CN111936635A - 用于单分子测序的单链环状dna模板的产生 - Google Patents

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Abstract

本发明是分别对核酸的每条链进行测序的新方法，其涉及使用包含链切割位点或链合成终止位点的衔接子。衔接子也可以在链切割位点自引发。

Description

用于单分子测序的单链环状DNA模板的产生
发明领域
本发明涉及核酸分析领域，并且更具体地，涉及制备用于核酸测序的模板。
发明背景
单分子核酸测序包括制备用于测序步骤的靶分子的文库的步骤。线性核酸文库通常与阻碍测序方法性能的线性核酸副产物共存。存在产生环状双链模板的文库制备方法，所述模板允许靶序列的两条链在连续聚合酶读取中被读取多次。参见美国专利号7,302,146和8,153,375。一些应用需要读取长的靶分子，使得分别单程读取或每条链是更理想的。本发明是有效产生文库并分别对靶核酸的每条链进行测序的方法。该方法具有以下详细描述的多个优点。
发明概述
在一些实施方案中，本发明是分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含至少一个链切割位点；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端；延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述切割位点，并且不进行到互补链上。所述接合可以通过例如靶核酸和衔接子的粘端的连接来进行。所述核酸外切酶可以选自核酸外切酶III和核酸外切酶VII之一或两者。所述衔接子可以包含至少一个条形码。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个脱氧尿嘧啶，并且所述切割剂包括尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UNG)和核酸内切酶，例如核酸内切酶III、核酸内切酶IV或核酸内切酶VIII。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个核糖核苷酸，并且所述切割剂包括RNA酶H。在一些实施方案中，所述切割位点包含一个或多个无碱基位点，并且所述切割剂包括选自核酸内切酶III、核酸内切酶IV和核酸内切酶VIII的核酸内切酶。所述衔接子可包含核酸外切酶保护核苷酸，诸如含有硫代磷酸酯基团的核酸外切酶保护核苷酸。
在一些实施方案中，所述衔接子包含捕获部分的配体。例如，所述配体可以是生物素或修饰的生物素，并且所述捕获部分包含亲和素或链霉亲和素。所述配体可以是腺苷序列（寡-dA），并且所述捕获部分包含胸苷序列(寡-dT)。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括在测序之前例如使用靶特异性探针的靶富集步骤。
在一些实施方案中，本发明是制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的靶核酸的文库的方法，所述方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含链切割位点；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端。在一些实施方案中，本发明是确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：如上所述形成靶核酸的文库；延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中所述延伸终止于所述切割位点并且不进行到互补链上。
在一些实施方案中，本发明是分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点，以及；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；使所述反应混合物与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；延伸所述引物，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点，并且不进行到互补链上。所述链合成终止位点可选自切口、缺口、无碱基核苷酸和非核苷酸接头。
在一些实施方案中，本发明是制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的文库的方法，该方法包括以下步骤：在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点；使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸，并且形成双衔接的靶核酸的文库。在一些实施方案中，本发明是确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：通过如上所述的方法形成靶核酸的文库；使所述文库与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；延伸所述引物，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点并且不进行到互补链上。
附图简述
图1是形成衔接的核酸的现有方法的示意图。
图2是本发明的工作流程，其中衔接子具有二级结构并包含切割位点。
图3说明了茎-环衔接子结构。
图4说明了在图3所示的衔接子中切割位点的不同布置。
图5说明了具有非核苷酸(HEG)切割位点的衔接子。
图6显示了在纳米孔测序仪上对文库进行测序的结果。
图7是自引发发夹衔接子的示意图。
发明详述
定义
以下定义辅助本公开内容的理解。
术语“样品”是指含有或假定含有靶核酸的任何组合物。这包括从个体分离的组织或流体，例如，皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官和肿瘤的样品，并且也是指从取自个体的细胞建立的体外培养物的样品，包括福尔马林固定的石蜡包埋组织(FFPET)和从其分离的核酸。样品还可以包括无细胞材料，诸如含有无细胞DNA(cfDNA)或循环肿瘤DNA (ctDNA)的无细胞血液级分。
术语“核酸”是指核苷酸(例如，天然的和非天然的核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸)的聚合物，包括DNA、RNA及其亚类，诸如cDNA、mRNA等。核酸可以是单链的或双链的，且通常将含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可以具有其他连接。核酸可以包括天然存在的碱基(腺苷、鸟苷、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷)以及非天然碱基。非天然碱基的一些实例包括在例如Seela等人, (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640中描述的那些。非天然碱基可以具有特定功能，例如，增加核酸双链体的稳定性、抑制核酸酶消化或阻断引物延伸或链聚合。
术语“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用。多核苷酸是单链或双链核酸。寡核苷酸是有时用于描述较短多核苷酸的术语。通过本领域已知的任意合适方法制备寡核苷酸，例如，通过涉及直接化学合成的方法，如以下文献中所述：Narang等人(1979) Meth. Enzymol. 68:90-99；Brown等人(1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage等人(1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; Matteucci等人(1981) J. Am. Chem. Soc.103:3185-3191。
术语“修饰的核苷酸”在本文中用于描述DNA中的核苷酸，其具有不同于由腺苷、鸟苷、胸苷和胞嘧啶组成的四种常规DNA碱基的碱基。dA、dG、dC和dT是常规核苷酸。但是，脱氧尿嘧啶（dU）和脱氧肌苷（dI）是DNA中的修饰的核苷酸。在本发明的上下文中，插入DNA中的核糖核苷酸（rA、rC、rU和rG）也被认为是“修饰的核苷酸”。 最后，在本发明的上下文中，代替核苷酸插入核酸链中的非核苷酸部分（例如PEG）也被认为是“修饰的核苷酸”。
术语“引物”是指与靶核酸中的序列(“引物结合位点”)杂交且能够在适合这种合成的条件下充当沿着核酸的互补链的合成的起始点的单链寡核苷酸。
术语“衔接子”意指可以被添加至另一个序列以便将额外的特性输入该序列的核苷酸序列。衔接子通常是这样的寡核苷酸：其可以是单链或双链的，或者可以具有单链部分和双链部分两者。术语“衔接的靶核酸”是指在一个或两个末端缀合了衔接子的核酸。
术语“连接”是指接合两条核酸链的缩合反应，其中一个分子的5'-磷酸基团与另一个分子的3'-羟基基团反应。连接通常是由连接酶或拓扑异构酶催化的酶促反应。连接可以接合两条单链以产生一个单链分子。连接还可以接合两条链(每条链属于一个双链分子)，由此接合两个双链分子。连接还可以将双链分子的两条链接合至另一个双链分子的两条链，因此接合两个双链分子。连接还可以接合在双链分子内的链的两个末端，因此修复双链分子中的切口。
术语“条形码”是指可以检测和标识的核酸序列。可以将条形码掺入多种核酸中。条形码是足够长的，例如2、5、20个核苷酸，使得在样品中，可以将掺入了条形码的核酸根据所述条形码进行区分或分组。
术语“多重标识符”或“MID”是指标识靶核酸的来源(例如，核酸所源自的样品)的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶核酸将共享相同的MID。可以将来自不同来源或样品的靶核酸混合并同时测序。使用MID，可以将序列读取结果分配至靶核酸所来源的各个样品。
术语“独特的分子标识符”或“UID”是指标识与其附着的核酸的条形码。来自相同样品的所有或基本上所有的靶核酸将具有不同的UID。源自相同原始靶核酸的所有或基本上所有的后代(例如，扩增子)将共享相同的UID。
术语“通用引物”和“通用引发结合位点”或“通用引发位点”是指存在于(通常，通过体外添加至)不同靶核酸的引物和引物结合位点。使用衔接子或使用具有在5'-部分中的通用引发位点的靶特异性(非通用)引物，将通用引发位点添加至多种靶核酸。通用引物可以结合通用引发位点并指导从所述通用引发位点的引物延伸。
更通常，术语“通用”是指可以添加至任何靶核酸并独立于靶核酸序列执行它的功能的核酸分子(例如，引物或其他寡核苷酸)。通用分子可以通过与互补物杂交(例如通用引物与通用引物结合位点杂交或通用环化寡核苷酸与通用引物序列杂交)来执行它的功能。
如本文所使用的，术语“靶序列”、“靶核酸”或“靶”是指要检测或分析的样品中的核酸序列的一部分。术语靶包括靶序列的所有变体，例如，一种或多种突变型变体和野生型变体。
术语“扩增”是指制备额外拷贝的靶核酸的过程。扩增可以具有多于一个循环，例如，多个循环的指数扩增。扩增可以仅具有一个循环(制备单拷贝的靶核酸)。拷贝可以具有额外序列，例如存在于用于扩增的引物中的那些。扩增也可以产生仅一条链（线性扩增）或优先一条链（不对称PCR）的拷贝。
术语“测序”是指确定靶核酸中的核苷酸的序列的任何方法。
术语“自引发衔接子”是指能够从衔接子自身起始链延伸（链的复制）的衔接子。自引发衔接子与包含引物结合位点的传统衔接子形成对比，在所述传统衔接子中，单独的引物分子与衔接子结合，以从引物起始链延伸。
单分子测序方法涉及产生衔接的靶核酸的文库的步骤。在一些方法中，文库由线性的衔接的靶核酸制成。在线性文库制备工作流程中，在加载到测序仪上之前，将测序衔接子（Y或h衔接子）连接至双链DNA。不幸的是，连接步骤不是100％有效的，并且产生了部分连接的产物或未连接的产物。那些副产物例如通过竞争与测序聚合酶的结合而降低了活性测序产率和仪器的性能。为了富集完全连接的产物，已设计了改良的衔接子。新的衔接子允许核酸外切酶步骤，该步骤除去部分连接的和未连接的产物。
本发明的方法具有许多优点。该方法使得能够对高度富集的文库进行长单分子测序（借助于核酸外切酶介导的富集）。此外，自引发衔接子的使用通过避免对另外的引物和引物退火步骤的需要而简化了测序工作流程。又进一步，由于相同的衔接子连接至每个靶核酸的两个末端并且使用相同的引发机制，因此没有链取向偏倚。又进一步，不同类型的靶核酸与这些衔接子相容，例如基因组DNA(gDNA)或扩增产物。靶核酸的大小和最终读取结果长度仅受所用测序平台的限制，并且不受文库设计的限制。
本发明包括检测样品中的靶核酸。在一些实施方案中，样品源自受试者或患者。在一些实施方案中，样品可以包含例如通过活组织检查源自受试者或患者的实体组织或实体瘤的片段。样品还可以包含体液(例如，尿、痰、血清、血浆或淋巴液、唾液、痰、汗液、泪液、脑脊液、羊水、滑液、心包液、腹膜液、胸膜液、囊液、胆汁、胃液、肠液和/或粪便样品)。样品可以包含其中可能存在肿瘤细胞的全血或血液级分。在一些实施方案中，样品，尤其是液体样品可以包含无细胞材料，诸如无细胞DNA或RNA，包括无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。本发明特别适合于分析稀有和低量靶。在一些实施方案中，样品是无细胞样品，例如无细胞血液来源的样品，其中存在无细胞肿瘤DNA或肿瘤RNA。在其他实施方案中，样品是含有或怀疑含有传染物或源自传染物的核酸的培养样品，例如，培养物或培养物上清液。在一些实施方案中，传染物是细菌、原生动物、病毒或支原体。
靶核酸是可以存在于样品中的关注的核酸。在一些实施方案中，靶核酸是基因或基因片段。在其他实施方案中，靶核酸含有遗传变体，例如，多态性，包括单核苷酸多态性或变体(SNP或SNV)，或导致例如基因融合的遗传重排。在一些实施方案中，靶核酸包含生物标志物。在其他实施方案中，靶核酸是特定生物体所特有的，例如，有助于鉴定病原生物体，或病原生物体的特征，例如，药物敏感性或药物抗性。在另外的其他实施方案中，靶核酸是人受试者所特有的，例如，定义受试者的独特HLA或KIR基因型的HLA或KIR序列。在另外的其他实施方案中，样品中的所有序列都是靶核酸，例如，在鸟枪基因组测序中。
在本发明的一个实施方案中，将双链靶核酸转化为本发明的模板构型。在一些实施方案中，靶核酸在自然界中以单链形式(例如，RNA，包括mRNA、微RNA、病毒RNA；或单链病毒DNA)存在。将单链靶核酸转化为双链形式以使得能够实现请求保护的方法的另外步骤。
可以将较长靶核酸片段化，尽管在一些应用中，可能期望较长靶核酸来实现较长的读取结果。在一些实施方案中，靶核酸被天然地片段化，例如，循环无细胞DNA (cfDNA)或化学降解的DNA，诸如在保存的样品中发现的DNA。在其他实施方案中，靶核酸在体外被片段化，例如，通过物理方式诸如超声处理或通过核酸内切酶消化，例如，限制酶切消化。
在一些实施方案中，本发明包括靶富集步骤。富集可以是通过经由一种或多种靶特异性探针捕获靶序列。样品中的核酸可以被变性并与单链靶特异性探针接触。探针可以包含亲和捕获部分的配体，从而在形成杂交复合物之后，通过提供亲和捕获部分来捕获它们。在一些实施方案中，亲和捕获部分是亲和素或链霉亲和素，且配体是生物素或脱硫生物素。在一些实施方案中，该部分结合至固体支持物。如下文进一步详细描述的，固体支持物可包括超顺磁性球形聚合物颗粒，例如DYNABEADS™磁珠或磁性玻璃颗粒。
在本发明的一些实施方案中，衔接子分子与靶核酸连接。连接可以是平端连接或更有效的粘端连接。通过“末端修复”，包括链填充，即通过DNA聚合酶延伸3'-末端以消除5'-突出端，可以使靶核酸或衔接子成为平端的。在一些实施方案中，通过将单个核苷酸添加至衔接子的3'-末端并将单个互补核苷酸添加至靶核酸的3'-末端（例如通过DNA聚合酶或末端转移酶），可以使平端的衔接子和靶核酸成为粘性的。在另外的其他实施方案中，衔接子和靶核酸可以通过用限制性核酸内切酶消化而获得粘端(突出端)。后一种选择对于已知含有限制酶识别位点的已知靶序列是更有利的。在一些实施方案中，可能需要其他酶促步骤来完成连接。在一些实施方案中，可以使用多核苷酸激酶将5'-磷酸添加至靶核酸分子和衔接子分子。
在一些实施方案中，衔接子包含双链部分（茎）和茎远端的单链部分（环）。茎包含链切割位点（图3）。在一些实施方案中，环包含引物结合位点（图4）。在这样的实施方案中，退火的引物可以起始链的复制。在一些实施方案中，衔接子包含双链部分（茎）和单链部分（环），包括茎远端的非常小的环。这样的衔接子可以是茎-环衔接子或发夹衔接子（图7）。茎包含链切割位点，其使得切割的衔接子能够自引发，即在没有单独引物的情况下起始链的复制。
在一些实施方案中，衔接子分子是体外合成的人工序列。在其他实施方案中，衔接子分子是体外合成的天然存在的序列。在另外的其他实施方案中，衔接子分子是分离的天然分子。
在一些实施方案中，本发明包括通过连接含条形码的衔接子将条形码引入靶核酸中。对各个分子测序通常需要分子条形码，诸如在例如美国专利号7,393,665、8,168,385、8,481,292、8,685,678和8,722,368中所述的。独特的分子条形码是通常在体外操作的最早步骤期间添加至样品(诸如患者的样品)中的每种分子的短人工序列。条形码标记分子和它的后代。独特的分子条形码(UID)具有多种用途。条形码允许追踪样品中的每种单个核酸分子以评估例如循环肿瘤DNA (ctDNA)分子在患者的血液中的存在和量，以便不经活组织检查而检测和监测癌症。参见美国专利申请14/209,807和14/774,518。独特的分子条形码还可以用于测序误差校正。单个靶分子的全部后代用相同条形码标记并形成带条形码的家族。不被带条形码的家族的所有成员共享的序列中的变异被作为伪迹抛弃且不是真突变。条形码还可以用于位置去重复(positional deduplication)和靶定量，因为整个家族代表原始样品中的单一分子。参见同上。
在本发明的一些实施方案中，衔接子包含一个或多个条形码。条形码可以是在样品被混合(多重化)的情况下用于标识样品的来源的多重样品ID (MID)。条形码也可以充当用于标识每种原始分子和它的后代的UID。条形码也可以是UID和MID的组合。在一些实施方案中，将单个条形码用作UID和MID两者。
在一些实施方案中，每个条形码包含预定义的序列。在其他实施方案中，条形码包含随机序列。条形码的长度可以是1-40个核苷酸。
在本发明的方法中，衔接子包含链切割位点。切割位点选自修饰的核苷酸，可获得针对所述修饰的核苷酸的特异性核酸内切酶。修饰的核苷酸-核酸内切酶对的实例的非限制性列表包括脱氧尿嘧啶-尿嘧啶-N-DNA糖基化酶（UNG）加核酸内切酶；无碱基位点-AP核酸酶；8-氧鸟嘌呤-8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（也称为Fpg（甲酰胺基嘧啶[fapy] -DNA糖基化酶））；脱氧肌苷-烷基腺嘌呤糖基化酶（AAG）加核酸内切酶和核糖核苷酸-RNA酶H。
在本发明的一些实施方案中，切割位点用于产生可延伸的3'-末端。在这样的实施方案中，切割位点位于衔接子的茎部分中，使得可以起始互补链的复制。
不同的切割剂产生不同的产物。在一些实施方案中，使用核酸内切酶VIII（EndoVIII），其产生产物的混合物，包括3′-P。在其他实施方案中，使用核酸内切酶III（EndoIII），其产生3'-磷酸-α,β-不饱和醛。在另外的其他实施方案中，使用核酸内切酶IV（EndoIV），其产生3′-OH末端。在其中使用单独的测序引物的实施方案中，不可延伸的末端是有利的。在没有单独的测序引物且测序反应由可延伸的3'末端自引发的情况下，可延伸的3'末端（3'-OH）是有利的。
在其他实施方案中，切割位点用作链合成（延伸）终止子。在这样的实施方案中，切割位点位于衔接子中引物结合位点上游的任何位置。
在一些实施方案中，该方法包括以下步骤：使反应混合物与能够对切割位点进行切割的核酸内切酶在能够发生这样的切割的条件下接触。
在一些实施方案中，测序反应包括自引发步骤。在切割位点的核酸内切酶链切割产生游离的3'末端，其可以在没有单独的测序引物的情况下通过合成反应在测序中延伸（图7）。
在一些实施方案中，切割位点充当链终止步骤。从衔接的靶核酸中的两个衔接子之一延伸链（或引物）后，测序DNA聚合酶到达靶核酸中第二衔接子中的切割位点。链断裂将充当链延伸终止子。在其他实施方案中，修饰的核苷酸是非核苷酸聚合物，诸如聚乙二醇（PEG），例如六乙二醇（HEG）。这些部分未被核酸内切酶切割，但在正在被复制的核酸链中充当链合成终止子。
在一些实施方案中，该方法包括衔接的靶核酸或任何其他测序中间体（例如，用于纳米孔测序中的孔蛋白、DNA聚合酶和模板的三元复合物）的亲和捕获。为此，衔接子可以掺入亲和配体（例如生物素），该亲和配体将使得靶能够被亲和捕获部分捕获（例如，经由链霉亲和素）。在一些实施方案中，使用脱硫生物素。在一些实施方案中，亲和捕获利用结合到固体支持物上的亲和分子（例如，链霉亲和素）。固体支持物可以能够悬浮在溶液中（例如，玻璃珠、磁珠、聚合物珠或其他类似颗粒）或可以是固相支持物（例如，硅晶片、载玻片等）。溶液相支持物的实例包括超顺磁球形聚合物颗粒，例如DYNABEADS™磁珠或磁性玻璃颗粒，例如在美国专利656568、6274386、7371830、6870047、6255477、6746874和6255851中所述。在一些实施方案中，亲和配体是核酸序列，并且其亲和分子是互补序列。在一些实施方案中，固体基质包含聚-T寡核苷酸，而衔接子包含至少部分单链的聚-A部分。
在一些实施方案中，通过各种试剂来增强链分离，所述试剂选自单链结合蛋白，例如细菌SSB、低复杂度DNA C0t DNA（富集重复序列的DNA），或化学试剂，例如碱、甘油、尿素、DMSO或甲酰胺。
在一些实施方案中，本发明在衔接子连接步骤之后包括核酸外切酶消化步骤。核酸外切酶将从反应混合物中消除任何包含游离末端的核酸。核酸外切酶消化将富集拓扑学环状的，即不含游离末端的双衔接的靶核酸。未连接的靶核酸、仅与一个衔接子连接的核酸和过量的衔接子将从反应混合物中消除。
核酸外切酶可以是单链特异性核酸外切酶、双链特异性核酸外切酶或其组合。核酸外切酶可以是核酸外切酶I、核酸外切酶III和核酸外切酶VII中的一种或多种。
在一些实施方案中，本发明包括制备本文所述的测序准备就绪的衔接的靶核酸的文库的方法以及通过该方法产生的文库。具体地，文库包含源自样品中存在的核酸的衔接的靶核酸的集合。文库的衔接的靶核酸分子是拓扑学环状分子，其包含在每个末端与衔接子序列接合的靶序列，并包含切割位点并任选地包含引物结合位点。
在一些实施方案中，本发明包括通过核酸测序检测样品中的靶核酸。可以将样品中的多个核酸，包括所有核酸，转化为本发明的文库并测序。
在一些实施方案中，该方法进一步包括从文库消除受损或降解的靶的步骤，以改进测序读取结果的质量和长度。该步骤可以包括使文库与尿嘧啶DNA N-糖基化酶（UNG或UDG）、AP核酸酶和Fpg （甲酰胺基嘧啶[fapy]-DNA糖基化酶）（也称作8-氧鸟嘌呤DNA糖基化酶）中的一种或多种接触，以降解这种受损的靶核酸。
可以通过本领域已知的任意方法执行测序。特别有利的是能够读取长靶核酸的高通量单分子测序。这样的技术的实例包括利用SMRT的Pacific Biosciences平台(PacificBiosciences, Menlo Park, Cal.)或利用纳米孔技术的平台(诸如由Oxford NanoporeTechnologies (Oxford, UK)或Roche Sequencing Solutions (Roche Genia, SantaClara, Cal.)制造的那些)和任意其他目前存在的或将来的涉及或不涉及通过合成测序的DNA测序技术。测序步骤可以利用平台专用的测序引物。
分析和误差校正
在一些实施方案中，测序步骤涉及序列分析，其包括序列比对的步骤。在一些实施方案中，使用比对来确定来自多个序列(例如，具有相同条形码(UID)的多个)的共有序列。在一些实施方案中，使用条形码(UID)来确定来自全部都具有相同条形码(UID)的多个序列的共有序列。在其他实施方案中，使用条形码(UID)来消除伪迹，即，存在于一些但并非全部具有相同条形码(UID)的序列中的变异。可以消除这样的源自样品制备或测序误差的伪迹。
在一些实施方案中，通过对样品中具有每种条形码(UID)的序列的相对数目进行定量，可以对样品中的每种序列的数目进行定量。每种UID代表在原始样品中的单个分子，且计数与每种序列变体相关的不同UID可以确定在原始样品中的每种序列的分数。本领域技术人员将能够确定为确定共有序列所必需的序列读取结果的数目。在一些实施方案中，相关数目是准确定量结果所必需的读取结果/UID (“序列深度”)。在一些实施方案中，期望的深度是5-50个读取结果/UID。
形成例如用于扩增和测序的衔接的靶核酸的文库的现有技术方法示于图1。该文库包含线性的衔接的靶核酸。相反，本发明的方法（图2中所示）形成对核酸外切酶消化具有抗性并且可以使用核酸外切酶富集的拓扑学封闭的核酸。具有一个脱氧尿嘧啶（dU）的衔接子的一个实施方案示于图3。具有多个dU的衔接子的其他实施方案在图4和图7中说明。衔接子的又另一个实施方案具有非核苷酸聚合物，诸如聚乙二醇（PEG），例如六乙二醇（HEG），而不是dU（图5）。
该方法始于将茎-环衔接子连接至反应混合物中的双链核酸的末端（图2）。所得的结构是缺乏游离5'和3'末端的拓扑学环状（封闭）核酸。可以从反应混合物中除去任何未连接的靶核酸和未使用的衔接子分子，由此富集衔接的靶核酸（图2）。衔接子在茎部分中包含至少一个脱氧尿嘧啶（dU），其将成为链切割位点（图3）。接下来，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（例如，UNG）切割尿嘧啶，在DNA中暴露无碱基位点。进一步，使用AP裂解酶、核酸内切酶（例如核酸内切酶IV）或非酶试剂或条件进行链断裂以产生单链断裂（切口）。
接下来，使反应混合物与测序引物接触，该测序引物与衔接子的单链部分中的引物结合位点结合，并且能够起始测序引物延伸反应。单链部分中的引物结合位点可以在环部分中（图4）。单链部分中的引物结合位点也可以位于与核酸内切酶切割后暴露的缺口相对的区域中（图4）。进行引物延伸，直至并且终止于衔接的靶核酸中的相对侧衔接子中的切割位点（切口）。
在另一个实施方案中，使用图7中所示的衔接子。该方法的这种实施方案也始于将茎-环衔接子连接至反应混合物中的双链核酸的末端。在这种实施方案中，不需要单独的测序引物，并且衔接子的环区域不需要包含用于测序步骤的测序引物结合位点。衔接子在茎部分中包含一个或多个脱氧尿嘧啶（dU），它们将成为链切割位点。所得的衔接的靶核酸是缺乏游离5'和3'末端的拓扑学环状（封闭）核酸。可以从反应混合物中除去任何未连接的靶核酸和未使用的衔接子分子，由此富集衔接的靶核酸。例如，可以使用以靶向5'-或3'-末端的核酸外切酶进行的处理。
接下来，使用尿嘧啶-DNA糖基化酶（例如UNG）切割一个或多个尿嘧啶，在DNA中暴露无碱基位点。进一步，使用AP裂解酶、核酸内切酶（例如核酸内切酶IV或核酸外切酶VIII）或非酶试剂或条件进行链断裂以产生单链断裂（切口）。如果存在多于一个脱氧尿嘧啶，则会产生缺口。接下来，在测序链延伸反应中延伸切口（或缺口）中链的游离3'末端。在一些实施方案中，衔接子包含对核酸外切酶切割具有抗性的核苷酸。这些核苷酸（例如，硫代磷酸酯核苷酸）位于切割位点附近，以保护可延伸的3'-末端免受核酸外切酶降解。进行延伸，直至并且终止于衔接的靶核酸中的相对侧衔接子中的切割位点（切口或缺口）。
实施例
实施例1. 用含dU的茎-环衔接子形成文库并对其进行测序。
在此实施例中，使用了图3中图解的茎-环衔接子。制备了用于基于SMRT的测序系统（SEQ ID No: 3和4）和用于基于纳米孔的系统（SEQ ID No: 1和2）的衔接子。使每种衔接子在茎区域中具有和不具有脱氧尿嘧啶核苷酸。衔接子序列区域示于表1中。
表1. 衔接子序列
Figure 259884DEST_PATH_IMAGE001
HIV基因组的片段（HIV Genewiz野生型DNA（106 个拷贝），扩增子大小为1.kb）被用作靶核酸。使用商业文库制备试剂（Kapa Biosystems, Wilmington, Mass.），将2ug纯化的PCR产物连接至衔接子。连接后，将反应混合物用核酸外切酶处理以除去任何剩余的线性分子。对于线性衔接子（SEQ ID NO：5），不使用核酸外切酶。Qubit用于确定ssDNA和dsDNA最终文库浓度。在下一步中，将衔接的靶核酸用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII（USER™, New England Biolabs, Waltham, Mass.）的混合物消化。对于没有尿嘧啶的衔接子（SEQ ID No：1、3和5），未使用USER™。在USER™处理之后，添加测序引物。测序引物结合位点在环区域中（图4）。所得文库在Pacific BioSciences RSII平台（Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.）和纳米孔（nanopore）平台（RocheSequencing Solutions, Santa Clara, Cal.）上测序。表2中总结了RSII平台上测序读取结果的质量和长度。
表2. 在RSII平台上的测序
Figure 177024DEST_PATH_IMAGE002
纳米孔平台上测序读取结果的质量和长度示于图6中。
实施例2（预言的）。用含有自引发dU的发夹衔接子形成文库并对其进行测序。
在此实施例中，使用了图7中图解的发夹衔接子。衔接子为SEQ ID NO: 6:
SEQ ID NO: 6:
Figure 520543DEST_PATH_IMAGE003
U-脱氧尿嘧啶; *-硫代磷酸酯核苷酸。
使用标准文库制备试剂（例如Kapa Biosystems）将衔接子连接至靶核酸。用核酸外切酶Exo VII和Exo III处理含有衔接的靶核酸的反应混合物，以富集衔接的靶核酸。用UDG和核酸内切酶Endo IV处理富集的衔接的靶核酸。UDG切割U并留下无碱基位点，并且Endo IV切割该无碱基并留下开放的3'- OH。此步骤将发夹衔接子转换为自引发衔接子。具有自引发衔接子的衔接的核酸直接应用于长读取平台（例如纳米孔平台）上的线性测序。测序聚合酶与自引发衔接子中的3'-OH结合，并通过在线性单程测序中向前移动链来延伸链。
实施例3（预言的）。用含有自引发核糖核苷酸的发夹衔接子形成文库并对其进行 测序。
在此实施例中，使用了图7中图解的发夹衔接子。衔接子为SEQ ID NO: 7:
SEQ ID NO: 7:
Figure 915753DEST_PATH_IMAGE004
rA-核糖核苷酸；*-硫代磷酸酯核苷酸。
使用标准文库制备试剂（例如Kapa Biosystems）将衔接子连接至靶核酸。用核酸外切酶Exo VII和Exo III处理含有衔接的靶核酸的反应混合物，以富集衔接的靶核酸。用RNA酶H（例如RNA酶H2）处理富集的衔接的靶核酸，所述RNA酶H切割核糖核苷酸并留下开放的3′-OH。此步骤将发夹衔接子转化为自引发衔接子。如实施例2中那样，具有自引发衔接子的衔接的核酸直接应用于长读取平台上的线性测序。
尽管已经参考特定实施例详细描述了本发明，但对本领域技术人员显而易见的是，可以在本发明的范围内进行各种修改。因此，本发明的范围不应受到本文所述的实施例限定，而是由到下面呈现的权利要求限定。
序列表
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
Roche Sequencing Solutions, Inc.
Kapa Biosystems, Inc.
<120> 用于单分子测序的单链环状DNA模板的产生
<130> P34639-WO
<150> US 62/638,034
<151> 2018-03-02
<150> US 62/685,817
<151> 2018-06-15
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 46
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 1
atatctctct actgactgtc ctcctcctcc gtttttgaga gatatt 46
<210> 2
<211> 46
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 2
atatctctct actgactgtc ctcctcctcc gtttttgaga gatatt 46
<210> 3
<211> 46
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 3
atatctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gatatt 46
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 4
atatctctct tttcctcctc ctccgttgtt gttgttgaga gatatt 46
<210> 5
<211> 36
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 5
atctctctct actgactgtc ctcctcctcc gttttt 36
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 6
atctctctca aatcctcctc ctccgttgga ggaacggagg aggaggattt gagagagatt 60
<210> 7
<211> 60
<212> DNA
<213> 单链人工的
<400> 7
atctctctct tttcctcctc ctccgttgga ggaacggagg aggaggaaaa gagagagatt 60

Claims (14)

1.分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：
a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含至少一个链切割位点；
b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；
c)使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端；
d)延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述切割位点，并且不进行到互补链上。
2.权利要求1的方法，其中接合至衔接子是通过连接。
3.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含至少一个条形码。
4.权利要求1的方法，其中所述切割位点包含一个或多个脱氧尿嘧啶，并且所述切割剂包括尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(UNG)和核酸内切酶。
5.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含核酸外切酶保护核苷酸。
6.权利要求1的方法，其中所述衔接子包含捕获部分的配体。
7.权利要求1的方法，进一步包括在测序之前的靶富集步骤。
8.权利要求15的方法，其中所述富集是通过经由靶特异性探针捕获。
9.制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的靶核酸的文库的方法，所述方法包括以下步骤：
a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述茎包含链切割位点；
b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；
c)使所述反应混合物与切割剂接触以在所述切割位点切割所述双衔接的靶核酸，在每条链上形成可延伸的末端。
10.确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过权利要求9的方法制备靶核酸的文库；
b)延伸所述可延伸的末端，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中所述延伸终止于所述切割位点并且不进行到互补链上。
11.分别对靶核酸的每条链进行测序的方法，该方法包括以下步骤：
a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点，以及；
b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸；
c)使所述反应混合物与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；
d)延伸所述引物，从而分别对所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点，并且不进行到互补链上。
12.权利要求12的方法，其中所述链合成终止位点选自切口、缺口、无碱基核苷酸和非核苷酸接头。
13.制备用于分别对靶核酸的每条链进行测序的文库的方法，该方法包括以下步骤：
a)在反应混合物中，将双链靶核酸的末端接合至衔接子以形成双衔接的靶核酸，其中所述衔接子是形成双链茎和单链环的单链，并且所述环包含引物结合位点，并且所述衔接子进一步包含链合成终止位点；
b)使所述反应混合物与核酸外切酶接触，从而富集所述双衔接的靶核酸，并且形成双衔接的靶核酸的文库。
14.确定样品中靶核酸的文库的序列的方法，所述方法包括以下步骤：
a)通过权利要求13的方法形成靶核酸的文库；
b)使所述文库与引物接触，所述引物能够与所述引物结合位点杂交；
c)延伸所述引物，从而分别对所述文库中的所述靶核酸的每条链进行测序，其中延伸终止于所述链合成终止位点并且不进行到互补链上。
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CN114763546A (zh) * 2021-01-12 2022-07-19 香港城市大学深圳研究院 一种dU5`衔接子及其应用和构建的cDNA文库
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