JP5985390B2 - 標的核酸にバーコードを付加するためのマルチプライマー増幅方法 - Google Patents

標的核酸にバーコードを付加するためのマルチプライマー増幅方法 Download PDF

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関連出願の相互参照
本願は、２００９年４月２日に出願された先行する米国仮特許出願第６１／１６６，１８１号；２００９年４月２日に出願された先行する米国仮特許出願第６１／１６６，１０５号；２００９年６月１１日に出願された先行する米国仮特許出願第６１／１８６，３２７号；及び２０１０年２月１８日に出願された先行する米国仮特許出願第６１／３０５，９０７号の利益を主張し、これらは全て、本明細書によって全体として参照により援用される。
本発明は、概して特定の標的核酸を検出及び／又は配列決定するためのハイスループットアッセイの分野に関する。特定の実施形態において、本発明は、標的ヌクレオチド配列に１つ又は複数のヌクレオチドタグとバーコードヌクレオチド配列とが付加される増幅方法を提供する。
試料中の特定の核酸配列を検出する能力は、診断及び予測医学、環境、食品及び農業モニタリング、分子生物学研究、並びに他の多くの分野において新規の手法をもたらしてきた。加えて、新規の配列決定方法論が、高速でハイスループットの核酸配列決定を行う手段を提供する。
さらなる方法、特に、試料において広範囲の濃度にわたる多数の標的の分析及び／又は多数の試料の同時分析を促進する方法であれば、大いに有利となる。
マイクロ流体デバイスは、最近までは考えられなかった規模での分析、調製、計測、及び他の操作に関する機能に用いることができる。マイクロ流体デバイスの利点としては、マクロ流体規模で動作する対応機器を代替することに伴う高価な試薬及び試料の節約、高密度及びハイスループットでの試料分析又は合成、肉眼ではほとんど見ることのできないレベルでの流体の精度及び正確さ、並びに空間の節減が挙げられる。サイズの低減及びマイクロ流体デバイスの密度の増加に伴い、ますます入り組んだものとなるデバイス構造に関連して複雑性が増し、技術費及び製造費が高くなる。
最近では、様々な化学的及び生化学的分析及び合成を実行するマイクロ流体システムの開発及び製造に向けて一致した取り組みがなされている。加えて、マイクロ流体デバイスは、自動化されたシステムでの使用に適合させることができる可能性があり、従って人の関与が減るため、さらなるコスト削減及び操作者のミスの減少という追加的な利点がもたらされる。マイクロ流体デバイスは、例えば、キャピラリー電気泳動法、ガスクロマトグラフ法、及び細胞分離法を含む様々な用途における使用が提案されている。
しかしながら、これらの利点は、これまで製造されてきたマイクロ流体デバイスに関連する種々の厄介な問題によって実現が阻まれることが多い。例えば、現行のマイクロ流体デバイスの多くはシリカベースの基板から製造されるが、そうした基板は機械加工が困難で複雑である。結果として、かかる材料から作製される多くのデバイスは脆弱となる。さらに、多くの既存のマイクロ流体デバイスを通じた流体の輸送では、デバイスを通じて流体を制御された形で輸送するために複雑な電界の制御が必要となる。
米国仮特許出願第６１／１６６，１８１号 米国仮特許出願第６１／１６６，１０５号 米国仮特許出願第６１／１８６，３２７号 米国仮特許出願第６１／３０５，９０７号
従って、既存デバイスの現行の制限は別にして、マイクロ流体デバイスで実現することのできる前述の利点をふまえると、様々な化学的及び生化学的分析の実施における使用向けに設計されたマイクロ流体デバイスが依然として必要とされている。現代の生化学におけるその重要性から、特に、様々な核酸増幅反応の実施に利用することができる一方、他のタイプの分析における使用も同様に満足する多用途性を有するデバイスが必要とされている。
核酸増幅を実施する能力を有するデバイスは、多様な有用性を有し得る。例えば、かかるデバイスは、対象とする特定の標的核酸が試料中に存在するか否かを決定する分析ツールとして用いられ得る。このように、デバイスを利用して、特定の病原体（例えば、ウイルス、細菌、又は真菌）の存在についての、及び識別を目的とした（例えば、父子鑑別及び法医学用途）試験が行われ得る。また、かかるデバイスを利用して、既に特定の疾患又は遺伝的障害と関連付けられている特定の核酸の検出又は特性決定も行われ得る。分析ツールとして用いられる場合、デバイスを利用して遺伝子型解析及び遺伝子発現解析（例えば、差次的遺伝子発現試験）もまた実施され得る。或いは、デバイスは、増幅産物の配列決定、細胞型決定、ＤＮＡフィンガープリンティングなどの後続の分析に十分な核酸を増幅する調製的な形で用いられてもよい。増幅産物はまた、後に所望のタンパク質産物を産生するための細胞の形質転換に用いることができるベクターへの挿入など、様々な遺伝子工学用途においても用いることができる。
このようにマイクロ流体工学的な設計及び使用は進歩しているが、マイクロ流体チップの複雑性の低減及びその動作の単純化は有用であり得る。加えて、マイクロ流体デバイスからの反応産物の収集能力の向上が求められている。従って、当該技術分野においては、マイクロ流体デバイスに関する改良された方法及びシステムが必要とされている。
特定の実施形態において、本発明は、複数の試料中の複数の標的核酸を増幅し、タグ付加し、及びバーコード付加する方法を提供する。この方法は、標的核酸毎に増幅混合物を調製するステップを伴う。各増幅混合物は、
標的特異的部分を含むフォワードプライマーと、
標的特異的部分を含むリバースプライマーと（フォワードプライマーは第１のヌクレオチドタグをさらに含み、及び／又はリバースプライマーは第２のヌクレオチドタグをさらに含む）、
バーコードヌクレオチド配列と第１及び／又は第２のヌクレオチドタグ特異的部分とを含む少なくとも１つのバーコードプライマーであって、フォワード及び／又はリバースプライマーより多くあるバーコードプライマーと、
を含む。
各増幅混合物は、増幅に供されると複数の標的アンプリコンを産生し、各標的アンプリコンは、第１及び／又は第２のヌクレオチドタグが標的ヌクレオチド配列に隣接した、タグ付き標的ヌクレオチド配列と、標的アンプリコンの５’又は３’末端にある少なくとも１つのバーコードヌクレオチド配列とを含む。
具体的な実施形態において、フォワードプライマーは第１のヌクレオチドタグをさらに含む。必要であれば、リバースプライマーが第２のヌクレオチドタグをさらに含んでもよい。
タグ付加／バーコード付加方法の特定の実施形態において、増幅混合物中のバーコードプライマーの濃度は、フォワード及び／又はリバースプライマーの濃度の少なくとも４倍である。かかる実施形態の変形例において、増幅混合物中のバーコードプライマーの濃度は、フォワード及び／又はリバースプライマーの濃度の少なくとも５０倍である。
バーコード付加／タグ付加方法の詳細な実施形態において、第１及び／又は第２のヌクレオチドタグ及び／又はバーコードヌクレオチド配列は、標的核酸との実質的なアニーリングを回避するように選択される。例示的実施形態において、バーコードヌクレオチド配列は、特定の試料を識別する。バーコードプライマーがバーコードヌクレオチド配列と第１のヌクレオチドタグ特異的部分とを含む場合、特定の実施形態において、複数のフォワードプライマーが同じ第１のヌクレオチドタグを含む。例えば、異なる試料において複数の標的が増幅される場合、その一組の標的に対応する一組のフォワードプライマーが、全て同じ第１のヌクレオチドタグを有し得る。
バーコード付加／タグ付加方法の詳細な実施形態において、各標的に対応するフォワード及びリバースプライマーは、初めに試料とは別に組み合わせられ、及び各バーコードプライマーが、初めにその対応する試料と組み合わされる。例えば、Ｓ個の試料においてＴ個の標的を増幅する場合（Ｔ及びＳは１より大きい整数である）、この方法は、Ｓ×Ｔ個の増幅混合物を調製するステップであって、初めに組み合わされたフォワード及びリバースプライマーが初めに組み合わされた試料及びバーコードプライマーに加えられるステップをさらに含み得る。
バーコード付加／タグ付加方法の特定の実施形態において、増幅は、第１及び第２のヌクレオチドタグとバーコードヌクレオチド配列とを導入するため少なくとも３サイクルにわたり実施される。これらの実施形態の変形例において、増幅は、５〜５０サイクルにわたり実施される。詳細な実施形態において、増幅は、標的アンプリコンコピー数を標的に関して且つ試料に関して正規化するのに十分なサイクル回数にわたり実施される。
バーコード付加／タグ付加方法の特定の実施形態において、増幅時に産生される標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントは、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。
他の実施形態において、本発明は、バーコードの付加が場合により省略され、標的ヌクレオチド配列が増幅後にタグを付加される方法を提供する。この方法は、典型的には複数の試料中の、複数の標的核酸を増幅するステップを伴う。増幅混合物は標的核酸毎に調製され、各増幅混合物は、
標的特異的配列を含むフォワードプライマーと、
標的特異的配列を含むリバースプライマーと、
を含む。
各増幅混合物は、増幅に供されると複数の標的ヌクレオチド配列を産生する。次に標的ヌクレオチド配列にタグが付加され（例えば、ヌクレオチドタグを標的ヌクレオチド配列の一方又は双方の末端にライゲートすることによる）、複数の標的アンプリコンが産生される。各標的アンプリコンは、標的ヌクレオチド配列に隣接する第１及び／又は第２のヌクレオチドタグを含む。詳細な実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントは、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。
本明細書に記載される増幅方法の特定の実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも７０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。例示的実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも９０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。
様々な実施形態において、標的アンプリコンの平均長さは、少なくとも２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、５００塩基、及び７５０塩基である。例えば、増幅が長距離ＰＣＲによって行われる場合など、より長い平均長さ、例えば１キロベース又はそれ以上である可能性もある。かかる実施形態では、増幅によって標的アンプリコンの少なくとも７０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する標的アンプリコンが得られることもある。
本明細書に記載される方法の利点は、増幅を少量の反応容量で実施し得ることである（しかし、そうすることが必要というわけではない）。詳細な実施形態において、増幅混合物の容量は約１ピコリットル〜約５０ナノリットルの範囲である。特定の実施形態において、増幅混合物の容量は約５ピコリットル〜約２５ナノリットルの範囲である。
本明細書に記載される方法は、場合により、増幅混合物から標的アンプリコンを収集するステップを含み得る。特定の実施形態において、標的アンプリコンは、収集された標的アンプリコンのうち約５０％未満が異なる容量及び／又はコピー数で収集される。収集されたアンプリコンは、さらなる増幅及び／又は分析（例えば、ＤＮＡ配列決定）に用いることができる。いくつかの実施形態において、それが望ましい場合には、少なくとも１つの標的アンプリコンが、第１及び第２のヌクレオチドタグに特異的なプライマーを使用した増幅に供され、バーコードヌクレオチド配列を欠いた標的アンプリコンが産生され得る。
本明細書に記載される方法の詳細な実施形態において、標的核酸はゲノムＤＮＡを含む。これらの実施形態の変形例において、ゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ配列決定、例えば自動ＤＮＡ配列決定を意図したＤＮＡである。
特定の実施形態において、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びバーコードプライマーの１つ又は複数は、少なくとも１つのさらなるプライマー結合部位を含み得る。例えば、バーコードプライマーが用いられる場合、バーコードプライマーは、第１のヌクレオチドタグの上流であるバーコードヌクレオチド配列の上流に、少なくとも第１のさらなるプライマー結合部位を含むことができる。かかる実施形態では、リバースプライマーが、第２のヌクレオチドタグの下流に少なくとも第２のさらなるプライマー結合部位を含むことができる。詳細な実施形態において、標的ヌクレオチド配列を自動ＤＮＡ配列決定により配列決定する場合、第１及び第２のさらなるプライマー結合部位は、ＤＮＡ配列決定プライマーを結合させる能力を有する。
バーコードプライマーが用いられず、標的ヌクレオチド配列が増幅後にタグを付加される場合、第１及び第２のヌクレオチドタグがＤＮＡ配列決定プライマーを結合させる能力を有し得る。
従って、本明細書に記載される方法は、場合により、少なくとも１つの標的アンプリコンをＤＮＡ配列決定に供するステップを含み得る。
特定の実施形態において、本方法は、場合により、増幅混合物中の標的アンプリコンの量を定量化するステップを含み得る。このステップは、例えば自動ＤＮＡ配列決定の前に実施されてもよい。詳細な実施形態において、定量化は、標的アンプリコンを収集するステップと、それらをデジタル増幅に供するステップとを含む。デジタル増幅は、詳細な実施形態において、
予備増幅された標的アンプリコンを個別の反応混合物中に分配するステップであって、各反応混合物が、平均して、反応混合物当たり１個以下のアンプリコンを含むステップと、
反応混合物を増幅に供するステップと、
を含む。
デジタル増幅における定量化は、リアルタイムＰＣＲ及び／又はエンドポイントＰＣＲにより実施されてもよい。
本明細書に記載される増幅方法は、場合により、各試料中に存在する各標的核酸の量を測定するステップを含み得る。特定の実施形態において、本方法は、各試料中にある標的核酸のコピー数の測定において実行することができる。詳細な実施形態において、本方法は、標的核酸に対応する遺伝子座における遺伝子型の決定において実行することができる。他の実施形態において、本方法は、標的核酸の発現レベルの測定において実行することができる。
詳細な実施形態において、本発明はマイクロ流体デバイスに関する。より詳細には、本発明は、反応産物の収集を提供するマイクロ流体デバイスに関する。単に例として、本方法及び装置は、次世代シーケンシング用のライブラリの調製に使用されるＰＣＲ試料調製システムに適用されている。しかしながら、本発明がはるかに広範囲にわたる適用性を有することは認識されるであろう。
本発明のある実施形態によれば、マイクロ流体デバイスが提供される。マイクロ流体デバイスは、複数の第１入力ラインと複数の第２入力ラインとを含む。マイクロ流体デバイスはまた、第１チャンバの複数のセットと、第２チャンバの複数のセットとを含む。第１チャンバの各セットは複数の第１入力ラインのうちの１つと流体連通し、第２チャンバの各セットは複数の第２入力ラインのうちの１つと流体連通している。マイクロ流体デバイスは、複数の第２入力ラインの第１の部分と流体連通する複数の第１ポンプ素子と、複数の第２入力ラインの第２の部分と流体連通する複数の第２ポンプ素子とをさらに含む。
本発明の別の実施形態によれば、アッセイチャンバと試料チャンバと回収ポートとを有するマイクロ流体デバイスの動作方法が提供される。この方法は、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインを閉鎖するステップと、試料入力ラインを介して試料を試料チャンバに流入させるステップと、アッセイ入力ラインを介してアッセイをアッセイチャンバに流入させるステップとを含む。この方法はまた、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインを開放するステップと、試料の少なくとも一部分とアッセイの少なくとも一部分とを組み合わせて混合物を形成するステップと、混合物を反応させて反応産物を形成するステップとを含む。本方法はさらに、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインを閉鎖するステップと、回収ポートから試料チャンバに回収試薬を流すステップと、マイクロ流体デバイスから反応産物を取り出すステップとを含む。
本発明の詳細な実施形態によれば、反応産物の調製方法が提供される。この方法は、Ｍ個の試料を提供するステップと、Ｎ個のアッセイを提供するステップとを含む。この方法はまた、Ｍ個の試料とＮ個のアッセイとを混合してＭ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせを形成するステップも含む。Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせの各々は、密閉容積内に収容される。この方法はさらに、Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせからＭ×Ｎ個の反応産物を形成するステップと、Ｍ×Ｎ個の反応産物を収集するステップとを含む。
本発明を用いることで、従来技術を上回る多くの利点が実現される。例えば、本発明の実施形態は、Ｍ×Ｎ個の試料及びアッセイの混合及び反応と、それに続く試料毎のプール内の反応産物の収集を提供する。加えて、拡張ポンピング（ｄｉｌａｔｉｏｎ ｐｕｍｐｉｎｇ）を利用して実質的に全ての反応産物がマイクロ流体デバイスから取り出され、種々の反応産物プール間には一様性が提供される。本明細書に記載されるシステム及び方法を利用すると、ライブラリの調製に必要な時間及び労力が従来技術と比較して低減される。本発明の以上及び他の実施形態が、その利点及び特徴の多くと共に、以下の本文及び添付の図と併せてさらに詳細に記載される。
本発明は、本発明のある種の特定の実施形態を例示する添付の図面と併せて考慮される以下の説明を参照することにより理解され得る。
例示的な行列型マイクロ流体デバイスを平面図で示す。 キャリア及び反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスの概略斜視図である。 反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスの概略構成図である。 図３に示されるマイクロ流体デバイスのいくつかのユニットセルの概略構成図である。 反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスの概略構成図である。 図５Ａに示されるマイクロ流体デバイスの一部の概略構成図である。 図５Ａに示されるマイクロ流体デバイスのいくつかのユニットセルの概略構成図である。 反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスの動作方法の概略フローチャートである。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスのユニットセルを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスのユニットセルを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスのユニットセルを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスのユニットセルを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを通じた流体フローを示す概略構成図である。 動作中の反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを通じた流体フローを示す概略構成図である。 配列決定前に標的核酸にバーコードを付加するための３−プライマー増幅方法の実施形態を示す。 実施例１に記載されるゲルの写真を示す。レーンは以下のとおりである：（２）分子マーカー、（４）４５４テールで増幅した試料；（５）４５４テールで増幅した試料（ＮＴＣ）；（７）Ａ５プライマー対で増幅した試料；（８）Ａ５プライマー対で増幅した試料（ＮＴＣ）；（１０）３個のプライマーで増幅した試料；及び（１１）３個のプライマーで増幅した試料（ＮＴＣ）。 実施例４においてＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣ（集積流体回路）上で実行した個別の試料の各々について４個のＡｇｉｌｅｎｔ １Ｋ Ｂｉｏｌａｎａｌｙｚｅｒチップから得られたゲル電気泳動図を示す。図の各列は、各試料中のＤＮＡ産物のサイズ分布を示す。全ての試料が同様の産物分布をもたらす。 実施例４による結果を示す。この一組の標的特異的プライマーについての全ＰＣＲ産物の予想サイズ。 実施例４による結果を示す。Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣから得られた試料プールのうちの１つの電気泳動図。単一の産物プール内における産物のサイズ分布。全ての産物が（Ｂ）に示される予想サイズの範囲内にある。 実施例４による結果を示す。４５４配列のランにおいてバーコード当たりにカウントされる配列数。上の水平線は、バーコード当たりの平均カウント数の２倍を表す。下の水平線は、バーコード当たりの平均カウント数の５０％を表す。 実施例４による結果を示す。アンプリコン当たりにカウントされる配列数。プロットの各点は、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣ上の個別のチャンバの配列がシーケンサーで計測された回数を表す。三角形の点は、平均リプレゼンテーションの２倍より大きいＰＣＲ反応物を表す。濃い灰色の点は、平均リプレゼンテーションの０．５倍より小さいＰＣＲ反応物を表す。 実施例４による結果を示す。アンプリコンリプレゼンテーションの度数分布。濃い灰色の線は、所与のリプレゼンテーションで存在するアンプリコン数を表す。薄い灰色の線は、所与のカバレッジで計測され得る読み取り数（例えば２０倍のカバレッジで９８％）を表す。平均の２倍以内のアンプリコンの割合：９５．８％；平均の５倍以内のアンプリコンの割合：９９．７％。 プライマー結合部位とヌクレオチドタグとの種々の組み合わせによる４個のアウタープライマーを使用したマルチプライマー反応設定の例を示す（実施例５）。２個のフォワードバーコードプライマー（４５４Ｂ−ＢＣ−Ｔａｇ８、４５４Ａ−ＢＣ−Ｔａｇ８）及び２個のリバースバーコードプライマー（４５４Ａ−ＢＣ−Ｔａｇ５、４５４Ｂ−ＢＣ−Ｔａｇ８）が、１個のインナープライマー対（Ｔａｇ８−ＴＳＦ及びＴａｇ５−ＴＳＲ）と組み合わされる。 プライマー結合部位とヌクレオチドタグとの種々の組み合わせによる４個のアウタープライマーを使用したマルチプライマー反応設定の例を示す（実施例５）。このＰＣＲ反応により形成された２個の主要なＰＣＲ産物。各末端に４５４−Ａ Ｔａｇ８及び４５４Ａ−Ｔａｇ５又は各末端に４５４Ｂ−Ｔａｇ８及び４５４Ｂ−Ｔａｇ５を含むＰＣＲ産物はＰＣＲ抑制に起因して有意なＰＣＲ産物を産生しない。 図１５Ｂにおけるアンプリコンの各々についての試料の各々におけるプライマー配列の各々のリプレゼンテーションを示す。アンプリコン当たりにカウントされる配列数は、試料中のアンプリコン当たりの平均カウント数に対して正規化した。個別のアンプリコンについての正規化したカウントは、エマルジョンＡ中のＴａｇ５アンプリコン＋エマルジョンＢ中のＴａｇ ８アンプリコンについて、ＡエマルジョンとＢエマルジョンとの間で合計した。中央の濃い灰色の線は各アンプリコンの平均リプレゼンテーションを表す。上の薄い灰色の線は平均カバレッジの２倍を表す。下の薄い灰色の線は平均リプレゼンテーションの５０％を表す。 図１５Ｂにおけるアンプリコンの各々についての試料の各々におけるプライマー配列の各々のリプレゼンテーションを示す。アンプリコン当たりにカウントされる配列数は、試料中のアンプリコン当たりの平均カウント数に対して正規化した。個別のアンプリコンについての正規化したカウントは、エマルジョンＢ中のＴａｇ５アンプリコン＋エマルジョンＡ中のＴａｇ ８アンプリコンについて、ＡエマルジョンとＢエマルジョンとの間で合計した。中央の濃い灰色の線は各アンプリコンの平均リプレゼンテーションを表す。上の薄い灰色の線は平均カバレッジの２倍を表す。下の薄い灰色の線は平均リプレゼンテーションの５０％を表す。 実施例６による結果を示す：Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩシーケンサーにおける使用向けに設計された４−プライマー戦略を使用したＰＣＲ産物の増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の成功例。表１４に掲載されるバーコードプライマーがアウター・ショートと表示される。 実施例８による結果を示す：ＰＣＲ反応が鋳型特異的プライマーのみについて、及び４−プライマーモードで実行されたときの１０組のＰＣＲプライマーの３個のプール（Ａ、Ｂ、Ｃ）のＰＣＲ反応。４−プライマー戦略においてより高分子量の産物が存在することから、４−プライマー構築の成功が実証される。 実施例８による結果を示す：インナープライマーとアウタープライマーとの比を変えると、インナー及びアウタープライマーを使用したマルチプレックス４−プライマーＰＣＲにおける収量に影響する。
特定の実施形態において、本発明は、標的ヌクレオチド配列に１つ又は複数のヌクレオチドタグとバーコードヌクレオチド配列とを付加する増幅方法を提供する。付加された配列は、次にプライマー及び／又はプローブ結合部位として機能することができる。バーコードヌクレオチド配列は、それが結合する標的ヌクレオチド配列に関する情報、例えば、試料由来をコードすることができる。標的ヌクレオチド配列にタグ付加及び／又はバーコード付加を行うと、単一のアッセイで１つ又は複数の標的について分析することのできる試料数が増加する一方、アッセイ費用の増加を最小限に抑えることができる。この方法は、マイクロ流体デバイス上で実行されるアッセイの高効率化に特に良く適している。
詳細な実施形態では、本方法を使用してＤＮＡ配列決定用の核酸が調製され、これは例えば、ＤＮＡ配列決定プライマー用の結合部位を付加し、その後場合によりＤＮＡ配列決定用に試料を較正することによって行われる。特定の例示的実施形態では、本方法を用いることにより、反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスにおいてＤＮＡ配列決定プライマー用の結合部位を付加することができる。このタイプの例示的デバイスでは、拡張ポンピングを利用して実質的に全ての反応産物をマイクロ流体デバイスから取り出すことができ、種々の反応産物プール間の一様性が提供される。従って、容量及びコピー数に関して一様なバーコード付き反応産物のプールを作成することが可能である。様々な実施形態において、容量及び／又はコピー数の一様性とは、容量及び／又はコピー数に関して、デバイスから収集される各プールのばらつきが、約１００パーセント未満、約９０パーセント未満、約８０パーセント未満、約７０パーセント未満、約６０パーセント未満、約５０パーセント未満、約４０パーセント未満、約３０パーセント未満、約２０パーセント未満、約１７パーセント未満、又は約１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４．５、４、３．５、３、２．５、２、１．５、１、又は０．５パーセント未満のものである。当業者は、容量及び／又はコピー数のばらつきが、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲（例えば、約２〜約７パーセント）の中にあり得ることを理解する。例示的実施形態において、マイクロ流体デバイスから収集される容量試料は約１０％以下だけ異なる。標準的なピペッティング誤差は５〜１０％程度である。従って、観察される容量のばらつきは、大部分がピペッティング誤差に起因する。本明細書に記載されるシステム及び方法を利用すると、配列決定ライブラリの調製に必要な時間及び労力が従来技術と比較して低減される。
本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬等は当業者により変更され得るため、本発明がそれらに限定されないことが理解される。また、本明細書で用いられる用語は、特定の例示的実施形態の説明を目的として使用されるに過ぎず、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことも理解される。また、本明細書で使用されるとき、及び添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数形の参照を含むことも注記される。従って、例えば「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」が参照されるとき、それは１つ又は複数の細胞及び当業者に公知のその均等物を参照する。
本発明の実施形態並びにその様々な特徴及び有利な詳細が、添付の図面に記載及び／又は例示され、且つ以下の記載に詳述される非限定的な実施形態及び例を参照して、さらに詳しく説明される。図面に例示される特徴は、必ずしも一定の尺度で描かれているとは限らず、及び当業者は認識するであろうとおり、本明細書で明示的に述べられていない場合であっても、一実施形態の特徴が他の実施形態で用いられ得ることに留意しなければならない。周知されている構成要素及び処理技法についての記載は、本明細書の実施形態が不必要に不明瞭となることのないよう省略されることがある。
定義
特許請求の範囲及び明細書において使用される用語は、特に指示されない限り、以下に記載するとおり定義される。これらの用語は明確にするため具体的に定義されるが、いずれの定義も、それらの用語を当業者が理解するであろうものと一致する。
用語「隣接する」は、本明細書で使用されるとき、核酸中の２個のヌクレオチド配列を指し、０〜約２０ヌクレオチドだけ、より具体的には約１〜約１０ヌクレオチドの範囲で離れているヌクレオチド配列、又は互いに直接接している配列を指すことができる。
用語「核酸」はヌクレオチドポリマーを指し、特に限定されない限り、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で機能（例えば、ハイブリダイズ）することができる天然ヌクレオチドの公知の類似体を含む。
用語の核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡ；通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写又は増幅により得られる、ｍＲＮＡのＤＮＡリプレゼンテーションである相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成的に又は増幅により産生されるＤＮＡ分子；及びｍＲＮＡを含めた、任意の形態のＤＮＡ又はＲＮＡを含む。
用語の核酸は、二本鎖又は三本鎖核酸、並びに一本鎖分子を包含する。二本鎖又は三本鎖核酸では、核酸鎖は同延である必要はない（すなわち、二本鎖核酸は双方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。
用語の核酸はまた、メチル化及び／又はキャッピングによるなどの、その任意の化学修飾も包含する。核酸修飾は、個別の核酸塩基又は全体としての核酸に対してさらなる電荷、分極率、水素結合性、静電相互作用、及び官能性を組み込む化学基の付加を含むことができる。かかる修飾としては、２’位糖修飾、５位ピリミジン修飾、８位プリン修飾、シトシンの環外アミンにおける修飾、５−ブロモウラシルの置換、骨格修飾、イソ塩基のイソシチジン及びイソグアニジンなどの異常塩基対を形成する組み合わせなどの塩基修飾を挙げることができる。
より詳細には、特定の実施形態において、核酸としては、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含む）、及びプリン又はピリミジン塩基のＮ−又はＣ−グリコシドである任意の他の種類の核酸、並びに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、例えばポリアミドポリマー（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））及びポリモルホリノポリマー（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ）からＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）、及びＤＮＡ及びＲＮＡにおいて見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能にする構成の核酸塩基をポリマーが含むことを条件とした他の合成的な配列特異的核酸ポリマーを挙げることができる。用語の核酸はまた連鎖核酸（ｌｉｎｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ：ＬＮＡ）も包含し、これについては米国特許第６，７９４，４９９号明細書、同第６，６７０，４６１号明細書、同第６，２６２，４９０号明細書、及び同第６，７７０，７４８号明細書（それらのＬＮＡの開示について全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。
１つ又は複数の核酸は、核酸を産生する任意の種からの単離を介するなど、固相媒介化学合成などの、生物学的供給源からの完全な化学合成方法によるか、又は分子生物学ツール、例えば、ＤＮＡ複製、ＰＣＲ増幅、逆転写による核酸の操作が関わる方法によるか、又はそれらの方法の組み合わせにより得ることができる。
用語「標的核酸」は、本明細書では、本発明の方法において検出すべき特定の核酸を指して使用される。
本明細書で使用されるとき、用語「標的ヌクレオチド配列」は、標的核酸のヌクレオチド配列を含む分子、例えば、標的核酸又はＲＮＡ標的核酸の逆転写時に産生されるｃＤＮＡを増幅することにより得られる増幅産物を指す。
本明細書で使用されるとき、用語「相補的」は、２個のヌクレオチド間で正確に対形成する能力を指す。すなわち、核酸の所与の位置にあるヌクレオチドが別の核酸のヌクレオチドと水素結合する能力を有する場合、それらの２個の核酸は当該の位置において互いに相補的であると見なされる。２個の一本鎖核酸分子間の相補性は、ヌクレオチドの一部のみが結合する「部分的」なものであってもよく、又はそれらの一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合に完全なものであってもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きい影響を有する。
「特異的ハイブリダイゼーション」は、規定のストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーション混合物中に存在する他のヌクレオチド配列との実質的な結合がない場合の核酸の標的ヌクレオチド配列との結合を指す。当業者は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを緩和することにより配列のミスマッチを許容可能であることを認識する。
詳細な実施形態において、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で実施される。語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、概して、規定のイオン強度及びｐＨにおける特定の配列についての融解温度（Ｔｍ）を約５℃〜約２０℃又は２５℃下回る範囲の温度を指す。本明細書で使用されるとき、Ｔｍは、二本鎖核酸分子の集合が半分に解離されて一本鎖となる温度である。核酸のＴｍの計算方法は当該技術分野において周知である（例えば、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（１９８７年）「ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１５２：ＧＵＩＤＥ ＴＯ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ」、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）、双方とも参照により本明細書に援用される）。標準的な文献に示されるとおり、Ｔｍ値の単純な推定は以下の式により計算することができる：核酸が１ＭのＮａＣｌの水溶液中にあるとき、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ及びＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｆｉｌｔｅｒ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、「ＮＵＣＬＥＩＣ ＡＣＩＤ ＨＹＢＲＩＤＩＺＡＴＩＯＮ」所収（１９８５年）を参照のこと）。ハイブリッドの融解温度（ひいてはストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件）は、プライマー又はプローブの長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）及び標的核酸の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するか、又は固定化されているか等）、並びに塩及び他の構成成分の濃度（例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在又は不在）など、様々な要因によって影響を受ける。これらの要因の影響は周知されており、当該技術分野の標準的な文献において考察がなされている。ほとんどの配列の特異的ハイブリダイゼーションの実現に好適な例示的ストリンジェント条件は、少なくとも約６０℃の温度及びｐＨ７で約０．２モル濃度の塩濃度である。
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短い、概して２００ヌクレオチドより短い、より詳細には１００ヌクレオチドより短い、最も詳細には５０ヌクレオチドより短い核酸を指して用いられる。典型的には、オリゴヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡ分子である。
用語「プライマー」は、核酸とハイブリダイズ（「アニーリング」とも称される）し、且つ適切な緩衝液中、好適な温度において、適切な条件下で（すなわち、４個の異なるヌクレオシド三リン酸と、重合剤、例えばＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素との存在下で）ヌクレオチド（ＲＮＡ又はＤＮＡ）重合の開始部位として働く能力を有するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーの適切な長さは、プライマーの目的とする用途に依存するが、プライマーは、典型的には少なくとも７ヌクレオチド長、及びより典型的には１０〜３０ヌクレオチド、又はさらにより典型的には１５〜３０ヌクレオチドの範囲の長さである。他のプライマーはいくらかより長く、例えば３０〜５０ヌクレオチド長であり得る。これに関連して、「プライマー長」は、オリゴヌクレオチド又は核酸のなかで、相補的な「標的」配列とハイブリダイズし、且つヌクレオチド合成をプライミングする一部分を指す。短鎖プライマー分子は、鋳型との十分に安定したハイブリッド複合体を形成するために、概してより冷温を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分な相補性を有しなければならない。用語「プライマー部位」又は「プライマー結合部位」は、標的核酸のうちプライマーがハイブリダイズするセグメントを指す。
プライマーは、そのプライマー、又はその一部分が別の核酸内のヌクレオチド配列とハイブリダイズする場合、その核酸とアニールすると言われる。プライマーが特定のヌクレオチド配列とハイブリダイズするという記述は、プライマーが完全に又は専らそのヌクレオチド配列とのみハイブリダイズすることを含意するように意図するものではない。例えば、特定の実施形態において、本明細書で使用される増幅プライマーは、「ヌクレオチドタグとアニールする」と言われる。この記載は、そのヌクレオチドタグと全面的にアニールするプライマー、並びにそのヌクレオチドタグと部分的にアニールし、且つ部分的に隣接するヌクレオチド配列、例えば標的ヌクレオチド配列とアニールするプライマーを包含する。かかるハイブリッドプライマーは増幅反応の特異性を高めることができる。
本明細書で使用されるとき、「標的核酸との実質的なアニーリングを回避するための」プライマーの選択とは、予想より短いアンプリコンを産生する標的核酸内部のプライミングから生じるアンプリコンとは対照的に、標的核酸の各末端における予想部位のプライミングから生じるという意味において、増幅後に検出されるアンプリコンの大多数が「完全長」となるようにプライマーが選択されることを意味する。様々な実施形態において、プライマーは、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％が完全長であるように選択される。
用語「プライマー対」は、増幅されるＤＮＡ配列の５’末端の相補体とハイブリダイズする５’側の「上流プライマー」又は「フォワードプライマー」と、増幅される配列の３’末端とハイブリダイズする３’側の「下流プライマー」又は「リバースプライマー」とを含む一組のプライマーを指す。当業者は認識するであろうとおり、用語「上流」及び「下流」又は「フォワード」及び「リバース」は限定を意図するものではなく、むしろ詳細な実施形態において説明的な向きを提供するものである。
「プローブ」は、１つ又は複数の種類の化学結合を介して、概して相補的な塩基対形成を介して、通常は水素結合の形成を介して相補配列の標的核酸と結合する能力を有し、ひいてはデュプレックス構造を形成する核酸である。プローブは「プローブ結合部位」と結合又はハイブリダイズする。プローブを検出可能標識で標識すると、特にプローブがその相補標的とハイブリダイズした後の、プローブの容易な検出を可能とすることができる。しかしながら、或いはプローブは標識されなくともよく、標識されたリガンドと直接的或いは間接的に特異的に結合することによって検出可能とされ得る。プローブのサイズは大きく異なり得る。概して、プローブは少なくとも７〜１５ヌクレオチドの長さである。他のプローブは、少なくとも２０、３０、又は４０ヌクレオチド長である。さらに他のプローブはいくらかより長く、少なくとも５０、６０、７０、８０、又は９０ヌクレオチド長である。いまだ他のプローブはさらにより長く、少なくとも１００、１５０、２００又はそれ以上のヌクレオチド長である。プローブはまた、上記の値を境界とする任意の範囲（例えば、１５〜２０ヌクレオチド長）の中にある任意の長さであってもよい。
プライマー又はプローブは標的核酸配列と完全に相補的であってもよく、又は不完全な相補性であってもよい。特定の実施形態において、プライマーは、標的核酸配列の相補体と少なくとも７ヌクレオチドの配列にわたり、より典型的には１０〜３０ヌクレオチドの範囲の配列にわたり、及び多くの場合に少なくとも１４〜２５ヌクレオチドの配列にわたり少なくとも６５％の同一性を有し、及びさらに多くの場合には少なくとも７５％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、又は少なくとも９５％、９６％、９７％。９８％、又は９９％の同一性を有する。特定の塩基（例えば、プライマーの３’側塩基）は標的核酸配列の対応する塩基と完全に相補的であることが概して望ましいことは理解されるであろう。プライマー及びプローブは、典型的にはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列とアニールする。
用語「ヌクレオチドタグ」は、本明細書では、標的ヌクレオチド配列に付加される所定のヌクレオチド配列を指して使用される。ヌクレオチドタグは、標的ヌクレオチド配列のアイデンティティ又は標的ヌクレオチド配列が由来した試料のアイデンティティなどの、標的ヌクレオチド配列に関する情報項目をコードすることができる。特定の実施形態において、かかる情報は、１つ又は複数のヌクレオチドタグ、例えば２個のヌクレオチドタグの組み合わせにおいてコードされてもよく、標的ヌクレオチド配列のいずれかの末端にある１つが標的ヌクレオチド配列のアイデンティティをコードし得る。
本明細書で使用されるとき、用語「バーコードプライマー」は、そのバーコードプライマーが増幅反応に用いられるときに産生されるアンプリコンに関する情報をコードする特異的バーコードヌクレオチド配列を含むプライマーを指す。例えば、バーコードヌクレオチド配列が、得られるアンプリコンの試料由来を含むように、異なるバーコードプライマーを用いて数多くの異なる試料の各々から１つ又は複数の標的配列を増幅することができる。
本明細書で使用されるとき、用語「コード化反応（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」は、少なくとも１個のヌクレオチドタグが標的ヌクレオチド配列に付加される反応を指す。ヌクレオチドタグは、例えば「コード化ＰＣＲ（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＰＣＲ）」により付加することができ、ここでは少なくとも１個のプライマーが標的特異的部分と標的特異的部分の５’末端に位置するヌクレオチドタグとを含み、及び第２のプライマーが標的特異的部分のみを含むか、又は標的特異的部分と標的特異的部分の５’末端に位置するヌクレオチドタグとを含む。コード化ＰＣＲに適用可能なＰＣＲプロトコルの例示的な例については、係属中の国際公開第ＵＳ０３／３７８０８号パンフレット並びに米国特許第６，６０５，４５１号明細書を参照のこと。ヌクレオチドタグはまた、「コード化ライゲーション（ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｌｉｇａｔｉｏｎ）」反応により付加することもでき、これは少なくとも１個のプライマーが標的特異的部分と標的特異的部分の５’末端に位置するヌクレオチドタグとを含み、及び第２のプライマーが標的特異的部分のみを含むか、又は標的特異的部分と標的特異的部分の５’末端に位置するヌクレオチドタグとを含むライゲーション反応を含み得る。例示的なコード化ライゲーション反応は、例えば、本明細書によって全体として、及び特にライゲーション反応について参照により援用される米国特許出願公開第２００５／０２６０６４０号明細書に記載されている。
本明細書で使用されるとき、「コード化反応」は、標的ヌクレオチド配列に連結されたヌクレオチドタグを含む「タグ付き標的ヌクレオチド配列」を産生する。
本明細書でプライマーの一部分を参照して使用されるとき、用語「標的特異的」ヌクレオチド配列は、好適なアニーリング条件下で標的核酸又は標的ヌクレオチド配列と特異的にアニールすることのできる配列を指す。
本明細書でプライマーの一部分を参照して使用されるとき、用語「ヌクレオチドタグ特異的ヌクレオチド配列」は、好適なアニーリング条件下でヌクレオチドタグと特異的にアニールすることのできる配列を指す。
本教示に係る増幅は、限定なしに、核酸配列を線形的或いは指数関数的に増幅する広範囲にわたる技法を含め、典型的には鋳型依存的な方法で、少なくとも１個の標的核酸の少なくとも一部を複製する任意の手段を包含する。増幅ステップの例示的な実行手段としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、ライゲーションと、その後のＱ−レプリカーゼ増幅、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、超分岐鎖置換増幅、多置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、二段階マルチプレックス増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）などが、それらの複合版及び組み合わせ、例えば限定はされないが、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）−ＣＣＲとしても知られる）なども含め、挙げられる。かかる技法についての記載は、数ある資料のなかでも特に、Ａｕｓｂｅｌら；「ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｄｉｆｆｅｎｂａｃｈ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９９５年）；「Ｔｈｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｂｏｏｋ」、Ｃｈａｎｇ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（２００２年）；Ｍｓｕｉｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ．３４：５０１−０７頁（１９９６年）；「Ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ」、Ｒ．Ｒａｐｌｅｙ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．（２００２年）；Ａｂｒａｍｓｏｎら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９３年２月；４（１）：４１−７頁、米国特許第６，０２７，９９８号明細書；米国特許第６，６０５，４５１号明細書、Ｂａｒａｎｙら、国際公開第９７／３１２５６号パンフレット；Ｗｅｎｚら、国際公開第０１／９２５７９号パンフレット；Ｄａｙら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９（１）：１５２−１６２頁（１９９５年）、Ｅｈｒｌｉｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６４３−５０頁（１９９１年）；Ｉｎｎｉｓら、「ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９０年）；Ｆａｖｉｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：５６１−６４頁（２０００年）；及びＲａｂｅｎａｕら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ２８：９７−１０２頁（２０００年）；Ｂｅｌｇｒａｄｅｒ、Ｂａｒａｎｙ、及びＬｕｂｉｎ、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｔｙｐｉｎｇ Ａｓｓａｙ」、第６回Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ，１９９５年（ワールド・ワイド・ウェブ：ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｇｅｎｅｔｉｃｉｄｐｒｏｃ／ｕｓｓｙｍｐ６ｐｒｏｃ／ｂｌｅｇｒａｄ．ｈｔｍｌ−で利用可能）；ＬＣＲ Ｋｉｔ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ、カタログ番号２００５２０、改訂番号０５０００２、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、２００２年；Ｂａｒａｎｙ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８８−９３頁（１９９１年）；Ｂｉ及びＳａｍｂｒｏｏｋ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２９２４−２９５１頁（１９９７年）；Ｚｉｒｖｉら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２７：ｅ４０ｉ−ｖｉｉｉ（１９９９年）；Ｄｅａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９９：５２６１−６６頁（２００２年）；Ｂａｒａｎｙ及びＧｅｌｆａｎｄ、Ｇｅｎｅ １０９：１−１１頁（１９９１年）；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０：１６９１−９６頁（１９９２年）；Ｐｏｌｓｔｒａら、ＢＭＣ Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．２：１８−（２００２年）；Ｌａｇｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．２００３年２月；１３（２）：２９４−３０７頁、及びＬａｎｄｅｇｒｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７−８０頁（１９８８年）、Ｄｅｍｉｄｏｖ，Ｖ．、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ．２００２年１１月；２（６）：５４２−８頁、Ｃｏｏｋら、Ｊ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、２００３年５月；５３（２）：１６５−７４頁、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１年２月；１２（１）：２１−７頁、米国特許第５，８３０，７１１号明細書、米国特許第６，０２７，８８９号明細書、米国特許第５，６８６，２４３号明細書、国際公開第００５６９２７Ａ３号パンフレット、及び国際公開第９８０３６７３Ａ１号パンフレットにおいて見ることができる。
いくつかの実施形態において、増幅は、以下の逐次的手順の少なくとも１つのサイクルを含む：少なくとも１個の標的核酸における相補的又は実質的に相補的な配列との少なくとも１個のプライマーのアニーリング；ポリメラーゼを使用した鋳型依存的方法でのヌクレオチドの少なくとも１本の鎖の合成；及び新規に形成された核酸二重鎖の変性による鎖の分離。サイクルは繰り返されても、又は繰り返されなくともよい。増幅は熱サイクリングを含むこともでき、又は等温的に行うこともできる。
用語「ｑＰＣＲ」は、本明細書では、「リアルタイムＰＣＲ」又は「動的ポリメラーゼ連鎖反応」としても知られる定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を指して使用される。
「試薬」は、分析物（例えば、分析される核酸）以外の、反応に使用される任意の薬剤を広く指す。核酸増幅反応用の例示的な試薬としては、限定はされないが、緩衝剤、金属イオン、ポリメラーゼ、逆転写酵素、プライマー、鋳型核酸、ヌクレオチド、標識、色素、ヌクレアーゼなどが挙げられる。酵素反応用の試薬としては、例えば、基質、補因子、緩衝剤、金属イオン、阻害薬、及びアクチベータが挙げられる。
用語「ユニバーサル検出プローブ」は、本明細書では、産物中に存在する標的ヌクレオチド配列のアイデンティティにかかわらず、増幅産物の存在を同定する任意のプローブを指して使用される。
用語「ユニバーサルｑＰＣＲプローブ」は、本明細書では、ｑＰＣＲにおける増幅産物の存在を同定する任意のかかるプローブを指して使用される。詳細な実施形態において、本発明に係るヌクレオチドタグは、検出プローブ、例えばユニバーサルｑＰＣＲプローブが結合するヌクレオチド配列を含むことができる。標的ヌクレオチド配列の双方の末端にタグが付加される場合、各タグは、必要であれば、検出プローブによって認識される配列を含むことができる。かかる配列の組み合わせは、そのタグ付き標的ヌクレオチド配列のアイデンティティ又は試料源に関する情報をコードすることができる。他の実施形態では、１つ又は複数の増幅プライマーが、検出プローブ、例えばユニバーサルｑＰＣＲプローブが結合するヌクレオチド配列を含むことができる。このようにすることで、本発明の方法の増幅ステップの間、１個、２個、又はそれ以上のプローブ結合部位を増幅産物に付加することができる。当業者は、予備増幅（実施される場合）を行う間、複数のプローブ結合部位を導入可能であり、増幅により、その所与の増幅混合物又はアリコートにおいて２個以上の異なる増幅産物を検出することのできるマルチプレックス検出が促進されることを認識する。
用語「ユニバーサル検出プローブ」はまた、検出可能標識（例えば、蛍光標識）で標識されたプライマー、並びに非配列特異的プローブ、例えばＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎなどの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）色素を含めたＤＮＡ結合色素を包含することも意図される。
用語「標的特異的ｑＰＣＲプローブ」は、本明細書では、産物中に存在する標的ヌクレオチド配列とのｑＰＣＲプローブのハイブリダイゼーションに基づきｑＰＣＲにおいて増幅産物の存在を同定するｑＰＣＲプローブを指して使用される。
「加水分解プローブ」については、概して、その加水分解プローブの記載について全体として参照により本明細書に援用される米国特許第５，２１０，０１５号明細書に記載されている。加水分解プローブは、典型的にはＰＣＲ反応に使用される耐熱性Ｔａｑポリメラーゼ酵素に存在する５’−ヌクレアーゼ活性を利用する（ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ技法、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ ＣＡ））。加水分解プローブは、フルオレシンなどの蛍光検出色素、及びアクセプター色素又はクエンチャーで標識される。概して、蛍光色素はプローブの５’末端に共有結合し、及びクエンチャーはプローブの３’末端に結合して、プローブが未変化のとき、検出色素の蛍光が蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）によって消光される。プローブは、ＰＣＲ反応において標的核酸の一方の末端を定義するプライマーのうちの１つの下流にアニールする。Ｔａｑ酵素のポリメラーゼ活性を用いると、標的核酸の増幅は、プローブの上流にある１つのプライマーと、プローブの下流にあるが、標的核酸の反対側の鎖とアニールする第２のプライマーとによって誘導される。上流プライマーが伸長されると、Ｔａｑポリメラーゼは標識プローブがアニールされる領域に達し、プローブ−鋳型ハイブリッドを基質として認識し、プローブのリン酸ジエステル結合を加水分解する。加水分解反応によりレポーター色素に対するクエンチャー色素の消光効果が不可逆的に取り除かれ、従って各連続ＰＣＲサイクルの度に検出蛍光の増加がもたらされる。特に、本発明における使用に好適な加水分解プローブは、ヒト及び他のゲノム及び／又はトランスクリプトームにおいて一般的な８ｍｅｒ又は９ｍｅｒのモチーフの検出能を有し得るとともに、連鎖核酸（ＬＮＡ）類似体の使用により可能となる約７０℃の高いＴｍを有し得る。
用語「標識」は、本明細書で使用されるとき、検出可能及び／又は定量化可能なシグナルを提供するために使用することのできる任意の原子又は分子を指す。特に、標識は、直接的又は間接的に、核酸又はタンパク質に結合することができる。プローブに結合することのできる好適な標識としては、限定はされないが、放射性同位元素、フルオロフォア、発色団、質量標識、高電子密度粒子、磁性粒子、スピン標識、ケミルミネッセンスを発する分子、電気化学的に活性な分子、酵素、補因子、及び酵素基質が挙げられる。
用語「色素」は、本明細書で使用されるとき、概して、３４０ｎｍより大きい波長の電磁放射線を吸収する任意の有機又は無機分子を指す。
用語「蛍光色素」は、本明細書で使用されるとき、概して、ランプ、フォトダイオード、又はレーザーなどの電磁放射線源による照射時に蛍光機構によってより長い波長の電磁放射線を発する任意の色素を指す。
用語「エラストマー」は、当該技術分野で用いられる一般的な意味を有する。従って、例えばＡｌｌｃｏｃｋら（「Ｃｏｎｔｅｍｐｏｒａｒｙ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第２版）は、エラストマーについて、概してそのガラス転移温度と液化温度との間の温度で存在するポリマーとして記載している。高分子鎖はねじれ運動を受け易く、従って力に応じて骨格鎖が解けることが可能であり、力がない場合に骨格鎖は反動して以前の形をとるため、エラストマー材料は弾性特性を呈する。一般に、エラストマーは力が加わると変形するが、次に力が取り除かれるとその元の形に戻る。
「多型マーカー」又は「多型部位」は、ヌクレオチド配列の相違が現れる遺伝子座である。例示的マーカーは少なくとも２個の対立遺伝子を有し、各々が、特定の集団の１％より高い頻度で、及びより典型的には１０％又は２０％より高い頻度で現れる。多型部位は、１個の塩基対ほどの小ささであり得る。多型マーカーとしては、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、高変異反復配列（ＶＮＴＲ）、超可変領域、ミニサテライト、ジヌクレオチド反復、トリヌクレオチド反復、テトラヌクレオチド反復、単純配列反復、欠失、及びＡｌｕなどの挿入エレメントが挙げられる。初めに同定された対立形質が任意に基準形質として指定され、他の対立形質が代替又は変異対立遺伝子として指定される。特定の集団内で最も高頻度で出現する対立形質は、時に野生型形質と称されることもある。二倍体生物は対立形質についてホモ接合体か、又はヘテロ接合体であり得る。二対立遺伝子多型は２つの形質を有する。三対立遺伝子多型は３つの形質を有する。
「一塩基変異多型」（ＳＮＰ）は、単一のヌクレオチドによって占有される多型部位に起こり、これは対立遺伝子配列間で異なる部位である。この部位は、通常は対立遺伝子の高度に保存された配列（例えば、集団の１／１００又は１／１０００未満のメンバーにおいて異なる配列）が先行し、及びそれが後続する。ＳＮＰは通常、多型部位においてあるヌクレオチドが別のヌクレオチドと置換されるために生じる。塩基転移は、あるプリンの別のプリンによる置換、又はあるピリミジンの別のピリミジンによる置換である。塩基転換は、プリンのピリミジンによる、又はその逆の置換である。ＳＮＰはまた、基準の対立遺伝子に対するヌクレオチドの欠失又はヌクレオチドの挿入によっても生じ得る。
増幅方法
概要
詳細な実施形態において、本発明は、複数（例えば、少なくとも３個）の選択されたヌクレオチド配列を１つ又は複数の標的核酸に導入するための増幅方法を提供する。この方法は、典型的には複数の試料中の、複数の標的核酸を増幅するステップを伴う。例示的実施形態において、同じ一組の標的核酸を２つ以上の異なる試料の各々において増幅することができる。試料はいずれかの形で互いに異なることができ、例えば試料は、異なる組織、対象、環境供給源等に由来し得る。少なくとも３個のプライマーを使用して各標的核酸を増幅することができ、すなわち：フォワード及びリバース増幅プライマーであり、各プライマーが標的特異的部分を含み、一方又は双方のプライマーがヌクレオチドタグを含む。標的特異的部分は、好適なアニーリング条件下で標的に特異的にアニールすることができる。フォワードプライマーのヌクレオチドタグは、リバースプライマーのヌクレオチドタグと同じ、又は異なる配列を有し得る。概して、ヌクレオチドタグは標的特異的部分の５’側である。第３のプライマーは、バーコードヌクレオチド配列と、第１及び／又は第２のヌクレオチドタグ特異的部分とを含むバーコードプライマーである。バーコードヌクレオチド配列は、そのバーコードプライマーが増幅反応に用いられるときに産生されるアンプリコンに関する情報をコードするように選択された配列である。タグ特異的部分は、フォワード及びリバースプライマー中の一方又は双方のヌクレオチドタグに特異的にアニールすることができる。バーコードプライマーは概してタグ特異的部分の５’側である。
バーコードプライマーは、典型的には増幅混合物中にフォワード及び／又はリバースプライマーより多く存在する。より具体的には、バーコードプライマーがフォワードプライマーのヌクレオチドタグとアニールする場合、バーコードプライマーは、概してフォワードプライマーより多く存在する。バーコードプライマーがリバースプライマーのヌクレオチドタグとアニールする場合、バーコードプライマーは、概してリバースプライマーより多く存在する。それぞれの場合に、増幅混合物中の第３のプライマー、すなわち、それぞれリバースプライマー又はフォワードプライマーが、例示的実施形態においてはバーコードプライマーの濃度とほぼ同様の濃度で存在し得る。概してバーコードプライマーは実質的に過剰に存在する。例えば、増幅混合物中のバーコードプライマーの濃度は、フォワード及び／又はリバースプライマーの濃度に対して少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも３０倍、少なくとも３５倍、少なくとも４０倍、少なくとも４５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０３倍、少なくとも５×１０３倍、少なくとも１０４倍、少なくとも５×１０４倍、少なくとも１０５倍、少なくとも５×１０５倍、少なくとも１０６倍、又はそれ以上であり得る。加えて、バーコードプライマーの濃度過剰は、上記の値のいずれかを端点として有する任意の範囲（例えば、２倍〜１０５倍）の中にあり得る。例示的実施形態において、バーコードプライマーがフォワードプライマー上のヌクレオチドタグに特異的なタグ特異的部分を有する場合、フォワードプライマーはピコモル濃度からナノモル濃度、例えば、約５ｐＭ〜５００ｎＭ、約５ｐＭ〜１００ｎＭ、約５ｐＭ〜５０ｎＭ、約５ｐＭ〜１０ｎＭ、約５ｐＭ〜５ｎＭ、約１０ｐＭ〜１ｎＭ、約５０ｐＭ〜約５００ｐＭ、約１００ｐＭ又はこれらの値のいずれかを端点として有する任意の他の範囲（例えば、１０ｐＭ〜５０ｐＭ）で存在し得る。フォワードプライマーのこれらの濃度のいずれかとの組み合わせで用いられ得るバーコードプライマーの好適な例示的濃度としては、約１０ｎＭ〜約１０μＭ、約２５ｎＭ〜約７．５μＭ、約５０ｎＭ〜約５μＭ、約７５ｎＭ〜約２．５μＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約２５０ｎＭ〜約７５０ｎＭ、約５００ｎＭ又はこれらの値のいずれかを端点として有する任意の他の範囲（例えば、１００ｎＭ〜５００ｎＭ）が挙げられる。フォワード及びバーコードプライマーのかかる濃度を使用した増幅反応において、リバースプライマーはバーコードプライマーと同程度の（例えば、約１０倍以内の、約５倍以内の、又は等しい）濃度を有する。
各増幅混合物は、増幅に供すると、タグ付き標的ヌクレオチド配列を含む標的アンプリコンであって、各々が標的ヌクレオチド配列に隣接する第１及び第２のヌクレオチドタグと、標的アンプリコンの５’又は３’末端（標的アンプリコンの一方の鎖に対して）にある少なくとも１つのバーコードヌクレオチド配列とを含む標的アンプリコンを産生することができる。特定の実施形態において、第１及び第２のヌクレオチドタグ及び／又はバーコードヌクレオチド配列は、標的核酸との実質的なアニーリングを回避するように選択される。かかる実施形態において、タグ付き標的ヌクレオチド配列は、以下のエレメントを有する分子を含むことができる：５’−（バーコードヌクレオチド配列）−（フォワードプライマーからの第１のヌクレオチドタグ）−（標的ヌクレオチド配列）−（リバースプライマーからの第２のヌクレオチドタグ配列）−３’又は５’−（フォワードプライマーからの第１のヌクレオチドタグ）−（標的ヌクレオチド配列）−（リバースプライマーからの第２のヌクレオチドタグ配列）−（バーコードヌクレオチド配列）−３’。
例示的実施形態において、バーコードヌクレオチド配列は特定の試料を識別する。従って、例えば、Ｓ個の試料の各々において一組のＴ個の標的核酸を増幅することができる（式中、Ｓ及びＴは、典型的には１より大きい整数である）。かかる実施形態において、増幅は、各試料について別々に実行することができ、ここで各試料に対して同じ一組のフォワード及びリバースプライマーが使用され、その一組のフォワード及びリバースプライマーは、その組の中の全プライマーに共通する少なくとも１個のヌクレオチドタグを有する。各試料について異なるバーコードプライマーを使用してもよく、ここでバーコードプライマーは異なるバーコードヌクレオチド配列を有するが、共通のヌクレオチドタグにアニールすることのできる同じタグ特異的部分を有する。この実施形態は、複数の標的配列について産生されるアンプリコンに試料由来をコードするために合成が必要となり得る異なるプライマーの数が低減されるという利点を有する。或いは、各試料について異なる一組のフォワード及びリバースプライマーが用いられてもよく、ここで各組は、他の組のプライマーと異なるヌクレオチドタグを有し、及び各試料について異なるバーコードプライマーが使用され、ここでバーコードプライマーは、異なるバーコードヌクレオチド配列と異なるタグ特異的部分とを有する。いずれの場合にも、増幅によって各試料から、試料特異的バーコードを有するＴ個のアンプリコンの組が産生される。
各試料に対して同じ一組のフォワード及びリバースプライマーが使用される実施形態において、各標的に対するフォワード及びリバースプライマーは、初めに試料とは別に組み合わせることができ、及び各バーコードプライマーを、初めにその対応する試料と組み合わせることができる。次に、初めに組み合わせたフォワード及びリバースプライマーのアリコートを、初めに組み合わせた試料及びバーコードプライマーのアリコートに加え、Ｓ×Ｔ個の増幅混合物を生成することができる。これらの増幅混合物は、増幅に好適な条件に供することのできる任意の物品において形成することができる。例えば、増幅混合物は、マイクロ流体デバイスの個別の画室内で形成するか、又はそこに分配された後、増幅することができる。好適なマイクロ流体デバイスとしては、例示的実施形態において、以下に記載されるものなどの行列型マイクロ流体デバイスが挙げられる。
任意の増幅方法を用いて増幅混合物からアンプリコンを産生することができる。例示的実施形態ではＰＣＲが用いられる。増幅は、概して、第１及び第２のヌクレオチドタグとバーコードヌクレオチド配列とを導入するため、少なくとも３サイクルにわたり実施される。様々な実施形態において、増幅は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０サイクル、又はこれらの値のいずれかを端点として有する範囲（例えば５〜１０サイクル）の中にある任意の数のサイクルにわたり実施される。詳細な実施形態において、増幅は、標的アンプリコンコピー数を標的に関して且つ試料に関して正規化するのに十分なサイクル回数（例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０サイクル、又はこれらの値のいずれかを端点として有する範囲の中にある任意の数のサイクル）にわたり実施される。
上述される方法の特定の実施形態は実質的に一様な増幅を提供し、アンプリコンの大多数が、複数の標的アンプリコンについて計算される平均コピー数に比較的近いレベルで存在する複数の標的アンプリコンを生じる。従って、様々な実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、又は少なくとも９９パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。
本発明はまた、特定の実施形態において、複数の標的ヌクレオチドの増幅方法も提供し、ここでバーコードの付加は場合により省略され、標的ヌクレオチド配列は増幅後にタグが付加される。より具体的には、本発明は、典型的には複数の試料中の、複数の標的核酸を増幅する方法であって、標的核酸毎に増幅混合物を調製するステップを伴う方法を提供する。各増幅混合物は、標的特異的配列を含むフォワードプライマーと、標的特異的配列を含むリバースプライマーとを含む。増幅混合物は、増幅に供されると複数の標的ヌクレオチド配列を産生する。次に標的ヌクレオチド配列にタグが付加され、複数の標的アンプリコンであって、各々が標的ヌクレオチド配列に隣接する第１及び／又は第２のヌクレオチドタグを含む標的アンプリコンが産生される。この方法は複数の標的アンプリコンを産生し、ここで標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントは、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。この方法の様々な実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、又は少なくとも９９パーセントは、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する。
様々な実施形態において、増幅される標的ヌクレオチド配列は、例えば、２５塩基、５０塩基、１００塩基、２００塩基、５００塩基、又は７５０塩基であり得る。上記の方法の特定の実施形態では、長距離ＰＣＲなどの長距離増幅方法を用いて増幅混合物からアンプリコンを産生することができる。長距離ＰＣＲは、１キロベース又は数キロベース（ｋｂ）から５０ｋｂを上回るまでの範囲の標的ヌクレオチド配列の増幅が可能である。様々な実施形態において、長距離ＰＣＲにより増幅される標的ヌクレオチド配列は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、又は５０ｋｂの長さである。標的ヌクレオチド配列はまた、これらの値のいずれかを端点として有する任意の範囲（例えば、２５塩基〜１００塩基又は５〜１５ｋｂ）の中にあってもよい。上記の方法における長距離ＰＣＲの使用は、いくつかの実施形態において、標的アンプリコンの少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、又は少なくとも７０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する複数の標的アンプリコンを生じる。
長距離ＰＣＲは当該技術分野において周知である。例えば、Ｃｈｅｎｇ Ｓ、Ｆｏｃｋｌｅｒ Ｃ、Ｂａｒｎｅｓ ＷＭ、Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ（１９９４年６月）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｎｇ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｒｏｍ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｓｅｒｔｓ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１（１２）：５６９５−９頁を参照のこと。本明細書に記載される方法における使用に好適な長距離ＰＣＲ用の酵素、プロトコル、及びキットは市販されている；例としては：ＳｅｑｕａｌＰｒｅｐ（商標）Ｌｏｎｇ ＰＣＲ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）、ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標）ＩＩ Ｆｕｓｉｏｎ ＨＳ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｆｌａｓｈ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）が挙げられる。
特定の実施形態において、標的アンプリコンは増幅混合物から収集することができる。例えば、各反応チャンバの内容物が収集可能であるよう適合された行列型マイクロ流体デバイス（下記参照）を増幅に用いて標的アンプリコンを生成することができる。これらの実施形態の変形例において、標的アンプリコンは、さらなる増幅及び／又は分析に供することができる。例えば、第１及び第２のヌクレオチドタグに特異的なプライマーを使用して１個又は複数の標的アンプリコンを増幅に供し、バーコードヌクレオチド配列を欠いた標的アンプリコンを産生することができる。特定の実施形態において、増幅混合物中で産生される標的アンプリコンの量は、例えば定量的リアルタイムＰＣＲによる増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）中に、又は増幅後に、定量化することができる。
詳細な実施形態において、上記の増幅方法を用いて自動ＤＮＡ配列決定に好適なアンプリコンを産生することができる。特に、上記のとおりの、標的ヌクレオチド配列の実質的に一様な増幅を提供するこの方法の能力は、良好なカバレッジを有するＤＮＡ配列決定ライブラリの調製に役立つ。自動ＤＮＡ配列決定との関連において、用語「カバレッジ」は、配列決定時に配列が計測される回数を指す。実質的に一様なカバレッジを有するＤＮＡ配列決定ライブラリは、同様にカバレッジが実質的に一様な配列データをもたらし得る。従って、様々な実施形態において、本明細書に記載されるとおり調製された複数の標的アンプリコンの自動配列決定を実行すると、標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントの配列は、標的アンプリコン配列の平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコン配列の平均コピー数の２倍未満で存在する。この方法の様々な実施形態において、標的アンプリコン配列の少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９１、少なくとも９２、少なくとも９３、少なくとも９４、少なくとも９５、少なくとも９６、少なくとも９７、少なくとも９８、又は少なくとも９９パーセントが、標的アンプリコン配列の平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコン配列の平均コピー数の２倍未満で存在する。
ＤＮＡ配列決定用の核酸の調製
多くの現行のＤＮＡ配列決定技法は、「合成による配列決定」に頼るものである。これらの技法は、ライブラリ作成、ライブラリ分子の大規模並行ＰＣＲ増幅、及び配列決定を伴う。ライブラリ作成は、試料核酸を適切なサイズの断片に変化させて、断片の末端にアダプター配列をライゲートし、及びアダプターが適切に追加された分子を選択することから始まる。ライブラリ分子の末端にアダプター配列が存在することにより、ランダム配列インサートの増幅が可能となる。ヌクレオチド配列にタグを付加するための上記の方法は、以下にさらに詳細に記載されるとおり、ライゲーションに代替してアダプター配列を導入することができる。
詳細な実施形態において、大規模並行ＰＣＲステップで産生されるライブラリＤＮＡ分子の数は、２個の分子が同じ担体、例えば同じビーズ（４５４ＤＮＡシーケンシングにおいて）又は同じ表面パッチ（Ｓｏｌｅｘａ ＤＮＡシーケンシングにおいて）に結合する可能性を低くするには十分に少なく、しかし増幅された配列の収量がハイスループットの提供を満足するには十分な多さである。以下でさらに考察されるとおり、好適なアダプター配列の導入後、合成による配列決定の前にデジタルＰＣＲを用いてライブラリＤＮＡ分子の数を較正することができる。
ＤＮＡ配列決定プライマーの核酸への付加
配列決定するＤＮＡは、任意のタイプのＤＮＡであってよい。詳細な実施形態において、ＤＮＡは生物由来のゲノムＤＮＡである。かかる実施形態の変形例において、生物から採取した試料又はＤＮＡライブラリから得られる全ゲノムＤＮＡが、配列決定用に調製される。
上記のとおり、少なくとも３個のプライマーを用いて配列決定用のＤＮＡが調製される：フォワードプライマー、リバースプライマー、及びバーコードプライマー。しかしながら、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びバーコードプライマーの１つ又は複数が、少なくとも１つのさらなるプライマー結合部位を含む。具体的な実施形態において、バーコードプライマーが、第１のヌクレオチドタグ特異的部分の上流であるバーコードヌクレオチド配列の上流に少なくとも第１のさらなるプライマー結合部位を含む。特定の実施形態において、フォワードプライマー、リバースプライマー、及びバーコードプライマーのうちの２つが、少なくとも１つのさらなるプライマー結合部位を含む（すなわち増幅時に産生されるアンプリコンは、ヌクレオチドタグ配列、バーコードヌクレオチド配列、及び２個のさらなる結合部位を含むことになる）。例えば、バーコードプライマーがバーコードヌクレオチド配列の上流に第１のさらなるプライマー結合部位を含む場合、具体的な実施形態において、リバースプライマーが第２のヌクレオチドタグの下流に少なくとも第２のさらなるプライマー結合部位を含み得る。次に増幅によって以下のエレメントを有する分子が生じる：５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（バーコードヌクレオチド配列）−（フォワードプライマーからの第１のヌクレオチドタグ）−（標的ヌクレオチド配列）−（リバースプライマーからの第２のヌクレオチドタグ）−（第２のさらなるプライマー結合部位）−３’。具体的な実施形態において、第１及び第２のさらなるプライマー結合部位はＤＮＡ配列決定プライマーを結合させる能力を有し、上記に考察されるとおり、試料由来を指示することのできるバーコードを含め、アンプリコン全体の配列決定を促進する。
いくつかの実施形態では、３個より多いプライマーを用いて所望のエレメントを標的ヌクレオチド配列に付加することができる。例えば、４個のプライマーを用いて、上記で考察したものと同じ５個のエレメントに加え、任意のさらなるバーコードを有する分子、例えば、５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（バーコードヌクレオチド配列）−（フォワードプライマーからの第１のヌクレオチドタグ）−（標的ヌクレオチド配列）−（リバースプライマーからの第２のヌクレオチドタグ）−（さらなるバーコードヌクレオチド配列）−（第２のさらなるプライマー結合部位）−３’を産生することができる。例示的な４−プライマーの実施形態では、フォワードプライマーが標的特異的部分と第１のヌクレオチドタグとを含み、及びリバースプライマーが標的特異的部分と第２のヌクレオチドタグとを含む。これらの２個のプライマーが一体となって「インナープライマー」を構成する。他の２個のプライマーが、インナープライマーに存在する第１及び第２のヌクレオチドタグにアニールする「アウタープライマー」である。一方のアウタープライマーはバーコードプライマーであり、第１のヌクレオチドタグ特異的部分の上流であるバーコードヌクレオチド配列の上流に少なくとも第１のさらなるプライマー結合部位を含み得る（すなわち、前段落で考察したものと同じバーコードプライマー）。第２のアウタープライマーは、第２のタグ特異的部分、さらなるバーコードヌクレオチド配列、及びその下流の、第２のさらなるプライマー結合部位を含み得る。
３個より多いプライマーからエレメントを組み込む増幅は、１つ又は複数の増幅反応物で実施することができる。例えば、４−プライマー増幅は１つの増幅反応物で実施することができ、ここには４個のプライマー全てが存在する。或いは、４−プライマー増幅は、例えば２つの増幅反応物で実施することができる：１つはインナープライマーを組み込み、及び別の増幅反応物がアウタープライマーを組み込む。４個全てのプライマーが１つの増幅反応物中に存在する場合、アウタープライマーは、概して反応混合物中に過剰に存在する。フォワード及び／又はリバースプライマーに対するバーコードプライマーについて上記に示した相対濃度値は、一段階の４−プライマー増幅反応におけるインナープライマーに対するアウタープライマーの相対濃度にも適用される。
４−プライマー増幅反応の例示的実施形態において、アウタープライマーの各々は固有のバーコードを含む。例えば、あるバーコードプライマーは、エレメント５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコードヌクレオチド配列）−（第１のヌクレオチドタグ）−３’から構成されることができ、及び第２のバーコードプライマーが、エレメント５’−（第２のさらなるプライマー結合部位）−（第２のバーコードヌクレオチド配列）−（第２のヌクレオチドタグ）−３’から構成されることができる。この実施形態において、個数（Ｊ）の第１のバーコードプライマーを個数（Ｋ）の第２のバーコードプライマーと組み合わせてＪ×Ｋ個の固有の増幅産物を作成することができる。
本発明のさらなる例示的実施形態において、４個より多いプライマーを単一の反応物に組み合わせて、異なる組み合わせのさらなるプライマー結合部位、バーコード配列、及びヌクレオチドタグを付加することができる。例えば、以下のエレメント：５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコードヌクレオチド配列）−（第１のヌクレオチドタグ）−３’、５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコードヌクレオチド配列）−（第２のヌクレオチドタグ）−３’、５’−（第２のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコードヌクレオチド配列）−（第１のヌクレオチドタグ）−３’、５’−（第２のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコードヌクレオチド配列）−（第２のヌクレオチドタグ）−３’を含むアウターバーコードプライマーを上記のとおりのインナー標的特異的プライマーと組み合わせて、所望のアンプリコン配列とのあらゆる組み合わせのバーコードプライマーを含む増幅産物プールを産生することができる。
本発明の他の例示的実施形態では、上記の組み合わせのいずれかにおけるアウターバーコードプライマー、又は当業者に明らかであろう他の組み合わせを、同じ第１及び第２のヌクレオチドタグ配列を有する標的プライマー配列の１つより多い対と組み合わせることができる。例えば、同じ第１のヌクレオチドタグと組み合わせた最大１０個の異なる標的特異的フォワードプライマー配列と、同じ第２のヌクレオチドタグと組み合わせた最大１０個の異なる標的特異的リバースプライマー配列とを含むインナープライマーを、最大２個又は最大４個のアウターバーコードプライマーと組み合わせて、上記のとおりの複数の増幅産物を生成することができる。様々な実施形態において、同じ第１のヌクレオチドタグ及び第２のヌクレオチドタグを有する少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも５００個、少なくとも１０００個、少なくとも２０００個、少なくとも５０００個又は少なくとも１００００個の異なる標的特異的プライマー対を最大２個又は最大４個のアウターバーコードプライマーと組み合わせて、複数の増幅産物を生成し得る。
本発明の方法は、任意の利用可能なＤＮＡ配列決定方法を用いて少なくとも１つの標的アンプリコンをＤＮＡ配列決定に供するステップを含むことができる。詳細な実施形態にでは、複数の標的アンプリコンはハイスループットシーケンシング法を用いて配列決定される。かかる方法は、典型的にはインビトロクローニングステップを用いて個々のＤＮＡ分子を増幅する。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）は、油相内にある水性液滴中に、プライマーで被覆されたビーズと共に個々のＤＮＡ分子を分離する。ＰＣＲによりＤＮＡ分子のコピーが産生され、それらがビーズ上のプライマーに結合し、続いて後の配列決定のために固定化される。ｅｍＰＣＲは、Ｍａｒｇｕｉｌｉｓら（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）により市販される）、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ及びＰｏｒｒｅｃａら（「ポロニーシーケンシング」としてもまた公知である）及びＳＯＬｉＤシーケンシング（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、ＣＡ））による方法において用いられる。Ｍ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓら（２００５年）「Ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｉｃｏｌｉｔｒｅ ｒｅａｃｔｏｒｓ」 Ｎａｔｕｒｅ ４３７：３７６−３８０頁；Ｊ．Ｓｈｅｎｄｕｒｅら（２００５年）「Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ Ｐｏｌｏｎｙ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ａｎ Ｅｖｏｌｖｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｏｍｅ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９（５７４１）：１７２８−１７３２頁を参照のこと。インビトロクローン増幅はまた、固体表面に結合させたプライマー上で断片を増幅する「ブリッジＰＣＲ」により実施することもできる。Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙらが単一分子法（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）により市販される）を開発しており、これはこの増幅ステップを省略し、ＤＮＡ分子を表面に直接固定するものである。Ｉ．Ｂｒａｓｌａｖｓｋｙら（２００３年）「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃａｎ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｓｉｎｇｌｅ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」 Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ １００：３９６０−３９６４頁。
表面に物理的に結合しているＤＮＡ分子は、並行して配列決定することができる。ダイターミネーション電気泳動シーケンシングのような「合成による配列決定」は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して塩基配列を決定する。可逆的ターミネーター法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｒｐ．、（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）により市販される）は、可逆版のダイターミネーターを使用するもので、一度に１個のヌクレオチドを加え、ブロック基を繰り返し取り除くことによって別のヌクレオチドの重合を可能にすることにより、リアルタイムで各位置の蛍光を検出する。「パイロシーケンシング」もまたＤＮＡ重合を使用し、一度に１個のヌクレオチドを加え、結合したピロリン酸塩が遊離することによって放たれる光を介して所与の位置に加わったヌクレオチドを検出し、その数を定量化する（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、（Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴ）により市販される）。Ｍ．Ｒｏｎａｇｈｉら（１９９６年）「Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｒｅｌｅａｓｅ」 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２：８４−８９頁を参照のこと。
デジタルＰＣＲによる試料調製
いくつかの実施形態において、試料は増幅デバイス、例えばＰＣＲプレート又はマイクロ流体デバイスに、ウェル又はチャンバ当たり平均１個未満の増幅鋳型を含む試料濃度でロードされる。デバイスの各ウェル又はチャンバは、それが好適なタグ付き標的特異的プライマーと、フォワード及びリバースバーコードプライマーの固有の組み合わせとを含むように調製される。例えば、あるウェルは、エレメント５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（第１のバーコード配列）−（第１のヌクレオチドタグ）−３’、５’−（第２のさらなるプライマー結合部位）−（第２のバーコード配列）−（第２のヌクレオチドタグ）−３’を含むバーコードプライマーを含み得る。第２のウェル又はチャンバは、エレメント５’−（第１のさらなるプライマー結合部位）−（第３のバーコード配列）−（第１のヌクレオチドタグ）−３’、５’−（第２のさらなるプライマー結合部位）−（第４のバーコード配列）−（第２のヌクレオチドタグ）−３’を含むバーコードプライマーを含み得る。各ウェルで産生された増幅産物は、それらのウェルにロードされたバーコード配列の組み合わせによって固有に標識され得る。
デジタルＰＣＲによる試料較正
詳細な実施形態において、例えばＤＮＡライブラリからの、上記の方法を用いた標的アンプリコンの産生数は、デジタル増幅方法を用いて較正することができる。このステップは、合成による配列決定用のＤＮＡの調製に特定の用途が見出される。「デジタルＰＣＲ」の考察については、例えば、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ及びＫｉｎｚｌｅｒ、１９９９年、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９６：９２３６−４１頁；ＭｃＢｒｉｄｅら、米国特許出願公開第２００５０２５２７７３号明細書、特に実施例５（これらの刊行物の各々は、本明細書によって全体として、及び特にデジタル増幅のそれらの開示について、参照により援用される）を参照のこと。デジタル増幅法は、典型的には多数の及び／又は高密度の小容積反応サイト（例えば、ナノ容積の反応サイト又は反応チャンバ）を含むマイクロ流体デバイスなどの、デジタルＰＣＲに好適な特定のハイスループットデバイスを利用することができる。例示的実施形態において、デジタル増幅は、マイクロ流体デバイス、例えば以下に記載されるデジタルアレイマイクロ流体デバイスを使用して実行される。デジタル増幅は、反応／アッセイプラットフォーム又はマイクロ流体デバイスに配置される数百から数千の反応混合物への試料の分配又は分割を伴い得る。かかる実施形態では、反応物のほとんどが鋳型分子を含まず、陰性の増幅結果を示すように、多数の別個の増幅反応物にわたって試料の限界希釈が行われる。例えば反応のエンドポイントにおける陽性の増幅結果数のカウントでは、入力試料中に存在する個々の鋳型分子が一つ一つカウントされる。デジタル増幅の大きい利点は、定量化が増幅効率のばらつきと無関係であることである−実際の産物量に関わらず、成功した増幅が１分子としてカウントされる。
特定の実施形態において、デジタル増幅は、試料核酸を予備増幅した後に実施され得る。典型的には、デジタル増幅前の予備増幅は、限られた回数の熱サイクル（例えば、５サイクル、又は１０サイクル）にわたり行われる。特定の実施形態において、予備増幅の間の熱サイクル回数は、約４〜１５回の熱サイクル、又は約４〜１０回の熱サイクルの範囲であってもよい。特定の実施形態において熱サイクル回数は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回、又は１５回より多い回数であり得る。ＤＮＡ配列決定用にアダプター配列を含むアンプリコンを産生する上記の増幅を、典型的な予備増幅ステップに代用することができる。
デジタル増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）方法は、本明細書によって全体として、及び特にデジタル増幅方法及びデバイスのその開示について参照により援用される２００９年９月２４日に出願された米国特許出願公開第２００９０２３９３０８号明細書に記載されている。概して、デジタル増幅では、同一の（又は実質的に同様の）増幅反応が、ゲノムＤＮＡなどの核酸試料に対して実行される。所与の核酸試料に対する個々の反応の回数は、約２回から１，０００，０００回を上回るまで異なり得る。典型的には、試料に対して実行される反応の回数は、約１００回以上、より典型的には約２００回以上、及びさらにより典型的には約３００回以上である。大規模デジタル増幅もまた行うことができ、ここで試料に対して実行される反応の回数は、約５００回以上、約７００回以上、約７６５回以上、約１，０００回以上、約２，５００回以上、約５，０００回以上、約７，５００回以上、又は約１０，０００回以上である。反応の実行回数はまた著しく多くてもよく、例えば、ゲノム試料当たりのアッセイが最大約２５，０００回、最大約５０，０００回、最大約７５，０００回、最大約１００，０００回、最大約２５０，０００回、最大約５００，０００回、最大約７５０，０００回、最大約１，０００，０００回、又はさらには１，０００，０００回より多くてもよい。
詳細な実施形態において、デジタル増幅に供される核酸の分量は、概して、個別の反応混合物に分配されたときに各個別の増幅反応物に含まれる増幅可能な核酸が１個以下であると予測されるように選択される。当業者は、上記のとおり産生される１個又は複数の標的アンプリコンの濃度を決定し、デジタル増幅に使用する適切な量を計算することができる。より好都合には、１個又は複数の標的アンプリコンの一組の段階希釈物を試験することができる。例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．から１２．７６５ デジタルアレイマイクロ流体デバイスとして市販されるデバイスは、１２個の異なる希釈物を同時に試験することが可能である。場合により、線形回帰プロットを作成することにより好適な希釈を判断することができる。最適な希釈については、線は直線で、原点を通るはずである。続いて元の試料の濃度をプロットから計算することができる。
１個又は複数の標的アンプリコンの適切な分量は、各反応物に含まれる容量当たりのアンプリコンが例えば平均約１個以下となるように、個別の場所又は反応ウェル若しくはチャンバに分配され得る。１個又は複数の標的アンプリコンは、分配する前又はその後に、定量的又は非定量的増幅用に選択された試薬と組み合わせることができる。
分配後、反応混合物は増幅に供され、標的アンプリコンを含む反応混合物が同定される。任意の増幅方法を用いることができ、しかし好都合には、ＰＣＲ、例えばリアルタイムＰＣＲ又はエンドポイントＰＣＲが使用される。この増幅では、１個又は複数の標的アンプリコンを増幅可能な任意のプライマーを用いることができる。従って、詳細な実施形態において、プライマーは、前の増幅ステップで導入されたプライマー結合部位にアニールするＤＮＡ配列決定プライマーであってもよい。
任意の標的アンプリコンの濃度（コピー／μＬ）は、陽性の（すなわち、増幅産物を含む）反応混合物の数と相関する。あらゆる目的から、及び特にデジタルＰＣＲ結果の分析について参照により援用される「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ」と題される同時係属中の米国特許出願第１２／１７０，４１４号明細書を参照のこと。また、あらゆる目的から、及び特にデジタルＰＣＲ結果の分析について参照により援用されるＤｕｂｅら、２００８年、「Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ ａ ＤＮＡ Ｓａｍｐｌｅ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｏｎ ａ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ」 ＰＬｏＳ ＯＮＥ ３（８）：ｅ２８７６．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００２８７６も参照のこと。
デジタルＰＣＲによるＤＮＡ配列決定のための試料較正の例示的実施形態において、ほぼ１００〜３６０個／μｌのアンプリコンを含むＰＣＲ反応混合物が、以下に記載されるＦｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の１２．７６５ デジタルアレイマイクロ流体デバイスなどのデジタルアレイマイクロ流体デバイスにロードされ得る。マイクロ流体チップは１２個のパネルを有し、各パネルが７６５個のチャンバを含む。ライブラリの初期濃度の絶対的定量を得るため、デジタルチップ上の複製物パネルをアッセイすることができる。配列決定には、９〜１２％の（又はそれより低い）典型的な（複製物間の）相対変動係数を有する希釈試料が用いられ得る。例えば、Ｗｈｉｔｅ ＩＩＩ ＲＡ、Ｂｌａｉｎｅｙ ＰＣ、Ｆａｎ ＣＨ、Ｑｕａｋｅ ＳＲ、「Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ａｂｓｏｌｕｔｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １０：１１６ ｄｏｉ：１０．１１８６／１４７１−２１６４−１０−１１６を参照のこと。
試料核酸
核酸（「試料」）の調製物は、生物学的供給源から得て、当該技術分野において公知の従来の方法を用いて調製することができる。特に、本明細書に記載される方法において有用なＤＮＡ又はＲＮＡは、細菌、原虫、真菌、ウイルス、細胞小器官、並びに植物又は動物などの高等生物、特に哺乳動物、より詳細にはヒトを含めた任意の供給源から抽出及び／又は増幅することができる。好適な核酸はまた、環境供給源（例えば、池水）、人工製品（例えば、食品）、法医学試料などから得ることもできる。核酸は、細胞、体液（例えば、血液、血液画分、尿等）、又は組織試料から様々な標準的技術のいずれかによって抽出又は増幅することができる。例示的な試料としては、血漿、血清、髄液、リンパ液、腹水、胸水、口腔液、及び皮膚の外側切片の試料；気道、腸管、生殖管、及び尿路からの試料；涙液、唾液、血球細胞、幹細胞、又は腫瘍の試料が挙げられる。例えば、胎児ＤＮＡの試料は胚又は母体血から得ることができる。試料は生物の生体若しくは死体から得ることも、又はインビトロ培養物から得ることもできる。例示的試料としては、単細胞、パラフィン包埋組織試料、及び針生検を挙げることができる。本発明において有用な核酸はまた、ｃＤＮＡ、コスミド、ＹＡＣ、ＢＡＣ、Ｐ１、ＰＡＣライブラリなどを含め、１つ又は複数の核酸ライブラリから得ることもできる。
対象とする核酸は、当該技術分野において周知の方法を用いて単離することができ、特定の方法の選択は、供給源、核酸の性質、及び同様の要因に依存する。試料核酸は純粋な形態である必要はないが、典型的には本発明の方法の増幅ステップを実行可能とするには十分に純粋である。標的核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡは当該技術分野において公知の、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」 Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第１、２、３巻（１９８９年）に記載されるとおりの標準方法によりｃＤＮＡに逆転写され得る。次にｃＤＮＡは、本発明の方法により分析することができる。
標的核酸
本発明（本明細書に記載される）のコード化反応においてタグを付加することのできる任意の標的核酸は、本発明の方法を用いて検出することができる。典型的な実施形態では、標的核酸について少なくとも一部のヌクレオチド配列情報は既知であり得る。例えば、用いられるコード化反応がＰＣＲである場合、所与の標的核酸の各末端について、好適な増幅プライマーの設計を可能とするのに十分な配列情報が、概して利用可能である。代替的実施形態において、プライマー中の標的特異的配列が、ランダム又は縮重ヌクレオチド配列に置き換えられてもよい。
標的としては、例えば、ウイルス、細菌、原虫、又は真菌などの病原体；ＲＮＡ、例えば、その過剰又は過小発現が疾患の指標となるもの、組織又は発生特異的な形で発現するもの；又は特定の刺激によって誘導されるもの；例えば遺伝子タイピングにおいて、特定の多型（ＳＮＰなど）、対立遺伝子、又はハプロタイプについて分析することができるゲノムＤＮＡに関連する核酸を挙げることができる。特に、遺伝性疾患又は他の病態において変化する（例えば、増幅、欠失、及び／又は変異する）ゲノムＤＮＡ；望ましい、又は望ましくない形質に関連する配列；及び／又は個人を一意的に識別する配列（例えば、法医学又は父子鑑別の判定において）に関心がもたれる。
プライマー設計
核酸増幅に好適なプライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分な長さである。プライマーの正確な長さ及び組成は、例えば、アニーリング反応の温度、プライマーの供給源及び組成、及びプローブが用いられる場合、プローブアニーリング部位のプライマーアニーリング部位に対する近接性及びプライマー：プローブの濃度比を含む多くの要因に依存し得る。例えば、標的核酸配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には約１５〜約３０個の範囲のヌクレオチドを含むが、より多くの、又はより少ないヌクレオチドを含んでもよい。プライマーは、そのそれぞれの鎖と選択的にアニールして安定したデュプレックスを形成するのに十分な相補性を有しなければならない。当業者には、対象とする標的核酸の増幅に適切なプライマー対をどのように選択すべきかは周知されている。
例えば、ＰＣＲプライマーは、任意の市販のソフトウェア又はオープンソースソフトウェア、例えばＰｒｉｍｅｒ３を使用することにより（例えば、Ｒｏｚｅｎ及びＳｋａｌｅｔｓｋｙ（２０００年）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１３２：３６５−３８６頁；ｗｗｗ．ｂｒｏａｄ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｎｏｄｅ／１０６０などを参照のこと）、又はＲｏｃｈｅ ＵＰＬウェブサイトにアクセスすることにより設計することができる。ＵＰＬプローブ配列を角括弧で括ってアンプリコン配列をＰｒｉｍｅｒ３プログラムに入力すると、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラムが角括弧で括られたプローブ配列の両側でプライマーを設計することが確実となる。
プライマーは、例えば、クローニング及び適切な配列の制限、又はＮａｒａｎｇら（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９頁のリン酸トリエステル法；Ｂｒｏｗｎら（１９７９年）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：１０９−１５１頁のリン酸ジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら（１９８１年）Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９−１８６２頁のジエチルホスホラミダイト法；米国特許第４，４５８，０６６号明細書の固形担体法などの方法による直接的な化学合成を含め、任意の好適な方法により調製されてもよく、又は供給業者から提供されてもよい。
プライマーは、Ｓｅｐｈａｄｅｘカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ））又は当業者に公知の他の方法を使用して精製されてもよい。プライマーの精製により本発明の方法の感度が向上し得る。
マイクロ流体デバイス
特定の実施形態において、本発明の方法のいずれも、マイクロ流体デバイスを使用して実施することができる。例示的実施形態において、デバイスは行列型マイクロ流体デバイスであり、別個の独立した反応チャンバにおいて複数の基質溶液を試薬溶液と同時に組み合わせることが可能なものである。基質溶液は１つ又は複数の基質を含み得るとともに、試薬溶液は１つ又は複数の試薬を含み得ることは認識されるであろう。例えば、マイクロ流体デバイスは、複数の異なる増幅プライマーと試料とを同時にペアワイズで組み合わせることが可能であり得る。特定の実施形態において、デバイスは、異なるチャンバの各々において異なる組み合わせのプライマー及び試料を収容するように構成される。様々な実施形態において、別個の反応チャンバの数は、５０個より多く、通常１００個より多く、より多くの場合には５００個より多く、さらにより多くの場合には１０００個より多く、及び時に５０００個より多く、又は１０，０００個より多くてもよい。
詳細な実施形態において、行列型マイクロ流体デバイスはダイナミックアレイ（「ＤＡ」）マイクロ流体デバイスであり、その例が図１に示される。ＤＡマイクロ流体デバイスは、試料と試薬（例えば、増幅プライマー、検出プローブ等）とのペアワイズの組み合わせを隔離するように設計された行列型マイクロ流体デバイスであり、定性的ＰＣＲ反応、及びリアルタイム定量的ＰＣＲ分析を含めた定量的ＰＣＲ反応の実施に好適である。いくつかの実施形態において、ＤＡマイクロ流体デバイスは、少なくとも一部において、エラストマーで作製される。ＤＡマイクロ流体デバイスについては、国際公開第０５１０７９３８Ａ２号パンフレット（「Ｔｈｅｒｍａｌ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄ Ｆｏｒ Ｕｓｉｎｇ Ｔｈｅ Ｓａｍｅ」）及び米国特許出願公開第２００５０２５２７７３Ａ１号明細書（双方とも、ＤＡマイクロ流体デバイスのそれらの記載について全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。ＤＡマイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスの層間の流体連通路を利用して、デバイス中及び層間に制御ライン及び流体ラインを張り巡らせる高密度行列設計を組み込み得る。エラストマーブロックの複数の層に流体ラインがあるため、高密度の反応セル構成が可能となる。或いはＤＡマイクロ流体デバイスは、試薬チャネル及び試料チャネルの全てが同じエラストマー層中にあって、制御チャネルが異なる層にあるように設計されてもよい。
米国特許出願公開第２００８／０２２３７２１号明細書及び国際公開第０５／１０７９３８Ａ２号パンフレットは、本明細書に記載される方法の実施に用い得る例示的な行列型デバイスについて記載している。後者の図２１が図１として再現され、中に形成された流体チャネルを各々が有する第１のエラストマー層２１１０（第１の層）と第２のエラストマー層２１２０（第２の層）とを有する例示的な行列設計を示す。例えば、第１の層２１１０における試薬流体チャネルは、通路２１３０を介して第２の層２１２０における試薬流体チャネルに接続され、一方、第２の層２１２０はそこに試料チャネルも有し、その試料チャネルと試薬チャネルとは、それぞれ試料及び試薬チャンバ２１８０で終端となる。試料及び試薬チャンバ２１８０は接合部チャネル２１５０を介して互いに流体連通しており、接合部チャネル２１５０は、反応セル２１６０のチャンバ２１８０の各々の間の流体連通を制御するようにそれと連係した接合部バルブ（ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｖａｌｖｅ）２１４０を有する。使用時、接合部は初めに閉鎖され、次に試薬入口から試薬チャネル内に試薬が導入され、及び試料入口を介して試料チャネル内に試料が導入される；次に封鎖バルブ（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ ｖａｌｖｅ）２１７０が閉鎖されて各反応セル２１６０が他の反応セル２１６０と隔離される。反応セル２１６０が隔離され、接合部バルブ２１４０が開放されると、試料チャンバと試薬チャンバとが互いに流体連通するようになり、従って所望の反応が起こり得る。以上から（及び国際公開第０５／１０７９３８Ａ２号パンフレットの記載から）、Ｍ個の異なる試料をＮ個の異なる試薬と反応させるためにＤＡマイクロ流体デバイスを使用し得ることは明らかであろう。
国際公開第０５／１０７９３８号パンフレットにおける上記のＤＡマイクロ流体デバイスは、本明細書に記載される方法の実施に非常に適しているが、本発明はいかなる特定のデバイス又は設計にも限定されるものではない。試料を分割する、及び／又は試薬と試料との独立したペアワイズの組み合わせを可能にする任意のデバイスを使用し得る。米国特許出願公開第２００８０１０８０６３号明細書（本明細書によって全体として参照により援用される）は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｃａｌｉｆ．）から入手可能な市販のデバイスである４８．４８ダイナミックアレイＩＦＣ（集積流体回路）を示す図を含む。例えば、４８×９６；９６×９６；３０×１２０；等、他の構成が可能であり、企図されることは理解されるであろう。
具体的な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、デジタル増幅の実行に適合したデジタルアレイマイクロ流体デバイスであり得る。かかるデバイスは、試料及び試薬の混合物をナノリットル容積の反応チャンバに分割する統合されたチャネル及びバルブを有し得る。いくつかの実施形態において、デジタルアレイマイクロ流体デバイスは、少なくとも一部において、エラストマーで作製される。例示的なデジタルアレイマイクロ流体デバイスが、「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｃｏｐｙ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ Ｕｓｉｎｇ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ」と題される米国特許出願第１２／１７０，４１４号明細書などの、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ，Ｉｎｃ．が所有する同時係属中の米国特許出願に記載される。例示的な実施形態の一つは、デバイスに対する１２個の別個の試料入力に対応した１２個の入力ポートを有し得る。デバイスは１２個のパネルを有し、１２個のパネルの各々が、パネル当たり４．５９μの総容量となる７６５個の６ｎＬ反応チャンバを含み得る。マイクロ流体チャネルが、パネル上の様々な反応チャンバを流体源に接続し得る。反応チャンバを流体源に接続するバルブを開閉するため、圧力がアキュムレータに加えられ得る。例示的実施形態では、試料と試薬との混合物をロードするため１２個の入口が提供され得る。４８個の入口を使用して試薬の供給源を提供してもよく、アキュムレータに圧力が加えられると、試薬がバイオチップに供給される。加えて、２個以上の入口を提供してバイオチップに補水をもたらしてもよい。補水入口はデバイスと流体連通しており、反応チャンバに関連する湿度の制御を促進する。当業者は理解するであろうとおり、デバイスの作製に利用することのできる一部のエラストマー材料はガス透過性であり、反応チャンバからの気化ガス又は蒸気がエラストマー材料を通過して周囲大気中に抜けることが可能である。詳細な実施形態において、デバイスの周縁部分に位置する流体ラインは、反応チャンバのパネルを取り囲むバイオチップの周縁部分に補水液、例えば緩衝液又はマスターミックスの遮蔽を提供し、従って反応チャンバ内に存在する液体の蒸発が低減又は防止される。従って、デバイスの周縁部分における湿度は、揮発性液体、例えば水を補水入口に加えることにより増加させることができる。特定の実施形態において、第１の入口は、バイオチップの第１の側にあるパネルを取り囲む補水流体ラインと流体連通しており、及び第２の入口は、バイオチップの他の側にあるパネルを取り囲む補水流体ラインと流体連通している。
デジタルアレイマイクロ流体デバイスは本明細書に記載されるデジタル増幅方法の実施に非常に適しているが、当業者は、これらのデバイスに対する多くの変形例及び代替例を認識するであろう。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ．（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）から市販されている１２．７６５ダイナミックアレイであるマイクロ流体デバイスは１２個のパネルを含み、各々が反応チャンバ当たり６ｎＬの容積の７６５個の反応チャンバを有する。しかしながら、この幾何構造が本明細書に記載されるデジタル増幅方法に必須というわけではない。所与のデジタルアレイマイクロ流体デバイスの幾何構造は特定の用途に依存し得る。本明細書に記載される方法での使用に好適なデバイスに関するさらなる記載が、デジタルアレイマイクロ流体デバイスのその開示について参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２５２７７３号明細書に提供される。
特定の実施形態において、本明細書に記載される方法は、反応産物の収集を提供するマイクロ流体デバイスを使用して実行することができる。かかるデバイスが、２００９年４月２日に出願された同時係属中の米国仮特許出願第６１／１６６，１０５号明細書に詳細に記載されており、これは本明細書によって全体として、及び特に反応産物の収集が可能なマイクロ流体デバイス及び関連する方法のその記載について参照により援用される。例えば、配列決定前にＤＮＡ試料を較正するためのデジタルＰＣＲ方法をかかるデバイスで実行することにより増幅産物の収集を可能とすることができ、次にそれらの増幅産物を、ＤＮＡ配列決定用の鋳型として供することができる。
図２は、本発明の実施形態に係るキャリア及びマイクロ流体デバイスの概略斜視図である。図２に示されるとおり、キャリア１００は、デジタルアレイマイクロ流体デバイスとも称され得るマイクロ流体デバイス１１０を支持する。キャリア１００は、キャリアの様々な要素に好適な機械的支持を提供する材料で作製され得る。例として、キャリアはプラスチック又は他の好適な材料を使用して作製される。キャリアの外側部分は標準的な３８４ウェルマイクロプレートと同じフットプリントを有することができ、独立したバルブ動作が可能である。加えて、キャリア１００は従来の独立型サーマルサイクラーと適合性を有する。以下に記載されるとおり、キャリア１００の第１の側に４８個の試料入力ポート１２０が位置し、及びキャリアの反対側に４８個のアッセイ入力ポート１２２が位置する。試料入力ポート１２０及びアッセイ入力ポート１２２のバンクはキャリアの上面に対して陥凹している。これらの陥凹した特徴を利用して、試料入力ポート又はアッセイ入力ポートの全てに対して同時に圧力を加え、入力ポートと、マイクロ流体デバイス１１０上に存在する通路、流体入力ライン、又はそれらの組み合わせのいずれかとを接続する流体ライン１４０を通じてそれぞれのポートに存在する流体を流動させることができる。試料はコードされたプライマーを含んでもよく、及びアッセイはまた、アンプリコン特異的（ＡＳ）プライマーとも称され得る。
キャリア１００はまた４つの供給源１３０、１３２、１３４、及び１３６も含み、これらはマイクロ流体デバイスに存在する制御ラインを作動させるために用いられ得る。ある実施形態では、供給源１３０、１３２、及び１３４を使用して、マイクロ流体デバイスに存在するバルブを開閉させるよう動作する制御ラインが加圧される。例えば、供給源１３２に対して大気圧より大きい圧力を加えると、その結果、供給源１３２に存在する液体がマイクロ流体デバイス上に存在する制御ラインに流れ込み、それによりバルブが作動し、同様にマイクロ流体デバイス上に存在する１つ又は複数の流体入力ラインを通じた流れを遮断するよう動作する。ある実施形態では、供給源１３０は、回収試薬を入れる流体ウェルとして使用される。供給源１３０に圧力が加えられると、回収試薬がキャリア上に提供される流体ラインを通じて押し流され、マイクロ流体デバイス上に提供される流体ラインに至り得る。従って、供給源１３０に圧力を加える結果、マイクロ流体デバイスを通じた回収試薬又は他の好適な流体のフローが生じ得る。供給源１３０〜１３６と流体連通する制御ラインには、接合部バルブ、封鎖バルブ、拡張ポンピングに使用されるバルブ用の制御ライン、回収試薬のフロー用の流体ラインなどが含まれ得る。詳細な実施形態において、バルブ１が供給源１３２により制御され、バルブ２が供給源１３４により制御され、回収試薬が供給源１３０に提供され、及び補水試薬が供給源１３６に提供される。この特定の実施形態において、接合部バルブは供給源１５０により制御され、及び封鎖バルブは供給源１５２により制御される。この特定の実施形態は本発明を限定することを意図するものではなく、単に一構成例の提供を意図しているに過ぎない。特定の用途に対する必要に応じて他の構成が利用されてもよい。
図３に関連してさらに詳しく記載されるとおり、キャリア１００上に存在する流体ライン１４０は、マイクロ流体デバイス１１０上に存在する１つ又は複数の流体ラインと流体連通している。これらの流体ラインは、流体をマイクロ流体デバイスの中に、及びそこから外に移送する働きをすることができ、又はマイクロ流体デバイス上に存在するバルブを作動させる制御ラインとして使用してされ得る。このように、試料入力ポート１２０又はアッセイ入力ポート１２２に提供される流体は、マイクロ流体デバイスの適切な流体入力ライン及びチャンバにロードすることができる。供給源１３０〜１３６に提供される他の流体（例えば、液体）もまた、マイクロ流体デバイスの流体入力ライン又は制御ラインのいずれかにロードすることができる。マイクロ流体デバイスのチャンバからの反応産物は、それらがマイクロ流体デバイス上の流体ラインを通じて圧送され、キャリア上に存在する流体ライン１４０に戻って試料入力ポート１２０又はアッセイ入力ポート１２２に入ることで、収集することができる。
圧力アキュムレータ１５０及び１５２を利用して他の制御ラインを加圧し、マイクロ流体デバイスの補水を提供してもよく、又はいくつかの実施形態では圧力アキュムレータ１５０及び１５２は使用されなくともよい。図２に示される本発明の実施形態では４８個の試料入力ポート及び４８個のアッセイ入力ポートが示されるが、これは本発明の要件ではない。他の実施形態では、特定の用途に応じて異なる数の試料及びアッセイが利用される。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
図３は、本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの概略構成図である。マイクロ流体デバイス２００は、流体入力ライン２１２に接続される通路２１０を含み、流体入力ライン２１２は、２４個の異なる試料に流体流路を提供するために使用される。２４個の試料は、図１に示される試料入力ポート１２０の一部にロードすることができ、通路２１０及び流体入力ライン２１２を通じて流れ、図４に示されるとおりの試料入力ライン３１２、及び最終的には試料チャンバ３１０に至る。マイクロ流体デバイス２００はまた、流体入力ライン２２２に接続される通路２２０も含み、流体入力ライン２２２は、２１個の異なるアッセイに対する流体流路を提供するために使用される。マイクロ流体デバイスのなかでアッセイ入力流体ラインと反対側にある通路２５０が、補水、制御ラインの作動、又は他の好適な動作を提供する。マイクロ流体デバイスのアレイ部分２３０が図４に（部分的に）示される。アレイ部分２３０では、試料及びアッセイが試料及びアッセイチャンバにロードされ、次に混合されてペアワイズの組み合わせを形成することができる。
本明細書全体を通じてさらに詳しく記載されるとおり、試料とアッセイとが混合されて反応した後、反応産物は、流体入力ライン２１２を通じて、図４に示されるとおりのマイクロ流体デバイスのアレイ部分２３０を通じて、及び出力流体ライン２４０及び通路２４２を通じて収集流体を流すことにより、マイクロ流体デバイスから収集することができる。これらの出力流体ラインは、キャリア上に提供される出力ポートと流体連通している。このように、試料と様々なアッセイの各々との組み合わせからプールされた反応産物が、独立した出力流体ライン２４０の各々を通じて別個に提供される。
図３に示される特定の数の試料及びアッセイ入力ラインは単に例として提供され、特定の実施態様がそれらの特定の数に限定されるものではない。他の実施形態において、マイクロ流体デバイスにおける試料及びアッセイのさらなるペアワイズの組み合わせを促進するため、さらなる試料及びアッセイ入力ラインが提供される。
図４は、図３に示されるマイクロ流体デバイスのいくつかのユニットセルの概略構成図である。図４では、明確にするため、アレイ部分２３０からの４個のユニットセルが示される。図３に示されるとおり、試料入力ライン３１６は流体入力ライン２１２と流体連通し、及びアッセイ入力ライン３１８はアッセイ入力ライン２２２と流体連通している。マイクロ流体デバイスのユニットセルセクションは、試料チャンバ３１０とアッセイチャンバ３１２とを含む。接合部バルブ３３０が開放位置にあるとき、流体ライン３１４が試料チャンバとアッセイチャンバとの間に流体連通を提供する。特定の実施形態において、試料入力ライン３１６は、マイクロ流体デバイスのなかの、試料チャンバを含む層の下にある層に提供される。同様にして、アッセイ入力ライン３１８は、マイクロ流体デバイスのなかの、アッセイチャンバを含む層の下にある層に提供される。試料は、図３に示される試料入力ライン２１２から試料入力ライン３１６に流れ、試料入力ライン３１６から試料チャンバ３１０に通じる１つ又は複数の通路（図示せず）を通って上る。試料入力ライン３１６は、流体が試料チャンバに送られるときに３本の入力ラインに分岐するものとして示されるが、この特定の数は本発明の要件ではなく、他の本数の試料入力ライン、例えば、１本の入力ライン、２本、４本の、又は４本より多い試料入力ラインが利用されてもよい。試料チャンバと対応するアッセイチャンバとを接続する３本の流体ライン３１４にも同様の設計基準が適用される。試料入力ライン３１６は図の行方向に連続流路を提供し、複数の試料チャンバ間、例えば上側の行の試料チャンバ又は下側の行の試料チャンバ間での単一の試料の均等な分配を可能にする。
接合部バルブ３３０及び封鎖バルブ３４０を利用して、試料チャンバの各々を他の試料チャンバ並びにアッセイチャンバの各々から隔離することができる。アッセイチャンバは、封鎖バルブを使用して他のアッセイチャンバから隔離することができる。隔離バルブ及び封鎖バルブの双方とも、キャリア上に存在する対応する制御ラインに圧力を加えることによるか、又は他の手段、例えば静電アクチュエーションにより作動される。
図４はアッセイ入力ライン３１８を示し、これは、図３に示されるアッセイ入力ライン２２２からアッセイチャンバ３１２にアッセイのフローを提供する。封鎖バルブが開放位置にあるとき、アッセイはアッセイ入力ラインからアッセイチャンバ３１２に流れることが可能である。特定の実施形態において、アッセイは、試料チャンバの充填と同様の方法で、入力ラインとアッセイチャンバとを接続する通路を通じて流れる。マイクロ流体デバイスの列に沿ったアッセイのロードにより、試料の各列に異なるアッセイが提供され、Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせがもたらされる。
接合部バルブ３３０を開放することで、試料とアッセイとをペアワイズの組み合わせとして自由界面拡散により混合することが可能となる。試料とアッセイとが混合した後、熱サイクリングを実行して反応産物を形成することができる。反応産物は、回収バルブ３５０を開放し、それによって試料入力ラインのうち試料チャンバに隣接した部分３６０への反応産物の流入を可能にすることにより、マイクロ流体デバイスから収集される。試料入力ライン３１６及びオンチップポンプ（図示せず）を使用して、反応産物が試料入力ラインを通じ、キャリア上の収集ポートに向かって流される。
図４に示される実施形態において、試料はマイクロ流体デバイスの第１の側からロードされる。アッセイはマイクロ流体デバイスの隣接する側からロードされる。処理後、回収試薬が試料入力ラインを使用してデバイスの第１の側から入力され、反応産物がマイクロ流体デバイスを、マイクロ流体デバイスのうち第１の側と反対側に向かって延在する流体ラインに出る。この実施形態において、マイクロ流体デバイスの残りの側は、試料又はアッセイのロード又は反応産物の取出しには使用されない。他の構成が本発明の範囲内に含まれ、図４に示される例示的構成は単に例として提供されるに過ぎない。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
本明細書に記載されるシステムにより提供される利点は、試料入力ポート及びアッセイ入力ポートに分注されるピペッティング容量に関わらず、反応に使用される試料及びアッセイの容量が一定となることである。試料及び／又はアッセイ入力ポート中の容量が、試料／アッセイ入力ライン及び試料／アッセイチャンバを充填するのに十分な所定の閾値を上回る場合、試料／アッセイ入力ポートに圧力が加えられると、試料／アッセイチャンバは完全に充填される。従って完全に充填されたチャンバが、従来のマイクロタイタープレート技法では利用不可能な一定の反応容量を提供する。
システムは、限定はされないが、ＥＬＩＳＡアッセイなどの免疫学的実験を含めた、多数の同時結合アッセイを実行するために本譲受人によって開発されたが、本発明の実施形態は、「オンチップ」での拡張ポンピング並びに別個の試料及びアッセイチャンバを提供する。従って、本明細書に記載される実施形態を使用して、これまでに開発された技法では不可能な試料とアッセイとのペアワイズの組み合わせが可能となる。結合アッセイについてのさらなる記載が、２００６年９月１３日に出願された米国特許出願公開第２００７／００７４９７２号明細書（その開示は本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される）に提供される。
本発明の実施形態は、入力ＤＮＡ鋳型からのアンプリコンライブラリの調製における費用、時間、及び労力の減少を特徴とするＰＣＲ試料の調製に好適なシステムを提供する。典型的な使用の場合、第１の増幅を用いて次世代シーケンシング用のライブラリが作成される。本発明の実施形態を利用して、試料及びコードされたプライマーがアンプリコン特異的（ＡＳ）プライマーと組み合わされ、所望の反応に好適な混合物が作成される。Ｍ×Ｎ構成のマイクロ流体デバイスに基づき、Ｍ個の試料の各々がＮ個のＡＳプライマー（すなわち、アッセイ）の各々と組み合わされ、Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせが形成される。すなわち、試料及びアッセイの各対につき１個の反応サイトが提供される。反応（例えば、ＰＣＲ）の完了後、典型的にはマイクロ流体デバイスを通じて流される回収試薬を使用して、反応産物がシステムから収集される。特定の実施形態において、各試料に関連する反応産物は別個の反応プールに収集され、様々なアッセイの各々と反応した所与の試料を含むプールのさらなる処理又は試験が可能とされる。
従って、本明細書に記載される実施形態では、Ｍ×Ｎ個のアレイ構成において独立した試料入力がプライマー入力と組み合わされるマイクロ流体デバイスが提供される。従って、各反応物は、特定の試料と特定のプライマーとの固有の組み合わせである。本明細書全体を通じてさらに詳しく記載されるとおり、試料は、一実施態様では列状に配置された試料入力ラインを介してマイクロ流体デバイスの試料チャンバにロードされる。ＡＳプライマーすなわちアッセイは、列と交わる行状に配置されたアッセイ入力ラインを介してマイクロ流体デバイスのアッセイチャンバにロードされる。試料チャンバ及びアッセイチャンバは、ロードする間は流体的に隔離されている。ロード過程が完了した後、試料チャンバとアッセイチャンバとの対の間に通じる流体ラインを遮断するよう動作する接合部バルブが開放され、試料とアッセイとのペアワイズの組み合わせの自由界面拡散が可能となる。試料とアッセイとの精密な混合により、様々なペアワイズの組み合わせの間で反応が起こることが可能となり、各試料が固有のバーコードで有効にコードされている一組の特異的ＰＣＲ反応物を含む反応産物が産生される。反応産物は回収され、次に後の配列決定プロセスに使用することができる。用語「アッセイ」及び「試料」は、本明細書で使用されるとき、いくつかの実施形態におけるデバイスの特定の使用を説明するものである。しかしながら、デバイスの使用は、あらゆる実施形態において「１つ又は複数の試料」及び「１つ又は複数のアッセイ」の使用に限定されるわけではない。例えば、他の実施形態において、「１つ又は複数の試料」は「第１の試薬」又は複数の「第１の試薬」を指してもよく、及び「１つ又は複数のアッセイ」は「第２の試薬」又は複数の「第２の試薬」を指してもよい。Ｍ×Ｎ形式のデバイスにより、任意の一組の第１の試薬を任意の一組の第２の試薬と組み合わせた組み合わせが可能となる。
本発明の実施形態を使用して実施される一つの特定の方法によれば、２５サイクルのＰＣＲ後、Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせからの反応産物が、マイクロ流体デバイスから、Ｍ個の試料の各々につき一つの個別のプールに収集される。典型的には、個別のプールは、キャリア上に提供される試料入力ポートに含まれる。いくつかの方法では、反応産物は、正規化を目的として「アンプリコン毎」のベースで回収され得る。本発明の実施形態を利用して、増幅産物のコピー数が一試料内で±２５％以下だけ異なり、且つ試料間で±２５％以下だけ異なる（試料とアッセイとの同じ入力溶液から構築した複製実験についての）結果を得ることが可能である。従って、マイクロ流体デバイスから収集された増幅産物は、特定の既知の遺伝子型の分布によって計測したとき、入力試料を代表するものとなり得る。好ましくは、出力試料濃度は２，０００コピー／アンプリコン／マイクロリットルより高くなり、及び反応産物の収集は２時間未満のうちに行われ得る。
本発明の実施形態を用い得る用途として、シーケンサー対応アンプリコンの調製及び長距離ＰＣＲアンプリコンライブラリの生成が挙げられる。シーケンサー対応アンプリコンの調製には、複数個のフォワードプライマーと３個のプライマーとの組み合わせプロトコルを利用することができる。
図５Ａは、本発明の別の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの概略構成図である。図５Ａに示されるマイクロ流体デバイスは、図２に示されるマイクロ流体デバイスと共通の特徴並びに違いを共有する。試料は、マイクロ流体デバイスの一方の縁端（すなわち、図５Ａの下端）に提供される４８本の通路及び対応する試料入力ラインを介してマイクロ流体デバイスにロードされる。試料は、マイクロ流体デバイスの試料入力ラインを通ってアレイ部分４３０に流入する。アッセイは、マイクロ流体デバイスの両側（すなわち、図５Ａの左側及び右側）にある通路及びアッセイ入力ラインからロードされる。アレイ部分４３０に存在するユニットセルについてのさらなる考察は、図６に関連して提供される。反応産物は試料入力ラインを介して取り出され、キャリア１００上に提供される試料入力ポート１２０に収集される。このように、図５Ａでは、試料のロード及び反応産物の収集は、マイクロ流体デバイスの下端を介した流れとして示される。
図５Ｂは、図５Ａに示されるマイクロ流体デバイスの一部の概略構成図である。図５Ｂに示される部分は、試料入力ライン４１０、偶数のアッセイ用のアッセイ入力ライン（アッセイ入力ライン４２０）、奇数のアッセイ用のアッセイ入力ライン（アッセイ入力ライン４２２）、及び回収試薬入力ライン４３０を含む。ある実施形態では、試料入力ライン４１０は、試料入力ライン１４０と整列している通路４１２と流体連通し、図２に示されるとおり試料入力ライン１４０が試料入力ポート１２０と流体連通している。他の実施形態ではさらなる試料入力ライン（図示せず）が提供され、試料入力ポート１２０と試料入力ライン４１０との間の流体連通が可能とされる。従って、試料入力ポートのバンクを加圧すると、様々な試料のフローが、示される試料入力ライン４１０に流入し得る。
以下で図６に関連して考察されるとおり、試料入力ライン４１０は、マイクロ流体デバイスに存在する試料入力ライン５１６及び試料チャンバ５１０と流体連通している。４８個の試料チャンバと４８個のアッセイチャンバとを備えるアレイについて、図５Ｂに示される４８個の試料入力ライン４１０は４８個の別個の試料チャンバ列に試料を提供し、そのうち２個が図６に示される。図５Ｂに示される様々な流体ラインは、特定の実施態様に応じて、マイクロ流体デバイス１１０に統合されても、キャリア１００に統合されても、又は１つ又は複数の他の構造に存在してもよいことに留意しなければならない。従って、図５Ｂにおける試料入力ライン４１０の例示は本発明の範囲の限定を意図するものではなく、単に、マイクロ流体デバイスの様々なチャンバに制御された流体フローを提供するのに好適な流体ラインを例示するものに過ぎない。
ある実施形態では、偶数のアッセイ入力ライン４２０及び奇数のアッセイ入力ライン４２２が、アッセイ入力ライン１４０と整列している通路４２４と流体連通し、図２に示されるとおりアッセイ入力ライン１４０がアッセイ入力ポート１２２と流体連通している。他の実施形態において、さらなるアッセイ入力ライン（図示せず）が提供され、アッセイ入力ポート１２２とアッセイ入力ライン４２０及び４２２との間の流体連通が可能とされる。従って、アッセイ入力ポート１２２のバンクを加圧すると、様々なアッセイのフローが示されるアッセイ入力ラインに流入し得る。図５Ｂに示される入力ラインを介して流れた後、最終的に様々な流体は、図６に示されるユニットセルに入り得る。
上記に考察されるとおり、様々な流体ラインは、キャリア、マイクロ流体デバイス、又は他の好適な構造に統合することができる。４８個の試料×４８個のアッセイのアレイ構成では、２４個の偶数のアッセイ入力ライン４２０が、図６に示されるアッセイ入力ライン５１８の行の半分に入力を提供し得る。２４個の奇数のアッセイ入力ライン４２２は、図６に示されるアッセイ入力ライン５１８の行の半分に入力を提供し得る。従って、図６においてはアレイの右側からのアッセイのロードのみが示されるが、実際の実施態様では、典型的にはアッセイは、偶数／奇数構成の双方の側からロードされ得る。いくつかの実施形態において、補水用流体のロード等のためさらなる通路が提供される。さらに、いくつかの実施形態では、既存のキャリアとの適合性を提供するため、一部の流体ラインが使用されず、又はかかる適合性を提供するよう改良される。
回収試薬入力ライン４３０は、マイクロ流体デバイスからの反応産物の収集において使用される回収試薬を提供する。図５Ｂに示される回収試薬入力ライン４３０は、図２に示される回収試薬入力ポート１３６と流体連通し、偶数のアッセイ入力ラインに隣接してマイクロ流体デバイスに従いデバイスの上部まで通り、次に複数の回収試薬入力ラインに分岐する。回収試薬の多重化機構は、全ての試料入力ラインについて実質的に等しい容積を有し、反応産物の収集動作中、一様な圧送を提供し得る。図５Ｂに示される特定の分岐システムは単に例として提供されるに過ぎず、他の分岐システムが本発明の範囲内に含まれることに留意しなければならない。回収試薬入力ライン４３０は、図６に関連して考察される試料入力ライン５１６と流体連通している。図９Ａ〜図９Ｄに関連して考察されるとおり、実施形態は試料チャンバの各列につき別個の回収試薬入力ラインを利用し、例えば４８×４８アレイ構成のマイクロ流体デバイスについては４８個の回収試薬入力ラインを利用する。加えて、回収試薬入力ラインは偶数のアッセイ入力ライン４２０に隣接する位置でマイクロ流体デバイスに入るが、これは本発明の実施形態の要件ではなく、他の構成が本発明の範囲内にある。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
図８Ｃに関連して記載されるとおり、回収試薬はキャリア上の回収試薬入力ポートから流れ、回収試薬入力ライン４３０を通り、試料入力ライン５１６の一端に入る。本明細書全体を通じてさらに詳しく考察されるとおり、試料入力ラインは入力ライン及び反応産物収集ラインの双方として機能する。ロードについては、試料流路は試料入力ポート１２０から入力ライン１４０を通り、通路４１２を通り、試料入力ライン４１０を通り、試料入力ライン５１６を通って反応チャンバ５１０及びローディングボウル８３０に至る。反応産物収集については、産物流路は回収試薬入力ポート１３６から回収試薬入力ライン４３０を通り、試料入力ライン５１６を通り、試料入力ライン４１０を通り、通路４１２を通って試料入力ポート１２０に至り、試料入力ポート１２０は回収中、流体収集ウェルとして働く。従って、「入力」ラインは試料のロードと、マイクロ流体デバイス及びキャリアからの反応産物の収集若しくは取出しとの双方の働きをし得るため、用語「入力」ラインの使用は実施される特定のプロセスとの関連において考えられるべきである。
試料入力ポート１２０のバンク及びアッセイ入力ポート１２２のバンクに圧力を加えることにより、示される試料及びアッセイ入力ラインを通じて、マイクロ流体デバイスに存在する試料及びアッセイチャンバに試料及び試薬をロードすることができる。回収試薬入力ポート１３６に圧力を加えることにより、試料チャンバから反応産物を収集して試料入力ポートに送り込むことができる。本明細書全体を通じてさらに詳しく記載されるとおり、マイクロ流体デバイスに存在するバルブを利用して、試料、アッセイ、及び反応産物のフローが制御される。図５Ｂは、試料入力ライン、アッセイ入力ライン、及び回収試薬入力ラインの一部分のみを示し、これらの入力ラインのさらなる部分が図５Ａ及び図６に示される。
図６は、図５Ａに示されるマイクロ流体デバイスのいくつかのユニットセルの概略構成図である。図６では、明確にするため、図５Ａに示されるアレイ部分４３０からの４個のユニットセルが示される。マイクロ流体デバイスのユニットセル部は、試料チャンバ５１０とアッセイチャンバ５１２とを含む。流体ライン５１４は、接合部バルブ５３０が開放位置にあるとき、試料チャンバとアッセイチャンバとの間に流体連通を提供する。特定の実施形態において、試料入力ライン５１６は、マイクロ流体デバイスのなかで試料チャンバを含む層の下にある層に提供される。同様に、アッセイ入力ライン５１８は、マイクロ流体デバイスのなかでアッセイチャンバを含む層の下にある層に提供される。試料は、図５Ｂに示される試料入力ライン４１０から試料入力ライン５１６に流れ、試料入力ラインから試料チャンバに通じる１つ又は複数の通路を通って上る。各試料チャンバについて２本の試料ラインが示されるが、この特定の数は本発明の要件ではなく、他の数の試料入力ライン、例えば、１本の入力ライン、３本、４本の、又は４本より多い試料入力ラインが利用されてもよい。試料入力ライン５１６は図の列方向に連続流路を提供し、複数の試料チャンバの間で単一の試料を均等に分配することが可能である。
図６はアッセイ入力ライン５１８を示し、これは図５Ｂに示されるアッセイ入力ライン４２０及び４２２からアッセイチャンバ５１２に至るアッセイのフローを提供する。図６は図の右側からユニットセルに入るアッセイ入力ラインのみを示すが、当業者には、図５Ｂに示される実施態様において、マイクロ流体デバイスの両側から偶数及び奇数のアッセイがロードされることは明らかであろう。図６に提供される例示は、明確にするため単に簡略化しているに過ぎない。特定の実施形態において、アッセイは、試料チャンバの充填と同様の方法で、入力ラインとアッセイチャンバとを接続する通路を介してロードされる。マイクロ流体デバイスの行に沿ってアッセイをロードすることにより、試料の各々に異なるアッセイが提供され、Ｍ×Ｎアレイに適切な多数のペアワイズの組み合わせが得られる。
本明細書全体を通じてさらに詳しく記載されるとおり、反応産物は、試料入力ライン５１６及びポンプ（図示せず）を使用してマイクロ流体デバイスから収集される。封鎖バルブ５４０が、各行における様々な試料及びアッセイチャンバの間の封鎖をもたらす。接合部バルブ５３０及び封鎖バルブ５４０を利用して、試料チャンバの各々を、他の試料チャンバの各々並びにアッセイチャンバから隔離することができる。アッセイチャンバは、封鎖バルブを使用して他のアッセイチャンバから隔離することができる。隔離バルブ及び封鎖バルブの双方とも、供給源１３０〜１３４と流体連通する対応する制御ラインに圧力を加えることによるか、又は他の手段、例えば静電アクチュエーションにより作動される。
図６では、アレイ構成における４個の試料チャンバ５１０が示される。４個の示されるチャンバは単に例として示されるに過ぎず、本発明の実施態様は４個の示されるチャンバに限定されるものではなく、典型的には、４８×４８アレイ構成では２，３０４個のチャンバ、６４×６４アレイ構成では４，０９６個のチャンバ、９６×９６アレイ構成では９，２１６個のチャンバなどを提供する。
本発明の実施形態は、数百ミクロン程度の寸法のユニットセル、例えば、５００×５００μｍ、５２５×５２５μｍ、５５０×５５０μｍ、５７５×５７５μｍ、６００×６００μｍ、６２５×６２５μｍ、６５０×６５０μｍ、６７５×６７５μｍ、７００×７００μｍなどの寸法のユニットセルを提供する。試料チャンバ及びアッセイチャンバの寸法は、試料及びアッセイの使用量を低減しながらも、所望のプロセスに十分な量の材料を提供するように選択される。例として、試料チャンバは、幅１００〜４００μｍ×長さ２００〜６００μｍ×高さ１００〜５００μｍ程度の寸法を有し得る。例えば、幅は、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍなどであってもよい。例えば、長さは、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍ、５００μｍ、５２５μｍ、５５０μｍ、５７５μｍ、６００μｍなどであってもよい。例えば、高さは、１００μｍ、１２５μｍ、１５０μｍ、１７５μｍ、２００μｍ、２２５μｍ、２５０μｍ、２７５μｍ、３００μｍ、３２５μｍ、３５０μｍ、３７５μｍ、４００μｍ、４２５μｍ、４５０μｍ、４７５μｍ、５００μｍ、５２５μｍ、５５０μｍ、５７５μｍ、６００μｍなどであってもよい。アッセイチャンバも同様の寸法範囲を有することができ、典型的には、小さいほうのチャンバ容積より小さい範囲にわたり同様の刻み幅を提供する。いくつかの実施形態において、試料チャンバ容積のアッセイチャンバ容積に対する比は、約５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、又は３０：１である。列挙した範囲より小さいチャンバ容積が本発明の範囲内に含まれ、マイクロ流体デバイス製造技法を用いて容易に製造される。
より高密度のマイクロ流体デバイスは、典型的には、ユニットセルのフットプリントを低減するため、より小さいチャンバ容積を利用する。利用可能な試料サイズが極めて少量である用途では、低減したチャンバ容積によってかかる少量の試料の試験は促進され得る。
接合部バルブ５３０の寸法は、試料チャンバとアッセイチャンバとを接続する流体ライン５１４の完全な遮断を提供するように選択される。いくつかの実施形態において、バルブ寸法は、約１０〜２００μｍ×１０〜２００μｍの範囲、例えば、５０×５０μｍ、５０×６５μｍ、５０×８０μｍ、５０×１００μｍ、６５×５０μｍ、６５×６５μｍ、６５×８０μｍ、６５×１００μｍ、８０×５０μｍ、８０×６５μｍ、８０×８０μｍ、８０×１００μｍ、１００×５０μｍ、１００×６５μｍ、１００×８０μｍ、１００×１００μｍなどである。試料入力ラインは、試料入力ラインの数及び試料チャンバ容積、並びにロード及び産物収集についての所望の流量に応じて様々な幅を有し得る。例として、試料入力ラインは、高さ１〜２０μｍ及び幅５０〜１００μｍの断面を有し得る。例えば、試料入力ラインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０μｍの高さ及び５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００μｍの幅を有し得る。
２０〜１００μｍの範囲の層間の配列、及び５０〜２００ミクロンの範囲の通路サイズを含む他のデバイスパラメータは、所望のシステム性能特性を提供するように選択される。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスのうち回収試薬入力ラインに隣接する側に、追加のアッセイ入口が提供される。加えて、マイクロ流体デバイスのうちキャリア上の試料入力ポートに隣接する側にはアッセイ入口が提供されない。この構成では、追加のアッセイ入口は、脱水チャンバのロードに使用することができる。典型的には、脱水チャンバのロードは、５μｌより多いアッセイ溶液を使用し得る。或いは、別個の脱水溶剤を使用してマイクロ流体デバイスにわたりアッセイ容量を一様に保つこともできる。
図７は、本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの動作方法の概略フローチャートである。例示される実施形態において、マイクロ流体デバイスは、少なくとも１個のアッセイチャンバと、少なくとも１個の試料チャンバと、少なくとも１個の回収ポートとを含む。詳細な実施形態において、マイクロ流体デバイスは、複数のアッセイチャンバと複数の試料チャンバとを含む。この方法６００は、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインを閉鎖するステップ（６１０）を含む。図６を参照すると、接合部バルブ５３０が、試料チャンバ５１０とアッセイチャンバ５１２までとの間に通じる流体ライン５１４を閉鎖するよう動作する。いくつかの実施形態において、接合部バルブ５３０は、以下にさらに詳しく記載されるとおり「プッシュアップ」バルブである。接合部バルブは制御ライン５３２、又はマイクロ流体デバイスの第１の層に少なくとも部分的に含まれる制御チャネルの交差する点により形成される。流体ラインは、マイクロ流体デバイスの第２の層に少なくとも部分的に含まれる。制御ライン５３２は、図２に示されるとおりの１つ又は複数の圧力アクチュエータ又はアキュムレータと流体連通している。
制御ライン５３２が流体ライン５１４と交差する点が、その交差点にバルブを形成し、これは、バルブが試料とアッセイとの間の接合部における混合を防止するため、接合部バルブ５３０と称される。接合部バルブ５３０は、制御ライン内の流体圧力に応答して作動し、流体ラインを通じた流体フローを阻止するように動作する。概して、本明細書で考察される多層マイクロ流体デバイスは多数のエラストマー層を含み、バルブ５３０は、第１の層と第２の層との間に撓曲自在な膜を含む。「プッシュアップ」構成では、バルブの撓曲自在な膜が撓曲し、制御ライン５３２と交差する点の上方に位置する流体ライン５１４に入り込むことができる。この構成では、撓曲自在な膜が上方に撓曲して流体ラインに入り込むと、バルブの位置で流体ラインが閉鎖され、このため「プッシュアップ」バルブと言われる。制御ライン内の圧力を解放すると、撓曲自在な膜が撓曲していない状態に戻り、それにより閉鎖されていたバルブが開放される。バルブを含むマイクロ流体デバイスについてのさらなる記載が、米国特許出願公開第２００５／０２２６７４２号明細書に提供され、その開示全体は、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。
図６に示されるとおり、制御ライン５３２を作動させると流体ライン５１４が遮断される。典型的には、制御ライン５３２は、圧力アキュムレータに圧力を加えることによって同時に作動させる。再び図７を参照すると、接合部バルブ５３０の閉鎖後、試料は試料入力ライン５１６を介して試料チャンバ５１０に流入する（６１２）。図６に示されるとおり、各試料チャンバ５１０は複数の（例えば、２本の）試料入力ライン５１６と流体連通している。他の実施形態では、他の本数の試料入力ラインが利用されてもよい。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。典型的には、マイクロ流体デバイスの第２の層に少なくとも部分的に含まれる試料入力ラインは、マイクロ流体デバイスの第３の層に少なくとも部分的に含まれる試料チャンバの下側を通る。試料入力ラインから試料チャンバまで通じる通路（図示せず）が、試料入力ラインから試料チャンバに至る流体フローを提供する。図６に示されるとおり、試料は、例えば列を上に向かって流れ、開放している封鎖バルブ５４０を越え、図の平面外に延在する通路を通って様々な試料チャンバに入る。試料チャンバ内に存在する空気などの流体は、マイクロ流体デバイスの作製に使用されるエラストマー材料の透過性の結果として、試料をロードする間に排出される。
再び図７を参照すると、アッセイはアッセイ入力ライン５１８を介してアッセイチャンバ５１２に流入する（６１４）。アッセイは、アッセイ入力ライン５１８を通り、開放している封鎖バルブ５４０を越え、アッセイ入力ラインからアッセイチャンバに通じる通路（図示せず）を通って流れる。接合部バルブ５３０の閉鎖により、試料チャンバ内の試料とアッセイチャンバ内のアッセイとの混合は阻止される。試料及びアッセイがロードされると、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインが開放される（６１６）。本発明の実施形態では、接合部バルブ５３０を開放することによって複数の流体ライン５１４が同時に開放される。試料の少なくとも一部分とアッセイの少なくとも一部分とが組み合わされ、混合物を形成する（６１８）。試料とアッセイとの混合物は、試料チャンバ及びアッセイチャンバ並びにそれらのチャンバを接続する流体ライン全体にわたり形成される。自由界面拡散は、混合が緩徐で、且つ種の平衡速度が種の拡散定数に依存する方法である。塩などの小分子は拡散定数が大きく、従って急速に平衡する。巨大分子（例えば、タンパク質）は拡散定数が小さく、より低速で平衡する。
混合物を反応させると反応産物が形成される（６２０）。本発明の範囲内に含まれる典型的な反応はＰＣＲであり、これは、当業者には明らかであろうとおり、多数のサイクルを介したマイクロ流体デバイスの熱サイクリングを伴う。接合部バルブ５３０を作動させることにより、アッセイチャンバと試料チャンバとの間の流体ラインが閉鎖される（６２２）。接合部バルブを閉鎖すると、試料チャンバ内に存在する反応産物がアッセイチャンバ内に存在する反応産物と分離される。加えて、熱サイクリング過程における沈殿を防止するため、熱サイクリング中に封鎖バルブ５４０を閉鎖することができる。試料チャンバ中に存在する反応産物の回収プロセスを開始するため、回収試薬が回収ポートから試料チャンバに流される（６２４）。回収ポート１３６は、回収プロセスにおいて有用な流体入力ポートの一例である。図４に示されるとおり、反応産物は試料入力ライン５１６を通って下方に、当初試料が提供されたところである試料入力ポートに向かって流れる。このように、例示される方法では、マイクロ流体デバイスから反応産物を取り出すステップは、試料入力ポートに試料をロードするために使用された試料入力ラインの少なくとも一部分を通じて反応産物を流動させることを含む。このように、反応産物はマイクロ流体デバイスから取り出され（６２６）、試料入力ポート、例えば図２に示される試料入力ポート１２０に出力される。
図９Ａ〜図９Ｄに関連してさらなる詳細を考察するとおり、マイクロ流体デバイスから反応産物を取り出すため、例示される実施形態では拡張ポンピングが用いられる。再び図２を参照すると、制御ポート１３０及び１３２又は圧力アキュムレータ１５０及び１５２を使用して、拡張ポンピングに使用されるバルブを作動させることができる。このように、実施形態は、マイクロ流体デバイスに対して拡張ポンピング用のバルブを提供し、これがマイクロ流体デバイスからの反応産物の取出しを提供する。これは、マイクロ流体デバイスの一部としてかかるバルブは提供されなかった従来の設計と対照をなす。
図７に示される具体的なステップが、本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの特定の動作方法を提供することは理解されなければならない。他のステップ順序もまた代替的実施形態により実行され得る。例えば、本発明の代替的実施形態は、上記に概説されるステップを異なる順番で実行し得る。さらに、図７に示される個々のステップは、個々のステップの必要に応じて様々な順序で実行され得る複数の下位ステップを含み得る。さらに、特定の用途に応じてさらなるステップが加えられても、又は取り除かれてもよい。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
図８Ａ〜図８Ｄは、本発明の実施形態に係る動作中のマイクロ流体デバイスのユニットセルを通じた流体フローを示す概略構成図である。図８Ａを参照すると、試料及びアッセイをロードするプロセスの間のマイクロ流体デバイスが示される。封鎖バルブ５４０が開放され、試料入力ライン５１６に沿って様々な試料チャンバ５１０に流体が流れ込むことが可能となる。封鎖バルブが開放状態であることにより、アッセイがアッセイ入力ライン５１８を通じて様々なアッセイチャンバ５１２に流入することも可能となる。試料入力ラインの各組（Ｍ個の試料のｍ）に対して単一の試料を使用することにより、試料チャンバの各列に単一の試料をロードすることが可能となる。加えて、各アッセイ入力ライン（Ｎ個のアッセイのｎ）に対して単一のアッセイを使用することにより、アッセイチャンバの各行に単一のアッセイの試料をロードすることが可能となる。接合部バルブ５３０を閉鎖状態にすると、試料とアッセイとの混合が阻止される。
図８Ｂは、試料及びアッセイ混合プロセス並びに後続の反応プロセス（例えば、増幅）の間のマイクロ流体デバイスを示す。封鎖バルブ５４０は閉鎖され、試料入力ライン５１６に沿った流体フローが阻止される。従って封鎖バルブの閉鎖により、試料チャンバは列に沿って互いに隔離される（各列は潜在的に異なる試料を収容している）。封鎖バルブ５４０の閉鎖により、さらに各行においてアッセイチャンバが他のアッセイチャンバと隔離される。このチャンバの隔離が提供された後、接合部バルブ５３０が開放されると、試料とアッセイとの自由界面拡散（ＦＩＤ）による混合が可能となり、Ｍ×Ｎ個のペアワイズの組み合わせが形成される。試料／アッセイチャンバ対の材料は、図８Ｂでは同じ陰影で示されるが、試料／アッセイチャンバの各対につき一つの、４つの異なるペアワイズの組み合わせが示されることは理解されるであろう。試料とアッセイとの混合と、次のＰＣＲ増幅の実行に関わる複数のステップは、図８Ｂでは単一の図面によって表されるが、当業者には、それらの過程に数多くのステップ、例えば複数回の熱サイクリングステップが関わることは明らかであろう。
図８Ｃは、試料チャンバの隔離及び回収試薬の初回ロードを行う間のマイクロ流体デバイスを示す。接合部バルブ５３０は閉鎖され、試料チャンバとアッセイチャンバとの間の隔離が維持される。従って、アッセイチャンバ中の反応産物が収集されない状態で、試料チャンバ中に存在する反応産物が収集される。封鎖バルブ５４０が開放されると、回収試薬が図５Ｂに示される回収試薬入力ライン４３０から試料入力ライン５１６に流入することが可能となる。回収試薬は試料入力ラインを通って試料チャンバに流入する。例示される実施形態において、反応産物は、図９Ａ〜図９Ｄに関連してさらに詳細に記載される拡張ポンピングプロセスに応答して、回収試薬が試料入力ライン及び試料チャンバを通って流れることに伴い取り出される。図８Ｃに示されるとおり、回収試薬は上側の反応チャンバの中央領域までしか到達していない。拡張ポンピングプロセスが続くと、回収試薬は次第に次の試料チャンバに導入され、それにより反応産物が移動する。最終的には、各試料に関連した反応産物は、当初試料が分注されたところである試料入力ポートにおいて、反応産物及び回収試薬を含むプールされた流体として収集されることになる。
回収試薬と反応産物との間の界面を表す直線は、単に簡略化する目的で示されているに過ぎないことは留意されるべきであり、実際にはより複雑な界面が存在し得ることは、当業者には明らかであろう。
図８Ｄは、回収試薬の最終ロード及び反応産物の収集を行う間のマイクロ流体デバイスを示す。拡張ポンピングプロセスが続くと、回収試薬入力ラインからさらに回収試薬が次第にさらなる試料チャンバへと導入される。図８Ｄに示される収集プロセスの状態は、反応産物が試料チャンバから押し流され、ここで試料チャンバは回収試薬で充填されていることを示す。図８Ｄには４個の試料チャンバのみが示されるが、アレイ内の全ての試料チャンバからの反応産物の収集が本明細書に記載される実施形態によって提供されることは理解されるであろう。
図９Ａ〜図９Ｄは、本発明の実施形態に係る動作中のマイクロ流体デバイスを通じた流体フローを示す概略構成図である。図９Ａは、試料及びアッセイをロードする間の本発明の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの一部分を示す。示される部分は、回収試薬入力ライン８１０と、ベント及びローディングボウル部分８３０と、隔離バルブ８４０とを含む。本明細書全体を通じてさらに詳しく記載されるとおり、バルブ８２０及び８２２を使用して、試料チャンバ５１０に存在する反応産物の拡張ポンピングが実行される。図９Ａに示されるとおり、バルブ８２０は閉鎖され、及びバルブ８２２は開放されている。バルブ８２０及び８２２は、典型的には、本明細書の他の箇所に記載される「プッシュアップ」バルブである。
図６に関連して記載されるとおり、試料は試料チャンバ５１０にロードされ、アッセイはアッセイチャンバ５１２にロードされる。接合部バルブ５３０は閉鎖され、試料とアッセイとの混合が阻止される。いくつかの実施形態ではベント及びローディングボウルが提供され、それにより枯渇フロント（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｆｒｏｎｔ）に関連する影響の低減が可能となる。本発明者らは、マイクロ流体デバイスへの（例えば、図９Ａに示される垂直試料入力ラインを通じた）試料のロードでは、流路の前縁に存在する試料の一部分がマイクロ流体デバイスの材料と結合すると、この結合プロセスの結果として試料の１つ又は複数の構成成分が枯渇する枯渇フロントが生じ得ることを観察している。ベント及びローディングボウル８３０を提供すると、使用者はマイクロ流体デバイスの様々な試料チャンバを通じて枯渇フロントを押し、枯渇した試料材料をローディングボウル８３０に蓄積させることができる。最終的に、枯渇した試料材料はデバイスを通じて押し流されてローディングボウルに入るため、マイクロ流体デバイスに含まれる試料は実質的に枯渇していないものとなる。
試料及びアッセイをロードするプロセスの間、隔離バルブ８４０は開放されており、枯渇フロントはローディングボウル８３０に流入することが可能である。バルブ８２２は開放されているため、試料は試料入力ラインを通って様々な試料チャンバに流れることが可能である。バルブ８２０は閉鎖されているため、試料は回収試薬入力ライン８１０に流れ込むことはできない。封鎖バルブ５４０は図９Ａでは閉鎖状態で示されていることに留意しなければならない。試料及びアッセイのロード中、封鎖バルブは開放されており、次に試料及びアッセイのロードの完了後、示されるとおり閉鎖される。封鎖バルブは、様々な対の反応及びアッセイチャンバを、様々なペアワイズの組み合わせを含む他の対から隔離する。
図９Ａでは、明確にするため、一列のマイクロ流体デバイスのみが示される。例えば図６に示されるとおりのマイクロ流体デバイスによってさらなる列が提供されることが理解される。さらに、明確にするため、列の多くは図示されない。図示される２組の試料／アッセイチャンバは、それぞれ図４Ａの上及び下にあるものである。バルブ８２０に隣接する組が最上部の組であり、バルブ８２２に隣接する組が最下部の組である。従って、これらの図は単に代表的なものに過ぎず、本発明の範囲を限定することは意図されない。
図９Ｂは、試料とアッセイとの混合、及び後続の反応（例えば、増幅）プロセスを示す。試料と試薬とを混合するため、示されるとおり接合部バルブ５３０が開放位置に置かれる。封鎖バルブ５４０の閉鎖により、試料及びアッセイチャンバ中の反応産物が、接続する流体ラインと共に封じられる。図９Ｂに示されるとおり、隔離バルブ８４０が閉鎖され、試料入力ラインとローディングボウル８３０との間の流体フローが阻止される。バルブ８４０を開放又は閉鎖位置に置くためのバルブ８４０の作動は、いくつかの実施形態では圧力アキュムレータ（図示せず）を使用して、及び他の実施形態では他の作動手法、例えば、機械的、静電的、電気機械的、熱力学的、圧電的手法などを使用して行われる。かかるさらなる手法はまた、本明細書に記載される他のバルブにも適用可能であり得る。当業者であれば、多くの変形例、修正例、及び代替例を認識するであろう。
図９Ｂは単一のイメージを用いて混合及び反応を示すが、当業者は、ＰＣＲプロセスを用いたＤＮＡの増幅に複数の熱サイクルが用いられ得ることを理解するであろう。従って、この単純な図は、マイクロ流体デバイスで行われ得る混合及び後続の反応を示すことを意図している。
図９Ｃは、反応産物回収プロセスの第１の段階におけるマイクロ流体デバイスの一部分を示す。回収試薬は、図５Ａに示されるとおりの回収ポートから回収試薬入力ライン８１０を通って試料チャンバに流入する。図９Ａに示されるとおり、バルブ８２０が開放され、回収試薬が最上部の試料チャンバに流入することが可能となる。接合部バルブ５３０は閉鎖されており、同様に反応産物を含むアッセイチャンバに回収試薬が流入することは阻止される。どの程度回収試薬が最初に試料入力ライン及び試料入力チャンバを充填するかは、バルブ８２２の閉鎖によって制限される。示されるとおり、回収試薬は第１の試料チャンバの一部分を部分的に充填しているのみである。試料チャンバに入る回収試薬のフローは、実際には図の平面から延在する通路を介するため、試料チャンバのうち回収試薬で充填されている側の図は、単に例として提供されるに過ぎない。隔離バルブ８４０は閉鎖されており、ローディングボウルに回収試薬が流入することは阻止されるが、他の実施形態では、必要であればかかるフローを可能にしてもよい。
マイクロ流体デバイスのアレイ部分に入る回収試薬のフローによって生じる流体圧力により、バルブ８２２の上側の試料入力ライン及び試料チャンバが膨張する。ポンプサイクルは、試料チャンバのこの加圧によって開始される。以下に記載されるとおり、バルブ８２０を閉鎖してバルブ８２２を開放することにより、加圧された回収試薬及び反応産物がマイクロ流体デバイスを通じて流れるに従い、それをマイクロ流体デバイスから収集することが可能となる。
図９Ｄは、反応産物回収プロセスの第２の段階におけるマイクロ流体デバイスの一部分を示す。第２の段階が示されるが、これは第２の段階が第１の段階の直後に続くことを含意するよう意図するものではない。以下に記載されるとおり、第２の段階は典型的には、拡張ポンピングの１つ又は複数の中間段階を経て第１の段階と隔たっている。
拡張ポンピング（容積性ポンピング（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ ｐｕｍｐｉｎｇ）としても知られる）は、マイクロ流体デバイスの全ての構成要素を介して正確な低速低容量の圧送を達成するよう適切に構成された集積流体回路（マイクロ流体デバイス）を動作させる方法である。拡張ポンピングは、エラストマー材料で形成された１つ又は複数のチャネル壁を有するチャネルを利用するマイクロ流体回路に特有のものである。例として、試料入力ライン及び試料チャンバを通じた回収試薬のフローは、容積性ポンピングと考えられる。ポンピングは、バルブ８２２を閉鎖し、且つバルブ８２０を開放することによって進行する。上記に考察されるとおり、回収試薬ポート（図示せず）が加圧され、チャネルと見なすことのできる最上部の試料入力ライン及び試料チャンバに回収試薬が導入される。エラストマー材料で形成される少なくとも１個のチャネル壁を備えるマイクロ流体チャネルを加圧すると、１つ又は複数のエラストマー壁がチャネルから外向きに膨張し、その結果としてチャネル容積が、チャネル内の流体圧力（又は代替的実施形態では気体圧力）、ヤング率などのエラストマーチャネル壁材料の弾性特性、並びにチャネルの長さ及び断面積に比例して増加する。試料入力ライン及び試料チャンバを加圧させた後、図９Ｄに示されるとおりバルブ８２０が閉鎖される。バルブ８２０の閉鎖後、バルブ８２２が開放される。試料入力ライン及び試料チャンバを通じて圧送される容積は、圧力下にあるときのチャネルの膨張した容積から、圧力が解放され、１つ又は複数の膨張したエラストマーチャネル壁を弛緩させたときのチャネルの固有の容積を差し引いたものに等しい。拡張ポンピングは、８２２の閉鎖、８２０の開放、試料入力ライン及び試料チャンバの加圧、８２０の閉鎖、及び８２２の開放の反復サイクルを介して継続される。このようにして、正確に制御された流量で連続又は不連続な低容量ポンピングが達成され得る。
このように、実施形態は、試料チャンバと試料入力ポートとの間に配置される第１のバルブ（すなわち、バルブ８２２）を閉鎖するステップと、回収ポートと試料チャンバとの間に配置される第２のバルブ（すなわち、バルブ８２０）を開放するステップと、第２のバルブを閉鎖するステップと、第１のバルブを開放するステップと、これらのステップを所定の回数繰り返すステップとを含む、拡張ポンピングの方法を提供する。第２のバルブを開放するステップと第２のバルブを閉鎖するステップとの間に、上記のとおり回収試薬が試料入力ライン及び試料チャンバに流入し、チャネルを加圧する。拡張ポンピングプロセスが完了すると、回収試薬は試料入力ライン及び試料チャンバを実質的に充填し（例えば、収集率＞９５％）、それにより所与の試料に関連した反応産物が、当初その所与の試料が分注されたところである試料入力ポートにプールされる。
拡張ポンピングは、従来技術の使用では典型的には得ることのできない利点を提供する。例えば、拡張ポンピングにより、反応産物をマイクロ流体デバイスから低速で取り出すことが可能となる。例示的実施形態において、反応産物は、１００μｌ毎時未満の流体流量で収集される。この例では、各列の反応チャンバ間に分配された４８個の反応産物であって、各々の容量が約１．５μｌである反応産物について、約３０分間で反応産物を取り出すと、７２μｌ／時間の流体流量となる（すなわち、４８×１．５／０．５時間）。他の実施形態において、反応産物の取出し速度は、９０μｌ／時未満、８０μｌ／時、７０μｌ／時、６０μｌ／時、５０μｌ／時、４０μｌ／時、３０μｌ／時、２０μｌ／時、１０μｌ／時、９μｌ／時、８μｌ／時未満、７μｌ／時未満、６μｌ／時未満、５μｌ／時未満、４μｌ／時未満、３μｌ／時未満、２μｌ／時未満、１μｌ／時未満、又は０．５μｌ／時未満の速度で行われる。
拡張ポンピングは、マイクロ流体デバイスに存在する反応産物のうちの実質的に高い割合及び潜在的には全ての除去をもたらす。いくつかの実施形態では、マイクロ流体デバイスの反応チャンバ（例えば、試料チャンバ）中に存在する反応産物の７５％超が取り出される。例として、いくつかの実施形態では、反応チャンバ中に存在する反応産物の８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％が取り出される。
いくつかの実施形態において、マイクロ流体デバイスには、デバイスを通じた回収試薬のフローを遮断する回収用バルブが提供される。回収用入力ポートに圧力源を適用すると、回収用流体（例えば、回収用液体）が回収試薬入力ラインを通って回収用バルブまで流れる。マイクロ流体デバイスの作製に利用される材料の透過性により、かかる回収用流体は回収試薬入力ラインを充填することが可能であり、典型的にはかかるライン中に当初存在する空気が排出される。回収用バルブが存在するため、回収試薬のフローは回収用バルブの位置で遮断される。回収用バルブの作動（すなわち、開放）により、回収用流体は、回収用バルブの下流にある回収試薬入力ラインを通って流れる。他の実施形態では、回収用バルブは、特定の用途の必要に応じて１つ又は複数の他の好適なバルブに置き換えられる。例えば、図９Ａ〜図９Ｄに示される実施形態では、バルブ８２０が、拡張ポンピングプロセスが開始されるまで回収試薬のフローを阻止する働きをする。
エラストマー材料を使用した作製方法並びにデバイス及びその構成要素の設計方法は、科学文献及び特許文献に詳細に記載されている。例えば、Ｕｎｇｅｒら（２０００年）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６頁；米国特許第６，９６０，４３７号明細書（「Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ」）；同第６，８９９，１３７号明細書（「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ ｖａｌｖｅ ａｎｄ ｐｕｍｐ ｓｙｓｔｅｍｓ」）；同第６，７６７，７０６号明細書（「Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ａｃｔｉｖｅ ｆｌｕｘ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ」）；同第６，７５２，９２２号明細書（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」）；同第６，４０８，８７８号明細書（「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｅｌａｓｔｏｍｅｒｉｃ ｖａｌｖｅ ａｎｄ ｐｕｍｐ ｓｙｓｔｅｍｓ」）；同第６，６４５，４３２号明細書（「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｌｙ ａｒｒａｙｅｄ ｃｈａｎｎｅｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓ」）；米国特許出願公開第２００４／０１１５８３８号明細書；同第２００５／００７２９４６号明細書；同第２００５／００００９００号明細書；同第２００２／０１２７７３６号明細書；同第２００２／０１０９１１４号明細書；同第２００４／０１１５８３８号明細書；同第２００３／０１３８８２９号明細書；同第２００２／０１６４８１６号明細書；同第２００２／０１２７７３６号明細書；及び同第２００２／０１０９１１４号明細書；国際公開第２００５／０８４１９１号パンフレット；同第０５／０３０８２２Ａ２号パンフレット；及び同第０１／０１０２５号パンフレット；Ｑｕａｋｅ及びＳｃｈｅｒｅｒ、２０００年、「Ｆｒｏｍ ｍｉｃｒｏ ｔｏ ｎａｎｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｓｏｆｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９０：１５３６−４０頁；Ｕｎｇｅｒら、２０００年、「Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ ｐｕｍｐｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｌａｙｅｒ ｓｏｆｔ ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８８：１１３−１１６頁；Ｔｈｏｒｓｅｎら、２００２年、「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」 Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９８：５８０−５８４頁；Ｃｈｏｕら、２０００年、「Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｅｄ Ｒｏｔａｒｙ Ｐｕｍｐ」Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ ３：３２３−３３０頁；Ｌｉｕら、２００３年、「Ｓｏｌｖｉｎｇ ｔｈｅ“ｗｏｒｌｄ−ｔｏ−ｃｈｉｐ”ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ｐｒｏｂｌｅｍ ｗｉｔｈ ａ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｍａｔｒｉｘ」 Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７５、４７１８−２３頁、Ｈｏｎｇら、２００４年、「Ａ ｎａｎｏｌｉｔｅｒ−ｓｃａｌｅ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ｗｉｔｈ ｐａｒａｌｌｅｌ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ」 Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：４３５−３９頁を参照のこと。
本明細書に記載される特定の実施形態によれば、１つ又は複数の試料からの１つ又は複数の標的核酸の検出及び／又は定量化は、概してマイクロ流体デバイスにおいて、試料を入手し、場合により試料を予備増幅し、場合により予備増幅した試料、又はそのアリコートを、適切な緩衝液と、プライマーと、任意の１つ又は複数のプローブと、１つ又は複数の酵素とを含むマイクロ流体デバイスの反応チャンバに分配し、それらの混合物を増幅に供し、及び増幅した標的核酸の存在についてアリコートを調べることにより実行され得る。試料アリコートは１ピコリットル未満、又は様々な実施形態では、約１ピコリットル〜約５００ナノリットルの範囲、約２ピコリットル〜約５０ピコリットルの範囲、約５ピコリットル〜約２５ピコリットルの範囲、約１００ピコリットル〜約２０ナノリットルの範囲、約１ナノリットル〜約２０ナノリットルの範囲、及び約５ナノリットル〜約１５ナノリットルの範囲の容量を有し得る。多くの実施形態において、増幅混合物の容量の大部分が試料アリコートである。従って、増幅混合物は、１ピコリットル未満、又は様々な実施形態では約２、約５、約７、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２５０、約５００、及び約７５０ピコリットル；又は約１、約２、約５、約７、約１５、約２０、約２５、約５０、約２５０、及び約５００ナノリットルの容量を有し得る。増幅混合物はまた、これらの値のいずれかを境界とする任意の範囲（例えば、約２ピコリットル〜約５０ピコリットル）内の容量を有し得る。
特定の実施形態において、個々の増幅混合物、例えばマイクロ流体デバイスの個々の反応チャンバにおいてマルチプレックス検出が実行され、これを用いて、単一のアッセイで分析することのできる試料及び／又は標的の数をさらに増加させたり、又は比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの比較法を実施したりすることができる。様々な実施形態において、最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００、５００、１０００、５０００、１００００回又はそれ以上の増幅反応を各個別の反応チャンバにおいて実施することができる。
具体的な実施形態において、アッセイは通常、少なくとも３桁、より多くの場合に少なくとも４桁、少なくとも５桁、少なくとも６桁、少なくとも７桁、又は少なくとも８桁のダイナミックレンジを有する。
定量的リアルタイムＰＣＲ並びに他の検出及び定量化方法
本発明では、核酸を検出及び／又は定量化する任意の方法を用いて増幅産物を検出することができる。一実施形態では、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて標的核酸が増幅及び／又は定量化される。他の実施形態では、例えば、米国特許第７，１１８，９１０号明細書（増幅／検出システムのその記載について全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるシステム及びＩｎｖａｄｅｒアッセイ；ＰＥ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を含む他の増幅システム又は検出システムが用いられる。詳細な実施形態では、リアルタイム定量化法が用いられる。例えば、「定量的リアルタイムＰＣＲ」法を用いることで、増幅プロセスそれ自体の間に形成された増幅産物の量を計測することによって試料中に存在する標的核酸の量を測定することができる。
蛍光ヌクレアーゼアッセイは、本明細書に記載される方法において成功裏に用いることのできるリアルタイム定量化法の一つの具体例である。増幅産物の形成を監視するこの方法は、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブを使用したＰＣＲ産物蓄積量の連続計測−文献では「ＴａｑＭａｎ（登録商標）法」と称されることの多い手法−を伴う。米国特許第５，７２３，５９１号明細書；Ｈｅｉｄら、１９９６年、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：９８６−９４頁（各々、蛍光ヌクレアーゼアッセイのそれらの記載について全体として参照により本明細書に援用される）を参照のこと。「ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ」がｑＰＣＲに最も広く用いられるが、本発明はそうしたプローブの使用に限定されるものではなく；任意の好適なプローブが用いられ得ることは理解されるであろう。
本発明において用いることのできる他の検出／定量化方法としては、ＦＲＥＴ及び鋳型伸長反応、分子ビーコン検出、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出、Ｉｎｖａｄｅｒ検出、及びパッドロックプローブ検出が挙げられる。
ＦＲＥＴ及び鋳型伸長反応は、ドナー／アクセプター対の一方のメンバーで標識されたプライマーと、ドナー／アクセプター対の他方のメンバーで標識されたヌクレオチドとを利用する。鋳型依存的伸長反応の間に標識されたヌクレオチドをプライマーに取り込む前は、ドナーとアクセプターとは、エネルギー移動が起こり得ない間隔だけ十分に離間されている。しかしながら、標識されたヌクレオチドがプライマーに取り込まれ、間隔が十分に近い場合には、エネルギー移動が起こり、それを検出することができる。こうした方法は、一塩基変異多型の検出における単一塩基対の伸長反応の実行に特に有用であり、米国特許第５，９４５，２８３号明細書及び国際公開第９７／２２７１９号パンフレットに記載される。
分子ビーコンでは、プローブが増幅産物の相補領域とハイブリダイズするとプローブの立体構造が変化することにより、検出可能なシグナルの形成がもたらされる。プローブそれ自体は２つの部分を含む：一方の部分は５’末端にあり、及び他方の部分は３’末端にある。これらの部分は、プローブのなかの、プローブ結合部位とアニールする部分に隣接し、互いに相補的である。一方の末端部分は典型的にはレポーター色素に結合し、及び他方の末端部分は通常クエンチャー色素に結合する。溶液中で２つの末端部分は互いにハイブリダイズし、ヘアピンループを形成することができる。この立体構造において、レポーター色素とクエンチャー色素とは、レポーター色素からの蛍光がクエンチャー色素によって有効に消光される十分に近い近接性を有する。対照的に、ハイブリダイズされたプローブは直鎖化した立体構造をもたらし、消光の程度が低下する。従って、２つの色素について発光の変化を監視することにより、増幅産物の形成を間接的に監視することが可能である。このタイプのプローブ及びその使用方法については、例えば、Ｐｉａｔｅｋら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：３５９−６３頁；Ｔｙａｇｉ及びＫｒａｍｅｒ、１９９６年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：３０３−３０８頁；及びＴｙａｇｉら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３頁（１９９８年）によってさらに記載されている。
Ｓｃｏｒｐｉｏｎ検出法については、例えば、Ｔｈｅｌｗｅｌｌら ２０００年、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２８：３７５２−３７６１頁及びＳｏｌｉｎａｓら、２００１年、「Ｄｕｐｌｅｘ Ｓｃｏｒｐｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｉｎ ＳＮＰ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ＦＲＥＴ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」 Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２９：２０頁によって記載されている。Ｓｃｏｒｐｉｏｎプライマーは、プローブエレメントがＰＣＲストッパーを介して５’末端に結合した蛍光ＰＣＲプライマーである。これらは、均一溶液中のＰＣＲ産物のリアルタイムアンプリコン特異的検出において使用される。「ステム−ループ」フォーマットと「デュプレックス」フォーマットとの２つの異なるフォーマットが可能である。いずれの場合にも、プロービング機構は分子内のものである。全てのフォーマットにおけるＳｃｏｒｐｉｏｎの基本エレメントは、（ｉ）ＰＣＲプライマー；（ｉｉ）プローブエレメントのＰＣＲリードスルーを防止するＰＣＲストッパー；（ｉｉｉ）特異的プローブ配列；及び（ｉｖ）少なくとも１個のフルオロフォアとクエンチャーとを含む蛍光検出系である。ＳｃｏｒｐｉｏｎプライマーのＰＣＲ伸長後、得られるアンプリコンはプローブと相補的な配列を含み、この配列は各ＰＣＲサイクルの変性段階の間に一本鎖にされる。冷却中にプローブはこの相補配列に自由に結合することができ、クエンチャーはもはやフルオロフォアに近接していないため、蛍光の増加がもたらされる。ＰＣＲストッパーが、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼによるプローブの望ましくないリードスルーを防止する。
Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ（Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））は、特にＳＮＰ遺伝子タイピングに用いられ、標的核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）又は多型部位と相補的な、シグナルプローブと命名されるオリゴヌクレオチドを利用する。Ｉｎｖａｄｅｒ Ｏｌｉｇｏと命名される第２のオリゴヌクレオチドは同じ５’ヌクレオチド配列を含むが、３’ヌクレオチド配列がヌクレオチド多型を含む。Ｉｎｖａｄｅｒ Ｏｌｉｇｏは、多型を含むヌクレオチドにおいてシグナルプローブの５’末端が「フラップ」を形成して、シグナルプローブの標的核酸との結合を妨げる。この複合体は、Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素と称される構造特異的エンドヌクレアーゼによって認識される。Ｃｌｅａｖａｓｅはヌクレオチドの５’フラップを切断する。遊離したフラップは、ＦＲＥＴ標識を有する第３のプローブと結合し、それによりＣｌｅａｖａｓｅ酵素によって認識される別のデュプレックス構造を形成する。この場合は、Ｃｌｅａｖａｓｅ酵素はフルオロフォアをクエンチャーから切り離し、蛍光シグナルを生成する。ＳＮＰ遺伝子タイピングについては、シグナルプローブは参照（野生型）対立遺伝子又は変異（突然変異）対立遺伝子のいずれかとハイブリダイズするように設計され得る。ＰＣＲと異なり、シグナルの線形増幅があって核酸増幅がない。当業者が指針とするのに十分なさらなる詳細が、例えば、Ｎｅｒｉ，Ｂ．Ｐ．ら、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３８２６：１１７−１２５頁、２０００年）及び米国特許第６，７０６，４７１号明細書によって提供される。
パッドロックプローブ（ＰＬＰ）は、長い（例えば、約１００塩基の）直鎖状オリゴヌクレオチドである。プローブの３’末端及び５’末端の配列が、標的核酸内の隣接する配列と相補的である。ＰＬＰの非相補的領域である中心には「タグ」配列があり、これを使用して特異的ＰＬＰを同定することができる。タグ配列にはユニバーサルプライミング部位が隣接し、これによりタグのＰＣＲ増幅が可能となる。標的とハイブリダイズすると、ＰＬＰオリゴヌクレオチドの両端がごく近接した状態となり、酵素ライゲーションによってつなぎ合わせることができる。得られる産物は、標的ＤＮＡ鎖と結合した環状プローブ分子である。任意のライゲートされなかったプローブ（すなわち、標的とハイブリダイズしなかったプローブ）が、エキソヌクレアーゼの作用により取り除かれる。ＰＬＰのハイブリダイゼーション及びライゲーションでは、双方の末端セグメントが標的配列を認識する必要がある。このように、ＰＬＰは極めて特異的な標的認識を提供する。
次に環状化されたＰＬＰのタグ領域を増幅し、得られたアンプリコンを検出することができる。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）リアルタイムＰＣＲを実施してアンプリコンを検出及び定量化することができる。アンプリコンの存在及び量は、試料中の標的配列の存在及び量と相関し得る。ＰＬＰについての記載は、例えば、Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら、２００３年、「Ｐａｄｌｏｃｋ ａｎｄ ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ ｐｒｏｂｅｓ ｆｏｒ ｉｎ ｓｉｔｕ ａｎｄ ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ ａｎａｌｙｓｅｓ：ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｏｓｔ−ｇｅｎｏｍｉｃ ｅｒａ」、Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５２５−３０頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら、２００６年、「Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｇｅｎｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｌｏｓｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｌｅｓ」 Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２４：８３−８頁；Ｎｉｌｓｓｏｎら、１９９４年、「Ｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅｓ：ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｆｏｒ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ＤＮＡ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：２０８５−８頁を参照のこと。
詳細な実施形態において、プローブに対する検出可能標識として使用することのできるフルオロフォアとしては、限定はされないが、ローダミン、シアニン３（Ｃｙ３）、シアニン５（Ｃｙ５）、フルオレセイン、Ｖｉｃ（商標）、Ｌｉｚ（商標）、Ｔａｍｒａ（商標）、５−Ｆａｍ（商標）、６−Ｆａｍ（商標）、及びＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）が挙げられる。（Ｖｉｃ（商標）、Ｌｉｚ（商標）、Ｔａｍｒａ（商標）、５−Ｆａｍ（商標）、６−Ｆａｍ（商標）は、全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、Ｃａｌｉｆ．）から入手可能である）。
蛍光指示薬を含む組成物を伴う熱サイクリング反応を実行し、特定波長の光ビームを発し、蛍光色素の強度を読み取り、各サイクル後に蛍光の強度を表示することのできるデバイスが開発されている。サーマルサイクラー、光線エミッター、及び蛍光シグナル検出器を含むデバイスが、例えば、米国特許第５，９２８，９０７号明細書；同第６，０１５，６７４号明細書；及び同第６，１７４，６７０号明細書に記載されている。
いくつかの実施形態において、これらの機能の各々は、別個のデバイスにより実行することができる。例えば、増幅にＱβレプリカーゼ反応を用いる場合、反応はサーマルサイクラーでは行われないこともあり、しかし特定波長で放たれる光ビーム、蛍光シグナルの検出、並びに増幅産物の量の計算及び表示は含み得る。
詳細な実施形態において、標的核酸の精密な定量化に、熱サイクリングと蛍光検出とが組み合わわれたデバイスを使用することができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の熱サイクルの前及び／又は後に蛍光シグナルを検出して表示することができ、従って反応が「リアルタイム」で起こるに従い増幅産物を監視することが可能である。特定の実施形態では、増幅産物の量及び増幅サイクルの回数を使用して、増幅前にどれだけの標的核酸配列が試料中にあったかを計算することができる。
いくつかの実施形態によれば、単に、試料中の標的核酸配列の存在を指示するのに十分な所定回数のサイクル後、増幅産物の量を監視するのみであり得る。当業者は、任意の所与の試料タイプ、プライマー配列、及び反応条件について、何回のサイクルが所与の標的核酸の存在を決定するのに十分であるかを容易に判断することができる。
特定の実施形態によれば、蛍光シグナルにより示される増幅産物を定量化するため内部標準を用いることができる。例えば、米国特許第５，７３６，３３３号明細書を参照のこと。
予備増幅を用いる様々な実施形態において、予備増幅サイクルの回数は、１つ又は複数のヌクレオチドタグを標的ヌクレオチド配列に付加し、それによってタグ付き標的ヌクレオチド配列の相対的なコピー数が、試料中の標的核酸の相対的なコピー数を実質的に代表するものとなるのに十分である。例えば、試料特異的又はセット特異的ヌクレオチドタグを導入するために、予備増幅は２〜２０サイクルにわたり実施され得る。他の実施形態では、検出は指数関数的増幅の最後、すなわち「プラトー」段階の間に実施され、又はエンドポイントＰＣＲが実施される。この場合、予備増幅によってアンプリコンコピー数が標的に関して且つ試料に関して正規化され得る。様々な実施形態において、予備増幅及び／又は増幅は、約２、４、１０、１５、２０、２５、３０、３５、若しくは４０サイクル又はこれらの値のいずれかを境界とする任意の範囲内にあるサイクル回数にわたり実施され得る。
標識戦略
任意の好適な標識戦略を本発明の方法に用いることができる。アッセイ混合物がアリコートに分割され、且つ各アリコートが単一の増幅産物の存在について分析される場合、増幅混合物中にユニバーサル検出プローブを用いることができる。詳細な実施形態において、ユニバーサルｑＰＣＲプローブを使用してリアルタイムＰＣＲ検出を実施することができる。好適なユニバーサルｑＰＣＲプローブとしては、二本鎖ＤＮＡ色素、例えば、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｐｉｃｏ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ））、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ（Ｂｉｏｔｉｎｕｍ）、臭化エチジウムなどが挙げられる（Ｚｈｕら、１９９４年、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１９４１−４８頁を参照のこと）。好適なユニバーサルｑＰＣＲプローブはまた、あらゆる増幅産物中に存在するヌクレオチド配列に結合する配列特異的プローブも含む。かかるプローブに対する結合部位は、好都合には増幅中にタグ付き標的核酸に導入することができる。
或いは、増幅混合物中に１つ又は複数の標的特異的ｑＰＣＲプローブ（すなわち、検出する標的ヌクレオチド配列に特異的なもの）を用いて増幅産物が検出される。標的特異的プローブは、例えば多数の試料においてわずか数個の標的核酸を検出するとき、有用であり得る。例えば、わずか３個の標的を検出するとすれば、各標的について異なる蛍光標識を有する標的特異的プローブが用いられ得る。標識を慎重に選択することにより、単一の反応物において異なる標識が異なる波長で励起及び／又は検出される分析を行うことができる。例えば、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」（Ｐｅｓｃｅら編） Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９７１年）；Ｗｈｉｔｅら、「Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９７０年）；Ｂｅｒｌｍａｎ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、第２版、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９７１年）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、「Ｃｏｌｏｕｒ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９７６年）；「Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ」（Ｂｉｓｈｏｐ編）、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９７２３；及びＨａｕｇｌａｎｄ、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ（１９９２年）を参照のこと。
不要な反応成分の除去
多数の反応ステップが用いられる核酸の複合混合物が関わる反応では、取り込まれない反応成分が種々生じ得るとともに、様々なクリーンアップ手順のいずれかによるかかる取り込まれなかった反応成分の除去、又はその濃度の低減により、続いて起こる反応の効率及び特異性が向上し得ることは理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される増幅ステップを実施する前に、予備増幅プライマーを除去するか、又はその濃度を低減することが望ましいこともある。
特定の実施形態において、不要な成分の濃度は、単純な希釈により低減することができる。例えば、予備増幅した試料は、増幅前に約２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍希釈して、続く増幅ステップの特異性を高めることができる。
いくつかの実施形態では、不要な成分は、様々な酵素的手段によって取り除くことができる。上記の方法に代えて又は加えて、不要な成分は精製によって取り除くことができる。例えば、精製タグを上記のプライマーのいずれかに（例えば、バーコードヌクレオチド配列に）組み込み、タグ付き標的ヌクレオチドの精製を促進することができる。
詳細な実施形態において、クリーンアップは、所望の核酸の選択的固定化を含む。例えば、所望の核酸を固形担体上に選択的に固定化することができる。例示的実施形態では、ビオチン（例えば、フォトビオチン）などの親和性部分が所望の核酸に結合され、得られたビオチン標識核酸が、ストレプトアビジンなどの親和性部分との結合剤を含む固形担体上に固定化される。固定化された核酸をプローブで調べることができ、ハイブリダイズされなかった、及び／又はライゲートされなかったプローブを洗浄により取り除くことができる（例えば、国際公開第０３／００６６７７号パンフレット及び米国特許出願第０９／９３１，２８５号明細書を参照のこと）。或いは、固定化された核酸を洗浄して他の成分を取り除き、次にさらなる分析のため固形担体から遊離させることができる。この手法は、例えば、ＤＮＡ配列決定用のプライマー結合部位を付加した後の増幅混合物からの標的アンプリコンの収集に用いることができる。詳細な実施形態では、ビオチンなどの親和性部分は増幅プライマーに結合させることができ、それにより増幅を行うと、親和性部分で標識された（例えば、ビオチン標識された）アンプリコンが産生される。従って、例えば、３個のプライマーを用いてバーコード及びヌクレオチドタグエレメントを標的ヌクレオチド配列に付加する場合、上記のとおり、バーコード又はリバースプライマーのうちの少なくとも１個が親和性部分を含むことができる。４個のプライマー（２個のインナープライマー及び２個のアウタープライマー）を用いて所望のエレメントを標的ヌクレオチド配列に付加する場合、アウタープライマーのうちの少なくとも１個が親和性部分を含むことができる。
データ出力及び分析
特定の実施形態において、本発明の方法が行列型マイクロ流体デバイスで実施される場合、データはヒートマトリックス（「ヒートマップ」とも称される）として出力され得る。ヒートマトリックスでは、ＤＡマトリックス上の反応チャンバを表す各四角形に、グレースケールで示され得るが、しかしより典型的にはカラーで示される色値が割り当てられている。グレースケールでは、黒色の四角形が、増幅産物が検出されなかったことを示し、一方、白色の四角形が最も高い増幅産物レベルを示し、灰色の陰影が中間の増幅産物レベルを示す。さらなる態様では、ソフトウェアプログラムを使用して、ヒートマトリックスで作成されたデータがより解読し易いフォーマットにコンパイルされてもよい。
応用
本発明の方法は、核酸試料中の１つ又は複数の標的核酸の存在又は量を検出することを意図した任意の技法に適用可能である。従って、例えば、これらの方法は、特定の多型（ＳＮＰなど）、対立遺伝子、又はハプロタイプ、又は増幅、欠失、若しくは異数性などの染色体異常の同定に適用することが可能である。この方法は、遺伝性疾患若しくは障害の診断、ファーマコゲノミクス（個別化された医薬）、農業における（例えば、種子若しくは家畜についての）品質管理、植物若しくは動物の集団の（例えば、水産養殖若しくは漁業経営における、又は集団多様性の判定における）研究及び管理、又は父子鑑別若しくは法鑑定を含む数多くの文脈で実施され得る遺伝子タイピングにおいて用いられ得る。本発明の方法は、生体試料又は環境試料における特定の条件又は生物を示す配列の同定において適用することができる。例えば、アッセイにおいて本方法を用いることにより、ウイルス、細菌、及び真菌）などの病原体を同定することができる。本方法はまた、環境又は微環境の特性決定、例えばヒト腸内の微生物種の特性決定を目的とした研究にも用いることができる。
これらの方法はまた、ＤＮＡ又はＲＮＡコピー数の測定にも用いることができる。ゲノムＤＮＡ中の異常ＤＮＡコピー数の測定は、例えば癌などの、遺伝的欠陥及び疾患の診断及び／又は予後において有用である。ＲＮＡ「コピー数」、すなわち発現レベルの測定は、例えば、種々の条件（例えば、種々の外部刺激又は疾患状態）及び／又は種々の発生段階にある種々の個体、組織、又は細胞において対象とする遺伝子の発現をモニタリングするのに有用である。
加えて、本方法は、例えばＤＮＡ配列決定などのさらなる分析用の核酸試料の調製に用いることができる。
最後に、核酸試料は第１の段階として後続の分析の前にタグを付加することで、試料の標識誤り又はクロスコンタミネーションにより結果が損なわれるリスクを低減することができる。例えば、任意の診療所、検査室、又は病院が、採取後直ちに試料にタグを付加することができ、及びタグは分析時に確認され得る。同様に、犯罪現場で採集された核酸を含む試料が、実行可能となり次第直ちにタグを付加され、試料の標識誤り又は混入ができないよう確実とされる。試料がある当事者から別の当事者に移る毎にタグを検出することを用いて、試料の分析過程の管理（ｃｈａｉｎ ｏｆ ｃｕｓｔｏｄｙ）を確立することができる。
キット
本発明に係るキットは、本発明の１つ又は複数のアッセイ方法の実行に有用な１つ又は複数の試薬を含む。キットは、概して、１つ又は複数の試薬（例えば、プライマー及び／又は１つ又は複数のプローブ）を、１つ又は複数の別個の組成物として、又は場合により、試薬の適合性上可能である場合には混合物として保持する１つ又は複数の容器を備えたパッケージを含む。キットはまた、１つ又は複数の緩衝剤、１つ又は複数の希釈剤、１つ又は複数の標準、及び／又は試料の処理、洗浄、若しくはアッセイの任意の他のステップの実行に有用な任意の他の材料などの、使用者の立場から望ましいものであり得る１つ又は複数の他の材料も含むことができる。
本発明に係るキットは、概して、本発明の方法の１つ又は複数を実施するための使用説明書を含む。本発明のキットに含まれる使用説明書は包装材料に貼着されてもよく、又は添付文書として含まれてもよい。使用説明書は典型的には文書又は印刷物であるが、それに限定されるものではない。かかる使用説明書を保存してそれを最終利用者に伝達する能力を有する任意の媒体が、本発明により企図される。かかる媒体としては、限定はされないが、電子記憶媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ ＲＯＭ）、ＲＦタグなどが挙げられる。本明細書で使用されるとき、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
本明細書に記載される例及び実施形態は例示目的に過ぎず、それらを踏まえた様々な修正又は変更が当業者に提案され得るとともに、本願の趣旨及び範囲並びに添付の特許請求の範囲の中に含まれることが理解される。
加えて、本明細書に引用される他の全ての刊行物、特許、及び特許出願は、本明細書によってあらゆる目的から全体として参照により援用される。
実施例１
ＤＮＡ配列決定用の調製において標的核酸にバーコード付加するためのマルチプライマー増幅方法
１００ｎｇ／ｍｌ及び０ｎｇ／ｍｌ（陰性対照［「ＮＴＣ」］）のゲノムＤＮＡ試料（ＢｉｏＣｈａｉｎ、米国）を、プライマー当たり２００ｎＭで以下のプライマー対により、７９００ＨＴ ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国）の２５サイクルにわたり増幅した：１）４５４テール；２）Ａ５特異的プライマー；及び３）図１０に示される３個のプライマー。７．５μｌのＦａｓｔＳｔａｒｔ ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、米国）と、０．７５μｌのＤＡ試料ローディング試薬（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐ、米国）と、６．７５μｌの試料とを含む１５μｌの反応容量でＰＣＲを実行した。熱サイクリング条件は、５０℃で２分間及び９４℃で１０分間のホットスタートと、それに続く９４℃で１５秒間、７０℃で５秒間、６０℃で３０秒間及び７２℃で９０秒間の２５サイクルとを含んだ。得られた増幅産物は、製造者の指示に従いレーン当たり８μｌの反応混合物を用いて電気泳動ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）上に展開した。３−プライマー法により正しいサイズのアンプリコンが産生されたことを示す図１１を参照のこと。ＰＣＲ増幅により生成されたアンプリコンのＡｍｐｕｒｅ Ｂｅａｄｓ（登録商標）を用いた精製、その後のＰＣＲプレート上での４５４テールプライマーによる再増幅と、続くいずれかの４５４テールプライマーによるサンガー配列決定から、３−プライマー法によって正しい配列を有するアンプリコンが生成されたことが示された。
実施例２
ＤＮＡ配列決定用の調製において標的核酸を定量化するためのマルチプライマー増幅方法
様々なＤＮＡの従来のＤＮＡ配列決定法を用いた配列決定用のゲノムＤＮＡを調製するためのプライマーを以下に示す。
ＳｈｏｔＧｕｎ フォワード：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号１）
ＳｈｏｔＧｕｎ リバース：５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号２）
ＳｈｏｔＧｕｎ ＵＰＲ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣ−３’（配列番号３）

ＭＩＤ フォワード：５’−ＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号４）
ＭＩＤ リバース：５’−ＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧ−３’（配列番号５）
ＭＩＤ ＵＰＲ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号６）

Ｓｏｌｅｘａ フォワード：５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ−３’（配列番号７）
Ｓｏｌｅｘａ リバース：５’−ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡ−３’（配列番号８）
Ｓｏｌｅｘａ ＵＰＲ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡ−３’（配列番号９）

Ｓｏｌｉｄ フォワード：５’−ＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１０）
Ｓｏｌｉｄ リバース：５’−ＣＴＧＣＣＣＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＴＣＴ−３’（配列番号１１）
Ｓｏｌｉｄ ＵＰＲ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＴＡＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＴＣＣＴＣＴＣＴＡＴＧ−３’（配列番号１２）

４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ フォワード：５’−ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１３）
４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ リバース：５’−ＣＣＴＡＴＣＣＣＣＴＧＴＧＴＧＣＣＴＴＧ−３’（配列番号１４）
４５４ Ｔｉｔａｎｉｕｍ ＵＰＲ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧ−３’（配列番号１５）

Ｓｏｌｅｘａ ｓｍＲＮＡ フォワード：５’−ＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣ−３’（配列番号１６）
Ｓｏｌｅｘａ ｓｍＲＮＡ リバース：５’−ＡＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣ−３’（配列番号１７）
Ｓｏｌｅｘａ ｓｍＲＮＡ ＵＰＬ フォワード：５’−ＧＧＣＧＧＣＧＡＴＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣ−３’（配列番号１８）
これらのプライマーの特性を以下の表１に示す。
プライマー配列を組み込むためのゲノムＤＮＡの増幅に使用した反応混合物を以下の表２に示す。
実施例３
４５４ＤＮＡシーケンシング用の調製において標的核酸にバーコードを付加するためのさらなる例示的プライマー
以下の表３及び表４は、４５４ＤＮＡシーケンシング用の調製において標的核酸にバーコード付加するためのさらなる例示的プライマーを示す。「４５４Ｆ」は４５４フォワードプライマー結合部位を指し；「４５４Ｒ」は４５４リバースプライマー結合部位を指す。「ＢＣ」はヌクレオチドバーコードを指す。「ＴＡＧ」はヌクレオチドタグを指す。「Ｐ５３」は標的特異的プライマー配列を指す。
実施例４
増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを使用した４５４ＤＮＡシーケンシング用の調製における標的核酸の４−プライマーバーコーディング
前立腺癌に関連する４８個のゲノム領域に対する標的特異的プライマーを設計した。標的特異的領域に加え、５’末端にさらなるタグ配列を含むプライマーを設計した。フォワードプライマーは配列ＡＣＡＣＴＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＴＴＣＴＡＣＡ（配列番号１６３）を含んだ。リバースプライマーは配列ＴＡＣＧＧＴＡＧＣＡＧＡＧＡＣＴＴＧＧＴＣＴ（配列番号１６４）を含んだ。タグ配列と標的特異的領域との双方を含むこれらのプライマーの配列を表５に掲載する。
反応混合物の調製
プライマーを１０ｎｍｏｌ規模でＩＤＴにより合成し、１００μＭの濃度で水中に再懸濁した。９６ウェルＰＣＲプレート（ＵＳＡ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の個別のウェルにおいて、表５の各領域に対するフォワードプライマー及びリバースプライマーを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＣＲ等級水（Ｔｅｋｎｏｖａ）中で各プライマーの最終濃度が１μＭとなるよう組み合わせた。
ＨａｐＭａｐサンプルコレクションからの４８個のヒトゲノムＤＮＡ試料を５０ｎｇ／μｌで低ＥＤＴＡ ＴＥ 緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に再懸濁し、ＰＣＲ用に以下のとおり調製した。
予備試料混合物を以下のとおり調製した。
各試料について、フォワード及びリバースバーコードプライマーとゲノムＤＮＡと予備試料混合物とを含む試料混合を、９６ウェルＰＣＲプレートの個々のウェルに調製した。
各試料を、表８から選択される一対のバーコードプライマーと混合した。
Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣの実行
封鎖及び接合部アキュムレータリザーバを３０μｌの制御ライン流体（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＰＮ ８９００００２０）で充填し、Ｈ１〜Ｈ４試薬ウェルにＰＣＲ等級水中の５００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０をロードした後、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣのロードを行った。５μｌの各試料混合物を試料ポートにロードし、５μｌの各プライマー混合物をＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣのプライマー入口にロードした。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造されるＢｉｏＭａｒｋ（商標）リアルタイムＰＣＲシステムを使用してＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣを熱サイクルにかけ、画像化した。Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣ熱サイクリングプロトコルは、熱混合ステップ［５０℃で２分間、７０℃で２０分間］、ホットスタートステップ［９５℃で１０分間］、３５サイクルのタッチダウンＰＣＲ戦略［９５℃で１５秒間及び６３℃で１分間を２サイクル、９５℃で１５秒間及び６２℃で１分間を２サイクル、９５℃で１５秒間及び６１℃で１分間を２サイクル、９５℃で１５秒間及び６０℃で１分間を２サイクル、９５℃で１５秒間及び５８℃で１分間を２サイクル、９５℃で１５秒間及び７２℃で１分間を２５サイクル］、及び伸長ステップ［７２℃で３分間］を含む。ＦｌｕｉｄｉｇｍリアルタイムＰＣＲ分析ソフトウェアによりリアルタイムデータを分析し、各反応チャンバについてのＣＴ値を得た。
増幅後、Ｐｏｓｔ−ＰＣＲ ＩＦＣ Ｌｏａｄｅｒ ＡＸを使用してＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣからＰＣＲ産物を回収した。回収前に、各試料ポートを２μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で充填した。Ｈ１〜Ｈ４試薬ウェルから残留溶液を取り出し、それらのウェルを６００μｌの１×Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ回収試薬（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で再度充填した。回収後、各試料ポートは、１０μｌ（±１０％）の４８個のプールされたＰＣＲ産物を含むＰＣＲ産物出口となった。プールされたＰＣＲ産物をＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣから取り出し、マイクロタイタープレートに４℃で保存した。
各試料につき１μｌの各ＰＣＲ産物プールを取り、Ａｇｉｌｅｎｔ １Ｋ バイオアナライザーチップにロードした。図１２は、４８個の個別の産物プールの各々からの電気泳動図を示す。図１３は、単一の産物プール内の産物のサイズ分布を示す。全ての産物が予想サイズの範囲内にあり、小さいサイズのＰＣＲ副産物の証拠は一切ない。
Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザートレースから計算された濃度に基づき、各試料についてＰＣＲ産物をプールした。ＡＭＰｕｒｅビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ）を使用して、製造者の指示に従い産物プールを精製した。
精製した産物プールをエマルジョンＰＣＲに供し、続いて４５４ ＦＬＸシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で製造者の指示に従いパイロシーケンシングにかけた。次に、バーコード付きＰＣＲ産物の存在について、シーケンサーによって出力された配列ファイルを分析した。
各バーコードについて得られた配列数をカウントしてプロットした（図１４（Ａ））。各バーコードについて平均約３４００個の配列がカウントされた。全ての試料は、平均の５０％超〜平均の２倍未満を示した。
次に、各試料中の各個別のＰＣＲ産物についてカウントされた配列数を分析した（図１４（Ｂ））。２３０４個のＰＣＲ産物のうち１個のみがシーケンサーで観測されなかった。大多数の配列は平均の５０％超〜平均の２倍未満で存在した。２３０４個の産物のうち２３０３個は５回より多くカウントされた。図１４（Ｃ）は、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣにおける全２３０４個のＰＣＲ反応物からのＰＣＲ産物の分布を示す。配列の９５％超が平均カバレッジの５０％〜２倍の間で計測された。配列の９９％超が平均カバレッジの５０％〜２倍の間で計測された。
実施例５
プライマー結合部位とヌクレオチドタグとの種々の組み合わせによる４個のアウタープライマーを使用したマルチプライマー増幅
ＥＧＦＲ遺伝子及びＭＥＴ遺伝子から特定の領域を増幅するようにプライマー対のセットを設計した。次にそれらのセットを、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣにおいてヒトゲノムＤＮＡ及び４個のアウタープライマーと組み合わせた（図１５）。
反応混合物の調製
プライマーを１０ｎｍｏｌ規模でＥｕｒｏｆｉｎｓ ＭＷＧ Ｏｐｅｒｏｎにより合成し、１００μＭの濃度で水中に再懸濁して提供した。９６ウェルＰＣＲプレート（ＵＳＡ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の別個のウェルにおいて、表９の各領域に対するフォワード及びリバースプライマーを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＣＲ等級水（Ｔｅｋｎｏｖａ）中で各プライマーの最終濃度が１μＭになるように組み合わせた。
単一のヒトゲノムＤＮＡ試料（Ｃｏｒｉｅｌｌ ＮＡ１０８３０）を５０ｎｇ／μｌで低ＥＤＴＡ ＴＥ 緩衝液（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に再懸濁し、以下のとおりＰＣＲ用に調製した。
予備試料混合物は以下のとおり調製した。
各試料複製物について、フォワード及びリバースバーコードプライマーとゲノムＤＮＡと予備試料混合物とを含む試料混合物を、９６ウェルＰＣＲプレートの個別のウェルに調製した。
各試料を、表１２から選択される一対のバーコードプライマーと混合することにより、４個の複製物試料を調製した。
Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣの実行
封鎖及び接合部アキュムレータリザーバを３００μｌの制御ライン流体（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＰＮ ８９００００２０）で充填し、Ｈ１〜Ｈ４試薬ウェルにＰＣＲ等級水中の５００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０をロードした後、Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣのロードを行った。５μｌの各試料混合物を試料ポートにロードし、５μｌの各プライマー混合物をＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣ上のプライマー入口にロードした。
ＩＦＣ独立型サーマルサイクラー（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣを熱サイクルにかけ、画像化した。熱サイクリングプロトコルは、熱混合ステップ［５０℃で２分間、７０℃で２０分間］、ホットスタートステップ［９５℃で１０分間］、３５サイクルＰＣＲ戦略［９５℃で１５秒間及び６０℃で４分間の２サイクル、９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、７２℃で１分間の３３サイクル、及び伸長ステップ［７２℃で３分間］を含む。
増幅後、Ｐｏｓｔ−ＰＣＲ ＩＦＣ Ｌｏａｄｅｒ ＡＸを使用してＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣからＰＣＲ産物を回収した。回収前、各試料ポートを２μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で充填した。Ｈ１〜Ｈ４試薬ウェルから残留溶液を取り出し、それらのウェルを６００μｌの１×Ａｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ回収試薬（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で再充填した。回収後、各試料ポートは、１０μｌ（±１０％）の４８個のプールされたＰＣＲ産物を含むＰＣＲ産物出口となった。プールされたＰＣＲ産物をＡｃｃｅｓｓ Ａｒｒａｙ ＩＦＣから取り出し、マイクロタイタープレートに４℃で保存した。
Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザートレースから計算された濃度に基づき、各試料についてＰＣＲ産物をプールした。精製した産物プールをエマルジョンＰＣＲに供し、続いて４５４ ＦＬＸシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において製造者の指示に従いパイロシーケンシングにかけた。エマルジョンＰＣＲ反応は、結合したＡ及びＢプライマー配列の双方を含むビーズにより実行し、アンプリコンの双方の鎖についての配列読み取りを可能とした。
各試料中の各個別のＰＣＲ産物についてカウントされた配列数を分析し、図１５に示されるＰＣＲ産物のリプレゼンテーションを実証した。配列は、図１５Ｂに示されるアンプリコンの各々について、エマルジョンＡからのタグ５配列をエマルジョンＢからのタグ８配列（図１６Ａ）と、又はエマルジョンＢからのタグ５配列をエマルジョンＡからのタグ８配列と加算することによりカウントすることができた。図１６は、全てのアンプリコンのリプレゼンテーションが主に平均カバレッジの２倍〜０．５倍の間にあることを示す。さらに、図１６Ｂに示されるアンプリコンは試料内のばらつきがより小さいことを示しているが、各プライマー対についての双方のアンプリコンのリプレゼンテーションは極めて類似している。
実施例６
増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）産物の収集が可能なマイクロ流体デバイスを使用したＩｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡシーケンシング用の標的核酸の４−プライマーバーコーディング
４−プライマータギングスキーム用に、Ｉｌｌｕｍｉｎａゲノムアナライザー（Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ）ＩＩで使用されるように設計された配列を、表１３及び表１４に示す。タグ配列はインナープライマー配列である。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＧＡ ＩＩシーケンサーでの使用向けに設計された４−プライマー戦略を使用したＰＣＲ産物の増幅（ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）の成功例を図１７に示す。
実施例７
４５４ ＦＬＸシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるＴｉｔａｎｉｕｍケミストリー用の標的核酸のバーコーディング
表１５は、４５４ ＦＬＸシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるＴｉｔａｎｉｕｍケミストリーで使用されるフォワードバーコード配列を示す。表１６は、４５４ ＦＬＸシーケンサー（Ｒｏｃｈｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるＴｉｔａｎｉｕｍケミストリーで使用されるリバースバーコード配列を示す。
実施例８
標的核酸のマルチプレックスバーコーディング
表９に掲載されるプライマーから１０個のプライマーの３個のプールを構築した。ＰＣＲ条件は実施例４に掲載されるものと同じであったが、但しプライマー濃度は異なった。図１８は、鋳型特異的プライマーのみについて、及び４−プライマーモードでＰＣＲ反応を実行したときの１０組のＰＣＲプライマーの３個のプール（Ａ、Ｂ、Ｃ）のＰＣＲ反応の結果を示す。４−プライマー戦略においてより高分子量の産物が存在することから、４−プライマー構築の成功が実証される。

Claims (24)

  1. 複数の標的核酸を増幅する方法であって、
    反応産物プールの収集が可能なマイクロ流体デバイスにおいて標的核酸毎に増幅混合物を調製するステップであって、容量及び／又はコピー数に関して、デバイスから収集される各プールのばらつきが１０パーセント未満であり、前記増幅混合物の容量が１ピコリットル〜５０ナノリットルの範囲であり、各増幅混合物が、
    標的特異的部分を含むフォワードプライマーと、
    標的特異的部分を含むリバースプライマーと（前記フォワードプライマーが第１のヌクレオチドタグをさらに含み、及び／又は前記リバースプライマーが第２のヌクレオチドタグをさらに含む）、
    バーコードヌクレオチド配列と第１及び／又は第２のヌクレオチドタグ特異的部分とを含む少なくとも１つのバーコードプライマーであって、その濃度が前記フォワード及び／又はリバースプライマーの少なくとも５倍である、バーコードプライマーと、
    を含み、１００より多い数の増幅混合物を調製するステップと、
    各増幅混合物を増幅に供するステップであって、それによりタグ付き標的ヌクレオチド配列を含む複数の標的アンプリコンであって、各々が、前記標的ヌクレオチド配列に隣接する第１及び／又は第２のヌクレオチドタグと、前記標的アンプリコンの５’又は３’末端にある少なくとも１つのバーコードヌクレオチド配列とを含み、前記標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する、標的アンプリコンを産生するステップと、
    を含む方法。
  2. 前記フォワードプライマーが、前記標的特異的部分と第１のヌクレオチドタグを含むインナーフォワードプライマーを含み、
    前記リバースプライマーが、前記標的特異的部分と第２のヌクレオチドタグとを含むインナーリバースプライマーを含み、
    前記増幅混合物が、一方が前記バーコードプライマーである２個のアウタープライマーを含み、
    第１のアウタープライマーが、前記第１のヌクレオチドタグ特異的部分を含み、第２のアウタープライマーが前記第２のヌクレオチドタグ特異的部分を含み、片方又は両方のアウタープライマーが前記バーコードヌクレオチド配列を含み、前記アウタープライマーの濃度が、前記インナープライマーの濃度の少なくとも５倍である、
    請求項１に記載の方法。
  3. 前記第１のアウタープライマーが、前記第１のヌクレオチドタグ特異的部分の上流であるバーコードヌクレオチド配列の上流に第１のさらなるプライマー結合部位を含み、
    前記第２のアウタープライマーが、前記第２のタグ特異的部分、さらなるバーコードヌクレオチド配列、及びその上流の、第２のさらなるプライマー結合部位を含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記フォワードプライマーが第１のヌクレオチドタグをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記リバースプライマーが第２のヌクレオチドタグをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記増幅混合物中の前記バーコードプライマーの濃度が、前記フォワード及び／又はリバースプライマーの濃度の少なくとも５０倍である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記第１及び／又は第２のヌクレオチドタグ及び／又は前記バーコードヌクレオチド配列が、前記標的核酸との実質的なアニーリングを回避するように選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記バーコードヌクレオチド配列が特定の試料を識別する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記バーコードプライマーがバーコードヌクレオチド配列と第１のヌクレオチドタグ特異的部分とを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 複数のフォワードプライマーが同じ第１のヌクレオチドタグを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 各試料中の標的配列の増幅に使用される全てのフォワードプライマーが、同じ第１のヌクレオチドタグを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 各標的に対する前記フォワード及びリバースプライマーが、初めに前記試料とは別に組み合わせされ、及び各バーコードプライマーが、初めにその対応する試料と組み合わされる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. Ｓ個の試料においてＴ個の標的が増幅され、Ｔ及びＳは１より大きい整数であり、Ｓ×Ｔ個の増幅混合物を調製するステップであって、前記初めに組み合わされたフォワード及びリバースプライマーが前記初めに組み合わされた試料及びバーコードプライマーに加えられるステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記増幅が、前記第１及び第２のヌクレオチドタグと前記バーコードヌクレオチド配列とを導入するため少なくとも３サイクルにわたり実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記増幅が５〜５０サイクルにわたり実施される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記増幅が、標的アンプリコンコピー数を標的に関して且つ試料に関して正規化するのに十分なサイクル回数にわたり実施される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  17. 複数の標的核酸を増幅する方法であって、
    反応産物プールの収集が可能なマイクロ流体デバイスおいて標的核酸毎に増幅混合物を調製するステップであって、容量及び／又はコピー数に関して、デバイスから収集される各プールのばらつきが１０パーセント未満であり、前記増幅混合物の容量が１ピコリットル〜５０ナノリットルの範囲であり、
    増幅混合物が、
    標的特異的配列を含むフォワードプライマーと、
    標的特異的配列を含むリバースプライマーと、
    を含み、100より多い数の増幅混合物を調製するステップと、
    各増幅混合物を増幅に供するステップであって、それにより複数の標的ヌクレオチド配列を産生するステップと、
    前記標的ヌクレオチド配列にタグを付加するステップであって、それにより前記標的ヌクレオチド配列に隣接する第１及び／又は第２のヌクレオチドタグを各々が含む複数の標的アンプリコンを産生するステップと、
    を含み、
    前記標的アンプリコンの少なくとも５０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する、方法。
  18. 前記標的アンプリコンの少なくとも７０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 前記標的アンプリコンの少なくとも９０パーセントが、標的アンプリコンの平均コピー数の５０パーセント超、且つ標的アンプリコンの平均コピー数の２倍未満で存在する、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記標的アンプリコンがＤＮＡ配列決定ライブラリを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記増幅混合物から前記標的アンプリコンを収集するステップをさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 配列決定用の標的核酸を調製するために実行される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記標的アンプリコンの平均長さが少なくとも１キロベースである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記マイクロ流体デバイスが、少なくとも一部において、エラストマー材料で作製される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
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