KR20190104611A - 1 단계 프로세스를 통한 앰플리콘 라이브러리 구축 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 1 단계 프로세스를 통해 앰플리콘 라이브러리를 신속하게 구축하는 방법을 개시한다. 본 방법은 하기 단계를 포함한다: 1. DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 데 사용되는 프라이머 조합을 합성하는 단계이며, 여기서 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 데 사용되는 프라이머 조합은 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 정방향 융합 프라이머, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 역방향 융합 프라이머, 정방향 범용 프라이머 및 역방향 범용 프라이머를 포함하는 것인 단계; 2. DNA 샘플의 PCR 반응 시스템을 구축하는 단계; 및 3. PCR을 수행하는 단계.
Description
본 발명은 2017년 4월 5일자로 제네트론 헬쓰 (베이징) 컴퍼니, 리미티드(Genetron Health(Beijing) Co., Ltd.)에 의해 중국 특허청에 출원된 중국 특허 출원 출원 번호 201710218529.4 (발명의 명칭: "method for rapidly constructing amplicon library through one-step process")를 우선권 주장한다. 상기 출원의 전문이 본원에서 참조로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 생명공학 분야, 및 특히 1 단계 프로세스를 통해 앰플리콘 라이브러리를 신속하게 구축하는 방법에 관한 것이다.
최근 몇 년 동안 차세대 서열분석법 (NGS)이 그의 고처리량, 고감도, 및 높은 수준의 자동화에 기인하여 질환 연구, 진단, 및 치료에서 널리 사용되어 오고 있다. 종래 검출 방법과 비교하여, NGS 기술은 다중 유전자를 동시에 검출할 수 있고, 샘플을 절약할 수 있다. 게다가, 이는 감도가 더 높은 바, 이를 통해 더욱 사실적인 방식으로 종양 변이의 파노라마식 뷰를 복원시킬 수 있다. 그러나, 라이프(Life) NGS 플랫폼에서의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 종래 방법은 번거롭고, PCR 증폭, 소화, 첨가 및 정제를 필요로 하며, 약 5시간이 소요된다. 추가로, 다단계의 조작에서는 뚜껑을 개봉하여야 하기 때문에, 라이브러리는 쉽게 오염되고, 라이브러리 손실률은 높다. 추가로, 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 종래 방법에서, 단일 샘플에 대하여 라이브러리를 확립하는 비용은 사례당 약 200-1,000 RMB로 비교적 높다.
배경기술 부분에 개시된 정보는 오직 본 발명의 일반적인 배경에 대한 이해를 증진시키기 위한 것으로만 의도되며, 상기 정보가 관련 기술분야의 통상의 기술자들에게 이미 공지되어 있는 선행 기술을 형성한다는 것을 인정하는 것으로, 또는 어떤 형태로든 제안하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본 발명의 목적은 1 단계 프로세스를 통해 앰플리콘 라이브러리를 신속하게 구축하는 방법을 제공하는 것이다. 본 방법은 간단하고, 신속한 방식으로 1 단계 PCR에 의해 앰플리콘 라이브러리를 구축할 수 있고, 바코드가 PCR 시작 이전에 도입되기 때문에, 샘플과 라이브러리 사이의 교차 오염의 가능성은 크게 감소되고, 실험 사이트 파티션의 요구 사항이 간소화될 수 있다. 본 방법은 또한 단일 샘플 라이브러리를 확립하는 데 드는 비용을 사례당 30 RMB로 통제한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법을 제공한다.
단계 1: DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합을 합성하는 단계이며, DNA 샘플을 구축하는 데 사용되는 앰플리콘 라이브러리의 프라이머 조합은
표적 앰플리콘에 따라 디자인된 융합 프라이머. 상류 융합 프라이머는 5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열 (브릿지(Bridge) 서열) 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열을 포함한다;
표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머. 하류 융합 프라이머는 5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열 (trP1 서열) 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열을 포함한다;
제3 링커 서열 (A 서열), 바코드 서열, 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열을 포함하는 상류 범용 프라이머; 및
범용 서열 (Uni 서열), 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열을 포함하는 하류 범용 프라이머를 포함하는 것인 단계;
단계 2: DNA 샘플을 위한 PCR 반응 시스템을 구축하고, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머를 함께 혼합하여 PCR 반응 시스템에서 프라이머 조합으로서 제공하는 단계;
단계 3: PCR을 수행하는 단계.
본 발명의 한 실시양태에서, 제1 링커 서열은 서열식별번호(SEQ ID): 1의 서열을 포함하고, 서열식별번호: 1의 서열의 뉴클레오티드 서열은 GGCATACGTCCTCGTCTA이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제2 링커 서열은 서열식별번호: 2의 서열을 포함하고, 서열식별번호: 2의 서열의 뉴클레오티드 서열은 TCTATGGGCAGTCGGTGAT이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 제3 링커 서열은 서열식별번호: 3의 서열을 포함하고, 서열식별번호: 3의 서열의 뉴클레오티드 서열은 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 범용 서열은 서열식별번호: 4의 서열을 포함하고, 서열식별번호: 4의 서열의 뉴클레오티드 서열은 CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 동일한 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합에서, 상류 범용 프라이머 중의 바코드 서열은 동일하다. 상이한 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합에서, 상류 범용 프라이머 중의 바코드 서열은 상이하다. 바코드 서열은 샘플에 상응하는 것이다. 바코드 서열은 상이한 샘플 간에는 상이하다. 상이한 샘플이 구별될 수만 있다면, 바코드 서열은 특이적이지 않고, 그의 서열은 변이될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 표적 앰플리콘 중 어느 하나에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 농도, 표적 앰플리콘 중 어느 하나에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 농도, 상류 범용 프라이머의 농도, 및 하류 범용 프라이머의 농도는 모두 100 μM이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 동일한 PCR 반응에서 표적 앰플리콘의 개수가 1 초과일 때, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머는 각 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 조합이고, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머는 각 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 조합이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 표적 앰플리콘 중 어느 하나에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머 대 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 몰비는 1:1이고; 상류 범용 프라이머 대 하류 범용 프라이머의 몰비는 1:1이다. 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머의 구체적인 양은 PCR 증폭 동안 표적 앰플리콘의 개수에 따라 조정되어야 한다. 예를 들어, PCR 증폭시, 5개의 표적 앰플리콘이 증폭되어야 하고, 22개의 표적 앰플리콘이 증폭되어야 할 때, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머의 구체적인 양은 상이할 수 있고, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머의 구체적인 양은 관련 기술분야의 종래 기술에 따라 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, DNA 샘플은 게놈 DNA이다
본 발명의 한 실시양태에서, 게놈 DNA는 조직 샘플 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매된 샘플로부터 추출된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 표적 앰플리콘은 하기 22개의 표적 앰플리콘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함한다:
그의 서열이 서열식별번호: 5:TAAGGGACAAGCAGCCACACCCCATTCTTGAGGGGCTGAGGTGGAAGAGACAGGCCCGGAGGGGTGAGGCAGTCTTTACTCACCTGTAGATGTCTCGGGCCATCCCGAAGTCTCCAATCTTGGCCACTCTTCCAGGGCCTGGACAGGTCAAGAGGCAGT에 제시된, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 6:CGGAGGAAGGACTTGAGGTCTCCCCCCGCCATGAGCTCCAGCAGGATGAACCGGGGCAGGGATTGCAGGCTCACCCCAATGCAGCGAACAATGTTCTGGTGGTTGAATTTGCTGCAGAGCAGAGAGGGATGTAACCAAAATTAACTGAGCTGAGTCTGG에 제시된 ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 7:CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGGATCCAGACAACTGTTCAAACTGATGGGACCCACTCCATCGAGATTTCACTGTAGCTAGACCAAAATCACCTATTTTTACTGTGAGGTCTTCATGAAGAAATATATCTGAGGTGTAGTAAGTAAAGGAAAACAGTAG에 제시된 BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 8: TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTGTCCCCCCCAGCTTGTGGAGCCTCTTACACCCAGTGGAGAAGCTCCCAACCAAGCTCTCTTGAGGATCTTGAAGGAAACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCTGGGCTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATAAGGTAAGGTCCCTGG에 제시된 EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 9: ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCCTTCTCTCTCTGTCATAGGGACTCTGGATCCCAGAAGGTGAGAAAGTTAAAATTCCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAACATCTCCGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCGATGTGAGTTTCTGCTTTGCTGTGT에 제시된 EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 10:GAAGCCACACTGACGTGCCTCTCCCTCCCTCCAGGAAGCCTACGTGATGGCCAGCGTGGACAACCCCCACGTGTGCCGCCTGCTGGGCATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAGCTCATCACGCAGCTCATGCCCTTCGGCTGCCTCCTGGACTATGTCCGGGAACAC에 제시된 EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 11:CCGCAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGGCTGGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAGAAAGAATACCATGCAGAAGGAGGCAAAGTAAGGAGGTGGCTTTAGGTCAGCCAGCATTTTCCTGACACCAGGGACCAGGCTGCCTTCCCACTAGCTGTATTGTTTA에 제시된 EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 12:CATACCCTCTCAGCGTACCCTTGTCCCCAGGAAGCATACGTGATGGCTGGTGTGGGCTCCCCATATGTCTCCCGCCTTCTGGGCATCTGCCTGACATCCACGGTGCAGCTGGTGACACAGCTTATGCCCTATGGCTGCCTCTTAGACCATGTCCG에 제시된 ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 13:AGTCCTCATGTACTGGTCCCTCATTGCACTGTACTCCTCTTGACCTGCTGTGTCGAGAATATCCAAGAGACAGGTTTCTCCATCAATTACTACTTGCTTCCTGTAGGAATCCTGAGAAGGGAGAAACACAGTCTGGATTATTACAGTGCA에 제시된 KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 14:AAAGAATGGTCCTGCACCAGTAATATGCATATTAAAACAAGATTTACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTCCACAAAATGATTCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCTACGCCACCAGCTCCAACTACCACAAGTTTATATTCAGTCATTTTCAGCAGGCCTT에 제시된 KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 15:TCGATCTGCCATGTGTGCATTCCCTATCAAATATGTCAACGACTTCTTCAACAAGATCGTCAACAAAAACAATGTGAGATGTCTCCAGCATTTTTACGGACCCAATCATGAGCACTGCTTTAATAGGGTAAGTCACATCAGTTCCC에 제시된 MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 16:CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGCTCTTTCTTTCTCTCTGTTTTAAGATCTGGGCAGTGAATTAGTTCGCTACGATGCAAGAGTACACACTCCTCATTTGGATAGGCTTGTAAGTGCCCGAAGTGTAAGCCCAACTACAGAAATGGTTTCAAATGAATCTGTAGACTACCGAGCT에 제시된 MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 17:ATGTTACGCAGTGCTAACCAAGTTCTTTCTTTTGCACAGGGCATTTTGGTTGTGTATATCATGGGACTTTGTTGGACAATGATGGCAAGAAAATTCACTGTGCTGTGAAATCCTTGAACAGTAAGTGGCATTTTATTTAACCATGGAGTATACTTTTGTGGTTTGCAAC에 제시된 MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 18:CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTCTTGCCAGAGACATGTATGATAAAGAATACTATAGTGTACACAACAAAACAGGTGCAAAGCTGCCAGTGAAGTGGATGGCTTTGGAAAGTCTGCAAACTCAAAAGTTTACCACCAAGTCAGATGTG에 제시된 MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 19:TTCGCCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCATGGCACTGTACTCTTCTTGTCCAGCTGTATCCAGTATGTCCAACAAACAGGTTTCACCATCTATAACCACTTGTTTTCTGTAAGAATCCTGGGGGTG에 제시된 NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 20:TGAGAGACAGGATCAGGTCAGCGGGCTACCACTGGGCCTCACCTCTATGGTGGGATCATATTCATCTACAAAGTGGTTCTGGATTAGCTGGATTGTCAGTGCGCTTTTCCCAACACCACCTGCTCCAACCACCACCAGTTTGTACTCAG에 제시된 NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 21:GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAGCAATTTCTACACGAGATCCTCTCTCTGAAATCACTGAGCAGGAGAAAGATTTTCTATGGAGTCACAGGTAAGTGCTAAAATGGAGATTCTCTGTTTCTTTTTCTTTATTACAGAAAAAATAACTGAATTTGGCTGATCTCAGCATGTT에 제시된 PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 22:ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGACATTGCATACATTCGAAAGACCCTAGCCTTAGATAAAACTGAGCAAGAGGCTTTGGAGTATTTCATGAAACAAATGAATGATGCACATCATGGTGGCTGGACAACAAAAATGGATTG에 제시된 PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 23:CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACCTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGCAGCTCGTGGTGAGGCTCCCCTTTCTTGCGGAGATTCTCTTCCTCTGTGCGCCGGTCTCTCCCAGGACAGGCACAAACACGCACCTCAAAGCTGTTCCGTCCCAGTAGATTACCACTACTCAGGATAGGAAAAGAG에 제시된 TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 24:GCAAGTGGCTCCTGACCTGGAGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCGGTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTGTTACACATGTAGTTGTAGTGGATGGTGGTACAGTCAGAGCCAACCTAGGAGATAACACAGGCCCAAGA에 제시된 TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 25:CCCCAGTTGCAAACCAGACCTCAGGCGGCTCATAGGGCACCACCACACTATGTCGAAAAGTGTTTCTGTCATCCAAATACTCCACACGCAAATTTCCTTCCACTCGGATAAGATGCTGAGGAGGGGCCAGACCTAAGAGCAATCAGTGAGGAATCAGAGG에 제시된 TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 26:ACCATCGCTATCTGAGCAGCGCTCATGGTGGGGGCAGCGCCTCACAACCTCCGTCATGTGCTGTGACTGCTTGTAGATGGCCATGGCGCGGACGCGGGTGCCGGGCGGGGGTGTGGAATCAACCCACAGCTGCACAGGGCAGGTCTTGGCCAGTTGGCAAAACATCTTGTTGAGGGCAGGGGAGTACTG에 제시된 TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘.
본 발명의 한 실시양태에서, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 27: ACTGCCTCTTGACCTGTCC에 제시된 것이고; ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 28: TAAGGGACAAGCAGCCACAC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 29: CCAGACTCAGCTCAGTTAATTTTGG에 제시된 것이고; ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 30: CGGAGGAAGGACTTGAGGT에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 31: CTACTGTTTTCCTTTACTTACTACACCTC에 제시된 것이고; BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 32: CCTCAATTCTTACCATCCACAAAATGG에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 33: TGACCCTTGTCTCTGTGTTCTTG에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 34: CCAGGGACCTTACCTTATACACC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 35: ACAATTGCCAGTTAACGTCTTCC에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 36: ACACAGCAAAGCAGAAACTCAC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 37: GAAGCCACACTGACGTGC에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 38: GTGTTCCCGGACATAGTCCAG에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 39: CCGCAGCATGTCAAGATCACA에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 40: TAAACAATACAGCTAGTGGGAAGGC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 41: CATACCCTCTCAGCGTACCC에 제시된 것이고; ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 42: CGGACATGGTCTAAGAGGCAG에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 43: TGCACTGTAATAATCCAGACTGTGT에 제시된 것이고; KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 44: AGTCCTCATGTACTGGTCCCTC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 45: AAGGCCTGCTGAAAATGACTGA에 제시된 것이고; KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 46: AAAGAATGGTCCTGCACCAGTA에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 47: TCGATCTGCCATGTGTGCATT에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 48: GGGAACTGATGTGACTTACCCT에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 49: CCATGATAGCCGTCTTTAACAAGC에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 50: AGCTCGGTAGTCTACAGATTCATTT에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 51: ATGTTACGCAGTGCTAACCAAG에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 52: GTTGCAAACCACAAAAGTATACTCCA에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 53: CAGTCAAGGTTGCTGATTTTGGTC에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 54: CACATCTGACTTGGTGGTAAACTT에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 55: CACCCCCAGGATTCTTACAGAAAA에 제시된 것이고; NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 56: TTCGCCTGTCCTCATGTATTGG에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 57: CTGAGTACAAACTGGTGGTGGT에 제시된 것이고; NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 58: TGAGAGACAGGATCAGGTCAGC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 59: GGAAAATGACAAAGAACAGCTCAAAG에 제시된 것이고; PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 60: AACATGCTGAGATCAGCCAAATTC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 61: ATGCCAGAACTACAATCTTTTGATGAC에 제시된 것이고; PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 62: CAATCCATTTTTGTTGTCCAGCC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 63: CTCTTTTCCTATCCTGAGTAGTGGTAATC에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 64: CTTCTTGTCCTGCTTGCTTACC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 65: TCTTGGGCCTGTGTTATCTCCTAG에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 66: GCAAGTGGCTCCTGACCTG에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 67: CCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 68: CCCCAGTTGCAAACCAGAC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열은 서열식별번호: 69: CAGTACTCCCCTGCCCTCAA에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열은 서열식별번호: 70: ACCATCGCTATCTGAGCAGC에 제시된 것이다.
본 발명의 한 실시양태에서, 표적 앰플리콘은 하기 22개의 종이다:
그의 서열이 서열식별번호: 5에 제시된, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 6에 제시된, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 7에 제시된, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 8에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 9에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 10에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 11에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 12에 제시된, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 13에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 14에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 15에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 16에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 17에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 18에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 19에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 20에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 21에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 22에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 23에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 24에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 25에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘; 및
그의 서열이 서열식별번호: 26에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘.
본 발명의 한 실시양태에서, 상기 22개의 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 조합, 상기 22개의 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 조합, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머의 몰비는 0.1-0.3: 0.1-0.3: 0.5-1: 0.5-1, 예를 들어, 0.1:0.1:0.5:0.5이다.
본 발명의 한 실시양태에서, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머; KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머; MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, 및 TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 몰비는 1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:1:4:2:2:2:2:4:2:4:2이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PCR 반응 시스템은 하기 성분을 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, PCR 마스터 믹스는 KAPA 하이파이 PCR 키츠 2x(KAPA HiFi PCR Kits 2x)이다.
본 발명의 한 실시양태에서, PCR 수행을 위한 반응 절차는 하기와 같다.
본 발명의 한 실시양태에서, PCR 반응 후, PCR 증폭 생성물을 정제하는 단계를 또한 포함한다.
선행 기술과 비교하였을 때, 본 발명은 하기 이점을 가진다:
본 발명에 개시된 방법은 PGM 플랫폼의 디자인을 기반으로 하고, 다중의 표적 영역 (앰플리콘)을 동시에 효과적으로 증폭시킬 수 있다. 구축을 위해 라이브러리를 사용하는 프로세스에서, 본 발명은 단 1 라운드의 PCR 반응 및 1 라운드의 생성물 정제 단계만을 포함하며, 이를 통해 기존 상업적 키트의 실험 조작 (예컨대, PCR 프로세스, 정제 단계, 소화 및 연결 등의 단계)은 크게 간소화되고, 구축 시간은 절약된다. 전체 데이터베이스 구축 프로세스는 단 2.5시간 소요된다 (DNA 및 RNA 데이터베이스의 동일한 샘플 포함).
샘플 및 라이브러리 오염은 효과적으로 제거된다. 크게 간소화된 조작 프로세스를 통해 라이브러리 구축 프로세스는 더욱 안전하고, 신뢰가능해졌고, 조작 프로세스 및 단계 감소는 데이터베이스 구축 프로세스 동안 유발될 수 있는 라이브러리 오염을 효과적으로 제거한다.
간소화된 생물정보학 분석 프로세스가 수득된다. 본 방법에 의해 수득된 앰플리콘 라이브러리는 단일 구조의 신뢰가능한 데이터를 가지며, 수득된 라이브러리의 DNA 가닥 조성은 간단하고, 명료하며, 후속 생물정보학 분석은 더욱 간소화된다.
라이브러리 구축 후, 라이브러리는 장치 "큐비트 2.0(Qubit 2.0)"에 의해 정량화되는 것만이 요구되며, 이를 통해 장치 "qPCR"에 의한 정제 단계는 생략된다. 그러므로, 데이터베이스 구축 시간은 단축되고, 상응하는 조작 단계는 감소되며, 번거로운 실험 프로세스에 의해 유발될 수 있는 실험상의 오차를 피할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 앰플리콘 라이브러리의 구축 완료 후에 검출된 증폭 생성물의 분포 다이어그램이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 수득된 라이브러리 중의 22개의 앰플리콘의 관련된 파라미터이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 수득된 라이브러리 중의 22개의 앰플리콘의 관련된 파라미터이다.
본 발명의 구체적인 실시양태는 첨부 도면을 참조로 하여 하기에서 상세하게 설명되지만, 본 발명의 범주가 구체적인 실시양태에 의해 제한되는 것은 아님을 이해하여야 한다.
실시예 1
시험하고자 하는 샘플은 6개의 FFPE 샘플 (즉, 포르말린 고정된 파라핀 포매된 샘플, FFPE는 포르말린 고정 및 파라핀 포매(Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded)를 의미한다)이며, 그 중 4개는 비소세포 폐암 환자로부터의 FFPE 샘플이고, 2개는 비-암 환자로부터의 FFPE 샘플이다. 증폭된 프라이머를 사용하여 특이적으로 디자인된 융합 프라이머를 이용함으로써 6개의 FFPE 샘플로부터 앰플리콘 DNA 라이브러리를 구축한다. 구체적인 프로세스는 하기와 같다:
1. 게놈 DNA 추출:
"퀴아젠 FFPE DNA 키트(Qiagen FFPE DNA Kit)"를 이용하여 FFPE 샘플 중의 게놈 DNA를 추출한다. 상세한 추출 단계는 키트 설명서를 참조할 수 있다. 게놈 DNA를 "트리스-HCl" 완충제 중에 용해시키고, 추출된 DNA의 품질을 "나노 드롭(Nano Drop)"을 이용하여 검출한다. 샘플 DNA의 농도를 장치 "퀴즈 3.0(quiz 3.0)"을 이용하여 검출한 후, 각 게놈 DNA 샘플을 20 ng/㎕ 농도로 희석시킨다.
2. 프라이머 디자인 및 합성:
표적 앰플리콘에 따라 상류 융합 프라이머를 디자인한다. 상류 융합 프라이머는 5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열을 포함하고;
표적 앰플리콘에 따라 하류 융합 프라이머를 디자인한다. 하류 융합 프라이머는 5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열을 포함하고;
상류 범용 프라이머는 제3 링커 서열, 바코드 서열, 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열을 포함하고;
하류 범용 프라이머는 범용 서열, 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열을 포함한다.
DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합에서, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열 및 특이적 하류 프라이머 서열의 정보는 하기와 같다:
상이한 표적 앰플리콘에 대한 정보는 하기 표에 제시되어 있으며, 이들 앰플리콘에 대한 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열 "특수 프라이머 시작" 및 특이적 하류 프라이머 서열 "특수 프라이머 종료"가 또한 제시되어 있다. 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머, 상류 범용 프라이머, 및 하류 범용 프라이머의 서열이 또한 제시되어 있다. Puf는 대안적 상류 범용 프라이머를 나타내고, Pur은 하류 범용 프라이머를 나타낸다.
제1 링커 서열은 GGCATACGTCCTCGTCTA이고, 제2 링커 서열은 TCTATGGGCAGTCGGTGAT이고, 제3 링커 서열은 CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAG이고, 범용 서열은 CCACTACGCCTCCGCTTTCCTC이다.
3. PCR 반응 시스템 형성. 구체적인 PCR 반응 시스템은 하기와 같다:
동일한 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합은 하기 방법에 의해 제조된다: (1) 상류 범용 프라이머, 하류 범용 프라이머, 및 22개의 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 각 상류 융합 프라이머 및 각 하류 융합 프라이머를 100 μM 농도로 물에 용해시키고; (2) 상류 융합 프라이머 조합을 수득하기 위해, 일련 번호 범위가 작은 번호부터 큰 번호까지인 22개의 상류 융합 프라이머를 각각 100 μM 농도로 혼합하고, 몰비는 1:2:1:4:2:1:2:4:2:2:2:2:2:4:2:2:2:2:4:2:4:2이고, 하류 융합 프라이머 조합을 수득하기 위해, 100 μM 농도의 22개의 하류 융합 프라이머를 각각 상응하는 상류 융합 프라이머와 혼합한 후, 이어서, 상류 융합 프라이머 조합 및 하류 융합 프라이머 조합을 동일한 부피로 혼합하고; (3) 100 μM 농도의 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머를 동일한 부피로 혼합하고; (4) 상류 융합 프라이머 조합, 하류 융합 프라이머 조합, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머를 0.1:0.1:0.5:0.5 몰비에 따라 혼합하여 DNA 샘플을 구축하기 위한 앰플리콘을 수득한다. 시험하고자 하는 6개의 상이한 샘플 세트는 6개의 상이한 바코드 서열 태그를 함유하는 프라이머 조합에 상응하여야 한다.
4. PCR 프로그램 수행. PCR 장치는 어플라이드 바이오-시스템(Applied Bio-system)의 2720 써말 사이클러(2720 Thermal Cycler)이다. PCR 반응 절차는 하기와 같다:
5. PCR 반응 후, 벡크만 쿨터 컴퍼니(Beckman Coulter company)로부터 입수한 "아젠코트 AM퓨어 XP 키트(Agencourt AMPure XP Kit)" (카탈로그 번호 A63880/A63881/A63882)를 이용하여 정제를 수행한다. 단계는 하기와 같다:
1) 아젠코트 AM퓨어 XP 키트를 30분 전에 미리 꺼내 놓고, 자기 비드를 키트에서 충분히 회전시키고, EP 튜브를 실온에서 그대로 유지시킨다.
2) PCR 반응 완료 후, 자기 비드를 다시 충분히 회전시키고, 20 ul의 자기 비드를 시스템에 첨가하고, 반복하여 5회 이상 블로잉하거나, 또는 충분히 회전시키고, 키트를 실온에서 5분 동안 방치시킨다.
3) EP 튜브를 자기 스탠드를 옮기고, 용액이 정화될 때까지 5분 동안 그대로 유지시킨다. 비드를 건드리지 않도록 주의를 기울이면서 조심히 피펫을 이용하여 상청액을 제거한다.
4) 100 ul의 새로 제조된 80% 에탄올 용액을 각 튜브에 첨가하고, EP 튜브를 자기 스탠드 상에 놓고, 2 바퀴 회전시키고, 이를 5분 동안 그대로 유지시키고, 상청액을 폐기한다.
5) 단계 4)를 1회 반복한다.
6) EP 튜브를 개봉하고, 이를 실온에서 그대로 유지시켜 액체를 완전히 휘발시킨다. 자기 비드의 표면이 확실하게 무광택이 되도록 만들고, 자기 비드를 과도하게 건조시키지 않도록 주의한다.
7) 자기 스탠드에서 EP 튜브를 제거하고, 30 ul의 PCR 등급의 정제수를 첨가하고, 회전시키고, 혼합하고, 이를 실온에서 10분 동안 그대로 유지시킨다.
8) 2분 동안 또는 용액이 정화될 때까지, EP 튜브를 자기 스탠드 상에 놓아 둔다. 비드를 건드리지 않도록 주의를 기울이면서 조심히 피펫을 이용하여 자기로부터 떨어져 있는 한 면으로부터 상청액을 흡입한다.
이 시점에서 앰플리콘 라이브러리가 구축된다. 도 1은 라이브러리 완료 이후 애질런트 2200 테이프스테이션 시스템즈(Agilent 2200 TapeStation Systems)에 의해 검출된, 증폭된 생성물의 분포를 보여주는 것이다. 가로 좌표는 단편의 길이이고, 세로 좌표는 신호 강도 (FU)이고, 하위 피크는 25 bp 위치 마커이고, 상위 피크는 1500 bp 위치 마커이다. 도 1에 제시된 바와 같이, PCR 증폭에 의해 수득된 PCR 생성물은 241-271 bp 범위에 집중되어 있다. 도 1은 실험 결과가 실험 디자인과 일치한다는 것을 보여준다. 도 1로부터 구축된 라이브러리의 크기 및 라이브러리의 농도를 판정할 수 있다.
6. 기계상에서의 서열분석 및 결과 분석
융합 프라이머 1 단계 방법에 의해 앰플리콘 라이브러리를 수득한다. 이온 PGM(Ion PGM) 플랫폼의 칩 318을 이용하여 앰플리콘 서열분석을 수행하고, 각 라이브러리의 데이터 양은 50 M bps이다. 각 샘플의 평균 서열분석 심도는 1600X 이상이고, 단일 앰플리콘 서열분석 심도는 600X에 달하였다. 수득된 서열분석 결과는 도 2에 제시되어 있다. 22개의 앰플리콘의 각 앰플리콘의 증폭 여부 및 각 앰플리콘의 증폭 균일성을 도 2로부터 추가로 분석할 수 있다.
데이터 프로세싱 및 생물정보학 분석에 의해 서열분석 결과를 분석하여 검출된 유전자의 돌연변이를 수득한다. 데이터 프로세싱 프로세스는 서열분석 데이터의 전환, 품질 관리, 및 서열 정렬 (참조 게놈은 NCBI GRCh37/Hg19이다), 돌연변이 부위 분석 및 다른 프로세스를 포함하고, 검출된 샘플의 돌연변이 정보는 데이터 프로세싱 분석을 통해 수득한다.
실제 샘플 수집물은 하기와 같다: 6명의 대상체의 FFPE 샘플 중 2개의 정상적인 인간의 샘플에서는 종양 관련 돌연변이가 검출되지 않았고, 종양 환자의 4개의 FFPE 샘플 중에서는 p.R248W 돌연변이가 샘플 1에서 검출되고, p.T790M 돌연변이가 샘플 2에서 검출되고, p.G12A 돌연변이가 샘플 3에서 검출되고, p.E545K 돌연변이가 샘플 4에서 검출되었다. 본 결과는 생어(sanger) 시험 결과와 일치한다. 본 발명의 실질적인 적용가능성 및 우수한 특이성이 충분히 설명된다.
본 발명의 구체적인 실시양태에 관한 상기 설명은 예시 및 설명 목적으로 제공된 것이다. 이는 완전한 것, 또는 본 발명을 개시된 정확한 형태로 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 상기 교시에 비추어 명백하게 다수의 수정 및 변형이 가능하다. 예시적인 실시양태는 본 발명의 특정 원리 및 그의 실질적인 적용을 설명하기 위해 선택 및 기술되며, 이로써, 관련 기술분야의 통상의 기술자들은 본 발명의 다양한 예시적인 실시양태 뿐만 아니라, 그의 다양한 대안 및 변형을 제조 및 사용할 수 있다. 본 발명은 오직 하기 제공되는 특허청구범위 및 그의 등가물에 의해서만 제한되어야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Genetron Health(Beijing) Co., Ltd
<120> Method for rapidly constructing amplicon library through one-step process
<130> P170585DD1F
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 1
ggcatacgtc ctcgtcta 18
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 2
tctatgggca gtcggtgat 19
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 3
ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 4
ccactacgcc tccgctttcc tc 22
<210> 5
<211> 159
<212> DNA
<213> Chr2:29432588-29432707 (Hg19) amplicon of the ALK gene
<400> 5
taagggacaa gcagccacac cccattcttg aggggctgag gtggaagaga caggcccgga 60
ggggtgaggc agtctttact cacctgtaga tgtctcgggc catcccgaag tctccaatct 120
tggccactct tccagggcct ggacaggtca agaggcagt 159
<210> 6
<211> 159
<212> DNA
<213> Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) amplicon of the ALK gene
<400> 6
cggaggaagg acttgaggtc tccccccgcc atgagctcca gcaggatgaa ccggggcagg 60
gattgcaggc tcaccccaat gcagcgaaca atgttctggt ggttgaattt gctgcagagc 120
agagagggat gtaaccaaaa ttaactgagc tgagtctgg 159
<210> 7
<211> 163
<212> DNA
<213> Chr7: 140453091-140453197 amplicon of the BRAF gene
<400> 7
cctcaattct taccatccac aaaatggatc cagacaactg ttcaaactga tgggacccac 60
tccatcgaga tttcactgta gctagaccaa aatcacctat ttttactgtg aggtcttcat 120
gaagaaatat atctgaggtg tagtaagtaa aggaaaacag tag 163
<210> 8
<211> 169
<212> DNA
<213> Chr7: 55241604-55241726 amplicon of the EGFR gene
<400> 8
tgacccttgt ctctgtgttc ttgtcccccc cagcttgtgg agcctcttac acccagtgga 60
gaagctccca accaagctct cttgaggatc ttgaaggaaa ctgaattcaa aaagatcaaa 120
gtgctgggct ccggtgcgtt cggcacggtg tataaggtaa ggtccctgg 169
<210> 9
<211> 161
<212> DNA
<213> Chr7: 55242398-55242513 amplicon of the EGFR gene
<400> 9
acaattgcca gttaacgtct tccttctctc tctgtcatag ggactctgga tcccagaagg 60
tgagaaagtt aaaattcccg tcgctatcaa ggaattaaga gaagcaacat ctccgaaagc 120
caacaaggaa atcctcgatg tgagtttctg ctttgctgtg t 161
<210> 10
<211> 166
<212> DNA
<213> Chr7: 55248970-55249096 amplicon of the EGFR gene
<400> 10
gaagccacac tgacgtgcct ctccctccct ccaggaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga 60
caacccccac gtgtgccgcc tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac 120
gcagctcatg cccttcggct gcctcctgga ctatgtccgg gaacac 166
<210> 11
<211> 163
<212> DNA
<213> Chr7: 55259505-55259621 amplicon of the EGFR gene
<400> 11
ccgcagcatg tcaagatcac agattttggg ctggccaaac tgctgggtgc ggaagagaaa 60
gaataccatg cagaaggagg caaagtaagg aggtggcttt aggtcagcca gcattttcct 120
gacaccaggg accaggctgc cttcccacta gctgtattgt tta 163
<210> 12
<211> 155
<212> DNA
<213> Chr17: 37880969-37881082 amplicon of the ERBB2 gene
<400> 12
cataccctct cagcgtaccc ttgtccccag gaagcatacg tgatggctgg tgtgggctcc 60
ccatatgtct cccgccttct gggcatctgc ctgacatcca cggtgcagct ggtgacacag 120
cttatgccct atggctgcct cttagaccat gtccg 155
<210> 13
<211> 150
<212> DNA
<213> Chr12: 25380261-25380363 amplicon of the KRAS gene
<400> 13
agtcctcatg tactggtccc tcattgcact gtactcctct tgacctgctg tgtcgagaat 60
atccaagaga caggtttctc catcaattac tacttgcttc ctgtaggaat cctgagaagg 120
gagaaacaca gtctggatta ttacagtgca 150
<210> 14
<211> 172
<212> DNA
<213> Chr12: 25398183-25398310 amplicon of the KRAS gene
<400> 14
aaagaatggt cctgcaccag taatatgcat attaaaacaa gatttacctc tattgttgga 60
tcatattcgt ccacaaaatg attctgaatt agctgtatcg tcaaggcact cttgcctacg 120
ccaccagctc caactaccac aagtttatat tcagtcattt tcagcaggcc tt 172
<210> 15
<211> 146
<212> DNA
<213> Chr7: 116340233-116340335 amplicon of the MET gene
<400> 15
tcgatctgcc atgtgtgcat tccctatcaa atatgtcaac gacttcttca acaagatcgt 60
caacaaaaac aatgtgagat gtctccagca tttttacgga cccaatcatg agcactgctt 120
taatagggta agtcacatca gttccc 146
<210> 16
<211> 175
<212> DNA
<213> Chr7: 116411880-116412005 amplicon of the MET gene
<400> 16
ccatgatagc cgtctttaac aagctctttc tttctctctg ttttaagatc tgggcagtga 60
attagttcgc tacgatgcaa gagtacacac tcctcatttg gataggcttg taagtgcccg 120
aagtgtaagc ccaactacag aaatggtttc aaatgaatct gtagactacc gagct 175
<210> 17
<211> 169
<212> DNA
<213> Chr7: 116417426-116417546 amplicon of the MET gene
<400> 17
atgttacgca gtgctaacca agttctttct tttgcacagg gcattttggt tgtgtatatc 60
atgggacttt gttggacaat gatggcaaga aaattcactg tgctgtgaaa tccttgaaca 120
gtaagtggca ttttatttaa ccatggagta tacttttgtg gtttgcaac 169
<210> 18
<211> 149
<212> DNA
<213> Chr7: 116423399-116423499 amplicon of the MET gene,
<400> 18
cagtcaaggt tgctgatttt ggtcttgcca gagacatgta tgataaagaa tactatagtg 60
tacacaacaa aacaggtgca aagctgccag tgaagtggat ggctttggaa agtctgcaaa 120
ctcaaaagtt taccaccaag tcagatgtg 149
<210> 19
<211> 126
<212> DNA
<213> Chr1: 115256507-115256586 amplicon of the NRAS gene
<400> 19
ttcgcctgtc ctcatgtatt ggtctctcat ggcactgtac tcttcttgtc cagctgtatc 60
cagtatgtcc aacaaacagg tttcaccatc tataaccact tgttttctgt aagaatcctg 120
ggggtg 126
<210> 20
<211> 149
<212> DNA
<213> Chr1: 115258651-115258755 amplicon of the NRAS gene
<400> 20
tgagagacag gatcaggtca gcgggctacc actgggcctc acctctatgg tgggatcata 60
ttcatctaca aagtggttct ggattagctg gattgtcagt gcgcttttcc caacaccacc 120
tgctccaacc accaccagtt tgtactcag 149
<210> 21
<211> 174
<212> DNA
<213> Chr3: 178936056-178936179 amplicon of the PIK3CA gene
<400> 21
ggaaaatgac aaagaacagc tcaaagcaat ttctacacga gatcctctct ctgaaatcac 60
tgagcaggag aaagattttc tatggagtca caggtaagtg ctaaaatgga gattctctgt 120
ttctttttct ttattacaga aaaaataact gaatttggct gatctcagca tgtt 174
<210> 22
<211> 143
<212> DNA
<213> Chr3: 178952000-178952092 amplicon of the PIK3CA gene
<400> 22
atgccagaac tacaatcttt tgatgacatt gcatacattc gaaagaccct agccttagat 60
aaaactgagc aagaggcttt ggagtatttc atgaaacaaa tgaatgatgc acatcatggt 120
ggctggacaa caaaaatgga ttg 143
<210> 23
<211> 179
<212> DNA
<213> Chr17: 7577027-7577154 amplicon of the TP53 gene
<400> 23
cttcttgtcc tgcttgctta cctcgcttag tgctccctgg gggcagctcg tggtgaggct 60
cccctttctt gcggagattc tcttcctctg tgcgccggtc tctcccagga caggcacaaa 120
cacgcacctc aaagctgttc cgtcccagta gattaccact actcaggata ggaaaagag 179
<210> 24
<211> 150
<212> DNA
<213> Chr17: 7577507-7577613 amplicon of the TP53 gene
<400> 24
gcaagtggct cctgacctgg agtcttccag tgtgatgatg gtgaggatgg gcctccggtt 60
catgccgccc atgcaggaac tgttacacat gtagttgtag tggatggtgg tacagtcaga 120
gccaacctag gagataacac aggcccaaga 150
<210> 25
<211> 160
<212> DNA
<213> Chr17: 7578182-7578298 amplicon of the TP53 gene
<400> 25
ccccagttgc aaaccagacc tcaggcggct catagggcac caccacacta tgtcgaaaag 60
tgtttctgtc atccaaatac tccacacgca aatttccttc cactcggata agatgctgag 120
gaggggccag acctaagagc aatcagtgag gaatcagagg 160
<210> 26
<211> 189
<212> DNA
<213> Chr17: 7578389-7578537 amplicon of the TP53 gene
<400> 26
accatcgcta tctgagcagc gctcatggtg ggggcagcgc ctcacaacct ccgtcatgtg 60
ctgtgactgc ttgtagatgg ccatggcgcg gacgcgggtg ccgggcgggg gtgtggaatc 120
aacccacagc tgcacagggc aggtcttggc cagttggcaa aacatcttgt tgagggcagg 180
ggagtactg 189
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 27
actgcctctt gacctgtcc 19
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 28
taagggacaa gcagccacac 20
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 29
ccagactcag ctcagttaat tttgg 25
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 30
cggaggaagg acttgaggt 19
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 31
ctactgtttt cctttactta ctacacctc 29
<210> 32
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 32
cctcaattct taccatccac aaaatgg 27
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 33
tgacccttgt ctctgtgttc ttg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 34
ccagggacct taccttatac acc 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 35
acaattgcca gttaacgtct tcc 23
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 36
acacagcaaa gcagaaactc ac 22
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 37
gaagccacac tgacgtgc 18
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 38
gtgttcccgg acatagtcca g 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 39
ccgcagcatg tcaagatcac a 21
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 40
taaacaatac agctagtggg aaggc 25
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 41
cataccctct cagcgtaccc 20
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 42
cggacatggt ctaagaggca g 21
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 43
tgcactgtaa taatccagac tgtgt 25
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 44
agtcctcatg tactggtccc tc 22
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 45
aaggcctgct gaaaatgact ga 22
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 46
aaagaatggt cctgcaccag ta 22
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 47
tcgatctgcc atgtgtgcat t 21
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 48
gggaactgat gtgacttacc ct 22
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 49
ccatgatagc cgtctttaac aagc 24
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 50
agctcggtag tctacagatt cattt 25
<210> 51
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 51
atgttacgca gtgctaacca ag 22
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 52
gttgcaaacc acaaaagtat actcca 26
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 53
cagtcaaggt tgctgatttt ggtc 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 54
cacatctgac ttggtggtaa actt 24
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 55
cacccccagg attcttacag aaaa 24
<210> 56
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 56
ttcgcctgtc ctcatgtatt gg 22
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 57
ctgagtacaa actggtggtg gt 22
<210> 58
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 58
tgagagacag gatcaggtca gc 22
<210> 59
<211> 26
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 59
ggaaaatgac aaagaacagc tcaaag 26
<210> 60
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 60
aacatgctga gatcagccaa attc 24
<210> 61
<211> 27
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 61
atgccagaac tacaatcttt tgatgac 27
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 62
caatccattt ttgttgtcca gcc 23
<210> 63
<211> 29
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 63
ctcttttcct atcctgagta gtggtaatc 29
<210> 64
<211> 22
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 64
cttcttgtcc tgcttgctta cc 22
<210> 65
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 65
tcttgggcct gtgttatctc ctag 24
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 66
gcaagtggct cctgacctg 19
<210> 67
<211> 24
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 67
cctctgattc ctcactgatt gctc 24
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 68
ccccagttgc aaaccagac 19
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<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
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cagtactccc ctgccctcaa 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Synthetic sequence
<400> 70
accatcgcta tctgagcagc 20
Claims (10)
- 하기 단계들:
1) DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 데 사용되는 프라이머 조합을 합성하는 단계이며, 여기서 DNA 샘플을 구축하는 데 사용되는 앰플리콘 라이브러리의 프라이머 조합은
5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열 (브릿지(Bridge) 서열) 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열을 포함하는, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머;
5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열 (trP1 서열) 및 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열을 포함하는, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머;
제3 링커 서열 (A 서열), 바코드 서열, 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제1 링커 서열을 포함하는 상류 범용 프라이머; 및
범용 서열 (Uni 서열), 및 5'에서 3' 순서로 배열된 제2 링커 서열을 포함하는 하류 범용 프라이머를 포함하는 것인 단계;
2) DNA 샘플을 위한 PCR 반응 시스템을 구축하고, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머를 함께 혼합하여 PCR 반응 시스템에서 프라이머 조합으로서 제공하는 단계; 및
3) PCR을 수행하는 단계
를 포함하는, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법. - 제1항에 있어서, 제1 링커 서열이 서열식별번호(SEQ ID): 1의 서열을 포함하고; 임의적으로, 제2 링커 서열이 서열식별번호 2의 서열을 포함하고; 임의적으로, 제3 링커 서열이 서열식별번호: 3의 서열을 포함하고; 임의적으로, 범용 서열이 서열식별번호: 4의 서열을 포함하는 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법.
- 제1항에 있어서, 동일한 DNA 샘플의 복수의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합에서, 상류 범용 프라이머 중의 바코드 서열이 동일하고, 상이한 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합에서, 상류 범용 프라이머 중의 바코드 서열이 상이한 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법.
- 제1항에 있어서, 동일한 PCR 반응에서 표적 앰플리콘의 개수가 1 초과일 때, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머가 각 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 조합이고, 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머가 각 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 조합인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법.
- 제1항에 있어서, DNA 샘플이 게놈 DNA이고, 임의적으로, 게놈 DNA가 조직 샘플 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매된 샘플로부터 추출된 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법.
- 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘이 하기 22개의 표적 앰플리콘:
그의 서열이 서열식별번호: 5에 제시된, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 6에 제시된, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 7에 제시된, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 8에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 9에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 10에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 11에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 12에 제시된, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 13에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 14에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 15에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 16에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 17에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 18에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 19에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 20에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 21에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 22에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 23에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 24에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 25에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘; 및
그의 서열이 서열식별번호: 26에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘
으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법. - 제6항에 있어서, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 27에 제시된 것이고; ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 28에 제시된 것이고;
임의적으로, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 29에 제시된 것이고; ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 30에 제시된 것이고;
임의적으로, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 31에 제시된 것이고; BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 32에 제시된 것이고;
임의적으로, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 33에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 34에 제시된 것이고;
임의적으로, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 35에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 36에 제시된 것이고;
임의적으로, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 37에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 38에 제시된 것이고;
임의적으로, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 39에 제시된 것이고; EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 40에 제시된 것이고;
임의적으로, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 41에 제시된 것이고; ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 42에 제시된 것이고;
임의적으로, KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 43에 제시된 것이고; KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 44에 제시된 것이고;
임의적으로, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 45에 제시된 것이고; KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 46에 제시된 것이고;
임의적으로, MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 47에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 48에 제시된 것이고;
임의적으로, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 49에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 50에 제시된 것이고;
임의적으로, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 51에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 52에 제시된 것이고;
임의적으로, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 53에 제시된 것이고; MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 54에 제시된 것이고;
임의적으로, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 55에 제시된 것이고; NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 56에 제시된 것이고;
임의적으로, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 57에 제시된 것이고; NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 58에 제시된 것이고;
임의적으로, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 59에 제시된 것이고; PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 60에 제시된 것이고;
임의적으로, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 61에 제시된 것이고; PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 62에 제시된 것이고;
임의적으로, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 63에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 64에 제시된 것이고;
임의적으로, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 65에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 66에 제시된 것이고;
임의적으로, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 67에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 68에 제시된 것이고;
임의적으로, TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 상류 프라이머 서열이 서열식별번호: 69에 제시된 것이고; TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘에 따라 디자인된 특이적 하류 프라이머 서열이 서열식별번호: 70에 제시된 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법. - 제1항에 있어서, 표적 앰플리콘이 하기 22개의 종:
그의 서열이 서열식별번호: 5에 제시된, ALK 유전자의 Chr2:29432588-29432707 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 6에 제시된, ALK 유전자의 Chr2: 29443616-29443730 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 7에 제시된, BRAF 유전자의 Chr7: 140453091-140453197 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 8에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55241604-55241726 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 9에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55242398-55242513 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 10에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55248970-55249096 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 11에 제시된, EGFR 유전자의 Chr7: 55259505-55259621 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 12에 제시된, ERBB2 유전자의 Chr17: 37880969-37881082 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 13에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25380261-25380363 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 14에 제시된, KRAS 유전자의 Chr12: 25398183-25398310 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 15에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116340233-116340335 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 16에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116411880-116412005 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 17에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116417426-116417546 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 18에 제시된, MET 유전자의 Chr7: 116423399-116423499 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 19에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115256507-115256586 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 20에 제시된, NRAS 유전자의 Chr1: 115258651-115258755 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 21에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178936056-178936179 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 22에 제시된, PIK3CA 유전자의 Chr3: 178952000-178952092 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 23에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577027-7577154 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 24에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7577507-7577613 (Hg19) 앰플리콘;
그의 서열이 서열식별번호: 25에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578182-7578298 (Hg19) 앰플리콘; 및
그의 서열이 서열식별번호: 26에 제시된, TP53 유전자의 Chr17: 7578389-7578537 (Hg19) 앰플리콘인 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법. - 제8항에 있어서, 제8항의 22개의 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 상류 융합 프라이머의 조합, 상기 22개의 표적 앰플리콘에 따라 디자인된 하류 융합 프라이머의 조합, 상류 범용 프라이머 및 하류 범용 프라이머의 몰비가
0.1-0.3: 0.1-0.3: 0.5-1: 0.5-1인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법. - 제9항에 있어서, PCR 반응 시스템이 하기 성분:
PCR 마스터 믹스, 10 ㎕;
DNA 샘플, 1-8 ㎕ 총 20 ng;
동일한 DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하기 위한 프라이머 조합, 2 ㎕;
DNA아제 무함유 H2O, 20 ㎕가 될 때까지의 양
을 포함하는 것인, DNA 샘플의 앰플리콘 라이브러리를 구축하는 방법.
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