CN108103159A - 一种高特异性的碱基突变多重pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，包括：在无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR扩增，修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端与待检测突变型模板上下游序列互补，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，多对引物特异性结合模板并正常延伸，实现多重PCR扩增。本发明解决了多重PCR非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或健康人采集的体液DNA进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法。
背景技术
在等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)技术出现之前，常用检测基因突变的方法是PCR富集突变点序列进行Sanger测序检测多种突变，Sanger测序的质量对片段长度有要求，大于100bp且突变位点在序列中部，检测结果较为准确，对于100bp以下的小片段常常出现测序质量低的问题；另外Sanger测序的灵敏度能检测≥5％的基因突变，显然不能满足游离DNA短片段低频突变的检测要求。
AS-PCR利用碱基错配阻滞扩增的原理，设计特异的正向引物和远端反向引物，引物3’端与SNP的突变型基因型相同，只有突变型模板能被扩增，野生型模板无法扩增。增加了扩增反应的特异性，突变型模板信号被放大，灵敏度达到1％。这种方法可以用来检测基因频率≤10％的突变，特异性低于2.5％。
2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基础上进行改进，将引物3’端脱氧核苷酸dNMP更换为双脱氧核苷酸ddNMP，使用无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端与模板互补的引物发生焦磷酸解才能进行扩增，不互补的引物则无法扩增。这种扩增依赖焦磷酸解反应的激活，称为焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，简称PAP)。与传统的AS-PCR相比，这一改进显著增加了扩增的选择性和特异性。
2006年，Liu和Sommer使用的聚合酶是在F667Y突变和N端删除的Taq DNA聚合酶，该酶切除了5’-3’核酸外切酶结构，扩增产物突变错配率是Taq DNA聚合酶的1/2，能够准确地对引物3’端进行焦磷酸解反应。Liu和Sommer针对8个杂合缺失位点设计了8对引物，正反向引物3’端均添加双脱氧核苷酸ddNMP进行多重PCR，有效提高反应特异性，同时避免引物二级结构的发生。
现有技术存在以下缺点：(1)非特异性，多重PCR由于引物之间Tm值差异，退火温度较低时，Tm值较高的引物对易出现非特异性扩增，或者引物与模板的错配都有可能产生非特异性扩增产物；(2)二级结构，多对引物存在同一反应体系中易形成二级结构，尤其是引物3’端连续4bp有反向互补序列容易形成引物二聚体；(3)由于存在以上两个问题，单一多重PCR体系包含的扩增目的条带种类十分有限。
发明内容
本发明旨在解决多重PCR非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或健康人采集的体液DNA进行检测。
因此，本发明提供一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR扩增，上述修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端与突变位点上下游的野生型序列互补，上述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解上述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，实现多重PCR扩增，产物包含野生型与突变型DNA片段。
进一步地，上述修饰引物是预先合成的3’末端缺少上述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到上述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。
进一步地，上述模板DNA是基因组DNA或游离DNA。
进一步地，上述碱基突变是单碱基替换、插入或缺失，或短序列插入、缺失或拷贝数变异。
进一步地，上述方法用于组织、血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液样本的基因检测。
进一步地，上述方法用于恶性肿瘤相关体细胞突变的基因检测。
进一步地，上述方法还包括：对上述多重PCR扩增的产物构建高通量测序文库，然后进行高通量测序。
进一步地，上述方法还包括：对上述高通量测序数据进行生物信息分析，然后与基因组参考序列比对找出突变基因及其频率。
进一步地，上述修饰引物的5’端连接测序引物互补通用序列，上述多重PCR扩增之后利用上述测序引物互补通用序列进行大量扩增。
进一步地，上述测序引物互补通用序列中插入用于区别不同样本的标签序列，上述多重PCR扩增之后将来源于不同样本的多重PCR扩增产物混库进行高通量测序。
本发明解决了多重PCR非特异性条带干扰和引物二聚体的问题，提高检测特异性和灵敏度，增加体系对引物的容量；可针对肿瘤患者或健康人采集的体液DNA进行检测，包括血浆、脑脊液、胸腔积液等。这种非侵入式的采样方式，更适合健康人群早筛和肿瘤患者复发监测。另一方面，体液ctDNA比组织取样更全面地反应恶性突变，一定程度上可改善组织异质性问题，扩大了基因检测的应用范围。依赖本发明的方法可以准确鉴别杂合或纯合的胚系突变，可以使用100M的二代测序数据量一次性检测多个突变位点，与二代测序二次验证相比，节省时间，降低成本，与Sanger测序相比效率更高。
附图说明
图1为本发明高特异性的碱基突变多重PCR检测方法的反应原理示意图；
图2为实施例1中血浆DNA和血细胞DNA特异性PCR产物Agilent2100 Bioanalyser检测结果，可以看到主峰单一，无引物二聚体和非特异性扩增；
图3为实施例2中血浆DNA文库和血细胞DNA特异性PCR产物Agilent2100Bioanalyser检测结果，可以看到主峰单一，无引物二聚体和非特异性扩增；
图4为实施例3中同一例癌症患者血浆DNA、癌组织DNA和血细胞DNA的多重PCR产物条带峰，除了血细胞DNA非特异性产物较多，血浆和癌组织DNA主条带较为集中。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。
如图1所示，本发明方法的原理：以突变碱基为中心设计上下游引物，上下游引物3’端均修饰以双脱氧核苷酸，之后利用一种无3’-5’外切酶活性、有焦磷酸解活性的DNA聚合酶(例如，生物工程改造(F667Y及N端删除)的Taq DNA聚合酶(Klentaq-S，ScienTechCorp.)，在有焦磷酸盐存在的环境下依赖模板焦磷酸解3’末端双脱氧核苷酸，引物正常延伸。本发明中，能够发生焦磷酸解的引物(也称为PAP引物)的3’末端的碱基与突变位点上下游的野生型序列特异性结合，扩增产物包括该位点为野生型和突变型的DNA片段，这样可以避免引物与其他序列错配非特异性扩增干扰目的序列的扩增。这种修饰引物能够提高特异性，减少非特异性扩增，也有效防止了引物二聚体的形成。非特异性扩增会产生非特异性条带，即引物与模板错配产生的非目的条带，本发明的修饰引物会特异性扩增目的区域，包含野生型和突变型序列。扩增产物构建文库进行高通量测序，使用生物信息分析软件计算基因突变频率。利用本发明的方法(可称为PAP-PCR方法)可在单一体系内有效检测多个低频(1％水平)单碱基替换或插入、缺失突变。本发明扩增产物可用于多种测序平台测序(包括Illumina，Ion torrent，BGIseq500，BGIseq100，CG，Pacbio及其他测序平台)。
在本发明的特定具体实施例中，可以按照以下方法实现本发明的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法。
1.提取DNA
从样本中提取DNA。
2.修饰引物
a)寡核苷酸连接反应，体系如表1所示，37℃反应4h。
表1
b)尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)
(1)凝固的尿素变性PAGE胶置于盛有1×TBE的垂直电泳槽中，于250V恒压条件下，预电泳30min备用；
(2)样本从37℃取出，放至室温，每体系(30μl)加15μl溴酚黄上样缓冲液，混合均匀；
(3)将样品加入PAGE胶加样孔底部，200V恒压电泳，约1h(具体电泳时间视引物长度而定)；
(4)电泳结束后，小心将PAGE胶取下转移至1XTBE配置的EB染色液中，染色10min。
c)目的片段回收
(1)将胶块捣碎，于粉碎的胶块中加入适量的1×NEB buffer2(NEB)；
(2)将悬浮体系置于56℃水浴锅中水浴1h，每隔15min震荡混匀一次；
(3)水浴后的混合体系倒入Spin-X离心过滤管中，全速离心1min；离心后弃滤膜及碎胶，保留收集管中的流穿液体；
(4)用移液器测量流穿液体体积；测量后，向流穿液体中加3倍体积的无水乙醇，20μl 3M NaAc(pH5.6)以及2μl糖元(Glycogen)(5mg/mL)，颠倒混匀，置于-20℃沉淀过夜；
(5)将第一天的醇沉体系置于离心机中，4℃全速离心30min；
(6)离心后小心倒掉上清，向管底沉淀加700μl 75％乙醇溶液，颠倒混合后置于4℃全速离心10min；
(7)重复上述步骤一次；
(8)将管子开盖置于通风处晾干；
(9)向管中沉淀加适量无DNase的水回溶；
(10)飞行时间质谱检测质量值变化，确定引物3’端是否修饰成功。
3.多重PCR扩增，体系如下表2所示。
表2
多重PCR扩增程序如下表3所示。
表3
4.琼脂糖电泳鉴定
a)2％琼脂糖胶100V电泳，使用NEB 50bp Marker进行对比；
b)电泳结束后1％溴化乙锭进行染胶，在紫外灯下进行图像采集；
c)在蓝光切胶仪上将单一目的条带回收；
d)采用Qiagen凝胶回收试剂盒进行胶回收；
e)Qubit2.0检测浓度。
5.高通量文库构建与测序
a)对切胶回收片段进行末端修复；
b)在片段3’末端加dATP；
c)片段两端连接含有与测序平台引物互补序列的接头，构建文库；
d)高通量测序，深度≥1000X；
e)生物信息分析，过滤之后与人类基因组参考序列比对找出突变基因及其频率。
本发明使用无3’-5’外切功能的聚合酶，结合3’端双脱氧核苷酸修饰的上下游引物进行多重PCR扩增，解决了多重PCR存在的非特异性扩增产物和引物二聚体问题，增加了体系对引物对的容量，此方法可用于检测恶性肿瘤早期低频突变及复发检测。
以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案和技术效果。以下实施例中的具体实验流程和方法按照如上描述进行。
实施例1
对一例癌症患者NGS数据显示的基因突变进行验证，设计5对引物对(见表4)，并将所有引物等比例混合配成引物组合。
表4实施例1中的引物信息表
使用5对引物组合分别对该患者血浆DNA和血细胞DNA进行多重PCR(PCR产物检测结果见图2)，之后构建高通量测序文库，测序结果显示该患者JAK2和DNMT3A基因发生了突变，基因频率分别为0.9％和0.7％(见表5)。
表5实施例1的测序结果
| Chr. | 位置 | 参考 | 突变 | 基因 | 频率 |
| 9 | 5073770 | G | T | JAK2 | 0.9％ |
| 2 | 25457181 | G | +A | DNMT3A | 0 |
| 2 | 25463229 | A | C | DNMT3A | 0 |
| 2 | 25464453 | A | T | DNMT3A | 0.7％ |
| 2 | 25469095 | T | A | DNMT3A | 0 |
实施例2
对一例癌症患者NGS数据显示的基因突变进行验证，设计4对引物对(见表6)，并将所有引物等比例混合配成引物组合。
表6实施例2中的引物信息表
使用4对引物组合分别对血浆DNA和血细胞DNA进行多重PCR(PCR产物检测结果见图3)，之后构建高通量测序文库，测序结果显示该患者DNMT3A基因发生了突变，基因频率为0.85％(见表7)。
表7实施例2的测序结果
实施例3
针对肺癌具有用药指导意义的热点突变(见表8)设计6对引物(见表9)，并将所有引物等比例混合配成引物组合。对一例II期非小细胞肺癌患者术前血浆DNA，血细胞DNA和手术采集癌组织DNA和分别进行多重PCR，产物检测结果见图4，Hiseq测序结果显示相对于血细胞DNA，该患者癌组织和血浆均出现EGFR 19del体细胞突变，基因频率检测值分别为1.2％和0.8％。
表8肺癌热点突变
表9实施例3中的引物信息表
作为本发明的改进或替换方式，在修饰引物5’端可以设计连接测序引物互补通用序列，PCR之后进行大量扩增，或者公共序列中插入用于区别不同样本的标签(index)序列，可以将不同样本的扩增产物混库(pooling)进行高通量测序。本发明也适用于探针法实时荧光定量PCR。此外，修饰引物3’端可以使用锁核酸代替双脱氧核苷酸。锁核酸LNA(LockedNucleic Acid)是一种类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种碱基。结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。单LNA可以将异源核酸双链退火温度提高1～8℃。
以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 天津华大医学检验所有限公司；深圳华大基因股份有限公司；广州华大基因医学检验所有限公司
<120> 一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法
<130> 16I23169
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<170> PatentIn version 3.3
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Claims (10)
1.一种高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用多对修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物的上下游引物的3’末端均是双脱氧核苷酸，该3’末端与突变位点上下游的野生型序列互补，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，实现多重PCR扩增，产物包含野生型与突变型DNA片段。
2.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。
3.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述模板DNA是基因组DNA或游离DNA。
4.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述碱基突变是单碱基替换、插入或缺失，或短序列插入、缺失或拷贝数变异。
5.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于组织、血浆、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液样本的基因检测。
6.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于恶性肿瘤相关体细胞突变的基因检测。
7.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述多重PCR扩增的产物构建高通量测序文库，然后进行高通量测序。
8.根据权利要求7所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述方法还包括：对所述高通量测序数据进行生物信息分析，然后与基因组参考序列比对找出突变基因及其频率。
9.根据权利要求1所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物的5’端连接测序引物互补通用序列，所述多重PCR扩增之后利用所述测序引物互补通用序列进行大量扩增。
10.根据权利要求9所述的高特异性的碱基突变多重PCR检测方法，其特征在于，所述测序引物互补通用序列中插入用于区别不同样本的标签序列，所述多重PCR扩增之后将来源于不同样本的多重PCR扩增产物混库进行高通量测序。
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