JP2016182127A - 統合された試料調製システムおよび安定化酵素混合物 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料を処理し、配列決定法または他の適切な核酸分析法における使用に適するDNAライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。
【解決手段】a)生物学的試料の導入のために構成された、添加ポート;b)前記添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキット;c)前記溶解サブサーキットに作動可能に連結した核酸抽出サブサーキットであって、抽出核酸の混合物を生成する、核酸抽出サブサーキット;e)前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物、および/または断片化構成要素を含む、断片化サブサーキット;並びにf)前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットであって、核酸リンカー、および連結酵素混合物を含む、リンカー連結サブサーキット;を含む、マイクロフリューディックカード。
【選択図】なし
【解決手段】a)生物学的試料の導入のために構成された、添加ポート;b)前記添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキット;c)前記溶解サブサーキットに作動可能に連結した核酸抽出サブサーキットであって、抽出核酸の混合物を生成する、核酸抽出サブサーキット;e)前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物、および/または断片化構成要素を含む、断片化サブサーキット;並びにf)前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットであって、核酸リンカー、および連結酵素混合物を含む、リンカー連結サブサーキット;を含む、マイクロフリューディックカード。
【選択図】なし
Description
本出願は、それぞれの全体を全体として参照により本明細書に組み込む、2011年5月6日に出願した(本出願と同時出願した)米国特許出願第13/102,520号および2010年5月6日に出願した米国仮出願第61/331,910号の優先権を主張するものである。
本発明は、契約番号HDTRA−1−07−C−0096の下で合衆国政府の支援と共になされた。合衆国政府は、本発明の一定の権利を有する。
本発明は、統合された試料調製および配列決定システムおよび安定化酵素混合物に関する。詳細には本発明は、試料を処理し、配列決定法(例えば次世代配列決定法)または他の適切な核酸分析法における使用のために適するDNAライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供し、これらのカードからの出力はDNA配列決定システムと統合されることができ、自動化および統合された試料を配列決定システムに提供する。本発明は、酵素(例えば全ゲノム増幅において使用される酵素)、BSAおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されてよく、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
DNAの配列分析は、配列決定ライブラリーの調製における使用のために多量の抽出されたDNAを必要とする。細胞培養するステップ、細胞を溶解するステップ、DNAを抽出するステップ、DNAを断片化するステップ、リンカーを連結するステップおよび配列決定用鋳型の精製の工程は、当業者によって実施されるのに数日間を要しうる多ステップ工程である。配列に基づく検出の問題は、Roche454などの既存の全ゲノム配列決定システムが試料調製のために数日および配列決定のために数日を必要とすることである。図1は、Roche454法などの次世代配列決定技術のための試料調製に関与する現在の冗長な工程を表す流れ図を示している。この図に示すとおり、それは試料前処理;細胞溶解、核酸抽出および全ゲノム増幅(WGA)に1日かかる場合がある。次いでそれは、次のステップ:DNA断片化;DNA末端修復;アダプター連結;断片固定化;ニック修復;1本鎖DNA単離;およびエマルジョンPCR滴定を含むDNAライブラリーの生成のために1から5日間かかる場合がある。最後にそれは、配列決定のための試料調製ならびに次のステップ:バルクエマルジョンPCR;切断エマルジョンPCR;PCR陽性ビーズ精製;配列決定用ビーズ調製;および配列決定反応の実施を使用する配列決定それ自体に1から4日間かかる場合がある。
必要とされるのは、実施するのがより迅速であり、より容易であるDNA配列決定ライブラリー調製のための方法およびシークエンサーを伴うこれらの方法の統合である。
(発明の要旨)
本発明は、統合された試料調製/核酸配列決定システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理し、配列決定法(例えば次世代配列決定法)または他の適切な核酸分析法における使用に適するDNAライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素(例えば全ゲノム増幅において使用される酵素)、BSAおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されてよく、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
本発明は、統合された試料調製/核酸配列決定システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理し、配列決定法(例えば次世代配列決定法)または他の適切な核酸分析法における使用に適するDNAライブラリーを生成するように構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素(例えば全ゲノム増幅において使用される酵素)、BSAおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されてよく、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
特定の実施形態において本発明は、a)生物学的試料の導入のために構成された添加ポート;b)i)核酸(例えば増幅核酸)を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および/またはii)核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む断片化サブサーキット、ならびにc)i)配列決定法または他の方法における使用のために構成された核酸リンカー、およびii)前記核酸リンカーを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキット;を含有するマイクロフリューディックカードを提供する。
特定の実施形態において本発明は、a)生物学的試料の導入のために構成された添加ポート;b)細胞溶解サブサーキット;c)核酸抽出サブサーキット;d)i)PCRなどの標的配列特異的増幅またはii)多置換増幅による全ゲノム増幅などの全核酸増幅サブサーキット、を含む核酸増幅サブサーキット;e)i)核酸(例えば増幅核酸)を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および/またはii)核酸を物理的に断片化して断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む、断片化サブサーキット;f)断片化核酸の末端加工;g)i)配列決定法または他の方法における使用のために構成された核酸リンカー、およびii)前記核酸リンカーを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキット;h)i)例えばエキソヌクレアーゼを使用して酵素的に、ならびにまたはii)結合および溶出抽出によって、またはiii)ビオチン標識された連結産物などの親和性タグを使用する親和性単離によって実施されうる、連結していないまたは部分的に連結した核酸の除去のための方法;i)酵素的または結合溶出または親和性またはサイズ排除などによる最終的ライブラリー精製;j)配列決定システムとの統合を含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
詳細な実施形態において、マイクロフリューディックカードは、次の群1)i)混合チャンバーおよびii)(例えば密封容器中の)溶解緩衝液を含む、(例えば前記添加ポートに作動可能に連結した)溶解サブサーキット;2)i)溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、ii)(例えば密封容器中の)洗浄緩衝液、iii)(例えば密封容器中の)溶出緩衝液およびiv)(例えば抽出核酸の混合物を生成するために核酸抽出構成要素に溶出緩衝液をポンピングするように構成された)ポンプ構成要素を含む(例えば前記溶解サブサーキットおよび廃棄物チャンバーの両方に作動可能に連結した)核酸抽出サブサーキット;3)抽出核酸について増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも1つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む(例えば核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した)増幅サブサーキット;ならびに4)廃棄物チャンバー、から選択される少なくとも1つの追加的サブサーキットをさらに含む。
特定の実施形態において本発明はa)生物学的試料の導入のために構成された添加ポート、b)核酸について全ゲノム増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも1つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む(例えば核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した)増幅サブサーキットを含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
いくつかの実施形態において本発明は、a)生物学的試料の導入のために構成された添加ポート;b)廃棄物チャンバー;c)i)混合チャンバーおよびii)溶解緩衝液を含む第1密封容器を含み、混合チャンバー中において溶解緩衝液で生物学的試料を溶解して、溶解試料を生成するように構成された、添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキット;d)i)溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、ii)洗浄緩衝液を含む第2密封容器、iii)溶出緩衝液を含む第3密封容器およびiv)核酸抽出構成要素に溶出緩衝液をポンピングして、抽出核酸の混合物を生成するように構成されたポンプ構成要素を含む、細胞溶解サブサーキットおよび廃棄物チャンバーの両方に作動可能に連結した核酸抽出サブサーキット;e)抽出核酸において増幅を実施して、増幅核酸を生成するのに有用である少なくとも1種類の増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物を含む、核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキット;f)i)増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物および/またはii)増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素を含む、増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキット;ならびにg)i)配列決定法における使用のために構成された核酸リンカー(アダプター)、およびii)核酸リンカーを断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物を含む、断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットを含む、マイクロフリューディックカードを提供する。
特定の実施形態において、少なくとも1つの増幅関連酵素は、全ゲノム増幅(WGA)(例えば多置換増幅)を実施するのに有用なまたはPCRを実施するのに有用なまたは転写増幅法(TMA)を実施するのに有用な酵素を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも1つの増幅関連酵素は、Phi−29ポリメラーゼ、E.コリ(E.coli)DNAポリメラーゼI、無機ピロホスファターゼまたはこれらの任意の組合せからなる群から選択される。特定の実施形態において増幅関連酵素は、本明細書に記載の次世代配列決定法などの次世代配列決定において使用されるリンカー(アダプター)と組み合わされる。詳細な実施形態において任意の増幅ステップ(例えばPCR)のために使用されるプライマーは、(例えば増幅産物を固体支持体に繋ぎ止めるために)次世代配列決定法において有用であるリンカーを含む。
詳細な実施形態において安定化酵素混合物は、i)BSA、ii)糖ならびにiii)無機塩、二価金属カチオン、緩衝剤、乳化剤および還元剤からなる群から選択される少なくとも1つの追加的構成要素をさらに含む。他の実施形態において安定化酵素混合物は、i)BSA、ii)糖、iii)無機塩、iv)二価金属カチオン、v)緩衝剤、vi)乳化剤およびvii)還元剤、をさらに含む。
いくつかの実施形態においてマイクロフリューディックカードは、h)核酸配列決定ライブラリー上のリンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含み、リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット、をさらに含む。他の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む。特定の実施形態において断片化サブサーキットは、断片化核酸の末端をポリッシングするように構成された少なくとも1種類の酵素をさらに含む。詳細な実施形態においてリンカー連結サブサーキットは、核酸配列決定ライブラリーの末端をポリッシングするように構成された少なくとも1種類の酵素をさらに含む。他の実施形態において安定化酵素混合物は、乾燥形態で存在する。いくつかの実施形態において試薬混合物は乾燥形態で存在する。
さらなる実施形態においてポンプ構成要素は、ベローズを含む。他の実施形態において核酸抽出構成要素は、膜を含む。追加的実施形態において核酸抽出構成要素はフィルターを含む。詳細な実施形態においてマイクロフリューディックカードは、複数の弁を含む。追加的実施形態においてカードは、処理機器に作動可能に連結するように、プロセッサーによって操作されるように構成される。他の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、処理機器上のニューマチックインターフェースに作動可能に連結するように構成された複数の空気ポートをさらに含む。いくつかの実施形態において核酸リンカーは、ABI SOLID、ILLUMINA SOLEXA、ROCHE454、ION TORRENT、Lifetechnologies STARLITEおよびPACIFIC BIOSCIENCES SMART配列決定からなる群から選択される配列決定法における使用のために構成される。追加的実施形態においてマイクロフリューディックカードは、抽出核酸混合物が増幅を必要とするか否かを測定するように構成された感知器をさらに含む。
本発明の試料調製システムは、(例えばまたは再利用可能なカードまたは使い捨てカードとして)任意の種類の配列決定システムと統合されうる。特定の実施形態において本発明の試料調製システムは、HiSeq2000、Hiseq1000、HiScanSQ、Genome Analyzer IIx、MiSeqを含むILLIMINA SOLEXAシークエンサーと統合され、PIPELINEおよび/またはCASAVAソフトウエアパッケージなどの関連するIlluminaソフトウエアと共に作動するように構成されうる。他の実施形態において本発明の試料調製システムは、Genome Sequencer FLX SystemおよびGS Junior Systemを含むROCHE454シークエンサーと統合され、関連するGS Run Browser Software、GS De Novo Assembler Software、GS Reference Mapper Software、GS Amplicon Variant Analyzer SoftwareおよびGS FLX Titanium Clusterと共に作動するように構成されうる。いくつかの実施形態において本発明の試料調製システムは、Ion Personal Genome Machine(PGM)シークエンサーを含むION TORRENTシークエンサーと統合され、関連するDNASTAR(登録商標)SeqMan(登録商標)NGen(登録商標)Software、Partek(登録商標)Genomics Suite(商標)Software、SoftGeneticsによるIon PGMプラットフォームのためのNextGENe(登録商標)ソフトウエアまたはAvadis NGS Softwareと共に作動するように構成されうる。追加的実施形態において本発明の試料調製システムは、PacBio RSシークエンサーを含むPACIFIC BIOSCIENCESシークエンサーと統合され、関連するRSリモートソフトウエア、RSタッチソフトウエア、Primary Analysisソフトウエア、SMRT PortalソフトウエアおよびSMRT Viewソフトウエアと共に作動するように構成されうる。
いくつかの実施形態において本発明は、本明細書に記載のマイクロフリューディックカード;およびb)マイクロフリューディックカードを受け入れ、操作するように構成された処理機器を含むシステムを提供する。特定の実施形態において処理機器は、蓄圧器、真空溜め、少なくとも1つのポンプ、複数の弁、少なくとも1つの加熱器、ニューマチックインターフェースおよび入力−出力コンピューター接続部から選択される少なくとも1つの構成要素を含む。追加的実施形態において処理機器は、蓄圧器、真空溜め、少なくとも1つのポンプ、複数の弁、少なくとも1つの加熱器、ニューマチックインターフェースおよび入力−出力コンピューター接続部を含む。
いくつかの実施形態において本発明は、a)少なくとも1種類の酵素;b)ウシ血清アルブミン(BSA);c)糖;およびd)緩衝剤ならびに場合によって水を含むまたは本質的にこれらからなるまたはこれらからなる安定化酵素混合物を提供する。特定の実施形態において安定化酵素混合物は、無機塩、二価金属カチオン、乳化剤および還元剤からなる群から選択される少なくとも1つの試薬を、さらに含む、また本質的にこれらからなるまたはこれらからなる。
詳細な実施形態において本発明は、a)少なくとも1種類の酵素;b)ウシ血清アルブミン(BSA);c)糖;d)無機塩;e)二価金属カチオン;f)緩衝剤;g)乳化剤およびh)還元剤を、含むまたは本質的にこれらからなるまたはこれらからなる安定化酵素混合物を提供する。
特定の実施形態において混合物は、ポリエチレングリコール(PEG)(例えばPEG−8000または他の重量)をさらに含む。さらなる実施形態において安定化酵素混合物は、水溶液形態または凍結乾燥形態にある。他の実施形態において安定化酵素混合物は、摂氏20−40度で2カ月間保存後に摂氏20−25度での水和において酵素にその活性の少なくとも70%(例えば70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%)を保持させることができる。
さらなる実施形態においてBSAは、安定化酵素混合物中で0.05%−3.0%の濃度で存在する(例えば0.05%、0.10%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%)。さらなる実施形態において糖は、安定化酵素混合物中で5−35%の濃度で存在する(例えば5%、15%、25%、35%)。他の実施形態において糖は、非還元糖である。さらなる実施形態において糖は、二糖である。追加的実施形態において糖は、トレハロースである。
いくつかの実施形態において少なくとも1種類の酵素は、中温性酵素、熱不安定性酵素または好熱性酵素を含む。追加的実施形態において少なくとも1種類の酵素は、ポリメラーゼを含む。詳細な実施形態においてポリメラーゼは、Phi−29ポリメラーゼである。さらなる実施形態においてポリメラーゼは、E.コリポリメラーゼIである。追加的実施形態において少なくとも1種類の酵素は、無機ピロホスファターゼを含む。特定の実施形態において無機ピロホスファターゼは、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)無機ピロホスファターゼである。追加的実施形態において少なくとも1種類の酵素は、Phi−29ポリメラーゼ、E.コリDNaポリメラーゼIおよびS.セレビシエ無機ピロホスファターゼを含む。
特定の実施形態において無機塩は、安定化酵素混合物中で1mM−25mMの濃度で存在する(例えば1mM、10mM、17mM、25mM)。さらなる実施形態において無機塩は(NH4)2SO4である。特定の実施形態において二価金属カチオンは、安定化酵素混合物中で1mM−30mMの濃度で存在する(例えば1mM、10mM、20mMまたは30mM)。詳細な実施形態において二価金属カチオンは、MgCl2である。さらなる実施形態において緩衝剤は、10mM−100mMの濃度で存在する(例えば10mM、35mM、75mM、100mM)。いくつかの実施形態において緩衝剤は、Trisである。
詳細な実施形態において乳化剤は、安定化酵素混合物中で0.01%−0.15%の濃度で存在する(例えば0.01%、0.1%、0.15%)。いくつかの実施形態において乳化剤は、Tween40、Tween20またはTween80である。追加的実施形態において還元剤は、1mM−10mMの濃度で存在する(例えば1mM、5mM、10mM)。特定の実施形態において還元剤は、ジチオスレイトール(DTT)である。
いくつかの実施形態において本発明は、a)ウシ血清アルブミン(BSA);b)糖;c)無機塩;ならびに場合によって1)二価金属カチオン;2)緩衝剤;3)乳化剤;4)還元剤;および5)水を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる、酵素を安定化させるための組成物を提供する。
さらなる実施形態において本発明は、E.コリポリメラーゼIおよびウシ血清アルブミン(BSA)を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなり、凍結乾燥組成物である組成物を提供する。詳細な実施形態において凍結乾燥組成物は、摂氏20−40度での少なくとも1カ月間、2カ月間または3カ月間保存後の摂氏20−25度での水和においてE.コリポリメラーゼIにその活性の少なくとも70%(例えば70%、90%、100%)を保持させることができる。
特定の実施形態において本発明は、無機ホスファターゼおよびウシ血清アルブミン(BSA)を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなり、凍結乾燥組成物である組成物を提供する。いくつかの実施形態において凍結乾燥組成物は、摂氏20−40度での2カ月間の保存後の摂氏20−25度での水和において無機ホスファターゼにその活性の少なくとも70%(例えば70%、90%、100%)を保持させることができる。
さらなる実施形態において本発明は、a)i)少なくとも1種類の酵素;ii)ウシ血清アルブミン(BSA);iii)糖;iv)無機塩;v)二価金属カチオン;vi)緩衝剤;vii)乳化剤;およびviii)還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる凍結乾燥組成物を提供するステップ、ならびにb)摂氏20−25度での水和において少なくとも1つの酵素がその活性の少なくとも70%を保持するように摂氏15−45度の保存温度で少なくとも15日間凍結乾燥組成物を保存するステップを含む、凍結乾燥組成物の保存方法を提供する。さらなる実施形態において少なくとも15日間は、少なくとも30日間(少なくとも30日間、60日間、90日間、120日間またはより長く)である。特定の実施形態において保存温度は、摂氏20−25度である。いくつかの実施形態において少なくとも1つの酵素は、E.コリポリメラーゼI、Phi−29ポリメラーゼおよび無機ピロホスファターゼから選択される。
特定の実施形態において本発明は、a)i)A)少なくとも1種類の酵素;B)ウシ血清アルブミン(BSA);C)糖;D)無機塩;E)二価金属カチオン;F)緩衝剤;G)乳化剤;およびH)還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる水溶性組成物;ならびにii)透析膜;を提供するステップ;ならびにb)i)糖;ii)無機塩;iii)二価金属カチオン;iv)緩衝剤;v)乳化剤;およびvii)還元剤を含む、本質的にこれらからなるまたはこれらからなる水溶液中に透析膜で水溶性組成物を透析するステップ、c)凍結組成物を生成するために水溶性組成物を凍結させるステップ;ならびにd)凍結乾燥組成物が生成されるように昇華を介して水を除去するために凍結組成物を高真空に供するステップを含む、安定化酵素組成物を生成する方法を提供する。
(定義)
本明細書において使用される用語「マイクロフリューディックカード」は、選択された内部チャネル、空所または少なくとも1つの寸法がおよそ0.1から500ミクロンである他のマイクロ構造を有するデバイス、カートリッジまたは「カード」を意味する。マイクロフリューディックデバイスは、レーザー謄写、型押し、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチングおよび3次元ソフトリソグラフィーなどの技術を使用して種々の材料から作製されうる。積層マイクロフリューディックデバイスは、粘着性中間層または、方向性ポリプロピレンの圧力処置によってなどの熱性非粘着性結合技術でさらに作製される。積層化された成形マイクロフリューディックデバイスの微小構造は、異なっている場合がある。特定の実施形態において本発明のマイクロフリューディックカードは、制御インターフェースならびに場合による温度および磁気的インターフェースを提供するホスト機器と相互作用するまたは「ドッキングされる」ように設計される。しかしカードは、一般にアッセイを実施するために必要な全ての生物学的試薬を含有しており、1つ以上の試料の添加だけを必要とする。これらのカードは一般に使い捨て、1回限りの使用で使用中および廃棄において生物学的有害物質への暴露の危険を最小化するために、一般に衛生的機能を有して製造される。
本明細書において使用される用語「マイクロフリューディックカード」は、選択された内部チャネル、空所または少なくとも1つの寸法がおよそ0.1から500ミクロンである他のマイクロ構造を有するデバイス、カートリッジまたは「カード」を意味する。マイクロフリューディックデバイスは、レーザー謄写、型押し、スタンピング、射出成形、マスキング、エッチングおよび3次元ソフトリソグラフィーなどの技術を使用して種々の材料から作製されうる。積層マイクロフリューディックデバイスは、粘着性中間層または、方向性ポリプロピレンの圧力処置によってなどの熱性非粘着性結合技術でさらに作製される。積層化された成形マイクロフリューディックデバイスの微小構造は、異なっている場合がある。特定の実施形態において本発明のマイクロフリューディックカードは、制御インターフェースならびに場合による温度および磁気的インターフェースを提供するホスト機器と相互作用するまたは「ドッキングされる」ように設計される。しかしカードは、一般にアッセイを実施するために必要な全ての生物学的試薬を含有しており、1つ以上の試料の添加だけを必要とする。これらのカードは一般に使い捨て、1回限りの使用で使用中および廃棄において生物学的有害物質への暴露の危険を最小化するために、一般に衛生的機能を有して製造される。
用語「全ゲノム増幅」または「WGA」は、本明細書において一般に、元の試料から識別不能だが高いDNA濃度を有する新たな試料を生成するために(標的WGAが使用される場合を除いて)非特異的なやり方で限られた試料の増幅のための方法を意味する。理想的な全ゲノム増幅技術は、元の配列表現を維持する一方で、試料をマイクログラム程度に至るまで増幅する。試料のDNAは、ゲノム全体またはこの一部分を含む場合がある。縮重オリゴヌクレオチドプライムPCR(DOP)、プライマー伸長PCR技術(PEP)および多置換増幅(MDA)は、全ゲノム増幅法の例である。
用語「多置換増幅」は本明細書において、DNAを変性させるためのランダムヘキサマー(または標的法においては非ランダムプライマー)のアニーリングに続く一定温度での鎖置換合成に基づく、PCRに基づかない等温性の方法を意味する。これは小さなゲノムのDNA試料に適用されていて、限定的な配列表現偏向を有する高分子量DNAの合成を導いている。DNAが鎖置換によって合成されることから、生じるプライミング事象の数が徐々に増加し、高分岐DNA構造のネットワークが形成される。反応は、例えばPhi−29DNAポリメラーゼによってまたはBstDNAポリメラーゼの大断片によって触媒されうる。
詳細な記載
本発明は、統合試料調製システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理するステップおよび配列決定法(例えば次世代配列決定法)または他の適切な核酸分析法における使用に適しているDNAライブラリーを生成するステップのために構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素(例えば全ゲノム増幅において使用される酵素)、BSAおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されることができ、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
本発明は、統合試料調製システムおよび安定化酵素混合物を提供する。詳細には本発明は、試料を処理するステップおよび配列決定法(例えば次世代配列決定法)または他の適切な核酸分析法における使用に適しているDNAライブラリーを生成するステップのために構成されたマイクロフリューディックカードを提供する。本発明は、酵素(例えば全ゲノム増幅において使用される酵素)、BSAおよび糖を含有する安定化酵素混合物も提供する。そのような酵素混合物は、凍結乾燥されることができ、酵素活性の顕著な減少を伴うことなく数カ月間室温で保存されうる。
I.マイクロフリューディックカードおよび機器
本発明は、いくつかの分子生物学的工程/ステップの、マイクロフリューディックカードを使用する単一の統合されたシステムへの統合を提供する。次いで統合された方法は、例えば(臨床的、生物学的、環境的)試料の採取および細胞の溶解、核酸の抽出、抽出核酸の増幅(例えば全ゲノム増幅)、増幅核酸の断片化、DNA断片末端の加工、リンカーの連結および処理された核酸(例えば配列決定に適するDNA配列決定ライブラリー)の精製のために使用されうる。統合された工程は、処理時間、労働を劇的に低減させ、自動制御および1回限りの使用のシステム内に統合され品質管理された試薬の使用を通じて工程の一貫性を改善する。
本発明は、いくつかの分子生物学的工程/ステップの、マイクロフリューディックカードを使用する単一の統合されたシステムへの統合を提供する。次いで統合された方法は、例えば(臨床的、生物学的、環境的)試料の採取および細胞の溶解、核酸の抽出、抽出核酸の増幅(例えば全ゲノム増幅)、増幅核酸の断片化、DNA断片末端の加工、リンカーの連結および処理された核酸(例えば配列決定に適するDNA配列決定ライブラリー)の精製のために使用されうる。統合された工程は、処理時間、労働を劇的に低減させ、自動制御および1回限りの使用のシステム内に統合され品質管理された試薬の使用を通じて工程の一貫性を改善する。
工程全体が、工程を実施するために必要な全ての試薬を含む1回限りの使用のマイクロフリューディックカードに統合されうる。いくつかの実施形態において工程の廃棄物もカード中に含まれる。試薬は安定化されることができ、それによりカードは室温で長期間保存されうる。カードは、一般に得られた処理物が取り出され、サンガー配列決定、ABI SOLID、Illumina Solexa、Roche454、Ion Torrent、ABI Starlite、PacBio SMRTおよび他の核酸分析技術などの種々のDNA配列決定技術で使用されうるための出口ポートを含む。
特定の実施形態において、Micronics Inc.によって製造され、彼らの特許公報に記載されたマイクロフリューディックカードは、本発明の一部として使用される。Micronics’PanNAT(商標)分子診断プラットフォームは、それぞれが単一のおよび/または複数の核酸増幅アッセイを実施するように設計された別々のカートリッジの処理が可能な好都合な、電池式および/または商用電源式の機器として記載されている。各アッセイは、必要な全ての試薬を含む使い捨てカートリッジに完全に統合される。少量の生物学的試料だけがアッセイの実施のために必要とされる。特定のMicronicsカードの記載は、本明細書において全体が説明されたのと同様にその全体を参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第20090325276号において提供される。特定の実施形態において、本発明で使用されるマイクロフリューディックカードは、以下の段落において記載されるものである。
マイクロフリューディックカードは、独立したアッセイモジュールに対応する複数のサブサーキットから形成されるが、単一のデバイスにまたは2つ以上の相互接続したデバイスに合わせて統合される。さらに各サブサーキットは、好ましくはマイクロフリューディック要素または構成要素で構成されている。これらのサブサーキットの要素は、マイクロフリューディックチャネル、ティー、チャンバー、弁、フィルター、固相捕獲要素、単離フィルター、ニューマチック多岐管、ブリスター包装(例えば試薬袋と共に)、廃棄物隔離チャンバー、衛生ベント、ベローズチャンバー、ベローズポンプ、光学的窓、検査用パッドおよび脱水された試薬のマイクロチャネル保管場所を含むことができ、場合によって緩衝剤、溶解剤および不動態化剤を含む。サブサーキットは、一般にプラスチックで製造され、積層化によって、成形によっておよびリソグラフィーによってまたはこれらの技術の組合せによって製造されうる。
典型的にはカードデバイスは、1つ以上の試料を導入した後は、いかなる生物学的有害物質も廃棄用に永久にカード中に封じ込められるようにデバイスが密封されることを意味する一回導入式(single entry)である。しかし特定の実施形態においてカードは、得られたDNAライブラリーを取り出すための出口ポートを有する。典型的にはカードは、内蔵式であり、アッセイのために必要ないかなる試薬も製造者によってデバイスと共に供給される。マイクロフリューディックデバイスが場合によって分析データの処理における助力としてのRFID、マイクロチップ、バーコードおよび標示も含みうることならびにカード接続のためのホスト機器は場合によって高性能の機器であり、患者データおよび検査結果をネットワークに伝達できることは理解される。
「マイクロチャネル」とも称されるマイクロフリューディックチャネルは、種々の長さを有する流路であるが、横断面における一方向は500umより短い。マイクロフリューディックチャネルにおけるマイクロフリューディック流体挙動は、非常に非理想的、層状で末端間または横断面の圧力降下よりも、さらに壁面の湿潤特性、粗度、液体の粘性、付着性および粘着性に依存する可能性がある。マイクロフリューディック流動様式は、しばしばチャネル中の「実質的な液体壁」の存在と関連する。マイクロフリューディックチャネルは、「ティー」によって相互にまたは他の処理構成要素と液体的に連結される。弁は、マイクロフリューディックチャネル中に形成され、従来技術で使用されるように逆止め弁、ニューマチック逆止め弁、ピンチ弁、表面張力弁などであってよい。
電気的に活性化される弁も使用されうるが、カードデバイスは一般にそれを覆い、制御および液体操作に役立つニューマチック多岐管を含む。空気孔は、ニューマチック多岐管および一般に稼働ベローズポンプに連結される。弁が空気圧で始動されると、空気ポートも関係する。空気ポートは、デバイス内からの液体の漏出が望ましくないおよび安全でない場合に、疎水性単離フィルター(例えば任意の液体不透過性、気体透過性フィルター膜)と共に提供される場合がある。弁は一般にニューマチック多岐管には直接連結されず、その中の圧力を均一にするために作用する。
反応チャンバーは、マイクロフリューディックカード上に提供され、矩形チャンバー、環状チャンバー、テーパーチャンバー、蛇行チャネルおよび反応を実施するための種々の幾何図形的配置などの任意の適切な形状であってよい。これらのチャンバーは、検出チャンバーにおいてと同様に内容物の調査のための窓を有する場合がある。廃棄物隔離容器は、マイクロフリューディックカード上に一般に提供される。廃棄物容器は、場合によって衛生的疎水成膜と共に排出される。
図2は、例示的な射出成形マイクロフリューディックカードおよびカードを形成しうる種々の層を示す。図2は、細胞溶解、DNA抽出および全ゲノム増幅の3つの最初のサブサーキットも記載する。
図3は、試料入口ポート、DNA抽出サーキットおよび凍結乾燥酵素(例えば下の実施例1において記載されるものなど)を含む増幅サーキットを含む、表示された種々のサブサーキットを有する例示的マイクロフリューディックカードを示す。
図4は、マイクロフリューディックカードを利用する試料調製工程のステップ1を示す。この図は、試料入口ポートおよび混合チャンバーを詳細に示す。
図5は、溶解ステップであるステップ2を示す。ブリスター包装からの溶解緩衝液は、細胞が溶解されるように試料由来の細胞と共に混合チャンバーに流入する。
図6は、溶解混合物が、捕獲フィルター上を通過し、次いで廃棄物チャンバーに向かうステップ3を示す。ブリスター包装からの第1洗浄緩衝液は次いで廃棄物チャンバーへ向かう前にフィルターを通過する。
図7は、第2洗浄液が捕獲フィルターを通過し、次いで廃棄物チャンバーへ向かうステップ4を示す。次いでフィルターは、洗浄緩衝液を除くために空気乾燥される。
図8は、溶出ベローズを使用してブリスター包装からの溶出緩衝液がフィルターから精製核酸を取り出す、ステップ5を示す。溶出ベローズは、溶出緩衝液をフィルター上にゆっくりポンピングする。
図9は、溶解および抽出ステップを評価するために本発明の実施形態の開発において使用された、3つの参照試料(S.アルレウス;B.セレウス;およびK.ニューモニエ)を記載する。
図10は、S.アルレウス、B.セレウスおよびK.ニューモニエを使用する溶解および抽出サブサーキットの最終検証の結果を示す。示された結果は、B.セレウスおよびK.ニューモニエの10,000CFUならびにS.アルレウスの新鮮増殖培地の導入についてである。
図11、汚染のない全ゲノム増幅試薬の作製。特定の実施形態においてWGAのために使用される試薬は、DNA吸着ユニットおよび0.2uM滅菌フィルターを通過する。得られるのは精製された試薬であり、ネガティブコントロールは12時間後であってもDNAを産生しない。
図12は、精製核酸試料が増幅サブサーキットを通過するステップ6を示す。このサーキットにおいて全ゲノム増幅は、精製試料が増幅緩衝液(溶出緩衝液と同じであってよい)と混合し、摂氏95度まで加熱されるゾーンを使用して実施されることができ、次いで摂氏30度で増幅酵素と混合する反応ゾーンに移されうる。酵素は、下の実施例1において記載される安定化酵素混合物の部分である凍結乾燥された増幅酵素であることが好ましい。
図13は、カード中に乾燥された試薬(安定化酵素混合物凍結乾燥ビーズを含む)を備える例示的マイクロフリューディックカードおよび緩衝液包装の配置を示す。
図14は、従来技術WGA酵素混合物が室温では5日間だけの安定性を有して保存時に安定でなかったことを示す。図14は、下の実施例1において提供される増幅酵素の凍結乾燥混合物の有利点も記載する。
図20は、(廃棄物パッドおよび液体試薬を備える)成形カートリッジ、上蓋、積層底およびニューマチックガスケットを含む例示的マイクロフリューディックカードを示す。
図21は、例示的緩衝液ブリスター包装の画像を示す。図21は、マイクロフリューディックカード上の成形刃がどのようにブリスター包装に穴を開けて、それらに保存されている試薬を放出するために使用されうるかを記載する。
図22は、マイクロフリューディックカードと相互作用するおよび操作するために使用される例示的処理機器の模式図を示す。この図において記載されるとおり処理機器は、機器を作動させるプロセッサー、USBまたはイーサーネット接続を含みうる入出力、使用者に状態を提供するためのLCD画面および使用者制御のためのタッチスクリーンを含む。処理機器は、空気ポンプ、レギュレーター、多岐弁、圧力/真空リザーバーおよび弁を含むニューマチックシステムも含みうる。プロセッサーは、クランプ、ニューマチック多岐管および加熱器とのカード/カートリッジインターフェースも含みうる。
図23は、処理機器と共に作動する消耗マイクロフリューディックカードの例示的システム概観を示す。
図24は、物理的または酵素的手段のいずれかでのWGA増幅試料の断片化の例示的結果を示す。そのような断片化は、ステップ7でマイクロフリューディックカード中の断片化サブサーキットにおいて実施されうる。増幅された試料は、断片化サブサーキットに移されてよく、次いで機械的剪断を使用して(例えば断片化サブサーキット中の開口部を通過することによって)断片化されうるまたは制限酵素に供されてもよい。使用されうる断片化法は、これだけに限らないが例えば制限酵素または切断プライマーでの切断を含む。制限酵素および切断プライマーを使用する方法は、当業者に十分に周知である。断片の末端は、次いでクレノウ断片のように酵素で加工されうる。
特定の実施形態において、マイクロフリューディックカード中の次のサブサーキットは、リンカー連結サブサーキットである。このサブサーキットにおいてリンカーは、断片化核酸の末端に連結される。好ましくはリンカーは、ABI SOLID、ILLUMINA SOLEXA、ROCHE454、ION TORRENT、ABI STARLITEおよびPACIFIC BIOSCIENCES SMRT配列決定において使用されるものなどの、配列決定法において使用されるものである。これらの配列決定技術および関連するリンカーについての記載は、下にさらに提供される。
II.全ゲノム増幅法
特定の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、増幅サブサーキットにおいて全ゲノム増幅(WGA)を実施するために必要な、十分なまたは有用な試薬を有する。本発明が増幅方法としてWGAに限定されず、どちらも当技術分野において十分に周知のPCRまたはTMAなどのその他の任意の種類の適切な増幅技術(および対応する試薬)が使用されうることは記載される。
特定の実施形態においてマイクロフリューディックカードは、増幅サブサーキットにおいて全ゲノム増幅(WGA)を実施するために必要な、十分なまたは有用な試薬を有する。本発明が増幅方法としてWGAに限定されず、どちらも当技術分野において十分に周知のPCRまたはTMAなどのその他の任意の種類の適切な増幅技術(および対応する試薬)が使用されうることは記載される。
A.非標的WGA
遺伝子診断、癌研究または法医学などの研究の多数の分野において、ゲノムDNAの不足は、試料に実施されうる遺伝子検査の種類および量の重大な制限要因となる場合がある。この問題を克服するために設計された1つの手法が全ゲノム増幅(WGA)である。元の試料と識別不能だが高いDNA濃度を有する新たな試料を生成するために、目標は限定的なDNA試料を非特異的方法で増幅することである。典型的な全ゲノム増幅技術の目的は、元の配列表現を尊重する一方で、試料をマクログラムレベルにまで増幅することである。
遺伝子診断、癌研究または法医学などの研究の多数の分野において、ゲノムDNAの不足は、試料に実施されうる遺伝子検査の種類および量の重大な制限要因となる場合がある。この問題を克服するために設計された1つの手法が全ゲノム増幅(WGA)である。元の試料と識別不能だが高いDNA濃度を有する新たな試料を生成するために、目標は限定的なDNA試料を非特異的方法で増幅することである。典型的な全ゲノム増幅技術の目的は、元の配列表現を尊重する一方で、試料をマクログラムレベルにまで増幅することである。
最初の全ゲノム増幅法は1992年に記載され、ポリメラーゼ連鎖反応の原理に基づいていた。Zhangら(Zhang L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、1992年、89:5847−5851頁、参照により本明細書に組み込む)はプライマー伸長PCR技術(PEP)を開発し、Teleniusらは(Teleniusら、Genomics.1992年、13(3):718−25頁、参照により本明細書に組み込む)は縮重オリゴヌクレオチドプライマーPCR法(DOP−PCR)を設計した Zhang L.ら、1992年)。
DOP−PCRは、Taqポリメラーゼおよび、ヒトゲノム中のおよそ100万部位に低アニーリング温度で結合する半縮重オリゴヌクレオチド(例えばCGACTCGAGNNNNATGTGG(配列番号1)など、ここでN=A、T、CまたはG)を使用する方法である。最初のサイクルに、高いアニーリング温度の多数のサイクルが続き、最初のステップで標識された断片の増幅を可能にする。
多置換増幅(MDA、鎖置換増幅;SDAとしても周知)は、ランダムヘキサマーの変性DNAへのアニーリングに続く一定温度での鎖置換合成に基づく、PCRに基づかない等温性の方法である(Blancoら、1989年、J.Biol.Chem.264:8935−40頁、参照により本明細書に組み込む)。これは小さなゲノムのDNA試料に適用されており、限定的な配列表現偏向を有する高分子量DNAの合成を導いている(Lizardiら、Nature Genetics 1998年、19、225−232頁;Deanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002年、99、5261−5266頁、両者を参照により本明細書に組み込む)。DNAが鎖置換によって合成されることから、生じるプライミング事象の数が徐々に増加し、高分岐DNA構造の網目が形成される。反応は、Phi29DNAポリメラーゼによってまたはBstDNAポリメラーゼの大断片によって触媒されうる。Phi29DNAポリメラーゼは、Taqポリメラーゼより100倍低いエラー率をもたらすプルーフリーディング活性を有する。
いくつかの実施形態において、多数の置換増幅のために使用される反応混合物は、複数のポリメラーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態において触媒活性は、5’−3’DNAポリメラーゼ活性、3’−5’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性および、5’−3’除去修復活性などのDNA修復活性を含む。種々のポリメラーゼ酵素の例は、これだけに限らないが以下の;Phi29、クレノウ断片、T4ポリメラーゼ、T7ポリメラーゼ、BstEポリメラーゼ、E.コリPol I、Vent、Deep Vent、Vent exo−、Deep Vent exo−、KOD HiFi、Pfu ultra、Pfu turbo、Pfu native、Pfu exo−、Pfu exo−Cx、Pfu cloned、PROOFSTART(Qiagen)、rTth、TgoおよびTfu Qbioを含む。これらのポリメラーゼは周知であり、ほとんどが商業的に入手できる。
他の実施形態において、例えばヘリカーゼ、ジャイレース、T4G32およびSSBP例えばなどの、他の非ポリメラーゼ酵素またはアクセサリータンパク質はMDA反応混合物中に含まれる。いくつかの実施形態においてMDA用の反応混合物は、ピロリン酸をリン酸に転換するために作用するピロホスファターゼを含む。ピロリン酸は、増幅反応の結果として反応混合物中に蓄積する(1等量のピロリン酸は添加され取り込まれた各デオキシヌクレオチド三リン酸から生成され、増幅反応を阻害することが周知である)。いくつかの実施形態において、約0.004単位のピロリン酸が反応混合物に添加される。
B.標的WGA
特定の実施形態において標的全ゲノム増幅(TWGA)は、本発明の一部として使用される。標的WGAは、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第20100035232号に記載されている。
特定の実施形態において標的全ゲノム増幅(TWGA)は、本発明の一部として使用される。標的WGAは、例えば、参照により本明細書に組み込む米国特許出願公開第20100035232号に記載されている。
標的全ゲノム増幅プライマーの設計のための標的ゲノム
いくつかの好ましい実施形態において、1つ以上の標的ゲノムが選択される。標的ゲノムの選択は分析の目的によって決定される。例えば標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、生物戦争攻撃の現場において土壌試料中に存在することが疑われるバチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)などの生物戦争生物のゲノムを代表する核酸を得ることである場合は、ただ1つの標的ゲノムとしてバチルス・アントラシスのゲノムを選択することを選ぶことができる。一方標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、潜在的生物兵器剤の群などの細菌群を代表する核酸を得ることである場合は、次の細菌:バチルス・アントラシス、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、ブルセラ属種(Brucella sp.)、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、リケッチア・プロワゼキイ(Rickettsia prowazekii)およびエシュリキア・コリ0157(Escherichia coli 0157)の任意または全てを含む群のように複数の標的ゲノムが選択されうる。同様に、異なるゲノムまたはゲノム群が、他の目的のための(1つ以上の)標的ゲノムとして選択されうる。例えばヒトゲノムまたはミトコンドリアDNAは、犯罪が行われた可能性がある場所の土壌試料または他の環境試料中に見出される一般的ゲノムに優先して標的になりうる。したがって従来の方法および組成物は、適用されることができ、ヒトゲノム(標的)はバックグラウンドゲノムに優先して選択的に増幅されうる。他の例は、呼吸器疾患を生じるウイルス群、敗血症を生じる病原体または家庭を汚染することが周知の真菌群のゲノムを含みうる。
いくつかの好ましい実施形態において、1つ以上の標的ゲノムが選択される。標的ゲノムの選択は分析の目的によって決定される。例えば標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、生物戦争攻撃の現場において土壌試料中に存在することが疑われるバチルス・アントラシス(Bacillus anthracis)などの生物戦争生物のゲノムを代表する核酸を得ることである場合は、ただ1つの標的ゲノムとしてバチルス・アントラシスのゲノムを選択することを選ぶことができる。一方標的全ゲノム増幅工程の望ましい結果が、潜在的生物兵器剤の群などの細菌群を代表する核酸を得ることである場合は、次の細菌:バチルス・アントラシス、フランシセラ・ツラレンシス(Francisella tularensis)、エルシニア・ペスチス(Yersinia pestis)、ブルセラ属種(Brucella sp.)、バークホルデリア・マレイ(Burkholderia mallei)、リケッチア・プロワゼキイ(Rickettsia prowazekii)およびエシュリキア・コリ0157(Escherichia coli 0157)の任意または全てを含む群のように複数の標的ゲノムが選択されうる。同様に、異なるゲノムまたはゲノム群が、他の目的のための(1つ以上の)標的ゲノムとして選択されうる。例えばヒトゲノムまたはミトコンドリアDNAは、犯罪が行われた可能性がある場所の土壌試料または他の環境試料中に見出される一般的ゲノムに優先して標的になりうる。したがって従来の方法および組成物は、適用されることができ、ヒトゲノム(標的)はバックグラウンドゲノムに優先して選択的に増幅されうる。他の例は、呼吸器疾患を生じるウイルス群、敗血症を生じる病原体または家庭を汚染することが周知の真菌群のゲノムを含みうる。
標的全ゲノム増幅プライマーの設計のためのバックグラウンドゲノム
バックグラウンドゲノムは、存在する特定の生物の核酸の可能性に基づいて選択されうる。例えばヒトによって取り扱われた土壌試料は、これだけに限らないが、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)、ガルス・ガルス(Gallus gallus)、ギラルディア・テータ(Guillardia theta)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、サッカロマイセス・セレビシエ、デバイヨマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、クリベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、シゾサッカロマイセス・ポム(Schizosaccharomyces pom)、アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigatus)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンセファリトゾーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi)、エレモテシウム・ゴシッピー(Eremothecium gossypii)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アピス・メリフェラ(Apis mellifera)、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、トリボリウム・カスタネウム(Tribolium castaneum)、アノフェレス・ガンビアエ(Anopheles gambiae)およびカエノルハブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)を含む生物のゲノムを代表する核酸を含有することが期待される。任意のまたはこれら全てのゲノムは、試料中のバックグラウンドゲノムを評価するために適している。任意の特定の試料中の実際の生物は、供給原および/または環境に基づいて各試料について変化する。したがってバックグラウンドゲノムは、試料中に実際に存在する生物の独自性に基づいて選択されうる。試料の成分は、当業者に周知の任意の多数の技術を使用して測定されうる。さらなる実施形態において、プライマーは、試料中の1つ以上のバックグラウンド生物の実際の同定に基づいておよび試料中に存在する任意のさらなる1つ以上のバックグラウンド生物の可能性に基づいて設計されうる。
バックグラウンドゲノムは、存在する特定の生物の核酸の可能性に基づいて選択されうる。例えばヒトによって取り扱われた土壌試料は、これだけに限らないが、ホモ・サピエンス(Homo sapiens)、ガルス・ガルス(Gallus gallus)、ギラルディア・テータ(Guillardia theta)、オリザ・サティバ(Oryza sativa)、アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis thaliana)、ヤロウイア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)、サッカロマイセス・セレビシエ、デバイヨマイセス・ハンセニイ(Debaryomyces hansenii)、クリベロマイセス・ラクチス(Kluyveromyces lactis)、シゾサッカロマイセス・ポム(Schizosaccharomyces pom)、アスペルギルス・フミガータス(Aspergillus fumigatus)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、エンセファリトゾーン・クニクリ(Encephalitozoon cuniculi)、エレモテシウム・ゴシッピー(Eremothecium gossypii)、カンジダ・グラブラタ(Candida glabrata)、アピス・メリフェラ(Apis mellifera)、ドロソフィラ・メラノガスター(Drosophila melanogaster)、トリボリウム・カスタネウム(Tribolium castaneum)、アノフェレス・ガンビアエ(Anopheles gambiae)およびカエノルハブディティス・エレガンス(Caenorhabditis elegans)を含む生物のゲノムを代表する核酸を含有することが期待される。任意のまたはこれら全てのゲノムは、試料中のバックグラウンドゲノムを評価するために適している。任意の特定の試料中の実際の生物は、供給原および/または環境に基づいて各試料について変化する。したがってバックグラウンドゲノムは、試料中に実際に存在する生物の独自性に基づいて選択されうる。試料の成分は、当業者に周知の任意の多数の技術を使用して測定されうる。さらなる実施形態において、プライマーは、試料中の1つ以上のバックグラウンド生物の実際の同定に基づいておよび試料中に存在する任意のさらなる1つ以上のバックグラウンド生物の可能性に基づいて設計されうる。
プライマーハイブリダイゼーション部位としての固有ゲノム配列セグメントの同定
試料の標的およびバックグラウンドゲノムが測定されると、次のステップはプライマーハイブリダイゼーション部位として有用な標的ゲノム中のゲノム配列セグメントを同定することである。所与の標的全ゲノム増幅の効率は、プライマーの効果的な使用に依存する。全ゲノムを代表する増幅産物を産生するためにプライマーハイブリダイゼーション部位は、ゲノムの長さにわたって適切な間隔を有するべきである。好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔距離は、約1000核酸塩基またはそれ未満である。より好ましくは平均間隔は長さ約800核酸塩基またはそれ未満である。さらに好ましくは平均間隔は長さ約600核酸塩基またはそれ未満である。最も好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔は長さ約500核酸塩基またはそれ未満である。
試料の標的およびバックグラウンドゲノムが測定されると、次のステップはプライマーハイブリダイゼーション部位として有用な標的ゲノム中のゲノム配列セグメントを同定することである。所与の標的全ゲノム増幅の効率は、プライマーの効果的な使用に依存する。全ゲノムを代表する増幅産物を産生するためにプライマーハイブリダイゼーション部位は、ゲノムの長さにわたって適切な間隔を有するべきである。好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔距離は、約1000核酸塩基またはそれ未満である。より好ましくは平均間隔は長さ約800核酸塩基またはそれ未満である。さらに好ましくは平均間隔は長さ約600核酸塩基またはそれ未満である。最も好ましくはプライマーハイブリダイゼーション部位間の平均間隔は長さ約500核酸塩基またはそれ未満である。
当業者は、全ゲノム増幅に対する効果的なプライミングは、プライマー伸長のために使用されるポリメラーゼ酵素の忠実度および処理能力などのいくつかの要因に依存することを認識する。プライマーハイブリダイゼーション部位間のより長い平均間隔距離は、ポリメラーゼ酵素が高い処理能力を有する場合にはより受け入れられる。これは、ポリメラーゼが核酸鋳型に強く結合していることを示す。ポリメラーゼが鋳型核酸に結合し続けることおよび合成されている相補的核酸鎖の伸長を継続することを可能にすることから、これは標的全ゲノム増幅についての望ましい特徴である。高い処理能力を有するポリメラーゼ酵素の例は、これだけに限らないがPhi29ポリメラーゼおよびTaqポリメラーゼを含む。タンパク質工学的戦略が、例えばポリメラーゼとDNA結合タンパク質との共有結合によって、高い処理能力を有するポリメラーゼ酵素を産生するために使用されている(Wangら、Nucl.Acids.Res.,2004年、32(3) 1197−1207頁、参照により本明細書に組み込む)。改善された処理能力を有するポリメラーゼが入手可能になることから、1000核酸塩基を超えさえするより長い平均間隔距離が標的全ゲノム増幅のために許容可能である場合がある。
ハイブリダイゼーション感度および選択性
標的全ゲノム増幅の目的のためにプライマーハイブリダイセーション部位(ゲノム配列決定セグメント)の長さおよびこれらにハイブリダイズする対応するプライマーの長さの選択は、好ましくは2つの要因;(1)所与のプライマーの標的ゲノムへの結合頻度を示す感度、および(2)所与のプライマーがバックグラウンドゲノムにハイブリダイズするよりもより高い頻度で標的ゲノムにハイブリダイズする程度を示す選択性を比較考量する。一般に、より長いプライマーは高い選択性および低い感度である傾向があり、一方短いプライマーについては逆になる。好ましくは長さ約5から約13核酸塩基のプライマーが標的全ゲノム増幅に有用であるが、この範囲から外れるプライマー長も同様に使用されうる。この範囲が5、6、7、8、9、10、11、12および13核酸塩基の長さを有するプライマーを含むことは認識される。プライマーの大きさは、プライマーの選択性とプライマーの感度との間のバランスに影響を与える。最適なプライマー長は、このバランスを考慮して各試料について決定される。5核酸塩基より短いまたは13核酸塩基より長い長さを有するプライマーも、選択性および感度がその試料について最適に維持される場合は有用である。種々の長さを有する複数のプライマーを選択することは、(1つ以上の)標的ゲノム配列にわたる広範なプライミングを提供し、バックグラウンドゲノム配列と比較して(1つ以上の)標的ゲノム配列へのプライマーの優先的な結合も提供する。
標的全ゲノム増幅の目的のためにプライマーハイブリダイセーション部位(ゲノム配列決定セグメント)の長さおよびこれらにハイブリダイズする対応するプライマーの長さの選択は、好ましくは2つの要因;(1)所与のプライマーの標的ゲノムへの結合頻度を示す感度、および(2)所与のプライマーがバックグラウンドゲノムにハイブリダイズするよりもより高い頻度で標的ゲノムにハイブリダイズする程度を示す選択性を比較考量する。一般に、より長いプライマーは高い選択性および低い感度である傾向があり、一方短いプライマーについては逆になる。好ましくは長さ約5から約13核酸塩基のプライマーが標的全ゲノム増幅に有用であるが、この範囲から外れるプライマー長も同様に使用されうる。この範囲が5、6、7、8、9、10、11、12および13核酸塩基の長さを有するプライマーを含むことは認識される。プライマーの大きさは、プライマーの選択性とプライマーの感度との間のバランスに影響を与える。最適なプライマー長は、このバランスを考慮して各試料について決定される。5核酸塩基より短いまたは13核酸塩基より長い長さを有するプライマーも、選択性および感度がその試料について最適に維持される場合は有用である。種々の長さを有する複数のプライマーを選択することは、(1つ以上の)標的ゲノム配列にわたる広範なプライミングを提供し、バックグラウンドゲノム配列と比較して(1つ以上の)標的ゲノム配列へのプライマーの優先的な結合も提供する。
選択性限界基準
いくつかの実施形態において、プライマーセットの費用および複雑度を低減するために標的全ゲノム増幅セット中のプライマーの総数を低減するために全ての固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットを決定することは好ましい。いくつかの実施形態において固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットの決定は、所与のゲノム配列セグメントの感度および/または選択性についての有用なおよび実用的なカットオフ点を示す1つ以上の閾値基準を選択することを必要とする。そのような基準の例は、これだけに限らないが発生頻度の選択された閾値(頻度閾値)および選択された選択性比(選択比閾値)を含む。
いくつかの実施形態において、プライマーセットの費用および複雑度を低減するために標的全ゲノム増幅セット中のプライマーの総数を低減するために全ての固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットを決定することは好ましい。いくつかの実施形態において固有のゲノム配列セグメントの適切なサブセットの決定は、所与のゲノム配列セグメントの感度および/または選択性についての有用なおよび実用的なカットオフ点を示す1つ以上の閾値基準を選択することを必要とする。そのような基準の例は、これだけに限らないが発生頻度の選択された閾値(頻度閾値)および選択された選択性比(選択比閾値)を含む。
いくつかの実施形態において、基準に従って全ての固有のゲノム配列セグメントを分類することは有用である。例えば全ての固有のゲノム配列セグメントは、1位が最も高い発生頻度を示し、最も低い順位が最も低い発生頻度を示して発生頻度に従って分類される。次いで発生頻度の閾値は、順位から選択されうる。発生頻度の閾値は、さらなる分析のために選択されたサブセットのメンバーとさらには分析されないメンバーとの間の境界線として働く。
プライマー設計
選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、好ましくはゲノム配列セグメントに100%相補的である。他の実施形態において選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、ゲノム配列セグメントに少なくとも約70%から約100%またはこれらの間の任意の整数もしくは小数で相補的である。一般的に、選択された核酸配列にハイブリダイズするためのプライマーの設計は、当業者に十分に周知であり、商業的に入手可能なコンピュータープログラムによって支援されうる。分析され、プライマーハイブリダイセーション部位として選択されるゲノム配列セグメントと同じ長さであるように所与のプライマーを設計することは一般に好ましい。しかしいくつかの場合においては、プライマーハイブリダイセーション部位と比較してプライマーの長さを変更することは有利でありうる。例えばプライマーが分析され好ましくない融解温度を有することが見出された場合および標的ゲノム配列に対する改善された親和性を有するプライマーを生成するために5’または3’末端での延長から利益を得る場合。プライマーの長さは、増大されても、減少されてもよい。当業者は、プライマー長の変更がプライマーハイブリダイセーション部位も変更し、元の選択されたゲノム配列セグメントとはもはや同一でないことを認識する。いくつかの場合において、所与の長さを変更したプライマーのハイブリダイゼーション部位に対応するゲノム配列セグメントを分析することは有益でありうる。この分析は、これだけに限らないが、発生頻度および選択比を含むデータの検討によって実施されることができ、長さを変更したプライマーの実際のインビトロ検査によっても実施されうる。
選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、好ましくはゲノム配列セグメントに100%相補的である。他の実施形態において選択されたゲノム配列セグメントにハイブリダイズするために設計されるプライマーは、ゲノム配列セグメントに少なくとも約70%から約100%またはこれらの間の任意の整数もしくは小数で相補的である。一般的に、選択された核酸配列にハイブリダイズするためのプライマーの設計は、当業者に十分に周知であり、商業的に入手可能なコンピュータープログラムによって支援されうる。分析され、プライマーハイブリダイセーション部位として選択されるゲノム配列セグメントと同じ長さであるように所与のプライマーを設計することは一般に好ましい。しかしいくつかの場合においては、プライマーハイブリダイセーション部位と比較してプライマーの長さを変更することは有利でありうる。例えばプライマーが分析され好ましくない融解温度を有することが見出された場合および標的ゲノム配列に対する改善された親和性を有するプライマーを生成するために5’または3’末端での延長から利益を得る場合。プライマーの長さは、増大されても、減少されてもよい。当業者は、プライマー長の変更がプライマーハイブリダイセーション部位も変更し、元の選択されたゲノム配列セグメントとはもはや同一でないことを認識する。いくつかの場合において、所与の長さを変更したプライマーのハイブリダイゼーション部位に対応するゲノム配列セグメントを分析することは有益でありうる。この分析は、これだけに限らないが、発生頻度および選択比を含むデータの検討によって実施されることができ、長さを変更したプライマーの実際のインビトロ検査によっても実施されうる。
いくつかの実施形態において、対応するゲノム配列セグメントに100%より少なく相補的であるプライマーを設計することが有利である可能性がある場合には、対応する元のゲノム配列セグメントに100%より少なく相補的であるプライマーに100%相補的な仮説上のゲノム配列セグメントに関して再計算選択基準の補数(発生頻度および選択比など)を検討することも有利である。選択閾値が好ましくない場合は、改善された選択閾値を有する代替プライマー配列の設計を考慮することは有利である。
III.配列決定技術
上に記載のとおり本発明の実施形態は、マイクロフリューディックカードで生成されるDNAライブラリーを配列決定することに関与する。本発明は、使用される配列決定法によって限定されない。例示的配列決定法は下に記載される。
上に記載のとおり本発明の実施形態は、マイクロフリューディックカードで生成されるDNAライブラリーを配列決定することに関与する。本発明は、使用される配列決定法によって限定されない。例示的配列決定法は下に記載される。
核酸配列決定技術の説明的非限定的例は、これだけに限らないが連鎖停止(サンガー)配列決定およびダイターミネーター配列決定を含む。連鎖停止配列決定は、修飾ヌクレオチド基質を使用するDNA合成反応の配列特異的停止を使用する。伸長は、その領域の鋳型に相補的な短い放射活性または他で標識されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して鋳型DNA上の特定の部位で開始される。オリゴヌクレオチドプライマーは、DNAポリメラーゼ、標準的な4種のデオキシヌクレオチド塩基および低濃度の1種類の連鎖停止ヌクレオチド、最も一般的にはジデオキシヌクレオチドを使用して伸長される。この反応は、塩基それぞれをジデオキシヌクレオチドに替えた4つの別々のチューブ中で反復される。DNAポリメラーゼによる連鎖停止ヌクレオチドの限定的取り込みは、特定のジデオキシヌクレオチドが使用された位置でだけ停止された一連の関連するDNA断片を生じる。各反応チューブについて断片は、平板ポリアクリルアミドゲルまたは粘稠なポリマーを充填されたキャピラリーチューブ中で電気泳動によって大きさで分離される。配列は、ゲルの上から下までを走査した際にどのレーンが標識プライマー由来の視覚化された目印を産生しているかを読み取ることによって決定される。
ダイターミネーター配列決定は、転写ターミネーターを代替的に標識する。ジデオキシヌクレオチド鎖転写ターミネーターのそれぞれを異なる波長で蛍光を発する別々の蛍光色素で標識することによって完全な配列決定が単一の反応において実施されうる。
「次世代配列決定」技術と称される一連の方法は、サンガーおよびダイターミネーター配列決定法への代替として現れている(Voelkerdingら、Clinical Chem.、55:641−658頁、2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7、287−296頁;それぞれを参照により本明細書に組み込む)。最新の方法は、生物の一次核酸配列を決定するための全ゲノムのde novo配列決定のための次世代配列決定技術の使用を記載する。追加的に標的化再配列決定(大規模配列決定)は、野生型配列集団中での高感度な変異検出を可能にする。いくつかの例は、HIV薬剤耐性変種および抗TK治療剤への応答を判定するためのEGFR変異の同定を記載している最近の研究を含む。典型的な配列決定の実行において複数の試料の同時配列決定を可能にするバーコードプライマー配列の使用を記載している最近の刊行物は、例えばMargulies,M.ら、“Genome Sequencing in Microfabricated High−Density Picolitre Reactors”、Nature、437、376−80頁(2005);Mikkelsen,T.ら、“Genome−Wide Maps of Chromatin State in Pluripotent and Lineage−Committed Cells”、Nature、448、553−60頁(2007);McLaughlin,S.ら、“Whole−Genome Resequencing with Short Reads:Accurate Mutation Discovery with Mate Pairs and Quality Values”、ASHG Annual Meeting (2007);Shendure,J.ら、“Accurate Multiplex Polony Sequeneing of an Evolved Bacterial Genome”、Science、309、1728−32頁(2005);Harris,T.ら、“Single−Molecule DNA Sequencing of a Viral Genome”、Science、320、106−9頁(2008);Simen,B.ら、“Prevalence of Low Abundance Drug Resistant Variants by Ultra Deep Sequencing in Chronically HIV−infected Antiretroviral(ARV) Naive Patients and the Impact on Virologic Outcomes”、16th International HIV Drug Resistence Workshop、Barbados(2007);Thomas,R.ら、“Sensitive Mutation Detection in Heterogeneous Cancer Specimens by Massively Parallel Picoliter Reactor Sequencing”、Nature Med.、12,852−855頁(2006);Mitsuya,Y.ら、“Minority Human Immunodeficiency Virus Type1 Variants in Antiretroviral−Naive Persons with Reverse Transcriptase Codon 215 Revertant Mutations”、J.Vir.、82、10747−10755頁(2008);Binladen,J.ら、“The Use of Coded PCR Primers Enables High−Throughput Sequencing of Multiple Homolog Amplification Products by 454 Parallel Sequencing”、PloS ONE、2,e197(2007);およびHoffmann,C.ら、“DNA Bar Coding and Pyrosequencing to Identify Rare HIV Drug Resistence Mutations”、Nuc.Acids Res.、35、e91(2007)を含み、全てを参照により本明細書に組み込む。
伝統的なサンガー配列決定と比較して、次世代配列決定技術は、多量の配列決定データ点を作成する。典型的な実行は、ギガ塩基範囲に達する1日あたりの潜在的作成量を有して、1実行あたり10から100メガ塩基を容易に作成できる。これは、典型的な多重実行において数百データ点を作成できる標準的96ウエルプレートよりも数桁大きいことを表している。1ヌクレオチド程度だけ異なる標的増幅産物は、関連する種由来の複数の標的が存在する場合であっても、容易に区別されうる。これは、正確な遺伝子型判定を実行する能力を非常に増強する。共通配列を作成するために使用される次世代配列アラインメントソフトウエアプログラムは、新たな点変異を容易に同定でき、薬剤耐性に関連する新たな株を生じうる。プライマーバーコードの使用も単回の配列決定での異なる患者試料の多重化を可能にする。
次世代配列決定(NGS)法は、古い配列決定法との比較でさらに低コストを目標に、大量に平行する、ハイスループットな戦略の一般的機能を共有する。NGS法は鋳型増幅を必要とするものと必要としないものに大きく分類されうる。増幅を必要とする方法は、454技術プラットフォーム(例えばGS 20およびGS FLX)としてRocheによって商業化されたピロ配列決定;Illuminaによって商業化されたSolexaプラットフォームおよびApplied Biosystemsによって商業化されたSupported Oligonucleotide Ligation and Detection(SOLiD)プラットフォームを含む。単一分子配列決定としても周知の非増幅手法は、Helicos BioSciencesによって商業化されたHeliScopeプラットフォームおよびVisiGen and Pacific Biosciencesによって商業化された新たなプラットフォームのそれぞれによって例示される。
ピロ配列決定(Voelkerdingら、Clinical Chem.、55、641−658頁、2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7、287−296頁;米国特許第6,210,891号;米国特許第6,258,568号;それぞれ全体を参照により本明細書に組み込む)において、鋳型DNAは断片化され、末端修復され、アダプターに連結され、アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズを有する単一鋳型分子を捕獲することによってin situでクローン性に増幅される。単一の鋳型を保持している各ビーズは、油中水微小胞中に個々に区画化され、鋳型はエマルジョンPCRと称される技術を使用してクローン性に増幅される。エマルジョンは増幅後に破壊され、ビーズは配列決定反応中にフローセルとして機能するピコタイタープレートの個々のウエルに入れられる。4種のdNTP試薬それぞれの整然と反復される導入が配列決定酵素およびルシフェラーゼなどの発光レポーターの存在下でフローセル中で生じる。適切なdNTPが配列決定プライマーの3’末端に付加される事象において、生じるATP産生は、CCDカメラを使用して記録されるウエル中での突発的発光を引き起こす。400塩基より長いまたは同等の読み取り長さを達成することは可能であり、配列の5億塩基対(Mb)に至るまでが得られる1x106配列読み取りも達成されうる。
Solexa/Illuminaプラットフォームにおいて(Voelkerdingら、Clinical Chem.、55、641−658頁、2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7、287−296頁;米国特許第6,833,246号;米国特許第7,115,400号;米国特許第6,969,488号;それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む)、配列決定データは、短い読み取り長さの形式で作成される。この方法において1本鎖断片化DNAは、5’−リン酸化平滑末端を生成するために末端修復され、断片の3’末端への単一A塩基のクレノウ介在付加が続く。A付加は、Tオーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を促進し、これは、後で、オリゴヌクレオチドアンカーで覆われているフローセルの表面上において鋳型アダプター分子を捕獲するために使用される。アンカーはPCRプライマーとして使用されるが、鋳型の長さおよび他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドとの近接性から、PCRによる伸長は、近接アンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする分子の「アーチ」を生じ、フローセルの表面上に架橋構造を形成する。DNAのこれらのループは、変性され、切断される。次いで順方向鎖は、可逆的ダイターミネーターで配列決定される。取り込まれたヌクレオチドの配列は、取り込み後蛍光の検出によって決定され、次のサイクルのdNTP添加の前に各蛍光およびブロックは除去される。配列読み取り長さは、36ヌクレオチドから50を超えるヌクレオチドまでの範囲であり、全体の出力は分析実行1回あたり10億ヌクレオチドを超える。
SOLiD技術(Voelkerdingら、Clinical Chem、55、641−658頁、2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7、287−296頁;米国特許第5,912,148号:米国特許第6,130,073号;それぞれその全体を参照により本明細書に組み込む)を使用する配列決定核酸分子は、鋳型の断片化、オリゴヌクレオチドアダプターへの連結、ビーズへの付着およびエマルジョンPCRによるクローン性増幅にも関与する。続いて鋳型を保持しているビーズは、ガラスフローセルの誘導体化表面上に固定され、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーにアニールされる。しかしこのプライマーを3’伸長に利用するよりも、6個の縮重塩基および4種の蛍光標識の内の1つが続く2つのプローブ特異的塩基を含有する照合プローブへの連結のために5’リン酸基を提供するために代わりに使用される。SOLiDシステムにおいて照合プローブは、各プローブの3’末端での2塩基に16種の可能な組合せおよび5’末端に4種類の蛍光の内の1つを有する。蛍光色およびそれによる各プローブの独自性は、特定の色−位置コード体系に対応する。複数周期(通常7)のプローブアニーリング、連結および蛍光検出には、変性および、次いで最初のプライマーと比較して1塩基ずれているプライマーを使用する配列決定の第2周期が続く。このやり方において鋳型配列は、コンピューター的に再構築されることができ、鋳型塩基は2回照合され、向上した正確性をもたらす。配列読み取り長は平均35ヌクレオチドであり、配列決定1実行あたりの総出力は40億塩基を超える。
特定の実施形態においてナノポア配列決定が使用される(例えば、参照により本明細書に組み込むAstierら、J Am Chem Soc.2006年2月8日;128(5):1705−10頁を参照されたい)。ナノポア配列決定の背景にある理論は、ナノポアが導電性流体に浸漬され、それを超えて電位(電圧)をかける際に生じることに関係があり、これらの条件下でナノポアを通るイオンの伝導によりわずかな電流が観察される場合があり、電流量はナノポアの大きさに非常に影響されやすい。DNA分子がナノポアを通過する(またはDNA分子の一部が通過する)場合、これはナノポアを通じる電流の大きさにおける変化を生じさせることができ、したがってDNA分子の配列が決定されることを可能にする。ナノポアは、金属および/もしくは非金属製表面またはα−ヘモリジンなどのタンパク質ベースナノポアに成形された固体ポアであってよい(Clarkeら、Nat.Nanotech.、2009年2月4日:265−270頁)。
Helicos BiosciencesによるHeliScope(Voelkerdingら、Clinical Chem.、55:641−658頁;2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7:287−296頁;米国特許第7,169,560号;米国特許第7,282,337号;米国特許第7,482,120号;米国特許第7,501,245号;米国特許第6,818,395号;米国特許第6,911,345号;米国特許第7,501,245号;これら全体を参照により本明細書に組み込む)は、最初に商業化された単一分子配列決定プラットフォームである。この方法は、クローン性増幅を必要としない。鋳型DNAは、断片化され、最後のアデノシンが蛍光標識を保持して3’末端でポリアデニル化される。変性ポリアデニル化鋳型断片は、フローセル表面上のポリ(dT)オリゴヌクレオチドに連結される。捕獲された鋳型分子の最初の物理的位置はCCDカメラによって記録され、次いで標識が切断され、洗い流される。配列決定は、ポリメラーゼの添加および蛍光標識されたdNTP試薬の一連の添加によって達成される。取り込み事象は、dNTPに対応する蛍光シグナルを生じ、各回のdNTP添加の前にシグナルはCCDカメラによって捕捉される。配列読み取り長さは25−50ヌクレオチドの範囲であり、分析1実行あたりの総出力は10億ヌクレオチド対を超える。VisiGenプラットフォームを使用する合成による他の新たな単一分子配列法リアルタイム配列決定(Voelkerdingら、Clinical Chem.、55:641−658頁、2009年;米国特許第7,329,492号;米国特許出願第11/671956号;米国特許出願第11/781166号;これら全体を参照により本明細書に組み込む)では、固定化されたプライムDNA鋳型が蛍光修飾ポリメラーゼおよび蛍光受容体分子を使用する鎖伸長に供され、ヌクレオチドの添加において検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を生じる。Pacific Biosciencesによって開発された他のリアルタイム単一分子配列決定システム(Voelkerdingら、Clinical Chem.55:641−658頁、2009年;MacLeanら、Nature Rev.Microbiol.、7:287−296頁;米国特許第7,170,050号;米国特許第7,302,146号;米国特許第7,313,308号;米国特許第7,476,503号;これら全体を参照により本明細書に組み込む)は、直径50−100nmでおよそ20ゼプトリットル(10x10−21L)の反応容量を有する反応ウエルを利用する。配列決定反応は、固定化された鋳型、改変phi29 DNAポリメラーゼおよび高局所濃度の蛍光標識dNTPを使用して実施される。高局所濃度および継続的反応条件は、レーザー励起、光導波路およびCCDカメラを使用する蛍光シグナル検出によってリアルタイムで捕捉される取り込み事象を可能にする。
特定の実施形態において、ゼロモード導波路(ZMW)を使用するPacific Biosciencesによって開発された単一分子リアルタイム(SMRT)DNA配列決定法または同様の方法が使用される。この技術と共にDNA配列決定は、個々に数千個のゼロモード導波路(ZMW)を含むSMRTチップ上で実施される。ZMWは、直径数十ナノメートル、シリコンジオキシド基層上に設置された100nm金属フィルムに成形された孔である。各ZMWは、ナノ光学的視覚化チャンバーを形成し、正確に20ゼプトリットル(10−21リットル)の検出容量を提供する。この容量で単一分子の活性は、数千の標識ヌクレオチドのバックグラウンド中で検出されうる。
ZMWは、DNAポリメラーゼが合成によって配列決定を実施する際にこれを観察するための窓を提供する。各チャンバー内に単一DNAポリメラーゼ分子は、検出容量中に永続的に存在するように底表面に付着される。異なる色のフルオロフォアで種類ごとに標識されたリン酸結合ヌクレオチドは、次いで酵素の速度、正確性および処理能力を促進する高濃度で反応溶液中に導入される。ZMWの容量が小さいことから、これらの高い、生物学的に適切な濃度であってさえ検出容量は、短時間ヌクレオチドだけによって占められる。追加的に、拡散がヌクレオチドを運ぶ必要があるのが非常に短い距離であることから検出容量の通過は速く、数マイクロ秒間続くだけである。この結果は、バックグラウンドが非常に低かった。
DNAポリメラーゼが相補的ヌクレオチドを取り込むことから、各塩基は検出容量中に数十ミリ秒間保持され、これはヌクレオチドが検出容量に拡散で入って出るまでにかかる時間数より数桁長い。結合したフルオロフォアは、この時間内にこの色が塩基の独自性に対応する蛍光を発する。次いで天然の取り込み周期の一部として、ポリメラーゼはフルオロフォアを定位置に維持している結合を切断し、色素は検出容量から拡散する。取り込み続いて、シグナルは直ちにベースラインに戻り、工程は反復する。
制約されず、中断されずにDNAポリメラーゼは、1秒あたり10個の速度で塩基の取り込みを継続する。この方法において完全に天然の長い鎖のDNAが数分で産生される。同時および継続的検出が、SMRTチップ上の数千のZMWの全てにわたってリアルタイムで生じる。PacBioの研究者らは、この手法が長さ数千ヌクレオチドの読み取りを作成する能力を有することを実証している。
次の実施例は、本発明の特定の例示的実施形態を提供するために提示され、この範囲を限定することを意図しない。
[実施例1]
安定化酵素混合物
この実施例は、全ゲノム増幅(WGA)などの方法において有用である安定化酵素混合物の開発を記載する。図15において記載のとおり、多数の賦形剤製剤がPhi−29、ポリメラーゼIおよび無機ピロホスファターゼのWGAとの適合性について検査された。16個の専売の安定化製剤(賦形剤と称される。)は、WGAにおいて一般に使用される酵素をうまく安定化させることにおいて有用でなかったことが見出された。図16に示すとおり、BSAがこれらの酵素を安定化させるために重要な構成要素であったことが見出された。
安定化酵素混合物
この実施例は、全ゲノム増幅(WGA)などの方法において有用である安定化酵素混合物の開発を記載する。図15において記載のとおり、多数の賦形剤製剤がPhi−29、ポリメラーゼIおよび無機ピロホスファターゼのWGAとの適合性について検査された。16個の専売の安定化製剤(賦形剤と称される。)は、WGAにおいて一般に使用される酵素をうまく安定化させることにおいて有用でなかったことが見出された。図16に示すとおり、BSAがこれらの酵素を安定化させるために重要な構成要素であったことが見出された。
開発された1つの好ましい賦形剤は、「Ibis製剤33」と称される。この製剤を産生する方法の記載は次のとおりである。8968u/ml Phi−29ポリメラーゼ(Monserate)、180u/ml ポリメラーゼI(Epicentre Biotechnologies)、3.6u/ml無機ピロホスファターゼ(U.S.Biochemical)の混合物を、20%トレハロース、10mM (NH4)2SO4、12 MgCl2、50mM Tris pH7.6、0.05%Tween40、4mM DTTおよび最終濃度0.25%を達成するレベル(透析中に容量が変化するため透析中はより高濃度のBSAが存在し、それにより溶液は適切な透析後最終容量になる場合がある。)のBSAを含有する溶液と1:1で混合する。この混合物を30KDa透析膜を使用して20%トレハロース、10mM (NH4)2SO4、12 MgCl2、50mM Tris pH7.6、0.05%Tween40および4mM DTTを含有する溶液中で4時間、室温で透析する。
次いで透析した酵素混合物を透析膜から出し、20%トレハロース、10mM (NH4)2SO4、12 MgCl2、50mM Tris pH7.6、0.05%Tween40および4mM DTTを含有する溶液を使用して適切な最終容量にする(透析/希釈工程中の希釈レベルが凍結乾燥単位あたりにどれだけの酵素が存在するかを調節する)。次いでこの溶液を適切な一定容量に分注し、凍結させ、凍結乾燥組成物を生成するために昇華を介して水を除去するための高真空に供する。
多数のBSAレベル(最終濃度0.13%−1%)および0.5%(最終濃度)のPEG−8000の添加を上の記載と同じ一般計画を使用して検査した。この検査の結果は図17に示されている。
この作業において開発された賦形剤を使用して、本発明者らはこれらの酵素3種類全ての酵素活性が凍結乾燥中に維持され、これらの酵素の安定性が室温(25Cまで)で10日間より短いから40Cで2カ月を超えるまで劇的に増大したことを成功裏に実証した。この製剤は、新鮮酵素混合物(すなわち使用まで−20C冷凍庫で保存)と比較した場合に総反応収量も増大させた。室温での保存に関する長期間安定性の結果は、図18に示されている。この図は、Ibis製剤33中の凍結乾燥酵素が室温で4カ月間保存された場合に新鮮酵素と同等に作用したことを示している。図19は、およそ6カ月間の室温保存と同等である、摂氏40度、2カ月間の促進熟成を使用した長期保存安定性を示す。図19はIbis製剤33中の凍結乾燥された酵素が、2カ月間、摂氏40度の後に新鮮酵素と同等に作用したことを示している。
[実施例2]
試料調製法
この実施例は、例えばマイクロフリューディックデバイスにおいて使用されうる種々の試料調製法を記載する。このような方法は、単一のユニバーサル緩衝剤の使用を可能にし、試料が単一のチューブ中に留まることを可能にする。このような方法のための概要は、次のステップ:溶解および抽出;全ゲノム増幅(または他の増幅法);DNAの断片化;末端の加工;連結;未完成生成物の除去;および最終精製を含む。下に記載されるのは、多数のそのようなステップについての特定の詳細である。
試料調製法
この実施例は、例えばマイクロフリューディックデバイスにおいて使用されうる種々の試料調製法を記載する。このような方法は、単一のユニバーサル緩衝剤の使用を可能にし、試料が単一のチューブ中に留まることを可能にする。このような方法のための概要は、次のステップ:溶解および抽出;全ゲノム増幅(または他の増幅法);DNAの断片化;末端の加工;連結;未完成生成物の除去;および最終精製を含む。下に記載されるのは、多数のそのようなステップについての特定の詳細である。
i.例示的断片化法
増幅試料(例えばWGA試料)は、次の構成要素:1)ソニケーターアセンブリ:2.4メガヘルツ(meghaertz)、Sonaer241V;2)トランスデューサー:金コーティングネブライザークリスタル(gold coated nebulizer crystal)、Sonaer24AU;3)電源:24ボルト電源、Sonaer ST624;および4)蓋:ソニケーター中を封入するために機械加工されたプラスチック、からなるデバイスで断片化されうる。この方法を使用する超音波処理は、15sオン、15sオフの間隔を有する50%負荷サイクルで合計10分間実施されうる。
増幅試料(例えばWGA試料)は、次の構成要素:1)ソニケーターアセンブリ:2.4メガヘルツ(meghaertz)、Sonaer241V;2)トランスデューサー:金コーティングネブライザークリスタル(gold coated nebulizer crystal)、Sonaer24AU;3)電源:24ボルト電源、Sonaer ST624;および4)蓋:ソニケーター中を封入するために機械加工されたプラスチック、からなるデバイスで断片化されうる。この方法を使用する超音波処理は、15sオン、15sオフの間隔を有する50%負荷サイクルで合計10分間実施されうる。
ii.連結反応速度最適化
連結速度は(30分間に生成される最終産物の量における顕著な増加をもたらした)初期条件から最適化された。最適化は、改変緩衝剤構成要素または濃度および改変酵素濃度を含んだ。パラメーターは下の表1に示されている。反応条件は30C、30分間および65C、10分間であった。
連結速度は(30分間に生成される最終産物の量における顕著な増加をもたらした)初期条件から最適化された。最適化は、改変緩衝剤構成要素または濃度および改変酵素濃度を含んだ。パラメーターは下の表1に示されている。反応条件は30C、30分間および65C、10分間であった。
iii.増幅緩衝剤中のWGA酵素の末端加工効率
条件を末端加工効率について検査するために検討した。検査した条件は、反応時間、反応温度、dATP濃度、DTT濃度、PEG濃度、スペリミジン濃度、ポリリジン濃度を含んだ。使用されたパラメーターは、下の表2に示される。使用された反応条件は、37C 5分間、50C、2分間および75C、10分間であった。
条件を末端加工効率について検査するために検討した。検査した条件は、反応時間、反応温度、dATP濃度、DTT濃度、PEG濃度、スペリミジン濃度、ポリリジン濃度を含んだ。使用されたパラメーターは、下の表2に示される。使用された反応条件は、37C 5分間、50C、2分間および75C、10分間であった。
iv.連結反応物のエキソヌクレアーゼ精製
上の表1に示した「条件1」を(ヘアピン/挿入配列にわずかな変更を有して)使用して実施した連結反応物をexoIIIおよびexoVIIを使用して消化した。下に示すヘアピンおよび挿入物の濃度は、連結反応前である。挿入物の大部分は、連結反応中に「最終産物」に転換された。使用した条件は表3に示されている。反応条件は、37C、1時間および70C、10分間であった。
上の表1に示した「条件1」を(ヘアピン/挿入配列にわずかな変更を有して)使用して実施した連結反応物をexoIIIおよびexoVIIを使用して消化した。下に示すヘアピンおよび挿入物の濃度は、連結反応前である。挿入物の大部分は、連結反応中に「最終産物」に転換された。使用した条件は表3に示されている。反応条件は、37C、1時間および70C、10分間であった。
本出願において述べられた全ての刊行物および特許を参照により本明細書に組み込む。本発明の記載された方法および組成物の種々の改変および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は、特定の好ましい実施形態との関連において記載されているが、特許請求される本発明がそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解されるべきである。実際に、本発明を実施するための記載された様式への関連分野の当業者に明らかである種々の改変は、次の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
Claims (18)
- a)生物学的試料の導入のために構成された、添加ポート;
b)前記添加ポートに作動可能に連結した細胞溶解サブサーキットであって、
i)溶解チャンバー、および
ii)溶解緩衝液
を含み、前記溶解チャンバー中の前記生物学的試料を前記溶解緩衝液で溶解して溶解試料を生成するように構成された、細胞溶解サブサーキット;
c)前記溶解サブサーキットに作動可能に連結した核酸抽出サブサーキットであって、
i)前記溶解試料中に存在する核酸に結合するように構成された核酸抽出構成要素、
ii)洗浄緩衝液、および
iii)溶出緩衝液
を含み、抽出核酸の混合物を生成する、核酸抽出サブサーキット;
d)前記核酸抽出サブサーキットに作動可能に連結した増幅サブサーキットであって、
前記抽出核酸の混合物について増幅を実施して増幅核酸を生成するのに有用である、少なくとも1つの増幅関連酵素を含む安定化酵素混合物
を含む、増幅サブサーキット;
e)前記増幅サブサーキットに作動可能に連結した断片化サブサーキットであって、
i)前記増幅核酸を消化して、断片化核酸を生成するように構成された試薬混合物、および/または
ii)前記増幅核酸を機械的に断片化して、断片化核酸を生成するように構成された断片化構成要素
を含む、断片化サブサーキット;並びに
f)前記断片化サブサーキットに作動可能に連結したリンカー連結サブサーキットであって、
i)配列決定方法における使用のために構成された核酸リンカー、および
ii)前記核酸アダプターを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するように構成された連結酵素混合物
を含む、リンカー連結サブサーキット;
を含む、マイクロフリューディックカード。 - 前記核酸配列決定ライブラリー上の前記リンカーにハイブリダイズするように構成されたアンカー核酸配列を含む核酸精製構成要素を含む、前記リンカー連結構成要素に作動可能に連結した精製サブサーキット
をさらに含む、請求項1に記載のマイクロフリューディックカード。 - 前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部分を使用者が回収できるように構成された出口ポートをさらに含む請求項1に記載のマイクロフリューディックカード。
- 前記溶解サブサーキット、前記核酸抽出サブサーキット、前記増幅サブサーキット、前記断片化サブサーキット、および/またはリンカー連結サブサーキットの1つ以上に作動可能に連結した廃棄物チャンバーをさらに含む請求項1に記載のマイクロフリューディックカード。
- 前記安定化酵素混合物がi)BSA、ii)糖,iii)無機塩、iv)二価金属カチオン、v)緩衝剤、vi)乳化剤、およびvii)還元剤をさらに含む請求項1に記載のマイクロフリューディックカード。
- 前記安定化酵素混合物中において、前記BSAが0.05%−3.0%の濃度で存在し、糖が5−35%の濃度で存在し、前記無機塩が1mM−25mMの濃度で存在し、前記二価金属カチオンが1mM−30mMの濃度で存在し、前記緩衝剤が10mM−100mMの濃度で存在し、前記乳化剤が0.01%−0.15%の濃度で存在し、前記還元剤が1mM−10mMの濃度で存在する請求項1から5の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
- 緩衝液および試料を通過させるように構成された処理構成要素をさらに含む請求項1から6の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
- 溶解緩衝液、洗浄緩衝液、溶出緩衝液、安定化酵素混合物、前記増幅核酸を消化するように構成された試薬混合物、および前記連結酵素混合物の1つ以上を含む1つ以上の密封容器をさらに含む請求項1から7の一項に記載のマイクロフリューディックカード。
- (a)請求項1から8の一項に記載のマイクロフリューディックカード;および
(b)連鎖停止シークエンサー、ダイターミネーターシークエンサー、増幅ベースシークエンサー、ピロ配列決定シークエンサー、Supported Oligonucleotide Ligation and Detection(SOLiD)シークエンサー、非増幅ベースシークエンサー、単一分子シークエンサー、ナノポアシークエンサー、合成シークエンサーによるリアルタイム配列決定、ゼロモード導波路(ZMW)を使用する単一分子リアルタイム(SMRT)シークエンサー、ROCHE454シークエンサー、ION TORRENTシークエンサーおよびPacific Biosciencesシークエンサーからなる群より選択される次世代核酸シークエンサー;および
(c)前記マイクロフリューディックカードおよび前記次世代核酸シークエンサーが統合された処理機器
を含む、試料調製および配列決定システム。 - 前記次世代核酸シークエンサーが、ゼロモード導波路、前記核酸リンカーに相補的なオリゴヌクレオチドが固定化されているフローセル、DNAが通過するナノポア、および前記核酸リンカーに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズの1つ以上を含む請求項9に記載の試料調製および配列決定システム。
- (a)生物学的試料を請求項1から8の一項に記載のマイクロフリューディックカードに導入するステップ;
(b)前記生物学的試料の細胞を溶解して、溶解試料を生成するステップ;
(c)前記溶解試料から核酸を抽出して、抽出核酸の混合物を生成するステップ;
(d)抽出核酸の前記混合物について増幅を実施して、増幅核酸を生成するステップ;
(e)前記増幅核酸を断片化して、断片化核酸を生成するステップ;
(f)核酸リンカーを前記断片化核酸に連結して、核酸配列決定ライブラリーを生成するステップ;
(g)前記マイクロフリューディックカードから前記核酸配列決定ライブラリーの少なくとも一部を回収するステップ;および
(h)前記核酸配列決定ライブラリー由来の1つ以上の核酸を配列決定するステップ
を含む、生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)前記核酸リンカーに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ;
(ii)前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ;
(iii)エマルジョンPCRによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施するステップ;
(iv)ビーズを個々のウエルに入れるステップ;
(v)適切なdNTPが前記単一分子に付加される際に検出可能な発光が産生されるように、配列決定酵素および発光レポーターの存在下でdNTPの反復的導入を実施するステップ;および
(vi)前記単一分子の配列を読み取るためにdNTPの前記反復的導入によって産生された前記発光を検出するステップ;
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)前記核酸リンカーに相補的なオリゴヌクレオチドアンカーで覆われたフローセルの表面上に前記核酸配列決定ライブラリーからの核酸分子を捕獲するステップ;
(ii)増幅分子と隣接アンカーとのハイブリッド形成が生じる条件下で前記アンカーをプライマーとして使用して前記核酸分子をPCR増幅して、前記フローセルの前記表面上に架橋構造を形成するステップ;
(iii)前記架橋構造を変性および切断するステップ;
(iv)色素標識転写ターミネーターヌクレオチドを、切断された架橋構造中に可逆的に取り込むステップ;
(v)取り込み後にヌクレオチド蛍光を検出するステップ;
(vi)色素およびターミネーターを除去するステップ;および
(vii)ステップ(iv)から(vi)を反復して、前記核酸分子を配列決定するステップ
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)前記核酸リンカーに相補的なオリゴヌクレオチドを保持しているビーズで前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ;
(ii)前記ビーズを水−油微小胞中に個々に区画化するステップ;
(iii)エマルジョンPCRによって前記単一分子上でクローン性増幅を実施して、鋳型を生成するステップ;
(iv)前記ビーズをフローセルの誘導体化表面上に固定化するステップ;
(v)前記リンカーに相補的なプライマーをアニーリングするステップ;
(vi)1つの照合プローブが前記鋳型に結合する条件下で前記鋳型を標識された照合プローブに暴露するステップ;
(vii)蛍光を検出するステップ;
(viii)前記鋳型由来の前記照合プローブを変性するステップ;および
(ix)ステップ(v)から(viii)を反復し、これにより前記単一分子を配列決定するステップ
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)前記核酸配列決定ライブラリーから単一分子を捕獲するステップ;
(ii)電導性液中に浸漬したナノポアを通して前記単一分子を通過させるステップであって、前記ナノポアの端から端まで電圧がかけられているステップ;および
(iii)前記単一分子が前記ナノポアを通して通過する際に産生される電流を検出するステップ
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)フローセルの表面上のオリゴヌクレオチドに前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子のリンカーを連結するステップ;
(ii)相補的dNTPが前記核酸に付加される条件下で、前記核酸分子に蛍光標識されたdNTPを連続的に付加するステップ;
(iii)取り込まれたdNTPに関連する蛍光を検出するステップ
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - (i)前記核酸配列決定ライブラリー由来の核酸分子を反応溶液中に入れるステップ;
(ii)ゼロモード導波路(ZMW)を前記反応溶液に暴露するステップであって、前記ZMWがその底表面に付着したDNAポリメラーゼを含むステップ;
(iii)明確に標識されたリン酸結合ヌクレオチドを前記反応溶液に添加するステップ;および
(iv)標識されたdNTP残基がZMW中にある時間量に基づいてdNTPの取り込みを検出するステップ
を含む、請求項11に記載の生物学的試料由来の核酸を配列決定する方法。 - 前記リンカーが核酸アダプターである請求項1に記載のマイクロフリューディックカード。
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US13/102,520 | 2011-05-06 | ||
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