CN107513578A - 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法 - Google Patents

一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法 Download PDF

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刘慧莹
雷菁
刁波
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    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法。本发明的检测方法考虑了亚洲人与欧美人群肺癌基因谱的差异性，选择了与亚洲人群罹患肺癌风险显著相关的29个肺癌热点突变和20个单核苷酸多态性位点并进行组合，检测的驱动基因和易感基因更前沿，并纳入了多个与肺癌易感和靶向治疗耐药相关的位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于评估个体罹患肺癌的风险；本发明的检测技术价格优势明显，在肺癌早筛检测方面的灵敏度更高，通量更大，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用，可转化研究应用于临床。

Description

一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法
技术领域
本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法。
背景技术
肺癌是我国的头号癌症杀手，在我国每年新增的65.3万例肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)患者占到了85％。与大多数癌症的生存率稳定上升相比，肺癌的治疗进展缓慢。通常，肺癌患者的5年生存率为16％，如果早期诊断，肺癌患者的5年生存率则上升至52％。然而，如果发生转移，到了Ⅳ期将降低到4％以下。不幸的是，一半以上肺癌患者在确诊的时候就已经是Ⅳ期肺癌了。面对肺癌，绝对是一场与时间赛跑的生命之战，早发现、早确诊、早治疗，才有可能战胜病魔。目前肺癌的早期诊断主要是根据病史中的高危因素，并结合影像学、支气管内镜、细胞学及分子生物学等技术手段进行早期筛查，从而达到早发现早治疗的目的。
肺癌的发生、发展以及治疗与基因变异关系密切，给予基因变异的“个体化”靶向治疗是继传统放化疗后肿瘤领域的新突破。非小细胞肺癌(NSCLC)样本中基因靶点变异可从相应的靶向药物治疗中获益，针对EGFR和ALK基因变异的酪氨酸激酶抑制剂(TLI)吉非替尼(gefitinib)/厄洛替尼(erlotinib)和克唑替尼(crizotinb)等靶向治疗可延长患者的生存期。随着研究深入，ROS1、RET、ERBB2，STK11等分子变异被逐步确定为肺癌的驱动基因(driver gene)。
SNP(single nucleotide polymorphism)，即单核昔酸多态性标记，主要是指由基因组核昔酸水平上的变异引起的DNA序列多态性，它是基因组中最为广泛存在的一类多态性标记，占大约90％。这些基因组序列变异可以导致个体间表型的差异以及不同个体对疾病，特别是复杂疾病的易感性和对环境因素、药物反应的差异。SNP在疾病基因定位中所发挥的作用主要包括：1.在疾病定位区域中寻找致病SNP，这种SNP的出现可能直接导致了基因转录水平上和翻译水平上的变化，即改变了基因表达量或者基因产物蛋白质的组成结构，从而导致某种疾病发生或使得个体对某种特殊的环境易感；2.SNP作为一个遗传标记，与疾病或表型紧密连锁。
肿瘤发生发展、靶向治疗后耐药以及转移机制等分子靶点的复杂性分析，以及对肺癌患者样本多靶点变异基因变异基因进行单基因检测的局限性，传统的基因分型检测方法成本高，不能实现高通量检测和高通量分析，决定了在临床转化医学研究中开展多基因检测平台的必要性与紧迫性。目前LungCarta试剂盒可检测26个癌症相关基因的214个突变位点，但技术信息保密，价格昂贵，且未完全包括前沿分子靶点，也未考虑东亚和欧美地区驱动基因谱的差异性，因此建立适合中国人群的多基因检测方法具有重要意义。
平台应用先进的质谱技术，一张核酸质谱芯片可以进行384个样本的检测，每个样本可以实现最多36个基因位点的检测，为基因组学的研究提供了无与伦比的灵敏度和特异性。基于MassARRAY平台的iPLEX技术利用单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术，可以实现多重扩增反应基因型检测。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，此方法能检测肺癌11种驱动和耐药相关基因的29个亚洲人热点变异位点和14种易感基因的20个亚洲人SNPs位点。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，该方法包括如下步骤：
(1)筛选出可用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点，并进行位点的组合；
(2)设计步骤(1)的用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点的扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分为6组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物混合，得到对应的6组扩增引物混合液；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为6组，分别得到6组单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本基因组DNA为模板，对步骤(3)中的6组扩增引物混合液分别进行PCR扩增；
(6)虾碱式磷酸酶消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用步骤(6)中各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)脱盐树脂纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过观察质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否存在突变。
进一步地，所述用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H、EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS、EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA、KRAS_p.G12CRS。
进一步地，所述可用来评估个体罹患肺癌风险的易感基因的SNPs位点为：ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T、BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A。
进一步地，用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点的PCR引物、延伸引物的序列为：
EML4-ALK_p.G1269A
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctctcggaggaaggacttg-3'
下游5'-acgttggatgacattgttcgctgcattggg-3'
延伸引物：5'-ccgccatgagctcca-3'
EGFR_p.E746_A750del1
PCR引物：上游5'-acgttggatgatttccttgttggctttcgg-3'
下游5'-acgttggatgtctctctgtcatagggactc-3'
延伸引物：5'-ggctttcggagatgt-3'
EGFR_p.L861Q
PCR引物：上游5'-acgttggatgcctccttctgcatggtattc-3'
下游5'-acgttggatgaaacaccgcagcatgtcaag-3'
延伸引物：5'-ctcttccgcacccagc-3'
ERBB2_p.A775_G776insYVMA
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下游5'-acgttggatgagaaggcgggagacatatgg-3'
延伸引物：5'-aagcatacgtgatggc-3'
PIK3CA_p.E542K
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下游5'-acgttggatggcaatttctacacgagatcc-3'
延伸引物：5'-ctcctgctcagtgattt-3'
STK11_p.P281L
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下游5'-acgttggatgatgaggctcccacctttcag-3'
延伸引物：5'-tggcgactgtggccccc-3'
EML4-ALK_p.L1196M
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延伸引物：5'-gagagtggccaagattg-3'
PTEN_p.R233*
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下游5'-acgttggatgttgtggtctgccagctaaag-3'
延伸引物：5'-cccaacttgtcttcccgtc-3'
KRAS_p.G13DAV
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下游5'-acgttggatgaggcctgctgaaaatgactg-3'
延伸引物：5'-ccaggcactcttgcctacg-3'
ERBB2_p.S310F
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下游5'-acgttggatgctgtcacctcttggttgtgc-3'
延伸引物：5'-attgctacggacgtgggat-3'
PTEN_p.R173CS
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下游5'-acgttggatggtgccactggtctataatcc-3'
延伸引物：5'-taactattcccagtcagagg-3'
c-MET_p.N375S
PCR引物：上游5'-acgttggatgccatgtgtgcattccctatc-3'
下游5'-acgttggatgtgggtccgtaaaaatgctgg-3'
延伸引物：5'-catctgtcaacgacttcttca-3'
CD74-ROS1_p.G2032R
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延伸引物：5'-gcaaataagtaagaaggtctc-3'
BRAF_p.D594GV
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下游5'-acgttggatgtcttcatgaagacctcacag-3'
延伸引物：5'-cttcactgtagctagaccaaaa-3'
KRAS_p.K117N
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延伸引物：5'-atatggtcctagtaggaaataa-3'
BRAF_p.G469AEV
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KRAS_p.Q61H
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EGFR_p.T790M
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EGFR_p.E746_A750del2
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KRAS_p.G13CRS
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EGFR_p.L858R
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BRAF_p.V600EAG
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DDR2_S768R
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CD74-ROS1_p.D2033N
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PTEN_p.R173HPL
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KRAS_p.A146TPS
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EGFR_p.G719X
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KRAS_p.G12DVA
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KRAS_p.G12CRS
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ERCC2_p.D312N
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下游5'-acgttggatgtggatccgtgtcctgctgt-3'
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AGPHD1_g.78508074G>A
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TNFRSF19_g.24293859A>G
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ABCB1_c.*193A>G
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CYP1A1_p.I462VLF
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下游5'-acgttggatgctccttaatatttaccccac-3'
延伸引物：5'-caatcaatgctgttattactg-3'
进一步地，所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H位点的17对扩增引物，第二组P2包含EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS位点的9对扩增引物，第三组P3包含EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA位点的2对扩增引物，第四组P4包含KRAS_p.G12CRS位点的1对扩增引物，第五组P5包含ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T位点的16对扩增引物，第六组P6包含BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A位点的4对扩增引物。
进一步地，所述每组扩增引物混合物中的扩增引物等摩尔混合均匀。
进一步地，所述每组扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM。
进一步地，所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H位点的17条延伸引物，第二组E2包含EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS位点的9条延伸引物，第三组E3包含EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA位点的2条延伸引物，第四组E4包含KRAS_p.G12CRS位点的1条延伸引物，第五组E5包含ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T位点的16条延伸引物，第六组E6包含BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A位点的4条延伸引物。
进一步地，所述步骤(5)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
进一步地，所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供的用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法考虑了亚洲人却与欧美人群肺癌基因谱的差异性，选择了与亚洲人群罹患肺癌风险显著相关的29个肺癌热点突变和20个单核苷酸多态性位点，检测的驱动基因和易感基因更前沿，并纳入了多个与肺癌易感和靶向治疗耐药相关的位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于评估个体罹患肺癌的风险。
(2)本发明提供的检测技术，价格优势明显，改变传统单碱基检测价格昂贵、耗时长、操作繁琐等劣势。在肺癌早筛检测方面的灵敏度更高，通量更大，可实现单个小样本多基因的检测，满足小样本最大化使用，可转化研究应用于临床。
(3)本发明提供的基于MassARRAY核酸质谱技术检测一组肺癌早期诊断相关基因的方法具有高准确性、高灵敏性的技术优势，检测结果稳定，较Sanger测序发具有明显优势，提高了检测阳性率。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。
实施例1：亚洲人群个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点筛选的可行性分析
本发明的发明人通过肺癌的全基因组测序分析，搜索NCBI国内外全基因组关联分析(genome-wide association study，GWAS)研究文献和相关专利(专利文献6和非专利文献7等，包括但不限于此)，同时检索GWAS Catalog数据库和COSMIC，CIViC，ICGC和MYCANCER GENOME等癌症相关数据库，筛选出GWAS研究中亚洲人群阳性样本超过1000例或中国人群阳性样本超过500例，在大规模病理对照组临床研究中得到验证的肺癌发生相关位点，本发明人对其做出筛选和评估，选择了与亚洲人群罹患肺癌风险显著相关的29个肺癌热点突变和20个单核苷酸多态性位点，并且彼此独立，不存在连锁不平衡，因此本发明的位点选择具有代表性、独立性和风险值可积累性，可用于评估个体罹患肺癌的风险。
专利文献
专利文献1：公开号CN 101153319 A
专利文献2：公开号CN 101153323A
专利文献3：公开号CN 103468813 A
专利文献4：公开号CN 105567822 A
专利文献5：公开号CN 104152551 A
专利文献6：公开号CN 104894269 A
非专利文献
非专利文献1：Wang,H.et al.,Cancer,2009,115,595-607
非专利文献2：Hsiung,C.A.et al.,PLoS genetics,2010,6
非专利文献3：Hu,Z.et al.,Nature genetics,2011,43,792-796
非专利文献4：Lan,Q.et al.Nature genetics2012,44,1330-1335
非专利文献5：Hosgood,H.D.,3rd et al.,Human genetics,2012,131,1197-1203
非专利文献6：Shiraishi,K.et al.,Nature genetics,2012,44,900-903
非专利文献7：Seow,W.J.et al.,Human molecular genetics,2017,26,454-465
非专利文献8：Wang,Y.et al.,Nature genetics,2014,46,736-741
非专利文献9：Shi,Y.et al.,Journal of thoracic oncology:officialpublication of the International Association for the Study of Lung Cancer,2014,9,154-162
实施例2：本发明的检测方法检测肺癌细胞株
1.研究对象
选用已知突变位点H460、PC9、H1650、H1975、A549、GLC82、HCC827、H1299的8个肺癌(均能从ATCC购买得到)进行本检测方法的可行性分析，同时设立正常人基因组DNA(gDNA)(来源于就诊广州军区武汉总医院的正常人的口腔黏膜组织提取得到)做为阴性对照，水(H20)做为空白对照。
2.实验步骤
(1)提取肺癌细胞株DNA，得DNA提取液；
(2)设计表1、表2中用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点的扩增引物和表3、表4中单碱基延伸引物，分别将上述扩增引物和单碱基引物分为6组，分组方式如表5所示。分别将混合好的6管扩增引物加入DNA提取液，然后在扩增仪中进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。每种扩增引物先稀释成10μM，然后每组扩增引物混合物中的扩增引物等摩尔比混合均匀，使工作液以每条引物浓度为0.5μM。
所述PCR扩增体系的总体积为5μL，扩增体系的组分、浓度或含量如下：
扩增的热循环参数：
表1评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点的扩增引物
表2评估个体罹患肺癌风险的易感基因的SNPs位点的扩增引物
表3评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点的单碱基延伸引物
表4评估个体罹患肺癌风险的易感基因的SNPs位点的单碱基延伸引物
表5基因SNPs及突变位点的分组编号
(3)应用核酸外切酶和虾碱式磷酸酶将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行消化处理，得到消化后的扩增产物，消化反应条件如下：
扩增产物的消化反应体系，体积7μL
扩增产物消化反应条件：
37℃ 40min
85℃ 5min
(4)对步骤(3)中的目标产物的位点进行单碱基延伸，每个细胞株的6管消化扩增产物分别对应6管延伸引物，P1对应E1，以此类推进行单碱基延伸反应。延伸反应试剂和延伸反应条件如下：
延伸反应体系，反应体积9μl:
延伸反应的热循环参数
(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。加入水41μl，Clean Resin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触，然后3200g离心5min。
(5)启动MassARRAY Nanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据观察质谱图上变异碱基处是否出峰，判断基因是否突变。
3.结论
建立方法检测8例肺癌细胞株的变异位点，验证结果显示与美国标准菌种收藏所(ATCC)细胞株的变异情况一致,本发明中使用的驱动基因突变位点均能在各自的细胞系中检测出突变，如H460和H1650已报道存在KRAS和EGFR_Exon19deletion突变，本发明提供的组合物包含KRAS_Q61H和EGFR_p.E746_A750del(c.2235-2249del15)突变，并且检测结果为阳性；其中H460、PC9、H1650、H1975、A549人肺癌细胞系中可以检测到本发明中TERT-CLPTM1L rs2736100、TP63rs10937405、HLA-DPB1rs2179920、ABCB1rs3842等10个易感基因SNP位点。阴性对照以及空白对照均没有检测到基因变异，表明本发明技术具有可行性。
实施例3：从26例病理已经诊断为肺癌患者的外周血中检测一组肺癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点
1.研究对象
本研究采用广州军区武汉总医院待检测者外周静脉血标本，对标本样品进行基因检测，病例数为26例。对照组来自当地健康体检的健康人群样本。
2.实验步骤
应用本发明的技术来检测外周血样本中肺癌早期诊断相关基因的SNPs和突变位点的具体步骤如下所述：
(1)使用百泰克全血基因组DNA快速提取试剂盒获得受检者cfDNA样本
(a)取200μl收集的外周血，放入1.5ml离心管。加入200μl结合液CB，立刻剧烈颠倒轻摇，充分混匀，在加入20ul蛋白酶K(20mg/ml)溶液，颠倒轻摇充分混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮(但颜色偏黑色)。
(b)加入100μl异丙醇，剧烈颠倒轻摇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。(不可用手剧烈振荡，以免剪切DNA)。
(c)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)10000rpm离心30s，倒掉收集管中的废液。
(d)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
(e)加入700μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。
(f)加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30s,弃掉废液。
(g)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(h)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中预热)，室温放置3-5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
(i)2-8℃存放DNA，如果要长期存放，可以放置在-20℃。
(2)以提取的外周血DNA为模板，以表1和表2中混合好的特异性扩增引物混合液为扩增引物，进行PCR扩增反应，获得目标位点的PCR产物片段。
PCR的体系为：
扩增的热循环参数：
(3)将步骤(2)得到的PCR产物进行虾碱式磷酸酶纯化处理，向步骤(2)得到的PCR产物中加入核酸外切酶SAP 0.3μl、SAP缓冲液0.17μl，水补足至7μl；纯化处理条件为：37℃40min，85℃5min。
(4)将步骤(3)中的目标产物的位点进行单碱基延伸，每个待测样品的6管纯化扩增产物分别对应6管延伸引物，P1对应E1，以此类推进行单碱基延伸反应。延伸反应试剂和延伸反应条件如下：
延伸反应体系，反应体积9μl:
延伸反应的热循环参数：
(5)将步骤(4)获得的产物加入脱盐树脂，进行脱盐纯化，避免离子在质谱中对待测样本的影响，消除盐峰干扰。具体实验步骤为：在步骤(4)产物中加入水41μl，CleanResin树脂15mg(96孔)或者水16μl，Clean Resin树脂6mg(384孔)，将干燥后的树脂倒入延伸产物板中，封膜，低速垂直旋转30min,使树脂与反应物充分接触；3200g离心5min。
(6)启动MassARRAYNanodispenser RS1000点样仪进行芯片点样，利用Analyzer分析仪芯片扫描；检测结果使用TYPER 4.0软件(sequenom)分型并输出结果，根据质谱峰变异碱基处是否出现峰，判断突变。
3.结论
结果显示本实施例检测的26例病人样本中，每个样本都能检测到本发明清单中6～13个突变位点和9～14个易感基因SNP，说明本发明技术能够有效的检测到肺癌患者体内存在的突变。
本发明基于核酸质谱技术，提供一组肺癌发生相关的突变和易感基因SNPs的组合，并设计专用的MASSAssay核酸质谱扩增引物和单碱基延伸引物，特异性强、灵敏度高，能够覆盖亚洲区肺癌热点突变基因位点，一次性检测出可能的突变点，准确高效。
以上所述实施例为本发明的优选实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，所做出的若干变形和改进，均应为等效的置换方式，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 武汉赛云博生物科技有限公司
<120> 一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法
<160> 147
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gcaaataagt aagaaggtct c 21
<210> 40
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
acgttggatg ccactccatc gagatttcac 30
<210> 41
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cttcactgta gctagaccaa aa 22
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
acgttggatg ctgaagatgt acctatggtc 30
<210> 44
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
acgttggatg tcctgagcct gttttgtgtc 30
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
atatggtcct agtaggaaat aa 22
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
acgttggatg gggacaaaga attggatctg 30
<210> 47
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
acgttggatg acttgtcaca atgtcaccac 30
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggggattgga tctggatcat ttg 23
<210> 49
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
acgttggatg tggagaaacc tgtctcttgg 30
<210> 50
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
acgttggatg catgtactgg tccctcattg 30
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
ggatcttctc gacacagcag gtca 24
<210> 52
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
acgttggatg atctgcctca cctccaccgt 30
<210> 53
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
acgttggatg tgttcccgga catagtccag 30
<210> 54
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
ccgtgcagct catca 15
<210> 55
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
acgttggatg tctctctgtc atagggactc 30
<210> 56
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
acgttggatg atttccttgt tggctttcgg 30
<210> 57
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ttcccgtcgc tatcaag 17
<210> 58
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 59
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
acgttggatg ctgtatcgtc aaggcactct 30
<210> 60
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ggtagttgga gctggt 16
<210> 61
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acgttggatg aaacaccgca gcatgtcaag 30
<210> 62
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acgttggatg cctccttctg catggtattc 30
<210> 63
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gatcacagat tttgggc 17
<210> 64
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acgttggatg ttcaaactga tgggacccac 30
<210> 65
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
acgttggatg tcttcatgaa gacctcacag 30
<210> 66
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
ccactccatc gagatttc 18
<210> 67
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acgttggatg aaatagggca agttcactac 30
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
acgttggatg ggaatagggc tgttcttgac 30
<210> 69
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
caagttcact acagcaag 18
<210> 70
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
acgttggatg ccgggcttta cgcaaataag 30
<210> 71
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgttggatg ttgtctgctg aatgaacccc 30
<210> 72
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
cgcaaataag taagaaggt 19
<210> 73
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
acgttggatg tctgtccacc agggagtaac 30
<210> 74
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
acgttggatg gtgccactgg tctataatcc 30
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
aacgattccc agtcagaggc 20
<210> 76
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
acgttggatg aggctcagga cttagcaaga 30
<210> 77
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
acgttggatg ttcagtgtta cttacctgtc 30
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
gaattccttt tattgaaaca tca 23
<210> 79
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
acgttggatg ttaccttata caccgtgccg 30
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
acgttggatg tctcttgagg atcttgaagg 30
<210> 81
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cgaacgcacc ggagc 15
<210> 82
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
acgttggatg ctgtatcgtc aaggcactct 30
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 84
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
cctcttgcct acgcca 16
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
acgttggatg ctgtatcgtc aaggcactct 30
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
acgttggatg aggcctgctg aaaatgactg 30
<210> 87
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
atcttgccta cgccac 16
<210> 88
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
acgttggatg ggaggcggga aagggactg 29
<210> 89
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acgttggatg acggacgccc acctggccaa 30
<210> 90
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cctgcagcac ttcgt 15
<210> 91
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
acgttggatg tggcagtcgt ggcctggtc 29
<210> 92
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
acgttggatg tggatccgtg tcctgctgt 29
<210> 93
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
cggaagcgca cggag 15
<210> 94
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
acgttggatg tctcttttcc tgcctcttgg 30
<210> 95
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
acgttggatg tttaagggtc ttcctggtgg 30
<210> 96
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
tgcctcttgg ttcagca 17
<210> 97
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
acgttggatg aaatataggt gggccctgtc 30
<210> 98
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
acgttggatg tctcaagaat cccctcttgc 30
<210> 99
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tcatgtgaag gcttgaa 17
<210> 100
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
acgttggatg ccacaatgag ataccctttt 30
<210> 101
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
acgttggatg gtatgaattc cagttactcg 30
<210> 102
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
acccttttac atccactg 18
<210> 103
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
acgttggatg agttgtaatg gctgaacccc 30
<210> 104
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
acgttggatg tctgcagatg gccatcttac 30
<210> 105
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cttttgattt tgccccctg 19
<210> 106
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
acgttggatg aggtctgcta tccagacaac 30
<210> 107
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
acgttggatg gctctccaaa gttgtcgtag 30
<210> 108
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
tccagacaac ttcagagtc 19
<210> 109
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
acgttggatg ggaacagagt gagagacatc 30
<210> 110
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
acgttggatg taaaatctac tttaattctg t 31
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
catcaagtgg agagaaatc 19
<210> 112
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
acgttggatg gaagcaggag agtggaatc 29
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
acgttggatg aaagtcagct ccttcacacc 30
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
gagagtggaa tctgagactt 20
<210> 115
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
acgttggatg atcaatctcc cggcttcttc 30
<210> 116
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
acgttggatg gaacctacaa tcacagggac 30
<210> 117
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
ggacggcttc ttctctccct c 21
<210> 118
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
acgttggatg cttcaattcc tcagcctgtc 30
<210> 119
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
acgttggatg tcatgcatgt ctgactgagg 30
<210> 120
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
cttttattct gtgagcattg a 21
<210> 121
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
acgttggatg cacaaattca accctacttc 30
<210> 122
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
acgttggatg acataccaaa ctaggacctg 30
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
ccctacttca acattataat ct 22
<210> 124
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
acgttggatg ctgtgtaaaa gagtttgagg 30
<210> 125
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
acgttggatg gcaagcatct gctcttgagg 30
<210> 126
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
agtaataaga atcactgttt ca 22
<210> 127
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
acgttggatg gttcaagacc agcctggtaa 30
<210> 128
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
acgttggatg agctaggatt acaggcgcgt 30
<210> 129
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
taaaaataca aaaattagct ggg 23
<210> 130
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
acgttggatg tgggcaagcg gaagtgtatc 30
<210> 131
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
acgttggatg ctgaattcca cccgttgcag 30
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
ccgctgaagt gtatcggtga gacc 24
<210> 133
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
acgttggatg cttgagctga attcagttta 30
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
acgttggatg ggaatgcaat gattcttcag 30
<210> 135
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
tcagtttaaa ttaatatgaa ttttgc 26
<210> 136
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
acgttggatg tgagcttaag cacacctttc 30
<210> 137
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
acgttggatg gtagactctg gtagagattg 30
<210> 138
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cacctttcag cccac 15
<210> 139
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
acgttggatg atcgtgcgta aggagtgggt 30
<210> 140
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
acgttggatg caggataagg agcagggttg 30
<210> 141
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
ggcggctgcc ctccc 15
<210> 142
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
acgttggatg tgacaccccc acaagctaag 30
<210> 143
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
acgttggatg aaaggaggaa aagcagggcg 30
<210> 144
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
ccgtgttgag tgtttct 17
<210> 145
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
acgttggatg tccaggcttt cccttttttc 30
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
acgttggatg ctccttaata tttaccccac 30
<210> 147
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
caatcaatgc tgttattact g 21

Claims (10)

1.一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
(1)筛选出可用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点，并进行位点的组合；
(2)设计步骤(1)的用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点的扩增引物和单碱基延伸引物；
(3)将步骤(2)中的扩增引物分为6组，各组中所含的各SNP位点和基因突变位点的上下游引物混合，得到对应的6组扩增引物混合液；
(4)对应于步骤(3)中扩增引物分组的方式，将步骤(2)中的单碱基延伸引物分为6组，分别得到6组单碱基延伸引物混合液；
(5)以待测样本基因组DNA为模板，对步骤(3)中的6组扩增引物混合液分别进行PCR扩增；
(6)虾碱式磷酸酶消化步骤(5)反应体系中剩余的dNTP；
(7)利用步骤(6)中各组相对应的单碱基延伸引物对步骤(6)消化后的产物进行单碱基延伸反应，获得延伸产物；
(8)脱盐树脂纯化延伸产物；
(9)MassARRAY平台检测分析进行芯片点样、扫描，检测结果使用TYPER4.0软件(sequenom)分型并输出结果，通过观察质谱峰变异碱基处是否出峰来判断是否存在突变。
2.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点为：EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H、EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS、EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA、KRAS_p.G12CRS。
3.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述可用来评估个体罹患肺癌风险的易感基因的SNPs位点为：ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T、BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A。
4.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：用来评估个体罹患肺癌风险的特异性和敏感性的基因突变位点和易感基因的SNPs位点的PCR引物、延伸引物的序列为：
EML4-ALK_p.G1269A
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctctcggaggaaggacttg-3'
下游5'-acgttggatgacattgttcgctgcattggg-3'
延伸引物：5'-ccgccatgagctcca-3'
EGFR_p.E746_A750del1
PCR引物：上游5'-acgttggatgatttccttgttggctttcgg-3'
下游5'-acgttggatgtctctctgtcatagggactc-3'
延伸引物：5'-ggctttcggagatgt-3'
EGFR_p.L861Q
PCR引物：上游5'-acgttggatgcctccttctgcatggtattc-3'
下游5'-acgttggatgaaacaccgcagcatgtcaag-3'
延伸引物：5'-ctcttccgcacccagc-3'
ERBB2_p.A775_G776insYVMA
PCR引物：上游5'-acgttggatgttgtccccaggaagcatacg-3'
下游5'-acgttggatgagaaggcgggagacatatgg-3'
延伸引物：5'-aagcatacgtgatggc-3'
PIK3CA_p.E542K
PCR引物：上游5'-acgttggatgtagcacttacctgtgactcc-3'
下游5'-acgttggatggcaatttctacacgagatcc-3'
延伸引物：5'-ctcctgctcagtgattt-3'
STK11_p.P281L
PCR引物：上游5'-acgttggatgtttgagaacatcgggaaggg-3'
下游5'-acgttggatgatgaggctcccacctttcag-3'
延伸引物：5'-tggcgactgtggccccc-3'
EML4-ALK_p.L1196M
PCR引物：上游5'-acgttggatgagaaactgcctcttgacctg-3'
下游5'-acgttggatgtcgccctgtagatgtctcg-3'
延伸引物：5'-gagagtggccaagattg-3'
PTEN_p.R233*
PCR引物：上游5'-acgttggatgggctgagggaactcaaagta C-3'
下游5'-acgttggatgttgtggtctgccagctaaag-3'
延伸引物：5'-cccaacttgtcttcccgtc-3'
KRAS_p.G13DAV
PCR引物：上游5'-acgttggatgctgtatcgtcaaggcactct-3'
下游5'-acgttggatgaggcctgctgaaaatgactg-3'
延伸引物：5'-ccaggcactcttgcctacg-3'
ERBB2_p.S310F
PCR引物：上游5'-acgttggatgacaactacctttctacggac-3'
下游5'-acgttggatgctgtcacctcttggttgtgc-3'
延伸引物：5'-attgctacggacgtgggat-3'
PTEN_p.R173CS
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctgtccaccagggagtaac-3'
下游5'-acgttggatggtgccactggtctataatcc-3'
延伸引物：5'-taactattcccagtcagagg-3'
c-MET_p.N375S
PCR引物：上游5'-acgttggatgccatgtgtgcattccctatc-3'
下游5'-acgttggatgtgggtccgtaaaaatgctgg-3'
延伸引物：5'-catctgtcaacgacttcttca-3'
CD74-ROS1_p.G2032R
PCR引物：上游5'-acgttggatgccgggctttacgcaaataag-3'
下游5'-acgttggatgttgtctgctgaatgaacccc-3'
延伸引物：5'-gcaaataagtaagaaggtctc-3'
BRAF_p.D594GV
PCR引物：上游5'-acgttggatgccactccatcgagatttcac-3'
下游5'-acgttggatgtcttcatgaagacctcacag-3'
延伸引物：5'-cttcactgtagctagaccaaaa-3'
KRAS_p.K117N
PCR引物：上游5'-acgttggatgctgaagatgtacctatggtc-3'
下游5'-acgttggatgtcctgagcctgttttgtgtc-3'
延伸引物：5'-atatggtcctagtaggaaataa-3'
BRAF_p.G469AEV
PCR引物：上游5'-acgttggatggggacaaagaattggatctg-3'
下游5'-acgttggatgacttgtcacaatgtcaccac-3'
延伸引物：5'-ggggattggatctggatcatttg-3'
KRAS_p.Q61H
PCR引物：上游5'-acgttggatgtggagaaacctgtctcttgg-3'
下游5'-acgttggatgcatgtactggtccctcattg-3'
延伸引物：5'-ggatcttctcgacacagcaggtca-3'
EGFR_p.T790M
PCR引物：上游5'-acgttggatgatctgcctcacctccaccgt-3'
下游5'-acgttggatgtgttcccggacatagtccag-3'
延伸引物：5'-ccgtgcagctcatca-3'
EGFR_p.E746_A750del2
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctctctgtcatagggactc-3'
下游5'-acgttggatgatttccttgttggctttcgg-3'
延伸引物：5'-ttcccgtcgctatcaag-3'
KRAS_p.G13CRS
PCR引物：上游5'-acgttggatgaggcctgctgaaaatgactg-3'
下游5'-acgttggatgctgtatcgtcaaggcactct-3'
延伸引物：5'-ggtagttggagctggt-3'
EGFR_p.L858R
PCR引物：上游5'-acgttggatgaaacaccgcagcatgtcaag-3'
下游5'-acgttggatgcctccttctgcatggtattc-3'
延伸引物：5'-gatcacagattttgggc-3'
BRAF_p.V600EAG
PCR引物：上游5'-acgttggatgttcaaactgatgggacccac-3'
下游5'-acgttggatgtcttcatgaagacctcacag-3'
延伸引物：5'-ccactccatcgagatttc-3'
DDR2_S768R
PCR引物：上游5'-acgttggatgaaatagggcaagttcactac-3'
下游5'-acgttggatgggaatagggctgttcttgac-3'
延伸引物：5'-caagttcactacagcaag-3'
CD74-ROS1_p.D2033N
PCR引物：上游5'-acgttggatgccgggctttacgcaaataag-3'
下游5'-acgttggatgttgtctgctgaatgaacccc-3'
延伸引物：5'-cgcaaataagtaagaaggt-3'
PTEN_p.R173HPL
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctgtccaccagggagtaac-3'
下游5'-acgttggatggtgccactggtctataatcc-3'
延伸引物：5'-aacgattcccagtcagaggc-3'
KRAS_p.A146TPS
PCR引物：上游5'-acgttggatgaggctcaggacttagcaaga-3'
下游5'-acgttggatgttcagtgttacttacctgtc-3'
延伸引物：5'-gaattccttttattgaaacatca-3'
EGFR_p.G719X
PCR引物：上游5'-acgttggatgttaccttatacaccgtgccg-3'
下游5'-acgttggatgtctcttgaggatcttgaagg-3'
延伸引物：5'-cgaacgcaccggagc-3'
KRAS_p.G12DVA
PCR引物：上游5'-acgttggatgctgtatcgtcaaggcactct-3'
下游5'-acgttggatgaggcctgctgaaaatgactg-3'
延伸引物：5'-cctcttgcctacgcca-3'
KRAS_p.G12CRS
PCR引物：上游5'-acgttggatgctgtatcgtcaaggcactct-3'
下游5'-acgttggatgaggcctgctgaaaatgactg-3'
延伸引物：5'-atcttgcctacgccac-3'
ERCC2_p.D312N
PCR引物：上游5'-acgttggatgggaggcgggaaagggactg-3'
下游5'-acgttggatgacggacgcccacctggccaa-3'
延伸引物：5'-cctgcagcacttcgt-3'
TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T
PCR引物：上游5'-acgttggatgtggcagtcgtggcctggtc-3'
下游5'-acgttggatgtggatccgtgtcctgctgt-3'
延伸引物：5'-cggaagcgcacggag-3'
AGPHD1_g.78508074G>A
PCR引物：上游5'-acgttggatgtctcttttcctgcctcttgg-3'
下游5'-acgttggatgtttaagggtcttcctggtgg-3'
延伸引物：5'-tgcctcttggttcagca-3'
TNFRSF19_g.24293859A>G
PCR引物：上游5'-acgttggatgaaatataggtgggccctgtc-3'
下游5'-acgttggatgtctcaagaatcccctcttgc-3'
延伸引物：5'-tcatgtgaaggcttgaa-3'
MTMR3_g.30337586T>C
PCR引物：上游5'-acgttggatgccacaatgagataccctttt-3'
下游5'-acgttggatggtatgaattccagttactcg-3'
延伸引物：5'-acccttttacatccactg-3'
TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G
PCR引物：上游5'-acgttggatgagttgtaatggctgaacccc-3'
下游5'-acgttggatgtctgcagatggccatcttac-3'
延伸引物：5'-cttttgattttgccccctg-3'
TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T
PCR引物：上游5'-acgttggatgaggtctgctatccagacaac-3'
下游5'-acgttggatggctctccaaagttgtcgtag-3'
延伸引物：5'-tccagacaacttcagagtc-3'
ABCB1_c.*193A>G
PCR引物：上游5'-acgttggatgggaacagagtgagagacatc-3'
下游5'-acgttggatgtaaaatctactttaattctgt-3'
延伸引物：5'-catcaagtggagagaaatc-3'
MTMR3_g.30598552C>G
PCR引物：上游5'-acgttggatggaagcaggagagtggaatc-3'
下游5'-acgttggatgaaagtcagctccttcacacc-3'
延伸引物：5'-gagagtggaatctgagactt-3'
BPTF_g.65898809G>A
PCR引物：上游5'-acgttggatgatcaatctcccggcttcttc-3'
下游5'-acgttggatggaacctacaatcacagggac-3'
延伸引物：5'-ggacggcttcttctctccctc-3'
ROS1-DCBLD1_117786180C>A
PCR引物：上游5'-acgttggatgcttcaattcctcagcctgtc-3'
下游5'-acgttggatgtcatgcatgtctgactgagg-3'
延伸引物：5'-cttttattctgtgagcattga-3'
TP63_g.189383183C>T
PCR引物：上游5'-acgttggatgcacaaattcaaccctacttc-3'
下游5'-acgttggatgacataccaaactaggacctg-3'
延伸引物：5'-ccctacttcaacattataatct-3'
TP63_g.189356261T>C
PCR引物：上游5'-acgttggatgctgtgtaaaagagtttgagg-3'
下游5'-acgttggatggcaagcatctgctcttgagg-3'
延伸引物：5'-agtaataagaatcactgtttca-3'
TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T
PCR引物：上游5'-acgttggatggttcaagaccagcctggtaa-3'
下游5'-acgttggatgagctaggattacaggcgcgt-3'
延伸引物：5'-taaaaatacaaaaattagctggg-3'
CYP1A1_p.I462VLF
PCR引物：上游5'-acgttggatgtgggcaagcggaagtgtatc-3'
下游5'-acgttggatgctgaattccacccgttgcag-3'
延伸引物：5'-ccgctgaagtgtatcggtgagacc-3'
HLA-DPB1_g.33058874C>T
PCR引物：上游5'-acgttggatgcttgagctgaattcagttta-3'
下游5'-acgttggatgggaatgcaatgattcttcag-3'
延伸引物：5'-tcagtttaaattaatatgaattttgc-3'
BTNL2_g.32368087T>C
PCR引物：上游5'-acgttggatgtgagcttaagcacacctttc-3'
下游5'-acgttggatggtagactctggtagagattg-3'
延伸引物：5'-cacctttcagcccac-3'
XRCC1_p.Q399R
PCR引物：上游5'-acgttggatgatcgtgcgtaaggagtgggt-3'
下游5'-acgttggatgcaggataaggagcagggttg-3'
延伸引物：5'-ggcggctgccctccc-3'
TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A
PCR引物：上游5'-acgttggatgtgacacccccacaagctaag-3'
下游5'-acgttggatgaaaggaggaaaagcagggcg-3'
延伸引物：5'-ccgtgttgagtgtttct-3'
ABCC1_c.*866T>A
PCR引物：上游5'-acgttggatgtccaggctttcccttttttc-3'
下游5'-acgttggatgctccttaatatttaccccac-3'
延伸引物：5'-caatcaatgctgttattactg-3' 。
5.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中扩增引物分组的具体方法为：第一组P1包含EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H位点的17对扩增引物，第二组P2包含EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS位点的9对扩增引物，第三组P3包含EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA位点的2对扩增引物，第四组P4包含KRAS_p.G12CRS位点的1对扩增引物，第五组P5包含ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T位点的16对扩增引物，第六组P6包含BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A位点的4对扩增引物。
6.根据权利要求5所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述每组扩增引物混合物中的扩增引物等摩尔混合均匀。
7.根据权利要求5所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述每组扩增引物混合液的最终工作浓度为0.5μM。
8.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中单碱基延伸引物分组的具体方法为：第一组E1包含EML4-ALK_p.G1269A、EGFR_p.E746_A750del1、EGFR_p.L861Q、ERBB2_p.A775_G776insYVMA、PIK3CA_p.E542K、STK11_p.P281L、EML4-ALK_p.L1196M、PTEN_p.R233*、KRAS_p.G13DAV、ERBB2_p.S310F、PTEN_p.R173CS、c-MET_p.N375S、CD74-ROS1_p.G2032R、BRAF_p.D594GV、KRAS_p.K117N、BRAF_p.G469AEV、KRAS_p.Q61H位点的17条延伸引物，第二组E2包含EGFR_p.T790M、EGFR_p.E746_A750del2、KRAS_p.G13CRS、EGFR_p.L858R、BRAF_p.V600EAG、DDR2_S768R、CD74-ROS1_p.D2033N、PTEN_p.R173HPL、KRAS_p.A146TPS位点的9条延伸引物，第三组E3包含EGFR_p.G719X、KRAS_p.G12DVA位点的2条延伸引物，第四组E4包含KRAS_p.G12CRS位点的1条延伸引物，第五组E5包含ERCC2_p.D312N、TERT-CLPTM1L_g.1279849G>C/T、AGPHD1_g.78508074G>A、TNFRSF19_g.24293859A>G、MTMR3_g.30337586T>C、TERT-CLPTM1L_g.1325688A>G、TERT-CLPTM1L_g.1321972C>T、ABCB1_c.*193A>G、MTMR3_g.30598552C>G、BPTF_g.65898809G>A、ROS1-DCBLD1_117786180C>A、TP63_g.189383183C>T、TP63_g.189356261T>C、TERT-CLPTM1L_g.1334614C>T、CYP1A1_p.I462VLF、HLA-DPB1_g.33058874C>T位点的16条延伸引物，第六组E6包含BTNL2_g.32368087T>C、XRCC1_p.Q399R、TERT-CLPTM1L_g.1286401C>A、ABCC1_c.*866T>A位点的4条延伸引物。
9.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述步骤(5)的扩增条件为：95℃、3min；95℃、15s，56℃、15s，72℃、1min，45个循环；72℃保持5min。
10.根据权利要求1所述的一种用于肺癌驱动基因及易感基因早筛的核酸质谱检测方法，其特征在于：所述步骤(7)的延伸反应的条件为：94℃、30s；94℃、5s，(52℃、5s，80℃、5s)，5个循环，35个循环；72℃保持5min。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108977517A (zh) * 2018-07-24 2018-12-11 为康（苏州）基因科技有限公司 一种遗传性耳聋基因的检测方法及检测试剂盒
CN109536611A (zh) * 2018-12-11 2019-03-29 北京中源维康基因科技有限公司 基于核酸质谱技术检测人类肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
CN110144399A (zh) * 2019-04-09 2019-08-20 中源协和(天津)医学检验所有限公司 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
CN114622003A (zh) * 2020-12-11 2022-06-14 上海吉凯医学检验所有限公司 适用于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌相关基因的突变检测试剂盒
EP4025701A4 (en) * 2019-09-08 2023-11-01 The University of Toledo KITS AND METHODS FOR TESTING LUNG CANCER RISK

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070099202A1 (en) * 2005-05-19 2007-05-03 Young Robert P Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders
CN101183067A (zh) * 2007-06-11 2008-05-21 辽宁师范大学 用于个人识别的13个snp位点多色荧光复合扩增试剂盒
CN102534009A (zh) * 2012-01-16 2012-07-04 南京医科大学 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用
CN104862389A (zh) * 2015-05-04 2015-08-26 广州拓普基因科技有限公司 用于辅助评价待测者肺癌遗传风险性的试剂盒
CN104894269A (zh) * 2015-06-09 2015-09-09 广东省人民医院 基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用
CN106086220A (zh) * 2016-08-19 2016-11-09 浙江省中医院 一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用
CN106191222A (zh) * 2015-05-04 2016-12-07 广州拓普基因科技有限公司 用于辅助评估肺癌遗传风险的试剂盒
CN106191221A (zh) * 2015-05-04 2016-12-07 广州拓普基因科技有限公司 用于肺癌易感基因检测的试剂盒
CN106434978A (zh) * 2016-11-24 2017-02-22 深圳市核子基因科技有限公司 一种用于检测肺癌易感性的试剂盒及其snp标志物
CN106544427A (zh) * 2016-10-27 2017-03-29 广东省人民医院(广东省医学科学院) 一种检测肺癌egfr基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070099202A1 (en) * 2005-05-19 2007-05-03 Young Robert P Methods and compositions for assessment of pulmonary function and disorders
CN101183067A (zh) * 2007-06-11 2008-05-21 辽宁师范大学 用于个人识别的13个snp位点多色荧光复合扩增试剂盒
CN102534009A (zh) * 2012-01-16 2012-07-04 南京医科大学 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的snp标志物及其应用
CN104862389A (zh) * 2015-05-04 2015-08-26 广州拓普基因科技有限公司 用于辅助评价待测者肺癌遗传风险性的试剂盒
CN106191222A (zh) * 2015-05-04 2016-12-07 广州拓普基因科技有限公司 用于辅助评估肺癌遗传风险的试剂盒
CN106191221A (zh) * 2015-05-04 2016-12-07 广州拓普基因科技有限公司 用于肺癌易感基因检测的试剂盒
CN104894269A (zh) * 2015-06-09 2015-09-09 广东省人民医院 基于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌基因谱检测方法及试剂盒与应用
CN106086220A (zh) * 2016-08-19 2016-11-09 浙江省中医院 一种非小细胞肺癌单核苷酸多态性检测试剂盒及其应用
CN106544427A (zh) * 2016-10-27 2017-03-29 广东省人民医院(广东省医学科学院) 一种检测肺癌egfr基因突变靶向治疗相关耐药变异位点的试剂盒
CN106434978A (zh) * 2016-11-24 2017-02-22 深圳市核子基因科技有限公司 一种用于检测肺癌易感性的试剂盒及其snp标志物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
崔斌 等: "《R语言在生物医学领域的应用》", 30 October 2016, 上海交通大学出版社 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108977517A (zh) * 2018-07-24 2018-12-11 为康（苏州）基因科技有限公司 一种遗传性耳聋基因的检测方法及检测试剂盒
CN109536611A (zh) * 2018-12-11 2019-03-29 北京中源维康基因科技有限公司 基于核酸质谱技术检测人类肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
CN110144399A (zh) * 2019-04-09 2019-08-20 中源协和(天津)医学检验所有限公司 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
CN110144399B (zh) * 2019-04-09 2021-12-03 中源维康(天津)医学检验所有限公司 检测人类循环肿瘤dna中肺癌相关基因突变的引物组、试剂盒及使用方法
EP4025701A4 (en) * 2019-09-08 2023-11-01 The University of Toledo KITS AND METHODS FOR TESTING LUNG CANCER RISK
CN114622003A (zh) * 2020-12-11 2022-06-14 上海吉凯医学检验所有限公司 适用于MassARRAY质谱平台Iplex分析的肺癌相关基因的突变检测试剂盒

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