CN108103158A - 一种高特异性的胚系碱基突变pcr检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，包括：在无3’‑5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情况下，DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。本发明的方法能够提高特异性和灵敏度，可针对胚系碱基突变，并可定量检测基因频率，解决了ASA‑PCR假阳性导致基因频率定量不准的问题。

Description

一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法

技术领域

本发明涉及基因突变检测技术领域，尤其涉及一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法。

背景技术

等位基因特异性PCR(allele specific PCR,AS-PCR)利用的是碱基错配不能扩增的原理，设计特异的正向引物和远端反向引物，引物3’端与SNP的突变型基因型相同，因此只有突变型模板能被扩增，野生型模板无法扩增。

2000年，Liu和Sommer在AS-PCR基础上进行改进，将引物3’端脱氧核苷酸dNMP更换为双脱氧核苷酸ddNMP，使用无3’-5’外切酶活性的DNA聚合酶，只有3’末端与模板互补的引物发生焦磷酸解才能进行扩增，不互补的引物则无法扩增。这种扩增依赖焦磷酸解反应的激活，称为焦磷酸解激活聚合反应(Pyrophosphorolysis-activated polymerization，简称PAP)。与传统的AS-PCR相比，这一改进显著增加了扩增的选择性和特异性。

2006年，Liu和Sommer使用的聚合酶是在F667Y突变基础上将N端删除的Taq DNA聚合酶，这种酶被切除了5’-3’核酸外切酶结构，扩增产物突变错配率是Taq DNA聚合酶的1/2，能够准确地对引物3’端进行焦磷酸解反应。

目前碱基胚系突变检测的常用方法包括测序和实时荧光定量PCR等，实时荧光定量PCR采用△△CT值法，设计与碱基突变野生型基因型一致的引物特异性扩增野生型模板，利用野生型模板和内参基因作为对照，样本拷贝数与内参基因拷贝数的比值，与野生型基因拷贝数与其内参基因拷贝数的比值比较得出基因频率，理论上，纯合野生型基因该比值为100％，杂合突变比值为50％，纯合突变该比值为0％。但是由于该方法所使用的酶具有矫正功能，因此一部分突变型模板也会扩增，导致检测到的基因频率偏高。

现有技术存在如下缺点：(1)假阳性，由于引物3’端不严格配对，因此PCR中引物3’末端与突变位点不匹配也可以发生非特异性扩增，导致假阳性，进而导致检测到的基因频率偏差大，准确率低；(2)二级结构，多对引物存在同一反应体系中易形成二级结构，尤其是引物3’端连续4bp有反向互补序列容易形成引物二聚体；(3)异质性，针对恶性肿瘤体细胞突变的检测样本DNA多采集自肿瘤组织，存在取样位置不同产生的异质性问题。

发明内容

本发明能够提高实时荧光定量PCR检测胚系突变基因频率的准确性，减少误差，适合用于遗传性肿瘤纯合或杂合突变的检测，为胚系碱基突变定量检测提供一种特异性较高的新方法。

因此，本发明提供一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，上述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情况下，上述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解上述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，野生型模板被扩增，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。

进一步地，上述修饰引物是预先合成的3’末端缺少上述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到上述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。

进一步地，上述模板DNA是基因组DNA。

进一步地，上述胚系碱基突变是替换、插入、缺失或拷贝数变异。

进一步地，上述方法用于多种体液样本的基因检测。

进一步地，上述多种体液样本包括血液、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液。

进一步地，上述方法用于组织样本的基因检测。

进一步地，上述方法用于遗传性恶性肿瘤易感基因及其它基因相关胚系突变的基因检测。

进一步地，上述修饰引物的5’端连接公共序列，上述PCR扩增之后利用上述公共序列进行大量扩增。

进一步地，上述公共序列中插入用于区别不同样本的标签序列，上述PCR扩增之后将来源于不同样本的PCR扩增产物混库进行高通量测序。

本发明的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，能够提高特异性和灵敏度，可针对胚系碱基突变，并可定量检测基因频率，解决了ASA-PCR假阳性导致基因频率定量不准的问题。

附图说明

图1为本发明高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法的反应原理示意图；

图2为本发明一个实施例中修饰前和修饰后的脱氧核苷酸链的质谱图；其中，上图为修饰前的脱氧核苷酸链，下图为修饰后的脱氧核苷酸链，横坐标显示分子量，修饰后的脱氧核苷酸链比修饰前多了300，即一个双脱氧核苷酸的平均分子量；

图3为本发明一个实施例中修饰引物检测EGFR胚系突变检测结果，柱状图表示样本和野生型DNA的相对表达量，患者该位点拷贝数与内参基因拷贝数的比值，是野生型该位点拷贝数与内参基因拷贝数比值的52.1％，标准差SD＝0.033，结果显示待测样本该位点发生了杂合突变；

图4为本发明一个实施例中未修饰引物检测EGFR胚系突变检测结果，柱状图表示样本和野生型DNA的相对表达量，患者该位点拷贝数与内参基因拷贝数的比值，是野生型该位点拷贝数与内参基因拷贝数比值的60.6％，标准差SD＝0.311，结果显示待测样本该位点发生了杂合突变。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

如图1所示，本发明方法的原理：制备3’端双脱氧核苷酸与胚系碱基突变位点野生型基因型一致的引物，利用一种无3’-5’外切酶活性、有焦磷酸解活性的DNA聚合酶(例如，生物工程改造(F667Y及N端删除)的Taq DNA聚合酶(Klentaq-S，ScienTech Corp.)，在有焦磷酸盐存在的环境下，依赖模板焦磷酸解引物3’末端双脱氧核苷酸，引物能够正常延伸。如果引物3’末端与突变型模板不互补，双脱氧核苷酸无法发生焦磷酸解，因而不能正常扩增。实时荧光定量(QuantitativeReal-timePCR，简称QPCR)对样本和野生型样本进行检测，分别与内参基因的Ct值比较判断样本的野生型模板拷贝数，从而推断有无纯合突变或杂合突变。本方法可准确检测杂合或纯合的胚系碱基替换或插入缺失突变。

在本发明的特定具体实施例中，可以按照以下方法实现本发明的高特异性的碱基突变PCR检测方法。

1.提取DNA

从样本中提取DNA。

2.修饰引物

a)寡核苷酸连接反应，体系如表1所示，37℃反应4h。

表1

b)尿素变性聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE)

(1)凝固的尿素变性PAGE胶置于盛有1×TBE的垂直电泳槽中，于250V恒压条件下，预电泳30min备用；

(2)样本从37℃取出，放至室温，每体系(30μl)加15μl溴酚黄上样缓冲液，混合均匀；

(3)将样品加入PAGE胶加样孔底部，200V恒压电泳，约1h(具体电泳时间视引物长度而定)；

(4)用1×TBE配置EB染色液(之前使用约70μl EB母液，加适量1×TBE至溶液呈淡橙色，能够满足染色需要)；

(5)电泳结束后，小心将PAGE胶取下转移至EB染色液中，染色10min。

c)目的片段回收

(1)将胶块捣碎，于粉碎的胶块中加入适量的1×NEB buffer2(NEB)；

(2)将悬浮体系置于56℃水浴锅中水浴1h，每隔15min震荡混匀一次；

(3)水浴后的混合体系倒入Spin-X离心过滤管中，全速离心1min；离心后弃滤膜及碎胶，保留收集管中的流穿液体；

(4)用移液器测量流穿液体体积；测量后，向流穿液体中加3倍体积的无水乙醇，20μl 3M NaAc(pH5.6)以及2μl糖元(Glycogen)(5mg/mL)，颠倒混匀，置于-20℃沉淀过夜；

(5)将第一天的醇沉体系置于离心机中，4℃全速离心30min；

(6)离心后小心倒掉上清，向管底沉淀加700μl 75％乙醇溶液，颠倒混合后置于4℃全速离心10min；

(7)重复上述步骤一次；

(8)将管子开盖置于通风处晾干；

(9)向管中沉淀加适量无DNase的水回溶；

(10)飞行时间质谱检测质量值变化，确定引物3’端是否修饰成功。

3.实时荧光定量PCR(QPCR)

采用Step One Plus^TM实时荧光定量PCR系统进行PCR及检测。实时荧光定量PCR体系如表2所示。

表2

程序如表3所示：

表3

以下通过具体实施例详细说明本发明的技术方案和技术效果。以下实施例中的具体实验流程和方法按照如上描述进行。

实施例1

检测某患者样本EGFR T790M是否发生胚系突变，基因组DNA chr7:55181378位置发生C→T的突变，测序数据显示突变频率约50％。订购正反向引物并制备3’端ddNMP与野生型一致的正向修饰引物(质谱结果见图2，表明修饰引物3’端双脱氧核苷酸添加成功)，与反向引物共同使用(序列见表4)，并取8ng样本血细胞基因组DNA和8ng血细胞野生型基因组DNA进行QPCR检测(△△CT法)，以ACTB作为内参基因(序列见表4)，图3中柱形图显示该患者突变频率52.1％，标准差SD＝0.033，为杂合突变。另外，使用3’端为脱氧胞嘧啶核苷酸的正向引物和反向引物(序列见表4)进行测试，图4中柱形图显示该患者突变频率60.6％，标准差SD＝0.311。与非修饰引物相比，本方法检测胚系突变基因频率更为准确。

表4 实施例1中的引物信息表

作为本发明的其它替换或改进方式，本发明的PAP-PCR技术还可在液滴式数字PCR平台检测，可对突变频率进行准确定量，DNA模板起始量也可进一步降低。引物5’端可以设计连接公共序列，PAP-PCR之后进行大量扩增，或者公共序列中插入用于区别不同样本的标签(index)序列，PAP-PCR之后可以混库(pooling)的形式进行高通量测序。此外，引物3’端可以使用锁核酸代替双脱氧核苷酸。锁核酸LNA(Locked Nucleic Acid)是一种类寡核苷酸衍生物，包括A，C，G，T，U，mC六种碱基。结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。单LNA可以将异源核酸双链退火温度提高1～8℃(Zeng,Y.,et al.,Establishment of Real TimeAllele Specific Locked Nucleic Acid Quantitative PCR for Detection of HBVYIDD(ATT)Mutation and Evaluation of Its Application.PLoS One,2014.9(2):p.e90029)。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。PCR退火环节，引物3’端LNA如果能与模板互补，则可以继续延伸得到扩增产物，否则就无法延伸。多对PAP引物进行多重PCR，参考Ampliseq技术。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津华大医学检验所有限公司；深圳华大基因股份有限公司；广州华大基因医学检验所有限公司

<120> 一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法

<130> 16I23170

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tccaccgtgc agctcatcac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccaccgtgc agctcatcac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgatctgcac acaccagttg 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catgtacgtt gctatccagg c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ctccttaatg tcacgcacga t 21

Claims (10)

1.一种高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法包括：在无3’-5’外切酶活性且有焦磷酸解活性的DNA聚合酶的作用下，在焦磷酸盐存在的环境下，使用修饰引物进行PCR扩增，所述修饰引物的3’末端是双脱氧核苷酸，该3’末端与胚系碱基突变位点野生型基因型一致而与突变型基因型不一致，在有胚系碱基突变位点野生型模板存在的情况下，所述DNA聚合酶依赖模板而焦磷酸解所述修饰引物的3’末端与模板互补的双脱氧核苷酸，引物正常延伸，野生型模板被扩增，使用实时荧光定量PCR对样本进行检测，与内参基因的Ct值比较判断样本有无纯合突变或杂合突变。

2.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物是预先合成的3’末端缺少所述双脱氧核苷酸的寡核苷酸，在末端脱氧核苷酸转移酶和ddNTP的存在下，将双脱氧核苷酸加到所述寡核苷酸的3’末端而得到的引物。

3.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述模板DNA是基因组DNA。

4.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述胚系碱基突变是替换、插入、缺失或拷贝数变异。

5.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于多种体液样本的基因检测。

6.根据权利要求5所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述多种体液样本包括血液、癌组织、脑脊液、胸腔积液、唾液、腹水、脱落细胞和淋巴液。

7.根据权利要求1所述的高特异性的胚系突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于组织样本的基因检测。

8.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述方法用于遗传性恶性肿瘤易感基因及其它基因相关胚系突变的基因检测。

9.根据权利要求1所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述修饰引物的5’端连接公共序列，所述PCR扩增之后利用所述公共序列进行大量扩增。

10.根据权利要求9所述的高特异性的胚系碱基突变PCR检测方法，其特征在于，所述公共序列中插入用于区别不同样本的标签序列，所述PCR扩增之后将来源于不同样本的PCR扩增产物混库进行高通量测序。