JP2024506899A - 核酸中のメチル化の塩基レベル検出のための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、核酸中のメチル化を検出するための改良された方法及び組成物を含む。特に、本開示は、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）及び／又は５－メチルシトシン（５ｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換する方法に関する。さらに、本開示は、試料中の５ｈｍＣ及び／又は５ｍＣを検出する方法にも関する。
Description
本発明は、核酸に基づく診断の分野に関する。より具体的には、本発明は、エピジェネティック修飾が生物学的及び臨床的意義を有し得る、核酸中のエピジェネティック修飾を検出する方法に関する。
エピジェネティック修飾、特にＤＮＡメチル化は、発生及び病理学的過程において役割を果たす。メチル化を検出することは、核酸中の修飾シトシン塩基（メチル及びヒドロキシメチルシトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ））を検出することを含む。最近まで、メチル化を検出するためのゴールドスタンダードは、ＤＮＡをバイサルファイトで処置することを含んでいた。この処置は、非メチル化シトシン（Ｃ）をウラシル（Ｕ）に変換するが、メチル化シトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）は無傷のままである。次いで、ＣからＵへの変化を、例えば核酸配列決定によって検出することができる。残念ながら、バイサルファイト処置は、試料ＤＮＡの大部分の分解をもたらす。メチル化シトシンを検出するための代替のそれほど過酷でない方法としては、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼによる酵素処置及び酸化生成物のいずれか１つの検出が挙げられる。ＴＡＰＳ（ＴＥＴ支援ピリジン－ボランシーケンシング）と呼ばれる特定の方法の１つは、ＴＥＴ及び共触媒（例えば、Ｆｅ（ＩＩ）イオン及びアルファ－ケトグルタル酸）を用いた核酸中のメチル化シトシンの酸化、及びボラン誘導体を用いた酸化生成物の処置を含み、ジヒドロウラシル（ＤＨＵ）を形成し、これは配列決定中にＴとして読み取られる（Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｆｒｅｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，４２４－４２９を参照）。他の方法もＴＥＴを利用するが、ボラン還元の代替物を提供する。
一例では、酸化生成物をマロノニトリルと反応させて、配列決定中にＴとも読み取られる付加物を形成することができる（Ｚｈｕ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ５－Ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ＥＳＣｓ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０：７２０－７３１．ｅ５を参照）。マロノニトリルは、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）と排他的に反応する。５ｆＣを検出する別の方法としては、有機溶媒中でウィティッヒ試薬を用い、紫外光を照射する方法がある。反応の生成物は、国際公開第２０２０１５５７４２号に記載されているような蛍光認識技術を使用して検出される。
残念なことに、より新しい方法は、臨床検査室で広く採用され得る前に障害に直面し、ＴＡＰＳ及びマロノニトリル法における化学反応は、高温（７０℃）を必要とするか、又は完了するのに数日かかる。臨床検査室で展開することができる迅速かつ便利なメチル化検出アッセイが必要とされている。
残念ながら、現在使用されている酸化方法（Ｆｅ（ＩＩ）イオン及びアルファ－ケトグルタル酸の存在下でのＴＥＴ等）は、５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）と５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）の混合物を生じる。シトシンメチル化の正確な塩基レベル検出を可能にするために、メチル化シトシンを選択的に酸化し、下流検出手順のために優先的又は排他的に５ｆＣを形成する酵素的方法が必要とされている。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）反応スキームに従って、５ｆＣを含む核酸を含有する試料を、核酸中の５ｆＣと反応して付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）の化合物を含む組成物と接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している、インキュベートすることと、（ｉｉｉ）反応混合物からの核酸を配列決定して試験配列を得ることであって、付加物が配列決定中にチミン（Ｔ）として読み取られる、配試験配列を得ることと、（ｉｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｆＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、Ｒ１は、シアノ基（ＣＮ）である。いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物を含む組成物は、有機酸部分を含む。いくつかの実施形態では、有機酸は、式Ｒ－ＣＯＯＨを有し、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、及びＣ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニルから選択される。いくつかの実施形態では、有機酸は酢酸である。いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物を含む組成物は、非水性溶媒中に存在する。いくつかの実施形態では、非水溶媒は、式Ｒ－ＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、非水性溶媒は、１０～１００％、例えば９０～１００％のメタノール又はエタノールである。いくつかの実施形態では、反応混合物は、式ＲｘＮＨｙ（式中、ｘ及びｙは０、１、２又は３であるため、ｘ＋ｙ＝３であり、各Ｒは独立して、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される）の化合物を更に含む。いくつかの実施形態では、ＲｘＮＨｙ はトリエタノールアミンである。いくつかの実施形態では、反応混合物は１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の配列決定の前に、例えば、付加物の反対側にアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを用いて核酸を増幅する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）における配列決定は、例えばナノポアを用いる合成による配列決定（ＳＢＳ）法によるものである。
いくつかの実施形態では、５ｆＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、ｐＨ７～８で、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び５～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む組成物と接触させることによって得られる。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ８の１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び５～１０μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ７の１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び８０～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｅ（ＩＩ）イオンは、試料をＦｅＳＯ４、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ、及びＦｅＣｌ２から選択される化合物と接触させることによって生成される。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸、アルファ－ケトグルタル酸及び還元剤の１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、５ｆＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、Ｃｕ（ＩＩ）化合物及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）を含む組成物と接触させることによって得られる。いくつかの実施形態では、５ｆＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、ルテニウム酸カリウム（Ｋ２ＲｕＯ４）及び過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）から選択されるカリウムルテニウム塩と接触させることによって得られる。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシン（Ｃ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸を含有する試料を、核酸中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができる１０－１１の転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び核酸中の５ｆＣと反応して反応して反応スキームによる付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）の化合物を含む組成物と接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している、インキュベートすることと、（ｉｉｉ）反応混合物からの核酸を配列決定して試験配列を得ることであって、付加物が配列決定中にチミン（Ｔ）として読み取られる、配試験配列を得ることと、（ｉｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、工程（ｉ）で添加される組成物は、式Ｒ－ＯＨ（式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）を有する非水性溶媒を含み、反応混合物中の溶媒の濃度は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、工程（ｉ）で添加される組成物は、反応混合物中に少なくとも９０％の濃度でエタノール又はメタノールを含有し、トリエタノールアミンを更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）アダプターを、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸にライゲートすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、ライゲートすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができる１０－１１の転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、
（ｉｉｉ）反応スキームに従って、反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）の化合物と接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｖ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している、インキュベートすることと、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが増幅中にチミン（Ｔ）として付加物を読み取る、増幅することと、（ｖｉ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、工程（ｉ）で添加される組成物は、式Ｒ－ＯＨ（式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）を有する非水性溶媒を含み、反応混合物中の溶媒の濃度は少なくとも９０％である。いくつかの実施形態では、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、工程（ｉ）で添加される組成物は、反応混合物中に少なくとも９０％の濃度でエタノール又はメタノールを含有し、トリエタノールアミンを更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、３時間未満で核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を検出するためのキットであって、マロノニトリルのエタノール溶液を含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、核酸配列決定試薬、核酸増幅試薬、核酸精製試薬、酢酸の溶液、トリエタノールアミンの溶液、並びに有機酸及びアルキルアミンの存在下で、核酸中の５ｆＣをマロノニトリルと反応させる際の説明書のうちの１つ以上を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、３時間未満で核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出するためのキットであって、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ酵素、マロノニトリルのエタノール溶液を含み、核酸精製、増幅及び配列決定のための試薬を更に含むキットである。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）５ｆＣ及び／又は５ｃａＣを含む核酸を含有する試料を、ボラン誘導体を含む組成物と接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣ及び５ｃａＣの少なくとも９０％がジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に還元されている、インキュベートすることと、
（ｉｉｉ）反応混合物からの核酸を配列決定して、配列決定中にＤＨＵがチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列を得ることと、（ｉｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｆＣ又は５ｃａＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、ボラン誘導体はピコリンボランである。いくつかの実施形態では、反応混合物は、有機酸部分を含有する。いくつかの実施形態では、有機酸は、式Ｒ－ＣＯＯＨを有し、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、及びＣ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニルから選択される。いくつかの実施形態では、有機酸は酢酸である。いくつかの実施形態では、ボラン誘導体は、非水性溶媒中に存在する。いくつかの実施形態では、非水溶媒は、式Ｒ－ＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、非水性溶媒はメタノール又はエタノールである。いくつかの実施形態では、反応混合物は１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）の配列決定の前に、例えば、ＤＨＵの反対側にアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを用いて核酸を増幅する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）における配列決定は、例えばナノポアを用いる合成による配列決定（ＳＢＳ）法によるものである。いくつかの実施形態では、５ｆＣ及び／又は５ｃａＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、ｐＨ７～８で、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び５～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む組成物と接触させることによって得られる。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ８の１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び５～１０μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ｐＨ７の１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び８０～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｅ（ＩＩ）イオンは、試料をＦｅＳＯ４、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２、ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ、（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ、及びＦｅＣｌ２から選択される化合物と接触させることによって生成される。いくつかの実施形態では、組成物は、アスコルビン酸、アルファ－ケトグルタル酸及び還元剤の１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、５ｆＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、Ｃｕ（ＩＩ）化合物及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）を含む組成物と接触させることによって得られる。いくつかの実施形態では、５ｆＣを含む核酸は、メチル化シトシンを含む核酸を、ルテニウム酸カリウム（Ｋ２ＲｕＯ４）及び過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）から選択されるカリウムルテニウム塩と接触させることによって得られる。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシン（Ｃ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸を含む試料を、非水性溶媒中において、核酸中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）及びボラン誘導体に変換することができる１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼを含む組成物と接触させることによって反応混合物を形成することと、
（ｉｉ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣ及び５ｃａＣの少なくとも９０％がジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に還元されている、インキュベートすることと、（ｉｉｉ）反応混合物からの核酸を配列決定して、配列決定中にＤＨＵがチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列を得ることと、（ｉｖ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、ボラン誘導体は、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムから選択され、非水性溶媒はメタノール及びメタノールから選択され、反応混合物は酢酸を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）アダプターを、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸にライゲートすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、ライゲートすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）に変換することができる１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を非水性溶媒中でボラン誘導体と接触させることと、（ｉｖ）反応混合物を３時間未満インキュベートするスことであって、５ｆＣ及び５ｃａＣの少なくとも９０％がジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に還元されている、インキュベートすることと、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して、適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが、増幅中にチミン（Ｔ）としてＤＨＵを読み取る、増幅することと、（ｖｉ）増幅された核酸を配列決定して、試験配列を得ることと、（ｖｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、ボラン誘導体は、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムから選択され、非水性溶媒はメタノール及びメタノールから選択され、反応混合物は酢酸を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）を３時間未満で検出するためのキットであって、エタノール溶液中のボラン誘導体を含むキットである。いくつかの実施形態では、ボラン誘導体は、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムから選択される。いくつかの実施形態では、キットは、核酸配列決定試薬、核酸増幅試薬、核酸精製試薬、酢酸の溶液、並びに核酸中の５ｆＣ及び５ｃａＣを有機酸の存在下でボラン化合物と反応させる際の説明書のうちの１つ以上を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、３時間未満で核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出するためのキットであって、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ酵素、ボラン誘導体のエタノール溶液を含み、核酸精製、増幅及び配列決定のための試薬を更に含むキットである。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）ヌクレオチドを検出する単一チューブ法であって、（ｉ）５ｆＣを含む核酸を含有する試料を、溶液中の１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼを含む組成物と、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）の化合物と接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉ）反応混合物をインキュベートして付加物を形成することと、
（ｉｉｉ）反応混合物からの核酸を配列決定して、配列決定中に付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列を得ることと、（ｉｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｆＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物はマロノニトリルである。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の核酸の起源の組織を検出する方法であって、本明細書に開示される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの組織の既知のメチル化パターンと比較することと、試料中の核酸の起源の組織を同定することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、移植レシピエントにおける臓器移植拒絶を検出する方法であって、無細胞核酸を含有する血液試料を移植レシピエントから得ることと、本明細書に開示される方法によって無細胞核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの器官の既知のメチル化パターンと比較することと、移植された器官特異的メチル化パターンを有する無細胞核酸が試料において検出される場合に移植拒絶を検出することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、本明細書に開示されるメチル化シトシンの存在及び位置を検出し、移植された器官特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって移植拒絶をモニタリングする方法であり、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は、臓器移植拒絶を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者における癌性腫瘍の存在についてスクリーニングする方法であって、無細胞核酸を含有する血液試料を患者から得ることと、本明細書に開示される方法によって無細胞核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンを、腫瘍及び非腫瘍組織の既知のメチル化パターンと比較し、腫瘍特異的メチル化パターンが検出された場合、腫瘍の存在を検出することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍体積をモニタリングする方法であって、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングすることと、本明細書に開示される方法によってメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、腫瘍特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することとを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍増殖を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍縮小を示す方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングすることと、本明細書に開示される方法によってメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、腫瘍特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することとを含む方法によって患者の癌の処置の有効性を監視する方法であり、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は治療が無効であることを示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は治療の有効性を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、癌患者における診断又は微小残存病変（ＭＲＤ）の方法であって、無細胞核酸を含む血液試料を患者から得ることと、本明細書に開示される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの組織の既知のメチル化パターンと比較することと、試料中の核酸の起源の組織を同定することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の自己免疫疾患を診断する方法であって、無細胞核酸を含む血液試料を患者から得ることと、本明細書に開示される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンを免疫疾患によって損傷された組織の既知のメチル化パターンと比較することと、そのようなメチル化パターンが見出される場合、免疫疾患を診断することと、を含む方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、反応混合物をＴＥＴジオキシゲナーゼと接触させる前に、核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）がＴＥＴと反応するのを化学的に遮断されることを更に含む、本明細書に開示されるメチル化シトシンの存在及び位置を検出する方法である。いくつかの実施形態では、５ｈｍＣは、反応混合物をグルコシルトランスフェラーゼ及びグルコース部分と接触させることによって遮断される。いくつかの実施形態では、反応混合物をβ－グルコシルトランスフェラーゼ及びＵＤＰグルコースと接触させる。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸を含有する反応混合物をラッカーゼと接触させることを含む、核酸中に５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を形成する方法である。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）から選択される種から単離される。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）ＭＴＣＣ－１４１、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）ＭＴＣＣ－１８０１、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＭＴＣＣ－１１００、及びカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）ＭＴＣＣ－１１７１から選択される株から単離される。いくつかの実施形態では、反応混合物は、補因子、例えば、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）、アセトシリンゴン、シリンガアルデヒド、パラクマル酸２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホネート（ＡＢＴＳ）、ビオルル酸（ＶＬＡ）、Ｎ－アセチル－Ｎ－フェニルヒドロキシルアミン（ＮＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）及びＮ－ヒドロキシフタルイミド（ＨＰＩ）を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する方法であって、５ｈｍＣを含む核酸を含む試料を、５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に酸化するのに適した条件下でラッカーゼと接触させる工程、試料を、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ１～Ｃ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ１～Ｃ６アルキル一置換及びＣ１～Ｃ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、５ｆＣ付加物を形成するのに適した条件下で、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゼン化５員又は６員ヘテロアリールから選択される）の化合物を含む組成物と、接触させる工程、反応混合物からの核酸を配列決定して、試験配列を得る工程であって、配列決定中に付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる、反応混合物からの核酸を配列決定して、試験配列を得る工程、及び試験配列を参照配列と比較する工程であって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｈｍＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較する工程、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、アルキル置換は、Ｏ又はＮのようなヘテロ原子、例えば－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－ＣＨ３を含み得る。いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物はマロノニトリルである。あるいは、ウィティッヒ試薬を用いて同じ変換を行うことができる。次いで、Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮは、Ｐｈ３Ｐ＝Ｃ（Ｒ２）ＣＮで置き換えられ、式中、Ｒ２は、水素、シアノ、ハロゲン、アルキル及びＯ、Ｎ、ハロゲン、Ｐ、Ｓ又はＳｉを含有するアルキルのうちの１つである。これは国際公開第２０２０／１５５７４２号に開示されている。
反応は以下の通りである：
反応は以下の通りである：
以下では、上記で開示されたＲ１－ＣＨ２－ＣＮ及びウィティッヒ試薬は、ポリメラーゼ基質として機能するときにシトシンをチミン等価物に変換することができるため、「ｆＣ変換試薬」と定義される。
さらに、以下では、Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ及びウィティッヒ試薬と５－ホルミル－シトシン（５ｆＣ）との反応生成物を、ポリメラーゼ基質として働く場合にチミン等価物として作用する「５ｆＣ付加物」又は「付加物」と定義する。
さらに、以下では、Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ及びウィティッヒ試薬と５－ホルミル－シトシン（５ｆＣ）との反応生成物を、ポリメラーゼ基質として働く場合にチミン等価物として作用する「５ｆＣ付加物」又は「付加物」と定義する。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、有機酸、非水溶媒及び式ＲｘＮＨｙ（式中、ｘ及びｙは、ｘ＋ｙ＝３となるような０、１、２又は３であり、各Ｒは、Ｏ及びＮ等のヘテロ原子を含み得るＯ及びＮなどのヘテロ原子を含みうるＣ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ６～Ｃ１０－アリール、又は５若しくは６員ヘテロアリールから独立して選択される）の化合物の１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、有機酸は酢酸であり、非水性溶媒はエタノール又はメタノールであり、式ＲｘＮＨｙの化合物はトリエタノールアミン又はピペリジンである。他の実施形態では、化合物は緩衝剤、例えば酢酸アンモニウム又はＴｒｉｓである。いくつかの実施形態では、非水性溶媒は、１０～１００％、例えば９０～１００％の濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、反応混合物は１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、配列決定の前に、チミン等価物とは反対のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを用いて核酸を増幅する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシン（Ｃ）を検出する方法であって、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸を含有する試料を、５ｍＣを５ｈｍＣに変換することができる１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ及び５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができるラッカーゼと接触させることと、試料を、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ１～Ｃ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ１～Ｃ６アルキル一置換及びＣ１～Ｃ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゼン化５員又は６員ヘテロアリールから選択される）の化合物と接触させることと、試料からの核酸を配列決定して、配列決定中に付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列を得る、配列決定することと、試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物はマロノニトリルである。いくつかの実施形態では、反応混合物は、有機酸、非水溶媒及び式ＲｘＮＨｙ（式中、ｘ及びｙはｘ＋ｙ＝３となるような０、１、２又は３であり、各Ｒは、Ｏ及びＮ等のヘテロ原子を含み得るＣ１～Ｃ６、Ｃ６～Ｃ１０－アリール、又は５若しくは６員ヘテロアリールから独立して選択される）の化合物の１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、有機酸は酢酸であり、非水性溶媒はエタノール又はメタノールであり、式ＲｘＮＨｙの化合物はトリエタノールアミン又はピペリジンである。いくつかの実施形態では、非水性溶媒は、１０～１００％、例えば９０～１００％の濃度で反応混合物中に存在する。いくつかの実施形態では、反応混合物は１時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、配列決定の前に、付加物とは反対のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを用いて核酸を増幅する。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ及びラッカーゼは、同じ反応混合物中で活性である。他の実施形態では、ＴＥＴ及びラッカーゼは同じ反応混合物中で活性ではなく、試料に連続的に添加される。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する方法であって、５ｈｍＣを含む核酸を含む試料を、５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に酸化するのに適した条件下でラッカーゼと接触させる工程、試料をウィティッヒ試薬と接触させる工程、試料に紫外光を照射して生成物を形成する工程、反応混合物からの核酸を配列決定して、試験配列を得る工程であって、配列決定中に生成物がチミン（Ｔ）として読み取られる、反応混合物からの核酸を配列決定して、試験配列を得る工程、及び試験配列を参照配列と比較する工程であって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移は、核酸中の５ｈｍＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較する工程、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、５ｆＣ変換試薬は、式Ｐｈ３Ｐ＝Ｃ（Ｒ２）ＣＮの化合物である。いくつかの実施形態では、化合物は、Ｐｈ３Ｐ＝Ｃ（ＣＮ）２（Ｒ２＝－ＣＮ）である。
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも１つの５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸を含む反応混合物を、キシレンモノオキシゲナーゼ、トルエンメチルモノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１５．２６）、Ｐ４５０モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１４．１）、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼから選択される酵素と接触させることを含む、核酸中で５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を形成する方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、ラッカーゼを含む核酸中のメチル化シトシンを検出するためのキットである。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）から選択される種から単離される。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）ＭＴＣＣ－１４１、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）ＭＴＣＣ－１８０１、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＭＴＣＣ－１１００、及びカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）ＭＴＣＣ－１１７１から選択される株から単離される。いくつかの実施形態では、キットは、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）、アセトシリンゴン、シリンガアルデヒド、パラクマル酸２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホネート（ＡＢＴＳ）、ビオルル酸（ＶＬＡ）、Ｎ－アセチル－Ｎ－フェニルヒドロキシルアミン（ＮＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）、及びＮ－ヒドロキシフタルイミド（ＨＰＩ）から選択されるラッカーゼ補因子を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸配列決定試薬、核酸増幅試薬、及び核酸精製試薬のうちの１つ以上を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、１０－１１の転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ酵素を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ及びラッカーゼは、同じチューブ内に存在する。いくつかの実施形態では、キットは、マロノニトリルのエタノール溶液を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは酢酸の溶液を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、トリエタノールアミンの溶液を更に含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、５ｍＣを５ｈｍＣ及び／又は５ｆＣに変換することができる酵素であって、キシレンモノオキシゲナーゼ、トルエンメチルモノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１５．２６）及びＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１４．１）から選択される酵素を含む、核酸中のメチル化シトシンを検出するためのキットである。いくつかの実施形態では、本発明は、５ｈｍＣを５ｆＣに変換することができる酵素であって、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼから選択される酵素を含む、核酸中のメチル化シトシンを検出するためのキットである。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のヒドロキシメチル化シトシン（５ｈｍＣ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）アダプターを、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を含む核酸にライゲートすることであって、アダプターが、増幅プライマー結合部位を含む、ライゲートすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができるラッカーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物をマロノニトリルと接触させて、５ｆＣ付加物を形成することと、（ｉｖ）増幅中にＤＮＡポリメラーゼがチミン（Ｔ）として５ｆＣ付加物を読み取る、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して工程（ｉｉｉ）からの核酸を増幅することと、（ｖ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のヒドロキシメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシン（５ｍＣ）ヌクレオチドを検出する方法であって、（ｉ）アダプターを、５－メチルシトシン（５ｍＣ）を含む核酸にライゲートすることであって、アダプターが、増幅プライマー結合部位を含む、ライゲートすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｍＣを５ｈｍＣに変化することができるＴＥＴ酵素及び核酸中の５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができるラッカーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物をマロノニトリルと接触させて、５ｆＣ付加物を形成することと、（ｉｖ）増幅中にＤＮＡポリメラーゼがチミン（Ｔ）として５ｆＣ付加物を読み取る、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して工程（ｉｉｉ）からの核酸を増幅することと、（ｖ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中のメチル化シトシンの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の核酸の起源の組織を検出する方法であって、本明細書に開示される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの組織の既知のメチル化パターンと比較することと、試料中の核酸の起源の組織を同定することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、移植レシピエントにおける臓器移植拒絶を検出する方法であって、無細胞核酸を含有する血液試料を移植レシピエントから得ることと、本明細書に記載される方法によって無細胞核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの器官の既知のメチル化パターンと比較することと、移植された器官特異的メチル化パターンを有する無細胞核酸が試料において検出される場合に移植拒絶を検出することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、本明細書に記載される方法に従ってメチル化シトシンの存在及び位置を検出し、移植された器官特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって移植拒絶をモニタリングする方法であり、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は、臓器移植拒絶を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者における癌性腫瘍の存在についてスクリーニングする方法であって、無細胞核酸を含有する血液試料を患者から得ることと、本明細書に記載される方法によって無細胞核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンを、腫瘍及び非腫瘍組織の既知のメチル化パターンと比較し、腫瘍特異的メチル化パターンが検出された場合、腫瘍の存在を検出することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の腫瘍体積をモニタリングする方法であって、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングすることと、本明細書に記載される方法に従ってメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、腫瘍特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することとを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍増殖を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍縮小を示す方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングすることと、本明細書に記載される方法に従ってメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、腫瘍特異的メチル化パターンを有する無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することとを含む方法によって患者の癌の処置の有効性を監視する方法であり、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は治療が無効であることを示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は治療の有効性を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、癌患者における診断又は微小残存病変（ＭＲＤ）の方法であって、無細胞核酸を含む血液試料を患者から得ることと、本明細書に記載される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンをいくつかの組織の既知のメチル化パターンと比較することと、試料中の核酸の起源の組織を同定することとを含む、方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者の自己免疫疾患を診断する方法であって、無細胞核酸を含む血液試料を患者から得ることと、本明細書に記載される方法によって核酸中のメチル化シトシンの存在及び位置を検出することと、メチル化パターンを免疫疾患によって損傷された組織の既知のメチル化パターンと比較することと、そのようなメチル化パターンが見出される場合、免疫疾患を診断することと、を含む方法である。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を５－メチルシトシン（５ｍＣ）と区別する方法であって、試料を２つのアリコートに分離することと、第１のアリコートにおいて、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む核酸を、５ｈｍＣ及び５ｍＣが５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換される条件下で、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼと接触させることと、第２のアリコートにおいて、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む核酸を、５ｈｍＣが５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換される条件下でラッカーゼと接触させることと、両方のアリコートを、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ１～Ｃ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ１～Ｃ６アルキル一置換及びＣ１～Ｃ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゼン化５員又は６員ヘテロアリールから選択される）の化合物と別々に接触させることと、両方のアリコートからの核酸を別々に配列決定して、配列決定中に付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる第１及び第２の試験配列を得ることと、第１の試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｈｍＣ及び５ｍＣの存在を示す、第１の試験配列を参照配列と比較すること、第２の試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｈｍＣの存在を示す、第２の試験配列を参照配列と比較することと、第１の試験配列を第２の試験配列と比較することであって、第１の試験配列のそのようなシトシンのみが、第２の試験配列においてヒドロキシメチル化シトシン（５ｈｍＣ）として検出されない５ｍＣである、第１の試験配列を第２の試験配列と比較することと、を含む、方法である。あるいは、両方のアリコートを別々にウィティッヒ試薬と接触させることが可能である。
略語
本開示を通して使用されるいくつかの略語を以下に列挙する。
Ｃ－シトシン
Ｔ－チミン
Ｕ－ウラシル
ＤＨＵ－ジヒドロウラシル
５ｍＣ－５－メチルシトシン
５ｈｍＣ－５－ヒドロキシメチルシトシン
５ｇｈｍＣ－５－グルコシル－ヒドロキシメチルシトシン
５ｆＣ－５－ホルミルシトシン
５ｃａＣ－５－カルボキシシトシン
ＴＥＴ－１０－１１転座ジオキシゲナーゼ
ＴＡＰＳ－ＴＥＴ支援ｐｉｃ－ボランシーケンシング（ＴＥＴ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｐｉｃ－ｂｏｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ＣＡＰＳ－化学支援ｐｉｃ－ボランシーケンシング（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｐｉｃ－ｂｏｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ｏｘＢＳ又はｏｘＢＳ－Ｓｅｑ－酸化的バイサルファイトシーケンシング
本開示を通して使用されるいくつかの略語を以下に列挙する。
Ｃ－シトシン
Ｔ－チミン
Ｕ－ウラシル
ＤＨＵ－ジヒドロウラシル
５ｍＣ－５－メチルシトシン
５ｈｍＣ－５－ヒドロキシメチルシトシン
５ｇｈｍＣ－５－グルコシル－ヒドロキシメチルシトシン
５ｆＣ－５－ホルミルシトシン
５ｃａＣ－５－カルボキシシトシン
ＴＥＴ－１０－１１転座ジオキシゲナーゼ
ＴＡＰＳ－ＴＥＴ支援ｐｉｃ－ボランシーケンシング（ＴＥＴ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｐｉｃ－ｂｏｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ＣＡＰＳ－化学支援ｐｉｃ－ボランシーケンシング（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｐｉｃ－ｂｏｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
ｏｘＢＳ又はｏｘＢＳ－Ｓｅｑ－酸化的バイサルファイトシーケンシング
５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）は、腫瘍学、出生前検査及び他の分野における多くの臨床応用を有する重要なエピジェネティックバイオマーカーである。最近まで、メチル化の塩基レベル検出は、非メチル化シトシンをバイサルファイトと反応させ、続いてＰＣＲ、アレイハイブリダイゼーション又は配列決定を行うことによって達成されていた。非メチル化シトシン（Ｃ）は、バイサルファイトと反応した後にチミン（Ｔ）として読み取られ、一方、メチル化シトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）はＣとして読み取られる。残念ながら、バイサルファイト処置は、試料核酸の大部分の分解をもたらし、高感度を必要とする用途には適さない。例えば、無細胞ＤＮＡ等の無細胞核酸を分析する最新の用途には不向きである。
近年、メチル化シトシンを検出するためのそれほど過酷でない方法が開示されている。最新の方法は、バイサルファイト処置（Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｆｒｅｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，４２４－４２９）の場合のように、非メチル化シトシンの代わりにメチル化シトシンの修飾を伴う。５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を介したメチルシトシン（５ｍＣ）のホルミルシトシン（５ｆＣ）及びカルボキシルシトシン（５ｃａＣ）への段階的酸化は、Ｆｅ（ＩＩ）イオン及びアルファ－ケトグルタル酸の存在下で、１０－１１転座ジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）を使用して実施される。
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．は、ボラン誘導体（ピリジンボラン、ピコリンボラン等）を使用して５ｆＣ（及び５ｃａＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に還元することを更に記載した。その後、ＤＨＵは、その後の増幅及び配列決定においてＴとしてウラシル耐性核酸ポリメラーゼによって読み取られる。その結果、メチル化されたＣはＴと読み取られるが、メチル化されていないＣは変化しない。ＴＡＰＳ（ＴＥＴ支援ピコリン－ボランシーケンシング）と呼ばれるこのＴＥＴ及びピコリン－ボランに基づく方法は、バイサルファイト処置ほどＤＮＡ分解を引き起こさず、バックグラウンドを差し引いてシグナルを得る代わりにシグナルを直接検出することを可能にする。両方の利点は、より高いアラインメント速度、場合によってはより低いシーケンシング深度を可能にし、試料からより高い分子多様性を回収する。
ＣＡＰＳ（化学的支援ピコリン－ボランシーケンシング）と呼ばれる別の技術は、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）を使用した５ｈｍＣから５ｆＣへの選択的変換を含む。ＴＥＴの化学的代替物としてのＫＲｕＯ４の使用は、酸化的バイサルファイトシーケンシング（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又はｏｘＢＳ－ｓｅｑと呼ばれる技術から知られている（Ｂｏｏｔｈ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １２ Ｍａｙ：９３４－９３７を参照）。過ルテニウム酸カリウム変換によって得られた５ｆＣは、例えばボラン処置又は任意の他の下流の方法による更なる処置のための好ましい標的となる。
更に別の配列決定技術は、ボランによる５ｆＣの減少の代替である。この方法は、Ｔとして認識される５ｆＣの付加物を形成することを含む。付加物は、マロノニトリルを使用して形成される（Ｚｈｕ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ５－Ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ＥＳＣｓ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０：７２０－７３１．ｅ５を参照）。
Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．のＴＡＰＳ、ＣＡＰＳ及びマロノニトリル法は、過酷な化学処置及び結果として生じる試料核酸の損失を回避するという点で、バイサルファイト法よりも優れている。しかしながら、より新しい方法は、完了するのに非常に長い時間がかかるか、又は高温を必要とするという欠点を有する。ＴＡＰＳのボラン反応のために７０℃で３時間又は３７℃で１６時間（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．３７，ｐａｇｅｓ ４２４－４２９（２０１９）又は１～２日でマロノニトリル付加物を形成した（米国特許第１０，５１９，１８４号及び米国特許出願公開第２０２００１６５６６１号を参照）。本開示は、核酸中のシトシンメチル化を検出する改良されたより実用的な方法を含む。
本発明の様々な態様を以下で更に詳細に説明する。
いくつかの実施形態では、本発明は、エピジェネティック修飾、具体的には、核酸中のシトシンメチル化を検出する方法である。核酸中のメチル化シトシンを検出する技術水準の方法は、以下の重要な工程を含む：１）メチル化シトシンの酸化工程、２）配列決定中にチミン（Ｔ）として読み取ることができる形態への酸化生成物の還元工程、３）核酸を配列決定する工程、４）配列リード中のシトシン（Ｔ）からチミン（Ｔ）への変化がメチル化シトシンの存在を示した、処置下配列及び未処置配列を比較する工程。本発明は、上記の一般的なスキームに対するいくつかの有用な改良を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、改良された１）メチル化シトシンを酸化する工程、及び技術水準に従って実施される工程２）～４）を含む方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、改良された２）酸化生成物の還元工程、並びに技術水準に従って実施される工程１）、３）及び４）を含む方法である。いくつかの実施形態では、本発明は、改良された１）メチル化シトシンを酸化する工程、改良された２）酸化された生成物の還元工程、並びに技術水準に従って実施される工程３）及び工程４）を含む方法である。
本発明は、試料からの核酸を操作する方法を含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象又は患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、生検によって、対象又は患者に由来する固形組織又は固形腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、核酸を含み得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液若しくは血液分画、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、又は糞便試料）を含み得る。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、核酸を単離し得る細胞及び流体を含有する組織培養物である。いくつかの実施形態では、試料中の目的の核酸は、ウイルス、細菌、原虫又は真菌等の感染病原体に由来する。
本発明は、試料から単離又は抽出された、単離された核酸を操作することを含む。核酸抽出の方法は、当技術分野で周知である。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” １９８９，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい）。生物学的試料から核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出するための様々なキット（例えば、ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン））、並びにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州マディソン）；Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）；及びＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）から他の同様の製品等が市販されている。
いくつかの実施形態では、例えば国際公開第２０１９０９２２６９号及び国際公開第２０２００７４７４２号に記載されているように、核酸が抽出され、サイズによって分離され、任意に、エピタコフォレーシスによって濃縮される。
本発明は、核酸中のエピジェネティック修飾を検出することを含む。条件付きエピジェネティック修飾を受ける核酸配列は、本明細書に開示される方法によって分析される標的配列である。同じ核酸配列は、５位（５ｍＣ又は５ｈｍＣ）のシトシンのメチル化を特徴とするエピジェネティック修飾を有してもよく、又は有しなくてもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸のセット又はパネルは、メチル化の存在についてプローブされる。例えば、Ｐａｔａｉ ＡＶ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｎ－Ｇｅｎｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ａｄｅｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ １０（８）：ｅ０１３３８３６、及びＯｎｗｕｋａ，Ｊ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍａｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０，６９２に示され、メチル化バイオマーカーのパネルにおけるバイオマーカーのメチル化は、患者における結腸直腸癌の存在を示す。したがって、予後診断又は診断目的のためのメチル化バイオマーカーの任意の既知の又は将来のパネルの試験が、本明細書に開示される方法によって想定される。
いくつかの実施形態では、生物のゲノム全体がメチル化の存在についてプローブされる。本発明の方法は、例えば、Ｓｈｕｌｌ ＡＹ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３８：６２７－５に記載される配列分析及び人工知能ツールを使用して、疾患若しくは症状を診断するため、又は疾患若しくは症状に対する素因を診断するため、生物のゲノム全体の全ての部位におけるメチル化を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを別々に検出又は区別することが望ましい。この実施形態では、５ｈｍＣは酸化から遮断され、配列決定中にＴとして読み取られる化合物に変換されない。ブロッキングプロセスは、５ｍＣではなく５ｈｍＣに存在する反応性ヒドロキシル基を利用する。いくつかの実施形態では、５ｈｍＣに付加されるブロッキング基は糖部分である。いくつかの実施形態では、糖部分は、修飾又は非修飾グルコース部分であり、５－グルコシル－ヒドロキシメチルシトシン（５ｇｈｍＣ）が形成される。５ｇｈｍＣは、５ｆＣ及び５ｈｍＣについて公知のスキームによるボラン誘導体との付加物形成又は還元を受けない。いくつかの実施形態では、ブロッキング基の付加は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、グルコシルトランスフェラーゼ）によって触媒される。いくつかの実施形態では、核酸中の５ｈｍＣを、ベータ－グルコシルトランスフェラーゼの存在下で修飾グルコースと反応させる。いくつかの実施形態では、修飾グルコースはＵＤＰ－グルコースであり、触媒はバクテリオファージＴ４ベータ－グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４ ＢＧＴ）である。
いくつかの実施形態では、方法は、下流検出のためにメチル化シトシンを酸化する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、５－メチルシトシン（５ｍＣ）及び／又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）若しくは５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）又は５ｆＣと５ｃａＣとの混合物に変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、試料又は反応混合物を、例えば米国特許第９，１１５，３８６号又は米国特許出願公開第２０２００３７０１１４号に記載される、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ酵素は、ＴＥＴ１、ＴＥＴ２、ＴＥＴ３及び関連タンパク質ＣＸＸＣ４から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＥＴは、マウスＴＥＴ１、ＴＥＴ２若しくはＴＥＴ３（ｍＴＥＴ１、２又は３）、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２若しくはＴＥＴ３（ｈＴＥＴ１、２又は３）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（ＣｃＴＥＴ）、又は類似若しくは同等の酵素活性を有する任意の他の類似体若しくは同等物から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｆＣに変換する工程を利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｃａＣに変換する工程を利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｆＣと５ｃａＣの混合物に変換する工程を利用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、Ｆｅ（ＩＩ）イオンの存在下で試料をＴＥＴと接触させることによって、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｆＣに変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、適切な供給源又はＦｅ（ＩＩ）イオンは、ＦｅＳＯ４，（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２，ＦｅＳＯ４７Ｈ２Ｏ，（ＮＨ４）２Ｆｅ（ＳＯ４）２６Ｈ２Ｏ，ＦｅＣｌ２及び同様の例から選択される。いくつかの実施形態では、本発明は、試料をＴＥＴ及び５～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンとｐＨ７～８で接触させることによって、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｆＣに変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、ｐＨ８でのＴＥＴ及び５～１０μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンとのインキュベーションによって、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｆＣに変換する工程を利用する。いくつかの実施形態では、本発明は、ｐＨ７でのＴＥＴ及び８０～１００μＭのＦｅ（ＩＩ）イオンとのインキュベーションによって、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを５ｆＣに変換する工程を利用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、アスコルビン酸、アルファ－ケトグルタル酸及び還元剤の存在下で試料をＴＥＴ及びＦｅ（ＩＩ）イオンと接触させることによって、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｆＣに変換する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料をＣｕ（ＩＩ）化合物及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）と接触させることによって、試料中の５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｆＣに変換する工程を利用する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）ヌクレオチドを検出することによって核酸中のメチル化シトシンを検出する改良された工程を含み、５ｆＣは、本明細書において上記で記載される方法の１つによって形成される。この方法は、５ｆＣを含む核酸を含有する試料を、改良された溶媒組成物中の式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリールから選択される）の化合物を含む改良された組成物と接触させることを含み、化合物は、反応スキームに従って核酸中の５ｆＣと反応して付加物を形成することができる。上記反応の反応物は、例えば、米国特許第１０，５１９，１８４号及びＹｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２０２００１６５６６１号に記載される。例えば、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、反応物はマロノニトリルである。
本発明は、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している３時間未満にわたって反応を進行させることを可能にすることによってＹｉ法を改良する反応混合物の改良された組成物を提供する。いくつかの実施形態では、反応は、１時間のみ進行し、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成する。対照的に、Ｙｉ反応は、２０時間以上から最大４８時間（米国特許出願公開第２０２００１６５６６１号の実施例を参照）を必要とする。
いくつかの実施形態では、先行技術に対する改良は、有機酸部分を含む溶液中で５ｆＣと式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物との間の反応を行うことを含む。有機酸は式Ｒ－ＣＯＯＨを有し、ＲはＣ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、反応は酢酸の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、反応中の有機酸の濃度は、１％～３０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である。
いくつかの実施形態では、先行技術に対する改良は、非水性溶媒中で５ｆＣと式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物との間の反応を行うことを含む。非水溶媒は、式Ｒ－ＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、反応は、メタノール又はエタノール中で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、１０％～１００％メタノール又はエタノール中で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、９０％以上のメタノール又はエタノール中で行われる。
いくつかの実施形態では、先行技術に対する改良は、式ＲｘＮＨｙの化合物を含む溶液中で５ｆＣと式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物との反応を行うことを含み、式中、ｘ及びｙはｘ＋ｙ＝３であるように０、１、２又は３ であり、各Ｒは独立して、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、式ＲｘＮＨｙ の化合物は、脂肪族又は芳香族基を有する第一級、第二級又は第三級アミンである。いくつかの実施形態では、反応はトリエタノールアミンの存在下で行われる。
いくつかの実施形態では、従来技術に対する改良は、ＴＥＴ酸化と同時に５ｆＣと式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物との間の反応を実施して、簡略化された１チューブのワークフローを可能にすることを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ及びマロノニトリルを同時に添加し、５ｆＣ及び５ｆＣ－マロノニトリル付加物形成への酸化を同じチューブで行う。
いくつかの実施形態では、本発明は、５－カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）及び５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を形成及び検出することによって核酸中のメチル化シトシンを検出する改良された工程を含み、５ｆＣ、５ｃａＣ又は５ｆＣと５ｃａＣの混合物は、本明細書に上記の方法の１つによって形成される。この方法は、５ｆＣ及び／又は５ｃａＣを含む核酸を含む試料を、改良された溶媒組成物中にボラン誘導体を含む改良された組成物と接触させることを含み、ボラン誘導体は、核酸中の５ｃａＣと、より低い効率で５ｆＣと反応してジヒドロウラシル（ＤＨＵ）を形成することができる。ボラン誘導体の例としては、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ボラン）、ピリジンボラン、ｔｅｒｔ－ブチルアミンボラン、エチレンジアミンボラン、及び国際公開第２０１９１３６４１３号（ＴＥＴ支援ピコリン－ボラン配列決定又はＴＡＰＳ）のＳｏｎｇ及びＬｉｕによって記載されているジメチルアミンボランが挙げられる。
本発明は、５ｃａＣのほぼ全てがＤＨＵに変換される３５℃で１時間未満反応を進行させることを可能にすることによってＴＡＰＳ法を改良する、ボラン含有反応混合物の改良された組成物を提供する。いくつかの実施形態では、反応は１／２時間のみ進行し、５ｃａＣのほぼ全てが変換される。対照的に、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，によって記載されたＴＡＰＳボラン反応は、７０℃又は１６時間及び３７℃で３時間以上を必要とする（国際公開第２０１９１３６４１３号、実施例：ボラン還元を参照）。
いくつかの実施形態では、先行技術に対する改良は、有機酸部分を含む溶液中で５ｆＣ又は５ｃａＣとボラン誘導体との間の反応を行うことを含む。有機酸は式Ｒ－ＣＯＯＨを有し、ＲはＣ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、反応は酢酸の存在下で行われる。
いくつかの実施形態では、先行技術に対する改良は、非水性溶媒中で５ｆＣ又は５ｃａＣとボラン誘導体との間の反応を行うことを含む。非水溶媒は、式Ｒ－ＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、反応は、メタノール又はエタノール中で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、９０％以上のメタノール又はエタノール中で行われる。
付加物（マロノニトリル処置の場合）又はＤＨＵ（ボラン処置の場合）の形成に続いて、付加物又はＤＨＵを有する核酸を配列決定に供する。いくつかの実施形態では、配列決定は次世代の大規模並列シーケンシングプロセスによるものである。配列決定は、付加物又はＤＨＵがチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列をもたらす、すなわち、シーケンシングポリメラーゼは、コピーされている鎖に付加物又はＤＨＵを収容し、付加物又はＤＨＵの反対側にアデニン（Ａ）を組み込むことができる。方法は、試験配列を参照配列と比較する工程を更に含み、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化は、試験核酸中のメチル化シトシンの存在を示す。
いくつかの実施形態では、試料中の核酸は、配列決定の前に増幅される。いくつかの実施形態では、増幅は、マロノニトリル付加物又はＤＨＵとは反対側のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを利用する。この実施形態では、付加物又はＤＨＵが増幅ポリメラーゼによってＴとして既に認識されているため、配列決定プロセスに適した任意のポリメラーゼで配列決定を進めることができる。
いくつかの実施形態では、試料中の核酸はアダプターにライゲートされ、アダプターは増幅及び配列決定において有用なエレメントを含む。アダプターは、バーコード、プライマー結合部位及びライゲーション部位のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出する改良された方法であって、（ｉ）試料中の核酸にアダプターをライゲーションすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、試料中の拡散にライゲーションすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができるＴＥＴと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出する改良された方法であって、（ｉ）試料中の核酸にアダプターをライゲーションすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、試料中の拡散にライゲーションすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換することができるＴＥＴと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール（例えば、マロノニトリル）から選択される）の化合物と接触させることによって、反応スキームに従って付加物を形成することと、（ｉｖ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している、インキュベートすることと、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが増幅中にチミン（Ｔ）として付加物を読み取る、増幅することと、（ｖｉ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化が、核酸中の５ｍＣ存在を示す、試験配列を参照配列と比較することとを含む、方法である。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、非水溶媒、例えばエタノール又はメタノール中に存在する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、酢酸等の有機酸を含む溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、トリエタノールアミン等のアミンを含む溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化シトシンヌクレオチドを検出する改良された方法であって、（ｉ）増幅プライマー結合部位を含むアダプターを試料中の核酸にライゲーションすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中のメチル化シトシンを５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）又は５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）と５ｃａＣの混合物に変換することができるＴＥＴと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を、核酸中の５ｆＣ及び５ｃａＣと反応することができるボラン誘導体と接触させてＤＨＵを形成することと、（ｉｖ）反応混合物を約１時間以下インキュベートすることであって、５ｆＣ及び５ｃａＣの少なくとも９０％がＤＨＵを形成している、インキュベートすることと、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して、適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが、増幅中にチミン（Ｔ）としてＤＨＵを読み取る、増幅することと、（ｖｉ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化が、核酸中の５ｍＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）において、ボラン誘導体は、非水溶媒、例えばエタノール又はメタノール中に存在する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）において、ボラン誘導体は、酢酸等の有機酸を含む溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化を検出する単一チューブ法である。いくつかの実施形態では、該方法は、（ｉ）増幅プライマー結合部位を含むアダプターを試料中の核酸にライゲートすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）又は５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）と５ｆＣとの混合物に変換することができるＴＥＴと接触させ、同時に、同じ反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、置換又は非置換シアノ、ニトロ、ホルミル、カルボニル化合物から選択される電子吸引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ１～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル、シクロアルキル、アリール、又はヘテロアリール（例えば、マロノニトリル）から選択される）の化合物と接触させることによって、反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物をインキュベートして、５ｆＣが付加物を形成さすることを可能にすることと、（ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが増幅中にチミン（Ｔ）として付加物を読み取る、増幅することと、（ｖ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化が、核酸中の５ｍＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することとを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）において、ＴＥＴの性能を改良するために条件が最適化される。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）において、反応混合物は、非水性溶媒、例えばエタノール又はメタノールを含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）において、反応混合物は、酢酸等の有機酸を含む。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）及び工程（ｉｉｉ）において、反応混合物は、トリエタノールアミン等の有機アミンを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定工程の前に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、５ｆＣとマロノニトリルとの付加物を形成する工程の後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、酸化メチル化シトシンをボラン誘導体で還元する工程の後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は標的濃縮工程の前に行われる。増幅は、上流プライマー及び下流プライマーを利用する。いくつかの実施形態では、両方のプライマーは、標的特異的プライマー、すなわち、メチル化バイオマーカーの標的配列に相補的な配列を含むプライマーである。いくつかの実施形態では、一方又は両方のプライマーはユニバーサルプライマーである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、本明細書に記載されるように配列決定された標的にライゲーションされたアダプターに存在する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、標的特異的プライマーの５’領域（尾部）に存在する。したがって、尾部標的特異的プライマーを用いた１回以上のプライマー伸長の後、ユニバーサルプライマーをその後の増幅のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、（同じ又は異なる配列の）別のユニバーサルプライマーと対になっていてもよい。他の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーと対にされる。
いくつかの実施形態では、本発明は核酸ポリメラーゼを含む。増幅及び配列決定に使用される核酸ポリメラーゼは公知であり、複数の供給元から市販されている。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のように形成された５ｆＣ付加物を含む鎖を複製することを含む。そのような複製は、５ｆＣ付加物を収容するポリメラーゼを必要とする。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼはＢファミリーポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、付加物をＴ（すなわち、付加物の反対側にＡを組み込むこと）として認識することによって、５ｆＣ付加物を含む鎖をコピーすることができる。本明細書に記載の５ｆＣ付加物を収容することができるポリメラーゼとしては、ＤＮＡ鎖にウラシル（Ｕ）を収容することが知られているＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼ又は操作されたポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、超好熱性古細菌、例えばパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、（パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓ））又はサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属（例えば、サーマス・アクアティカスＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ））から単離される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、中等温度好性古細菌（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅａ）、例えばメタノサルシナ（Ｍｅｔａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属（例えば、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ））から単離される。操作されたウラシル耐性ポリメラーゼの例としては、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ＋ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）、Ｔａｋａｒａ Ｔｅｒｒａ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、カリフォルニア州マウンテンビュー）、及びＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ウォルサム）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、限定された末端トランスフェラーゼ活性を有する（コピー鎖の３’末端に単一のｄＡを付加するＴａｑポリメラーゼ）。他のＤＮＡポリメラーゼは、検出可能な末端トランスフェラーゼ活性を有しない。そのような実施形態では、別々の末端トランスフェラーゼ酵素を使用して、非鋳型ヌクレオチドをコピー鎖の３’末端に付加する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ又は同様の条件付きで活性化されるポリメラーゼである。増幅工程のために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用され、例えば、ポリメラーゼはＴａｑ又はＴａｑ由来ポリメラーゼ（例えば、マサチューセッツ州ウィルミントンのＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＫＡＰＡ ２Ｇポリメラーゼ）である。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸又は核酸鎖の一方又は両方の末端に付加されたアダプターを利用する。様々な形状及び機能のアダプターが当技術分野で知られている（例えば、２０１９年２月２８日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５１５、米国特許第８８２２１５０号及び米国特許第８４５５１９３号を参照）。いくつかの実施形態では、アダプターの機能は、所望のエレメントを核酸に導入することである。アダプター由来エレメントは、核酸バーコード、プライマー結合部位又はライゲーション可能部位のうちの少なくとも１つを含む。
アダプターは、二本鎖、部分的に一本鎖又は一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙ字形、ヘアピンアダプター又はステムループアダプターが使用され、アダプターの二本鎖部分は、本明細書に記載されるように形成された二本鎖核酸にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成天然配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子又は分離した非天然分子である。
二本鎖又は部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドは、オーバーハング又は平滑末端を有することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ライゲーションを適用して平滑末端アダプターをライゲーションすることができる平滑末端を含み得る。他の実施形態では、平滑末端ＤＮＡはＡテイリングを受け、単一のＡヌクレオチドが平滑末端に付加されて平滑末端から延びる単一のＴヌクレオチドを有するように設計されたアダプターに適合し、ＤＮＡとアダプターとの間のライゲーションを容易にする。アダプターライゲーションを行うための市販のキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット又はＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ、及びＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）が挙げられるいくつかの実施形態では、アダプター連結（適応）ＤＮＡは、過剰なアダプター及びライゲーションされていないＤＮＡから分離され得る。
いくつかの実施形態では、本発明はバーコードの使用を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾を検出する方法は、配列決定を含む。本明細書に記載されるようにプロセシングされた核酸は、配列決定、好ましくは、大規模並列単一分子シーケンシングに供される。大規模並列シーケンシングによる個々の分子の分析は、典型的には、試料の同定及びエラー訂正のために別々のレベルのバーコード化を必要とする。米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号及び同第８，７２２，３６８号に記載されているような分子バーコードの使用。配列決定される各分子にユニーク分子バーコードを付加して、分子及びその子孫をマークする（例えば、元の分子及びＰＣＲによって生成されたそのアンプリコン）。ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）は、試料中の元の標的分子の数のカウント及びエラー訂正を含む複数の用途を有する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。
いくつかの実施形態では、ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）が、シーケンシングエラー訂正のために使用される。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードで標識され、バーコード化されたファミリーを形成する。バーコード化ファミリーの全てのメンバーによって共有されていない配列内の変動は、アーチファクトして破棄される。ファミリー全体が元の試料中の単一分子を表すので、バーコードは位置重複排除及び標的定量にも使用することができる（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。
本発明のいくつかの実施形態では、バーコード化標的核酸の一方又は両方の末端にライゲーションされたアダプターは、配列決定に使用される１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される試料の供給源を識別するために使用されるＵＩＤ又は多重試料ＩＤ（ＭＩＤ又はＳＩＤ）であり得る。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、バーコードは約４～２０塩基長であり、したがって、９６個～３８４個の異なるアダプター（それぞれ、同一バーコードの異なる対を有する）が、ヒトゲノム試料に付加される。いくつかの実施形態では、反応におけるＵＩＤの数は、標識されるべき分子の数を超え得る。当業者は、バーコードの数が試料の複雑さ（すなわち、固有の標的分子の予想数）に依存し、各実験に適した数のバーコードを作成することができることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、方法は、試料から核酸を含むライブラリを形成することを含む。ライブラリは、配列決定又は別の種類の検出方法、例えばＰＣＲの準備ができている複数の核酸からなる。ライブラリを保存し、ライブラリ中の核酸の増幅又は配列決定等の更なる処理のために複数回使用することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリは、本明細書に記載の方法によってメチル化が検出されるインプット核酸である。他の実施形態では、ライブラリは、本明細書に記載のメチル化検出反応を受けた核酸から形成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によるエピジェネティック修飾の検出のために処理された核酸を配列決定する。多くのシーケンシング技術又はシーケンシングアッセイのいずれかを利用できる。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローンで増幅された分子及び単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にする配列決定方法を指す。
本明細書に開示される方法での使用に適した配列アッセイの非限定的な例は、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号及び第２０１５／０３３７３６６号）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））等の質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、及び限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、又はＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａより入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
市販のシーケンシング技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（カリフォルニア州サンディエゴ）及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の合成によるシーケンシングプラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを含む。他のシーケンシング技術は、限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びナノポアシーケンシング（カリフォルニア州サンタクララのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定工程は、配列アラインメントを伴う。いくつかの実施形態では、アライメントを使用して、複数の配列、例えば、同じユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。分子ＩＤは、配列決定の前に、又は増幅工程が含まれる場合には増幅工程の前に各分子に付加することができるバーコードである。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ＲＴプライマーの５’部分に存在する。同様に、ＵＩＤは、化合物バーコードに追加される最後のバーコードサブユニットの５’末端に存在することができる。他の実施形態では、ＵＩＤは、アダプター中に存在し、ライゲーションによって標的核酸の一方又は両方の末端に付加される。
いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、全て同一のＵＩＤを有する複数の配列から決定される。同一のＵＩＤを有する配列決定されたものは、増幅によって同じ元の分子に由来すると推定される。他の実施形態では、ＵＩＤは、アーチファクト、すなわち、（特定のＵＩＤによって特徴付けられる）単一分子の子孫に存在する変動を排除するために使用される。ＰＣＲエラー又はシーケンシングエラーから生じるこのようなアーチファクトは、ＵＩＤを使用して除去され得る。
いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数は、同じ多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）を有する集団の中の各ＵＩＤを有する配列の相対数を定量することによって定量することができる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一の分子を表し、各配列バリアントと会合した異なるＵＩＤを計数することによって、全ての分子が同じＭＩＤを共有する、元の試料中の各配列バリアントの分率を決定し得る。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読取りの数を決定することができる。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読出しである。いくつかの実施形態では、所望の深度は、ＵＩＤ当たり５～５０読出しである。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＤＮＡメチル化を検出する改良された方法を行うための構成要素及びツールを含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで酸化された５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の産物を検出することによって核酸中のシトシンメチル化を検出するための構成要素を含む。いくつかの実施形態では、産物は、５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）又は５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）である。他の実施形態では、キットは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）又は５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ酸化を実施するための構成要素を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、ボラン誘導体及び非水性溶媒を含む。ボラン誘導体は、ピリジンボラン、２－ピコリンボラン（ｐｉｃ－ＢＨ３）、ボラン、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムから選択され、一方、非水性溶媒は、エタノール及びメタノールから選択される。他の実施形態では、キットは、非水性溶媒を含める代わりに、ボラン誘導体と、本明細書に記載のＤＮＡメチル化を検出する方法においてボラン誘導体と共に非水性溶媒（エタノール又はメタノール等）を使用することに関する説明書とを含む。いくつかの実施形態では、キットは有機酸を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の非水性溶媒中のボラン誘導体を含むＤＮＡメチル化を検出する方法において有機酸（酢酸等）を使用することに関する説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＭＥＳ又はＴＲＩＳ等の緩衝液を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、マロノニトリル及び非水性溶媒を含む。非水溶媒は、エタノール及びメタノールから選択される。他の実施形態では、非水性溶媒を含める代わりに、キットは、本明細書に記載のマロノニトリルによるＤＮＡメチル化を検出する方法における非水性溶媒（エタノール又はメタノール等）の使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、有機酸及び第一級、第二級又は第三級アミンを更に含む。有機酸は酢酸であってもよく、アミンはトリエタノールアミンであってもよい。他の実施形態では、キットは、本明細書に記載のマロノニトリルによるＤＮＡメチル化を検出する方法における有機酸及びアミン（酢酸及びトリエタノールアミン等）の使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＭＥＳ又はＴＲＩＳ等の緩衝液を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、５－メチルシトシン（５ｍＣ）又は５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ酸化のためのＴＥＴ酵素を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴは、マウスＴＥＴ１、ＴＥＴ２又はＴＥＴ３（ｍＴＥＴ１、２又は３）、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２又はＴＥＴ３（ｈＴＥＴ１、２又は３）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（ＣｃＴＥＴ）から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＥＴは、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）ＴＥＴ様オキシゲナーゼ（ＮｇＴＥＴ１）である。いくつかの実施形態では、ＴＥＴは、野生型タンパク質である。他の実施形態では、ＴＥＴは変異タンパク質である。いくつかの実施形態では、キットは、α－ケトグルタル酸及びＦｅ（ＩＩ）イオン源から選択される１つ以上の補因子を更に含む。
いくつかの実施形態では、ＴＥＴの代替として、キットには、化学酸化剤、例えば過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）又はルテニウム酸カリウム（Ｋ２ＲｕＯ４）が含まれる。
いくつかの実施形態では、キットは、５ｍＣを含む反応を受けないように５ｈｍＣを化学的に遮断するための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、グルコース化合物と、グルコース部分を５ｈｍＣの５－ヒドロキシル部分に転移することができるグルコシルトランスフェラーゼとを含む。いくつかの実施形態では、キットはベータ－グルコシルトランスフェラーゼ（ＢＧＴ）及びＵＤＰ－グルコースを含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＴはＴ４ ＢＧＴである。
いくつかの実施形態では、方法は、患者のゲノム内の１つ以上の遺伝子座のメチル化状態に基づく対象（例えば、患者）の状態の評価を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者の試料において、ゲノム位置、及び任意にゲノム内のメチル化シトシン（５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣ）の量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、疾患のバイオマーカーであることが知られている遺伝子座がメチル化について評価される。方法は、患者の疾患又は症状の診断、又は患者から単離された核酸中のメチル化の存在又は量に基づいて処置を選択又は変更することを更に含む。
本明細書に開示される方法を使用してメチル化について評価され得る疾患又は症状特異的メチル化遺伝子座を同定するためのいくつかの方法が存在する（例えば、米国特許出願公開第２０２００３８５８１３号”Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”；米国特許出願公開第２０２００２３９９６５号”Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；米国特許出願公開第２０１９０２８７６５２号”Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（疾患状態を示すメチル化マーカー）；米国特許出願公開第２０１９０３１６２０９号”Ｍｕｌｔｉ－ａｓｓａｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；米国特許出願公開第２０１９０３９０２５７号Ａ１”Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ”；国際公開第２０１１／０７０４４１号”Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；国際公開第２０１１／１０１７２８号”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；国際公開第２０２０／１８８５６１号”Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ．”を参照）。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して組織特異的ＤＮＡメチル化パターンを検出する方法を含む。この実施形態の一態様では、方法は、試料中に存在するメチル化ＤＮＡの起源組織を同定することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、血液から単離された無細胞ＤＮＡの起源の組織を同定することを更に含む。この実施形態の別の態様では、本発明は、無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用した移植レシピエントにおける臓器移植拒絶を含む臓器不全又は臓器損傷の検出を含む。本発明は、臓器特異的メチル化パターンを有する循環無細胞ＤＮＡを検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は臓器移植拒絶を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、器官特異的メチル化パターンにより無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって移植拒絶を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は臓器移植拒絶を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における癌性腫瘍の存在について診断又はスクリーニングする方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を用いた無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを用いた腫瘍の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて循環無細胞ＤＮＡを検出することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、その組織又は器官に由来する腫瘍の存在を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、腫瘍特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって腫瘍の成長又は縮小を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍成長を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍縮小を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における癌の処置の有効性を監視する方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用する、処置と相関する腫瘍動態の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍に対する処置の効果を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍成長及び処置の無効性を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小及び処置の有効性を示し、そのような無細胞ＤＮＡの安定なレベルは安定な疾患及び処置の有効性を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、処置後の癌患者における診断方法又は微小残存病変（ＭＲＤ）を含む。米国国立癌研究所は、患者が疾患の徴候又は症候を有さない場合、処置中又は処置後に体内に残る非常に少数の癌細胞としてＭＲＤを定義する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を用いて検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを用いてＭＲＤを検出する方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを組織又は器官特異的メチル化パターンで検出することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍からＭＲＤを検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、腫瘍からのＭＲＤの存在を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における自己免疫疾患の存在又は状態について診断又はスクリーニングする方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用する自己免疫疾患の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを組織又は器官特異的メチル化パターンで検出することによって、特定の組織又は器官への損傷を特徴とする自己免疫疾患を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、自己免疫疾患に起因する器官損傷及び自己免疫疾患の存在を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって自己免疫疾患の再発又は寛解を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は、器官損傷の増加及び自己免疫疾患の再発を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は、器官損傷の減少及び自己免疫疾患の寛解を示す。
５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）は、腫瘍学、出生前検査及び他の分野における多くの臨床応用を有する重要なエピジェネティックバイオマーカーである。最近まで、メチル化の塩基レベル検出は、非メチル化シトシンをバイサルファイトと反応させ、続いてＰＣＲ、アレイハイブリダイゼーション又は配列決定を行うことによって達成されていた。非メチル化シトシン（Ｃ）は、バイサルファイトと反応した後にチミン（Ｔ）として読み取られ、一方、メチル化シトシン（５ｍＣ及び５ｈｍＣ）はＣとして読み取られる。残念ながら、バイサルファイト処置は、試料核酸の大部分の分解をもたらし、高感度を必要とする用途には適さない。例えば、無細胞ＤＮＡ等の無細胞核酸を分析する最新の用途には不向きである。
近年、メチル化シトシンを検出するためのそれほど過酷でない方法が開示されている。Ｒａｏ ｅｔ ａｌ．（米国特許第９，１１５，３８６号）は、１０－１１転座ジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）のファミリーがｉｎ ｖｉｔｒｏで５ｍＣを５ｈｍＣに変換することを発見した。Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．は、Ｆｅ（ＩＩ）イオン及びアルファ－ケトグルタル酸の存在下でＴＥＴを使用して、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を介してメチルシトシン（５ｍＣ）をホルミルシトシン（５ｆＣ）及びカルボキシルシトシン（５ｃａＣ）に段階的に酸化する方法を開示した。Ｌｉｕ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ－ｆｒｅｅ ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７，４２４－４２９．
Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．は、ボラン誘導体（ピリジンボラン、ピコリンボラン等）を使用して５ｆＣ（及び５ｃａＣ）をジヒドロウラシル（ＤＨＵ）に還元することを更に記載した。その後、ＤＨＵは、その後の増幅及び配列決定においてＴとしてウラシル耐性核酸ポリメラーゼによって読み取られる。その結果、メチル化されたＣはＴと読み取られるが、メチル化されていないＣは変化しない。ＴＡＰＳ（ＴＥＴ支援ピリジン－ボランシーケンシング）と呼ばれるこのＴＥＴ及びピリジン－ボランに基づく方法は、バイサルファイト処置ほどＤＮＡ分解を引き起こさず、バックグラウンドを差し引いてシグナルを得る代わりにシグナルを直接検出することを可能にする。両方の利点は、より高いアラインメント速度、場合によってはより低いシーケンシング深度を可能にし、試料からより高い分子多様性を回収する。
ＣＡＰＳ（化学的支援ピリジン－ボランシーケンシング）と呼ばれる別の技術は、過ルテニウム酸カリウム（ＫＲｕＯ４）を使用した５ｈｍＣから５ｆＣへの選択的変換を含む。ＴＥＴの化学的代替物としてのＫＲｕＯ４の使用は、酸化的バイサルファイトシーケンシング（Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）又はｏｘＢＳ－ｓｅｑと呼ばれる技術から知られている（Ｂｏｏｔｈ Ｍ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｎｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ａｔ ｓｉｎｇｌｅ ｂａｓｅ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ １２ Ｍａｙ：９３４－９３７を参照）。過ルテニウム酸カリウム変換によって得られた５ｆＣは、例えばボラン処置又は任意の他の下流の方法による更なる処置のための好ましい標的となる。
更に別の配列決定技術は、ボランによる５ｆＣの減少の代替である。この方法は、Ｔとして認識される５ｆＣの付加物を形成することを含む。付加物は、マロノニトリルを使用して形成される（Ｚｈｕ Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１７）Ｓｉｎｇｌｅ－Ｃｅｌｌ ５－Ｆｏｒｍｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅａｒｌｙ Ｅｍｂｒｙｏｓ ａｎｄ ＥＳＣｓ ａｔ Ｓｉｎｇｌｅ－Ｂａｓｅ Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ，２０：７２０－７３１．ｅ５を参照）。
上記の方法は全て、少なくとも部分的に、ＴＥＴファミリー酵素で５ｈｍＣ及び５ ｍＣを５ｆＣに酸化することに依存する。他の１つの公知の酸化技術は、Ｃｕ（ＩＩ）化合物及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）を用いて５ｈｍＣを主に又は排他的に５ｆＣに変換することを含む。
５ｈｍＣを排他的に又は主に５ｆＣに酵素酸化するための方法及び組成物が本明細書に開示される。酸化は、特定の条件下でフェノール含有及び非フェノール化合物の酸化を触媒することが以前から知られている酵素であるラッカーゼを用いて触媒される。本発明者らは、驚くべきことに、この酵素が核酸との関連で作用して、５－ｈｍＣの５－ヒドロキシル基を５－ホルミル基に変換することを発見した。
本発明の様々な態様を以下で更に詳細に説明する。
いくつかの実施形態では、本発明は、エピジェネティック修飾、具体的には、核酸中のシトシンメチル化を検出する方法である。核酸中のメチル化シトシンを検出する技術水準の方法は、以下の重要な工程を含む：１）メチル化シトシンの酸化工程、２）配列決定中にチミン（Ｔ）として読み取ることができる形態への酸化生成物の変換工程、３）核酸を配列決定する工程、４）配列リード中のシトシン（Ｃ）からチミン（Ｔ）への変化がメチル化シトシンの存在を示した、処置した配列及び未処置配列を比較する工程。本発明は、工程１）メチル化シトシンを酸化する新しい実施手段を含む。酸化工程に続いて、技術水準に従って工程２）～工程４）が実施される。
本発明は、試料からの核酸を操作する方法を含む。いくつかの実施形態では、試料は、対象又は患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、生検によって、対象又は患者に由来する固形組織又は固形腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、核酸を含み得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液若しくは血液分画、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、又は糞便試料）を含み得る。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、核酸を単離し得る細胞及び流体を含有する組織培養物である。いくつかの実施形態では、試料中の目的の核酸は、ウイルス、細菌、原虫又は真菌等の感染病原体に由来する。
本発明は、試料から単離又は抽出された、単離された核酸を操作することを含む。核酸変異を検出するための方法が当該技術分野で周知である。（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” １９８９，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。生物学的試料から核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出するための様々なキット（例えば、ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン））、並びにＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州マディソン）；Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）；及びＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）；ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）から他の同様の製品等が市販されている。
いくつかの実施形態では、例えば国際公開第２０１９０９２２６９号及び国際公開第２０２００７４７４２号に記載されているように、核酸が抽出され、サイズによって分離され、任意に、エピタコフォレーシスによって濃縮される。
本発明は、核酸中のエピジェネティック修飾を検出することを含む。条件付きエピジェネティック修飾を受ける核酸配列は、本明細書に開示される方法によって分析される標的配列である。同じ核酸配列は、５位（５ｍＣ又は５ｈｍＣ）のシトシンのメチル化を特徴とするエピジェネティック修飾を有してもよく、又は有しなくてもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸のセット又はパネルは、メチル化の存在についてプローブされる。例えば、Ｐａｔａｉ ＡＶ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｖｅａｌｓ ａ Ｃｏｍｍｏｎ Ｔｅｎ－Ｇｅｎｅ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｉｎ Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ Ａｄｅｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．ＰＬＯＳ ＯＮＥ １０（８）：ｅ０１３３８３６、及びＯｎｗｕｋａ，Ｊ．Ｕ．，ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａ ｐａｎｅｌ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｆｒｏｍ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍａｙ ｐｒｅｄｉｃｔ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ．ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０，６９２に示され、メチル化バイオマーカーのパネルにおけるバイオマーカーのメチル化は、患者における結腸直腸癌の存在を示す。したがって、予後診断又は診断目的のためのメチル化バイオマーカーの任意の既知の又は将来のパネルの試験が、本明細書に開示される方法によって想定される。
いくつかの実施形態では、生物のゲノム全体がメチル化の存在についてプローブされる。本発明の方法は、例えば、Ｓｈｕｌｌ ＡＹ，ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔｈｙｌｏｍｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１２３８：６２７－５に記載される配列分析及び人工知能ツールを使用して、疾患若しくは症状を診断するため、又は疾患若しくは症状に対する素因を診断するため、生物のゲノム全体の全ての部位におけるメチル化を検出することを含む。
いくつかの実施形態では、試料中の５ｍＣ及び５ｈｍＣを別々に検出又は区別することが望ましい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のラッカーゼで試料を処置することによって、試料中の５ｈｍＣのみを検出することが望ましい。他の実施形態では、５ｍＣのみを検出することが望ましい。
一実施形態では、試料の２つのアリコートに対して２つの手順が並行して実行される。並行の一つでは、５ｈｍＣは遮断されるが、５ｍＣは、例えば、２０２１年２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１４７，３０７号に記載されているＴＥＴ及びマロノニトリル手順によって、Ｔ当量に変換することによって排他的に検出される。５ｈｍＣのブロッキングは、５ｍＣではなく５ｈｍＣに存在する反応性ヒドロキシル基を利用する。いくつかの実施形態では、５ｈｍＣに付加されるブロッキング基は糖部分である。いくつかの実施形態では、糖部分は、修飾又は非修飾グルコース部分であり、５－グルコシル－ヒドロキシメチルシトシン（５ｇｈｍＣ）が形成される。いくつかの実施形態では、ブロッキング基の付加は、グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、グルコシルトランスフェラーゼ）によって触媒される。いくつかの実施形態では、核酸中の５ｈｍＣを、ベータ－グルコシルトランスフェラーゼの存在下で修飾グルコースと反応させる。いくつかの実施形態では、修飾グルコースはＵＤＰ－グルコースであり、触媒はバクテリオファージＴ４ベータ－グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ４ ＢＧＴ）である。
一実施形態では、試料の２つのアリコートに対して２つの手順が並行して実行される。並行の一つでは、５ｈｍＣは、本明細書に記載されるようにラッカーゼを使用して５ｆＣに変換され、５ｆＣは、マロノニトリルプロセスを介してＴとして検出される。５ｍＣは反応しておらず、Ｃとして検出される。第２の並行では、例えば、２０２１年２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１４７，３０７号に記載されているＴＥＴ及びマロノニトリル手順によって、５ｈｍＣ及び５ｍＣの両方が区別なくＴとして検出される。２つの並列手順のうちの第１の並列手順は５ｈｍＣを明らかにし、一方、２つの並列手順のうちの第２の並列手順は５ｈｍＣ＋５ｍＣを明らかにする。
いくつかの実施形態では、本発明は、試料中の核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を５－メチルシトシン（５ｍＣ）と区別する方法であって、（ｉ）試料を２つのアリコートに分離することと、（ｉｉ）第１のアリコートにおいて、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む核酸を、５ｈｍＣ及び５ｍＣが５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換される条件下で、１０－１１転座（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼと接触させることと、（ｉｉｉ）第２のアリコートにおいて、５ｍＣ及び５ｈｍＣを含む核酸を、５ｈｍＣが５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換される条件下でラッカーゼと接触させることと、（ｉｖ）両方のアリコートを、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ１～Ｃ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ１～Ｃ６アルキル一置換及びＣ１～Ｃ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゼン化５員又は６員ヘテロアリールから選択される）の部分と別々に接触させることと、（ｖ）両方のアリコートからの核酸を別々に配列決定して、配列決定中に付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる第１及び第２の試験配列を得ることと、（ｖｉ）第１の試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｈｍＣ及び５ｍＣの存在を示す、第１の試験配列を参照配列と比較すること、（ｖｉｉ）第２の試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への転移が、核酸中の５ｈｍＣの存在を示す、第２の試験配列を参照配列と比較することと、（ｖｉｉｉ）第１の試験配列を第２の試験配列と比較することであって、第１の試験配列のそのようなシトシンのみが、第２の試験配列においてヒドロキシメチル化シトシン（５ｈｍＣ）として検出されない５ｍＣである、第１の試験配列を第２の試験配列と比較することと、を含む、方法である。あるいは、両方のアリコートを別々にウィティッヒ試薬と接触させることが可能である。
いくつかの実施形態では、５ｍＣ及び５ｈｍＣを区別せずに検出することが望ましい。この実施形態では、例えば、米国特許第９，１１５，３８６号に記載されているように、５ｍＣをＴＥＴと反応させて、本明細書に記載のラッカーゼによって酸化される５ｈｍＣを得る。
いくつかの実施形態では、方法は、下流検出のためにメチル化シトシンを酸化する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ラッカーゼ酵素を用いて５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換する工程を含む。いくつかの実施形態では、酸化は補因子の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、補因子は、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）である。いくつかの実施形態では、酸化は低ｐＨ、例えばｐＨ＜６で起こる。ラッカーゼは、酸素の水への還元によるリグニンを含むフェノール含有化合物の酸化を触媒し、メディエータの存在により、ベンジルアルコールのような非フェノール化合物の酸化もスキームに従って可能になる。
（Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０，１３５，１０５８８７を参照）。
一実施形態では、ラッカーゼ型のオキシドレダクターゼ（ＥＣ番号１．１０．３．２）が使用される。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは真菌源に由来する。いくつかの実施形態では、真菌源は、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）から選択される。いくつかの実施形態では、真菌源は、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）ＭＴＣＣ－１４１、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）ＭＴＣＣ－１８０１、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＭＴＣＣ－１１００、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）ＭＴＣＣ－１１７１、ササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）、又はアルコールデヒドロゲナーゼ、アルコールオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、クロロペルオキシダーゼ及びペルオキシダーゼ等の類似若しくは同等の酵素活性を有するその任意の他の類似体若しくは同等物から選択される。いくつかの実施形態では、トルエンメチル－モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１５．２６）及びＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＥＣ１．１４．１４．１）が、５ｍＣを５ｈｍＣに変換するために使用される。
いくつかの実施形態では、試料を補因子の存在下でラッカーゼと接触させる。いくつかの実施形態では、補因子は、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）である。いくつかの実施形態では、補因子は、アセトシリンゴン、シリンガアルデヒド、パラ－クマリン酸から選択されるラッカーゼの天然補因子、及び２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホネート（ＡＢＴＳ）、ビオルル酸（ＶＬＡ）、Ｎ－アセチル－Ｎ－フェニルヒドロキシルアミン（ＮＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）、Ｎ－ヒドロキシフタルイミド（ＨＰＩ）のようなＮ－ヒドロキシ型メディエータから選択されるラッカーゼの合成補因子から選択される（Ｔｗｏ ｄｅｃａｄｅｓ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅｓ：Ａｄｖａｎｃｉｎｇ ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｍ．Ｄ．Ｃａｎｎａｔｅｌｌｉ，Ａ．Ｊ．Ｒａｇａｕｓｋａｓ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｃ．２０１７，１７（１），１２２－１４０．を参照）。
いくつかの実施形態では、この方法は、５ｈｍＣをラッカーゼと反応させる前に、ＴＥＴ等の酵素で５ｍＣを５ｈｍＣに変換する予備工程を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ及びラッカーゼは、同じ簡便な「ワンポット」反応において存在する。いくつかの実施形態では、ＴＥＴ、ラッカーゼ及びマロノニトリルは、同じ簡便な「ワンポット」反応において存在する。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）ヌクレオチドを検出する下流工程を更に含み、５ｆＣは、本明細書において上記で記載される方法によって形成される。いくつかの実施形態では、下流工程は、５ｆＣを含む核酸を含む試料を、溶媒組成物中の式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物を含む改良された組成物と接触させることを含み、化合物は、反応スキームに従って核酸中の５ｆＣと反応して付加物を形成することができ、
式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ１～Ｃ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ１～Ｃ６アルキル一置換及びＣ１～Ｃ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゾ縮合５員又は６員ヘテロアリールから選択される。上記反応の反応物は、例えば、米国特許第１０，５１９，１８４号及びＹｉ ｅｔ ａｌ．による米国特許出願公開第２０２００１６５６６１号に記載される。例えば、Ｒ１はシアノ基（ＣＮ）であり、反応物はマロノニトリルである。あるいは、Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ（Ｂ．Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５，１２（１１），１０４７－１０５０を参照）の代わりに１，３－インダンジオン化合物を５ｆＣ変換試薬として使用することができる。また、５ｆＣをウィティッヒ試薬と反応させることも可能である。
他の実施形態では、下流工程は、５ｆＣを含む核酸を含む試料を有機溶媒中でウィティッヒ試薬と接触させ、次いで紫外線を照射することを含む。反応の生成物は、国際公開第２０２０１５５７４２号に記載されている蛍光認識技術を使用して検出される。
いくつかの実施形態では、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、反応が３時間未満にわたって進行することを可能にする反応混合物で提供され、少なくとも９０％の５ｆＣが、２０２１年２月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１４７，３０７号に記載されるような付加物を形成している。いくつかの実施形態では、反応は、１時間のみ進行し、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成する。いくつかの実施形態では、反応混合物は、有機酸部分を含む。有機酸は、式Ｒ－ＣＯＯＨを有し、Ｒは、Ｃ１－Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ２～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルケニル、Ｃ２～Ｃ３０直鎖又は分岐鎖アルキニル（Ｏ及びＮ等のヘテロ原子を含み得る）、アリール又はヘテロアリールから選択される。いくつかの実施形態では、反応は酢酸の存在下で行われる。いくつかの実施形態では、反応中の有機酸の濃度は、１％～３０％、例えば１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、又は３０％である。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、非水性溶媒を含む。非水性溶媒は、式Ｒ－ＯＨを有し、式中、Ｒは、Ｃ１～Ｃ３直鎖又は分岐鎖アルキルから選択され、Ｏ及びＮ等のヘテロ原子を含み得る。いくつかの実施形態では、反応は、メタノール又はエタノール中で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、１０％～１００％メタノール又はエタノール中で行われる。いくつかの実施形態では、反応は、９０％以上のメタノール又はエタノール中で行われる。
いくつかの実施形態では、反応混合物は、式ＲｘＮＨｙ（式中、ｘ及びｙはｘ＋ｙ＝３となるような０、１、２又は３であり、各Ｒは独立して、Ｏ及びＮなどのヘテロ原子を任意に含むＣ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ６～Ｃ１０－アリール、又は５員若しくは６員ヘテロアリール等から選択される）の化合物を含む。いくつかの実施形態では、式ＲｘＮＨｙ の化合物は、脂肪族又は芳香族基を有する第一級、第二級又は第三級アミンである。いくつかの実施形態では、Ｒｘは、Ｎと共にピペリジン等の５員又は６員環状ヘテロアルキルを形成することができる。いくつかの実施形態では、反応はトリエタノールアミンの存在下で行われる。
付加物の形成に続いて、付加物を有する核酸を配列決定に供する。いくつかの実施形態では、配列決定は次世代の大規模並列シーケンシングプロセスによるものである。配列決定は、付加物がチミン（Ｔ）として読み取られる試験配列をもたらす、すなわち、シーケンシングポリメラーゼは、コピーされている鎖に付加物を収容し、付加物の反対側にアデニン（Ａ）を組み込むことができる。方法は、試験配列を参照配列と比較する工程を更に含み、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化は、試験核酸中のメチル化及び／又はヒドロキシメチル化シトシンの存在を示す。
いくつかの実施形態では、試料中の核酸は、配列決定の前に増幅される。いくつかの実施形態では、増幅は、マロノニトリル付加物とは反対側のアデニン（Ａ）ヌクレオチドを効率的に組み込むＢファミリーポリメラーゼを利用する。この実施形態では、付加物が増幅ポリメラーゼによってＴとして既に認識されているため、配列決定プロセスに適した任意のポリメラーゼで配列決定を進めることができる。
いくつかの実施形態では、試料中の核酸はアダプターにライゲートされ、アダプターは増幅及び配列決定において有用なエレメントを含む。アダプターは、バーコード、プライマー結合部位及びライゲーション部位のうちの少なくとも１つを含む。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化及び／又はヒドロキシメチル化シトシンヌクレオチドを検出する改良された方法であって、（ｉ）アダプターを試料中の核酸にライゲーションすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、試料中の拡散にライゲーションすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｈｍＣを５ｆＣに変換することができるラッカーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸中のメチル化及び／又はヒドロキシメチル化シトシンヌクレオチドを検出する改良された方法であって、（ｉ）アダプターを試料中の核酸にライゲーションすることであって、アダプターが増幅プライマー結合部位を含む、試料中の拡散にライゲーションすることと、（ｉｉ）アダプター連結核酸を含有する試料を、核酸中の５ｈｍＣを５ｆＣに変換することができるラッカーゼと接触させることによって反応混合物を形成することと、（ｉｉｉ）反応混合物を、核酸中の５ｆＣと反応して反応スキームに従って付加物を形成することができる式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮ
（式中、Ｒ１は、シアノ、ニトロ、Ｃ １～Ｃ ６アルキルカルボン酸エステル、非置換カルボキサミド、Ｃ １～Ｃ ６アルキル一置換及びＣ １～Ｃ ６アルキル二置換カルボキサミド、置換カルボニル部分、置換スルホニル部分から選択される電子求引基であり、置換は、Ｃ１～Ｃ６直鎖又は分岐鎖アルキル、Ｃ４～Ｃ６シクロアルキル、フェニル、５員又は６員ヘテロアリール及びベンゼン化５員又は６員ヘテロアリールから選択される）の化合物と接触させることと、（ｉｖ）反応混合物を３時間未満インキュベートすることであって、５ｆＣの少なくとも９０％が付加物を形成している、インキュベートすることと、（ｖ）ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマー結合部位に結合することができるプライマーを利用して適合された核酸を増幅することであって、ＤＮＡポリメラーゼが増幅中にチミン（Ｔ）として付加物を読み取る、増幅することと、（ｖｉ）増幅された核酸を配列決定して試験配列を得ることと、（ｖｉｉ）試験配列を参照配列と比較することであって、参照配列中のシトシン（Ｃ）から試験配列中の対応する位置中のチミン（Ｔ）への変化が、核酸中の５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣの存在を示す、試験配列を参照配列と比較することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、非水溶媒、例えばエタノール又はメタノール中に存在する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）において、反応混合物を、ラッカーゼの補因子、例えば２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）等と更に接触させる。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉ）の前に、試料をＴＥＴと接触させて、工程（ｉｉ）におけるラッカーゼとの反応のために核酸中の５ｍＣを５ｈｍＣに変換する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、酢酸等の有機酸を含む溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、工程（ｉｉｉ）において、式Ｒ１－ＣＨ２－ＣＮの化合物は、トリエタノールアミン又はピペリジン等のアミンを含む溶液中に存在する。あるいは、工程（ｉｉｉ）においてウィティッヒ試薬を使用することが可能である。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸を増幅する工程を含む。いくつかの実施形態では、増幅は、配列決定工程の前に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、５ｆＣとマロノニトリルとの付加物を形成する工程の後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は、酸化メチル化シトシンをボラン誘導体で還元する工程の後に行われる。いくつかの実施形態では、増幅は標的濃縮工程の前に行われる。増幅は、上流プライマー及び下流プライマーを利用する。いくつかの実施形態では、両方のプライマーは、標的特異的プライマー、すなわち、メチル化バイオマーカーの標的配列に相補的な配列を含むプライマーである。他の実施形態では、一方又は両方のプライマーはユニバーサルプライマーである。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、本明細書に記載されるように配列決定された標的にライゲーションされたアダプターに存在する。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマー結合部位は、標的特異的プライマーの５’領域（尾部）に存在する。したがって、尾部標的特異的プライマーを用いた１回以上のプライマー伸長の後、ユニバーサルプライマーをその後の増幅のために使用することができる。いくつかの実施形態では、ユニバーサルプライマーは、（同じ又は異なる配列の）別のユニバーサルプライマーと対になっている。他の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、標的特異的プライマーと対にされる。
いくつかの実施形態では、本発明は核酸ポリメラーゼを含む。増幅及び配列決定に使用される核酸ポリメラーゼは公知であり、複数の供給元から市販されている。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載のように形成された５ｆＣ付加物を含む鎖を複製することを含む。そのような複製は、５ｆＣ付加物を収容するポリメラーゼを必要とする。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼはＢファミリーポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、付加物をＴ（すなわち、付加物の反対側にＡを組み込むこと）として認識することによって、５ｆＣ付加物を含む鎖をコピーすることができる。本明細書に記載の５ｆＣ付加物を収容することができるポリメラーゼとしては、ＤＮＡ鎖にウラシル（Ｕ）を収容することが知られているＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ポリメラーゼは、天然に存在するポリメラーゼ又は操作されたポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、超好熱性古細菌、例えばパイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ属（例えば、（パイロコッカス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｕｓ））又はサーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）属（例えば、サーマス・アクアティカスＴｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ））から単離される。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、中等温度好性古細菌（ｍｅｓｏｐｈｉｌｉｃ ａｒｃｈａｅａ）、例えばメタノサルシナ（Ｍｅｔａｎｏｓａｒｃｉｎａ）属（例えば、メタノサルシナ・アセチボランス（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ａｃｅｔｉｖｏｒａｎｓ））から単離される。操作されたウラシル耐性ポリメラーゼの例としては、ＫＡＰＡ ＨｉＦｉ Ｕｒａｃｉｌ＋ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）、Ｔａｋａｒａ Ｔｅｒｒａ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ、カリフォルニア州マウンテンビュー）、及びＥｐｉＭａｒｋ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州ウォルサム）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ａ型ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）である。いくつかのＤＮＡポリメラーゼは、限定された末端トランスフェラーゼ活性を有する（コピー鎖の３’末端に単一のｄＡを付加するＴａｑポリメラーゼ）。他のＤＮＡポリメラーゼは、検出可能な末端トランスフェラーゼ活性を有しない。そのような実施形態では、別々の末端トランスフェラーゼ酵素を使用して、非鋳型ヌクレオチドをコピー鎖の３’末端に付加する。
いくつかの実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔポリメラーゼ又は同様の条件付きで活性化されるポリメラーゼである。増幅工程のために、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが使用され、例えば、ポリメラーゼはＴａｑ又はＴａｑ由来ポリメラーゼ（例えば、マサチューセッツ州ウィルミントンのＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ製のＫＡＰＡ ２Ｇポリメラーゼ）である。
いくつかの実施形態では、本発明は、核酸又は核酸鎖の一方又は両方の末端に付加されたアダプターを利用する。様々な形状及び機能のアダプターが当技術分野で知られている（例えば、２０１９年２月２８日に出願されたＰＣＴ／ＥＰ２０１９／０５５１５、米国特許第８８２２１５０号及び米国特許第８４５５１９３号を参照）。いくつかの実施形態では、アダプターの機能は、所望のエレメントを核酸に導入することである。アダプター由来エレメントは、核酸バーコード、プライマー結合部位又はライゲーション可能部位のうちの少なくとも１つを含む。
アダプターは、二本鎖、部分的に一本鎖又は一本鎖であり得る。いくつかの実施形態では、Ｙ字形、ヘアピンアダプター又はステムループアダプターが使用され、アダプターの二本鎖部分は、本明細書に記載されるように形成された二本鎖核酸にライゲーションされる。
いくつかの実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成人工配列である。他の実施形態では、アダプター分子は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成天然配列である。更に他の実施形態では、アダプター分子は、分離した天然分子又は分離した非天然分子である。
二本鎖又は部分的に二本鎖のアダプターオリゴヌクレオチドは、オーバーハング又は平滑末端を有することができる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡは、平滑末端ライゲーションを適用して平滑末端アダプターをライゲーションすることができる平滑末端を含み得る。他の実施形態では、平滑末端ＤＮＡはＡテイリングを受け、単一のＡヌクレオチドが平滑末端に付加されて平滑末端から延びる単一のＴヌクレオチドを有するように設計されたアダプターに適合し、ＤＮＡとアダプターとの間のライゲーションを容易にする。アダプターライゲーションを行うための市販のキットとしては、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐキット又はＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐ、及びＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、カリフォルニア州プレザントン）が挙げられるいくつかの実施形態では、アダプター連結（適応）ＤＮＡは、過剰なアダプター及びライゲーションされていないＤＮＡから分離され得る。
いくつかの実施形態では、本発明はバーコードの使用を含む。いくつかの実施形態では、エピジェネティック修飾を検出する方法は、配列決定を含む。本明細書に記載されるようにプロセシングされた核酸は、配列決定、好ましくは、大規模並列単一分子シーケンシングに供される。大規模並列シーケンシングによる個々の分子の分析は、典型的には、試料の同定及びエラー訂正のために別々のレベルのバーコード化を必要とする。米国特許第７，３９３，６６５号、同第８，１６８，３８５号、同第８，４８１，２９２号、同第８，６８５，６７８号及び同第８，７２２，３６８号に記載されているような分子バーコードの使用。配列決定される各分子にユニーク分子バーコードを付加して、分子及びその子孫をマークする（例えば、元の分子及びＰＣＲによって生成されたそのアンプリコン）。ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）は、試料中の元の標的分子の数のカウント及びエラー訂正を含む複数の用途を有する（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ａｎ ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｂｒｏａｄ ｐａｔｉｅｎｔ ｃｏｖｅｒａｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３５１９）。
いくつかの実施形態では、ユニーク分子バーコード（ＵＩＤ）が、シーケンシングエラー訂正のために使用される。単一の標的分子の子孫全体が同じバーコードで標識され、バーコード化されたファミリーを形成する。バーコード化ファミリーの全てのメンバーによって共有されていない配列内の変動は、アーチファクトして破棄される。ファミリー全体が元の試料中の単一分子を表すので、バーコードは位置重複排除及び標的定量にも使用することができる（Ｎｅｗｍａｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，（２０１６）Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｄｉｇｉｔａｌ ｅｒｒｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ＤＮＡ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３４：５４７）。
本発明のいくつかの実施形態では、バーコード化標的核酸の一方又は両方の末端にライゲーションされたアダプターは、配列決定に使用される１つ以上のバーコードを含む。バーコードは、試料が混合（多重化）される試料の供給源を識別するために使用されるＵＩＤ又は多重試料ＩＤ（ＭＩＤ又はＳＩＤ）であり得る。バーコードはまた、ＵＩＤとＭＩＤとの組合せであってもよい。いくつかの実施形態では、単一のバーコードが、ＵＩＤ及びＭＩＤの両方として使用される。いくつかの実施形態では、各バーコードは、所定の配列を含む。他の実施形態では、バーコードは、ランダム配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、バーコードは約４～２０塩基長であり、したがって、９６個～３８４個の異なるアダプター（それぞれ、同一バーコードの異なる対を有する）が、ヒトゲノム試料に付加される。いくつかの実施形態では、反応におけるＵＩＤの数は、標識されるべき分子の数を超え得る。当業者は、バーコードの数が試料の複雑さ（すなわち、固有の標的分子の予想数）に依存し、各実験に適した数のバーコードを作成することができることを認識するであろう。
いくつかの実施形態では、方法は、試料から核酸を含むライブラリを形成することを含む。ライブラリは、配列決定又は別の種類の検出方法、例えばＰＣＲの準備ができている複数の核酸からなる。ライブラリを保存し、ライブラリ中の核酸の増幅又は配列決定等の更なる処理のために複数回使用することができる。いくつかの実施形態では、ライブラリは、本明細書に記載の方法によってメチル化が検出されるインプット核酸である。他の実施形態では、ライブラリは、本明細書に記載のメチル化検出反応を受けた核酸から形成される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によるエピジェネティック修飾の検出のために処理された核酸を配列決定する。多くの配列決定技術又は配列決定アッセイのいずれかを利用できる。本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング（ＮＧＳ）」という用語は、クローンで増幅された分子及び単一の核酸分子の超並列シーケンシングを可能にする配列決定方法を指す。
本明細書に開示される方法での使用に適した配列アッセイの非限定的な例は、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号、第２０１３／０２６４２０７号、第２０１４／０１３４６１６号、第２０１５／０１１９２５９号及び第２０１５／０３３７３６６号）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））等の質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、及び限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、又はＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａより入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、及びＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
市販のシーケンシング技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（カリフォルニア州サンディエゴ）及びＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の合成によるシーケンシングプラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを含む。他のシーケンシング技術は、限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及びナノポアシーケンシング（カリフォルニア州サンタクララのＲｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＳｏｌｕｔｉｏｎｓのＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）を含む。
いくつかの実施形態では、配列決定工程は、配列アラインメントを伴う。いくつかの実施形態では、アライメントを使用して、複数の配列、例えば、同じユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）を有する複数の配列からコンセンサス配列を決定する。分子ＩＤは、配列決定の前に、又は増幅工程が含まれる場合には増幅工程の前に各分子に付加することができるバーコードである。いくつかの実施形態では、ＵＩＤは、ＲＴプライマーの５’部分に存在する。同様に、ＵＩＤは、化合物バーコードに追加される最後のバーコードサブユニットの５’末端に存在することができる。他の実施形態では、ＵＩＤは、アダプター中に存在し、ライゲーションによって標的核酸の一方又は両方の末端に付加される。
いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、全て同一のＵＩＤを有する複数の配列から決定される。同一のＵＩＤを有する配列は、増幅によって同じ元の分子に由来すると推定される。他の実施形態では、ＵＩＤは、アーチファクト、すなわち、（特定のＵＩＤによって特徴付けられる）単一分子の子孫に存在する変動を排除するために使用される。ＰＣＲエラー又はシーケンシングエラーから生じるこのようなアーチファクトは、ＵＩＤを使用して除去され得る。
いくつかの実施形態では、試料中の各配列の数は、同じ多重試料ＩＤ（ＭＩＤ）を有する集団の中の各ＵＩＤを有する配列の相対数を定量することによって定量することができる。各ＵＩＤは、元の試料中の単一の分子を表し、各配列バリアントと会合した異なるＵＩＤを計数することによって、全ての分子が同じＭＩＤを共有する、元の試料中の各配列バリアントの分率を決定し得る。当業者は、コンセンサス配列を決定するために必要な配列読取りの数を決定することができる。いくつかの実施形態では、関連する数は、正確な定量結果のために必要なＵＩＤ（「配列深度（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄｅｐｔｈ）」）当たりの読出しである。いくつかの実施形態では、所望の深度はＵＩＤ当たり５～５０読取りである。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるＤＮＡメチル化を検出する改良された方法を行うための構成要素及びツールを含むキットである。いくつかの実施形態では、キットは、５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）へのｉｎ ｖｉｔｒｏ酸化を行うことによって核酸中のシトシンメチル化を検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、キットは、核酸中の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を検出するための試薬を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットはラッカーゼ酵素を含む。いくつかの実施形態では、ラッカーゼは真菌源に由来する。いくつかの実施形態では、真菌源は、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）及びササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）から選択される。いくつかの実施形態では、真菌源は、ヘキサゴニア・テヌイス（Ｈｅｘａｇｏｎｉａ ｔｅｎｕｉｓ）、ホウビタケ（Ｐｌｅｕｒｏｔｉｓ ｓａｊｏｒ ｃａｊｕ）ＭＴＣＣ－１４１、ヒラタケ（Ｐｌｅｕｔｏｒｉｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）ＭＴＣＣ－１８０１、マメザヤタケ（Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）ＭＴＣＣ－１１００、アラゲカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｈｉｒｓｕｔａ）ＭＴＣＣ－１１７１、ササクレヒトヨタケ種（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｓｐｐ．）又はＦ．等の類似若しくは同等の酵素活性を有するその任意の他の類似体若しくは同等物から選択される。
いくつかの実施形態では、キットは、ラッカーゼ酸化のための補助因子を更に含む。いくつかの実施形態では、補因子は、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）、アセトシリンゴン、シリンガアルデヒド、パラクマル酸２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホネート（ＡＢＴＳ）、ビオルル酸（ＶＬＡ）、Ｎ－アセチル－Ｎ－フェニルヒドロキシルアミン（ＮＨＡ）、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＢＴ）、及びＮ－ヒドロキシフタルイミド（ＨＰＩ）から選択される。
いくつかの実施形態では、キットは、１０－１１転座ジオキシゲナーゼ（ＴＥＴ）を更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＴは、マウスＴＥＴ１、ＴＥＴ２若しくはＴＥＴ３（ｍＴＥＴ１、２又は３）、ヒトＴＥＴ１、ＴＥＴ２若しくはＴＥＴ３（ｈＴＥＴ１、２又は３）、ネグレリア（Ｎａｅｇｌｅｒｉａ）ＴＥＴ（ＮｇＴＥＴ）、コプリノプシス・シネレア（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）（ＣｃＴＥＴ）、又は類似若しくは同等の酵素活性を有する任意の他の類似体若しくは同等物から選択される。
いくつかの実施形態では、キットはマロノニトリルを更に含む。いくつかの実施形態では、マロノニトリルは、非水性溶媒中に存在する。非水溶媒は、エタノール及びメタノールから選択される。他の実施形態では、非水性溶媒を含める代わりに、キットは、本明細書に記載のマロノニトリルによるＤＮＡメチル化を検出する方法における非水性溶媒（エタノール又はメタノール等）の使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、有機酸及び第一級、第二級又は第三級アミンを更に含む。有機酸は酢酸であってもよく、アミンはトリエタノールアミンであってもよい。他の実施形態では、キットは、本明細書に記載のマロノニトリルによるＤＮＡメチル化を検出する方法における有機酸及びアミン（酢酸及びトリエタノールアミン又はピペリジン等）の使用説明書を含む。いくつかの実施形態では、キットは、ＭＥＳ又はＴＲＩＳ等の緩衝液を更に含む。
いくつかの実施形態では、キットは、５ｍＣを化学的に反応させながら５ｈｍＣを保護することによって、核酸中の５ｍＣを５ｈｍＣと区別するための試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、グルコース化合物と、グルコース部分を５ｈｍＣの５－ヒドロキシル部分に転移して５－グルコシルヒドロキシメチルシトシン（５ｇｈｍＣ）を形成することができるグルコシルトランスフェラーゼとを含む。いくつかの実施形態では、キットはベータ－グルコシルトランスフェラーゼ（ＢＧＴ）及びＵＤＰ－グルコースを含む。いくつかの実施形態では、ＢＧＴはＴ４ ＢＧＴである。
いくつかの実施形態では、方法は、患者のゲノム内の１つ以上の遺伝子座のメチル化状態に基づく対象（例えば、患者）の状態の評価を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、患者の試料において、ゲノム位置、及び任意にゲノム内のメチル化シトシン（５ｍＣ及び／又は５ｈｍＣ）の量を決定することを含む。いくつかの実施形態では、疾患のバイオマーカーであることが知られている遺伝子座がメチル化について評価される。方法は、患者の疾患又は症状の診断、又は患者から単離された核酸中のメチル化の存在又は量に基づいて処置を選択又は変更することを更に含む。
本明細書に開示される方法を使用してメチル化について評価され得る疾患又は症状特異的メチル化遺伝子座を同定するためのいくつかの方法が存在する（例えば、米国特許出願公開第２０２００３８５８１３号”Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ ｃｅｌｌ ｓｏｕｒｃｅ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ”；米国特許出願公開第２０２００２３９９６５号”Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；米国特許出願公開第２０１９０２８７６５２号”Ａｎｏｍａｌｏｕｓ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（疾患状態を示すメチル化マーカー）；米国特許出願公開第２０１９０３１６２０９号”Ｍｕｌｔｉ－ａｓｓａｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ”；米国特許出願公開第２０１９０３９０２５７号Ａ１”Ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ”；国際公開第２０１１／０７０４４１号”Ｃａｔｅｇｏｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；国際公開第２０１１／１０１７２８号”Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ”；国際公開第２０２０／１８８５６１号”Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ．”を参照）。
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して組織特異的ＤＮＡメチル化パターンを検出する方法を含む。この実施形態の一態様では、方法は、試料中に存在するメチル化ＤＮＡの起源組織を同定することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、血液から単離された無細胞ＤＮＡの起源の組織を同定することを更に含む。この実施形態の別の態様では、本発明は、無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用した移植レシピエントにおける臓器移植拒絶を含む臓器不全又は臓器損傷の検出を含む。本発明は、臓器特異的メチル化パターンを有する循環無細胞ＤＮＡを検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は臓器移植拒絶を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、器官特異的メチル化パターンにより無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって移植拒絶を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は臓器移植拒絶を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における癌性腫瘍の存在について診断又はスクリーニングする方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を用いた無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを用いた腫瘍の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて循環無細胞ＤＮＡを検出することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、その組織又は器官に由来する腫瘍の存在を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、腫瘍特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって腫瘍の成長又は縮小を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍成長を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍縮小を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における癌の処置の有効性を監視する方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用する、処置と相関する腫瘍動態の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍に対する処置の効果を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は腫瘍成長及び処置の無効性を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は腫瘍の縮小及び処置の有効性を示し、そのような無細胞ＤＮＡの安定なレベルは安定な疾患及び処置の有効性を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、処置後の癌患者における診断方法又は微小残存病変（ＭＲＤ）を含む。米国国立癌研究所は、患者が疾患の徴候又は症候を有さない場合、処置中又は処置後に体内に残る非常に少数の癌細胞としてＭＲＤを定義する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を用いて検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを用いてＭＲＤを検出する方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを組織又は器官特異的メチル化パターンで検出することによって、特定の組織又は器官に由来する腫瘍からＭＲＤを検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、腫瘍からのＭＲＤの存在を示す。
いくつかの実施形態では、本発明は、患者又は対象における自己免疫疾患の存在又は状態について診断又はスクリーニングする方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に開示されるメチル化検出方法を使用して検出される無細胞ＤＮＡのメチル化パターンを使用する自己免疫疾患の検出を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを組織又は器官特異的メチル化パターンで検出することによって、特定の組織又は器官への損傷を特徴とする自己免疫疾患を検出することを含み、そのような無細胞ＤＮＡの存在は、自己免疫疾患に起因する器官損傷及び自己免疫疾患の存在を示す。いくつかの実施形態では、本発明は、循環無細胞ＤＮＡを定期的にサンプリングし、組織又は器官特異的メチル化パターンを用いて無細胞ＤＮＡのレベルの変化を測定することによって自己免疫疾患の再発又は寛解を監視することを含み、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの増加は、器官損傷の増加及び自己免疫疾患の再発を示し、一方、そのような無細胞ＤＮＡのレベルの減少は、器官損傷の減少及び自己免疫疾患の寛解を示す。
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Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｎｅｗ ｎｏｎ－ｉｎｎｏｃｅｎｔ Ｏａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ａｓ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ａｅｒｏｂｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｓ
１２．Ｂａｃｉｏｃｃｈｉ，Ｅｎｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１９９９，（１７），１７１５－１７１６
Ｐｒｏｃｈｉｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｋｉｎｅｔｉｃ ｉｓｏｔｏｐｅ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
１３．Ｏｒｂｅｇｏｚｏ，Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００９，６５（３４），６８０５－６８０９
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｔｏ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｖｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ
１４．Ｄｕｆｆ，Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．，Ｕ．Ｓ．，５０１０００５，２３ Ａｐｒ １９９１
Ｅｎｚｙｍｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｉｎ ｔｗｏｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ
１５．Ｄｕｆｆ，Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９８９，３４（２），１５３－９
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｎｄ ｂｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ
１６．Ｆｒｉｔｚ－Ｌａｎｇｈａｌｓ，Ｅ．；Ｋｕｎａｔｈ，Ｂ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８，３９（３３），５９５５－５９５６
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｌａｃｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｏｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
１７．Ｇａｎｄｏｌｆｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００１，４２（３），５１３－５１４
Ａｎ ｅａｓｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ
１８．Ｇｅｉｇｅｒｔ，Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９８３，１１４（３），１１０４－８
Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ
１９．Ｃｈａｕｒａｓｉａ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ２０１３，３（１），１８８－１９７
Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐｓ ｕｓｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｌａｃｃａｓｅ ｏｆ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ ＭＴＣＣ－１８０３
２０．Ｃｈａｕｒａｓｉａ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｎ Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２，６（７），２３７－２４２
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｌａｃｃａｓｅ ｏｆ Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＭＴＣＣ－１１００ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ
２１．Ｐａｒｋ，Ｊｉｎ－Ｂｙｕｎｇ；Ｃｌａｒｋ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００６，９４（１），１８９－１９２
Ｎｅｗ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
２２．Ｎｕｅｓｋｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＤＥ １０２００４０４７７７４ Ａ１ ２００６０３３０
Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ
２３．Ｈａｕｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ２００３０３１６３４ Ａ１ ２００３０４１７
Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｔｏｌｕｅｎｅｓ ｂｙ Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ
２４．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１（４－６），２１１－２１９
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｐ－ａｎｄ ｍ－ｘｙｌｅｎｅ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ
２５．Ｂｕｈｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，６８（２），５６０－５６８
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
２６．Ｒｕｓｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，４３（５），７９１－７９３
Ｂｅｎｚｙｌｉｃ ｂｉｏ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｏｌｕｅｎｅｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．
２７．Ｐｏｔｔｈａｓｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，６０（１４），４３２０－１
Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｉｃ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｏｕｐｓ ｔｏ Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ
１．Ｋｅｃｉｅｋ，Ａ．，Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０２０，１３５，１０５８８７
Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｓ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ３，４－ｄｉｈｙｄｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎ－２（１Ｈ）－ｏｎｅｓ ｕｎｄｅｒ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙ ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
２．Ｓａｆａｅｉ，Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｌｙｈｙｄｒｏｎ ２０１６，１０６，１５３－１６２
ＴＥＭＰＯ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｅｒｏｂｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｂｉｓ（ｐｈｅｎｏｌ）ｄｉ－ａｍｉｎｅ ｌｉｇａｎｄ ａｓ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ
３．Ｓａｔｔｌｅｒ，Ｊ．Ｈ．；Ｋｒｏｕｔｉｌ，Ｗ．，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｗｈｉｔｔａｌｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ２（２０１２），１７７－１７９
Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ
４．Ｗｕ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２０１１，６２（４），１１２３－１１２７
Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｓｉｎｇ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ｉｎ ｂｉｐｈａｓｉｃ ｓｙｓｔｅｍ
５．Ｊａｉｎ，Ａ．Ｎ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２０１０，３２（１１），１６４９－１６５４
Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｉｎ ａ ｓｏｌｉｄ－ｌｉｑｕｉｄ ２－ｐｈａｓｅ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｕｓｉｎｇ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ
６．Ｖｉｌｌａ，Ｒ．ｅｔ ａｌ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，４３（３４），６０５９－６０６１
Ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｗｉｔｈ Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ
７．Ｂｕｈｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，６８（２），５６０－５６８
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
８．Ｆａｂｂｒｉｎｉ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００２，１６（５－６），２３１－２４０
Ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ
９．Ｓａｍｒａ，Ｂ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ １９９９，１７（５），３８１－３９１
Ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｕｓｉｎｇ ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅ ｏｘｉｄａｎｔ ｉｎ ｏｒｇａｎｉｃ ｍｅｄｉａ
１０．ＭｃＳｋｉｍｍｉｎｇ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１８，１４０（４），１２２３－１２２６
Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｑｕｉｎｏｉｄ ａｌｃｏｈｏｌ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ａｃｔｉｖｅ ｓｉｔｅ
１１．Ｓａｆａｅｉ，Ｅｌｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２０１７，１１３３，５２６－５３３
Ｃｏｐｐｅｒ（ＩＩ）ｃｏｍｐｌｅｘ ｏｆ ｎｅｗ ｎｏｎ－ｉｎｎｏｃｅｎｔ Ｏａｍｉｎｏｐｈｅｎｏｌ－ｂａｓｅｄ ｌｉｇａｎｄ ａｓ ｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｏｘｉｄａｓｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ａｅｒｏｂｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌｓ
１２．Ｂａｃｉｏｃｃｈｉ，Ｅｎｒｉｃｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）１９９９，（１７），１７１５－１７１６
Ｐｒｏｃｈｉｒａｌ ｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｋｉｎｅｔｉｃ ｉｓｏｔｏｐｅ ｅｆｆｅｃｔ ｉｎ ｔｈｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
１３．Ｏｒｂｅｇｏｚｏ，Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００９，６５（３４），６８０５－６８０９
Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｔｏ ｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ ｖｉａ ｈｙｄｒｏｇｅｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ
１４．Ｄｕｆｆ，Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．，Ｕ．Ｓ．，５０１０００５，２３ Ａｐｒ １９９１
Ｅｎｚｙｍｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈｅｒ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｉｎ ｔｗｏｐｈａｓｅ ｓｙｓｔｅｍｓ ｗｉｔｈ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ
１５．Ｄｕｆｆ，Ｓｈｅｌｄｏｎ Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｍｕｒｒａｙ，Ｗｉｌｌｉａｍ Ｄ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９８９，３４（２），１５３－９
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｅｎｚｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ｂｙ ｗｈｏｌｅ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ ａｎｄ ｂｙ ａｌｃｏｈｏｌ ｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ ａｑｕｅｏｕｓ ａｎｄ ｎｏｎａｑｕｅｏｕｓ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｄｉａ
１６．Ｆｒｉｔｚ－Ｌａｎｇｈａｌｓ，Ｅ．；Ｋｕｎａｔｈ，Ｂ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １９９８，３９（３３），５９５５－５９５６
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｌａｃｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｏｒ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ
１７．Ｇａｎｄｏｌｆｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００１，４２（３），５１３－５１４
Ａｎ ｅａｓｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ
１８．Ｇｅｉｇｅｒｔ，Ｊｏｈｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １９８３，１１４（３），１１０４－８
Ｐｅｒｏｘｉｄｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ａｌｃｏｈｏｌｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ
１９．Ｃｈａｕｒａｓｉａ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ２０１３，３（１），１８８－１９７
Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｏｕｐｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐｓ ｕｓｉｎｇ ｃｒｕｄｅ ｌａｃｃａｓｅ ｏｆ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ ＭＴＣＣ－１８０３
２０．Ｃｈａｕｒａｓｉａ，Ｐ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＣｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ａｎ Ｉｎｄｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ２０１２，６（７），２３７－２４２
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｌａｃｃａｓｅ ｏｆ Ｘｙｌａｒｉａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ ＭＴＣＣ－１１００ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒｏｍａｔｉｃ ｍｅｔｈｙｌ ｇｒｏｕｐ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｇｒｏｕｐ
２１．Ｐａｒｋ，Ｊｉｎ－Ｂｙｕｎｇ；Ｃｌａｒｋ，Ｄｏｕｇｌａｓ Ｓ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００６，９４（１），１８９－１９２
Ｎｅｗ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｂｙ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
２２．Ｎｕｅｓｋｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，ＤＥ １０２００４０４７７７４ Ａ１ ２００６０３３０
Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｏｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｓ
２３．Ｈａｕｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，ＷＯ ２００３０３１６３４ Ａ１ ２００３０４１７
Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｔｏｌｕｅｎｅｓ ｂｙ Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ
２４．Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ Ｂ：Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ２００３，２１（４－６），２１１－２１９
Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｔｅｒｍｉｎｉ ｏｆ ｐ－ａｎｄ ｍ－ｘｙｌｅｎｅ ｂｙ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｗｉｔｈ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ
２５．Ｂｕｈｌｅｒ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ２００２，６８（２），５６０－５６８
Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｘｙｌｅｎｅ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｓｔｅｐ ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ
２６．Ｒｕｓｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２００２，４３（５），７９１－７９３
Ｂｅｎｚｙｌｉｃ ｂｉｏ－ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｖａｒｉｏｕｓ ｔｏｌｕｅｎｅｓ ｔｏ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｂｙ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ．
２７．Ｐｏｔｔｈａｓｔ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９９５，６０（１４），４３２０－１
Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ Ｅｎｚｙｍｉｃ Ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｒｏｍａｔｉｃ Ｍｅｔｈｙｌ Ｇｒｏｕｐｓ ｔｏ Ａｌｄｅｈｙｄｅｓ
本開示のいくつかの実施形態は、試料由来の標的核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出する方法であって、（ａ）標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程、並びに（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程であって、工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む核酸において、５ｈｍＣが標的核酸中に元々存在した位置でＴが検出される場合、標的核酸中で５ｈｍＣが検出されている、工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程を含む、方法に関する。関連する実施形態では、工程（ａ）において、標的核酸をラッカーゼと接触させ、工程（ａ）は２２時間未満で行われるか、又は工程（ａ）は５時間未満で行われるか、又は工程（ａ）は４時間未満で行われるか、又は工程（ａ）は３時間未満で行われるか、又は工程（ａ）は３時間で行われる。関連する実施形態では、工程（ａ）は２５℃前後で行われるか、又は工程（ａ）は２５℃で行われるか、又は工程（ａ）は３７℃前後で行われるか、又は工程（ａ）は３７℃で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）において、標的核酸はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触され、工程（ａ）は２４時間未満で行われるか、又は工程（ａ）は２２時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は６０℃前後で行われる。関連する実施形態では、工程（ｂ）は６０℃で行われ、及び／又は工程（ｂ）は反応混合物中で行われ、反応混合物は緩衝液を含む。一実施形態では、緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。別の実施形態では、緩衝液は８前後のｐＨである。別の実施形態では、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１．５時間接触させる。別の実施形態では、本方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の追加の工程を更に含み、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の追加の工程は、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をＮａＯＨと接触させることを含む。関連する実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１時間未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約１時間接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと３０分未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約３０分間接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態で は、緩衝液は以下の成分を含む：（ｉ）５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｉｉ）０．８５Ｍベタイン；（ｉｉｉ）７０ｍＭ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）；（ｉｖ）２．１ｍＭ ｄＡＴＰ；（ｖ）２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び（ｖｉ）１５ｍＭ硫酸アンモニウム。
本開示の他の実施形態は、試料由来の標的核酸中の５－メチルシトシン（５ｍＣ）を検出する方法であって、（ａ）標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程であって、ＴＥＴが、５ｍＣを５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に変換し、それにより１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成する、標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－マロノニトリル付加物（５５ｆＣ－Ｍ付加物）に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成する、工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程、並びに（ｅ）工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程であって、工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む核酸において、５ｈｍＣが標的核酸中に元々存在した位置でＴが検出される場合、標的核酸中で５ｈｍＣが検出されている、工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程を含む、方法に関する。別の実施形態では、工程（ａ）は、アミン触媒を含む緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態では、アミン触媒は、２－アミノ－５－メトキシ安息香酸である。別の実施形態では、緩衝液はリン酸ナトリウムを含み、５．２前後のｐＨを有する。別の実施形態では、アミン触媒は、２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩である。別の実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓを含み、８前後のｐＨを有する。別の実施形態では、工程（ｂ）において、標的核酸をラッカーゼと接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２２時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は５時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２５℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２５℃で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３７℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３７℃で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）及び工程（ｂ）は、単一の工程で組み合わされる。別の実施形態では、工程（ａ）と工程（ｂ）の組み合わせは、反応混合物中で行われ、反応混合物は緩衝液を含み、緩衝液はＴＥＴ及びラッカーゼの両方を含む。別の実施形態では、標的核酸をＴＥＴと接触させ、ＴＥＴは５ｍＣを５ｈｍＣに変換し、それにより、１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成し、ラッカーゼが５ｈｍＣを５ｆＣに変換し、それにより１つ以上の５ｆＣを含む核酸を生成する。別の実施形態では、工程（ｂ）において、標的核酸はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触される。別の実施形態では、工程（ｂ）は２４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２２時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は６０℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は６０℃で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態では、緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。別の実施形態では、緩衝液は８前後のｐＨである。別の実施形態では、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１．５時間接触させる。別の実施形態では、本方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の追加の工程を更に含み、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の追加の工程は、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をＮａＯＨと接触させることを含む。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１時間未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約１時間接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと３０分未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約３０分間接触させる。別の実施形態では、工程（ｄ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態で は、緩衝液は以下の成分を含む：（ｉ）５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｉｉ）０．８５Ｍベタイン；（ｉｉｉ）７０ｍＭ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）；（ｉｖ）２．１ｍＭ ｄＡＴＰ；（ｖ）２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び（ｖｉ）１５ｍＭ硫酸アンモニウム。
本開示の他の実施形態は、試料由来の標的核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換する方法であって、（ａ）標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程、並びに（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成し、標的核酸中の５ｈｍＣがＴに変換されている、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程を含む、方法に関する。別の実施形態では、工程（ａ）において、標的核酸をラッカーゼと接触させる。別の実施形態では、工程（ａ）は２２時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は５時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は３時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は３時間で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は２５℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は２５℃で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は３７℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は３７℃で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）において、標的核酸はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触される。別の実施形態では、工程（ａ）は２４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）は２２時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は６０℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は６０℃で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態では、緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。別の実施形態では、緩衝液は８前後のｐＨである。別の実施形態では、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１．５時間接触させる。別の実施形態では、本方法は、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の追加の工程を更に含み、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の追加の工程は、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をＮａＯＨと接触させることを含む。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１時間未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約１時間接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと３０分未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約３０分間接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態で は、緩衝液は以下の成分を含む：（ｉ）５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｉｉ）０．８５Ｍベタイン；（ｉｉｉ）７０ｍＭ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）；（ｉｖ）２．１ｍＭ ｄＡＴＰ；（ｖ）２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び（ｖｉ）１５ｍＭ硫酸アンモニウム。
本開示の他の実施形態は、試料由来の標的核酸中の５－メチルシトシン（５ｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換する方法であって、（ａ）標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程であって、ＴＥＴが、５ｍＣを５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に変換し、それにより１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成する、標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程、（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－マロノニトリル付加物（５ｆＣ－Ｍ付加物）に変換し、それにより１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと接触させる工程、（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより１つ以上のＴを含む核酸を生成し、標的核酸中の５ｍＣがＴに変換されている、工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸をポリメラーゼと接触させる工程を含む、方法に関する。別の実施形態では、工程（ａ）は、アミン触媒を含む緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態では、アミン触媒は、２－アミノ－５－メトキシ安息香酸である。別の実施形態では、緩衝液はリン酸ナトリウムを含み、５．２前後のｐＨを有する。別の実施形態では、アミン触媒は、２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩である。別の実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓを含み、８前後のｐＨを有する。別の実施形態では、工程（ｂ）において、標的核酸をラッカーゼと接触させる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２２時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は５時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２５℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２５℃で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３７℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は３７℃で行われる。別の実施形態では、工程（ａ）及び工程（ｂ）は、単一の工程で組み合わされる。別の実施形態では、工程（ａ）と工程（ｂ）の組み合わせは、反応混合物中で行われ、反応混合物は緩衝液を含み、緩衝液はＴＥＴ及びラッカーゼの両方を含む。別の実施形態では、標的核酸をＴＥＴと接触させ、ＴＥＴは５ｍＣを５ｈｍＣに変換し、それにより、１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成し、ラッカーゼが５ｈｍＣを５ｆＣに変換し、それにより１つ以上の５ｆＣを含む核酸を生成する。別の実施形態では、工程（ｂ）において、標的核酸はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触される。別の実施形態では、工程（ｂ）は２４時間未満で行われる。別の実施形態では、工程（ｂ）は２２時間で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は６０℃前後で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は６０℃で行われる。別の実施形態では、工程（ｃ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態では、緩衝液は２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。別の実施形態では、緩衝液は８前後のｐＨである。別の実施形態では、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１．５時間接触させる。別の実施形態では、本方法は、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の追加の工程を更に含み、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の追加の工程は、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をＮａＯＨと接触させることを含む。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと１時間未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約１時間接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと３０分未満接触させる。別の実施形態では、工程（ｃ）において、１つ以上の５ｆＣを含む核酸をマロノニトリルと約３０分間接触させる。別の実施形態では、工程（ｄ）は、緩衝液を含む反応混合物中で行われる。別の実施形態で は、緩衝液は以下の成分を含む：（ｉ）５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；（ｉｉ）０．８５Ｍベタイン；（ｉｉｉ）７０ｍＭ塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）；（ｉｖ）２．１ｍＭ ｄＡＴＰ；（ｖ）２．２５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び（ｖｉ）１５ｍＭ硫酸アンモニウム。
実施例１．メチル化検出アッセイ（ＴＡＰＳ）におけるピコリン－ボランの共溶媒としてのエタノールの使用。
この実施例では、ｃａＣヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチドを新規条件下でＤＨＵによる還元に供した。２－ピコリンボランを無水エタノール又はメタノール（１ｍｇ／５ｕＬ、１．８７ｍＭ）に溶解した。合成オリゴヌクレオチド、ＴＡＰＳ－ｃａＣ配列番号１（２．７ｎｍｏｌ、５’－Ｐｈｏｓ－ＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴ（ｃａＣ）ＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ）を３５ｕＬの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．３）に溶解し、２５ｕＬのピコリンボラン溶液と混合して、最終濃度を７９０ｍＭにした。得られた濁った溶液を、３５Ｃで３時間振盪するサーモミキサー上に置いた。溶液をＤＩ－水（３００ｕＬ）で希釈し、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＡ；勾配：３５分で２～１５％ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＡ）により精製して、質量分析計（ｍ／ｚ ９８６９．４３、計算値９８６９．０）により同定される１．３３ｎｍｏｌ（４９％）のＴＡＰＳ－ＤＨＵを得た。ＤＨＵ生成物の形成を、３０分、６０分、１８０分の期間で反応溶液のアリコート（２ｕＬ）を採取することによって監視し、ＬＣＭＳによって分析した。図１に示す結果は、ＤＨＵ変換が１時間で完了したことを実証している。
この実施例では、ｃａＣヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチドを新規条件下でＤＨＵによる還元に供した。２－ピコリンボランを無水エタノール又はメタノール（１ｍｇ／５ｕＬ、１．８７ｍＭ）に溶解した。合成オリゴヌクレオチド、ＴＡＰＳ－ｃａＣ配列番号１（２．７ｎｍｏｌ、５’－Ｐｈｏｓ－ＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴ（ｃａＣ）ＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ）を３５ｕＬの酢酸ナトリウム（３Ｍ、ｐＨ４．３）に溶解し、２５ｕＬのピコリンボラン溶液と混合して、最終濃度を７９０ｍＭにした。得られた濁った溶液を、３５Ｃで３時間振盪するサーモミキサー上に置いた。溶液をＤＩ－水（３００ｕＬ）で希釈し、ＨＰＬＣ（Ｃ１８、溶離液：ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＡ；勾配：３５分で２～１５％ＣＨ３ＣＮ／０．１Ｍ ＴＥＡＡ）により精製して、質量分析計（ｍ／ｚ ９８６９．４３、計算値９８６９．０）により同定される１．３３ｎｍｏｌ（４９％）のＴＡＰＳ－ＤＨＵを得た。ＤＨＵ生成物の形成を、３０分、６０分、１８０分の期間で反応溶液のアリコート（２ｕＬ）を採取することによって監視し、ＬＣＭＳによって分析した。図１に示す結果は、ＤＨＵ変換が１時間で完了したことを実証している。
実施例２．メチル化検出アッセイ（ＴＡＰＳ）におけるピコリン－ボランの共溶媒としてのメタノール及び酢酸の使用。
この実施例では、実施例１のオリゴヌクレオチドを、メタノール／酢酸溶液中にピコリン－ボランが存在することを除いて、実施例１に記載の条件下（配列番号１）で使用した。反応物は、１．３９ｎｍｏｌ ＴＡＰＳ ｃａＣオリゴヌクレオチド、１０：１ ｖ：ｖ酢酸及び２００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６中２５０ｍＭのピクボラン（ｐｉｃｂｏｒａｎｅ）を含有していた。本発明者らは、有効ボラン濃度を２５ｍＭまで低下させることができ、反応時間を更に１時間まで短縮した。反応の生成物を実施例１に記載のように検出した。結果を図２に示す。
この実施例では、実施例１のオリゴヌクレオチドを、メタノール／酢酸溶液中にピコリン－ボランが存在することを除いて、実施例１に記載の条件下（配列番号１）で使用した。反応物は、１．３９ｎｍｏｌ ＴＡＰＳ ｃａＣオリゴヌクレオチド、１０：１ ｖ：ｖ酢酸及び２００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６中２５０ｍＭのピクボラン（ｐｉｃｂｏｒａｎｅ）を含有していた。本発明者らは、有効ボラン濃度を２５ｍＭまで低下させることができ、反応時間を更に１時間まで短縮した。反応の生成物を実施例１に記載のように検出した。結果を図２に示す。
実施例３．メチル化検出アッセイにおける酢酸ナトリウム緩衝液中でのマロノニトリルの使用。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液として１Ｍ酢酸ナトリウムを使用して、３５Ｃで５時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）の５ｆＣ含有オリゴ（ＴＡＰＳ－ｆＣ：配列番号１ ５’－Ｐｈｏｓ－ＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴ（ｆＣ）ＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ））を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、ｐＨ８．４）中のマロノニトリル溶液（１００ｍＭ、５０ｕＬ）と反応させる。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析は、ＴＡＰＳ－ｆＣの９０％超が３５Ｃで５時間後に消費されたことを示す。結果を図３に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液として１Ｍ酢酸ナトリウムを使用して、３５Ｃで５時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）の５ｆＣ含有オリゴ（ＴＡＰＳ－ｆＣ：配列番号１ ５’－Ｐｈｏｓ－ＣＡＣＧＴＣＣＡＧＡＴＣＡＡＴ（ｆＣ）ＧＡＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＡ））を、酢酸ナトリウム（１Ｍ、ｐＨ８．４）中のマロノニトリル溶液（１００ｍＭ、５０ｕＬ）と反応させる。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析は、ＴＡＰＳ－ｆＣの９０％超が３５Ｃで５時間後に消費されたことを示す。結果を図３に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
実施例４．メチル化検出アッセイにおけるエタノール－ＴＲＩＳ緩衝液中でのマロノニトリルの使用。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液としてエタノール／ＴＲＩＳを使用して、３５Ｃで４時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）の配列番号１のＴＡＰＳ－ｆＣオリゴは、エタノール及びＴＲＩＳ（ｐＨ８、２０ｍＭ、２６ｕＬ）中のマロノニトリル溶液（２００ｍＭ、２５ｕＬ）と反応する。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析は、３７Ｃで４時間後に５ｆＣの大部分が生成物に変換されたことを示す。結果を図４に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液としてエタノール／ＴＲＩＳを使用して、３５Ｃで４時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）の配列番号１のＴＡＰＳ－ｆＣオリゴは、エタノール及びＴＲＩＳ（ｐＨ８、２０ｍＭ、２６ｕＬ）中のマロノニトリル溶液（２００ｍＭ、２５ｕＬ）と反応する。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析は、３７Ｃで４時間後に５ｆＣの大部分が生成物に変換されたことを示す。結果を図４に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
実施例５．メチル化検出アッセイにおけるエタノール－トリエチルアミン緩衝液中でのマロノニトリルの使用。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液としてエタノール／トリエチルアミンを使用して、３５Ｃで１時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）のＴＡＰＳ－５ｆＣオリゴ（配列番号１）を、エタノール及び１ｕＬのトリエチルアミン中のマロノニトリル溶液（１００ｍＭ、４６ｕＬ）と反応させる。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析。オリゴの９０％超が３５Ｃで１時間後に反応した。結果を図５に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
この実施例では、本発明者らは、緩衝液としてエタノール／トリエチルアミンを使用して、３５Ｃで１時間で５ｆＣオリゴ上に付加物を形成するマロノニトリルの改良されたプロセスを実証する。アッセイを以下のように行った。１ｎｍｏｌ（４ｕＬ）のＴＡＰＳ－５ｆＣオリゴ（配列番号１）を、エタノール及び１ｕＬのトリエチルアミン中のマロノニトリル溶液（１００ｍＭ、４６ｕＬ）と反応させる。異なるインキュベーション時間での試料のＬＣＭＳ分析。オリゴの９０％超が３５Ｃで１時間後に反応した。結果を図５に示す。ＴＡＰＳ－ｆＣの質量は９８９４であり、反応生成物の質量は９９４２である。
実施例６．ＴＥＴ及びマロノニトリルを用いた単一チューブメチル化検出アッセイ。
本実施例では、本発明者らは、ＴＥＴがマロノニトリル中で活性であり、単一チューブメチル化検出反応を可能にすることを実証する。ラムダＤＮＡ（非メチル化及びメチル化）をせん断し、アダプターにライゲートしてシーケンシングライブラリを作製した。１０ｎｇの非メチル化及びメチル化ライブラリをインプットＤＮＡとして使用した。１０ｎＭ、１００ｎＭ又は５００ｎＭのｍＴＥＴ２（ＮＥＢ）又はＮｇＴＥＴを、１５０ｍＭのマロノニトリルの最終濃度でＤＮＡとインキュベートした。反応物を３７Ｃで２０時間インキュベートした。Ｋａｐａ ＨｉＦｉポリメラーゼを使用して、試料の４分の１をＰＣＲに直接１４サイクル添加した。ライブラリを配列決定し、ＣｐＧ部位での変換率を図６に示す。変換率０．１％ＴＥＴなしの対照と比較して０．９％の変換率は、ＴＥＴがマロノニトリルの存在下で機能することができ、酸化及び付加物形成が単一チューブ内で起こり得ることを示唆している。
本実施例では、本発明者らは、ＴＥＴがマロノニトリル中で活性であり、単一チューブメチル化検出反応を可能にすることを実証する。ラムダＤＮＡ（非メチル化及びメチル化）をせん断し、アダプターにライゲートしてシーケンシングライブラリを作製した。１０ｎｇの非メチル化及びメチル化ライブラリをインプットＤＮＡとして使用した。１０ｎＭ、１００ｎＭ又は５００ｎＭのｍＴＥＴ２（ＮＥＢ）又はＮｇＴＥＴを、１５０ｍＭのマロノニトリルの最終濃度でＤＮＡとインキュベートした。反応物を３７Ｃで２０時間インキュベートした。Ｋａｐａ ＨｉＦｉポリメラーゼを使用して、試料の４分の１をＰＣＲに直接１４サイクル添加した。ライブラリを配列決定し、ＣｐＧ部位での変換率を図６に示す。変換率０．１％ＴＥＴなしの対照と比較して０．９％の変換率は、ＴＥＴがマロノニトリルの存在下で機能することができ、酸化及び付加物形成が単一チューブ内で起こり得ることを示唆している。
実施例７．ラッカーゼ酵素による５ｈｍＣの酸化。
この実施例では、５ｈｍＣヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチドをラッカーゼによる酸化に供した。５ｈｍＣ合成オリゴヌクレオチド（配列番号２）は、配列 ５’－ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＴｈｍＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ－３’を有していた。１５０μｌの反応混合物は、５０ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチド、１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）の２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）、２ｍｇのカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３８４２９）由来のラッカーゼ、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．２を含んでいた。反応を室温で５時間進行させた。第１の対照反応物は、ラッカーゼを除く上記試薬（ＴＥＭＰＯを含む）を全て含んでいた。第２の対照反応物は、ラッカーゼ及びＴＥＭＰＯを１：１０００希釈で添加したことを除いて、全ての上記試薬（ラッカーゼ及びＴＥＭＰＯを含む）を含んでいた。第３の対照反応物は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを除いて上記の試薬を全て含み、５ｈｍＣの代わりに５ｍＣを含んでいた：５’－ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＴｍＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ－３’。
この実施例では、５ｈｍＣヌクレオチドを有する合成オリゴヌクレオチドをラッカーゼによる酸化に供した。５ｈｍＣ合成オリゴヌクレオチド（配列番号２）は、配列 ５’－ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＴｈｍＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ－３’を有していた。１５０μｌの反応混合物は、５０ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチド、１．６ｍｇ（１０μｍｏｌ）の２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）、２ｍｇのカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３８４２９）由来のラッカーゼ、５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ５．２を含んでいた。反応を室温で５時間進行させた。第１の対照反応物は、ラッカーゼを除く上記試薬（ＴＥＭＰＯを含む）を全て含んでいた。第２の対照反応物は、ラッカーゼ及びＴＥＭＰＯを１：１０００希釈で添加したことを除いて、全ての上記試薬（ラッカーゼ及びＴＥＭＰＯを含む）を含んでいた。第３の対照反応物は、配列番号２のオリゴヌクレオチドを除いて上記の試薬を全て含み、５ｈｍＣの代わりに５ｍＣを含んでいた：５’－ＡＴＴ ＡＴＴ ＴＡＴ ＴＴＡ ＴＴｍＣ ＧＴＡ ＴＴＡ ＴＴＴ ＡＴＴ ＡＴＴ－３’。
反応混合物を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣＭＳ）によって分析した。分子量は以下の通りである：
５ｈｍＣ－９１７６ Ｄａ
５ｍＣ－９１６０ Ｄａ
５ｆＣ－９１７４ Ｄａ
図７は、反応から生じる９１７４Ｄａでの５ｆＣピークを示す。ＬＣ－ＭＳ溶離液からのｎ－ブチルアミンによる５－ホルミル－ｄＣのイミン形成から生じるアーチファクトに対応する９２２９Ｄａにおいて追加のピークが観察される（ｆＣ＋５５ Ｄａ＝９２２９Ｄａ）。ある程度まで、リボース糖のヒドロキシル基（＋１４ Ｄａ）で更なる酸化が起こる。
図８は、５ｍＣとの反応を示さない（５ｍＣピークは９１６０ Ｄａで不変）。ある程度まで、リボース糖のヒドロキシル基（＋１４ Ｄａ）で酸化が起こる。酵素及び希釈酵素を用いない対照反応は、５ｈｍＣ出発材料において変化を示さなかった（データは示さず）。
実施例８（仮想例）。５ｍＣを５ｈｍＣに酸化した後、５ｈｍＣをラッカーゼと反応させる。
５ｍＣを５ｈｍＣに変換するため、反応混合物は、３ｕｇ ＴＥＴタンパク質及び２μｇのオリゴヌクレオチド基質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭ ２－オキソグルタル酸、１００μＭ硫酸第一アンモニウム（Ｆｅ２＋）及び１ｍＭ ＤＴＴ中に含有し、Ｔａｈｉｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ５－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｔｏ ５－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｂｙ ＭＬＬ Ｐａｒｔｎｅｒ ＴＥＴ１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２９）：９３０－９３５．に記載されているように、３７℃で３時間インキュベートする。得られた核酸を、例えばＳＰＲＩによって精製する。反応混合物のアリコートを、実施例７に記載されるようにラッカーゼと共にインキュベートする。
５ｍＣを５ｈｍＣに変換するため、反応混合物は、３ｕｇ ＴＥＴタンパク質及び２μｇのオリゴヌクレオチド基質を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭアスコルビン酸、１ｍＭ ２－オキソグルタル酸、１００μＭ硫酸第一アンモニウム（Ｆｅ２＋）及び１ｍＭ ＤＴＴ中に含有し、Ｔａｈｉｌｉａｎｉ ｅｔ ａｌ，（２００９）Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ５－Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｔｏ ５－Ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｉｎ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＤＮＡ ｂｙ ＭＬＬ Ｐａｒｔｎｅｒ ＴＥＴ１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２４（５９２９）：９３０－９３５．に記載されているように、３７℃で３時間インキュベートする。得られた核酸を、例えばＳＰＲＩによって精製する。反応混合物のアリコートを、実施例７に記載されるようにラッカーゼと共にインキュベートする。
本発明を特定の実施例を参照して詳細に説明したが、本発明の範囲内で種々の変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載された例によって限定されるべきではなく、以下に提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。
実施例９：ＴＥＴ活性を５ｈｍＣ／５ｆＣに調節するためのアミン緩衝触媒の使用。
アミン緩衝触媒がＴＥＴ活性を調節して５ｍＣを５ｈｍＣ／５ｆＣに酸化することができるかどうかを決定するために研究を行った。これを研究するために、５ｍＣを含有する１μｇの二重鎖ＤＮＡを、特定の緩衝液条件で触媒の存在下又は非存在下、３７℃で１時間、３．２μＭ ＮｇＴＥＴで酸化した。一実験では、触媒である２－アミノ－５－メトキシ安息香酸（ＡＭＢＡ）を添加して、リン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ５．２を有する緩衝液中でＴＥＴ活性を調節した（結果を図９Ａに示す）。図９Ａの上のグラフは、ＡＭＢＡを含まないＴＥＴを示し、図９Ａの中央のグラフは、５ｍＭのＡＭＢＡを含むＴＥＴを示し、図９Ａの下のグラフは、１０ ｍＭのＡＭＢＡを含むＴＥＴを示す。図９Ａは、ＡＭＢＡが、望ましくない５ｃａＣ生成物の過度の蓄積なしに、用量依存的に５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＴＥＴ媒介性酸化を効率的に促進することを示す。別の実験では、触媒である２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩（ＡＭＩ）を添加して、Ｔｒｉｓを含有し、ｐＨ８を有する緩衝液中でＴＥＴ活性を調節した（結果を図９Ｂに示す）。図９Ｂの上のグラフは、ＡＭＩを含まないＴＥＴを示し、図９Ｂの中央のグラフは、５ｍＭのＡＭＩを含むＴＥＴを示し、図９Ｂの下のグラフは、１０ ｍＭのＡＭＩを含むＴＥＴを示す。図９Ｂは、ＡＭＩが、望ましくない５ｃａＣ生成物の過度の蓄積なしに、用量依存的に５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＴＥＴ媒介性酸化を効率的に促進することを示す。したがって、これらの研究は、緩衝液中のアミン触媒、ＡＭＢＡ及びＡＭＩが、ＴＥＴの存在下で、５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへの酸化に有利であることを実証している。
アミン緩衝触媒がＴＥＴ活性を調節して５ｍＣを５ｈｍＣ／５ｆＣに酸化することができるかどうかを決定するために研究を行った。これを研究するために、５ｍＣを含有する１μｇの二重鎖ＤＮＡを、特定の緩衝液条件で触媒の存在下又は非存在下、３７℃で１時間、３．２μＭ ＮｇＴＥＴで酸化した。一実験では、触媒である２－アミノ－５－メトキシ安息香酸（ＡＭＢＡ）を添加して、リン酸ナトリウムを含有し、ｐＨ５．２を有する緩衝液中でＴＥＴ活性を調節した（結果を図９Ａに示す）。図９Ａの上のグラフは、ＡＭＢＡを含まないＴＥＴを示し、図９Ａの中央のグラフは、５ｍＭのＡＭＢＡを含むＴＥＴを示し、図９Ａの下のグラフは、１０ ｍＭのＡＭＢＡを含むＴＥＴを示す。図９Ａは、ＡＭＢＡが、望ましくない５ｃａＣ生成物の過度の蓄積なしに、用量依存的に５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＴＥＴ媒介性酸化を効率的に促進することを示す。別の実験では、触媒である２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩（ＡＭＩ）を添加して、Ｔｒｉｓを含有し、ｐＨ８を有する緩衝液中でＴＥＴ活性を調節した（結果を図９Ｂに示す）。図９Ｂの上のグラフは、ＡＭＩを含まないＴＥＴを示し、図９Ｂの中央のグラフは、５ｍＭのＡＭＩを含むＴＥＴを示し、図９Ｂの下のグラフは、１０ ｍＭのＡＭＩを含むＴＥＴを示す。図９Ｂは、ＡＭＩが、望ましくない５ｃａＣ生成物の過度の蓄積なしに、用量依存的に５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＴＥＴ媒介性酸化を効率的に促進することを示す。したがって、これらの研究は、緩衝液中のアミン触媒、ＡＭＢＡ及びＡＭＩが、ＴＥＴの存在下で、５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへの酸化に有利であることを実証している。
まとめると、これらの研究は、アミン触媒（２－アミノ－５－メトキシ安息香酸（ＡＭＢＡ）及び２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩（ＡＭＩ）等）が５ｍＣのＴＥＴ媒介酸化を促進して５ｈｍＣ種及び５ｆＣ種の生成を促進するのに有用であり得るが、５ｃａＣ種への完全な酸化を妨げることを示唆している。したがって、アミン触媒（２－アミノ－５－メトキシ安息香酸（ＡＭＢＡ）及び２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩（ＡＭＩ）など）は最終的に有用であり、最終的にチミン生成を促進することによって５ｍＣ及び５ｈｍＣ種を検出するためのワークフローで採用され得る。
実施例１０：３時間以内という早期のラッカーゼ酵素による５ｈｍＣの酸化による５ｆＣ種の検出及び蓄積。
研究は、ラッカーゼ酵素が２２時間後に５ｈｍＣを５ｆＣに変換することを示す。５ｆＣを２２時間より早く／速く検出できるかどうかを決定するために研究を行った。この目的のため、ラッカーゼ（２ｍｇのラッカーゼカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（シグマカタログ番号３８４２９）由来）が５０ｎＭの５ｈｍＣ含有オリゴヌクレオチド基質から５ｈｍＣを酸化する能力を、１．６ｍｇ（１０μＭ）、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）及び１５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の存在下、２つの異なる温度（２５℃及び３７℃）で試験した。採用した５ｈｍＣ含有オリゴヌクレオチドの配列を図１０に示す。図１０は、５ｈｍＣのラッカーゼ酸化によって生成／蓄積された有意な量の５ｆＣが、２５℃及び３７℃で３時間という早い時間に検出され得ることを示す。
研究は、ラッカーゼ酵素が２２時間後に５ｈｍＣを５ｆＣに変換することを示す。５ｆＣを２２時間より早く／速く検出できるかどうかを決定するために研究を行った。この目的のため、ラッカーゼ（２ｍｇのラッカーゼカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）（シグマカタログ番号３８４２９）由来）が５０ｎＭの５ｈｍＣ含有オリゴヌクレオチド基質から５ｈｍＣを酸化する能力を、１．６ｍｇ（１０μＭ）、２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）及び１５０μｌの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．２）の存在下、２つの異なる温度（２５℃及び３７℃）で試験した。採用した５ｈｍＣ含有オリゴヌクレオチドの配列を図１０に示す。図１０は、５ｈｍＣのラッカーゼ酸化によって生成／蓄積された有意な量の５ｆＣが、２５℃及び３７℃で３時間という早い時間に検出され得ることを示す。
これらの研究は、ラッカーゼが、望ましくない５ｃａＣの望ましくない蓄積／変換なしに、２５℃及び３７℃のいずれかで、３時間以内に５ｈｍＣを５ｆＣに変換するのに効率的であることを実証している（図１０に示される）。したがって、これらの研究は、ラッカーゼが、その後にチミンに変換され得る５ｆＣへの変換を促進することによって、メチル化種（例えば、５ｈｍＣ）を検出するための重要な酵素として採用され得ることを示す。
実施例１１：５ｆＣから５ｆＣ－Ｍ付加物への変換におけるマロノニトリル活性の最適化。
５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換する際のマロノニトリル活性を最適化するために、ここで研究を行った。
５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換する際のマロノニトリル活性を最適化するために、ここで研究を行った。
特に、ここでは、高温が５ｆＣから５ｆＣ－Ｍ付加物へのマロノニトリル媒介性変換の反応を加速できるかどうかを決定するための研究を行った。当技術分野における以前の研究は、マロノニトリルを採用して５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換できることを実証しているが、これらの研究は、３７℃、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中、２０時間行われた（米国特許第１０，５１９，１８４号及び米国特許出願公開第２０２０／０１６５６６１号を参照）。高温の影響を評価するために、３３μＭの５ｆＣを、異なる温度及びインキュベーション時間（４０℃で１時間、６０℃で１時間、９５℃で１０分）で、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ中の１００ｍＭマロニニトリルに添加した。結果を図１１Ａに示す。図１１Ａは、様々な緩衝液条件下での５ｆＣから５ｆＣ－Ｍへの付加物の変換に対するマロノニトリルの効果のＬＣ－ＭＳデータを示す。図１１Ａの上のグラフは、４０℃で１時間の緩衝液条件を示し、図１１Ａの中央のグラフは、６０℃で１時間の緩衝駅条件を示し、図１１Ａの下のグラフは、９５℃で１０分間の緩衝液条件を示す。図１１Ａは、１時間後の高温（６０℃）での５ｆＣ－Ｍ付加物の劇的な蓄積を示す。図１１Ａはまた、わずか１０分後の高温（９５℃）での５ｆＣ－Ｍ付加物の劇的な蓄積を示す（但し、分解生成物の存在を伴う）。したがって、図１１Ａは、５ｆＣから５ｆＣ－Ｍ付加物への変換におけるマロノニトリル活性が高温（６０℃）で最適化されることを示しており、これは当該技術分野に対する有意な改良を表す。
別の研究では、５ｆＣから５ｆＣ－Ｍ付加物への変換のマロノニトリル活性に対する、二本鎖核酸を前変性させるＮａＯＨの効果を評価した。その目的のため、３０分間で、過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）中のマロノニトリル及びＮａＯＨの存在下で、２つの異なる合成５ｆＣオリゴヌクレオチド（ＣＧＡ及びＣＧＣ）を基質として採用した。５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換する際のマロノニトリル活性を評価し、結果を図１１Ｂに示す。図１１Ｂは、３０分するとすぐにＮａＯＨの存在下で有意なマロノニトリル活性を示す。これらの研究は、マロノニトリル活性がＮａＯＨ前変性によって増強されることを実証している。
さらに、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ緩衝液を使用して、ｐＨ８、６０℃で一本鎖ＤＮＡ上で短いインキュベーション時間（１．５時間）でもマロノニトリル活性を最適化できる可能性が高い。Ｔｒｉｓ（例えば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ）の量の上昇／増加、及び高温（例えば、５０Ｃ～６０Ｃ）では、反応の加速、及びマロニニトリル活性効率の改良がもたらされると考えられる（データは示さず）。さらに、過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（ＴＥＭＰＯ）（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）成分を添加すると、反応効率を高めることができる可能性もある（データは示さず）。
まとめると、これらの研究は、マロノニトリル活性を以下によって最適化できることを実証している：（ｉ）インキュベーション温度を上昇させること（６０℃まで）、（ｉｉ）ｐＨ８のＴｒｉｓ（例えば、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ）高緩衝液を使用することによって一本鎖ＤＮＡ上でのインキュベーション時間を短縮すること（１．５時間まで）、（ｉｉｉ）ＮａＯＨを使用する前変性工程を採用すること（これは二本鎖ＤＮＡ上でのインキュベーションを短縮することができる）、並びに（ｉｖ）過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）成分を添加すること（反応効率を高めることができる）。したがって、オリゴヌクレオチド試料中のメチル化種を検出する能力は、いくつかの方法でマロノニトリル活性を最適化することによって改良／増強することができる。
実施例１２：過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）の最適化。
５ｈｍＣから５ｆＣへのＣｕＴＥＭＰＯ媒介酸化に対するその効果を評価するために、過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）反応条件を最適化するための研究を行った。当技術分野における以前の研究は、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ反応が室温で４８時間もの長時間にわたって起こることを実証した（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，”ＤＮＡ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ－ｃｔａｌｙｚｅｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，” Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５３：５７５６－５７５９（２０１７を参照）。これらの研究は、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ反応を２２時間に短縮することができるかどうかを評価するために行われた。これを評価するために、以下の試薬を組み合わせた：４９μｌのＨ２Ｏ、１０μｌのＣｕ（ＣｌＯ４）２（１００ｍＭ）、１５μｌのＢｉＰｙｒ（１００ｍＭ）、１０μｌのＴＥＭＰＯ（１００ｍＭ）、１０μｌのＮａＯＨ（５０ｍＭ）、及び６μｌのｈＭＣ（１６９μＭ）を、ジメチルアミノエチルヒドラジン（ＤＭＡＥＨ）の存在下又は非存在下で（５ｆＣでのみ反応する）、２５℃で２２時間、５００ｒｐｍで混合した。結果を図１２に示す。図１２の上のグラフは、５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ酸化を示し、図１２の下のグラフは、ＤＭＡＥＨを使用した上のグラフからの生成物の誘導体化を示す。
５ｈｍＣから５ｆＣへのＣｕＴＥＭＰＯ媒介酸化に対するその効果を評価するために、過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）反応条件を最適化するための研究を行った。当技術分野における以前の研究は、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ反応が室温で４８時間もの長時間にわたって起こることを実証した（例えば、Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ ａｌ．，”ＤＮＡ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ－ｃｔａｌｙｚｅｄ ５－ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ，” Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５３：５７５６－５７５９（２０１７を参照）。これらの研究は、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ反応を２２時間に短縮することができるかどうかを評価するために行われた。これを評価するために、以下の試薬を組み合わせた：４９μｌのＨ２Ｏ、１０μｌのＣｕ（ＣｌＯ４）２（１００ｍＭ）、１５μｌのＢｉＰｙｒ（１００ｍＭ）、１０μｌのＴＥＭＰＯ（１００ｍＭ）、１０μｌのＮａＯＨ（５０ｍＭ）、及び６μｌのｈＭＣ（１６９μＭ）を、ジメチルアミノエチルヒドラジン（ＤＭＡＥＨ）の存在下又は非存在下で（５ｆＣでのみ反応する）、２５℃で２２時間、５００ｒｐｍで混合した。結果を図１２に示す。図１２の上のグラフは、５ｍＣから５ｈｍＣ／５ｆＣへのＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ酸化を示し、図１２の下のグラフは、ＤＭＡＥＨを使用した上のグラフからの生成物の誘導体化を示す。
したがって、これらのデータは、過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）反応を２２時間に短縮できることを示しており、これは当技術分野に対する改良を表す。
実施例１３：５ｆＣ－Ｍ付加物のチミン（Ｔ）への変換についてポリメラーゼ活性を最適化するための緩衝液条件
ポリメラーゼ酵素は、図１３Ａに示されるように、５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換する工程を媒介する。５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換に対する緩衝液の効果を評価するために研究を行った。そのため、標準緩衝液（「緩衝液Ａ」）を最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）と比較した。最適化緩衝液ＤＯＥ＿１の成分を図１３Ｂに示す。「ＣＧＡ」又は「ＣＧＣ」の状況で精製５ｆＣ－Ｍ付加物を含有するオリゴヌクレオチドを、標準緩衝液（「緩衝液Ａ」）又は最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）中でポリメラーゼを用いて増幅する。図１３Ｃは、標準緩衝液（「ＢｕｆｆｅｒＡ」）及び最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）を使用した５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換を示すデータを示す。特に、図１３Ｃは、５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換が、標準緩衝液と比較して最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）で増加／増強されることを示す。実際、図１３Ｃが示すように、「ＣＧＡ」の場合、最適化された緩衝液（９４．１２）による変換速度は、標準緩衝液（７６．９４）による変換速度よりも著しく大きく、「ＣＧＣ」の場合、最適化された緩衝液（８６．２８）による変換速度は、標準緩衝液（６９．４６）による変換速度よりも著しく大きい。したがって、これらの研究は、標準緩衝液と比較して最適化緩衝液の存在下でポリメラーゼ活性が増強されることを実証している。
ポリメラーゼ酵素は、図１３Ａに示されるように、５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換する工程を媒介する。５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換に対する緩衝液の効果を評価するために研究を行った。そのため、標準緩衝液（「緩衝液Ａ」）を最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）と比較した。最適化緩衝液ＤＯＥ＿１の成分を図１３Ｂに示す。「ＣＧＡ」又は「ＣＧＣ」の状況で精製５ｆＣ－Ｍ付加物を含有するオリゴヌクレオチドを、標準緩衝液（「緩衝液Ａ」）又は最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）中でポリメラーゼを用いて増幅する。図１３Ｃは、標準緩衝液（「ＢｕｆｆｅｒＡ」）及び最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）を使用した５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換を示すデータを示す。特に、図１３Ｃは、５ｆＣ－Ｍ付加物のＴへの変換が、標準緩衝液と比較して最適化緩衝液（「ＤＯＥ＿１」）で増加／増強されることを示す。実際、図１３Ｃが示すように、「ＣＧＡ」の場合、最適化された緩衝液（９４．１２）による変換速度は、標準緩衝液（７６．９４）による変換速度よりも著しく大きく、「ＣＧＣ」の場合、最適化された緩衝液（８６．２８）による変換速度は、標準緩衝液（６９．４６）による変換速度よりも著しく大きい。したがって、これらの研究は、標準緩衝液と比較して最適化緩衝液の存在下でポリメラーゼ活性が増強されることを実証している。
まとめると、これらの研究は、５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換するポリメラーゼ活性を最適化緩衝液で高めることができることを示す。これは、改良されたポリメラーゼ活性のための改良された緩衝液を使用して、オリゴヌクレオチド試料中のメチル化種を検出するための方法を改良することができることを意味する。
Claims (15)
- 試料由来の標的核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、前記ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、前記標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、前記マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程、並びに
（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む前記核酸を配列決定する工程であって、工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む前記核酸において、５ｈｍＣが前記標的核酸中に元々存在した位置でＴが検出される場合、前記標的核酸中で５ｈｍＣが検出されている、工程（ｃ）の１つ以上のＴを含む前記核酸を配列決定する工程
を含む、方法。 - 工程（ａ）において、前記標的核酸をラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触させる、請求項１に記載の方法。
- 工程（ａ）と工程（ｂ）との間に追加の工程を更に含み、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の前記追加の工程が、１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をＮａＯＨと接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
- 試料由来の標的核酸中の５－メチルシトシン（５ｍＣ）を検出するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程であって、前記ＴＥＴが、５ｍＣを５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に変換し、それにより１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成する、前記標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む前記核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、前記ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む前記核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、前記マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－マロノニトリル付加物（５５ｆＣ－Ｍ付加物）に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成する、工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程、並びに
（ｅ）工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程であって、工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む前記核酸において、５ｈｍＣが前記標的核酸中に元々存在した位置でＴが検出される場合、前記標的核酸中で５ｈｍＣが検出されている、工程（ｄ）の１つ以上のＴを含む核酸を配列決定する工程
を含む、方法。 - 工程（ａ）が反応混合物中で行われ、前記反応混合物がアミン触媒を含む緩衝液を含み、前記触媒が、好ましくは２－アミノ－５－メトキシ安息香酸又は２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩である、請求項４に記載の方法。
- 工程（ｂ）において、前記標的核酸をラッカーゼと接触させる、請求項４に記載の方法。
- 工程（ａ）及び工程（ｂ）が単一の工程で組み合わされ、前記反応混合物が緩衝液を含み、前記緩衝液がＴＥＴ及びラッカーゼの両方を含む、請求項６に記載の方法。
- 工程（ｂ）において、前記標的核酸をＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触させる、請求項４に記載の方法。
- 工程（ｂ）と工程（ｃ）との間に追加の工程を更に含み、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間の前記追加の工程が、１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をＮａＯＨと接触させることを含む、請求項４に記載の方法。
- 試料由来の標的核酸中の５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、前記ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、前記標的核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、前記マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－Ｍ付加物に変換し、それにより１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程、並びに
（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成し、標的核酸中の前記５ｈｍＣがＴに変換されている、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程
を含む、方法。 - 工程（ａ）において、前記標的核酸をラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触させる、請求項１０に記載の方法。
- 工程（ａ）と工程（ｂ）との間に追加の工程を更に含み、工程（ａ）と工程（ｂ）との間の前記追加の工程が、１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をＮａＯＨと接触させることを含む、請求項１０に記載の方法。
- 試料由来の標的核酸中の５－メチルシトシン（５ｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換するための方法であって、前記方法が、
（ａ）前記標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程であって、前記ＴＥＴが、５ｍＣを５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）に変換し、それにより１つ以上の５ｈｍＣを含む核酸を生成する、前記標的核酸を１０－１１転座（ＴＥＴ）と接触させる工程、
（ｂ）工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む前記核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程であって、前記ラッカーゼ又はＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯが５ｈｍＣを５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）に変換し、それにより１つ以上の５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）を含む核酸を生成する、工程（ａ）の１つ以上の５ｈｍＣを含む前記核酸をラッカーゼ又は過塩素酸銅（ＩＩ）及び２，２，６，６－テトラメチルピペリジン－１－オキシル（Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯ）と接触させる工程、
（ｃ）工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程であって、前記マロノニトリルが５ｆＣを５ｆＣ－マロノニトリル付加物（５ｆＣ－Ｍ付加物）に変換し、それにより、１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む核酸を生成する、工程（ｂ）の１つ以上の５ｆＣを含む前記核酸をマロノニトリルと接触させる工程、
（ｄ）工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程であって、前記ポリメラーゼが５ｆＣ－Ｍ付加物をチミン（Ｔ）に変換し、それにより、１つ以上のＴを含む核酸を生成し、標的核酸中の前記５ｍＣがＴに変換されている、工程（ｃ）の１つ以上の５ｆＣ－Ｍ付加物を含む前記核酸をポリメラーゼと接触させる工程
を含む、方法。 - 工程（ａ）が反応混合物中で行われ、前記反応混合物が、好ましくは２－アミノ－５－メトキシ安息香酸又は２－（アミノメチル）イミダゾール二塩酸塩であるアミン触媒を含む緩衝液を含む、請求項１３に記載の方法。
- 工程（ｂ）において、前記標的核酸をＣｕ（ＩＩ）／ＴＥＭＰＯと接触させる、請求項１３に記載の方法。
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