ES2595433T3 - Aumento de la confianza en las identificaciones de alelos con el recuento molecular - Google Patents

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Abstract

Un método para determinar el número mínimo de moléculas de polinucleótidos individuales que se originan a partir de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en una configuración o procedimiento de análisis de secuencia particular, que incluye: unir una región de bases degeneradas (DBR) a moléculas de polinucleótidos de partida; amplificar las moléculas de polinucleótidos de partida unidos a DBR; secuenciar las moléculas de polinucleótidos amplificadas, en donde se obtiene la secuencia de la DBR así como una porción del polinucleótido; determinar el número de DBR diferentes unidas a un polinucleótido de interés; usar el número de secuencias de DBR diferentes presentes en la etapa de secuenciación para determinar el número mínimo de moléculas de polinucleótidos individuales que se originan a partir de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en la configuración o el procedimiento de análisis de secuencias particular; y determinar un valor estadístico para una identificación de alelos en un ensayo de genotipado que no se puede derivar del número de lecturas en solitario.

Description

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ambos límites, los intervalos que excluyen cualquiera o ambos de dichos límites incluidos, están incluidos también en la invención.
A menos que se defina otra cosa, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que es entendido comúnmente por los expertos en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o ensayo de la presente invención se pueden utilizar cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos aquí, se describen ahora algunos métodos y materiales potenciales y preferidos. Todas las publicaciones mencionadas en el presente documento se citan como referencia para dar a conocer y describir los métodos y/o los materiales en relación a los cuales se citan las publicaciones. Se entiende que la presente descripción reemplaza cualquier descripción de una publicación citada como referencia en la medida en que haya una contradicción.
Se debe observar que, como se usa aquí y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", “una” y "el", “la” incluyen los plurales referentes a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un ácido nucleico" incluye una pluralidad de dichos ácidos nucleicos y la referencia a "el compuesto" incluye la referencia a uno o más compuestos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, y así sucesivamente.
La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique otra cosa, técnicas y descripciones convencionales de la química orgánica, tecnología de polímeros, biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes), biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la experiencia de la técnica. Tales técnicas convencionales incluyen la síntesis de matrices de polímeros, hibridación, ligamiento, y detección de la hibridación utilizando una etiqueta. Ilustraciones específicas de técnicas adecuadas se pueden haber tomado como referencia para el ejemplo que sigue. Sin embargo, también se pueden utilizar por supuesto, otros procedimientos convencionales equivalentes. Tales técnicas y descripciones convencionales se pueden encontrar en manuales de laboratorio estándar, tales como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols I-IV.), Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cells: A Laboratory Manual, PCR Primer: A Laboratory Manual, and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (todos de Cold Spring Harbor Laboratory Press), Stryer, L. (1995) Biochemistry (4th Ed.) Freeman, New York, Gait, "Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach" 1984, IRL Press, London, Nelson and Cox (2000), Lehninger, A., Principles of Biochemistry 3rd Ed., W. H. Freeman Pub., New York, N.Y. y Berg et al. (2002) Biochemistry, 5th Ed., W.H. Freeman Pub., New York, N. Y.
Las publicaciones expuestas en el presente documento se proporcionan únicamente para su descripción antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada en este documento se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no tiene derecho a anteceder a dicha publicación en virtud de una invención anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de publicación reales que puede ser necesario que sean confirmadas de forma independiente.
Como se ha resumido antes, algunos aspectos de la presente invención se dirigen al uso de bases de nucleótidos degeneradas (p. ej., en una región de bases degeneradas, o DBR) añadidas a los polinucleótidos sometidos a análisis de secuencias que se utilizan en el establecimiento del número de moléculas de polinucleótidos individuales procedentes de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en una configuración o proceso particular de análisis de secuencias. La inclusión de una DBR en los polinucleótidos sometidos a análisis de secuenciación se utiliza en una variedad de análisis genéticos, incluyendo el aumento de la confianza en la identificación de alelos al proporcionar un mecanismo para determinar un valor estadístico para una identificación de alelos, un valor que no se puede derivar del número de lecturas solo. La DBR se puede añadir a un polinucleótido de cualquier manera conveniente, incluyéndola como parte de un adaptador (o conjunto de adaptadores) unido a los polinucleótidos a secuenciar, p. ej., la DBR puede estar en un adaptador que incluye también un sitio del cebador de secuenciación, o la DBR puede estar presente en un cebador de síntesis de ácido nucleico, p. ej., un cebador de PCR, de tal manera que la DBR se añade a un polinucleótido diana cuando se utiliza el cebador en una reacción de polimerización.
Las DBR también encuentran utilidad en la realización de análisis genéticos en muestras agrupadas de polinucleótidos en las que cada polinucleótido de la muestra conjunta incluye un MID específico para su muestra de origen (descrito en detalle más adelante). Esto permite al usuario determinar la cobertura de secuencia de una especie específica de polinucleótidos (o múltiples especies) de cada una de las muestras de origen que se reunieron para generar la muestra conjunta. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención incluyen análisis de secuencia de polinucleótidos en una muestra conjunta, donde cada polinucleótido contiene un MID y una DBR.
Ácidos nucleicos
La presente invención (como se describe en detalle más adelante) se puede emplear para la manipulación y análisis de secuencias de ácido nucleico de interés (o polinucleótidos) procedentes de prácticamente cualquier fuente de ácido nucleico, que incluyen pero no se limitan a ADN genómico, ADN complementario (ADNc), ARN (p. ej., ARN mensajero, ARN ribosomial, ARN interferente corto, microARN, etc.), ADN plasmídico, ADN mitocondrial, ADN sintético, etc. Además, cualquier organismo, material orgánico o sustancia que contiene ácido nucleico se puede utilizar como una fuente de ácidos nucleicos para ser procesada de acuerdo con la presente invención, que incluyen,
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pero no se limitan a, plantas, animales (p. ej., reptiles, mamíferos, insectos, gusanos, peces, etc.), muestras de tejidos, bacterias, hongos (p. ej., levaduras), fagos, virus, tejido cadavérico, muestras arqueológicas/antiguas, etc. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos en la muestra de ácido nucleico se derivan de un mamífero, y en determinadas realizaciones, el mamífero es un ser humano.
En ciertas realizaciones, las secuencias de ácidos nucleicos están enriquecidas. Por enriquecido se entiende que los ácidos nucleicos (p. ej., en una muestra de polinucleótidos) se someten a un proceso que reduce la complejidad de los ácidos nucleicos, generalmente aumentando la concentración relativa de una especie particular de ácido nucleico en la muestra (p. ej., que tiene un locus específico de interés, que incluye una secuencia específica de ácido nucleico, que carece de un locus o secuencia, que está dentro de un intervalo de tamaño específico, etc.). Hay una amplia variedad de formas de enriquecer los ácidos nucleicos que tienen una característica o características de secuencia específicas, y por tanto se puede emplear cualquier método conveniente para conseguir esto. El enriquecimiento (o reducción de la complejidad) puede tener lugar en cualquiera de una serie de etapas del proceso, y será determinado por deseo del usuario. Por ejemplo, el enriquecimiento puede tener lugar en muestras parentales individuales (p. ej., ácidos nucleicos sin marcar antes del ligamiento al adaptador) o en muestras multiplexadas (p. ej., ácidos nucleicos marcados con secuencias de adaptadores que codifican MID; los MID se describen con más detalle más adelante).
En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos de la muestra de ácido nucleico se amplifican antes del análisis. En algunas de estas realizaciones, la reacción de amplificación sirve también para enriquecer una muestra de ácido nucleico de partida en una secuencia o locus de interés. Por ejemplo, una muestra de ácido nucleico de partida se puede someter a una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica una o más regiones de interés. En ciertas realizaciones, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación exponencial, mientras que en otras realizaciones particulares, la reacción de amplificación es una reacción de amplificación lineal. En la práctica de la presente invención, se puede utilizar cualquier método conveniente para llevar a cabo las reacciones de amplificación en una muestra de ácido nucleico de partida. En ciertas realizaciones, la polimerasa de ácido nucleico empleada en la reacción de amplificación es una polimerasa que tiene la capacidad de corrección de pruebas (p. ej., ADN polimerasa phi29, ADN polimerasa de Thermococcus litoralis, ADN polimerasa de Pyrococcus furiosus, etc.).
En ciertas realizaciones, la muestra de ácido nucleico a analizar se deriva de una única fuente (p. ej., un único organismo, virus, tejido, célula, sujeto, etc.), mientras que en otras realizaciones, la muestra de ácido nucleico es un conjunto de ácidos nucleicos extraídos de una pluralidad de fuentes (p. ej., un conjunto de ácidos nucleicos procedentes de una pluralidad de organismos, tejidos, células, sujetos, etc.), donde por "pluralidad" se entiende dos
o más. Como tal, en ciertas realizaciones, una muestra de ácido nucleico puede contener ácidos nucleicos procedentes de 2 o más fuentes, 3 o más fuentes, 5 o más fuentes, 10 o más fuentes, 50 o más fuentes, 100 o más fuentes, 500 o más fuentes, 1000 o más fuentes, 5000 o más fuentes, 10.000 o más fuentes, 25.000 o más fuentes, etc.
En ciertas realizaciones, los fragmentos de ácido nucleico se van a reunir con fragmentos de ácido nucleico se derivan de una pluralidad de fuentes (p. ej., una pluralidad de organismos, tejidos, células, sujetos, etc.), donde por "pluralidad" se entiende dos o más. En tales realizaciones, los ácidos nucleicos derivados de cada fuente incluyen un identificador multiplex (MID) de tal modo que se puede determinar la fuente de la que se deriva cada fragmento de ácido nucleico marcado. En tales realizaciones, cada fuente de la muestra de ácido nucleico se correlaciona con un MID único, donde por MID único se entiende que cada MID diferente empleado se puede diferenciar de cualquier otro MID empleado en virtud de al menos una característica, p. ej., la secuencia de ácido nucleico del MID. Se puede utilizar cualquier tipo de MID, incluyendo pero sin limitarse a los descritos en la solicitud de patente de EE.UU. número de serie 11/656,746, también en tramitación, presentada el 22 de enero de 2007, y titulada "Nucleic Acid Analysis Using Sequence Tokens", así como en la patente de Estados Unidos 7,393,665, expedida el 1 de julio de 2008, y titulada "Methods and Compositions for Tagging and Identifying Polynucleotides” que se citan como referencia por su descripción de etiquetas de ácidos nucleicos y su uso en la identificación de polinucleótidos. En ciertas realizaciones, un conjunto de MIDs empleados para marcar una pluralidad de muestras no necesita tener ninguna propiedad particular común (p. ej., Tm, longitud, composición de bases, etc.), ya que los métodos de marcado asimétrico (y muchos métodos de lectura de la marca, que incluyen pero no se limitan a la secuenciación de la marca o la medida de la longitud de la marca) pueden contener una amplia variedad de conjuntos de MID únicos.
Región de bases degeneradas (DBR)
Algunos aspectos de la presente invención incluyen métodos y composiciones para determinar o estimar el número de moléculas de polinucleótidos individuales procedentes de la misma región genómica de la misma muestra original que han sido secuenciadas en una configuración o proceso particular de análisis de secuencias. En estos aspectos de la invención, una región de bases degeneradas (DBR) se une a las moléculas de polinucleótidos de partida que se secuencian posteriormente (p. ej., después de que se realicen ciertas etapas del proceso, p. ej., la amplificación y/o el enriquecimiento, p. ej., la PCR). Como se detalla a continuación, la evaluación del número (y en algunos casos, la combinación) de diferentes secuencias de DBR presentes en una ronda de secuenciación permite el establecimiento del número (o número mínimo) de diferentes polinucleótidos de partida que han sido secuenciados para un polinucleótido particular (o región de interés; ROI). Este número se puede utilizar, por ejemplo, para dar una
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medida estadística de la confianza en las identificaciones de alelos, aumentando de este modo la confianza en la realización de tales determinaciones de alelos (p. ej., cuando se identifican alelos homocigóticos). Las DBR permiten también la identificación de errores potenciales de secuenciación o amplificación que impactan negativamente en el análisis genético si no son detectados.
La secuenciación del ADN incluye típicamente un etapa de unión de un adaptador a los polinucleótidos en una muestra a secuenciar, donde el adaptador contiene un sitio del cebador de la secuenciación (p. ej., mediante ligamiento). Como se usa en el presente documento, un "sitio del cebador de secuenciación" es una región de un polinucleótido que es o bien idéntica o bien complementaria a la secuencia de un cebador de secuenciación (cuando está en la forma de cadena simple) o una región de cadena doble formada entre una secuencia del cebador de secuenciación y su complemento. La orientación específica de un sitio del cebador de secuenciación puede ser deducida por los expertos en la técnica a partir de las características estructurales del polinucleótido específico que contiene el sitio del cebador de secuenciación.
En adición al sitio del cebador de secuenciación, también está unida a los polinucleótidos una región de bases degeneradas (DBR), ya sea como parte del adaptador que contiene el sitio del cebador de secuenciación o de forma independiente (p. ej., en un segundo adaptador unido al polinucleótido). Se puede emplear cualquier método conveniente para la unión o adición de una DBR a los polinucleótidos. Una DBR es una región que puede tener una composición o secuencia de bases variable (que se puede considerar como "aleatoria") en comparación con otros polinucleótidos marcados de la muestra. El número de DBR diferentes en una población de polinucleótidos de una muestra dependerá del número de bases en la DBR, así como del número potencial de diferentes bases que pueden estar presentes en cada posición. Por lo tanto, una población de polinucleótidos que tiene unidas DBR con dos posiciones de bases, donde cada posición puede ser una cualquiera de A, C, G y T, tendrá potencialmente 16 DBR diferentes (AA, AC, AG, etc.). Las DBR pueden incluir por lo tanto 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bases, incluyendo 15 o más, 20 o más, etc. En ciertas realizaciones, la DBR tiene de 3 a 10 bases de longitud. Además, cada posición en una DBR puede tener una composición de bases diferente. Por ejemplo, una DBR de 4 bases puede tener cualquiera de las siguientes composiciones: NNNN; NRSN; SWSW; BDHV (véase la Tabla 1 a continuación para el código de nucleótidos según la IUPAC). Se observa además que en ciertas realizaciones, una base en una DBR puede variar en virtud de tener una modificación detectable u otro resto unido a la misma. Por ejemplo, se pueden utilizar ciertas plataformas de secuenciación de nueva generación (p. ej., Pacific Biosciences™) para detectar diferencias de metilación en las bases durante el proceso de secuenciación. Como tal, una base no metilada en una DBR se podría distinguir de una base metilada en una DBR. Por lo tanto, no se pretende ninguna limitación con respecto a la longitud o composición de las bases de una DBR.
Código de nucleótidos según IUPAC
Base
A
Adenina
C
Citosina
G
Guanina
T (o U)
Timina (o uracilo)
R
A o G
Y
C o T
S
G o C
W
A o T
K
G o T
M
A o C
B
C o G o T
D
A o G o T
H
A o C o T
V
A o C o G
N
cualquier base
Se observa aquí que una DBR puede ser una única región (es decir, que tiene todas las bases de nucleótidos adyacentes entre sí) o puede estar presente en diferentes localizaciones en un polinucleótido (es decir, las bases de la DBR están separadas por secuencias no DBR, llamada también una DBR dividida). Por ejemplo, una DBR puede tener una o más bases en un primer adaptador en una primera localización en un polinucleótido y una o más bases en un segundo adaptador en una segunda localización en el mismo polinucleótido (p. ej., la DBR puede tener bases presentes en ambos extremos de un polinucleótido marcado asimétricamente, es decir, un polinucleótido que tiene adaptadores asimétricos). No se pretende ninguna limitación a este respecto.
Las DBR se pueden diseñar para facilitar la detección de los errores que se producen en las DBR durante los procesos de amplificación que se llevan a cabo antes del análisis de secuencia y/o los errores que se producen en la propia reacción de secuenciación. En tales realizaciones, las secuencias de DBR empleadas se diseñan de tal manera que un error en una secuencia de DBR no lleva necesariamente a la generación de otra posible secuencia de DBR (produciendo de ese modo la identificación incorrecta de replicones derivados del mismo molde como si
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El uso de una DBR como se describe aquí aumentará la confianza en la realización de identificaciones de alelos procedentes de muestras que tienen cantidades limitadas de ADN. Por ejemplo, si 16 lecturas de secuenciación de un alelo de un locus genético contienen todas la secuencia GA de DBR, entonces es probable que todas estas lecturas procedan de la misma molécula de polinucleótido parental (y por lo tanto no está justificada una identificación de un alelo homocigótico). Sin embargo, si las 16 lecturas de secuenciación tienen cada una, una secuencia de DBR diferente, se puede realizar una identificación homocigótica con más confianza, ya que cada lectura proviene de una molécula de polinucleótido parental diferente.
Se observa aquí que en muchas realizaciones, no es posible llegar a la conclusión de que los polinucleótidos que tienen secuencias de DBR idénticas se derivan de la misma molécula de polinucleótido parental, ya que múltiples DBR idénticas pueden estar presentes en los polinucleótidos unidos a la DBR. Por ejemplo, si una población de adaptadores que contiene una DBR de dos bases N se utiliza para marcar una muestra que contiene más de 16 polinucleótidos, un subconjunto de los polinucleótidos marcados tendrá idénticas DBR, y por lo tanto no será posible determinar que sus secuencias fueron derivadas de diferentes moléculas del polinucleótido parental.
Una manera a modo de ejemplo para determinar más exactamente el número real de moléculas de partida o moléculas parentales debería ser aumentar la degeneración de las DBR (es decir, aumentar el número de secuencias únicas en la DBR utilizadas para marcar la muestra particular de interés) de modo que es probable que cada molécula única tenga una DBR diferente. En cualquier caso, en métodos a modo de ejemplo, se puede utilizar el número de DBR observadas o también la distribución de probabilidad del número esperado de lecturas para producir muy probablemente el número observado de las DBR.
Cuando se calculan estimaciones de si una identificación de alelo particular es un heterocigoto o un homocigoto, se puede crear/emplear una función apropiada L(r,v) que restituye la probabilidad de un genotipo con las lecturas de referencia r y variante v. Cuando se emplean las DBR como se describe aquí, se puede utilizar una función modificada para el cálculo de los estimados L(r',v'), donde r' es el número de DBR únicas para la lectura de referencia y v' es el número de DBR únicas para la lectura variante. Se puede emplear cualquier función conveniente para realizar identificaciones de alelos y se puede modificar para emplear los datos relativos a las lecturas de DBR como se describe aquí.
Se observa aquí, que se pueden utilizar aspectos de la invención para aumentar la confianza en la identificación de las variaciones del número de copias en una muestra de polinucleótidos, p. ej., una muestra genómica. Las variaciones del número de copias pueden incluir reordenamientos genómicos tales como deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones o aneuploidías cromosómicas enteras tales como monosomías, disomías, trisomías, tetrasomías y pentasomías. Considérese, por ejemplo, un suceso de duplicación donde los padres tienen genotipos CA y CC en un SNP dado, y el probando tiene genotipo ACC. En el padre con el genotipo AC, con suficiente profundidad de cobertura de secuenciación (es decir, suficientes lecturas de secuenciación), se espera que el número de las DBR asociadas con el alelo C y con el alelo A sea similar. En el probando, con suficiente profundidad de cobertura de secuenciación, se espera que el número de las DBR asociadas con el alelo C sea 2 veces el número de las DBR asociadas con el alelo A, lo que proporciona la prueba de un caso de duplicación que engloba el alelo C. El uso de las DBR, más que el número de lecturas de secuenciación, proporciona más confianza en la identificación de una variación del número de copias ya que la DBR se puede utilizar para identificar lecturas que se derivan de diferentes moléculas de polinucleótidos.
Ejemplos de aplicaciones de las DBR
Como se ha detallado antes, las DBR permiten la validación estadística de las variantes de secuencia en una muestra heterogénea, incluyendo genomas o conjuntos de genomas complejos. Por ejemplo, las DBR encuentran uso en el análisis de genomas complejos en muestras de tumores, muestras microbianas, muestras ambientales, etc.
A continuación se proporcionan ejemplos de métodos estadísticos y ejemplos de aplicaciones de las DBR. Las descripciones que siguen se indican sólo a modo de ejemplos y no pretenden limitar el alcance del empleo de las DBR en los análisis de polinucleótidos.
Métodos Estadísticos
Como se ha descrito antes, en aspectos de la presente invención, las rondas de bases degeneradas (las DBR) se utilizan para estimar, o para obtener una medida cuantitativa del número real de moléculas molde secuenciadas o analizadas en un proceso dado. Dos lecturas pueden tener la misma DBR ya sea porque las lecturas proceden de la misma molécula molde o porque las moléculas han recibido la misma DBR por casualidad. El número potencial de distintas moléculas molde secuenciadas varía del número de las DBR al número de lecturas. La distribución de las DBR desde un número de moléculas de partida viene dada por la distribución de ocupación [véase C.A. Charalambides and C.A. Charalambides. Combinatorial methods in discrete distributions. John Wiley and Sons, 2005]. Dado un número observado de DBR, el número probable de moléculas de partida se puede calcular utilizando la estimación de máxima probabilidad, u otras técnicas adecuadas. Alternativamente, para cada DBR, la molécula molde más probable se puede estimar utilizando la secuencia de consenso de todas las lecturas con esa particular
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Tabla I. Marcado de DBR en los ciclos 0 a 3 de una reacción de PCR para un único molde de doble cadena (A y B).
Ciclo
Cadena DBR 5' nº DBR 3' nº Cadena molde Sobreescritura de DBR
Ciclo 0
A - - -
B
- - -
Ciclo 1
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
Ciclo 2
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
E
3 - A
F
4 1 C
G
5 2 D
H
6 - B
Ciclo 3
A - - -
B
- - -
C
1 - A
D
2 - B
E
3 - A
F
4 1 C
G
5 2 D
H
6 - B
I
7 - A
J
8 3 E
K
9 4 F sobreescritura de DBR 1 con DBR 9
L
10 1 C
M
11 2 D
N
12 5 G sobreescritura de DBR 2 con DBR 12
O
13 6 H
P
14 - B
La Tabla I anterior y la Figura 3 muestran las cadenas que se han acumulado durante todo el proceso de la PCR. (Debe observarse el arrastre de las cadenas A y B del ciclo 0 a los ciclos 1, 2, y 3; el arrastre de las cadenas C y D 5 del ciclo 1 a los ciclos 2 y 3; etc.).
Dada la suficiente profundidad de secuenciación, las DBR se pueden utilizar para rastrear la molécula de origen, incluso si se ha producido una sobreescritura de la DBR. Por ejemplo, la cadena K tiene DBR 5' nº 9 y DBR 3' nº 4. La DBR nº 4 se comparte con la cadena F, que tiene DBR 5' nº 4 y DBR 3' nº 1. La DBR nº 1 se comparte con la cadena C. Por lo tanto las cadenas K y F se derivan originalmente de la cadena C. Del mismo modo, la cadena N
10 tiene DBR 5' nº 12 y DBR 3' nº 5. La DBR nº 5 se comparte con la cadena G, que tiene DBR 5' nº 5 y DBR 3' nº 2. La DBR nº 2 se comparte con la cadena D. Por lo tanto las cadenas N y G se derivan originalmente de la cadena D.
Como se ha expuesto anteriormente, los cebadores de la PCR que contienen DBR se eliminan después de los primeros ciclos (p. ej., después de la finalización del ciclo 3 como se muestra en la Tabla I).
La Figura 3 muestra un esquema para los 2 primeros ciclos de PCR para un único molde de cadena doble como se
15 muestra en la Tabla I. En el ciclo 0, sólo las cadenas molde de doble cadena están presentes, es decir, la cadena A de la parte superior y la cadena B de la parte inferior. Obsérvese que la dirección de las flechas sobre cada cadena en la Figura 3 indica la dirección 5' a 3'. En el primer ciclo de la PCR (ciclo 1), se producen 2 productos mediante el par de cebadores de la PCR (ambos miembros del par de cebadores incluyen una secuencia de DBR), la primera cadena (C) que tiene DBR nº 1 ("1" como se muestra en la figura) y la segunda (D) que tiene DBR2 ("2" como se
20 muestra en la figura). En el segundo ciclo de la PCR (ciclo 2), los cuatro moldes (A, B, C y D) producen 4 productos (E, F, G y H), que tiene cada uno, una subsiguiente DBR unida (DBR nº 3, nº 4, nº 5 y nº 6, respectivamente). Se debe observar que los productos generados a partir de los moldes C y D (F y G) tienen ahora las DBR en ambos extremos. El ciclo 3 (que no se muestra en la Figura 3) utiliza entonces los 8 moldes del ciclo 2 para producir 8
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número de polinucleótidos parentales en una muestra, se pueden evaluar la cantidad relativa o cuantitativa de las especies de polinucleótidos específicos y la confianza en la determinación de dichas especies. Por ejemplo, el análisis de una muestra de ADNc utilizando las DBR se puede emplear para evaluar los niveles relativos o cuantitativos de diferentes especies de ADNc en la muestra, proporcionando así una manera de determinar sus niveles relativos de expresión génica.
Las DBR en el análisis de muestras conjuntas
Otra aplicación de las DBR es en la realización de análisis genéticos sobre muestras reunidas de polinucleótidos en las que cada polinucleótido de la muestra conjunta incluye un MID específico para su muestra de origen (descrito en detalle anteriormente). Esto permite al usuario determinar la cobertura de secuencia de una especie de polinucleótidos específicos (o múltiples especies) de cada una de las muestras de origen que se reúnen para generar la muestra conjunta. Esto proporciona un mecanismo para asegurar que los polinucleótidos de cada muestra de partida en la muestra conjunta están representados adecuadamente. Por lo tanto, las realizaciones de la presente invención incluyen análisis de secuencias de polinucleótidos en una muestra conjunta, donde cada polinucleótido contiene un MID y una DBR. Se observa que en estas realizaciones, se puede usar el mismo diseño de DBR en conjunción con todas las muestras parentales/MIDs, ya que esta es la combinación de MID/DBR que se utiliza en el análisis de secuencias de la muestra específica.
Los análisis de la muestra conjunta utilizando los MID y DBR se utilizan en numerosos análisis genéticos, incluyendo la realización de identificaciones de alelos, la corrección de errores de secuencias, los análisis relativos y cuantitativos de la expresión génica, y similares. Se observa que al analizar polinucleótidos en una muestra conjunta de acuerdo con aspectos de la presente invención, es importante mantener tanto los dominios de MID como los dominios de DBR en cada etapa del flujo de trabajo que se emplea, ya que la pérdida de uno u otro dominio tendrá un impacto negativo sobre la confianza en los resultados obtenidos.
Se observa, además, que el uso de los dominios de MID y DBR en el análisis genético es especialmente potente cuando se combina con plataformas de secuenciación de nueva generación (NGS), muchas de las cuales proporcionan datos de secuencias para cada polinucleótido individual presente en la muestra a ser secuenciada. En contraste con los métodos convencionales de secuenciación en los que los clones individuales de los polinucleótidos se secuencian de forma independiente, las plataformas de secuenciación de nueva generación proporcionan secuencias de múltiples polinucleótidos diferentes en una muestra de forma simultánea. Esta diferencia permite que se hagan análisis estadísticos específicos de la muestra que no están limitados por tener que clonar y secuenciar de forma independiente cada polinucleótido. Por lo tanto, los análisis del dominio MID/DBR descritos en la presente memoria son sinérgicos con las plataformas de secuenciación de nueva generación, proporcionando mejores métodos estadísticos para analizar las cantidades muy grandes de datos de las secuencias de las muestras conjuntas.
Kits y sistemas
Se describen también kits y sistemas para la práctica de los métodos propuestos, es decir, para el uso de las DBR para determinar el número (o mínimo número), de diferentes polinucleótidos de partida que han sido secuenciados para un polinucleótido particular. Como tales, los sistemas y kits pueden incluir polinucleótidos que contienen las DBR (p. ej., adaptadores), así como cualquier otro dominio funcional de interés como se describe en el presente documento (p. ej., sitios de los cebadores de secuenciación, MID, secuencias reflejas, etc.). Los sistemas y kits pueden incluir también reactivos para llevar a cabo todas las etapas para unir los adaptadores a los polinucleótidos de una muestra parental, preparar una muestra parental para la unión adaptador/DBR, y/o reactivos para llevar a cabo las reacciones de secuenciación (p. ej., ligasas, enzimas de restricción, nucleótidos, polimerasas, cebadores, cebadores de secuenciación, dNTPs, ddNTPs, exonucleasas, etc.). Los diversos componentes de los sistemas y kits pueden estar presentes en recipientes separados o ciertos componentes compatibles pueden ser pre-reunidos en un único recipiente, según se desee.
Los sistemas y kits pueden incluir también uno o más de otros reactivos para preparar o procesar una muestra de ácido nucleico de acuerdo con los métodos propuestos. Los reactivos pueden incluir una o más matrices, disolventes, reactivos de preparación de muestras, tampones, reactivos de desalación, reactivos enzimáticos, reactivos desnaturalizantes, donde los estándares de calibración, tales como los controles positivos y negativos se pueden proporcionar también. Así pues, los kits pueden incluir uno o más recipientes tales como viales o frascos, conteniendo cada recipiente un componente separado para llevar a cabo una etapa de procesamiento o preparación de una muestra según la presente invención.
Además de los componentes mencionados antes, los kits incluyen típicamente además instrucciones para utilizar los componentes del kit para practicar los métodos propuestos, p. ej., para emplear las DBR como se ha descrito anteriormente. Las instrucciones para la práctica de los métodos de la invención generalmente se registran en un medio de registro adecuado. Por ejemplo, las instrucciones se pueden imprimir sobre un sustrato, tal como papel o plástico, etc. Como tales, las instrucciones pueden estar presentes en los kits como un prospecto, en el etiquetado del recipiente del kit o de sus componentes (es decir, asociado con el empaquetado o sub-empaquetado), etc. En otros kits, las instrucciones están presentes como un archivo electrónico de almacenamiento de datos presente en
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un medio de almacenamiento legible por un ordenador adecuado, por ejemplo, CD-ROM, disquete, etc. Todavía en otros kits, las instrucciones reales no están presentes en el kit, pero se proporcionan medios para obtener las instrucciones de una fuente remota, p. ej., a través de Internet. Un ejemplo es un kit que incluye una dirección web en la que se pueden ver las instrucciones y/o de la que se pueden descargar las instrucciones. Al igual que con las instrucciones, este medio para obtener las instrucciones se registra en un sustrato adecuado.
Además de la base de datos, programación e instrucciones, los kits pueden incluir también una o más muestras control y reactivos, p. ej., dos o más muestras control para utilizar en el ensayo del kit.
Ejemplos
Métodos
Dos muestras idénticas de ADN genómico de ratón se marcaron con adaptadores. Una de las muestras utilizó un adaptador que tiene una región sintetizada de forma redundante que consiste en 7 bases (RYBDHVB), cada una de las cuales podría ser una de dos bases (para las posiciones R e Y) o de tres bases (para las posiciones B, D, H o V) (o un total de 972 secuencias diferentes), seguida por las bases ACA; la segunda muestra utilizó un adaptador que tiene una región sintetizada de forma redundante que consiste en 7 bases (RYBDHVB), cada una de las cuales podría ser una de dos bases (para las posiciones R e Y) o de tres bases (para las posiciones B, D, H o V) (o un total de 972 secuencias diferentes) seguida por las bases ACG. Nótese que las bases en negrita y subrayadas corresponden a un sitio polimórfico sintético. En estos adaptadores, la secuencia RYB sirve como la región DBR y la DHVB sirve como el MID. Por lo tanto, había presentes 12 posibles códigos de DBR (2 × 2 × 3) y 81 diferentes MID (3 × 3 × 3 × 3).
Se mezclaron después las dos muestras juntas en cantidades iguales para crear, en efecto, un perfecto heterocigoto 50/50 de tres bases A y G aguas abajo del MID (es decir, la secuencia DHVB). Diferentes cantidades de la mezcla (100 ng, 300 ng, 600 ng, 2500 ng, 5000 ng, y 10.000 ng) se sometieron a reacciones de interacción (pull-down) de hibridación seguidas por la amplificación a través de 10 ciclos de PCR con cebadores TiA y TiB. Las sondas de captura empleadas fueron oligonucleótidos purificados en cartucho en fase inversa de 60 meros 5'-biotinilados (Biosearch). Después de la amplificación con TiA y TiB, se utilizó una reacción secundaria de PCR con TiA y un cebador específico de la secuencia con cola de TiB (5'-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTCTCAGGGACACCCAGCCAAGACAGC-3') (SEQ ID NO: 1) para amplificar un fragmento específico. El fragmento de PCR generado a partir de cada muestra en la hibridación pulldown/PCR fue enviado para secuenciación con Shot 454 Ti para determinar la DBR, el MID y los alelos A/G.
La secuencia del amplicón procedente de la hibridación pull down/PCR se muestra a continuación (SEQ ID NO: 2). La región DBR está subrayada, el MID está en negrita, y el alelo (R, que corresponde a A o G) está en negrita y subrayado.
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Resultados
La Figura 1 muestra la relación de alelos para cada MID en la muestra. Los números en la parte superior de cada uno de los 6 paneles muestran la masa de entrada de ADN genómico utilizada (en nanogramos). El eje de abscisas muestra, para cualquier MID particular, la fracción de las lecturas de secuenciación de A, o calls (en inglés), (es decir, el número de lecturas de una de las bases polimórficas en la posición del SNP sintético) frente al número total de lecturas, por ejemplo, la relación de (lecturas de A)/(lecturas de A + lecturas de G). Esto se denomina la relación de alelos. El eje de ordenadas es el número de los MID observados con una relación particular de alelos (el número total de los MID, como se señaló anteriormente, es 81). Debido a que era sabido que el ADN de entrada tenía una relación de A/G 50/50, la relación de alelos para cada muestra debería ser 0,5.
Para una masa de entrada baja, la relación de alelos se distorsiona -demasiado alta o demasiado baja -debido a que las moléculas de entrada a la primera etapa de la PCR eran limitantes y por lo tanto se observó preferentemente uno de los dos alelos. Como la masa aumenta en la primera etapa, se observan ambos alelos y están cada vez más próximos a la relación esperada de 0,5. Este análisis demuestra que hubo una considerable caída de los alelos a 100 ng, 300 ng y 600 ng, mientras que hubo una pequeña o ninguna caída de los alelos en los niveles de entrada más altos.
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