CN117597453A - 用于测序试剂的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'‑羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的。本公开还涉及一种组合物，该组合物包含：一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。还公开了本文所述的一种或多种组合物的再水合的方法和包括本文所述的一种或多种组合物的试剂盒。还公开了包括流通池的料筒，该流通池包括一个或多个试剂贮存器，其中该一个或多个试剂贮存器包括本文所述的一种或多种组合物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年6月23日提交的美国临时专利申请号63/213,995的优先权权益，该美国临时专利申请的整个内容全文以引用方式并入本文。
技术领域
本公开通常涉及用于测序试剂的组合物、方法、试剂盒和系统。
背景技术
许多当前测序平台使用“边合成边测序”(“SBS”)技术和基于荧光的检测方法。期望将允许更具成本效益、更快速和更方便的测序和核酸检测的替代测序方法和改善的样品制备过程作为SBS的补充。
用于SBS技术的当前方案通常采用将DNA或RNA转化成片段化的可测序模板的文库的样品制备过程。样品制备方法通常涉及多个步骤、材料转移以及昂贵的仪器来实现片段化，并且因此往往是困难、繁琐、昂贵且低效的。
通常按任何合适的方式制备包含多核苷酸的文库，以将寡核苷酸衔接子附着到目标多核苷酸上。测序可导致确定目标多核苷酸的全部或部分序列。通过使用转座酶介导的片段化和加标签，可使在准备用于簇形成和测序的溶液中将核酸转化成衔接子修饰的模板所涉及的步骤数量减少或在一些情况下甚至最小化。该过程称为“标签片段化”(tagmentation)，其涉及通过转座体复合物修饰核酸，该转座体复合物包含与包括转座子末端序列的衔接子复合的转座酶，如例如WO 2016/130704中所述。在测序之前用于固定和扩增的方法描述于例如美国专利号8,053,192、WO 2016/130704、美国专利号8,895,249和美国专利号9,309,502中。模板的文库可用于通过固相扩增，并且更具体地为固相等温扩增制备核酸群体的簇阵列，如美国专利公布号2005/0100900、美国专利号7,115,400、WO 00/18957和WO 98/44151中所述。
测序可以使用任何合适的测序技术来进行，并且用于确定固定和扩增的衔接子-目标-衔接子分子的序列的方法(包括链再合成)是本领域已知的并且描述于例如美国专利号8,053,192、WO2016/130704、美国专利号8,895,249和美国专利号9,309,502中。SBS技术通常包括通过针对模板链反复加入核苷酸进行的新生核酸链的酶促延伸。在传统的SBS方法中，可在每次递送中在存在聚合酶的情况下将单个核苷酸单体提供给靶核苷酸。示例性SBS系统和方法描述于美国专利公布号2007/0166705、2006/0188901、2006/0240439、2006/0281109、2012/0270305和2013/0260372，美国专利号7,057,026、WO 05/065814，美国专利公布号2005/0100900、WO 06/064199和WO 07/010,251、美国专利公布号2013/0079232中。
包括例如PCR的样品制备所涉及的试剂的稳定性根据多种因素而变化。历史上，试剂是湿的，因此需要冷冻以进行运输和储存。转为干试剂允许环境运输和储存，但干试剂比湿试剂对环境条件更敏感。如果试剂在制造、运输、储存时或在文库制备期间暴露，则所得文库的质量和效率受到影响。类似地，试剂如SBS缓冲剂的pH在测序期间变化，并且需要改善这些缓冲剂的稳定性以提高SBS性能。样品制备所涉及的试剂可能对湿度、光和水分的变化高度敏感，因此，众所周知难以保持稳定。
而且，可用于样品制备的冻干微球往往在运输和储存期间暴露于机械应力时降解，并且可能不利地脱落它们的外部覆盖物。所得粉末可能因阻塞用于样品制备的膜而存在问题，并且在已经实现再水合之后可能导致所需最终浓度的变化。静电荷也是分配和干燥复合微球的风险。
因此，需要改善的样品制备组合物和方法。具体地讲，需要具有改善的稳定性的测序试剂以及相关的组合物、方法、系统、试剂盒和料筒，其显示出工作流程和带标签文库制备的改善的效率，进而增加了所得文库的读段富集并简化了工作流程。
本公开涉及克服本领域中的这些和其他缺陷。
发明内容
第一方面涉及一种组合物。该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的。
在一个具体实施中，该自由基清除剂是酚抗氧化剂。在一个具体实施中，该自由基清除剂包含没食子酸(GA)、没食子酸羟乙酯(HEG)、原儿茶酸(PCA)、儿茶素或它们的组合。
在一个具体实施中，该组合物还包含一种或多种非还原糖。在一个具体实施中，该一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精、葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物包含至少约5重量％的非还原糖。在一个具体实施中，该组合物包含约5重量％或更少的非还原糖。
在一个具体实施中，该组合物还包含聚合酶。在另一个具体实施中，该组合物还包含功能性蛋白质活化剂。在一个具体实施中，该功能性蛋白质活化剂是镁、镁盐或其他镁衍生物或它们的组合。
在一个具体实施中，3'-羟基封端基团是可逆的封端基团。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸与可检测标记连接。在一个具体实施中，可检测标记包含荧光团。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸通过可裂解的连接基与可检测标记连接。
在一个具体实施中，该组合物是微球、饼或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物具有介于约0.1mm与约25mm之间的横截面。在一个具体实施中，其中当该组合物是微球体时，该微球体为球形、椭圆形或环形。
在一个具体实施中，该组合物包含小于约1重量％的甘油。在一个具体实施中，该组合物包含约5重量％或更少的拥挤剂。在一个具体实施中，该拥挤剂包含聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、麦芽糖糊精、聚蔗糖、聚丙烯酰胺或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物具有低于约10重量％的含水量。
第二方面涉及一种再水合的方法。该方法包括提供一种组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；以及在有效地使该组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
在一个具体实施中，再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。
在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程中使用该经再水合的组合物。在另一个具体实施中，该方法还包括将该经再水合的组合物暴露于测序引物，其中该测序引物中该一种或多种经修饰的核苷酸的掺入产生延伸的测序引物。在另一个具体实施中，该方法还包括将将该经再水合的组合物施用于包含核苷酸簇的固体载体，其中该核苷酸簇包含靶多核苷酸。
第三方面涉及一种组合物。该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
在一个具体实施中，该功能性蛋白质包含聚合酶、重组酶、DNA结合蛋白质或它们的组合。在一个具体实施中，该功能性蛋白质活化剂是镁、镁盐、或其他镁衍生物或它们的组合。
在一个具体实施中，该一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精或葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物包含至少约5重量％的非还原糖。在一个具体实施中，该组合物包含约5重量％或更少的非还原糖。
在一个具体实施中，该组合物是微球、饼、粉末或它们的组合。在一个具体实施中，该组合物具有介于约0.1mm与约25mm之间的横截面。在一个具体实施中，当该组合物是微球体时，该微球体为球形、椭圆形或环形。
在一个具体实施中，该组合物包含小于约1重量％的甘油。在一个具体实施中，该组合物包含约5重量％或更少的拥挤剂。在一个具体实施中，该拥挤剂包含聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、麦芽糖糊精、聚蔗糖、聚丙烯酰胺或它们的组合。
在一个具体实施中，该组合物还包含一种或多种重组酶装载蛋白质、核苷酸三磷酸(dNPT)、ATP、ATP类似物、缓冲剂、还原剂、肌酸激酶或它们的组合。在一个具体实施中，该聚合酶是DNA聚合酶。在一个具体实施中，该DNA结合蛋白质是单链DNA结合蛋白质。在一个具体实施中，该组合物具有低于约10重量％的含水量。
第四方面涉及一种再水合的方法。该再水合的方法包括提供一种组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的；以及在有效地使该组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
在一个具体实施中，再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。在一个具体实施中，该方法还包括在排他性扩增过程中使用该经再水合的组合物。
第五方面涉及一种试剂盒。该试剂盒包括一种组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；和一种组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
第六方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：试剂贮存器，其中该试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的。
第七方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：试剂贮存器，其中该试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
第八方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：第一试剂贮存器，其中该第一试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；以及第二试剂贮存器，其中该第二试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
根据本公开，本文所述的组合物、方法、试剂盒和料筒和方法具有许多优点。
通过添加如本文所述的特定赋形剂，诸如自由基清除剂，解决了冻干期间的解封闭问题。
类似地，高干冰用量和运费成本的问题通过如本文所述的稳定化和冻干试剂的环境温度运输解决。试剂保质期短的问题通过稳定化和冻干增加试剂的稳定性解决。当前的测序试剂在干冰中运输，并且在室温下具有不同的稳定性。为了实现测序试剂的环境运输，研究了其稳定性，并且使用冻干或冷冻干燥稳定了几种不稳定的SBS试剂。
SBS测序试剂的最不稳定的组分是掺入混合物。具体地，全功能核苷酸(ffN)构成掺入混合物的最不稳定的组分。在本公开中，公开了使用冻干来稳定掺入混合物以及掺入混合物的单独组分。此外，还使用冻干法稳定了几种其他试剂。本公开还讨论了线性化混合物2、再合成混合物、扫描混合物、裂解混合物和引物的冻干。
当前的排他性扩增过程(ExAmp)或溶液中的重组酶聚合酶扩增-RCA混合物需要将试剂分离到两个或三个管中，其中Mg/PEG始终与蛋白质组分分离，以实现在-20℃储存下的至少一年的稳定性。此外，液体配制试剂的不稳定性也要求在-20℃下运输，这带来了相关的高运输成本，并且远非理想的客户体验。
本公开尤其开发了一种ExAmp制剂和冻干方法，其将使得能够单管制剂可被冻干和重悬，而对测序度量几乎没有影响。在此，描述了使用非还原糖和在Mg存在下冻干的赋形剂重配制，产生稳定的冻干饼，其在再溶解时保持全功能。
冻干ExAmp单管制剂使得能够环境温度运输，消除了干冰运输的成本，并通过降低接收和拆包消耗品的复杂性来改善客户体验。其还提供了一体化混合物，使料筒设计的复杂性最小化。当前液体制剂无法实现单管ExAmp混合物的简单性。此外，在此呈现的单管ExAmp制剂可重悬于水中，这将理想地是用于将所有其他冻干试剂重悬于料筒上的常用溶剂。此外，其增加了冻干试剂在高温下的稳定性，允许室温储存。
此外，饼冻干法具有几个缺点，这些缺点可以通过将原始组分冷冻成微球并将这些组分干燥复合成复合物试剂混合物来克服。传统饼格式的一个限制是其将冻干制剂与其将要在其中冻干的容器相联系。如试剂体积(可能因低通量或高通量试剂盒版本而变化)、赋形剂含量和活性组分浓度(因平台而异)等变量将改变产物的冻干方式。因此，生产冻干饼的工艺取决于在冻干周期开发可开始之前锁定复合物试剂制剂和料筒设计。这延长了开发时间线，因为冻干周期优化必须连续发生，并且使得制剂变化不灵活。
如本文所述，从饼到复合物试剂微球的调整将制剂从料筒中分离。这实现了灵活的料筒设计以及可变的填充体积，但是这仍然具有缺点，即需要在特定复合物试剂的冻干周期开发可发生之前锁定复合物制剂开发。
组分水平下的冻干微球解决了这个问题，因为试剂的组分在早期是已知的，并且每种单独组分的冻干周期开发可并行开始，或甚至在试剂和料筒开发之前开始。然后可将干燥组分微球复合(混合在一起)并填充到同一容器中，可灵活地改变适合于应用的每种单独组分的量(浓度)。
复合物试剂饼和微球的另一个缺点是制剂条件必须折衷，以使每种组分将保持功能，但是该制剂对于每种组分的稳定性或活性来说不是最佳的。如本文所述，将原始组分冻干成微球允许每种组分在其优化的稳定条件下配制。然后可将干燥组分与其他微球组合到同一容器中，这些微球可具有不同的冻干制剂，并针对储存稳定性进行了优化。由于冻干状态，应该发生最小的分子相互作用，以使每种组分将保持其最佳的冻干储存制剂，直到重悬。此外，可以添加最佳反应条件的微球来改变重悬的液体环境，因此条件现在与最佳活性的条件相匹配。
如上所述，当前测序试剂对温度敏感，并在干冰中运输。使用冷冻干燥是稳定用于测序的多种试剂的最温和的方法，以使能够进行环境运输和储存。传统的冻干采用原位冻干技术，或更普遍地称为饼冻干。尽管是一种常见且广泛的冻干形式，但饼冻干具有几个缺点，并且可以通过以本体格式形式的冻干来克服。在本公开中，展示了冻干成微珠和微球的本体格式。
饼冻干中的一个关键问题是需要在冻干开发之前使消耗品和试剂保持同步。这限制了冻干开发的时间线。然而，在批量冻干成微球时，消耗品和试剂开发与冻干开发是分离的，因为原材料可在其他处理之前冻干。任何重配制都将不需要重新开发冻干工艺。单独原材料的批量冻干还消除了对料筒中多孔的需要，因为试剂可在填充步骤期间合并到一个孔中。这使得料筒中的孔更少，并提供了料筒设计的灵活性。
饼冻干的另一个缺点是冻干周期长。一般来说，为了获得优雅且干燥的冻干饼，饼的冻干周期最少需要2天至7天的时间。然而，冻干成微球通常需要一天至两天才能完成。
饼是冻干最常见的格式。然而，饼冻干具有几个限制，这些限制可以通过小珠格式的冻干来克服。当以饼格式冻干时，每种试剂具有单独小瓶的问题通过以小珠格式冻干来解决，其中几种试剂，诸如ffN和Pol珠子可组合到一个小瓶中。这允许制剂、料筒设计的灵活性和小瓶数量的减少，这可以潜在地降低商品销售的成本。
冻干周期长的问题可通过以小珠格式冻干来解决。如与小珠格式相比，以饼格式的大体积试剂需要更长的时间来冻干。在试剂体积高的工厂平台规模中冻干将有助于在减少冻干周期方面节省时间和金钱。对于一些试剂，以小珠格式的冻干也已表现出如与饼格式相比更好的性能。
附图说明
图1示出了用自由基清除剂没食子酸(GA)、原儿茶酸(PCA)、没食子酸羟乙酯(HEG)和不同浓度的儿茶素冻干官能化的核苷酸。
图2示出了用不同浓度的PCA自由基清除剂冻干官能化的核苷酸。
图3示出了用不同浓度的PCA自由基清除剂冻干10X蓝色MiSeqTM饼。
图4示出了KPS-TEMED反应指示的自由基引起解封闭。
图5示出了KPS-TEMED反应引起官能化的核苷酸中一些染料的强度下降。左侧示出对照，并且右侧示出添加KPS-TEMED后的情况。
图6示出了蓝色全官能化核苷酸(ffN)中自由基的形成。
图7示出了光和氧在光漂白效应中的作用。
图8示出在MiniSeqTM中用自由基清除剂冻干红色和绿色ffN。
图9示出了自由基清除剂的添加降低了预定相。
图10A至图10B示出了自由基清除剂的细节。图10A示出了作为自由基清除剂的酚类抗氧化剂的示例。图10B示出了酚抗氧化剂清除自由基能力的机制。
图11示出了当前掺入混合物(ICM)在37℃下的稳定性。
图12示出了在37℃下经历两种不同老化研究的冻干ICM的聚合酶活性。
图13示出了冻干前后的聚合酶活性。
图14示出了冻干对于在热应力后保留BLM2的活性是必要的。
图15示出了在不同温度下老化实验后液体样品的活性百分比。
图16示出了在不同温度下老化实验后冻干样品的活性百分比。
图17示出了热应力前后的液体和冷冻干燥BRM。
图18示出了在高温下与和不与Mg一起温育的单独ExAmp蛋白质。
图19A至图19B示出了冷冻干燥时立即的(图19A)和沉淀在37℃下温育16小时后的(图19B)冻干无PEG的Ras6T成簇活性。所有冻干制剂在冻干后都具有活性。然而，一旦饼在37℃下温育16小时，不含非还原糖的重悬冻干粒料产生非常暗淡的簇(深蓝色泳道2-4)。冻干混合物中含有蔗糖或海藻糖的所有泳道保留活性(黄色至橙色)。
图20示出了冻干Ras6T在37℃温育5天后的稳定性。用镁冻干无PEG的Ras6T(泳道8)，仅需要水进行重悬。
图21示出了重组酶在应力条件下的比较，这些应力条件模拟在SDS-PAGE还原MES凝胶上有和没有镁的加速储存条件。
图22示出了胞外酶在pH 7.5下具有高稳定性，但相对于在pH 9下仅20％的活性。然而，在pH 9下，随时间推移，降解速率显著增加。
图23示出了蛋白质的Tm(熔融温度)是蛋白质稳定性的指标之一(较高的Tm＝较高的稳定性)。OGG在高盐条件下具有较高的Tm，但在高盐条件下具有较低的活性。如本文所述的OGG是8-氧桥鸟嘌呤DNA糖基化酶—提取自詹氏甲烷球菌(Methanococcus janaschii)的热稳定酶。
图24示出了使用在最佳储存条件下配制的原始组分微球，然后利用添加到相同容器中的反应缓冲剂微球，使得在重悬时，反应缓冲剂将改变对活性最佳的制剂环境。图24还示出了改变活性组分的浓度量或甚至组合几种活性组分的灵活性，由于储存制剂不相容性，这些活性组分传统上是分开在单独小瓶中的。
图25示出了不同制剂的冻干饼的核苷酸降解产物的分析结果。
图26示出了不同制剂的冻干小珠的核苷酸降解产物的分析结果。
图27示出了在较高赋形剂浓度下冻干小珠的核苷酸降解产物形成的分析结果。
图28A至图28B示出了在海藻糖或蔗糖存在下冻干重组酶稳定性(图28A)和在海藻糖或棉子糖存在下冻干重组酶A和重组酶B稳定性(图28B)。
图29示出了在制剂筛选中，在37℃下热应力液体成簇混合物的相对聚集体形成。
图30示出了微球中海藻糖含量为10％和20％时的韧性模量(杨氏模量对第一次断裂的积分)。
图31示出了10％和20％海藻糖含量的微球的断裂应力(第一次断裂前测量的最大应力)。
图32示出了冻干饼中10％和20％海藻糖含量的韧性模量(杨氏模量对第一次断裂的积分)。
图33示出了10％和20的海藻糖含量的冻干饼的断裂应力(在第一次断裂前测量的最大应力)。
图34示出了10％海藻糖微球的静电荷。
图35示出了20％海藻糖试剂微球的静电荷。
图36示出了不同冻干格式的ffN在37℃下每天R1预定相的增加。
图37示出了1X和10X ffN溶液的冻干ffN小珠。所有冻干小珠的残留水分低于0.2％。
图38示出了对于1X ffN溶液，冻干ffN饼和冻干ffN小珠的比较。
图39示出了具有2％、3％和5％海藻糖的Pol 812冻干小珠。
图40示出了具有200mM海藻糖+120mM甘露醇和300mM海藻糖+120mM甘露醇的冻干Ras6T小珠。
图41示出了具有两种不同赋形剂的冻干Ras6T饼和小珠的％簇通过滤波器。
图42示出了具有两种不同赋形剂的冻干Ras6T饼和小珠两者的强度。当样品在55℃下分级时，看出较低的强度，这很可能是由于在较高的温度下脱磷酸化。
应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分并且可用于实现本文所述的益处和优点。
具体实施方式
第一方面涉及一种组合物。该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的。
应当理解，本公开的某些方面、模式、具体实施、变型和特征在下面以各种细节水平进行描述，以便提供对本技术的实质理解。除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义通常与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。术语“包括”以及其他形式的使用不是限制性的。术语“具有”以及其他形式的使用不是限制性的。如本公开中所用，无论是在过渡短语中还是在权利要求的正文中，术语“包含(comprise(s))”和“包含(comprising)”都将被解释为具有开放式含义。即，术语应与短语“至少具有”或“至少包括”同义地解释。
术语“基本上”、“大约”、“约”、“相对”或可在整个本公开(包括权利要求书)中使用的其他此类类似术语用于描述和说明例如由于处理中的变化而来自参考或参数的小波动。此类小波动也包括来自参考或参数的零波动。例如，波动可以指小于或等于±10％，诸如小于或等于±5％，诸如小于或等于±2％，诸如小于或等于±1％，诸如小于或等于±0.5％，诸如小于或等于±0.2％，诸如小于或等于±0.1％，诸如小于或等于±0.05％。
还应理解，本文所述的某些特征(为了清楚起见，其在单独具体实施的上下文中描述)也可在单个具体实施中组合提供。相反，为了简洁起见，在单个具体实施的上下文中描述的各种特征也可以单独提供或者以任何合适的子组合提供。
术语“连接”、“接触”和/或“耦接”包括各种布置和组件。这些布置和技术包括但不限于：(1)一个部件和另一个部件的直接接合，其间没有居间部件(即，部件直接物理接触)；以及(2)一个部件和另一个部件的接合，其间具有一个或多个部件，前提条件是该一个部件“连接到”或“接触”或“耦接到”该另一个部件在某种程度上是与该另一个部件是操作性连通(例如，电气、流体、物理、光学连通等)(任选地在其间存在一个或多个附加部件)。彼此直接物理接触的一些部件可彼此电接触和/或流体接触或者可不彼此电接触和/或流体接触。此外，电连接、电耦接、光学连接、光学耦接、流体连接或流体耦接的两个部件可直接物理接触或可不直接物理接触，并且一个或多个其他部件可定位在这两个连接部件之间。
如本文所述，术语“阵列”可包括可附接到一个或多个固相基底的一组传导通道或分子，使得这些传导通道或分子可基于其位置彼此区分。如本文所述，阵列可包括各自位于固相基底上的不同可识别位置(例如，在不同传导通道处)的不同分子。另选地，阵列可包括各自带有不同分子的单独的固相基底，其中可根据固相基底在固相基底附接的表面上的位置或基于固相基底在液体(诸如流体流)中的位置来识别不同的探针分子。其中单独基底位于表面上的阵列的示例包括具有小珠的孔，如美国专利号6,355,431、美国专利公布号2002/0102578和WO 00/63437中所述，所有这些专利全文据此以引用方式并入。阵列的分子可以是核酸引物、核酸探针、核酸模板或核酸酶诸如聚合酶和核酸外切酶。
如本文所述，术语“附着”可包括当两个物体彼此接合、扣紧、粘附、连接或结合时。反应组分如聚合酶可通过共价键或非共价键附着到固相组分如传导通道。如本文所述，短语“共价附着”或“共价结合的”是指形成特征在于原子之间共享电子对的一个或多个化学键。非共价键是不涉及共享电子对的非共价键，并且可包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文所述，术语“多核苷酸”或“核酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或由核苷酸类似物制成的DNA或RNA的类似物。如本文所用，术语还涵盖cDNA，即由RNA模板例如通过逆转录酶的作用产生的互补DNA或拷贝DNA。在一个具体实施中，待例如通过使用所述系统的测序进行分析的核酸被固定在基底(例如，流通池内的基底或基底诸如流通池上的一个或多个小珠等)上。如本文所用，术语“固定”旨在包括直接或间接的共价或非共价附着，除非另外明确指出或通过上下文指出。在旨在使用载体的条件下，诸如在需要核酸测序的应用中，分析物(例如，核酸)可以保持固定或附着到载体。在一个具体实施中，模板多核苷酸是附着到基底的多个模板多核苷酸中的一个模板多核苷酸。在一个具体实施中，附着到基底的多个模板多核苷酸包括文库多核苷酸的拷贝的簇，如本文所述。
核酸包括天然存在的核酸或其功能类似物。特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有包含磷酸二酯键的主链。类似物结构可具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种主链键，诸如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA)。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如存在于脱氧核糖核酸(DNA)中)或核糖(例如存在于核糖核酸(RNA)
在RNA中，糖为核糖，并且在DNA中为脱氧核糖，即，缺乏存在于核糖中的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可为嘌呤或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)以及它们的经修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子可结合到嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。
核酸可包含本领域已知的这些糖部分的多种类似物中的任一种。核酸可包括天然的或非天然的碱基。天然脱氧核糖核酸可具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基，并且核糖核酸可具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一个或多个碱基。可包含在核酸中的有用的非天然碱基是本领域已知的。
如本文所述，术语核苷酸可包括天然核苷酸及其类似物、核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、双脱氧核糖核苷酸以及被称为核苷酸的其他分子。如本文所述，“核苷酸”可包含含氮杂环碱基、糖以及一个或多个磷酸基团。核苷酸可以是核酸序列的单体单元，例如以识别DNA或RNA链中存在的亚基。核苷酸还可包含不一定存在于聚合物中的分子，例如能够通过聚合酶以依赖于模板的方式掺入到多核苷酸中的分子。核苷酸可包含例如在5'碳上具有0、1、2、3个或更多个磷酸基团的核苷单元。核苷四磷酸、核苷五磷酸和核苷六磷酸可以是有用的，在5'碳上具有超过6个磷酸基团(诸如7、8、9、10或更多个磷酸基团)的核苷酸也可以是有用的。天然存在的核苷酸的示例包括但不限于ATP、UTP、CTP、GTP、ADP、UDP、CDP、GDP、AMP、UMP、CMP、GMP、dATP、dTTP、dCTP、dGTP、dADP、dTDP、dCDP、dGDP、dAMP、dTMP、dCMP和dGMP。
非天然核苷酸包括核苷酸类似物，诸如不存在于天然生物系统中或基本上不通过聚合酶在其天然环境下(例如在表达聚合酶的非重组细胞中)掺入到多核苷酸中的那些核苷酸。非天然核苷酸包括那些通过聚合酶以一种速率掺入到多核苷酸链中的那些非天然核苷酸，该速率显著快于或慢于另一种核苷酸(诸如具有与相同沃森-克里克互补碱基进行碱基配对的天然核苷酸)通过聚合酶掺入到链中的速率。例如，当与天然核苷酸的掺入速率相比时，非天然核苷酸可以至少2倍不同、5倍不同、10倍不同、25倍不同、50倍不同、100倍不同、1000倍不同、10000倍不同或更多倍不同的速率掺入。将非天然核苷酸掺入到多核苷酸中后能够被进一步延伸。示例包括具有3'羟基的核苷酸类似物或在3'位置具有可逆终止子部分的核苷酸类似物，该核苷酸类似物可被移除以允许掺入了该核苷酸类似物的多核苷酸进一步延伸。可逆终止子部分的示例描述于例如美国专利号7,427,673、7,414,116和7,057,026，以及WO 91/06678和WO 07/123744中，这些专利中的每一者全文据此以引用方式并入。应当理解，在一些具体实施中，具有3'终止子部分或缺乏3'羟基的核苷酸类似物(诸如双脱氧核苷酸类似物)可在已掺入核苷酸类似物的多核苷酸不被进一步延伸的条件下使用。在一些具体实施中，核苷酸可不包含可逆终止子部分，或该核苷酸将不包含不可逆终止子部分，或该核苷酸将根本不包含任何终止子部分。在一个具体实施中，3'-羟基封端基团是可逆的封端基团。
如本文所用，术语“扩增子”当用于提及核酸时，意指复制该核酸的产物，其中该产物具有与该核酸的核苷酸序列的至少一部分相同或互补的核苷酸序列。扩增子可通过使用核酸或其扩增子作为模板的多种扩增方法中的任一种产生，这些扩增方法包括例如聚合酶延伸、聚合酶链反应(PCR)、滚环扩增、连接延伸或连接酶链反应。扩增子可以是具有特定核苷酸序列的单拷贝(例如，PCR产物)或该核苷酸序列的多拷贝(例如，滚环扩增的串联产物)的核酸分子。靶核酸的第一扩增子通常为互补拷贝。后续的扩增子是在生成第一扩增子后，由靶核酸或由第一扩增子形成的拷贝。后续的扩增子可具有与靶核酸基本上互补或与靶核酸基本上相同的序列。
如本文所述，短语“扩增位点”是指阵列中或阵列上可生成一个或多个扩增子的位点。扩增位点还可被配置为包含、保持或附接在该位点生成的至少一个扩增子。
如本文所用，术语“容量”当用于提及位点和核酸材料时，意指可占据该位点的核酸材料的最大量。例如，该术语可指在特定条件下可占据该位点的核酸分子的总数。可使用其他度量，包括例如核酸材料的总质量或在特定条件下可占据该位点的特定核苷酸序列的拷贝总数。通常，靶核酸的位点的容量将基本上等于靶核酸的扩增子的位点的容量。
如本文所用，术语“克隆群体”包括相对于特定核苷酸序列而言是同源的核酸群体。同源序列通常为至少10个核苷酸长，但甚至可更长，包括例如至少50、至少100、至少250、至少500或至少1000个核苷酸长。克隆群体可来源于单个靶核酸或模板核酸。通常，克隆群体中的所有核酸将具有相同的核苷酸序列。应当理解，在不脱离克隆性的情况下，少量突变(例如，由于扩增伪影(amplification artifact))可发生在克隆群体中。还将理解的是，在不脱离克隆性的情况下，少量不同的靶核酸或模板核酸(例如，由于靶核酸未被扩增)可发生在克隆群体中。
术语“簇”是指由多个相同的固定核酸链和多个相同的固定互补核酸链构成的固体载体上的离散位点。术语“簇阵列”是指由此类簇或群体形成的阵列。在该上下文中，术语“阵列”不应被理解为需要簇的有序布置。
如本文所用，当参考核酸使用时，术语“不同”意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两种或更多种核酸可具有沿其整个长度不同的核苷酸序列。另选地，两种或更多种核酸可具有沿其长度的相当大部分不同的核苷酸序列。例如，两种或更多种核酸可以具有彼此不同的靶核苷酸序列部分，同时还具有彼此相同的通用序列区域。
如本文所用，如果蛋白质的氨基酸序列与该蛋白质相比具有指定量的序列相似性和/或序列同一性，则该蛋白质可与该蛋白质“同源”。两个氨基酸序列的结构相似性可通过比对两个序列的残基(例如，候选物蛋白质和蛋白质)来测定，以优化沿其序列长度的相同氨基酸的数量；为了优化相同氨基酸的数量，在进行比对时允许任一个或两个序列中有空位，尽管每个序列中的氨基酸必须保持其正确的顺序。候选物蛋白质是与该蛋白质进行比较的蛋白质。
在两个氨基酸序列的比较中，结构相似性可用百分比“同一性”来指代，或可用百分比“相似性”来指代。“同一性”是指存在相同的氨基酸。“相似性”是指不仅存在相同的氨基酸，而且存在保守取代。蛋白质中氨基酸的保守取代可选自该氨基酸所属类别的其他成员。例如，在蛋白质生物化学领域中已知，属于具有特定大小或特征(诸如电荷、疏水性或亲水性)的一组氨基酸的氨基酸可被另一个氨基酸取代，而不改变蛋白质的活性，特别是在与生物活性不直接缔合的蛋白质区域。
因此，如本文所用，与本文所述蛋白质的同源性，包括例如与DNA结合蛋白质的同源性，可包括与该蛋白质具有至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％氨基酸序列相似性的蛋白质。
如本文所用，“文库”是来自给定的来源或样品的多核苷酸群体。文库包括多个靶多核苷酸。
本文所述的经修饰的核苷酸包含具有嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分的经修饰的核苷酸。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸与可检测标记连接。在一个具体实施中，可检测标记包含荧光团。本公开涵盖包含荧光标记的核苷酸(或任何其他检测标签)，该荧光标记可用于本文公开的任何方法中，其本身掺入较大分子结构或缀合物中或与较大分子结构或缀合物缔合。可检测标记的附加示例描述于美国专利号7,541,444；9,593,373；和9,410,199中，这些专利全文据此以引用方式并入。
荧光标记可包括选自任何已知荧光物质的化合物，例如罗丹明或花青。如本文所公开的荧光标记可附着到核苷酸碱基上的任何位置，并且可以任选地包含连接基。在一个具体实施中，经修饰的核苷酸通过可裂解的连接基与可检测标记连接。连接基的功能通常是帮助荧光标记与核苷酸的化学附着。在特定具体实施中，仍然可以对所得的类似物进行沃森-克里克碱基配对。连接基基团可用于将染料共价附着到核苷或核苷酸。连接基部分可以具有足够的长度以将核苷酸连接到化合物，使得该化合物不显著干扰核酸复制酶对核苷酸的总体结合与识别。因此，连接基还可包含间隔区单元。间隔区距离为例如核苷酸碱基距裂解位点或标记的距离。
连接基可以是可裂解的，并且裂解位点可以位于连接基上导致部分连接基在裂解后仍附着于核苷酸碱基或导致整个连接基从核苷酸碱基上去除的位置。示例性连接基包含含叠氮化物和烯丙基的可裂解部分、二硫键连接基、酸不稳定部分(包括二烷氧基苄基部分、Sieber连接基、吲哚部分、叔丁基Sieber部分)、亲电可裂解部分、亲核可裂解部分、光可裂解部分、还原条件下的裂解、氧化条件下的裂解、通过使用安全捕获部分的裂解和通过消除机制的裂解。此类部分的示例描述于WO 03/048387和美国专利号9,127,314中，这两个专利全文据此以引用方式并入。
该组合物可包含与不同可检测标记连接的不同的经修饰的核苷酸。在一些具体实施中，四种不同的经修饰的核苷酸可与四种不同的可检测标记连接。另选地，可以用两种不同的可检测标记(例如，对于双通道边合成边测序)或用单一可检测标记(例如，对于单通道边合成边测序)标记四种不同的经修饰的核苷酸。
如本文所用，“核苷”在结构上类似于核苷酸，但缺少磷酸部分。核苷类似物的一个示例是其中标记与碱基连接并且没有磷酸基团连接到糖分子的核苷类似物。术语“核苷”在本文中以本领域技术人员所理解的常规含义使用。示例包括但不限于包含核糖部分的核糖核苷和包含脱氧核糖部分的脱氧核糖核苷。经修饰的戊糖部分是其中氧原子已被碳取代和/或碳已被硫或氧原子取代的戊糖部分。“核苷”是可以具有取代的碱基和/或糖部分的单体。
术语“嘌呤碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。类似地，术语“嘧啶碱基”在本文中以本领域技术人员所理解的普通含义使用，并且包括其互变异构体。任选地取代的嘌呤碱基的非限制性列表包括嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤、别黄嘌呤、7-烷基鸟嘌呤(例如，7-甲基鸟嘌呤)、可可碱、咖啡因、尿酸和异鸟嘌呤。嘧啶碱基的示例包括但不限于胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5,6-二氢尿嘧啶和5-烷基胞嘧啶(例如5-甲基胞嘧啶)。
如本文所述，术语基底(或固体载体)可包括核酸可附着到其上的任何惰性基底或基质，例如玻璃表面、塑料表面、胶乳、葡聚糖、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面和硅晶片。例如，基底可以是玻璃表面(例如，流通池通道的平面表面)。在一个具体实施中，基底可以包括已经被“官能化”的惰性基底或基质，例如通过施加中间材料的层或包衣，该中间材料包含允许共价附着到分子诸如多核苷酸的反应性基团。载体可包括负载在惰性基底诸如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶。分子(例如，多核苷酸)可直接共价附着至中间材料(例如，水凝胶)。载体可以包括多个颗粒或小珠，每个颗粒或小珠具有不同的附着分析物。
如本文所用，“衍生物”或“类似物”意指具有修饰的碱基部分和/或修饰的糖部分的合成核苷酸或核苷衍生物。这样的衍生物和类似物在例如Bücher,N.“NucleotideAnalogsSynthesis and Biological Function”,Angewandte Chemie 97:564(1980)和Uhlmann等人，“Antisense Oligonucleotides:A New Therapeutic Principle”,ChemicalReviews 90:543-584(1990)，这两篇文献全文据此以引用方式并入。核苷酸类似物还可包含经修饰的磷酸二酯键，包括硫代磷酸酯键、二硫代磷酸酯键、烷基膦酸酯键、苯胺磷酸酯键和氨基磷酸酯键。如本文所用，“衍生物”、“类似物”和“修饰的”可以互换使用，并且由本文所述的术语“核苷酸”和“核苷”涵盖。
如本文所用，术语“固相”或“表面”用于表示平面阵列，其中引物附接到平坦表面，例如玻璃、二氧化硅或塑料显微镜载片或类似的流通池装置；表示小珠，其中一个或两个引物附接到这些小珠并且这些小珠被扩增；或者表示在小珠已扩增后表面上的小珠阵列。
如本文所用，“基本上不含”材料(包括例如拥挤剂或核酸)是指组合物具有小于10％的材料、小于5％的材料、小于4％的材料、小于3％的材料、小于2％的材料或小于1％的材料。
本发明的方面描述的组合物包含自由基清除剂。如本文所用的术语“清除剂”是指与可能具有导致DNA光损伤和/或断裂能力的不希望的分子反应和/或中和的任何分子和/或化合物。例如，清除剂可包括但不限于自由基清除剂。如本文所述的自由基清除剂包括有助于保护免受自由基引起的损害的物质，诸如抗氧化剂。如本文所述的自由基包括存在于环境中的不稳定分子。在一个具体实施中，该自由基清除剂是酚抗氧化剂。在一个具体实施中，该自由基清除剂包含没食子酸(GA)、没食子酸羟乙酯(HEG)、原儿茶酸(PCA)、儿茶素或它们的组合。
在一个具体实施中，该组合物还包含一种或多种非还原糖。如本文所述的术语“非还原糖”可包括在碱性水溶液，诸如但不限于水中，不被弱氧化剂(氧化醛但不氧化醇的氧化剂)氧化的任何碳水化合物。非还原糖的特性包括，在碱性水介质中，非还原糖不生成任何含醛基的化合物。在一个具体实施中，一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精或葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。当存在时，非还原糖的重量％可在组合物的约0.001重量％至约50重量％的范围内。例如，非还原糖的重量％可介于约0.01重量％与约99重量％之间。另选地，当存在时，非还原糖的重量％可介于约0.01重量％与约75重量％之间或介于约0.01重量％与约65重量％之间或介于约0.01重量％与约55重量％之间或介于约0.01重量％与约50重量％之间或介于约0.01重量％与约45重量％之间或介于约0.01重量％与约35重量％之间或介于约0.01重量％与约25重量％之间或介于约0.01重量％与约15重量％之间、介于约0.01重量％与约5重量％之间，或其间的任何范围。在一个具体实施中，组合物包含至少约5重量％的非还原糖。例如，组合物可包含约5重量％、约6重量％、约7重量％、约8重量％、约8重量％、约8.5重量％、约9重量％、约9.5重量％、约10重量％、约11重量％、约12重量％、约13重量％、约14重量％、约15重量％、约19重量％、约19.5重量％、约20重量％、约25重量％、约30重量％、约35重量％、约40重量％、约45重量％、约50重量％、或高于50重量％、或其间任何量的非还原糖。在另一个具体实施中，组合物包含约5重量％或更少的非还原糖。例如，组合物可包含约4.5重量％、约4重量％、约3.5重量％、约3重量％、约2.5重量％、约2重量％、约1.5重量％、约1重量％、约0.5重量％、约0.4重量％、约0.3重量％、约0.2重量％、约0.1重量％、约0.05重量％、约0.01重量％、约0.001重量％、低于0.001重量％、或其间任何量的非还原糖。非还原糖可以任何适于产生期望效果的量添加。
在一些具体实施中，当在37℃下储存小于7天或多于7天的时间时，组合物是稳定的。例如，该组合物可稳定数月甚至一年以上。在某些示例中，组合物可在5天、7天、10天、14天、30天、31天、50天、100天、200天、300天、365天、400天、500天、600天、700天、800天、900天、1,000天的一段时间内或其间的任何时间段为稳定的。当DNA聚合酶在至多37℃下储存一段时间，例如7天或26天或更长时间后，保持储存前相同量的DNA聚合酶的至少75％，更优选至少80％的活性时，该DNA聚合酶被认为是“稳定的”。在一些具体实施中，DNA聚合酶的活性可使用FRET测定来测量。当在至多37℃下储存7天或26天或更长时间后，当经修饰的核苷酸在储存前包含99.92％具有3'-羟基保护基团时，当经修饰的核苷酸中的每种经修饰的核苷酸至少99.8％保持3'-羟基保护基团时，经修饰的核苷酸被认为是“稳定的”，如通过HPLC测量的。
实现包含一种或两种经修饰的核苷酸和DNA聚合酶的组合物，其中经修饰的核苷酸和DNA聚合酶两者在至多37℃下储存7天或26天或更长时间后都是稳定的，这不是微不足道的。事实上，组分之间可能的相互作用被认为禁止在冻干前混合组分。此外，允许经修饰的核苷酸稳定的条件可能与允许DNA聚合酶稳定的条件相反。
本文所述的组合物可为冻干的。在一个具体实施中，该组合物包含饼、小珠或粉末。在另一个具体实施中，该组合物可以是微球、饼或它们的组合。
当组合物呈饼或小珠(例如微球)的形式时，组合物可表现出机械刚性。如本文所用，本体组合物(例如，小饼或小珠)的“机械刚性”是指在本体组合物经受机械应力(诸如振动或冲击应力)之后表现出至多5％，更优选至多1％，甚至更优选至多0.5％，并且最优选至多0.1％的从本体组合物的质量损失的本体组合物。保持本体组合物的机械刚性有助于防止运输期间冻干材料的损失。例如，如果饼或小珠缺乏机械稳定性，则可能发生不完全的再水合，导致测序反应的效率损失。不完全的再水合可由冻干材料的不可预测的位置引起，其中冻干碎片或脱落的粉末可能位于再水合线之外。
如本文所用，“微球”包括直径为0.1μm至25,000μm的球形颗粒或小珠。例如，微球可具有约0.1μm、0.5μm、1μm、10μm、20μm、25μm、30μm、35μm、40μm、50μm、60μm、70μm、80μm、90μm、100μm、150μm、200μm、300μm、400μm、500μm、600μm、700μm、800μm、900μm、1000μm、10,000μm、25,000μm的直径，或介于约0.1μm与约25,000μm之间的任何直径。在一个具体实施中，包封的微球具有介于约100μm与约1000μm之间的直径。在一个具体实施中，微球具有介于约0.1mm与约25mm的横截面。在一个具体实施中，微球具有介于约0.1mm与约1mm的横截面。在一个具体实施中，组合物具有大于约1mm的横截面。在一个具体实施中，组合物具有约0.1mm、1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、50mm、100mm、200mm、300mm、400mm、500mm、600mm、700mm、800mm、900mm、1,000mm的直径，或介于约0.1mm与约1,000mm之间的任何直径。
在一个具体实施中，微球是球形、椭圆形或环形。微球通常由聚合物壳，例如生物可降解的聚合物组成。根据本公开的微球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。例如，微球可通过将液体冷冻成冷冻粒料，接着将冷冻微球放置在干燥器(例如旋转干燥器)中来制备。
根据本公开的大球包括通过本领域技术人员已知的常规技术制备的微球。本文所述的组合物、方法、料筒和系统可包括单个微球，或可包括多个微球并且因此可以形成大球。例如，本文所述的组合物可包含介于1个与超过1,000,000个之间的微球。在一个具体实施中，该组合物包含1个微球，或小于100个微球，或小于500个微球，或介于约1与约1,000,000之间的任何数量的微球。在一个具体实施中，例如在大球中，组成和/或试剂是不同的。
根据本公开的冻干包括根据本领域技术人员已知的常规技术的方法。冻干在本文中也称为冷冻干燥。在本公开中，术语“冻干(lyophilize)”或“冻干物(lyophilizate)”将用作“冻干的(lyophilised)”、“冻干物(lyophilisate)”或“冷冻干燥的”的等效术语，例如，关于本文所述的组合物、系统或方法。
可冻干制剂可以重构成溶液、悬浮液、乳液或任何其他适于施用或使用的形式。可冻干制剂通常首先制备成液体，然后冷冻并冻干。冻干前的总液体体积可以小于、等于或大于冻干制剂的最终重构体积。冻干制剂的最终重构体积可小于冻干前的总液体体积，或可大于冻干前的总液体体积，或可为与冻干前相同的总液体体积。冻干方法是本领域普通技术人员已知的，并且通常包括水在受控条件下从冷冻制剂中升华。
冻干制剂可以在宽范围的温度下储存。冻干制剂可在25℃以下储存，例如在2℃-8℃冷藏，或在室温(例如，大约25℃)下储存。冻干制剂可以在约0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃或介于37℃与-80℃之间的任何温度下储存。例如，它们的组合物可在介于约15℃与约37℃之间、低于约25℃、约4℃至20℃；低于约4℃；低于约-20℃；约-40℃；约-70℃或约-80℃下储存。冻干制剂的稳定性可以以本领域已知的多种方式测定，例如，通过微球和/或团块的视觉外观和/或通过水分含量来测定。本公开的组合物还可经受在运输期间可能发生的温度剧增，例如至多70℃。在一个具体实施中，本文所述的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统在储存一段时间(例如，10天、14天、20天、26天、30天、60天、100天、200天、300天、365天或更长试剂盒时间，例如在37℃的温度下储存时)表现出稳定性。
冻干制剂通常通过添加水溶液以溶解冻干制剂而再水合(在本文中可互换地称为“重构”)。多种水溶液可用于重构冻干制剂，包括水、盐水或另一种电解质或非电解质稀释剂。优选地，本文所述的冻干微球用水重构。冻干制剂可以用包含水(例如，USP WFI或注射用水)或抑菌水(例如，含0.9％苄醇的USP WFI)的溶液再水合。然而，包含添加剂、缓冲剂、赋形剂和/或载体的溶液也可以使用并且在本文中有描述。
冷冻干燥制剂或冻干制剂通常由液体制备，即由溶液、悬浮液、乳液等制备。因此，要经历冷冻干燥或冻干的液体优选包含最终重构液体制剂中所期望的所有组分。因此，当再水合或重构时，冷冻干燥制剂或冻干制剂将在重构时产生期望的液体制剂。
在一个具体实施中，当冻干时，本文所述的组合物包含低于约10重量％的含水量。例如，含水量可以小于约9.5重量％、小于约9重量％、小于约8.5重量％、小于约8重量％、小于约7.5重量％、小于约7重量％、小于约6.5重量％、小于约6重量％、小于约5.5重量％、小于约5重量％水、小于约4.5重量％、小于约4重量％、小于约3.5重量％、小于约3重量％、小于约2.5重量％、小于约2重量％、小于约1.5重量％、小于约1重量％、小于约0.5重量％、小于约0.1重量％水或其间的任何量。在一个具体实施中，冻干组合物中不存在可测量含量的水。
在一个具体实施中，组合物还包含但不限于一种或多种附加试剂，例如一种或多种酶、盐、表面活性剂、缓冲剂、酶抑制剂、引物、核苷酸、有机渗透物、磁珠、分子探针、拥挤剂、小分子、带标记的核苷酸或它们的任何组合。在优选的具体实施中，组合物不包含和/或不被水介质包围。
如本文所用，术语“试剂”描述可用于与样品反应、与样品相互作用、稀释样品或添加到样品中的单一试剂或两种或更多种试剂的混合物，并且可包括本文所述的组合物以及用于核酸反应中的试剂，包括例如缓冲剂、化学品、酶、聚合酶、引物(包括大小小于50个碱基对的引物)、模板核酸、核苷酸、标记物、染料或核酸酶。在一个具体实施中，试剂包含聚合酶，例如Pol 812、129DNA聚合酶、Taq聚合酶、Bsu聚合酶或它们的任何组合。在一些具体实施中，试剂可以进一步或另选地包含溶菌酶、蛋白酶K、随机六聚体、转座酶(例如，Tn5)、引物(例如，P5和P7衔接子序列)、连接酶、催化酶、脱氧核苷酸三磷酸、缓冲剂或二价阳离子。试剂可以进一步或另选地包含例如小珠连接的转座体(BLT)、Tris pH7、MgCl2、乙酸镁、硫酸镁、索引引物、Q5聚合酶、Bst3.0、Tris pH9、dNTP、NaCl、甜菜碱或它们的任何组合。在某些具体实施中，如本文所述的试剂可包含酶，诸如聚合酶、连接酶、重组酶或转座酶；结合伴侣，诸如抗体、表位、链霉亲和素、抗生物素蛋白、生物素、凝集素或碳水化合物；或其他生物化学活性分子。其他示例试剂包括用于生物化学方案的试剂，诸如核酸扩增方案、基于亲和力的测定方案、酶促测定方案、测序方案和/或用于分析生物流体的方案。根据本文公开的一些具体实施，根据特定工作流程和/或下游应用，试剂可以包含一个或多个小珠，尤其是磁珠。
在一个具体实施中，根据本公开的试剂是聚合酶。如本文所用，术语“聚合酶”旨在与其在本领域中的用途一致，并且包括例如使用核酸作为模板链产生核酸分子的互补复制的酶。通常，DNA聚合酶结合到模板链并且然后沿模板链向下移动，将核苷酸依序添加到生长核酸链的3'端处的游离羟基。DNA聚合酶通常自DNA模板合成互补DNA分子并且RNA聚合酶通常自DNA模板合成RNA分子(转录)。聚合酶可以使用短RNA或DNA链(称为引物)来开始链生长。一些聚合酶可以置换它们将碱基添加到链的位点上游的链。此类聚合酶称为链置换的，意味着它们具有从由聚合酶读取的模板链中去除互补链的活性。具有链置换活性的示例性聚合酶包括但不限于Bst(嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus))聚合酶、exo-Klenow聚合酶或测序级T7 exo-聚合酶的大片段。一些聚合酶可使它们前方的链降解，从而有效地用后面生长的链置换前方链(5'核酸外切酶活性)。一些聚合酶具有可使它们后面的链降解的活性(3'核酸外切酶活性)。一些有用的聚合酶已经通过突变或者以其他方式修饰以减少或消除3'和/或5'核酸外切酶活性。
根据本公开的聚合酶可以包括能够耐受掺入磷酸标记的核苷酸的任何聚合酶。根据本公开可能有用的聚合酶的示例包括但不限于phi29聚合酶、klenow片段、DNA聚合酶I、DNA聚合酶III、GA-1、PZA、phi15、Nf、G1、PZE、PRD1、B103、GA-1、9oN聚合酶、Bst、Bsu、T4、T5、T7、Taq、Vent、RT、polβ、polγ和它们的组合。可以使用被设计成具有特定特性的聚合酶。在一个具体实施中，聚合酶可用于测序(“测序聚合酶”)。
如本文所公开的引物包括可以与所关注靶序列杂交的核酸分子。在几个具体实施中，引物可用作底物，核苷酸可通过聚合酶聚合到该底物上。然而，在一些示例中，引物可掺入合成的核酸链中并提供另一引物可与之杂交的位点，以引发与合成的核酸分子互补的新链的合成。引物可包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一个具体实施中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。
可以包含在上述组合物中的核酸分子的非限制性示例还包括DNA，诸如基因组或cDNA；RNA，诸如mRNA、sRNA或rRNA；或DNA和RNA的杂交体。组合物还可包含带标记的核苷酸。
术语“盐”可包括由毒性或无毒酸或碱(包括无机酸和无机碱以及有机酸和有机碱)制备的盐。盐可以由例如药学上可接受的无毒酸(包括无机酸和有机酸)制备。
本领域技术人员已知的任何表面活性剂也可包含在组合物中，特别是当组合物被冻干时。表面活性剂可以是非离子型的或离子型的(特别是阳离子型的或阴离子型的)或者可以是两性离子的。如本文所述的表面活性剂包括Tween-20、Tween 80、CHAPS或其他洗涤剂，诸如Brij-L23、Pluronic-F127或它们的组合。合适的表面活性剂的示例包括但不限于聚丙烯酸盐表面活性剂、有机硅表面活性剂和/或其他可商购的表面活性剂或洗涤剂。本文所述的组合物可包含阴离子表面活性剂，该阴离子表面活性剂在一端含有阴离子官能团，诸如硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根官能团。试剂可包含中性表面活性剂，例如聚乙二醇月桂基醚。
组合物可以进一步或在替代方案中包含酶抑制剂、分子探针、拥挤剂、有机渗透物、环糊精、三磷酸腺苷(ATP)、乙二胺四乙酸(EDTA)、肌酸激酶、肌酸磷酸酯、钯、硫辛酸、六乙二醇、三羟基丙烷膦、抗坏血酸钠或它们的任何组合。如本文所述的酶抑制剂包括与酶结合并降低其活性的任何分子。如本文所述的分子探针包括，例如，地高辛、8-苯胺基萘-1-磺酸(“ANS”)、卟啉、BODIPY、花青或它们的任何组合。如本文所述的拥挤剂包括本领域技术人员已知的任何拥挤剂。示例包括但不限于聚乙二醇、ficoll、葡聚糖和血清白蛋白。在一个具体实施中，组合物包含约5重量％、约4重量％、约3重量％、约2重量％、约1重量％、小于约1重量％的拥挤剂，例如小于约0.001重量％、约0.001重量％、约0.005重量％、约0.01重量％、约0.05重量％、约0.1重量％、约0.5重量％、约1重量％或其间的任何量或范围。在一个具体实施中，组合物中不存在可测量含量的拥挤剂。
在一个具体实施中，组合物包含甘油。甘油的量可变化，但是在一个具体实施中，组合物包含小于约1重量％的甘油。例如，组合物可包含小于约0.001重量％、约0.001重量％、约0.005重量％、约0.01重量％、约0.05重量％、约0.1重量％、约0.5重量％、约1重量％或其间的任何量或范围。在一个具体实施中，组合物中不存在可测量含量的甘油。
测序技术领域的技术人员将理解存在本文未明确描述的可用于本公开的组合物、方法、试剂盒、系统和料筒的附加试剂。
在一个具体实施中，如本文所述的组合物还可包含一种或多种附加试剂，诸如功能性蛋白质活化剂。在一个具体实施中，功能性蛋白质活化剂包括镁、镁盐或其他镁衍生物或它们的组合。
在一个具体实施中，组合物可包含T4多核苷酸激酶(T4·PNK)，其为在DNA和RNA修复中具有两种不同功能的同源四聚体：5'-激酶活性和3'-磷酸酶活性。该酶的N-末端结构域将磷酸从ATP转移到DNA和RNA的5-OH末端。磷酸化反应是可逆的；在ADP存在的情况下，T4PNK切割5'磷酸。此外，T4PNK表现出交换活性以将存在于DNA分子5'末端处的现有磷酸基团与来自另一个磷酸供体的磷酸基团进行交换。该酶的C-末端结构域催化磷酸酶活性，其从DNA和RNA的3'-末端中去除磷酸基团。
在一个具体实施中，组合物还包含还原剂。还原剂可包括例如2-巯基乙醇、三(2-羧乙基)-磷酸氢盐(TCEP)，或三(羟丙基)膦(THP)或它们的组合。
在一个具体实施中，组合物还包含三(羟丙基)膦(THP)和烷醇胺。组合物在再水合后可用作裂解组合物。在一个具体实施中，裂解组合物可用于从经修饰的核苷酸上去除可检测标记，并再生3'-羟基保护基团。在一个具体实施中，烷醇胺包含乙醇胺、氨甲基丙醇、氨甲庚醇、异他林、丙醇胺、鞘氨醇、甲醇胺、二甲基乙醇胺或N-甲基乙醇胺。在一些具体实施中，烷醇胺包含乙醇胺。
值得注意的是，包含THP(其难以冻干)和乙醇胺(一种对冻干不理想的挥发性缓冲剂)的组合物仍然可冻干，从而允许试剂在环境温度下运输。此外，冻干后，THP可保持其促进施陶丁格反应的能力。
本文所述的组合物可用于多个依次共测定，包括裂解、DNA分析、RNA分析、蛋白质分析、标签片段化、核酸扩增、核酸测序、DNA文库制备、SBS技术、使用测序的转座酶可及染色质测定(ATAC-seq)、邻近性保留转座(CPT-seq)、单细胞组合索引测序(SCI-seq)或单细胞基因组扩增或依次执行的它们的任何组合。在一个具体实施中，该组合物用于进行多个共测定反应。在一个具体实施中，本文所述的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统可改善测序质量，使得能够进行一锅文库制备，并且简化制造。如本文所用，术语“一锅反应”也可称为“无转移反应”。
可准备本文所述的组合物、方法、试剂盒、料筒和系统用于测序的各个阶段，包括但不限于样品提取、文库制备、富集、成簇和测序。组合物可包含许多与本文所述的那些不同的试剂或可用于促进测序系统(例如，SBS技术)效用的任何试剂。
在一个具体实施中，生物样品接触该组合物。生物样品可以包括例如全血、淋巴液、血清、血浆、汗液、泪液、唾液、痰、脑脊髓液、羊水、精液、阴道分泌物、浆液、滑液、心包液、腹膜液、胸腔积液、漏出液、渗出液、胆囊液、胆汁、尿液、胃液、肠液、粪便样品、含有单个或多个细胞的液体、含有细胞器的液体、流化组织、流化生物体、含有多细胞生物体的液体、生物拭子和生物洗液。生物样品可以包括核酸，诸如DNA、基因组DNA、RNA、mRNA或其类似物；核苷酸，诸如脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或其类似物诸如具有终止子部分的类似物，诸如在以下文献中描述的那些：Bentley等人，“Accurate Whole Human Genome SequencingUsing Reversible Terminator Chemistry,”Nature 456:53-59(2008)；WO/2013/131962；美国专利号7,057,026；WO/2008/042067；WO/2013/117595；美国专利号7,329,492；美国专利号7,211,414；美国专利号7,315,019；美国专利号7,405,281；和美国专利公布号20080108082，其全部全文据此以引用方式并入。
第二方面涉及一种再水合的方法。该方法包括提供一种组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；以及在有效地使该组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
如本文所用的再水合(或重构)溶液可包括水、去离子水、盐水溶液、酸性溶液、碱性溶液、洗涤剂溶液和/或缓冲液，并且可与前述再水合溶液一致。在一个具体实施中，再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。在一个具体实施中，本文所述的具有不同浓度、不同类型的酶和不同量的辅因子、盐、pH等的试剂可单独用水或甚至经大气水捕获再水合。可以在再水合溶液中提供如本文所述的附加添加剂以进一步改善对微球释放的控制。
在一个具体实施中，再水合溶液的pH介于约7.0与约10.0之间。再水合溶液的pH可以是例如约7.0、约7.5、约8.0、约8.5、约9.0、约9.5、约10.0或其间的任何量。再水合时间将根据组合物含量和反应条件(例如，试剂、温度、pH)而变化。在一个具体实施中，再水合时间可介于0.01秒与5小时之间。例如，再水合时间可以是约0.01秒、0.1秒、1秒、10秒、30秒、45秒、60秒、5分钟、10分钟、12分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、70分钟、80分钟、90分钟、2小时、5小时或其间的任何量。
在一个具体实施中，该方法还包括在边合成边测序过程中使用该经再水合的组合物。在另一个具体实施中，该方法还包括将该经再水合的组合物暴露于测序引物，其中该测序引物中该一种或多种经修饰的核苷酸的掺入产生延伸的测序引物。在另一个具体实施中，该方法还包括将将该经再水合的组合物施用于包含核苷酸簇的固体载体，其中该核苷酸簇包含靶多核苷酸。
第三方面涉及一种组合物。该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
在一个具体实施中，该功能性蛋白质包含聚合酶、重组酶、DNA结合蛋白质或它们的组合。在一个具体实施中，该DNA结合蛋白质是单链DNA结合蛋白质。
在一个具体实施中，该一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精或葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。
第四方面涉及一种再水合的方法。该再水合的方法包括提供一种组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的；以及在有效地使该组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
桥式扩增的一种方法是排他性扩增(ExAmp)，也称为动力学排他性扩增。ExAmp包括重组酶促进的聚合酶扩增(也称为RCA或RPA)。参见Pipenburg等人，“DNA DetectionUsing Recombination Proteins,”PLOS Biol.4(7):e204(2006)，该文献据此全文以引用方式并入。ExAmp使用图案化阵列和等温条件来扩增文库。ExAmp阻止图案化阵列的孔内的多克隆簇；簇形成期间初始DNA模板的快速扩增防止了其他DNA模板在孔中杂交。在一个具体实施中，该方法还包括在排他性扩增过程中使用该经再水合的组合物。
第五方面涉及一种试剂盒。该试剂盒包括一种组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；和一种组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
第六方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：试剂贮存器，其中该试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
示例性料筒和构型描述于例如美国专利号8,637,242；8,951,781；9,116,139；9,193,996；9,387,476；9,410,977；9,650,669；9,777,325；9,782,770和美国公布号2017/0246635，所有这些专利全文据此以引用方式并入。例如，示例性流通池描述于美国专利号8,241,573和8,951,781，这两篇专利据此全文以引用方式并入。
此外或另选地，料筒可以包括用于执行扩增方法和执行检测方法的单独的贮存器和流体系统。能够产生扩增核酸并且还确定核酸序列的整合测序系统的示例包括但不限于MiSeqTM平台(Illumina,Inc.,San Diego,CA)和在美国专利号8,951,781中所述的装置，该专利据此全文以引用方式并入。
第七方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：试剂贮存器，其中该试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；以及一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
第八方面涉及一种料筒。该料筒包括流通池，该流通池包括：第一试剂贮存器，其中该第一试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种经修饰的核苷酸，其中该经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及自由基清除剂，其中该组合物是冻干的；以及第二试剂贮存器，其中该第二试剂贮存器包括组合物，该组合物包含一种或多种功能性蛋白质；一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及一种或多种非还原糖，其中该组合物是冻干的。
该方面根据前述方面进行，尤其是关于所述组合物的特征。
应当理解，前述概念和本文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。
在本公开中，参考了形成本公开的一部分的附图，并且在附图中通过图示的方式示出了可以实施的特定具体实施。详细描述这些实施式案以使本领域的技术人员能够实践本公开，并且应当理解，可利用其他具体实施，并且可在不脱离本公开的范围的情况下作出结构、逻辑和电改变。因此，下面对示例性具体实施的描述不应被理解为限制性的。
本公开可通过参考以下实施例进一步说明。
实施例
以下实施例旨在说明，但决不旨在限制如在所附权利要求中阐述的本公开的范围。
实施例1-使用自由基清除剂稳定核苷酸。
通过添加赋形剂，诸如自由基清除剂解决了冻干期间的解封闭问题。
测序平台中的全功能核苷酸(ffN)中的AZM(叠氮基甲基)基团用于在边合成边测序(SBS)期间允许单个掺入。然后该官能团被还原剂，诸如THP切割，形成3'OH基团，然后下一个核苷酸可掺入其中。
AZM基团在水中也易于水解，导致其裂解并随后形成3'OH基团。该过程也称为解封闭。当含有掺入混合物的ffN溶液或单独的ffN热应力时，观察到解封闭。对于每种ffN，掺入混合物中3'OH量的当前规格设定为<0.2％。努力通过冻干过程来稳定ffN。然而，在暴露于高温后，解封闭仍可见。3'OH的增加可引起测序度量中的预定相增加，并降低Q30分数。解封闭的存在将对满足环境运输要求是一个挑战，因此，探索了替代方法来减少ffN中的解封闭，其中之一是使用自由基清除剂。
提出了解封闭的问题可通过使用自由基清除剂来减少，从而允许达到环境运输和储存的目的。
用自由基清除剂冻干蓝色ffN降低了3'OH的形成观察到蓝色ffN的冻干可引起形成的3'OH的大幅增加。在单一蓝色ffN以及ffN的混合物中添加自由基清除剂，诸如没食子酸(GA)、没食子酸羟乙酯(HEG)、原儿茶酸(PCA)或儿茶素，可减少形成的3'OH的量(图1至图3)。自由基清除剂的添加降低了接近prelyo对照的3'OH。这些自由基清除剂是有效的，因为冻干过程本身可导致自由基物质的形成，并且这些自由基可引起解封闭，导致3'OH的增加。
自由基引起ffN中的解封闭已经证实，通过添加自由基引发剂，诸如过硫酸钾(KPS)和四甲基乙二胺(TEMED)，自由基可引起解封闭(图4)。在该实验中，测试了不同的蓝色、绿色和红色染料以及NextSeqTM/MiniSeqTM，并且发现在与KPS生成的自由基反应时，3'OH增加。在一些染料中，由于吸收峰的消失，3'OH不能被测量，因此强度也降低(图5)。
冻干期间蓝色ffN中自由基的形成机制图6示出了香豆素染料内自由基形成的可能位点。这些自由基是由热和/或光以及氧的作用生成的。在冻干过程期间，这些带有含香豆素染料的蓝色ffN易受任何光存在的影响。冻干本身也浓缩了溶解的氧，因为化合物由于含水量减少而干燥，因此有助于自由基的形成。图7示出了在光漂白过程中，光和氧对于处于激发的S1单重态的分子越过激发的T1三重态并与分子氧反应的作用。
用自由基清除剂冻干红色和绿色ffN在现有MiniSeqTM/NextSeqTM料筒中冻干红色和绿色ffN期间，也探索了自由基清除剂的添加。自由基清除剂，诸如PCA也减少了3'OH形成(图8)，以及在测序期间减少了％预定相(图9)。
自由基清除剂的机制自由基清除剂是作为抗氧化剂的物质，从而终止或抑制自由基的形成。最常见的自由基清除剂类型是酚型(图10A)，其中由于OH基团的存在，其充当良好的氢供体。该自由基从酚抗氧化剂中去除氢原子，该酚抗氧化剂本身变成自由基(图10B)。
实施例2-用于测序应用的稳定化SBS试剂—掺入混合物(ICM)的冻干。
在37℃下测试当前掺入混合物的稳定性将掺入混合物在37℃加热不同的持续时间，然后进行测序。发现％预定相度量是对热应力最敏感的度量。在37℃下，随着热应力持续时间的增加，％预定相增加。其仅在11小时内保持在平均值的2个标准偏差内(平均值来源于最终仪器测试数据，该数据汇总了来自多于300台仪器和测序运行的数据)。％预定相，以及Q30在37℃下热应力35小时后未通过QC度量，如图11所示。
为了实现环境运输，试剂将需要按照ISTA 7D运输标准在37℃下稳定至少4天。然而，内部运输数据已经示出，13％的封装需要7天以上才能到达。因此，为了实现环境运输，试剂在37℃下将至少需要14天的稳定性。为此，寻求通过冷冻干燥或冻干来稳定掺入混合物。
当前的掺入混合物制剂含有10％的甘油，这防止了ICM的冻干。在此，描述了使用两种非还原糖的组合的几种赋形剂重配制，其产生稳定的冻干饼，并且在再溶解时保持全功能。
除了添加合适的赋形剂，该制剂还包括增加无甘油聚合酶的量，以解释冻干后聚合酶活性的降低。
全掺入混合物(ICM)的赋形剂筛选首先，对掺入混合物(ICM)的合适冷冻保护剂进行赋形剂筛选。蔗糖和海藻糖是非还原糖，其在所测试的多于20种赋形剂中表现最佳。对掺入混合物进行蔗糖和海藻糖滴定，以测定冻干所需的最佳糖比例。
配制不同比例的蔗糖和海藻糖赋形剂，并在37℃下老化4天和14天。几种蔗糖-海藻糖赋形剂比例能够保持冻干ICM的结构刚性。为了识别赋形剂是否成功地保持了冻干ICM的机械刚性，第一标准是冻干饼应保持机械稳定性，并且在热应力后不塌缩。
为了评估冻干和热应力后聚合酶的活性，对冻干样品进行荧光共振能量转移(FRET)测定。从图12中可看出，20％海藻糖、10％蔗糖+15％海藻糖和20％蔗糖+10％海藻糖是其相应类别中最佳的赋形剂，在37℃热应力14天后表现出最高的聚合酶活性。图13示出了冻干前后的聚合酶活性。
从图11可看出，冻干ICM的聚合酶活性至少需要150％的聚合酶，以与冻干前的100％聚合酶相匹配。
10％蔗糖和15％海藻糖在2X浓度的ICM中成功地冻干。用乙醇胺缓冲剂重构冻干ICM，并在MiniseqTM上测序。
ffN溶液的冻干.也探索了仅冻干掺入混合物的不稳定组分而不是全掺入混合物的可能性。在此章节中，仅全功能核苷酸被冻干。
由于缓冲条件不同于全掺入混合物，必须对ffN进行另一次赋形剂筛选。对ffN进行蔗糖和海藻糖滴定，仅是为了测定ffN冻干所需的最佳糖比例。
配制不同比例的蔗糖和海藻糖赋形剂，并在37℃下老化3天。将选定的赋形剂制剂冻干在5mL玻璃小瓶中。保持所有赋形剂制剂的机械刚性，并干燥所有样品(基于目视检查)。这些冻干饼甚至在热应力后仍保持其机械刚性，没有一个塌缩。
ffN溶液的小珠冻干.还尝试了冻干ffN的替代格式，以形成冻干的ffN小珠。制备了两种含有50％海藻糖和20％蔗糖的仅ffN制剂。通过将仅ffN的溶液滴加到液氮中来生成ffN小珠。生成了单独小珠体积介于16μL至60μL之间的小珠。使用蠕动泵生成的小珠给出了迄今为止最一致的小珠。
将ffN和Pol单独配制并冻干。含有15％蔗糖和25％海藻糖的制剂在碱基处似乎是湿的。可能的假设是由于样品过载。进行了测序。
实施例3-第二线性化混合物(BLM2)的稳定性。
当前的BLM 2制剂含有2.4％的甘油，这防止了BLM 2的冻干。在此，描述了几种赋形剂重配制，其产生稳定的冻干饼，并在再溶解时保持全功能。
从图14中可看出，在35℃下老化BLM 2 4天后，BLM 2已经损失了超过一半的其活性。然而，冻干能够保留BLM2活性，仅损失15.5％。
在两个不同的温度下老化BLM 2之后，除了9.5％的蔗糖之外，赋形剂能够保持样品的机械刚性，这示出了预期的饼收缩。
比较图15和图16，可看出9.5％的蔗糖是保留BLM 2最大活性的最佳赋形剂。9.5％蔗糖+10％海藻糖也保持了机械刚性并表现出高活性。
实施例4-再合成混合物(BRM)的冻干。
T4多核苷酸激酶(T4 PNK)是在DNA和RNA修复中具有两种不同功能的同源四聚体酶：5'-激酶和3'-磷酸酶活性。
T4 PNK在工作流程的两个主要用途中使用了这两种功能。首先，在ILMN文库制备期间，T4PNK磷酸化DNA片段的5'末端，这些DNA片段的平末端被聚合酶修复，使DNA片能够进行连接。第二，在SBS测序期间，T4PNK从表面结合的P5引物上去除3'磷酰基，允许随后的链再合成。
目前，BRM溶液在37℃下5天内示出不稳定性。在此，描述了一种稳定呈液体形式以及冷冻干燥形式的该酶的方法。该酶所驻留溶液的内容物包括10％甘油、咪唑缓冲剂、蔗糖、氯化镁和2-巯基乙醇，构成了再合成混合物(BRM)。
该稳定方法将是实现测序料筒环境运输和储存目标的重要里程碑。
由于含10％甘油的BRM制剂不能冻干到干燥，因此BRM不被配制有甘油。赋形剂，诸如海藻糖、Kollidon 12PF和Kollidon 30也以5重量/体积％至15重量/体积％添加。以与掺入混合物相同的方式冻干BRM。成功地冻干了各种管格式的BRM。添加海藻糖作为赋形剂。
在有和没有赋形剂的情况下冻干后，BRM形成了良好的饼。使用HPLC测量测定，以检测呈液体以及冷冻干燥形式的酶的任何脱磷酸化活性。5分钟后测量活性。
图17示出添加海藻糖、Kollidon 12PF和Kollidon 30有助于在热应力后稳定呈液体形式的BRM。所赋予的稳定性的量取决于所使用的赋形剂的量。在45℃下热应力8小时后，15％ Kollidon 12PF、5％和10％ Kollidon 30能够保持BRM的活性。
BRM的冷冻干燥导致约20％的活性损失，然而添加赋形剂，诸如10％Kollidon12PF和Kollidon 30能够在热应力后保持或提高活性。
实施例5-其他试剂的冻干。
冻干方法还包括在-51℃下在歧管冷冻干燥器上干燥。成功冻干的试剂包括扫描混合物(SRM)、裂解混合物(CMS)、扩增混合物(BMS)、测序引物(BP10和BP11)和索引引物(BP14)，其具有小于1％的低甘油含量。所有冻干材料在NextSeqTM仪器上测序，并且Q30分数高于83％的通过度量。
实施例6-使用水进行重悬的冻干单管ExAmp混合物。
当前市售的来自TwistDx的冻干RPA混合物以双管格式配制，其中酶/底物在一个管中，并且PEG+镁在第二管中分离。
相比之下，本发明的制剂包括以下非显而易见的发现：(1)冻干无PEG的ExAmp混合物，和(2)将包含Mg的ExAmp混合物冻干在存在几种Mg依赖性酶的相同溶液中(例如重组酶、聚合酶)。
在溶液中，Mg加速结构变化，导致几种ExAmp组分的装配/寡聚化，如gp32、UvsY、重组酶或肌酸激酶。当DNA存在时，这导致成功的DNA链重组和随后的扩增。然而，在不存在DNA的情况下，随时间推移，该蛋白质寡聚化通过非功能性蛋白质聚集的方式导致不稳定性。在高温下与和不与Mg一起温育的单独ExAmp蛋白质示出在图18中。
所有样品一式两份冻干。冻干后，立即将一个复制组重悬于150uL水中，并通过移液管混合，以评估冻干过程后样品的活性。第二样品复制组在37℃下储存过夜或至多五天，以评估冻干饼在高温下随时间推移的稳定性。
为了评估活性，使用重悬的Ras6T样品在HiseqXTM v2.5标准流通池上聚集。这需要在高温下将单链DNA(来自TruseqNanoTM人类文库制备)流动到流通池中，并使流动池冷却，以便DNA可与流通池中的互补引物杂交。随后两次30分钟的将重悬冻干的Ras6T混合物推过流通池，使用RCA技术生成和扩增杂交的单链DNA的局部拷贝(成簇)。成簇后，使用标准SBS测序在HiseqXTM仪器上对流通池进行测序。通过将每个样品的簇强度与非冻干的新鲜混合的Ras6T对照进行比较来评估成簇混合物的活性。如果Ras6T制剂中的酶是不稳定的/无活性的，将不存在簇的扩增，这将表现为暗淡或无信号强度。
图19A和19B示出了需要非还原糖，海藻糖或蔗糖来稳定冻干酶。冷冻干燥时立即的(图19A)和沉淀在37℃下温育16小时后的(图19B)冻干无PEG的Ras6T成簇。所有冻干制剂在冻干后都具有活性。然而，一旦饼在37℃下温育16小时，不含非还原糖的重悬冻干粒料产生非常暗淡的簇(深蓝色泳道2-4)。冻干混合物中含有蔗糖或海藻糖的所有泳道保留活性(黄色至橙色)。
表1.图19中测量ExAmp混合物活性的流通池强度图像的泳道分配。
冻干Ras6T在37℃温育5天后的稳定性。图20示出了用镁冻干无PEG的Ras6T(泳道8)，仅需要水进行重悬。
表2.泳道分配。图20中测量Ras6T混合物活性的流通池强度图像。
| 泳道 | 样品类型 | 冻干 | 重悬缓冲剂 |
| 1 | EPX123(对照) | 否 | 无 |
| 2 | EPX123(对照) | 否 | 无 |
| 3 | Ras6T(对照) | 否 | 无 |
| 4 | Ras6T-TCEP-Mg | 是 | TCEP/Mg溶液 |
| 5 | Ras6T-TCEP-Mg+100mM蔗糖 | 是 | TCEP/Mg溶液 |
| 6 | Ras6T-TCEP+Mg+100mM蔗糖 | 是 | TCEP溶液 |
| 7 | Ras6T+TCEP-Mg+100mM蔗糖 | 是 | Mg溶液 |
| 8 | Ras6T+TCEP+Mg+100mM蔗糖 | 是 | 水 |
令人惊讶的是，在Mg存在下的冷冻干燥过程期间，蛋白质没有聚集到无活性的程度，并且在高温下仍能够在冻干状态下保持活性。鉴于发现Mg的结合降低RecA的热稳定性的出版物(Kim等人，“RecA Requires Two Molecules of Mg2+ Ions For Its OptimalStrand Exchange Activity In Vitro”,Nucleic Acids Research 46:2548-59(2018)，该文献据此全文以引用方式并入)，以及发现RecA蛋白质的聚集作为Mg的函数(Roman等人，“Relationship of the Physical and Enzymatic Properties of Escherichia coliRecA Protein to Its Strand Exchange Activity,”Biochemistry 25:7375-85(1986)，该文献据此全文以引用方式并入)。
实施例7-每平台的ExAmp制剂不会因组分而发生显著变化，只是每种组分的浓度
不同。
当前市售的来自TwistDx的冻干RPA混合物以双管格式配制，其中酶/底物在一个管中，并且PEG+镁在第二管中分离。相对而言，ExAmp制剂中包含相同的组分，但最大的差异在于浓度，并且针对所使用的特定流通池进行了优化。
单独冻干原始组分，如Bsu或ATP，然后以适当的量将干燥组分微球混合在一起，这允许为每种组分开发一次冻干方法，然后不需要随着每个交互平台而改变，原始微球将只需要填充有不同量的组分。这也允许灵活地省去一些制剂中不需要的组分，如PEG或UvsY。
实施例8-复合物试剂制剂是每种单独组分的稳定性与活性之间的折衷。
在ExAmp中的肌酸激酶(CK)和磷酸肌酸(PC)。例如，组分CK和PC在不同的ph下具有最佳的活性和稳定性。将呈液体形式的组分组合用于液体制剂或全试剂(复合物试剂)饼或微球中的冻干需要使用两种组分的最佳pH值之间的pH值。
复合物试剂制剂可能仍需要分离的组分仅在进行化学反应之前立即结合，因为相互作用可引起呈液体形式的降解增加(在可发生冻干之前，复合物试剂在制造中的液体分级)。
重组酶和镁镁是催化酶反应所需的辅因子，当呈液体形式储存在一起时，将引起一些酶(如重组酶)的寡聚化或聚集，在储存应力期间，随时间推移可产生无活性的酶(图21)。因此，镁溶液传统上在单独的小瓶中配制，仅在反应前与酶立即结合。一旦冻干，在相同小瓶中将干燥组分组合在一起不应表现出任何相互作用，因为缺水会显著降低分子运动。
实施例9-微球使配制达到最佳活性。
酶通常具有稳定性最佳的储存条件和最佳活性的不同条件。原始组分微球的一个益处是能够在稳定的条件下配制活性组分以用于储存，并且还生成包含不同缓冲剂、盐等的微球，该不同缓冲剂、盐改变制剂环境，使包含活性组分微球和“活性缓冲剂”微球两者的混合物重悬时立即产生最高的性能。
图22示出了胞外酶在pH 7.5下具有高稳定性，但相对于在pH 9下仅20％的活性。然而，在pH 9下，随时间推移，降解速率显著增加。图23示出蛋白质的Tm(熔融温度)是蛋白质稳定性的指标之一(较高的Tm＝较高的稳定性)。OGG在高盐条件下具有较高的Tm，但在高盐条件下具有较低的活性。
图24示出了使用在最佳储存条件下配制的原始组分微球，然后利用添加到相同容器中的反应缓冲剂微球，使得在重悬时，反应缓冲剂将改变对活性最佳的制剂环境。图24还示出了改变活性组分的浓度量或甚至组合几种活性组分的灵活性，由于储存制剂不相容性，这些活性组分传统上是分开在单独小瓶中的。
实施例10-微球生成过程。
在该实施例中，展示了通过微珠和微球的冻干的本体格式以稳定测序试剂的可行性。喷雾冷冻干燥的概念使得微球生成成为可能。喷雾冷冻干燥是两步过程，其中液体试剂首先通过喷嘴喷入立式冷塔以形成冷冻微球。随后，通过盘式冻干或其他冷冻干燥设备干燥这些冷冻微球，以获得干燥微球。也可通过将测序试剂直接滴入液氮中形成冷冻微珠，并且随后在冷冻干燥器中对其进行冷冻干燥来制备微珠。
根据用于生成液滴的喷嘴的大小，微球的典型大小可在200um至800um的范围内。
制剂考虑因素在开发测序试剂微球的制剂时，存在几个关键考虑因素。测序试剂的活性组分需要使用赋形剂和热稳定剂来充分稳定。此外，干燥微球具有足够的机械强度以承受任何振动应力也很重要。
掺入混合物筛选不同的赋形剂以稳定用于测序的经修饰的核苷酸，对于冻干饼和小珠都是如此。如图25和图26所示，冻干小珠表现出降解产物1和2的较低形成。图27示出了在较高赋形剂浓度下冻干小珠的核苷酸降解产物形成的分析结果。
成簇酶最初筛选用于酶成簇的重组酶在非还原糖稳定剂(海藻糖、蔗糖和棉子糖)存在下的冻干稳定性。海藻糖在冻干和热应力后赋予酶最高的稳定性，如图28A和图28B所示。
由于重组酶的表面电荷，需要高盐浓度来防止高蛋白质浓度制剂中的酶沉淀。然而，高盐溶液更难冷冻，产生较低的Tg'，并且在冻干过程期间脱水效率较低。该对[NaCl]和酶溶解度的依赖性可在非还原糖，诸如海藻糖的存在下减轻，尤其是对于重组酶B。
成簇混合物成簇混合物制剂包含显著的小分子组分(盐和底物)，以降低低于制造可行的制剂的Tg'。另外的赋形剂筛选以增加成簇混合物的Tg'包括海藻糖、蔗糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、麦芽糖糊精和甘露醇。发现如图29所示，在测试的混合物中，包含甘露醇的制剂示出较低的聚集百分比。
对微球的分析和功能测试-机械稳定性通过使用Micropress监测模量或韧性(直到第一次破裂(即失效)的杨氏模量的积分)和断裂应力(失效时的最大应力)来确定冻干材料的机械稳定性。Micropress(Biopharma)使用线性致动器轻轻压缩冻干材料，同时负荷传感器精确地测量所施加的力。
如图29和图30所示，赋形剂含量的增加导致微球中更高的韧性模量和断裂应力。
如与微球相比，冻干饼具有更大的韧性模量(图30和图32)。类似地，如与微球相比，冻干饼表现出更大的断裂应力(图31和图33)。
静电荷由于微球的性质，静电荷可能是由限制在小体积内的过量正电荷或负电荷的存在产生的。因此，了解微球生成的静电荷的范围是很重要的。
SMC IZH10是非接触式静电计，其测量物体的电荷。图34和图35分别示出了10％海藻糖和20％海藻糖试剂微球的经测量的静电荷的变化。为了诱导电荷的变化，以100rpm将装有微球的玻璃小瓶滚动15分钟。在这两种情况下，由于玻璃上微球的摩擦，静电荷增加。还有趣地注意到，试剂的存在以及存在于其储存介质中的组分导致微球在其天然状态下的电荷低得多。
再水合开发了内部系统来比较微球和冻干饼的再水合效率。
从小瓶底部再水合导致大量微球体漂浮在再水合溶液上。此外，由于吸管与微球接触，来自微球的静电荷导致其被吸管吸引。尽管这些观察结果可通过在微球上分配再水合缓冲剂并在配方中设置等待时间来缓解。
测序在MiniseqTM上对微球和冻干饼进行测序，并在37℃下每天R1预定相的增加如图36所示。从图36示出，如与冻干饼相比，微球具有R1预定相的最低的增加。
实施例11-将测序试剂冻干成小珠，作为本体格式。
将冻干引入产物中将集中于以饼格式的冻干。冻干试剂，诸如ffN、聚合酶和Ras6T的稳定性示出以饼格式相比于以液体格式更优越。
虽然当前大多数实验都在研究微调以冻干饼格式的试剂的稳定性，但也有正在进行的努力来冻干以小珠格式的试剂。
在该实施例中，公开了冻干的替代格式，小珠形式，以进一步稳定来自现有冻干饼的试剂。以小珠格式成功冻干的SBS试剂是来自ExAmp的ffN溶液、聚合酶和Ras6T。文库制备试剂也冻干成小珠，并已经示出与对照相当的结果。还设计了内部振动应力测试来评估小珠的机械稳定性。
小珠冻干过程为了以小珠格式冻干，首先必须将试剂滴入液氮池中(形成液滴)。这允许液滴冷冻成球。一旦液滴被冷冻，其就被转移到玻璃小瓶中，并放置于冷冻干燥器中。
探索了将试剂滴入液氮中的四种不同方法—手动移液、蠕动泵、滴管和自动移液器。蠕动泵和自动移液器导致最一致的小珠大小。选择自动移液器来产生液滴，因为其允许灵活地操纵小珠的体积。
使用自动移液器探索不同体积的冻干小珠。35uL及以上的较大小珠体积已导致小珠的破裂和破碎。因此，为了最大化试剂的体积，同时最小化小珠的数量，选择25uL小珠体积为最佳大小。
实施例12-ffN溶液的小珠冻干。
首先使用1X ffN溶液进行ffN溶液的小珠冻干，其中制剂相对于掺入混合物中存在的ffN比例进行制备。然后将赋形剂添加到制剂中。赋形剂选择基于冻干ffN饼上海藻糖和蔗糖的早期赋形剂筛选。
50％海藻糖和20％海藻糖和20％蔗糖的组合导致低3'OH形成。
10％海藻糖是用于冻干ffN小珠的当前最佳赋形剂。
除了在1X ffN溶液中冻干之外，还探索了在更高浓度的ffN，10X ffN溶液中冻干ffN小珠。如图37所示，10X小珠形状均匀，并且就外观的方面而言与1X ffN小珠没有区别。小珠的残留水分很低(<0.2％)，表示冷冻干燥过程是成功的。
展示了10X ffN冻干小珠在37℃下长达7天的稳定性，其中在37℃下分级7天的10XffN冻干小珠的％R1预定相在液体对照的2个标准偏差内。
比较冻干饼和ffN溶液小珠对于相同的冻干周期，冻干ffN饼的残留水分高于冻干ffN小珠(图38)。
还进行测序以比较冻干ffN饼与小珠之间的测序度量。ffN饼和小珠的冻干在两个冻干周期中进行，并且两个周期的结果示出，与ffN小珠相比，ffN饼表现出更高的预定相度量。
实施例13-聚合酶的小珠冻干
聚合酶冻干在不存在甘油的情况下进行。为聚合酶(例如Pol 812)冻干选择的赋形剂是基于在冻干Pol 812饼上的海藻糖和蔗糖的早期赋形剂筛选。含有30％海藻糖的冻干Pol 812在分级后表现出最高的FRET活性。
探索了较低浓度的海藻糖，并用2％、3％和5％的海藻糖以7.5mg/mL冻干Pol 812。尽管在37℃下分级后残留水分增加，但大多数所有测序度量仍在液体对照的2个标准偏差范围内。
进行了概念验证研究，其中在新加坡制备了冻干10X ffN小珠和Pol812小珠，并在环境运输到英国用于NextSeqTM测序。样品到达英国总共花了4天时间。
环境运输的冻干小珠的NextSeqTM测序是成功的，并且关键测序度量，诸如定相、预定相和Q30都与冷冻对照相当。
实施例14-无PEG的ExAmp的小珠冻干。
进行无PEG的ExAmp，例如Ras6T，饼冻干。对Ras6T进行了赋形剂筛选，并且200mM海藻糖+120mM甘露醇和300mM海藻糖+120mM甘露醇是前两种赋形剂。用这些赋形剂进行小珠冻干。如图40所示，Ras6T的小珠冻干是成功的，具有低残留水分。
比较Ras6T的冻干饼和小珠冻干Ras6T饼的残留水分略高于冻干小珠的残留水分(饼：0.3％-0.6％对小珠：0.17％-0.23％)。对于Ras6T，冻干饼与小珠之间的测序不存在显著差异。在图41和图42中发现了冻干Ras6T饼与小珠之间的测序度量比较。
总之，对于Ras6T，冻干饼与小珠之间不存在显著差异。饼和小珠都能够在37℃下承受分级长达26天。
实施例15-文库制备试剂的小珠冻干。
将文库制备试剂冻干成小珠。以下是冻干文库制备试剂的缓冲剂：(1)含有SSB但不含甘油的第一试剂；(2)含有SSB但不含甘油的第二试剂；(3)含有BB6标签片段化缓冲剂的第一试剂；或(4)含有BB6标签片段化缓冲剂的第二试剂。对以下赋形剂进行了赋形剂筛选：(1)3％海藻糖；(2)10％海藻糖；(3)1％葡聚糖40；或(4)0.375％甘氨酸。
含有10％海藻糖的样品导致小珠的形成，而含有其他赋形剂的样品不形成任何小珠。运输含有10％海藻糖和不同缓冲剂的第一试剂和第二试剂的冻干小珠，以测定其活性。
含10％海藻糖的样品残留水分在1％至2％的范围内。虽然其不在冻干小珠的残留水分的预期范围内，但即使在37℃下分级后，其仍示出与对照相当的活性。这示出第一试剂和第二试剂在冻干后均保留了活性，并且其随时间推移稳定活性。
为了进一步提高小珠的美观性和机械刚性，当冻干这些文库制备试剂时提出更高的海藻糖含量。添加海藻糖至多80％时，第一试剂和第二试剂均被测定为稳定的。
实施例16-冻干小珠的机械刚性。
为了评估冻干小珠的机械刚性，开发了内部振动应力测试。将样品置于速度调节至900rpm的涡旋混合器上。将测试样品涡旋10秒钟和脱落程度。另选地，可运行对照，并将样品与其进行比较。
用于测定冻干小珠的机械稳定性的赋形剂筛选探索了几种赋形剂以测定冻干小珠的机械稳定性。(以各种浓度)实验了以下赋形剂：
·Ficoll 400 ·Ficoll 400+海藻糖
·Ficoll 400+Ficoll 70 ·Ficoll 400+Ficoll 70+海藻糖
·葡聚糖40 ·葡聚糖40+海藻糖
·PEG 4K ·PEG 4K+海藻糖
·松三糖 ·松三糖+海藻糖
·麦芽糖糊精4-7 ·麦芽糖糊精4-7+海藻糖
·麦芽糖糊精13-17 ·麦芽糖糊精13-17+海藻糖
虽然本文可能已经详细描绘和描述了优选的具体实施，但是对于相关领域的技术人员将显而易见的是，在不脱离本发明的实质的情况下可以做出各种修改、添加、替换等，因此这些修改、添加、替换等被认为是在如以下权利要求书中所限定的本发明的范围内。
Claims (49)
1.一种组合物，所述组合物包含：
一种或多种经修饰的核苷酸，其中所述经修饰的核苷酸包含嘌呤或嘧啶碱基和具有3'-羟基封端基团的糖部分，以及
自由基清除剂，其中所述组合物是冻干的。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述自由基清除剂是酚抗氧化剂。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述自由基清除剂包含没食子酸GA、没食子酸羟乙酯HEG、原儿茶酸PCA、儿茶素或它们的组合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：
一种或多种非还原糖。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精、或葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。
6.根据权利要求4或权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含至少约5重量％的非还原糖。
7.根据权利要求4或权利要求5所述的组合物，其中所述组合物包含约5重量％或更少的非还原糖。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：
聚合酶。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：
功能性蛋白质活化剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述功能性蛋白质活化剂是镁、镁盐或其他镁衍生物或它们的组合。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述3'-羟基封端基团是可逆的封端基团。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的核苷酸与可检测标记连接。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述可检测标记包含荧光团。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的组合物，其中所述经修饰的核苷酸通过可裂解的连接基与可检测标记连接。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述组合物是微球、饼或它们的组合。
16.根据权利要求15所述的组合物，其中所述组合物具有约0.1mm至约25mm的横截面。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的组合物，其中当所述组合物是微球时，所述微球为球形、椭圆形或环形。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于约1重量％的甘油。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约5重量％或更少的拥挤剂。
20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述拥挤剂包含聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、麦芽糖糊精、聚蔗糖、聚丙烯酰胺或它们的组合。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的组合物，其中含水量低于约10重量％。
22.一种再水合的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求1至21中任一项所述的组合物；以及
在有效地使所述组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。
24.根据权利要求22或权利要求23所述的方法，所述方法还包括：
在边合成边测序过程中使用所述经再水合的组合物。
25.根据权利要求22至24中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述经再水合的组合物暴露于测序引物，其中所述测序引物中所述一种或多种经修饰的核苷酸的掺入产生延伸的测序引物。
26.根据权利要求22至25中任一项所述的方法，所述方法还包括：
将所述经再水合的组合物施用于包含核苷酸簇的固体载体，其中所述核苷酸簇包含靶多核苷酸。
27.一种组合物，所述组合物包含：
一种或多种功能性蛋白质；
一种或多种功能性蛋白质活化剂；以及
一种或多种非还原糖，其中所述组合物是冻干的。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述功能性蛋白质包含聚合酶、重组酶、DNA结合蛋白质或它们的组合。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的组合物，其中所述功能性蛋白质活化剂是镁、镁盐或其他镁衍生物或它们的组合。
30.根据权利要求27至29中任一项所述的组合物，其中所述一种或多种非还原糖是海藻糖、蔗糖、肌醇、麦芽糖糊精、或葡聚糖、甘露糖醇、棉子糖、环糊精、松三糖、山梨醇或它们的组合。
31.根据权利要求27至30中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含至少约5重量％的非还原糖。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约5重量％或更少的非还原糖。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物是微球、饼或它们的组合。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述组合物具有约0.1mm至约25mm的横截面。
35.根据权利要求33或权利要求34中任一项所述的组合物，其中当所述组合物是微球时，所述微球为球形、椭圆形或环形。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含小于约1重量％的甘油。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含约5重量％或更少的拥挤剂。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述拥挤剂包含聚乙二醇PEG、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、麦芽糖糊精、聚蔗糖、聚丙烯酰胺或它们的组合。
39.根据权利要求27至38中任一项所述的组合物，所述组合物还包含：
一种或多种重组酶装载蛋白质、核苷酸三磷酸(dNPT)、ATP、ATP类似物、缓冲剂、还原剂、肌酸激酶或它们的组合。
40.根据权利要求28所述的组合物，其中所述聚合酶是DNA聚合酶。
41.根据权利要求28所述的组合物，其中所述DNA结合蛋白质是单链DNA结合蛋白质。
42.根据权利要求27至41中任一项所述的组合物，其中所述含水量低于约10重量％。
43.一种再水合的方法，所述方法包括：
提供根据权利要求27至42中任一项所述的组合物；以及
在有效地使所述组合物再水合的条件下将所述组合物与再水合溶液混合。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述再水合溶液是水、乙醇胺或它们的组合。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，所述方法还包括：
在排他性扩增过程中使用所述经再水合的组合物。
46.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
根据权利要求1至21中任一项所述的组合物，以及
根据权利要求27至42中任一项所述的组合物。
47.一种料筒，所述料筒包括：
流通池，所述流通池包括：
试剂贮存器，其中所述试剂贮存器包括根据权利要求1至21中任一项所述的组合物。
48.一种料筒，所述料筒包括：
流通池，所述流通池包括：
试剂贮存器，其中所述试剂贮存器包括根据权利要求27至42中任一项所述的组合物。
49.一种料筒，所述料筒包括：
流通池，所述流通池包括：
第一试剂贮存器，其中所述第一试剂贮存器包括根据权利要求1至21中任一项所述的组合物；以及
第二试剂贮存器，其中所述第二试剂贮存器包括根据权利要求27至42中任一项所述的组合物。
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