配列と相補的なヌクレオチド配列をその３’末端（ＡＡＴ−３’）に備え ており、それは表面に移植されているのでそのプライマーとのアニーリングが起 こり得る。標的分子であるIIIの５’末端にある配列（５’−ＧＧＴ）は第２の プライマーであるIIの配列（５’−ＧＧＴ）に相当し、それもまた表面に移植さ れているので５’末端にある配列と相補的な配列はこの第２のプライマーとアニ ーリングすることができる。一般にこの相補配列（５’−ＡＣＣ）は、それが第 １のプライマー（５’−ＡＴＴ）とはアニーリングしないように選択される。第 Ａ節に記載した状態とは異なり、新しく合成された鎖の３’末端がひと度表面上 でプライマーとアニーリングすれば、それは、その配列が、それがその５’末端 に有している配列とは異なるプライマーを見つけなければならない(図１ｆと図 ５ｆとの間の相違を参照)。 一本鎖の標的分子の一方の末端が溶液中で同じ分子のもう一方の末端とアニー リングする可能性は避けることができ、それゆえ増幅がさらに進行するので、図 ５に示す具体例は図１に示された具体例よりも有利である。固定化された標的分 子の補体の両末端間で起こるアニーリングの可能性もまた回避することができる 。 実施例２ ５’末端でリン酸化されている２つのオリゴヌクレオチドの混合物(Microsynt h GmbH,Salgach，Switzerland)を、製造業者が推奨するように９６ウェルのヌク レオリンクプレート(Nunc,Denmark)に移植した。得られたプレートを４℃で乾燥 保存した。プライマーＰ１の配列は５’−ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡ ＣＴＡであり、他のプライマーＰ２の配列は５’−ＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴ ＣＡＣＴＡＡＡであった。これらのプレートはＮｕｎｃによって特別に処方され ており、標準的な方法により５’リン酸化ＤＮＡ断片の共有結合による移植が可 能である。 クローニング部位（すなわち、それぞれ６２１位および７９４位でＰ１および Ｐ２に相当する）で適当なＤＮＡ配列を用いてベクター(pBlueScript Skminus,S tratagene Inc,San Diego,CA)内で鋳型をクローン化し、Ｐ１およびＰ２を用い てＰＣＲ増幅により１７４ｂｐの長さの線状二本鎖ＤＮＡ鋳型を得た。ＰＣＲ増 幅中に使用したヌクレオチドおよびプライマーを除去するために、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａ−クイックカラム(Qiagen GmbH,Hilden，Germany)で鋳型ＰＣＲ産物を精 製した。 精製した鋳型（１Ｘ ＰＣＲ緩衝液(Perkin Elmer,Foster City,CA)と０．２ｍ Ｍの４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩（ｄＮＴＰ）(Pharmacia,Uppsa la,Swcden)、および２．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラー ゼ(Perkin Elmer,Foster City,CA)とを含有する５０μｌ溶液中）を支持体上、 すなわちＰ１およびＰ２を移植したヌクレオリンクプレート（プレートは、室温 で１５分間、１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ(ｐＨ７．５)、１５０ｍＭ ＮａＣｌお よび０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０(Fluka,Switzerland)を含有する溶液ですすいだ ）上に広げた。この溶液を９３℃で９分間インキュベートしてＤＮＡポリメラー ゼを活性化し、次いでＰＴＣ２００サーモサイクラーで６０サイクル(９４℃／ ３０秒、４８℃／３０秒、７２℃／３０秒)を行った。いくつかの異なる濃度の ＰＣＲ鋳 型を試験し(約１、０．５、０．２５、０．１２５、０．０６２５ｎｇ／μｌ)、 それぞれのサンプルに対してＴａｑポリメラーゼを含まずに実施する対照反応を 行った(前記と同じ濃度であるが、ＤＮＡポリメラーゼは除かれている)。 各サンプルを二本鎖ＤＮＡに対して高感度の染料であるＹＯ−ＰＲＯ(Molecul ar Probes,Portland OR)で染色した。得られた生成物を適当な励起（４８８アル ゴンレーザー）および検出フィルター（５１０低通過フィルター）を備えた４０ 倍の対物レンズ(LSM 410,Carl Zeiss AG,Oberkochen，Germany)を用いて共焦1顕 微鏡で観察した(注：各ウェルの底は平らであり、倒立蛍光顕微鏡で観察が可能 である)。 図６Ａでは、対照ウェル（ＤＮＡ鋳型を添加せず、パネルａ）はブランク表面 上で対象物がまれにしか観察できないことを示している(これらの対象物はこの 段階で、焦点が正しいことを報告するのに有効であった)。これらの対象物は不 規則な形状を有しており、その大きさは２０〜１００マイクロメートルであり、 観察した視野の深度よりはるかに大きい厚みを有している。ＤＮＡポリメラーゼ が存在するウェルの中で(図６Ａ、パネルii)、対照ウェル中では、不規則な形状 の対象物が観察される他、多数の蛍光スポットを観察することができる。それら は円形を示し、大きさは１〜５マイクロメートルであり、視野をわたるものでは ない。スポットの数はコロニー形成を開始させるために用いた鋳型の濃度に依存 する。観察されたコロニーの大きさから、１０，０００を越える別個のコロニー が支持体の１ｍｍ²内に並んでいると判断することができる。 実施例３ オリゴヌクレオチド(Microsynth GmbH,Switzerland)をヌクレオリンクウェル( Nunc,Denmark)上に移植した。オリゴヌクレオチドＰ１は配列５’−ＴＴＴＴＴ ＴＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＧＧに相当し、オリゴヌクレオチドＰ ２は５’−ＴＴＴＴＴＴＣＴＣＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧに 相当する。それぞれのヌクレオリンクウェルに、３６０ｆｍｏｌのＰ１および３ ６０ｆｍｏｌのＰ２を含有する１０ｍＭ １−メチル−イミダゾール（ｐＨ７． ０）(Sigma Chemicals,St.Louis,MO)溶液を４５μｌ添加した。１０ｍＭ １−メ チル−イミダゾール中の４０ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロ ピル）−カルボジイミド（ｐＨ７．０）(Sigma Chemicals)１５μｌを、各ウェ ルのオリゴヌクレオチド溶液に添加した。次いでウェルを密封し、５０℃で１６ 時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを２００μｌのＲＳ （０．４Ｎ ＮａＯＨ，０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回すすぎ、２００μ ｌのＲＳとともに１５分間インキュベートし、２００μｌのＲＳで２回洗浄し、 さらに２００μｌのＴＮＴ（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５，１５０ｍ Ｍ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、その後これらをオー ブンに入れて５０℃で乾燥させた。乾燥させた管は、密封したプラスチックバッ グ中で４℃にて保存した。 各ウェル内では、１５μｌの開始混合物（１Ｘ ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭ ｄ ＮＴＰおよび０．７５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、 ２０ナノグラムの鋳型ＤＮＡ、ここで図６Ｂについての考察に示したように、鋳 型ＤＮＡはＳ１ ＤＮＡまたはＳ２ＤＮＡのいずれかであるか、または異なる比 のＳ１ ＤＮＡおよびＳ２ ＤＮＡの混合物である）でコロニー増殖を開始させた 。Ｓ１およびＳ２は、それぞれ７０４塩基対および６５８ｂｐの断片であり、そ れらをｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ Ｓｋｍｉｎｕｓプラスミド中にクローン化し、 次いでプライマーとしてＰ１およびＰ２を用いたＰＣＲにより増幅させた。ヌク レオチドおよびプライマーを除去するため、断片をＱｉａｇｅｎ Ｑｉａ−クイ ックカラム(QIAGEN GmbH,Gcrmany)で精製した。 各ウェルをＣｙｃｌｅｓｅａｌ（登録商標）(Robbins Scientific Corp.,Sunn yvale,CA)で密封し、９３℃で９分間、６５℃で５分間さらに７２℃で２分間イ ンキ ュベートし、９３℃に戻した。次いで２００μｌのＴＮＴ溶液を用いて、９３℃ で３回連続して１分間の洗浄を行った。次いで開始混合物を１５μｌの増殖混合 物（開始混合物と同一であるが鋳型ＤＮＡを除いたもの）に置き換え、密封した ウェルを９３℃で９分間インキュベートし、以下の条件、すなわち９３℃で４５ 秒、６５℃で３分間、７２℃で２分間を４０回繰り返して増幅を行った。このプ ログラムの完了後、さらに使用するまでウェルを６℃で維持した。温度制御は、 ＰＴＣ２００サーモサイクラー中でヌクレオリンクキット中に装備されたシリコ ンパッドおよび加熱した（１０４℃）ＰＴＣ ２００のふたを用いて行った。 Ｐ１またはＰ２配列を含んではいないがＳ１断片の対照配列に相当する６４０ 塩基対の断片を、前記のＰＣＲにより増幅させた。製造業者の指示に従いＰｒｉ ｍｅ−ｉｔ ＩＩランダムプライマーラベリングキット(Stratagene，San Diego, CA)を用いてビオチン−１６−ｄＵＴＰ(Boehringer-Mannheim,Gcrmany)で標識し た。 密封したウェルを使用し、以下の温度スキームを用い(ＰＴＣ２００サーモサ イクラー内で)、ＥａＳｙＨｙｂ(Boehringer-Mannheim,Germany)中でビオチニル 化プローブをサンプルとハイブリダイズさせた：９４℃で５分間、次いで３０秒 ごとに温度を０．５℃下げる６８工程(換言すれば、３４分間に温度を６０℃下 げる)。次いでサンプルを室温にて２００μｌのＴＮＴで３回洗浄した。次いで ウェルを０.１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを含有する５０μｌのＴＮＴとともに３０分間 インキュベートした。次いでウェルを１５μｌの赤色蛍光性のヌートラビジンで 被覆した４０ｎｍ フルオスフェア（登録商標）(５８０ｎｍ励起および６０５ｎ ｍ発光，Molecular Probes,Portland,OR)とともに５分間インキュベートした。 微小球の溶液は２μｌの微小球原液からなり、それを５分間５０Ｗの超音波水浴 (Elgasonic,Bienne,Switzerland)中で音波処理し、０．１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを 含有する１ｍｌのＴＮＴ溶液で希釈し、Ｍｉｌｌｅｘ ＧＶ４ポアサイズ０．２ ２μｍのフ ィルター(Millipore,Bedford,MA)を通して濾過した。 Ａｘｉｏｖｅｒｔ １０型倒立顕微鏡を用い、Ｍｉｃｒｏｍａｘ ５１２ｘ７６ ８ ＣＣＤカメラ(Princeton Instruments,Trenton,NJ)を備えた２０倍の対物レ ンズ(Carl Zeiss AG，Oberkochen，Germany)を用い、ＸＦ４３フィルターセット (PB546/FT580/LP590，Omega Optical,Brattleboro,VT)で、１０秒間採光して染 色したサンプルを観察する。フェイルをＴＩＦＦフォーマットに変換し、好適な ソフトウェア(PhotoPaint，Coral Corp.,Ottawa，Canada)で処理した。レーザー プリンターで白黒のプリントアウトに適した画像を提供するために、処理は反転 および線形対照増強からなる。 図６Ｂは、開始反応に用いられる３つの異なる比のＳ１／Ｓ２鋳型についての 結果を示している：ｉ）Ｓ１／Ｓ２は１／０であり、多くのスポットを観察する ことができ、ii）Ｓ１／Ｓ２は１／１０であり、スポットの数は期待通り、ｉ） の像において観察できるスポットの数の約１／１０であり、またiii）Ｓ１／Ｓ ２は０／１であり、少数のまれなスポットしか見られない。Ｃ 標的分子が固定化プライマーと相補的な内部配列を含む場合の、核酸分子の 同時増幅・固定化を示すスキーム 図７は、図１および５で示された標的分子の５’末端および３’末端に示され ている配列が標的分子の末端に位置している必要はないということを示すために 提供される。 標的核酸分子（II）は、プライマー（配列５’−ＡＡＡおよび５’−ＣＣＣ） とアニーリングする相補配列を提供するためにプライマーとのアニーリングにも 、鋳型として作用にも関与していない各々の（またはいずれかの）末端に配列を 有していてもよい。内部配列（５’−ＡＡＴ）の１つは、図７（ａ）〜７（ｅ） で明らかなように、（５’−ＴＴＴ）に対する相補配列であるIIIを合成するた めの鋳型として使用される。 しかしながら配列５’−ＴＴＴは、図７（ｆ）〜７（ｋ）で明らかなように、 それに対して相補的な配列を提供するためにはそれ自身使用されない。図７（１ ）から、２ラウンドのプライマー伸長および鎖分離工程の後に、された４本の固 定化鎖のうちの１本のみが付加配列５’−ＴＴＴを含んでなり、この配列に対す る相補配列（５’−ＡＡＡ）を含んでなる鎖は存在しない（すなわち、他のもの よりもはるかに大きい１本の鎖のみが存在する）ということがわかるであろう。 数ラウンドの増幅の後、配列５’−ＴＴＴを含んでなる鎖は、存在する伸長した 固定化核酸分子の総数の中に有意な割合を占めないであろう。Ｄ）核酸鎖の付加コピーを合成するためのコロニー中に存在する核酸鎖に使用 本発明によって得られたコロニー中に存在する増幅した一本鎖核酸分子は、付 加的核酸鎖を合成するために鋳型としてそれ自身を使用することができる。 図８は、出発点として固定化核酸を用いる付加的核酸を合成する１つの方法を 示している。 コロニーは通常、所定の核酸鎖および固定化形態にあるその補体の双方を含ん でなる(図８ａ)。従って、それらを用いて所定の核酸鎖だけでなくその補体の付 加コピーを提供することもできる。 これをなす１つの方法は、本発明によって提供されたコロニー(図８ｃ)中に存 在する増幅した固定化核酸鎖とアニーリングする１以上のプライマー（プライマ ーＴＴＡおよびＴＧＧ）の溶液を提供することである。(これらのプライマーは 固定化形態ではなく遊離形態で提供される場合は別として、固定化コロニーを提 供するために最初に用いられたプライマーと同一のものであってもよい。)最初 のＤＮＡコロニーを加熱により変性させて一本鎖の形態（図８ｂ）とし、これに よって、プライマーＴＴＡおよびＴＧＧを各ＤＮＡ鎖の有効な３’末端とアニー リングさせることが可能となる。次いでＡｍｐｌｉｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ および４種のデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩（標識または非標識）を用い たプ ライマーを伸長させ、固定化核酸鎖または少なくともそれの一部に相補的な鎖を 合成することができる(工程(iii))。 前記の工程によってひと度新しく生じる鎖（図８ｄ）を合成されれば、それら をそれらがハイブリダイズしていた固定化鎖から分離（例えば、加熱によって） させることができる。次いで所望によりＰＣＲ反応を用いてこの工程を繰り返し 、多数のかかる鎖の溶液を提供することができる。 このようにして合成された鎖は、固定化鎖から分離した後に、所望により、互 いにアニーリングさせ（すなわち、所定の鎖およびその補体がアニーリング可能 である）、二本鎖核酸分子の溶液を提供することができる。また、それらを互い から分離させて一本鎖核酸分子の均一な集団の溶液を提供することができる。 ひと度一本鎖分子が溶液として提供されれば、それらをＰＣＲ（または逆ＰＣ Ｒ）用の鋳型として使用することができるということにも注目すべきである。従 って、所定の鎖およびそれと相補的な鎖をさらに増幅させるために、固定化核酸 鎖を連続使用することは必ずしも必要ではない。 複数のコロニーが提供され、異なるコロニー中の核酸鎖が異なる配列を有する 場合、付加的核酸分子の合成に鋳型として使用する特定のコロニーだけを選択で きることに注目すべきである。このことは、選択したコロニー中に存在する分子 に特異的なプライマー伸長のためのプライマーを用いることによりって行うこと ができる。 また、コロニーのうちのいくつかまたは総てを鋳型として使用可能とするため のプライマーを提供することもできる。かかるプライマーは多くの異なるプライ マーの混合物（例えば、コロニーの総てを提供するために最初に使用された総て のプライマーの混合物であるが、固体化形態ではなく溶液で提供されるプライマ ーを伴うもの）であってもよい。 実施例４ オリゴヌクレオチド(Microsynth GmbH Balgach,Switzerland)をヌクレオリン クウェル(Nunc,Denmark)に移植した。オリゴヌクレオチドＰ１は配列５’−ＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣに相当し 、オリゴヌクレオチドＰ２は５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡ ＧＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＧＧに相当する。各ヌクレオリンクウェルに、３６０ ｆｍｏｌのＰ１および３６０ｆｍｏｌのＰ２を含有する１０ｍＭ １−メチル− イミダゾール（ｐＨ７．０）(Sigma Chemicals)溶液４５μｌを添加した。１０ ｍＭ １−メチル−イミダゾール中の４０ｍＭ １−エチル−３−（３−ジメチル アミノプロピル）−カルボジイミド（ｐＨ７．０）(Sigma Chemicals)１５μｌ を各ウェルのオリゴヌクレオチド溶液に添加した。次いでウェルを密封し、５０ ℃で１６時間インキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを２００μ ｌのＲＳ（０．４Ｎ ＮａＯＨ，０．２５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回すすぎ、 ２００μｌのＲＳとともに１５分間インキュベートし、２００μｌのＲＳで２回 洗浄し、さらに２００μｌのＴＮＴ（１００ｍＭ トリス／ＨＣｌ ｐＨ７．５， １５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で２回洗浄し、その後それ らをオーブンに入れて５０℃で乾燥させた。乾燥させた管は、密封したプラスチ ックバッグ中で４℃にて保存した。 各ウェルの中で、１５μｌの開始混合物（１Ｘ ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭ ｄ ＮＴＰおよび０．７５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ ＤＮＡポリメラーゼ、 ２０ナノグラムの鋳型ＤＮＡ、ここで実施例３での考察で示されるように鋳型Ｄ ＮＡはＳ１ ＤＮＡまたはＳ２ ＤＮＡのいずれかであるか、またはＳ１ ＤＮＡ およびＳ２ ＤＮＡの１／１混合物である）でコロニー増殖を開始させた。Ｓ１ およびＳ２は、それぞれ６５８塩基対および７０４ｂｐの断片であり、これらは 実施例３に記載の通りに調製した。 各ウェルをＣｙｃｌｅｓｅａｌ（登録商標）(Robbins Scientific Corp.,Sunn yval e,CA)で密封し、９３℃で９分間、６５℃で５分間さらに７２℃で２分間インキ ュベートし、９３℃に戻した。次いで２００μｌのＴＮＴ溶液を用いて、９３℃ で３回連続して１分間の洗浄を行った。次いで開始混合物を１５μｌの増殖混合 物（開始混合物と同一であるが鋳型ＤＮＡを除いたもの）に置き換え、密封した ウェルを９３℃で９分間インキュベートし、以下の条件、すなわち９３℃で１５ 分間、６５℃で３分間、７２℃で２分間を４０回繰り返して増幅を行った。この プログラムの完了後、さらに使用するまでウェルを６℃で維持した。ＰＴＣ ２ ００サーモサイクラー中で温度制御を行った。 ６セット（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，ＥおよびＦ）の３つのウェル（１，２，３）(こ こで、１つは鋳型Ｓ１で調製したもの、１つは鋳型Ｓ１および鋳型Ｓ２で調製し たもの、また１つは鋳型Ｓ２単独で調製したもの)に異なる処理を施した（Ａ１ ，Ａ２，Ａ３，…，Ｆ１，Ｆ２，Ｆ３が得られる）。セットＡは処理せずに残し 、セットＢは３７℃で１０分間ＢＡＬ−３１緩衝液中でＢＡＬ−３１エキソヌク レアーゼ(New England Biolabs,Beverly,MA)とともにインキュベートし(ＢＡＬ −３１は本質的に両末端ともにフリーである二本鎖ＤＮＡを消化する)、セット Ｃは３７℃で１０分間Ｓ１緩衝液中でＳ１ヌクレアーゼ(Pharmacia,Uppsala,Swe den)とともにインキュベートし(Ｓ１ヌクレアーゼは本質的に一本鎖ＤＮＡを消 化する)、セットＤ、ＥおよびＦはＢＡＬ−３１およびＳ１ヌクレアーゼの双方 とともにインキュベートした。反応は、ウェルをＴＮＴ緩衝液ですすぐことによ り停止させた。 セットＡ、Ｂ、ＣおよびＤにおいて、０．２５μＭのプライマーＰ７０（５’ −ＣＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＡＣＣＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ ＴＡＧＧＧＣＧＡＡ）およびＰ７１（５’−ＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＡＡＧ ＧＧＡＡＡＧＧＧＴＡＡＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡ）溶液を有するヌ クレオリンクウェル中で、ＰＣＲ（２５サイクル、９４℃で３０秒、６０℃で４ ５秒、７２℃で４５秒）を行った。プライマーＰ７０はプライマーＰ１の配列を 含んでおり、Ｐ７１はＰ２を含んでいるので、Ｐ７０およびＰ７１はＳ１および Ｓ２の双方の増幅に適している。セットＥのウェルにおいては、３２１ｂｐのＰ ＣＲ産物を産生するためにＳ１内には存在するがＳ２内には存在しない一組の正 （Ｐ１５０，５’−ＧＧＴＧＣＴＧＧＴＣＣＴＣＡＧＴＣＴＧＴ）および逆プラ イマー（Ｐ１５１，５’−ＣＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＴ）でＰＣ Ｒを行い、セットＦのウェルにおいては、３９０ｂｐのＰＣＲ産物を産生するた めにＳ２内には存在するがＳ１内には存在しない一組の正（Ｐ１５２，５’−Ｃ ＴＧＧＣＣＴＴＡＴＣＣＣＴＡＡＣＡＧＣ）および逆プライマー（Ｐ１５３，５ ’−ＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＣＡＡＴ）でＰＣＲを行った。１８のＰ ＣＲ反応のそれぞれに対し、０．１μｇ／ｍｌの臭化エチジウムの存在下、３μ ｌの溶液を１％のアガロース上でのゲル電気泳動に使用した。ゲルの写真を図９ に表す。これらの写真は、コロニー中のＤＮＡがエキソヌクレアーゼから保護さ れ(セットＡと比較したセットＢ、ＣおよびＤ)、Ｓ１およびＳ２の双方がＰ１お よびＰ２を用いて同時に（セットＡ、Ｂ、ＣおよびＤ）または特異的に（セット ＥおよびＦ）回収できるということを示している。より短いＰＣＲ産物がセット Ａ、Ｂ、ＣおよびＤでのより長いＰＣＲ産物よりもより効率よく増幅されるセッ トＥおよびＦにおいて、Ｓ１鋳型とＳ２鋳型との間の交叉汚染が検出できる(レ ーンＥ２およびＦ１を参照)。Ｅ）２次コロニーの供給 また、最初に形成したコロニーを改変して、種々のコロニーを提供する（すな わち、最初に形成したコロニー中に存在するそれらの分子とは異なる配列を有す る固定化核酸分子を含んでなるコロニーを提供する）ことも可能である。ここで 、最初に形成したコロニーを「１次コロニー」と呼び、後に形成したコロニーを 「２次コロニー」と呼ぶ。１次コロニーを２次コロニーの形成に適した「２次プ ライ マー」に変えるためには予備的手順が必要である。 図１０は、既存の１次コロニーを用いていかにして「２次コロニー」を形成さ せるかということを示している。出発点として、１次コロニー（図１０ａ）を完 全にハイブリダイズした二本鎖の形態にしておく。一本鎖特異的ＤＮＡエキソヌ クレアーゼを用いて、伸長しなかったプライマーを総て除去してもよい。ＤＮＡ ターミナルトランスフェラーゼを用いてジデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩 でプライマーのフリーの３’−ＯＨ末端の総てをキャップすることを選択するこ ともできる(工程(ｉ)，図１０ｂ)。 第二に、また独立して、コロニーを形成しているＤＮＡ分子をエンドヌクレア ーゼを用いることにより切断することができる。例えば、コロニー内の特異的部 位を認識する制限酵素（図１０ｃでは「ＲＥ」矢印で描かれている）はＤＮＡコ ロニーを切断する(工程(ii)，図１０)。所望により、次いで酵素的に切断したコ ロニー（図１０ｄ）を３’ないし５’の二本鎖特異的エキソヌクレアーゼで部分 的に消化することができる(例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアー ゼIII、「Ｎ」で描かれている、工程(iii)、図１０ｄ)。いずれの場合でも変性 （例えば、加熱による）および洗浄の後に２次プライマーが得られる(図１０ｅ) 。 別法として、コロニーを形成している二本鎖ＤＮＡ（図１０ｆ）は、二本鎖Ｄ ＮＡの１本の鎖だけを消化する二本鎖特異的３’−５’エキソヌクレアーゼで消 化することもできる。重要な場合は、溶液に放出される前にエキソヌクレアーゼ がＤＮＡ分子の少数の塩基だけを消化する場合、またもう１つの酵素がＤＮＡ分 子に結合している際に消化が進行する場合である(図１０ｇ)。この場合、エキソ ヌクレアーゼの消化は、平均して出発物質の半分の長さであり、コロニー中の一 本鎖分子中に残存している（部分的に２重らせんを形成できる）相補部分を持た ない一本鎖の分子しか残らなくなるまで進行すると考えられる(図１０ｈ)。 総ての場合において、これらの処理によって、最初の鋳型の配列に相当する支 持体に移植された一本鎖の断片が得られ、コロニー開始のために適当な新しい鋳 型が得られば、それを新たなＤＮＡコロニーの増殖に使用することができる(図 １０ｅおよび１０ｈ)。 このようにかかる処理の結果、２次プライマーを保持している支持体を「２次 コロニー増殖用の支持体」という。２次コロニーの増殖に有用な鋳型は、公知の 配列（またはかかる配列の補体）を有する分子を含んでいてもよい。別法として 、鋳型は、配列決定されていない分子（例えば、ランダムフラグメント）に由来 していてもよい。いずれにしても、鋳型は１次コロニー中に存在する核酸鎖とア ニーリングするための１つ以上の領域が提供されなければならない。 図１１ａ〜ｅは、適当な鋳型（ＴＦ，図１１ａ）が２次プライマーを保持して いる２次コロニー増殖用の支持体上に、２回目のＤＮＡコロニー形成のために提 供されている場合に、いかにして２次コロニーを形成させ得るかということを示 している。この例では、前記の１次コロニーの処理によって２次プライマーであ るＳＰ１およびＳＰ２が形成する(図１１ａ)。鋳型ＴＰはその相補的２次プライ マーであるＳＰ１とハイブリダイズし、ＤＮＡポリメラーゼを用いた伸長反応の 後に、描かれているように伸長すると考えられる(図１２ｂ)。変性(工程ii)、再 アニーリング（工程iii）およびＤＮＡポリメラーゼ（工程iv）サイクルの後、 元の１次コロニーの複製が形成される(図１１ｅ)。 本発明のこの具体例によって提供される２次コロニーの最大の大きさは、それ が増殖する１次コロニーの大きさによって制限される。いくつかの２次増殖過程 を連続的に用いて、特異的な適用のためのコロニーを作出することができる(す なわち、第１のコロニーは第２のコロニーに置き換えることができ、第２のコロ ニーは第３のコロニーに置き換えることができる等)。Ｆ）伸長したプライマーの供給 図１２は、オリゴヌクレオチドの配列上でいかにして伸長したプライマーを形 成させ得るかということを示している。同方法は、第Ｅ節に記載のコロニーまた は２次プライマーで被覆した支持体にも適用することができる。 図１２ａ）では、その上に示した多数の固定化プライマーを有する支持体が手 共される。種々の固定化プライマーが（四角で表される）支持体の異なる領域に 存在するように示されている。配列５’−ＡＡＡを有するプライマーが一方の四 角に存在し、配列５’−ＧＧＧを有するプライマーは他方の四角に存在する。 図１２ｂ）〜１２ｄ）は、いかにして存在する最初のプライマー（最初のプラ イマー）を改変して異なるプライマー（伸長プライマー）を得るかということを 示している。この例では、配列５’−ＡＡＡを有する最初のプライマーを改変し て、それぞれ配列５’−ＡＡＡＧＣＣおよび５’−ＡＡＡＴＡＣを有する２種の 異なる伸長プライマーを産生する。このことはオリゴヌクレオチド鋳型である５ ’−ＧＴＡＴＴＴおよび５’−ＧＧＣＴＴＴの表面に固定化された１次プライマ ーとのハイブリダイゼーション(図１２ｂ)、続くＤＮＡポリメラーゼ反応によっ て達成される。配列５’−ＧＧＧを有する最初のプライマーを改変して、類似の 方法で配列５’−ＧＧＧＴＡＴおよび５’−ＧＧＧＴＡＡ（図１２ｄ）を有する ２種の異なる伸長プライマーを産生される。 伸長したプライマー産生する技術は、ＤＮＡチップまたは他の表面上に提供さ れた固定化オリゴヌクレオチドを転換して、特定の標的核酸配列を増幅し、およ び／またはそれに対する相補鎖を増幅するのに有用な固定化プライマーとするの に有用である。Ｇ）核酸断片の調製 本発明の装置は、それらのいくつかを後ほど記載するで種々の方法に使用する ことができる。コロニーの形成に使用する核酸断片を異なる方法で別々に調製し てもよい(本明細書中では「調製核酸」と呼ぶ)。種々の調製法を以下に記載する 。 （ｉ）ランダムＤＮＡ断片の調製 ここでは、それがコロニー内に組み込まれているときにＤＮＡの起源をたどる 必要がない場合において、増幅のためのある生物サンプル（または複数のサンプ ル）に由来するＤＮＡを調製する方法を説明する。 まず、注目するＤＮＡを生物サンプルから抽出し、ランダムに切断して「小」 片とする(例えば、５０〜１０，０００塩基長であるが、好ましくは５００〜１ ０００塩基対の長さであり、バー「Ｉ」で表される、図１３ａ)。(このことは、 例えばフェノール−クロロホルム抽出とそれに続く超音波処理、機械的剪断によ って、しばしばフレケントカッター(frequent cutter)制限エンドヌクレアーゼ での部分的消化、または当業者に公知の他の方法によって行うことができる)。 実験条件を標準化するために、抽出・切断したＤＮＡ断片を、例えばアガロース ゲル電気泳動、ショ糖勾配遠心分離またはゲルクロマトグラフィーによって大き さで分別することができる。単一の画分内で得られた断片を、鋳型の大きさの多 様性を小さくするための鋳型の提供に使用することができる。 次ぎに、抽出・切断して（光学的に）選別した鋳型ＤＮＡ断片を、予め支持体 に移植されたプライマー配列を含有するオリゴヌクレオチドリンカー（IIａおよ びIIｂ，図１３ａ）で連結することができる。このことは、例えば「平滑末端」 連結反応を用いて達成することができる。別法として、支持体に移植されたプラ イマー配列によってフランクされている部位で、鋳型ＤＮＡ断片を生物ベクター 中に挿入することができる。このクローン化ＤＮＡを生物宿主内で増幅させ、抽 出することができる。明らかに、ＤＮＡコロニーの形成用の固形支持体に移植さ れた単一のプライマーを用いて研究する場合には、Ｐ１およびＰ２プライマーの 双方を含有する断片を精製することに問題はない。 以下、かかる好適な方法の後に得られたＤＮＡ断片を、「調製ゲノムＤＮＡ」 （III，図１３ａ）という表現で示す。 （ii）複数のサンプルに由来するランダムＤＮＡ断片の調製 ここでは、それがコロニー内に組み込まれているときにＤＮＡの起源をたどる 必要がない場合において、複数の生物サンプルに由来するＤＮＡをいかにして調 製するかということを記載する。 ランダムに切断したゲノムＤＮＡ断片に尾を付けるために使用されるオリゴヌ クレオチドリンカーは現在、表面に移植されたプライマー配列(Ｐ１およびＰ２ 、図１３ｂ)、および各サンプルについて異なっており、ＤＮＡコロニーの起源 を同定するために用いられる「タグ」配列の２つの部分から作製され、この場合 を除き、方法は前節に記載したものと同一である。各サンプルに対して独自のも のでなくともよいが、複数のタグを使用することができることを注記する。以下 、発明者らはかかる好適な方法の後に得られたＤＮＡ断片を「タグ付きゲノムＤ ＮＡ」（III，図１３ｂ）という表現で示す。 このタグを付ける方法を、鋳型それ自身によって保持される配列によらない同 定手段を保持するコロニーを提供するために用いることができる。これはまた、 いくつかのコロニーを（第Ｄ節において得られた方法を用いて）特異的に回収す べき場合に有用である。またこれは、回収したコロニーを、例えば新しい１次コ ロニーを作出することによってさらに処理し、最初のコロニーと新しいコロニー との間の交叉参照が望まれる場合にも有用である。 （iii）１つのサンプルに由来する複数のＤＮＡ配列に相当するＤＮＡ断片の調 製 注目するＤＮＡは、まず、（前記のような）当業者に公知のいずれの手段によ っても生物サンプルから抽出できる。次いで注目する特異的配列を２つの部分か らなるＰＣＲプライマー（IIａおよびIIｂ）を用いるＰＣＲ（工程(ｉ)，図１３ ｃ）で増幅することができる。ここで、２つの部分とは、１）５’末端で、表面 に移植されているプライマーオリゴヌクレオチドの配列に相当する配列(Ｐ１お よび Ｐ２)、２）３’末端で、注目する配列に特異的なプライマー配列（Ｓ１および Ｓ２）である。以下、発明者らはかかる好適な方法の後に得られたＤＮＡ断片を 「調製ＤＮＡ」（III，図１３ｃ）という表現で示す。 （iv）複数のサンプルに由来する複数のＤＮＡ断片の調製 ＰＣＲ増幅（工程(ｉ)，図１３ｄ）を行うために使用されるＤＮＡプライマー （IIａおよびIIｂ）は現在、１）表面に移植されているプライマーの配列(Ｐ１ およびＰ２)、２）各サンプルに対して異なっており、ＤＮＡコロニーの起源を 同定するために用いられる「タグ」配列、および３）注目する特異的配列（Ｓ１ およびＳ２）に相当するプライマー配列、の３つの部分から作製され、この場合 を除けば方法は前節において記載したものと同一である。ここでＤＮＡプライマ ーは前記（ii）のように、各サンプルに対して複数のタグを使用してもよいこと を注記する。 以下、発明者らはかかる好適な方法の後に得られたＤＮＡ断片を「タグ付きＤ ＮＡ」（III，図１３ｄ）という表現で示す。タグの使用の可能性は前記（ii） と同じである。 （v）ｍＲＮＡの調製 当業者に公知のいずれかの手段によって（例えば、市販のｍＲＮＡ調製キット の使用により）ｍＲＮＡを抽出することが出発点であることを除けば、方法は前 節でＤＮＡ断片を調製するために記載した方法と同様である。当業者に公知のい ずれの手段によっても（例えば、逆転写酵素およびＰＣＲポリメラーゼの使用に より）ｍＲＮＡをコピーして二本鎖ｃＤＮＡとすることができる。確かに、前記 のタグおよびプライマーを二本鎖ｃＤＮＡの合成工程と組み合わせて使用すると 、それらの鋳型中への組み込みが可能となる。以下、発明者らはかかる好適な方 法の後に得られたｍＲＮＡ断片を「調製全ｍＲＮＡ」（前記第（Ｉ）節において 記載した「調製ゲノムＤＮＡ」を参照）、「タグ付き全ｍＲＮＡ」(前記第（ii ） 節において記載した「タグ付きゲノムＤＮＡ」を参照)、「調製ｍＲＮＡ」(前記 第（iii）節において記載した「調製ＤＮＡ」を参照)、および「タグ付きｍＲＮ Ａ」(前記第（iv）節において記載した「タグ付きＤＮＡ」を参照)、という表現 で示す。Ｈ）好ましい検出アッセイ 本発明の分析方法では、標識を用いて検出可能なシグナルが提供され得る。例 としては ａ）蛍光基またはエネルギー転移に基づく蛍光系、 ｂ）ビオチンに基づく系。この場合には、コロニーを蛍光基または酵素で標識 したストレプトアビジン（例えば、ストレプトアビジンで被覆した蛍光ラテック スビーズ、蛍光基で標識したストレプトアビジン、対応する蛍光アッセイととも に使用するための酵素）とともにインキュベートすることができる、 ｃ）抗原またはその断片、例えばハプテン（ビオチンおよび蛍光基を含有）の 検出に基づく系。この場合には、コロニーを抗体（例えば、ハプテンに特異的な もの）とともにインキュベートすることができる。抗体は蛍光基または酵素で標 識することができる（例えば、抗体で被覆した蛍光性ラテックスビーズ、蛍光性 基で標識した抗体、対応する蛍光または発光アッセイに使用するための酵素と結 合した酵素など）、 ｄ）放射性標識(例えば、核酸に放射性リン酸基を付加するために５’−ポリ ヌクレオチドキナーゼおよび［γ−³²Ｐ］アデノシン三リン酸塩またはＤＮＡポ リメラーゼおよび［α−³²Ｐまたはα−³³Ｐ］デオキシリボヌクレオシド三リン 酸塩を用いることによって組み込む)。ここで、コロニーはシンチレーション液 とともにインキュベートすることができる、 ｅ）染料または他の染色剤 が挙げられる。 本発明に使用される標識は、 ａ）核酸と、 ｂ）二本鎖ＤＮＡ（例えば、ヒストン、リプレッサー、エンハンサー）と特異 的に結合するタンパク質と、 および／または ｃ）一本鎖ＤＮＡ（例えば、一本鎖核酸結合タンパク質）と特異的に結合する タンパク質と 結合していることが好ましい。 標識コロニーは、 ａ）蛍光の測定、 ｂ）発光の測定、 ｃ）放射性の測定、 ｄ）流量または電場誘導蛍光異方性の測定、 および／または ｅ）ポリマー層の厚さの測定 によって検出することが好ましい。 本発明には染色剤を使用することができる。従って、ＤＮＡコロニーを、イン ターカレート染料、臭化エチジウム、ＹＯ−ＹＯ、ＹＯ−ＰＲＯ(Molecular Pro bes,Eugene,OR)のなどの好適なＤＮＡ特異的染色剤とともにインキュベートする ことができる。 特定の染色剤を用い、その結果を好適な蛍光画像装置で観察することができる 。 以下、特定のアッセイ／方法の例をさらに詳細に説明する。Ｉ）本発明のアッセイの好ましい具体例 （ｉ）核酸プローブハイブリダイゼーションアッセイ まず、ハイブリダイゼーションのためにＤＮＡコロニーを調製する。次いでそ れらをプローブ（標識または非標識）とハイブリダイズさせる。必要ならば、ハ イブリダイズしたプローブをアッセイし、その結果を観察する。これは本発明の 装置を用いて行うことができる(例えば前記のように)。ハイブリダイゼーションのための調製 本発明の好ましい具体例では、コロニーが形成された表面に、最初に移植され たプライマーのうちの１つの二本鎖形態により提供される配列、または鋳型ＤＮ Ａ分子中に存在するもう１つの配列に特異的なＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼに でコロニーを処理する(例えば、図１６ｃ参照)。 制限酵素消化の後に、二本鎖ＤＮＡが分離するのに十分に高い温度までコロニ ーを加熱することができる。この熱変性工程の後にコロニーを洗浄し、ハイブリ ダイズしていない、結合していない一本鎖ＤＮＡを除去し、残りの結合した一本 鎖ＤＮＡを残すことができる。 もう１つの具体例では、３'末端から開始してＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を 除去し、その結果一本鎖形態のＤＮＡ分子の一部が残った、二本鎖特異的３'→ ５'ＤＮＡエキソヌクレアーゼでコロニーを部分的に消化することができる(第Ｅ 節、図１０ｆ参照)。 別法として、コロニー中のＤＮＡをまず熱変性させ、次いで３'末端から開始 して一本鎖ＤＮＡを消化する一本鎖特異的３'→５'ＤＮＡエキソヌクレアーゼで 部分的に消化することもできる。 さらなる別法は、単にコロニー中でＤＮＡを加熱変性させることである。プローブのハイブリダイゼーション 一本鎖核酸プローブ（標識または非標識）は、適切な温度および緩衝液条件（ 各々のプローブの配列に依存し、当業者に公知のプロトコールを用いて決定する ことができる）でコロニー中の一本鎖ＤＮＡとハイブリダイズすることができる 。非標識ハイブリダイズプローブのアッセイ 最初に非標識形態で提供されたハイブリダイズプローブを、ＤＮＡポリメラー ゼを用いる、異なる（またはサブセットの異なる）標識した（または標識と非標 識の混合物）デオキシリボヌクレオシド三リン酸の組み込みのためのプライマー として使用することができる。次いで組み込まれた標識ヌクレオチドを前記のよ うに検出することができる。標識または非標識プローブのサイクリックアッセイ まず、ＤＮＡコロニーは、前記の方法によりハイブリダイゼーションのために 調製することができる。次いでそれらをプローブ（標識または最初は非標識）と ハイブリダイズさせることができる。必要であれば、ハイブリダイズした標識プ ローブをアッセイし、その結果を前記の装置で観察する。次いでプローブを加熱 変性によって除去し、第二のＤＮＡ配列に特異的なプローブをハイブリダイズし て検出してもよい。これらの工程はおそらくは新しいプローブを用いて所望の回 数だけ繰り返されるであろう。 次に、サブセットのみ（好ましくは１のみ）の異なるヌクレオチド（標識また は非標識）を各々のサイクルで使用する場合を除けば、プローブを非標識プロー ブに対して前記のようにアッセイすることができる。次いでヌクレオチドの組み 込みをモニターするためにコロニーをアッセイすることができる。この第２の工 程は、所望の長さの配列が決定されるまで繰り返すことができる。 （ii）in situＲＮＡ合成アッセイ この具体例では、図１４に示されたように、ＤＮＡコロニーをin situ ＲＮＡ 合成のための鋳型として使用することができる。ＤＮＡコロニーは鋳型およびプ ライマーから発生させることができ、その結果ＲＮＡポリメラーゼプロモーター 配列はコロニー中の二本鎖ＤＮＡの一方の末端に位置する。次いでＤＮＡコロニ ーをＲＮＡポリメラーゼとともにインキュベートし、新しく合成されたＲＮＡ（ ｃＲＮＡ）を所望の通りにアッセイすることができる。検出は非特異的に(例え ば、 染色)、または配列に依存する方法（例えば、ハイブリダイゼーション）で行う ことができる。 増幅されてコロニーとなるべきＤＮＡ鋳型（Ｉ，図１４ａ）を、プライマー（ IIａおよびIIｂ）を用いるＰＣＲ反応によって作出する。ここでプライマーは以 下の４つの部分、１）表面上に移植されたプライマー配列（「ＰＩ」および「Ｐ２」 ）と同一の配列、２）各サンプルとは異なる「タグ」配列、３）ＲＮＡポリメラ ーゼプロモーター、すなわちＴ３、Ｔ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター（「Ｒ ＰＰ」，図１４ａ）に相当する配列、および４）注目する特異的配列を取り囲む プライマー配列（「ＳＩ」および「Ｓ２」）を有する。以下、発明者らはかかる好適 な方法の後に得られるＤＮＡ断片を「タグ付きＲＮＡ合成ＤＮＡ」（III，図１ ４ｂ）という表現で示す。 最初のＤＮＡサンプルからＤＮＡ鋳型を増幅した後、これらの鋳型を用いてＤ ＮＡコロニーを発生させる。次いでＤＮＡコロニー（IV，図１４ｃ）をＲＮＡポ リメラーゼプロモーター（「ＲＰＰ」，図１４ｃ）に特異的なＲＮＡポリメラーゼ とともにインキュベートする。これはＤＮＡコロニー鋳型（鋳型−ｃＲＮＡ，Ｖ ，図１４ｄ）に特異的なＲＮＡのコピーを生成させる。 従って、合成されたｃＲＮＡを単離して、ハイブリダイゼーションプローブと して、in vitroタンパク質合成のためのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）鋳型 として、またはin situＲＮＡ配列分析のための鋳型として使用することができ る。 （iii）配列決定法 本発明のもう１つの具体例では、コロニーを分析してコロニーを形成する核酸 分子の配列を決定することができる。各コロニー中に非常に多くの同一核酸分子 を提供することができるので、得られた配列決定データの信頼性は非常に高いと 考えられる。 決定される配列は全部または部分的であってもよい。配列は、１つ以上のコロ ニーに存在する核酸について決定することができる。複数の配列を同時に決定し てもよい。 いくつかの具体例では、最初に配列決定すべき核酸鎖（またはその一部）に相 補的な鎖の配列を得てもよい。しかしながら、この配列は所望の配列（またはそ の一部）を提供するために塩基対合則を用いて変換することができる。この変換 は、コンピューターによってまたは人によって行うことができる。これはプライ マー伸長の各々の工程の後に行うことができるか、またはそれよりも後の段階で 行うことができる。 配列決定は種々の方法によって行うことができる。例えば、順次の制限エンド ヌクレアーゼ消化およびリンカーの結合に依存する方法を使用することができる 。かかる方法の１つが、例えば、ＷＯ９５／２７０８０に開示されている。この 方法は、プローブをポリヌクレオチドの末端に結合させ(このプローブはヌクレ アーゼ認識部位を有している)、ポリヌクレオチドの末端で１つ以上のヌクレオ チドを同定し、次いでプローブのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼ でポリヌクレオチドを切断する工程を含んでなり、その結果ポリヌクレオチドは １つ以上のヌクレオチドだけ短くなる。 しかしながら本発明の好ましい方法では、プライマーを核酸分子とハイブリダ イズし、プライマーを伸長させ、次いでプライマー伸長に用いられたヌクレオチ ドを検出することによって、増幅した核酸分子（好ましくは本明細書中で開示し たようなコロニーの形態で）を配列決定する。好ましくは、単一のヌクレオチド によってプライマーを伸長させた後、さらにヌクレオチドをプライマー伸長に使 用する前にヌクレオチドを検出する(段階的配列決定)。 プライマー伸長に使用される１以上のヌクレオチドは標識されていてもよい。 プライマー伸長の間に標識ヌクレオチドを使用することは検出を容易にする。（「 標識」とは、適当な検出系を用いて同定されるいずれの部分をも示すためにそ の広い意味で使用される。標識は天然に存在するヌクレオチドには存在しないこ とが好ましい。）理想的には、標識は、フルオロフォア(fluorophores）などの 非放射性である。しかしながら、放射性標識を使用することもできる。 ヌクレオチドが標識形態で提供される場合は、標識は種々のヌクレオチドにつ いて同一であってもよい。同一の標識を使用する場合、各ヌクレオチドの組み込 みを用いて同一シグナル（例えば、特定の波長で検出されるシグナル）の累積増 加を提供することができる。別法としては、異なる標識を（異なる波長で検出さ れてもよい）各種のヌクレオチドに使用してもよい。 従って、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰに対して４種の異なる 標識を提供してもよいし、または同一の標識をそれら総てについて提供してもよ い。同様に、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰに対して４種の異なる標識を 提供してもよいし、または同一の標識をそれら総てに対して提供してもよい。本 発明のいくつかの具体例では、後でさらに詳細に記載するが、標識および非標識 ヌクレオチドの混合物を提供してもよい。 本発明の好ましい具体例では、少なくとも２つの異なるコロニー中に存在する 核酸分子の配列決定が同時に行われる。さらに好ましくは、１０を越える、１０ ０を越える、１０００を越えるまたは１，０００，０００さえも越える異なるコ ロニー中に存在する核酸分子の配列決定が同時に行われる。従って、異なる核酸 分子を有するコロニーが提供される場合、多くの異なる配列(全部または部分的) を同時に決定することができる。すなわち、１０を越える、１００を越える、１ ０００を越えるまたは１，０００，０００さえも越える異なる配列が同時に決定 され得る。 所望により、対照を提供してもよく、それにより同一の核酸分子を含んでなる 複数のコロニーが提供される。これらのコロニー中の核酸分子に対して同一配列 が得られるかどうかを決定することにより、その配列決定法が信頼できるかどう かを確かめることができる。 本発明の１つの配列決定法を図１７に示し、それは「in situ配列決定」と題 されている。適当な配列決定プライマーとハイブリダイズした調製ＤＮＡコロニ ー上で、個々のデオキシリボヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼとの環 状付加によって配列決定プライマーに対して３’のＤＮＡ配列の決定が即可能と なる。図１７で概説した例において、ｄＧＴＰの付加によってコロニー１が「Ｇ 」を含むと決定することができる。２度目のｄＡＴＰの環状付加が双方のコロニ ーで検出される場合には、双方のコロニーが次の位置に「Ａ」を有していると決 定される。単一デオキシリボヌクレオシド三リン酸の付加を数回繰り返した後に は、いずれの配列をも決定することが可能となる。例えば、少なくとも１０、少 なくとも２０、少なくとも５０または少なくとも１００塩基の配列が決定され得 る。 コロニーが最初に二本鎖を含んでなる形態で提供される場合には、そのコロニ ーを処理して前記の配列決定に使用するための一本鎖分子を得ることができる。 (しかしながら、二本鎖分子はかかる処理をすることなく配列決定に用いること ができることにも注目すべきである。例えば、二本鎖ＤＮＡ分子はプロモーター 配列とともに提供することができ、次いでＲＮＡポリメラーゼおよび標識したリ ボヌクレオチドを用いて段階的配列決定を行うことができる(図１６ｄを参照)) 。 もう１つの別法はニック（切れ目）を二本鎖ＤＮＡ分子中に導入し、その結果 標識したデオキシリボヌクレオチドおよび５’ないし３’エキソヌクレアーゼ活 性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いてニック翻訳を行うことができる。） コロニー中に存在する二本鎖分子を処理して一本鎖コロニーを得る１つの方法 は、図１９を参照して後で記載する。ここで、コロニー中に存在する二本鎖の固 定化分子を切断し（架橋様構造の形態であってもよい）、次いで変性工程を行う 。(別法として、変性工程を最初に使用し、次いで切断工程を行うこともできる) 。切断は酵素的に行うことが好ましい。しかしながら、化学的切断などのの他の 切 断手段も可能である。(適当な切断部位はこの分子中に提供することができる)。 変性はいずれの好適な手段によっても行うことができる。例えば、加熱によって および／または核酸分子の付近で培地のイオン強度を変化させることによってそ れを行ってもよい。 ひと度配列決定すべき一本鎖分子が提供されれば、プライマー伸長のための好 適なプライマーをそれにハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチド がプライマーとして好ましい。これらは、典型的には６〜６０、例えば１５〜２ ５ヌクレオチドの長さである核酸分子である。それらは天然に存在するおよび／ または天然には存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。(しかしながら、 また、他の分子、例えば、より長い核酸鎖も、所望によりプライマーとして使用 してもよい。)増幅核酸を提供するために使用されたプライマーがそうであるよ うに、配列決定に使用されるプライマーは好ましくは増幅した核酸分子中に存在 する同一の配列とハイブリダイズする。(同一／類似の配列を有するプライマー を、増幅および配列決定の双方の目的に使用することができる)。 プライマーが溶液で得られ、コロニー中に存在する配列決定すべき核酸分子と アニーリングする（ハイブリダイズする）場合、溶液中に残存するか、または特 異的にアニーリングしないプライマーをアニーリング後に除去することができる 。好ましいアニーリング条件（温度および緩衝液組成）は非特異的なハイブリダ イゼーションを防ぐ。これらはストリンジェントな条件であってよい。かかる条 件は、典型的には所定の塩濃度（例えば、５０％ ＧＣ含量を有する２０量体の オリゴヌクレオチドに対し、５５℃で２０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液中の５０ｎＭプ ライマー）でプライマーのＴｍ（融点）に近いアニーリング温度である。（所定 の系に対するストリンジェントな条件は熟練者により決定することができる。そ れらは塩基組成、ＧＣ含量、使用するプライマーの長さおよび塩濃度に依存する 。５０％ ＧＣの２０塩基オリゴヌクレオチドに対し、算出された平均アニーリ ング温 度は５５〜６０℃であるが、実際には３５〜７０℃の間で様々であってよい。 プライマー伸長に用いられるプライマーは、固定化形態で提供することができ るので、溶液として提供する必要はない。この具体例では、プライマーはそれら がアニーリングすべき固定化分子に隣接して提供されるべきである。(かかるプ ライマーは実際にはコロニーの形成の間、核酸分子の増幅には使用されなかった 過剰の固定化プライマーとしてすでに存在していてもよい。） 配列決定すべきコロニー中に存在する核酸分子には、（好ましくは「ストリン ジェントな」条件下で）配列決定に使用すべきプライマーとハイブリダイズする 配列が含まれる。増幅前に当業者に公知の技術を用いてこの部分を一定の分子（ その分子は全体的に／部分的に未知の配列を有している可能性がある）に付加す ることができる。例えば、それは人工的に合成することができ、リガーゼを用い て所定の分子に付加することができる。 ひと度プライマーとアニーリングした核酸分子が提供されれば、プライマー伸 長を行うことができる。ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼを使用することができ る。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼは、好ましい具体例のために選択される 酵素である。これらのうちのいくつかは市販されている。Ｔ７ ＤＮＡポリメラ ーゼなどの３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用するこ とができ、またはＤＮＡポリメラーゼＩの小（クレノウ）断片を使用することが できる(例えば、改変Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼシーケナーゼ（登録商標）２．０ (Amersham)またはクレノウ断片（３’→５’エキソ−、New England Biolabs)) 。しかしながら、かかるポリメラーゼを使用することは必ずしも必要ではない。 実際は、ポリメラーゼが校正活性を有することが望まれる場合には、３’→５’ エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼは使用されないであろう。ある適用 ではサーモシーケナーゼ(ThermoSequenase)（登録商標）(Amersham)またはＴａ ｑｕｅｎａｓｅ（登録商標）(ScienTech,St Louis,MO)などの熱安定性ポリメラ ー ゼの使用が必要となるかもしれない。プライマー伸長反応にはいずれのヌクレオ チドを使用してもよい(天然に存在していても、天然には存在していなくともよ い)。好ましいヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド：ｄＡＴＰ、ｄＴＴ Ｐ、ｄＧＴＰおよびｄＣＴＰ(いくつかの適用ではｄＴＴＰに類似したｄＵＴＰ が好ましい)、またはリボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ であり、少なくともこれらのうちのいくつかは標識形態で提供される。 それに続く工程を妨げる可能性のある組み込まれていないヌクレオチドを除去 するために、各々のプライマー伸長工程の後に洗浄工程を組み入れられることが 好ましい。好ましい洗浄溶液はポリメラーゼ活性と適合しなければならず、プラ イマーの配列決定すべき核酸分子とのアニーリングを妨害しない塩濃度を有する べきである。(好ましくない具体例では、洗浄溶液はポリメラーゼ活性を妨害す る。ここで、さらなるプライマー伸長の前に洗浄溶液を除去する必要がある。) 配列決定すべき分子の多くのコピーを所定のコロニー中に提供することができる ことを考慮すれば、標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドとを組み合わせを使 用することができる。この場合において、たとえ少ない割合のヌクレオチドしか 標識（例えば、蛍光標識）されていないとしても、プライマー伸長の間に各々の コロニー中に組み込まれる標識の数は十分であり、検出装置によって検出するこ とができる。例えば、非標識ヌクレオチドに対する標識ヌクレオチドの比を、平 均して、標識ヌクレオチドがプライマー伸長において時間の５０％未満、２０％ 未満、１０％未満または１％未満でも使用されるように選択すればよい（すなわ ち、平均して、所定のプライマー伸長工程において、ヌクレオチドは標識形態で 伸長したプライマーの５０％未満、２０％未満、１０％未満、または１％未満が 組み込まれる。） 従って、本発明のさらなる具体例では、本発明のコロニー中に存在する核酸分 子を配列決定するための方法が提供され、この方法は ａ）互いと同一の配列を有し、ヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼの存在下 でプライマー伸長を可能にする方法でプライマーとハイブリダイズする複数の一 本鎖核酸分子を含んでなる少なくとも１つのコロニーを提供し、 ｂ）核酸ポリメラーゼを有する少なくとも１つのコロニー、およびこの少なく とも１つのコロニー中に存在する一本鎖核酸分子内の適当な位置に相補塩基また は複数のかかる塩基が存在する場合にプライマーの伸長を可能にする条件下で、 標識形態および非標識形態で、所定のヌクレオチドを提供し、 ｃ）このヌクレオチド上に存在する標識が伸長したプライマー中に組み込まれ ているか否かを決定することによって、この標識ヌクレオチドがプライマー伸長 に使用されているか否かを検出する 工程を含んでなる。 工程ｂ）およびｃ）を１回以上繰り返してもよい。複数の異なるコロニーが提 供され、いくつかの異なる配列が同時に決定されることが好ましい。 比較的少量の標識ヌクレオチドしか必要としないので、本発明のこのさらなる 具体例を使用すればコストを軽減できる。また、これを用いてクエンチング作用 を軽減することもできる。 しかしながら、プライマー伸長に標識ヌクレオチドのみを使用すること、また はその大部分を使用することもまた可能である(例えば、使用するヌクレオチド の５０％を越える、７０％を越えるまたは９０％を越える量が標識されていても よい)。例えば、クエンチング作用を防止または低下させるように標識を選択す る場合に、これを行うことができる。別法として、万−クエンチング効果が問題 となる場合には、種々の段階で標識を除去するか、またはその効力を打ち消して もよい(例えば、フルオロフォアのレーザーブリーチングを行ってもよい)。しか しながら、このことは必要な工程の数を増加させ、それゆえに標識を除去しない (または少なくとも各々のヌクレオチドが組み込まれた後にはそれらを除去しな い が、定期的にのみ除去する)ことが好ましい。他の好ましくない具体例では、プ ライマーそれ自体およびその伸長産物は除去されて別のプライマーで複製される 。必要であれば、標識ヌクレオチドの存在下で実際の配列決定を再開する前に、 一連の標識を含まないヌクレオチドの付加のいくつかの工程を行ってもよい。さ らなる別法は、万一クエンチング効果が問題となる場合には、（例えば、フルオ ロセインからローダミンに切り換えることによって）最初に使用されたものとは 異なる種の標識を使用することである。 本発明の好ましい具体例では、配列決定の間に複数の標識した塩基が伸長プラ イマー中に組み込まれる。このことは、ひと度標識した塩基が伸長プライマー中 に取り込まれると、さらに標識した塩基が組み込まれる前に標識を除去しなけれ ばならない方法と比較して、配列決定操作をスピードアップすることができる点 で有利である。(複数の標識塩基は１以上の連続ストレッチの形態であってもよ いが、これは必須ではない。) 従って本発明にはまた、その範囲内に、核酸分子を配列決定する方法であって 、 ａ）１次コロニーを用いて、互いに同一の配列を有し、ヌクレオチドおよび核 酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸長を可能にする方法でプライマーとハイ ブリダイズする複数の一本鎖核酸分子を提供し、 ｂ）２次コロニーを用いて、互いに同一の配列を有し、またヌクレオチドおよ び核酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸長を可能にする方法でプライマーと ハイブリダイズもする複数の一本鎖核酸分子を提供し、 ｃ）核酸ポリメラーゼを有する各々のコロニー、および一本鎖核酸分子中の適 当な位置に相補塩基または複数のかかる塩基が存在する場合にプライマーの伸長 を可能にする条件下で、所定のヌクレオチドを提供し、 ｄ）このヌクレオチド上に存在する標識が伸長したプライマー中に組み込まれ ているか否かを決定することによって、標識したヌクレオチドが各々のコロニー でプライマー伸長に使用されているか否かを検出し、 ｅ）複数の標識を含んでなる伸長プライマーが得られるように、工程ｃ）およ びｄ）を１回以上繰り返す 工程を含んでなる方法が含まれる。 好ましくは、この第１およびこの位置に存在する核酸分子の配列は互いに異な り、すなわち、異なる核酸分子を含んでなる複数のコロニーが配列決定される。 前記の点から、本発明のコロニーを使用して多数の異なる配列決定方法を用いる ことができるということが理解されるであろう。これらの方法では、種々の検出 系を用いて配列決定に使用された標識を検出することができる(ただし、ある具 体例では肉眼によって簡単に検出することが可能であり、従って検出系は必要で はない)。蛍光標識に関する好ましい検出系は電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラで あり、それは所望により拡大装置と組み合わせることができる。表面上の蛍光の 検出および、好ましくは定量化も可能にする他のいずれの装置を使用してもよい 。蛍光画像装置または共焦顕微鏡などの装置を選択してもよい。 好ましくない具体例では、標識は放射性であってもよく、次いで放射能検出装 置が必要となる。かかる装置は実時間の放射能画像系であることが理想的である 。また好ましくないものには、リン光体スクリーン(Moleculal Dynamics)または 検出用オートラジオグラフィーフィルムに依拠する他の装置がある。 モニターすべきコロニー数によっては、データ収集のためには走査系が好まし い。(別法としては、総てのコロニーをカバーすることができる複数の検出器を 提供することがある。)かかる系は検出器が分析すべき複数のコロニーに対して 動くことを可能にする。これは、シグナルを与える総てのコロニーが検出器の視 野内に存在しない場合に有用である。検出器は固定した位置で維持してもよいし 、分析すべきコロニーを検出器の視野内に移動させてもよい(例えば、可動プラ ットフォームによる)。別法として、コロニーを固定した位置で維持してもよい し、検 出装置を移動させてそれらを視野に入れるようにしてもよい。 各工程の後に、各コロニーにおけるプライマー伸長によって組み込まれた塩基 の数を（および好ましくは性質も）決定するために、検出系を分析系と組み合わ せて用いることが好ましい。この分析は、記録されたデータを用いて、各工程の 後直ちにまたは後に行ってもよい。次いで所定のコロニー内に存在する核酸分子 の配列を、各工程の後に加えたヌクレオチドの数および種から推定することがで きる。 検出系は他の構成要素を含んでなる装置の一部であることが好ましい。本発明 には、複数の標識ヌクレオチド、核酸ポリメラーゼおよびプライマー伸長によっ て核酸分子中に組み込まれた場合に標識ヌクレオチドを検出するための検出手段 、異なるコロニーで組み込まれた標識ヌクレオチドによって与えられたシグナル を識別するために適合させた検出手段を含んでなる装置が含まれる。 装置はまた温度制御、溶媒送達および洗浄手段を含んでもよい。それは自動化 されていてもよい。 本発明の範囲内の方法および装置は、以下の配列決定に使用可能である： 未同定の核酸分子（すなわち、de novo配列決定）、 および既知配列と比較して１以上の違いが存在するかどうかを調べるために配 列決定すべきである核酸分子(例えば、多形性の同定)。これはしばしば「再配列 決定」と呼ばれる。 de novo配列決定および再配列決定は双方とも後にさらに詳しく考察する(以下 の第（ｖ）節および第（vi）節を参照)。 de novo配列決定の適用については、所定の位置に適用されるヌクレオチドの オーダーを所望の通りに選択することができる。例えば、ヌクレオチドｄＡＴＰ 、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰな どの連続付加を選択してもよい。(一般には１オーダーの４つのヌクレオチドを 反復 させるが、これは必須ではない。)再配列決定の適用については、各工程で加え るべきヌクレオチドのオーダーを、好ましくは既知配列に従って選択する。 配列の違いを検出および同定するために、再配列決定は多数の類似する鋳型分 子の分析にとって（例えば、位置指定突然変異誘発の後に候補クローン中の組換 えプラスミドの分析にとって、またはさらに重要なところでは集団の中での多形 性スクリーニングにとって）特に興味深いものであり得る。所定の配列との違い を、プライマー伸長の特定の段階で所定の配列中に存在する１以上のヌクレオチ ドの組み込みの欠如によって検出することができる。最も一般的に用いられる技 術とは対照的に、本方法は、点突然変異、挿入または欠失などのいかなるタイプ の突然変異の検出をも可能にする。さらに、配列情報の提供により、既存の突然 変異のみならずこれまでに同定されていない突然変異までも同定することができ る。 本発明のいくつかの具体例では、いくつかの配列決定反応によって長い核酸分 子を配列決定しなければならず、各々の１つが全配列の一部の決定を可能にする 。これらの反応は異なるコロニーで行ってもよく(ここで、異なるコロニーはそ れぞれ配列決定すべき同一の核酸分子で、しかし異なるプライマーで得られる) 、または同一のコロニーに適用される連続サイクルを行ってもよい(ここで、そ れぞれのサイクルの間にプライマーおよび伸長産物を洗い流し、異なるプライマ ーと置き換える)。 （iv）ＤＮＡフィンガープリンティング 本発明のこの具体例は、単一ヌクレオチドの多形性の検出などの、所定の遺伝 子の所定の特徴を同定するために大きな集団をスクリーニングする際の問題を解 決することを目的とする。 １つの好ましい具体例では、それはタグ付きゲノムＤＮＡを作出することにあ る(前の第Ｇ（ii）節を参照)。(このように、所定の別個のサンプルに由来する 各サンプルは独自のタグで標識されている)。このタグ付きＤＮＡを、固定化プ ライマーを含んでなる適当な表面上で１次コロニーを形成させるために使用する ことができる。次いでコロニーに対するいくつかの一連のプローブハイブリダイ ゼーションアッセイを行うことができる。各アッセイの間に、例えば熱変性およ び洗浄によって、前回のプローブを除去することができる。 本発明のこの具体例のこの問題を解決するための他のアプローチにまさる利点 を、以下の可能性ある実用的な応用の例で説明する。 あったとして、（例えば、大きさが２０００塩基の）遺伝子のどの部分が典型 的に１，０００ないし１０，０００個体の集団内の疾病の表現型に関連するかを 検出することを意図している。それぞれの個体に対してＰＣＲ増幅を行って、注 目する遺伝子を特異的に増幅し、タグと、コロニーを形成しているプライマーを を結合させることができる(第Ｇ（ii）節、「タグ付きＤＮＡ」の調製を参照)。 サンプルの代表的な配列を得るために、ランダムに５００，０００コロニーを 配列させたい(すなわち、サンプルを小さな確立で検出し損なうに過ぎないよう に１０倍の余剰)。１ｍｍ²当たり１０，０００コロニーのコロニー密度で、−７ ｍｍ ｘ ７ｍｍの表面を使用することができる。これは現在利用可能な他のいず れの技術よりもはるかに小さい表面である(例えば、ＨｙＳｅｑアプローチは余 剰物のない同数のサンプル（５０，０００）に対して２２０ｍｍ ｘ ２２０ｍｍ 使用する)。反応物の量（コストの大部分）は、サンプルの配列が占める表面に 比例する。従って、本発明は、現在利用可能な技術を８００倍改良させたものを 提供することができる。 「in situ」配列決定またはプローブハイブリダイゼーションアッセイの結果 をモニターする装置を用いる場合、それは−１ｍｍ²の表面上に存在する蛍光を 用いてアッセイしたコロニーから蛍光シグナルを画像で示すために１〜１０秒の オーダーをとるべきである。従って、その方法の隘路がアッセイの結果を画像で 示す のに要する時間であると仮定すると、それは５０，０００サンプル（５００，０ ００コロニー）に関するアッセイの結果の画像を示すのに１０分のオーダーをと る。（１つまたはいくつかの７ｍｍ ｘ ７ｍｍの表面に関して）画像を示すこと を含めた２００アッセイを与えるために、本発明を用いると３６時間より短い時 間しかかからない。このことは現在公知の最良の方法と比較して、２０倍の改良 を表している(ＨｙSｅｑでは同等の仕事を達成するために３０日を要する)。 改良（１０倍高いコロニー密度および１秒の画像形成時間）により、非常に高 い処理量を見込むことができ、さらに結局期待される処理量はまだ十分に証明さ れていないが、目下利用可能な最善の技術より約２０００倍速いであろう。 本発明を使用するもう１つの有利な点は、それが所定の遺伝子の異型接合性変 異を有する個体が原因で起こる問題を克服するということにある。この問題が対 立遺伝子の多形性を検出する現存の配列決定法により取り組むことができる一方 、オリゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションに基づく最新の高処理量 変異検出法は、対立遺伝子多形性の場合のプローブの不等なハイブリダイゼーシ ョンのため結果の解釈は困難となり、それゆえにエラーが起こり得る。本発明の この具体例において、各コロニーは注目する増幅遺伝子の単一コピーより生じる 。平均１０コロニーが各個体の遺伝子座に対して形成される場合、ある遺伝子の １つの翻訳に相当する平均５コロニーおよびその遺伝子の他の翻訳に相当する５ コロニーが存在するだろう。かくして、異型接合性変異は、個々のゲノムサンプ ル当たり、ただ１つの対立遺伝子が検出される回数により評価できる。 （ｖ）ＤＮＡ配列決定法 本発明のこの具体例は、大きな集団の生物学的サンプルにおける公知な遺伝子 の新規の対立遺伝子多形性の同定および特徴付けについての問題の解決法を提供 する。 その好ましい具体例では、それはタグ付きＤＮＡ（所定の個体から生ずる各サ ンプルは非反復タグでタグ付けした−第Ｇ(iv)節を参照）を得ることにある。次 いで、このコードしたＤＮＡを、固定化プライマーを含んでなる好適な表面での １次コロニーの形成に用いることができる。さらにプローブのコロニーへのハイ ブリダイゼーションについてのいくつかの一連のアッセイを行い、各循環アッセ イ間に、前記プローブを熱変性および洗浄により取り除くことができる。好まし くは、特異的プローブに対するＤＮＡ配列３’は「in situ配列決定法」により 直接決定することができる(第Ｔ(iii)節、配列決定法)。 この問題を解決する他のアプローチにまさる本発明の有利な点を以下の実施可 能な適用例で示す： 典型的な例では４０００個体の集団において、あるとしても、（例えば、２０ ００塩基のサイズの）遺伝子の配列の多様性を同定することが望ましい。遺伝子 の参照配列は公知であると仮定される。各個体に対してＰＣＲ増幅が行われ、注 目する遺伝子を特異的に増幅し、さらにタグ、およびコロニーを形成するプライ マーを連結させることができる。サンプルの典型的な配列を得るために、無作為 に４００００コロニーを配列することが必要であろう(すなわち、サンプルの検 出をし損なう確率の低い１０倍の余剰)。ｍｍ²当たり１００００コロニーのコロ ニー密度で、〜２ｍｍｘ２ｍｍの表面が使用できる。 ＣＣＤカメラ（２０００ｘ２０００ピクセルチップを有する）を装備した装置 を使用し、アッセイの結果をモニターし、４ｍｍ²の表面上のコロニーからの蛍 光シグナルの画像を示すには、ほぼ１０秒程度かかるであろう。１回のアッセイ 間に少なくとも２０塩基を読み取ることが可能であるとすれば、これは６１の画 像形成工程が必要である(塩基数ｎの読み取りに３ｎ＋１の画像形成工程が必要 である)。手法の隘路がアッセイ結果の画像を示す時間であるとすれば、４００ ０サンプルのアッセイ結果の画像を示すには、ほぼ１５分程度かかる。注目する 全遺伝子を扱う１００のアッセイ（１またはいくつかの２ｘ２ｍｍ²表面におい て）を 実現するためには、本発明では全スクリーニング試験を１つの装置を使用し、約 １日で行うことができる。これは現在のところ使用できる最も効果的な系と比較 できる。 保守的な仮定（コロニー密度、画像形成時間、ＣＣＤチップのサイズ）を伴う 本発明のこの具体例では、処理量は時間当たり３．２ｘ１０⁶塩基に及ぶ、すな わち現時点で最も一般的に使用される系と比較した場合、４００倍の改良であろ う(最新のＤＮＡシーケンサーは、時間当たりほぼ８，０００塩基のオーダーの 読み取りという典型的な処理量を有する)。 （vi）de novoＤＮＡ配列決定 本発明のこの具体例は、そのＤＮＡ配列が未知である新規ゲノム（またはその 一部）の低コストかつ短時間での配列決定についての問題の解決を目的とする。 ゲノムＤＮＡは、注目する生物体の全ＤＮＡから、またはＤＮＡを挿入したベク ターから直接作製できる。作製したゲノムＤＮＡ（いずれの供給源からでも）を 用いてＤＮＡコロニーを形成できる。次いでＤＮＡコロニーを低頻度切断制限酵 素で消化する、その部位はリンカーに含まれており、さらに変性し、配列決定で きる。 図１６はde novoＤＮＡ配列決定の例を示す。この例ではゲノムＤＮＡを１０ ０〜２０００塩基対の小片へと断片化する(ランダムＤＮＡ断片の調製を参照、 第Ｇ（ｉ）節)。これらの断片を、表面上に移植されたプライマー（「ＰＩ」およ び「Ｐ２」）に特異的な配列を含むオリゴヌクレオチドリンカー(IIａおよびIIｂ 、図１６ａ)、低頻度切断制限ヌクレアーゼ（「ＲＥ」）により認識される配列お よび配列決定プライマー（[ＳＰ」）に対応する配列へ連結した結果、鋳型となる (III，図１６ｂ)。ＤＮＡコロニー形成の鋳型として作製したこのゲノムＤＮＡ を用い、１次コロニーを得る(IV，図１６ｃ)。これらのコロニーを対応する制限 エンドヌクレアーゼで消化し、さらに変性させ、結合していないＤＮＡ鎖を除去 す る(Ｖ，図１６ｄ)。次いで配列決定プライマー（ＳＰ）を結合した一本鎖鋳型と アニーリングさせる(図１６ｅ)。その後、標識ヌクレオチドの組み込みおよび検 出は、前記に記載のように行うことができる(第Ｉ(iii)節、配列決定法)。 この具体例では、得られる処理量は現在利用可能な方法より少なくとも４００ 倍多いであろう。 （vii）ｍＲＮＡ遺伝子発現モニタリング 発明者らの発明のこの具体例は、多数の遺伝子の発現を同時にモニターするこ とについての問題を解決することを意味する。 その好ましい具体例を図１７に示す。 まず、１次コロニーを図３に示すように調製する。その好ましい形態において 、この調製のために使用するＤＮＡは、それぞれ第Ｇ（ｉ）およびＧ（iii）節 に記載される「調製ＤＮＡゲノム」または「タグ付きゲノムＤＮＡ」であり、そ のＤＮＡは１（またはいくつかの）生物の全ゲノムに由来するか、またはそのサ ブセットに由来（例えば、予め単離した遺伝子のライブラリー由来）するかのい ずれかである。図１７で、大文字略語「Ａ」、「Ｂ」および「Ｄ」はそれぞれ高 度、中間、低度発現レベルを示すコロニーを表し、さらに「Ｅ」は非発現遺伝子 から生ずるコロニーを表す(実際の場合、これら総ての状態は必ずしも同時には 存在しないであろう)。 第２に、コロニーを第Ｅ節に記載のように２次コロニーの増殖のための支持体 （すなわち、２次プライマー）に変える処理をする(図１７ａの工程ｉ)。処理さ れたコロニーは下線を引いた文字（Ａ、Ｂ、Ｄ、またはＥ）で表す。 第３に、（図１７ｂの工程ii）２次コロニーの増殖のためのこの支持体を使用 して、第Ｃ節に記載のように生物学的サンプルから抽出したｍＲＮＡ（またはｃ ＤＮＡ）鋳型由来のコロニーを再生させる。鋳型がｍＲＮＡであれば、コロニー 再形成の第１工程は逆転写酵素を用いて行われよう。所定のコロニー増幅サイク ル回数、好ましくは１〜５０の後のその状態は（図１７ｃ）；それらの再生がｍ ＲＮＡの多数のコピーにより開始された場合は、高度に発現する遺伝子（文字「 Ａ」で表される）に相当するコロニーは全体的に再生される；中間の発現レベル （文字「ｂ」および「Ｂ」で表される）の遺伝子に相当するコロニーは部分的に 再生するのみであり；低頻度遺伝子（文字「ｄ」で表される）に相当するわずか なコロニーのみが部分的に再生し；非発現配列（文字「Ｅ」で表される）に相当 するコロニーは全く再生されないに示される通りである。 最後に(図１７ｃの工程iii)、コロニー増殖のさらなるサイクルを行う(好まし くは２〜５０)、さらに前記工程間に全体的に再生しなかったコロニーも、最終 的には全体的に再生し、すなわち「ｂ」は「Ｂ」になり、「ｄ」は「Ｄ」になる （図１７ｄ）；高度および中間の発現レベルを有する遺伝子に対応するコロニー は総て再生し、「Ａ」と「Ｂ」または「Ｂ」；低度の発現レベルを有する遺伝子 に対応するコロニーは、総てが再形成されるわけではなく、「Ｄ」と「Ｄ」；非 発現配列に対応するコロニーは全く再生しない、「Ｅ」。 遺伝子発現の相対レベルは以下の好ましい方法により得ることができる： まず、発現レベルは、コロニーが再生する速度がそのコロニーの再生が開始さ れるｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ）分子の数と関連するコロニーの再生速度を追跡 することにより（すなわち、工程（iii）間の異なるコロニー増殖サイクル回数 後のコロニー内のＤＮＡ量を測定することにより）モニターできる（最初の近似 で、Ｍ（ｎ）と示されるｎサイクル後のＤＮＡ分子数は、コロニーの再生下にお いてＭ（ｎ）＝Ｍ₀ｒ^(n-1)（式中、Ｍ₀はコロニーの再生が開始された分子数で あり、ｒは増幅速度であり、かつ、ｎはサイクル回数である）で与えられるはず であり； 第２に、発現レベルを各遺伝子に対して、再生されたコロニー数を計数し、さ らにこの数をその遺伝子に対応する全コロニー数と比較することによりモニター できる。一般にこれらの測定により、コロニーにより表現される相対的発現レベ ルに近似して得られるであろう。コロニーの同定は、特に具体例、第Ｉ（iv）節 と同様にフィンガープリンティングより行うことが好ましい。ＤＮＡサンプルの コード化は必要ではないが、コロニー中のＤＮＡの直接同定の別法と考えられる ことを注記する。コーディングがあれば、同一コード（例えば、コードのアッセ イに関与する同一オリゴヌクレオチド）は、いずれの遺伝子セットに対しても使 用できるが、コードがなければ、異なるセットの特異的オリゴヌクレオチドは、 各遺伝子セットに対して使用する必要しなければならないため、このことは実用 上注目に値することであろう。 この発明者らによる発明の具体例は、最新の技術の状況と比較した場合：非常 に高い処理量；予めｍＲＮＡの増幅が不要である（予めの増幅が適合するまたは 発明である場合でも）;本発明によるサンプルが高密度のため、少量のサンプル および反応物しか必要とされない；高度に発現した遺伝子の存在が低レベルで発 現する遺伝子をモニターする能力に影響しない；注目する遺伝子セット内の低度 および高度の発現レベルを同時にモニターすることができるという多数の有利な 点を有する。 １次ＤＮＡコロニーの形成における開始ＤＮＡが全ゲノムのＤＮＡから作製さ れる場合、この具体例はまた以下の：注目する遺伝子の特異的な増幅を行っても 、高レベルで発現した遺伝子と低レベルで発現した遺伝子間の干渉はないという 特徴もまた提供する。これは本発明の使用についての独自の特徴であり、この具 体例の最初の仮定がまだ単離されておらず、ゆえに未知であり、さらにそれにつ いて特異的な（独自の）配列は知られておらず、その特異的な配列は特異的な遺 伝子増幅には必要であると考えられる発現遺伝子をモニターすることであるので 、特異的増幅は不可能である。 本発明のこの種のｍＲＮＡ発現のモニタリングを行う能力は、１次コロニーが 調製される場合、統計的に、開始ゲノムの各断片は同数のコロニー(例えば、付 加ゲノム分子当たり１コロニー)により表現されるということによるものである 。定量的情報はコロニー増殖速度のモニタリングにより、高頻度および低頻度双 方のｍＲＮＡから得られよう。 （viii）新規発現遺伝子の単離および同定 この発明者らによる発明の具体例は、所定の条件下で、例えば、特異的な組織 、所定の種の異なる系統で、または特異的な活性化の下で特に誘導される遺伝子 を単離することについての問題を解決することを意味する。実施例として、薬剤 投与後にアップまたはダウンレギュレートされる遺伝子の同定がある。 参照生物学的サンプル（以後、参照サンプルと呼ぶ）と比較して、アップレギ ュレートされる特異的または活性化された生物学的サンプル（以後、標的サンプ ルと呼ぶ）由来の遺伝子を単離するための好ましい具体例は図１８に示される。 まず、１次コロニーを調製する(図１８ａ)。その好ましい形態において、この 調製のために使用されるＤＮＡは、それぞれ第Ｇ（ｉ）およびＧ（ii）節に記載 される調製ＤＮＡゲノムまたはタグ付きゲノムＤＮＡであり、そのＤＮＡは１( またはいくつかの)生物の全ゲノムに由来するか、またはそのサブセットに由来( 例えば、予め単離した遺伝子のライブラリーに由来)するかのいずれかであり、 さらにコロニー形成に使用される両プライマー（以後、Ｐ１およびＰ２と呼ぶ） はエンドヌクレアーゼ制限部位を含む。 図１８ａで、「Ａ」は参照サンプルおよび標的サンプルの双方で発現する遺伝 子から生じたコロニーを表し、「Ｂ」は参照サンプルでのみ発現する遺伝子から 生じたコロニーを表し、「Ｃ」は標的サンプルでのみ発現する遺伝子から生じた コロニーを表し、さらに「Ｄ」は非発現遺伝子から生じたコロニーを表す(実際 の場合、これら総ての状態は必ずしも同時には存在しないであろう)。 第２に、１次コロニーを処理し、２次コロニーの増殖のための支持体として２ 次プライマーを作製する(図１８ａの工程ｉ)。この段階（ｂ）でコロニーを下線 を引いた文字（Ａ，Ｂ，Ｄ、またはＥ）で表す。 第３に、（図２１ｂの工程ii）２次プライマーを使用して、Ｇ（ｖ）に記載の ように生物学的参照サンプルから抽出したｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ（「ｍＡ＋ｍ Ｂ」で表される）を鋳型として用いてコロニーを再生させる。鋳型がｍＲＮＡで あれば、コロニー再形成の第１の伸長工程は逆転写酵素を用いて行われよう。（ 図１８ｃ）に示されるように、十分なコロニー増殖サイクル回数、好ましくは５ 〜１００の後、参照サンプルで発現する遺伝子（「Ａ」および「Ｂ」）に対応するコ ロニーのみが再生される。 工程（iii）において、そのコロニーを、支持体上に移植され、１次コロニー 形成の基礎であったフランキングプライマー配列Ｐ１およびＰ２のある部位を認 識する制限酵素（ＲＥで表される）で消化する。工程（ii）の間に再生されたコ ロニーのみが消化されるということが重要である。これは２次コロニーの増殖の ための支持体が一本鎖ＤＮＡ分子から形成され、これは制限酵素によっては消化 できないためである。再生したＤＮＡのみが二本鎖形態で存在し、消化される。 消化後のその状態は図１８ｄに示されるものである。参照サンプルで発現する遺 伝子に対応するコロニーは完全に消失し、すなわちそれらは２次コロニーの増殖 のための支持体としてさえ存在しない。さらに標的サンプルでのみ発現する遺伝 子に対応するコロニー「Ｃ」および非発現遺伝子に対応するコロニー「Ｄ」は、 ２次コロニーの増殖のための支持体としてなお存在する。 工程（iv）において、標的サンプルから抽出したｍＲＮＡ（またはｃＤＮＡ） （「ｍＡ＋ｍＣ」で表される）を用いてコロニーを再生させる。ｍＡおよびｍＢに 対応するコロニーがもはや存在しないため、ｍＣに対応するコロニーのみが再生 され得る(すなわち、特に標的サンプルで発現するｍＲＮＡ分子のみ)。十分なコ ロニー増殖サイクル回数（好ましくは５〜１００）の後、その状態は特に標的サ ンプルで発現する遺伝子に対応するコロニーのみが再生されるようである(「Ｃ」 、図１８ｅ)。 工程（ｖ）において、再生されたコロニー「Ｃ」を用い、本発明の第Ｄ節に記 載のように、Ｐ１およびＰ２の存在下で数回の（好ましくは１〜２０）のコロニ ー増殖サイクルを行うことにより、それらが含むＤＮＡコピーを作製する。次い で溶液中のＰ１およびＰ２を用いてＰＣＲ増幅を行い(第Ｄ節に記載)、さらに増 幅されたＤＮＡを従来法により同定する。 参照生物学的サンプルにおいてより発現の低い特異的または活性化された生物 学的サンプル由来の遺伝子を単離する好ましい具体例は図１９に示される。この 手法に関与する種々の工程は、参照サンプルにおけるよりもより強く制御される 遺伝子の単離に関与するものと非常に類似しており、その表記は図１６と同じで ある。唯一の相違点は、コロニーを再生するために使用するオーダーを逆転させ ることである：工程（ii）において、使用されるｍＲＮＡは参照生物学的サンプ ル（「ｍＡ＋ｍＢ」）から抽出されたｍＲＮＡの代わりに、標的生物学的サンプル （「ｍＡ＋ｍＣ」）から抽出されたものである、次いで工程（iv）において、使用 するｍＲＮＡは標的サンプル（「ｍＡ＋ｍＣ」）から抽出されたものの代わりに、 参照生物学的サンプル（「ｍＡ＋ｍＢ」）から抽出されたものである。結果として 、参照サンプルでは発現するが標的サンプルでは発現しない遺伝子に対応するコ ロニー由来のＤＮＡのみが回復し、増幅する(「Ｂ」、図１９ｆ)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年２月８日（１９９９．２．８） 【補正内容】 請求の範囲 １．Ａ．固定化されているがプライマーを伸長させるために一方の末端を露出 させている複数のプライマーを準備し； Ｂ．一本鎖標的核酸分子を、その一本鎖核酸分子の長さの一部について複数の プライマーの１つとアニーリングさせ、次いでアニーリングした一本鎖核酸分子 を鋳型として用いてそのプライマーを伸長させて、伸長した固定化核酸鎖を提供 し； Ｃ．この伸長した固定化核酸鎖から標的核酸分子を分離し； Ｄ．伸長した固定化核酸鎖を工程Ａ）の複数のプライマーのうちの１つとアニ ーリングさせ、次いで伸長した固定化核酸鎖を鋳型として用いてそのプライマー を伸長させて、もう１つの伸長した固定化核酸鎖を提供し；所望により Ｅ．アニーリングした伸長した固定化核酸鎖を互いから分離する 工程を含んでなる核酸増幅法。 ２．Ｆ．少なくとも１つの伸長した固定化核酸鎖を用いて工程Ｄ）およびＥ） を繰り返して、さらなる伸長した固定化核酸鎖を提供し、次いで所望により Ｇ．工程Ｆ）を１回以上繰り返す ことをさらに含んでなる、請求項１記載の方法。 ３．一本鎖標的核酸分子が、増幅すべき所定の核酸配列（この配列は既知であ っても未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２の核酸配列 を付加することによって製造され、第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの １つとハイブリダイズし、第２の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つとハ イブリダイズする配列と相補的である、請求項１または請求項２記載の方法。 ４．一本鎖標的核酸が、増幅すべき所定の核酸配列（この配列は既知であって も未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２の核酸配列を付 加することによって製造され、第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つ とハイブリダイズし、第２の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つの配列と 同一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．第１および第２の核酸配列が一本鎖標的核酸の第１および第２の末端に提 供される、請求項３または請求項４記載の方法。 ６．所定の核酸配列にタグがさらに付加され、このタグが所定の核酸配列の増 幅産物を同定することを可能にする、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法 。 ７．複数のプライマーが同一配列を有する複数のプライマーである、請求項１ 〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８．複数のプライマーが少なくとも２つの異なるタイプのプライマーを含んで なり、一方のタイプが他方のタイプとは異なる配列を有する、請求項１〜６のい ずれか１項に記載の方法。 ９．複数のプライマーが２ⁿ（ｎは整数である）の異なるタイプのプライマー からなる、請求項８記載の方法。 １０．ｎが２である請求項９記載の方法。 １１．異なるタイプのプライマーが実質的に互いに同じ濃度で存在する、請求 項８〜１０のいずれか［項に記載の方法。 １２．プライマーが所定の領域に均一に分散している、請求項１〜１１のいず れか１項に記載の方法。 １３．プライマーが所定の配置に（例えば格子パターンに）位置する、請求項 １〜１２のいずれか１項に記載の方法。 １４．ヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼの供給源を用いてプライマーを伸 長させる、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。 １５．加熱してアニーリングした核酸鎖を分離させる、請求項１〜１４のいず れか１項に記載の方法。 １６．請求項１４に従属する場合、アニーリングした核酸鎖を分離させるため に用いた加熱条件によって、核酸ポリメラーゼが不活性化されない、請求項１５ 記載の方法。 １７．核酸ポリメラーゼがｔａｑポリメラーゼであるか、好熱性生物から誘導 可能な別のポリメラーゼであるか、またはその熱安定性のある誘導体である、請 求項１６記載の方法。 １８．プライマー伸長の結果、１以上の検出可能な標識（例えば、蛍光標識ま たは放射性標識）が伸長した固定化核酸鎖へ組み込まれる、請求項１〜１７のい ずれか１項に記載の方法。 １９．１以上の伸長した固定化核酸鎖を処理して、核酸分子またはその一部を 遊離させる工程をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。 ２０．処理が制限エンドヌクレアーゼによる、またはリボザイムによる切断で ある、請求項１９記載の方法。 ２１．１以上のプライマーが制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリボザ イム認識部位を有するか、またはかかる部位の一部を有し、その一部がプライマ ー伸長が起こる際に完全となる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。 ２２．核酸増幅の反復サイクルが可能となるよう自動化された、請求項１〜２ １のいずれか１項に記載の方法。 ２３．複数の異なる核酸配列が増幅するために使用される、請求項１〜２２の いずれか１項に記載の方法。 ２４．複数の異なる核酸配列を同時に増幅するために使用される、請求項２３ 記載の方法。 ２５．異なる核酸配列が各々、請求項３〜５のいずれか１項に記載の第１およ び第２の核酸配列とともに提供され、これら第１および第２の核酸配列が異なる 核酸配列の各々について同一である、請求項２３または２４記載の方法。 ２６．異なる核酸配列が各々、異なるタグとともに提供され、そのため異なる 配列が互いから識別される請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。 ２７．請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法により製造可能な複数の固 定化核酸。 ２８．各領域が複数の同一の核酸鎖とそれに対する複数の同一の相補鎖を含ん でなり、かかる領域内の各核酸鎖が、もう一方の核酸鎖がその表面上、その鎖の 長さの距離内に位置するように配置される、ある表面上の１以上の異なる領域の 形態にある複数の固定化核酸。 ２９．核酸分子が固定化される表面ｍｍ²当たり少なくとも１つの異なる領域 が存在する、請求項２７または請求項２８記載の複数の固定化核酸。 ３０．核酸が固定化される表面ｍｍ²当たりの異なる領域の数が１より大きい か、１０²より大きいか、１０³より大きいか、または１０⁴より大きい、請求項 ２８記載の複数の固定化核酸。 ３１．配列決定用の核酸分子の提供における、請求項１〜２６のいずれか１項 に記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核 酸分子の使用。 ３２．一本鎖核酸分子とハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、次いでプ ライマーの伸長に使用されたヌクレオチドを検出することによって配列決定を行 う、請求項３１記載の使用。 ３３．配列決定が段階的に実施され、それにより一本鎖ヌクレオチドによるプ ライマーの伸長の後、プライマー伸長にさらなるヌクレオチドが使用される前に このヌクレオチドが検出される、請求項３２記載の使用。 ３４．プライマーが、請求項１の方法で配列決定用の固定化核酸分子を提供す りために用いたプライマーと同一の配列とハイブリダイズする、請求項３２また は３３記載の使用。 ３５．プライマーが、請求項１の方法で配列決定用の固定化核酸分子を提供す るために用いたプライマーと同一の配列を有する、請求項３２または３３記載の 使用。 ３６．二本鎖核酸分子内にニックを提供し、ニックトランスレーションを行い 、次いでニックトランスレーションに使用されたヌクレオチドを検出する、請求 項３１の使用。 ３７．ＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ分子からＲＮＡ鎖を合成し、次い でこのＲＮＡ鎖を作るために使用されたヌクレオチドを検出する、請求項３１記 載の使用。 ３８．総てまたは少なくともいくつかのヌクレオチドが標識ヌクレオチドであ る、請求項３２〜３７のいずれか１項に記載の使用。 ３９．標識ヌクレオチドが総て同一の標識を有する、請求項３８記載の使用。 ４０．標識ヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項３８または請求項３９ 記載の使用。 ４１．標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの混合物を使用する、請求項３ ８〜４０のいずれか１項に記載の使用。 ４２．標識ヌクレオチドが使用するヌクレオチドの５０％未満である、請求項 ４１記載の使用。 ４３．標識ヌクレオチドが使用するヌクレオチドの１０％未満である、請求項 ４２記載の使用。 ４４．配列決定が、少なくとも２つの異なる別領域に存在する核酸分子の並行 配列決定である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の使用。 ４５．配列決定が、１０を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行配列 決定である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の使用。 ４６．配列決定が、１００を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行配 列決定である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の使用。 ４７．配列決定が、１０００を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行 配列決定である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の使用。 ４８．配列決定が、１００００００を越える異なる別領域に存在する核酸分子 の並行配列決定である、請求項３１〜４３のいずれか１項に記載の使用。 ４９．複数の異なる配列が並行して決定される、請求項３１〜４３のいずれか １項に記載の使用。 ５０．診断用の増幅核酸分子の提供における、請求項１〜２６のいずれか１項 に記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核 酸分子の使用。 ５１．スクリーニング用の増幅核酸分子の提供における、請求項１〜２６のい ずれか１項に記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数 の固定化核酸分子の使用。 ５２．他の成分のための支持体として使用するための増幅核酸分子の提供にお ける、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法、または請求項２７〜３０の いずれか１項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５３．遊離形態の（固定化ではなく）さらなる核酸分子の作製における、請求 項１〜２６のいずれか１項に記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１ 項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５４．in situＲＮＡ合成における請求項５３記載の方法の使用。 ５５．遺伝子発現のモニターにおける、請求項１〜２６のいずれか１項に記載 の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸分子 の使用。 ５６．まれにしか発現しない遺伝子産物を用いて核酸分子を同定する場合の、 請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれ か１項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５７．異型接合性の個体の同定における、請求項１〜２６のいずれか１項に記 載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸分 子の使用。 ５８．核酸のフィンガープリントにおける、請求項１〜２６のいずれか１項に 記載の方法、または請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸 分子の使用。 ５９．請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法を実施する装置であって、 複数の固定化プライマー、核酸ポリメラーゼ、複数のヌクレオチドおよびアニー リングした核酸鎖を分離する手段を含んでなる装置。 ６０．アニーリングした核酸鎖を分離する手段が加熱制御手段を有してなる、 請求項５９記載の装置。 ６１．請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の核酸分子を分析する装 置であって、反応物の供給源と、その反応物を核酸分子に適用した後に生じる１ 以上のシグナルを検出するための検出手段とを含んでなる装置。 ６２．検出手段が、請求項２８記載の異なる領域間で識別するに十分な分解能 を有する、請求項６１記載の装置。 ６３．電荷結合素子（ＣＣＤ）を含んでなる、請求項６１または請求項６２記 載の装置。 ６４．電荷結合素子（ＣＣＤ）が拡大装置（例えば、顕微鏡）に作動可能なよ うに接続されている、請求項６３記載の装置。 ６５．請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸を含んでな る、スクリーニング、診断、または核酸の配列決定に用いるキット。 ６６．本明細書に実質的に記載された発明。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ９７１３２３６．９ (32)優先日 平成９年６月23日(1997．6．23) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (31)優先権主張番号 ９７１３２３８．５ (32)優先日 平成９年６月23日(1997．6．23) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ， ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，Ｅ Ｅ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，Ｍ Ｄ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ， ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 パスカル、メイエ スイス国プラン―レ、ズアート、シュマ ン、ド、オ、14 セロノ、ファーマスーテ ィカル、リサーチ、インスティテュート、 ソシエテ、アノニム内 【要約の続き】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．Ａ．固定化されているがプライマーを伸長させるために一方の末端を露出 させている複数のプライマーを準備し； Ｂ．一本鎖標的核酸分子を、その一本鎖核酸分子の長さの一部について複数の プライマーの１つとアニーリングさせ、次いでアニーリングした一本鎖核酸分子 を鋳型として用いてそのプライマーを伸長させて、伸長した固定化核酸鎖を提供 し； Ｃ．この伸長した固定化核酸鎖から標的核酸分子を分離し； Ｄ．伸長した固定化核酸鎖を工程Ａ）の複数のプライマーのうちの１つとアニ ーリングさせ、次いで伸長した固定化核酸鎖を鋳型として用いてそのプライマー を伸長させて、もう１つの伸長した固定化核酸鎖を提供し；所望により Ｅ．アニーリングした伸長した固定化核酸鎖を互いから分離する 工程を含んでなる核酸増幅法。 ２．Ｆ．少なくとも１つの伸長した固定化核酸鎖を用いて工程Ｄ）およびＥ） を繰り返して、さらなる伸長した固定化核酸鎖を提供し、次いで所望により Ｇ．工程Ｆ）を１回以上繰り返す ことをさらに含んでなる、請求項１記載の方法。 ３．一本鎖標的核酸分子が、増幅すべき所定の核酸配列（この配列は既知であ っても未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２の核酸配列 を付加することによって製造され、第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの １つとハイブリダイズし、第２の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つとハ イブリダイズする配列と相補的である、請求項１または請求項２記載の方法。 ４．一本鎖標的核酸が、増幅すべき所定の核酸配列（この配列は既知であって も未知であってもよい）を準備し、そこへ第１の核酸配列と第２の核酸配列を付 加することによって製造され、第１の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つ とハイブリダイズし、第２の核酸配列は複数のプライマーのうちの１つの配列と 同一である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５．第１および第２の核酸配列が一本鎖標的核酸の第１および第２の末端に提 供される、請求項３または請求項４記載の方法。 ６．所定の核酸配列にタグがさらに付加され、このタグが所定の核酸配列の増 幅産物を同定することを可能にする、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法 。 ７．複数のプライマーが同一配列を有する複数のプライマーである、請求項１ 〜６のいずれか１項に記載の方法。 ８．複数のプライマーが少なくとも２つの異なるタイプのプライマーを含んで なり、一方のタイプが他方のタイプとは異なる配列を有する、請求項１〜６のい ずれか１項に記載の方法。 ９．複数のプライマーが２ⁿ（ｎは整数である）の異なるタイプのプライマー からなる、請求項８記載の方法。 １０．異なるタイプのプライマーが実質的に互いに同じ濃度で存在する、請求 項８または請求項９記載の方法。 １１．プライマーが所定の領域に均一に分散している、請求項１〜１０のいず れか１項に記載の方法。 １２．プライマーが所定の配置に（例えば格子パターンに）位置する、請求項 １〜１１のいずれか１項に記載の方法。 １３．ヌクレオチドおよび核酸ポリメラーゼの供給源を用いてプライマーを伸 長させる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。 １４．加熱してアニーリングした核酸鎖を分離させる、請求項１〜１３のいず れか１項に記載の方法。 １５．請求項１３に従属する場合、アニーリングした核酸鎖を分離させるため に用いた加熱条件によって、核酸ポリメラーゼが不活性化されない、請求項１４ 記載の方法。 １６．核酸ポリメラーゼがｔａｑポリメラーゼであるか、好熱性生物から誘導 可能な別のポリメラーゼであるか、またはその熱安定性のある誘導体である、請 求項１５記載の方法。 １７．プライマー伸長の結果、１以上の検出可能な標識（例えば、蛍光標識ま たは放射性標識）が伸長した固定化核酸鎖へ組み込まれる、請求項１〜１５のい ずれか１項に記載の方法。 １８．１以上の伸長した固定化核酸鎖を処理して、核酸分子またはその一部を 遊離させる工程をさらに含む、請求項１８記載の方法。 １９．処理が制限エンドヌクレアーゼによる、またはリボザイムによる切断で ある、請求項１８記載の方法。 ２０．１以上のプライマーが制限エンドヌクレアーゼ認識部位もしくはリボザ イム認識部位を有するか、またはかかる部位の一部を有し、その一部がプライマ ー伸長が起こる際に完全となる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。 ２１．核酸増幅の反復サイクルが可能となるよう自動化された、請求項１〜２ ０のいずれか１項に記載の方法。 ２２．複数の異なる核酸配列が増幅するために使用される、請求項１〜２１の いずれか１項に記載の方法。 ２３．複数の異なる核酸配列を同時に増幅するために使用される、請求項２２ 記載の方法。 ２４．異なる核酸配列が各々、請求項３〜５のいずれか１項に記載の第１およ び第２の核酸配列とともに提供され、これら第１および第２の核酸配列が異なる 核酸配列の各々について同一である、請求項２２または２３記載の方法。 ２５．異なる核酸配列が各々、異なるタグとともに提供され、そのため異なる 配列が互いから識別される請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。 ２６．請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法により製造可能な複数の固 定化核酸。 ２７．各領域が複数の同一の核酸鎖とそれに対する複数の同一の相補鎖を含ん でなり、かかる領域内の各核酸鎖が、もう一方の核酸鎖がその表面上、その鎖の 長さの距離内に位置するように配置される、ある表面上の１以上の異なる領域の 形態にある複数の固定化核酸。 ２８．核酸分子が固定化される表面ｍｍ²当たり少なくとも１つの異なる領域 が存在する、請求項２６または請求項２７記載の複数の固定化核酸。 ２９．核酸が固定化される表面ｍｍ²当たりの異なる領域の数が１より大きい か、１０²より大きいか、１０³より大きいか、または１０⁴より大きい、請求項 ２７記載の複数の固定化核酸。 ３０．配列決定用の核酸分子の提供における、請求項１〜２５のいずれか１項 に記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核 酸分子の使用。 ３１．一本鎖核酸分子とハイブリダイズしたプライマーを伸長させ、次いでプ ライマーの伸長に使用されたヌクレオチドを検出することによって配列決定を行 う、請求項３０記載の使用。 ３２．プライマーが、請求項１の方法で配列決定用の固定化核酸分子を提供す りために用いたプライマーと同一の配列とハイブリダイズする、請求項３１記載 の使用。 ３３．プライマーが、請求項１の方法で配列決定用の固定化核酸分子を提供す るために用いたプライマーと同一の配列を有する、請求項３１記載の使用。 ３４．二本鎖核酸分子内にニックを提供し、ニックトランスレーションを行い 、次いでニックトランスレーションに使用されたヌクレオチドを検出する、請求 項 ３０の使用。 ３５．ＤＮＡポリメラーゼを使用してＤＮＡ分子からＲＮＡ鎖を合成し、次い でこのＲＮＡ鎖を作るために使用されたヌクレオチドを検出する、請求項３０記 載の使用。 ３６．総てまたは少なくともいくつかのヌクレオチドが標識ヌクレオチドであ る、請求項３１〜３５のいずれか１項に記載の使用。 ３７．標識ヌクレオチドが総て同一の標識を有する、請求項３６記載の使用。 ３８．標識ヌクレオチドが蛍光標識されている、請求項３６または請求項３７ 記載の使用。 ３９．標識ヌクレオチドと非標識ヌクレオチドの混合物を使用する、請求項３ ６〜３８のいずれか１項に記載の使用。 ４０．標識ヌクレオチドが使用するヌクレオチドの５０％未満である、請求項 ３９記載の使用。 ４１．標識ヌクレオチドが使用するヌクレオチドの１０％未満である、請求項 ４０記載の使用。 ４２．配列決定が、少なくとも２つの異なる別領域に存在する核酸分子の並行 配列決定である、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の使用。 ４３．配列決定が、１０を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行配列 決定である、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の使用。 ４４．配列決定が、１００を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行配 列決定である、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の使用。 ４５．配列決定が、１０００を越える異なる別領域に存在する核酸分子の並行 配列決定である、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の使用。 ４６．配列決定が、１００００００を越える異なる別領域に存在する核酸分子 の並行配列決定である、請求項３０〜４１のいずれか１項に記載の使用。 ４７．複数の異なる配列が並行して決定される、請求項３０〜４６のいずれか １項に記載の使用。 ４８．診断用の増幅核酸分子の提供における、請求項１〜２５のいずれか１項 に記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核 酸分子の使用。 ４９．スクリーニング用の増幅核酸分子の提供における、請求項１〜２５のい ずれか１項に記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数 の固定化核酸分子の使用。 ５０．他の成分のための支持体として使用するための増幅核酸分子の提供にお ける、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法、または請求項２６〜２９の いずれか１項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５１．遊離形態の（固定化ではなく）さらなる核酸分子の作製における、請求 項１〜２５のいずれか１項に記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１ 項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５２．in situＲＮＡ合成における請求項５１記載の方法の使用。 ５３．遺伝子発現のモニターにおける、請求項１〜２５のいずれか１項に記載 の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸分子 の使用。 ５４．まれにしか発現しない遺伝子産物を用いて核酸分子を同定する場合の、 請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれ か１項に記載の複数の固定化核酸分子の使用。 ５５．異型接合性の個体の同定における、請求項１〜２５のいずれか１項に記 載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸分 子の使用。 ５６．核酸のフィンガープリントにおける、請求項１〜２５のいずれか１項に 記載の方法、または請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸 分子の使用。 ５７．請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法を実施する装置であって、 複数の固定化プライマー、核酸ポリメラーゼ、複数のヌクレオチドおよびアニー リングした核酸鎖を分離する手段を含んでなる装置。 ５８．アニーリングした核酸鎖を分離する手段が加熱制御手段を有してなる、 請求項５７記載の装置。 ５９．請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の核酸分子を分析する装 置であって、反応物の供給源と、その反応物を核酸分子に適用した後に生じる１ 以上のシグナルを検出するための検出手段とを含んでなる装置。 ６０．検出手段が、請求項２６記載の異なる領域間で識別するに十分な分解能 を有する、請求項５９記載の装置。 ６１．電荷結合素子（ＣＣＤ）を含んでなる、請求項５９または請求項６０記 載の装置。 ６２．電荷結合素子（ＣＣＤ）が拡大装置（例えば、顕微鏡）に作動可能なよ うに接続されている、請求項６１記載の装置。 ６３．請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の複数の固定化核酸を含んでな る、スクリーニング、診断、または核酸の配列決定に用いるキット。 ６４．本明細書に実質的に記載された発明。