JP2020513801A - メチル化状態が維持されるdna増幅方法 - Google Patents
メチル化状態が維持されるdna増幅方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2020513801A JP2020513801A JP2019548944A JP2019548944A JP2020513801A JP 2020513801 A JP2020513801 A JP 2020513801A JP 2019548944 A JP2019548944 A JP 2019548944A JP 2019548944 A JP2019548944 A JP 2019548944A JP 2020513801 A JP2020513801 A JP 2020513801A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- double
- dna
- stranded dna
- methylated
- cancer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
- C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
- C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
- C12Y201/01037—DNA (cytosine-5-)-methyltransferase (2.1.1.37)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/154—Methylation markers
Abstract
Description
本願は、2017年3月8日に出願された米国仮特許出願第62/468,595号に基づく優先権を主張し、当該米国仮特許出願の内容全体をあらゆる目的のために参照により援用するものである。
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられた5DP1CA186693を基に、政府援助を得てなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
Cheung, V.G. and S.F. Nelson, Whole genome amplification using a degenerate oligonucleotide primer allows hundreds of genotypes to be performed on less than one nanogram of genomic DNA, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1996. 93(25): p. 14676-9;
Telenius, H., et al., Degenerate oligonucleotide-primed PCR: general amplification of target DNA by a single degenerate primer, Genomics, 1992. 13(3): p. 718-25;
Zhang, L., et al., Whole genome amplification from a single cell: implications for genetic analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89(13): p. 5847-51;
Lao, K., N.L. Xu, and N.A. Straus, Whole genome amplification using single-primer PCR, Biotechnology Journal, 2008, 3(3): p. 378-82;
Dean, F.B., et al., Comprehensive human genome amplification using multiple displacement amplification, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2002. 99(8): p. 5261-6;
Lage, J.M., et al., Whole genome analysis of genetic alterations in small DNA samples using hyperbranched strand displacement amplification and array-CGH, Genome Research, 2003, 13(2): p. 294-307;
Spits, C., et al., Optimization and evaluation of single-cell whole-genome multiple displacement amplification, Human Mutation, 2006, 27(5): p. 496-503;
Gole, J., et al., Massively parallel polymerase cloning and genome sequencing of single cells using nanoliter microwells, Nature Biotechnology, 2013. 31(12): p. 1126-32;
Jiang, Z., et al., Genome amplification of single sperm using multiple displacement amplification, Nucleic Acids Research, 2005, 33(10): p. e91;
Wang, J., et al., Genome-wide Single-Cell Analysis of Recombination Activity and De Novo Mutation Rates in Human Sperm, Cell, 2012. 150(2): p. 402-12;
Ni, X., Reproducible copy number variation patterns among single circulating tumor cells of lung cancer patients, PNAS, 2013, 110, 21082-21088;
Navin, N., Tumor evolution inferred by single cell sequencing, Nature, 2011, 472 (7341):90-94;
Evrony, G.D., et al., Single-neuron sequencing analysis of l1 retrotransposition and somatic mutation in the human brain, Cell, 2012. 151(3): p. 483-96;及び、
McLean, J.S., et al., Genome of the pathogen Porphyromonas gingivalis recovered from a biofilm in a hospital sink using a high-throughput single-cell genomics platform, Genome Research, 2013. 23(5): p. 867-77。
国際公開第2012/166425号、米国特許第7,718,403号、米国特許出願公開第2003/0108870号及び米国特許第7,402,386号には、全ゲノム増幅の態様を対象とした方法が報告されている。
1つの態様によれば、DNA試料は、ゲノムDNA、顕微解剖された染色体DNA、酵母人工染色体(YAC)DNA、プラスミドDNA、コスミドDNA、ファージDNA、P1由来人工染色体(PAC)DNA、又はバクテリア人工染色体(BAC)DNA、ミトコンドリアDNA、葉緑体DNA、法医学試料DNA、又は試験対象である天然供給源若しくは人工的供給源に由来する他のDNAである。別の好ましい実施形態では、DNA試料は哺乳類DNA、植物DNA、酵母DNA、ウイルスDNA、又は原核生物DNAである。さらに別の好ましい実施形態では、DNA試料はヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、げっ歯類、トリ、魚、エビ、植物、酵母、ウイルス、又は細菌から得られる。DNA試料はゲノムDNAであることが好ましい。
(プロトコル)
以下の一般プロトコルが単一細胞全メチローム増幅に有用である。単一細胞の単離は、マウスピペッティング、レーザーダイセクション、マイクロ流体デバイス、フローサイトメトリーなどによって実行できる。
単一細胞を、FACSソーティング又はマウスピペッティングにより、2.5μLの溶解緩衝液中に入れる。この溶解緩衝液は以下を含有する:1.825μLのH2O、0.05μLの1M TEバッファー(pH8.0)、0.05μLの1M KCL、0.375μLの0.1M DTT、0.075μLの10%Triton X−100、0.125 20mg/ml Protease Q (キアゲン社)。溶解反応は以下の熱サイクルで行う:50℃20分間、75℃20分間、80℃5分間。溶解後、dsDNAが単一細胞から放出される。
タグメンテーション用にTn5トランスポゾン複合体を以下の通りに調製する。1μLの精製された5μM Tn5 Proteinを、1μLの5μM Tn5 dsDNAと混合する。25℃で45分間インキュベートする。98μLのTn5 Dilution Bufferを2μLの前記トランスポゾン混合物に添加して、0.05μM Tn5複合体を得る。前記Tn5 Dilution Bufferは、10μLの1M TEバッファー(pH8.0)、4μLの0.5M NaCl、及び84μLのH2Oを含む。Tn5 dsDNAは、上側鎖の5’−CAT TAC GAG CGA GAT GTG TAT AAG AGA CAG−3’と、下側鎖の5’−Phos−CTG TCT CTT ATA CAC ATC invdT−3’とを含む。2.5μLの細胞溶解物に、1.5μLの0.05μM Tn5トランスポゾン複合体、1μLの5×Tn5 Insertion Bufferを添加する。Tn5 Insertion Bufferの1×バッファー条件には、10mMトリス塩酸、5mM MgCl2、25℃でpH7.8が含まれる。5μLの反応系を50℃で10分間インキュベートする。1μLの1mg/μL ProteaseQ(キアゲン社)を前記反応系に添加し、以下の熱サイクルでインキュベートする:50℃、20分間及び70℃、30分間。得られるdsDNAは、30bpのDNAプライミング部位が両端に付加され、3’末端に9bpのギャップを残して、500bp〜1000bpの長さになるはずである。
9bpのギャップを充填するため、鎖置換活性を有するDeep Vent (exo−) Polymeraseを用いてこのギャップを修復する。ギャップ修復後、DNA断片を熱変性させる。得られたssDNAは、相補的な末端を有するため、ステムループ構造を形成する。このステムループ構造体を増幅するため、アニーリング温度を逓減させるシングルプライマーPCR反応を行う。6μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、配列5’−CAT TAC GAG CGA GAT GTG TAT AAG AGA CAG−3’を有する、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、0.2μLの100mM MgSO4、及び2.3μLのH2Oを添加する。1×PCRバッファー条件は、20mMトリス塩酸、10mM KCL、0.1%Trition X−100、25℃でpH7.8を含む。10μLの前記反応に対して、以下の熱サイクルを実行する:72℃10分間、95℃3分間、68℃60秒間、67℃60秒間、66℃60秒間、65℃60秒間、64℃60秒間、63℃60秒間、62℃60秒間、61℃60秒間、60℃60秒間、59℃60秒間、58℃60秒間、及び72℃3分間。これによりヘミメチル化dsDNA断片が得られる。
次に、得られた伸長産物をDNMTと共にインキュベートする。EDTAを添加してMg2+をキレート化する。10μLの反応系に、1.5μLの10× Methyl−Transfer(MT) Buffer、0.15μLの160μM SAM、0.15μLの100μg/ml BSA、0.3μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.9μLのH2Oを添加する。MERLOT MT Bufferの1×バッファー条件は、20mMトリス塩酸、1mM DTT、5%グリセロール、25℃でpH7.8を含む。15μLの前記反応系を37℃で3時間インキュベートする。これにより、メチル化dsDNA断片が得られ、1サイクルの増幅、すなわちシングルプライマー伸長、及びメチル化が完了する。
さらに、1〜20サイクル、1〜10サイクル又は1〜5サイクルの増幅及びメチル化を所望により実行できる。熱サイクルは1サイクル目の増幅及びメチル化と同じである。2サイクル目、3サイクル目、4サイクル目、5サイクル目などの増幅及びメチル化ではそれぞれ以下の試薬を添加する。
15μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、0.55μLの100mM MgSO4、及び2.95μLのH2Oを添加する。
20μLの前記反応系に、1μLの10× Methyl−Transfer(MT) Buffer、0.25μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.325μLの100mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.15μLの100mM DTT、及び1.175μLのH2Oを添加する。
25μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、0.85μLの100mM MgSO4、及び2.65μLのH2Oを添加する。
30μLの前記反応系に、1μLの10×MERLOT Methyl−Transfer(MT) Buffer、0.35μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.475μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.25μLの100mM DTT、及び0.825μLのH2Oを添加する。
35μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、1.15μLの100mM MgSO4、及び2.35μLのH2Oを添加する。
40μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT) Buffer、0.45μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.625μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.35μLの100mM DTT、及び0.475μLのH2Oを添加する。
45μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、1.45μLの100mM MgSO4、及び2.05μLのH2Oを添加する。
50μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT) Buffer、0.55μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.775μLの100mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.45μLの100mM DTT、及び0.125μLのH2Oを添加する。
(キット)
本開示の方法に必要な材料及び試薬はキット内に一緒にまとめてもよい。本開示の単一細胞全ゲノムメチロームシーケンスのためのキットは、通常、必要に応じてプライマーセットと一緒に、特許請求された方法を実行するのに必要な、トランスポソーム(トランスポザーゼ酵素とトランスポゾンDNAとからなる)、ヌクレオチド、及びDNAポリメラーゼを少なくとも含む。前記キットはまた、DNMT1と、必要となるあらゆる緩衝液と、を含み、例えば、本明細書に記載されるような陽イオンを含有する緩衝液が挙げられる。前記キットは、メチル化工程の際にそのような陽イオンをキレート化するためのキレート化剤を含んでいてもよく、プライマー伸長を実行する際に反応媒質を補充するための陽イオンを含んでもよい。前記キットは、DNA試料からメチローム増幅物を作製するための指示書も含む。本開示の早期のがん診断のためのキットは、通常、特許請求された方法を実施するために必要な、選択されたプライマーセットと、ヌクレオチドと、DNAポリメラーゼとを少なくとも含む。前記キットはまた、DNMT1と、必要となるあらゆる緩衝液とを含む。前記キットは、セルフリーDNA試料から標的DNA領域を増幅するための指示書も含む。いずれの場合でも、キットはそれぞれの試薬、酵素又は反応物用の別々の容器を含むことが好ましい。通常、各試薬は各々の容器に分注されていることが好適である。キットの収容手段としては、通常、少なくとも1つのバイアル又は試験管が含まれる。フラスコ、ビン、及び試薬を入れ分注するための他の収容手段も含まれ得る。キットの個々の容器は、商業販売用にきつく密閉した状態で維持されることが好ましい。好適なより大型の容器としては、中に所望のバイアルが保持された、射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器が挙げられる。キットには説明書が備えられていることが好ましい。
(メチル基転移効率)
本明細書に記載の方法のメチル基転移効率を決定するために、バイサルファイトシーケンス法(MiSeq v2ケミストリーキット、2×150bpのペアエンドリード、総リード数1,000,000)を、10pgのHeLa由来フルメチル化gDNA、及び10pgのHeLa由来フルメチル化gDNAを本明細書に記載されるような1サイクルのシングルプライマー伸長及びDNMT1インキュベーションにかけて得られた増幅DNA、に対して実施した。ヒトゲノムに対して独自にアライメントされた全てのリードの中で、HeLa由来フルメチル化gDNAについては、98.7%のCpG配列内シトシンがメチル化されており、一方、10pgのHeLa由来フルメチル化gDNAを、本明細書に記載されるような、1サイクルのシングルプライマー伸長及びDNMT1インキュベーションにかけて得られた増幅DNAについては、93.60%のCpG配列内シトシンがメチル化されている。図2を参照されたい。このことは、DNMT1インキュベーションの際のメチル基転移効率が95.1%であることを示している。図3を参照されたい。
(メチル化解析に基づいた診断法)
本開示の態様は、がんなどの状態の診断又は予後予測に基づいている。1つの態様によれば、セルフリーDNAを含む血液試料が個人から採取される。このセルフリーDNAが、本明細書に記載の方法に従い処理及び解析され、がん細胞DNAと一致するメチル化パターンの同定に基づいてがん細胞DNAの有無が判定される。差示的メチル化標的遺伝子座のメチル化状態を増幅することにより、少量のセルフリー腫瘍DNAに対する捕捉感度が増加する。前記方法は以下を含む:(a)個人から採取された血液試料から得られたメチル化パターンを有する二本鎖DNA配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、各5’末端にプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること、(b)前記鋳型二本鎖DNA断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、(c)プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖DNA配列を得ること、(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列を処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること;工程(b)〜(d)を1〜5回繰り返して、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること;前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコンを、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること;メチル化シトシンパターンを決定すること;前記メチル化シトシンパターンを、がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること;並びに、前記決定されたメチル化シトシンパターンが前記がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること。
前記6μLの溶出物に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM MERLOTビオチン−プライマーミックス、0.2μLの100mM MgSO4、及び2.3μLのH2Oを添加する。1×MERLOT PCRバッファー条件は、20mMトリス塩酸、10mM KCL、0.1%Trition X−100、25℃でpH7.8、を含む。21種のプライマーの全てのアニーリング温度にまたがるように(58℃〜64℃)、10μLの前記反応系に対して以下の熱サイクルを実行する:94℃2分間、64℃60秒間、63℃60秒間、62℃60秒間、61℃60秒間、60℃60秒間、59℃60秒間、58℃60秒間、及び72℃3分間。これにより、一方の鎖がビオチンと結合しているヘミメチル化dsDNA断片が得られる。
10μLの前記反応系に、1.5μLの10×MERLOT Methyl−Transfer(MT)Buffer、0.15μLの160μM SAM、0.15μLの100μg/ml BSA、0.3μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、及び0.9μLのH2Oを添加する。MT Bufferの1×バッファー条件は、20mMトリス塩酸、1mM DTT、5%グリセロール、25℃でpH7.8を含む。15μLの前記反応系を37℃で3時間インキュベートする。これにより、メチル化dsDNA断片が得られ、1サイクルの増幅及びメチル化が完了となる。
さらに、1〜4サイクルの増幅及びメチル化を所望により実行できる。熱サイクルは1サイクル目の増幅及びメチル化と同じである。2サイクル目、3サイクル目、4サイクル目、5サイクル目の増幅及びメチル化ではそれぞれ以下の試薬を添加する。
15μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM MERLOTビオチン−プライマーミックス、0.55μLの100mM MgSO4、及び2.95μLのH2Oを添加する。
20μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT)Buffer、0.25μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.325μLの100mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.15μLの100mM DTT、及び1.175μLのH2Oを添加する。
25μLの前記反応系に、1μLの10×MERLOT PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM MERLOTビオチン−プライマーミックス、0.85μLの100mM MgSO4、2.65μLのH2Oを添加する。
30μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT)Buffer、0.35μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.475μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.25μLの100mM DTT、及び0.825μLのH2Oを添加する。
35μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM MERLOTビオチン−プライマーミックス、1.15μLの100mM MgSO4、及び2.35μLのH2Oを添加する。
40μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT)Buffer、0.45μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.625μLの200mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.35μLの100mM DTT、及び0.475μLのH2Oを添加する。
45μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、0.2μLの1μM MERLOTビオチン−プライマーミックス、1.45μLの100mM MgSO4、及び2.05μLのH2Oを添加する。
50μLの前記反応系に、1μLの10×Methyl−Transfer(MT)Buffer、0.55μLの160μM SAM、0.1μLの100μg/ml BSA、0.775μLの100mM EDTA、2μLの2U/μL DNMT1、0.45μLの100mM DTT、0.125μLのH2Oを添加する。
増幅及びメチル化されたdsDNAは、DNAアンプリコンの両端に結合したビオチン分子を含有する。標準的なDynabeads M−280 Streptavidin洗浄によりこのアンプリコンが濃縮され、20μLの溶出緩衝液に溶出される。この増幅された差示的メチル化遺伝子アンプリコンが、ザイモリサーチ社製EZ−Direct Bisulfite Kitの指示書に従って亜硫酸水素ナトリウムで処理される。バイサルファイト変換されたDNAは、メチル化特異的qPCR、NGSシーケンス、ピロシーケンス、サンガー法シーケンスなどのその後の解析に供することができる状態となる。前記遺伝子アンプリコンのメチル化状態をがん遺伝子の既知のメチル化状態、すなわち標準(スタンダード)と比較することで、一致の状態(すなわち、がん細胞DNAの既知のメチル化状態に類似したメチル化状態)によって、試験された初期試料中にがん細胞由来の核酸が存在しているかどうかが判定される。
(合成鋳型での増幅及びメチル化)
インビトロにおけるDNMT1の性能を試験するため、また、本明細書に記載の増幅反応及びメチル化感応に最適な反応緩衝液を開発するために、図5に示されるようなメチル化感受性制限酵素切断部位を含む、合成dsDNAを用いる。この87bpのdsDNAは6bpのClaIモチーフである5’−ATCGAT−3’を含有する。この87bpのdsDNAは、そのCpG部位がメチル化されていない場合、Claiとのインキュベーションにより2つの断片に切断される。CpG部位がメチル化されている場合、このdsDNAは切断されない。dsDNAの一方の鎖だけがメチル化シトシンを含む場合、Claiの切断速度は大幅に減少するが、反応時間が十分に長ければ飽和するまで断片化する。Claiと3時間インキュベートした後(飽和)、バイオアナライザで電気泳動にかけることにより、未変化のdsDNA鋳型の正確な割合が算出され、これにより、試料中のメチル化された鋳型の割合が示される。
上側鎖:5’−ACC TGT GAC TGA GAC ATC TGA AGG TGC AAT CAG GTG TCA GTC TTA AAG GAT CGA TAA GGA AGC GGA AGT AGT GGT CTC GTC GTA GTG−3’
下側鎖:5’−CAC TAC GAC GAG ACC ACT ACT TCC GCT TCC TTA TCG ATC CTT TAA GAC TGA CAC CTG ATT GCA CCT TCA GAT GTC TCA GTC ACA GGT−3’。
(実施形態)
本開示は、(a)メチル化パターンを有する二本鎖DNA配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、5’末端及び3’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること、(b)前記鋳型二本鎖DNA断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、(c)プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること;及び、(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、を含む、増幅されたメチロームの作製方法を提供する。
1つの態様によれば、前記方法は、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、及びメチル化シトシンパターンを解析すること、をさらに含む。
1つの態様によれば、工程(a)における断片化は、前記二本鎖DNA配列をトランスポソームライブラリーと接触させること、及び、トランスポゾンDNAと鋳型二本鎖DNA断片配列との間のギャップをギャップ充填して、各端にプライマー結合部位を有する鋳型二本鎖DNA断片配列のライブラリーを形成すること、によるものであり、前記ライブラリーの各トランスポソームはそれぞれ独自の付随バーコード配列を有しており、前記ライブラリーの各トランスポソームはトランスポザーゼ−トランスポゾンDNAのホモ二量体を含んでおり、前記ホモ二量体の各トランスポゾンDNAはトランスポザーゼ結合部位と、独自のバーコード配列と、プライマー結合部位と、を含んでおり、前記トランスポソームライブラリーが前記二本鎖DNA配列上に存在する標的部位群に結合して、前記トランスポザーゼが前記二本鎖DNA配列を前記鋳型二本鎖DNA断片配列群へと切断し、各鋳型二本鎖DNA断片配列はその各端に独自のバーコード配列対のうちの一方を含んでいる。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む。
工程(e)は、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
1つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはDNMT1である。
1つの態様によれば、前記トランスポザーゼはTn5トランスポザーゼ、Muトランスポザーゼ、Tn7トランスポザーゼ又はIS5トランスポザーゼである。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列はゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は単一細胞から得られた全ゲノムDNA、又はセルフリーDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は出生前細胞、がん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜20回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜10回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜5回繰り返される。
1つの態様によれば、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコンは、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理される。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBECファミリーの酵素である。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBEC3Aである。
1つの態様によれば、前記プライマーは遺伝子座特異的プライマーである。
1つの態様によれば、前記プライマーは疾患特異的プライマーである。
1つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
(b)前記鋳型二本鎖DNA断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
(c)がん特異的プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること、
前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること;
メチル化シトシンパターンを決定すること;
前記メチル化シトシンパターンを、がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること;
前記メチル化シトシンパターンと前記がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定すること;並びに
決定された前記メチル化シトシンパターンが前記がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること、
を含む、個人のがんを診断する方法を提供する。
1つの態様によれば、前記液体生検試料は血液試料、髄液試料又は尿試料である。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(e)は、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
1つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはDNMT1である。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBECファミリーの酵素である。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBEC3Aである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は単一細胞から得られた全ゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列はがん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜20回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜10回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜5回繰り返される。
1つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
1つの態様によれば、メチル化シトシンパターンの決定は、次世代シーケンシング、メチル化特異的qPCR、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む。
1つの態様によれば、前記がんは、胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである。
(b)前記二本鎖DNA配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
(c)ポリメラーゼと、ヌクレオチドと、がん細胞と正常細胞とが異なるメチル化パターンを有するゲノム領域群を標的とする選択されたプライマーセットと、を用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させることで、選択された差示的メチル化遺伝子座群のヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼで処理することで、対応する二本鎖DNA配列内のメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記選択された差示的メチル化遺伝子座のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
(f)前記フルメチル化アンプリコン群を、メチル化シトシン残基は変化させずにシトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、
(g)メチル化シトシンパターンを決定すること;
(h)セルフリーDNAのメチル化シトシンパターンと、異なるがん組織のメチル化シトシンパターンと、を比較し、前記セルフリーDNAのメチル化シトシンパターンと前記異なるがん組織のメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定し、セルフリー腫瘍DNAが前記試料中に存在するかどうかを判定することにより、前記試料中のセルフリー腫瘍DNAの有無を判定すること;及び、
(i)決定された前記メチル化シトシンパターンががん特異的なメチル化パターンを含む場合に、前記個人が特定の種類のがんを有すると診断すること、
を含む、個人のがんを早期に診断する方法を提供する。
1つの態様によれば、前記液体生検試料は血液試料、髄液試料又は尿試料である。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理はマグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(c)はマグネシウムイオンを含み、工程(d)の処理は、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む。
1つの態様によれば、工程(e)は、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む。
1つの態様によれば、前記メチルトランスフェラーゼはDNMT1である。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬は亜硫酸水素ナトリウムである。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBECファミリーの酵素である。
1つの態様によれば、前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬はAPOBEC3Aである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は単一細胞から得られた全ゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列はがん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである。
1つの態様によれば、前記二本鎖DNA配列は、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜20回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜10回繰り返される。
1つの態様によれば、工程(b)〜(d)は1〜5回繰り返される。
1つの態様によれば、前記プライマーはがん特異的プライマーである。
1つの態様によれば、メチル化シトシンパターンの決定は、次世代シーケンシング、メチル化特異的qPCR、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む。
1つの態様によれば、前記がんは、胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである。
タグメンテーション用にTn5トランスポゾン複合体を以下の通りに調製する。1μLの精製された5μM Tn5 Proteinを、1μLの5μM Tn5 dsDNAと混合する。25℃で45分間インキュベートする。98μLのTn5 Dilution Bufferを2μLの前記トランスポゾン混合物に添加して、0.05μM Tn5複合体を得る。前記Tn5 Dilution Bufferは、10μLの1M TEバッファー(pH8.0)、4μLの0.5M NaCl、及び84μLのH2Oを含む。Tn5 dsDNAは、上側鎖の5’−CAT TAC GAG CGA GAT GTG TAT AAG AGA CAG−3’(配列番号1)と、下側鎖の5’−Phos−CTG TCT CTT ATA CAC ATC invdT−3’(配列番号2)とを含む。2.5μLの細胞溶解物に、1.5μLの0.05μM Tn5トランスポゾン複合体、1μLの5×Tn5 Insertion Bufferを添加する。Tn5 Insertion Bufferの1×バッファー条件には、10mMトリス塩酸、5mM MgCl2、25℃でpH7.8が含まれる。5μLの反応系を50℃で10分間インキュベートする。1μLの1mg/μL ProteaseQ(キアゲン社)を前記反応系に添加し、以下の熱サイクルでインキュベートする:50℃、20分間及び70℃、30分間。得られるdsDNAは、30bpのDNAプライミング部位が両端に付加され、3’末端に9bpのギャップを残して、500bp〜1000bpの長さになるはずである。
9bpのギャップを充填するため、鎖置換活性を有するDeep Vent (exo−) Polymeraseを用いてこのギャップを修復する。ギャップ修復後、DNA断片を熱変性させる。得られたssDNAは、相補的な末端を有するため、ステムループ構造を形成する。このステムループ構造体を増幅するため、アニーリング温度を逓減させるシングルプライマーPCR反応を行う。6μLの前記反応系に、1μLの10×PCRバッファー、0.2μLのdNTP、0.1μLの2U/μL DeepVent exo−、配列5’−CAT TAC GAG CGA GAT GTG TAT AAG AGA CAG−3’(配列番号1)を有する、0.2μLの1μM 30bp ssDNAプライマー、0.2μLの100mM MgSO4、及び2.3μLのH2Oを添加する。1×PCRバッファー条件は、20mMトリス塩酸、10mM KCL、0.1%Trition X−100、25℃でpH7.8を含む。10μLの前記反応に対して、以下の熱サイクルを実行する:72℃10分間、95℃3分間、68℃60秒間、67℃60秒間、66℃60秒間、65℃60秒間、64℃60秒間、63℃60秒間、62℃60秒間、61℃60秒間、60℃60秒間、59℃60秒間、58℃60秒間、及び72℃3分間。これによりヘミメチル化dsDNA断片が得られる。
上側鎖:5’−ACC TGT GAC TGA GAC ATC TGA AGG TGC AAT CAG GTG TCA GTC TTA AAG GAT CGA TAA GGA AGC GGA AGT AGT GGT CTC GTC GTA GTG−3’(配列番号3)
下側鎖:5’−CAC TAC GAC GAG ACC ACT ACT TCC GCT TCC TTA TCG ATC CTT TAA GAC TGA CAC CTG ATT GCA CCT TCA GAT GTC TCA GTC ACA GGT−3’(配列番号4)。
Claims (61)
- (a)メチル化パターンを有する二本鎖DNA配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、5’末端及び3’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること、
(b)前記鋳型二本鎖DNA断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
(c)プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること;及び、
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
を含む、増幅されたメチロームの作製方法。 - 前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、及び
メチル化シトシンパターンを解析すること、
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 工程(a)における断片化が、
前記二本鎖DNA配列をトランスポソームライブラリーと接触させること、及び、
トランスポゾンDNAと鋳型二本鎖DNA断片配列との間のギャップをギャップ充填して、各端にプライマー結合部位を有する鋳型二本鎖DNA断片配列のライブラリーを形成すること、
によるものであり、
前記ライブラリーの各トランスポソームはそれぞれ独自の付随バーコード配列を有しており、
前記ライブラリーの各トランスポソームはトランスポザーゼ−トランスポゾンDNAのホモ二量体を含んでおり、前記ホモ二量体の各トランスポゾンDNAはトランスポザーゼ結合部位と、独自のバーコード配列と、プライマー結合部位と、を含んでおり、
前記トランスポソームライブラリーが前記二本鎖DNA配列上に存在する標的部位群に結合して、前記トランスポザーゼが前記二本鎖DNA配列を前記鋳型二本鎖DNA断片配列群へと切断し、
各鋳型二本鎖DNA断片配列はその各端に独自のバーコード配列対のうちの一方を含んでいる、
請求項1に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む、
請求項1に記載の方法。 - 工程(e)が、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記メチルトランスフェラーゼがDNMT1である、請求項1に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼが、Tn5トランスポザーゼ、Muトランスポザーゼ、Tn7トランスポザーゼ又はIS5トランスポザーゼである、請求項3に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項2に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列がゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が、単一細胞から得られた全ゲノムDNA、又はセルフリーDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が出生前細胞、がん細胞、又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜20回繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜10回繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜5回繰り返される、請求項1に記載の方法。
- 前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群が、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理される、請求項1に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBECファミリーの酵素である、請求項2に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBEC3Aである、請求項2に記載の方法。
- 前記プライマーが遺伝子座特異的プライマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーが疾患特異的プライマーである、請求項1に記載の方法。
- 前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項1に記載の方法。
- (a)個人由来の液体生検試料から得られた、メチル化パターンを有する二本鎖DNA配列を断片化することで、メチル化パターンを有し、且つ、5’末端及び3’末端のそれぞれにプライマー結合部位を含む、鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること、
(b)前記鋳型二本鎖DNA断片配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
(c)がん特異的プライマー、ポリメラーゼ及びヌクレオチドを用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させ、非メチル化相補鎖を作製することで、メチル化パターンを有する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群に対応するヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼとメチル基供給源とで処理することにより、対応する前記鋳型二本鎖DNA断片配列群におけるメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、フルメチル化鋳型二本鎖DNA断片配列群を作製すること;
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコンを作製すること、
前記鋳型二本鎖DNA断片配列群のフルメチル化アンプリコン群を、シトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること;
メチル化シトシンパターンを決定すること;
前記メチル化シトシンパターンを、がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと比較すること;
前記メチル化シトシンパターンと前記がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定すること;並びに
決定された前記メチル化シトシンパターンが前記がんDNAの標準的なメチル化シトシンパターンと一致している場合に前記個人をがんと診断すること、
を含む、個人のがんを診断する方法。 - 前記液体生検試料が血液試料、髄液試料又は尿試料である、請求項24に記載の方法。
- 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項24に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、マグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む、
請求項24に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む、
請求項24に記載の方法。 - 工程(e)が、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記メチルトランスフェラーゼがDNMT1である、請求項24に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項24に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBECファミリーの酵素である、請求項24に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBEC3Aである、請求項24に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が単一細胞から得られた全ゲノムDNAである、請求項24に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列ががん細胞又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである、請求項24に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである、請求項24に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜20回繰り返される、請求項24に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜10回繰り返される、請求項24に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜5回繰り返される、請求項24に記載の方法。
- 前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項24に記載の方法。
- メチル化シトシンパターンの決定が次世代シーケンシング、メチル化特異的qPCR、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む、請求項24に記載の方法。
- 前記がんが胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである、請求項24に記載の方法。
- (a)個人由来の液体生検試料から、正常な体細胞と比較して異なるメチル化パターンを有するセルフリー腫瘍DNAを含有する可能性のある、セルフリーDNA又はゲノムDNAを抽出すること、
(b)前記二本鎖DNA配列群をそれぞれ上下の鋳型鎖に分離すること、
(c)ポリメラーゼと、ヌクレオチドと、がん細胞と正常細胞とが異なるメチル化パターンを有するゲノム領域群を標的とする選択されたプライマーセットと、を用いて前記上下の鋳型鎖を伸長させることで、選択された差示的メチル化遺伝子座群のヘミメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(d)前記ヘミメチル化二本鎖DNA配列群をメチルトランスフェラーゼで処理することで、対応する二本鎖DNA配列内のメチル化シトシンに対応する位置にメチル基を付加して、選択された差示的メチル化遺伝子座群のフルメチル化二本鎖DNA配列群を得ること、
(e)工程(b)〜(d)を繰り返して、前記選択された差示的メチル化遺伝子座のフルメチル化アンプリコン群を作製すること、
(f)前記フルメチル化アンプリコン群を、メチル化シトシン残基は変化させずにシトシン残基をウラシルに変換するための試薬で処理すること、
(g)メチル化シトシンパターンを決定すること;
(h)セルフリーDNAのメチル化シトシンパターンと、異なるがん組織のメチル化シトシンパターンと、を比較し、前記セルフリーDNAのメチル化シトシンパターンと前記異なるがん組織のメチル化シトシンパターンとの間の差異を決定し、セルフリー腫瘍DNAが前記試料中に存在するかどうかを判定することにより、前記試料中のセルフリー腫瘍DNAの有無を判定すること;及び、
(i)決定された前記メチル化シトシンパターンががん特異的なメチル化パターンを含む場合に、前記個人が特定の種類のがんを有すると診断すること、
を含む、個人のがんを早期に診断する方法。 - 前記液体生検試料が血液試料、髄液試料又は尿試料である、請求項43に記載の方法。
- 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理がマグネシウムイオンをキレート化するためにキレート化剤を添加することを含む、
請求項43に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理がマグネシウムイオンをキレート化するためにEDTAを添加することを含む、請求項43に記載の方法。 - 工程(c)がマグネシウムイオンを含み、
工程(d)の処理が、メチルトランスフェラーゼにとって理想的な緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを等モル量でキレート化するようにEDTAを添加することを含む、
請求項43に記載の方法。 - 工程(e)が、反復される工程(c)において、プライマー伸長に理想的なプライマー伸長用緩衝液条件をつくるために、マグネシウムイオンを添加することを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記メチルトランスフェラーゼがDNMT1である、請求項43に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬が亜硫酸水素ナトリウムである、請求項43に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBECファミリーの酵素である、請求項43に記載の方法。
- 前記シトシン残基をウラシルに変換するための試薬がAPOBEC3Aである、請求項43に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が単一細胞から得られた全ゲノムDNAである、請求項43に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列ががん細胞又は循環腫瘍細胞に由来するゲノムDNAである、請求項43に記載の方法。
- 前記二本鎖DNA配列が、個人から採取された血液試料から得られたセルフリー腫瘍細胞ゲノムDNAである、請求項43に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜20回繰り返される、請求項43に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜10回繰り返される、請求項43に記載の方法。
- 工程(b)〜(d)が1〜5回繰り返される、請求項43に記載の方法。
- 前記プライマーががん特異的プライマーである、請求項43に記載の方法。
- メチル化シトシンパターンの決定が次世代シーケンシング、メチル化特異的qPCR、又はメチル化検出用マイクロアレイを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記がんが胸部の浸潤癌、結腸の腺癌、肝臓の肝細胞癌、前立腺の腺癌、胃の腺癌、及び子宮体部の子宮内膜癌からなる群から選択されるがんである、請求項43に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201762468595P | 2017-03-08 | 2017-03-08 | |
US62/468,595 | 2017-03-08 | ||
PCT/US2018/021453 WO2018165366A1 (en) | 2017-03-08 | 2018-03-08 | Methods of amplifying dna to maintain methylation status |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020513801A true JP2020513801A (ja) | 2020-05-21 |
Family
ID=63448826
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2019548944A Pending JP2020513801A (ja) | 2017-03-08 | 2018-03-08 | メチル化状態が維持されるdna増幅方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20200063213A1 (ja) |
EP (1) | EP3596098A4 (ja) |
JP (1) | JP2020513801A (ja) |
CN (1) | CN110741092A (ja) |
AU (1) | AU2018231240A1 (ja) |
CA (1) | CA3055817A1 (ja) |
IL (1) | IL269178A (ja) |
MX (1) | MX2019010655A (ja) |
RU (1) | RU2754038C2 (ja) |
WO (1) | WO2018165366A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2023507876A (ja) * | 2019-10-25 | 2023-02-28 | チャンピン ナショナル ラボラトリー | 哺乳類dnaのメチル化の検出及び分析 |
KR102261606B1 (ko) * | 2019-11-07 | 2021-06-07 | (주)지노믹트리 | 대장암 검출 방법 |
EP4065725A1 (en) * | 2019-11-26 | 2022-10-05 | Guardant Health, Inc. | Methods, compositions and systems for improving the binding of methylated polynucleotides |
RU2743586C1 (ru) * | 2020-04-30 | 2021-02-20 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГАОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России) | Способ определения эффективности обогащения NGS-библиотеки участками экзонов для секвенирования экзома человека |
JP2023535636A (ja) | 2020-07-30 | 2023-08-18 | ケンブリッジ エピジェネティックス リミテッド | 核酸解析のための組成物および方法 |
EP4278006A1 (en) * | 2021-01-12 | 2023-11-22 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Layered analysis of methylated biomarkers for use in cancer diagnosis and prognosis |
CN114045345B (zh) * | 2022-01-07 | 2022-04-29 | 臻和(北京)生物科技有限公司 | 基于游离dna的基因组癌变信息检测系统和检测方法 |
WO2024020410A1 (en) * | 2022-07-22 | 2024-01-25 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Systems and methods for dual-end sequencing |
CN116064797B (zh) * | 2022-08-29 | 2023-10-20 | 广州达健生物科技有限公司 | 一种子宫内膜癌基因甲基化水平检测试剂及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003080862A1 (en) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Epigenomics Ag | Method and devices for dna methylation analysis |
EP1568786A2 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-31 | Affymetrix, Inc. (A US Entity) | Analysis of methylation status using nucleic acid arrays |
WO2013090588A1 (en) * | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and kits for detection of methylation status |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7879580B2 (en) * | 2002-12-10 | 2011-02-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for high fidelity production of long nucleic acid molecules |
US7459274B2 (en) * | 2004-03-02 | 2008-12-02 | Orion Genomics Llc | Differential enzymatic fragmentation by whole genome amplification |
US20110171642A1 (en) * | 2008-02-27 | 2011-07-14 | Peter Maccallum Cancer Institute | Analysing Methylation Specific PCR by Amplicon Melting |
US20100167942A1 (en) * | 2008-12-23 | 2010-07-01 | New England Biolabs, Inc. | Compositions, Methods and Related Uses for Cleaving Modified DNA |
AU2012300196B2 (en) * | 2011-08-25 | 2017-12-07 | Clinical Genomics Pty. Ltd. | DNA methylation in colorectal and breast cancer diagnostic methods |
CN111621548A (zh) * | 2016-04-26 | 2020-09-04 | 序康医疗科技(苏州)有限公司 | 扩增dna的方法 |
-
2018
- 2018-03-08 JP JP2019548944A patent/JP2020513801A/ja active Pending
- 2018-03-08 RU RU2019131550A patent/RU2754038C2/ru active
- 2018-03-08 MX MX2019010655A patent/MX2019010655A/es unknown
- 2018-03-08 CA CA3055817A patent/CA3055817A1/en active Pending
- 2018-03-08 WO PCT/US2018/021453 patent/WO2018165366A1/en unknown
- 2018-03-08 US US16/488,658 patent/US20200063213A1/en not_active Abandoned
- 2018-03-08 EP EP18763235.1A patent/EP3596098A4/en not_active Withdrawn
- 2018-03-08 AU AU2018231240A patent/AU2018231240A1/en not_active Abandoned
- 2018-03-08 CN CN201880029791.7A patent/CN110741092A/zh active Pending
-
2019
- 2019-09-08 IL IL26917819A patent/IL269178A/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003080862A1 (en) * | 2002-03-25 | 2003-10-02 | Epigenomics Ag | Method and devices for dna methylation analysis |
EP1568786A2 (en) * | 2004-02-13 | 2005-08-31 | Affymetrix, Inc. (A US Entity) | Analysis of methylation status using nucleic acid arrays |
WO2013090588A1 (en) * | 2011-12-13 | 2013-06-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Methods and kits for detection of methylation status |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
NAT. PROTOC., vol. 8, no. 10, JPN6020049371, 2013, pages 2022 - 2032, ISSN: 0004650092 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2018231240A2 (en) | 2019-11-07 |
US20200063213A1 (en) | 2020-02-27 |
AU2018231240A1 (en) | 2019-10-31 |
RU2754038C2 (ru) | 2021-08-25 |
RU2019131550A (ru) | 2021-04-08 |
EP3596098A1 (en) | 2020-01-22 |
EP3596098A4 (en) | 2020-11-04 |
WO2018165366A1 (en) | 2018-09-13 |
CN110741092A (zh) | 2020-01-31 |
RU2019131550A3 (ja) | 2021-07-09 |
IL269178A (en) | 2019-11-28 |
MX2019010655A (es) | 2020-01-13 |
CA3055817A1 (en) | 2018-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2754038C2 (ru) | Способы амплификации днк для сохранения статуса метилирования | |
US11130991B2 (en) | Method for highly sensitive DNA methylation analysis | |
JP2010535513A (ja) | 高スループット亜硫酸水素dnaシークエンシングのための方法および組成物ならびに有用性 | |
CN117604082A (zh) | 分析核酸片段的方法 | |
US10876169B2 (en) | Method and kit for estimating the amount of a methylated locus in a sample | |
CN117778531A (zh) | 分子库制备方法以及其组合物和用途 | |
US20230056763A1 (en) | Methods of targeted sequencing | |
CN114391043B (zh) | 哺乳动物dna的甲基化检测及分析 | |
Tost | Current and emerging technologies for the analysis of the genome-wide and locus-specific DNA methylation patterns | |
JPWO2019199696A5 (ja) | ||
EP4022092A1 (en) | Compositions and methods for oncology precision assays | |
Zhao et al. | Method for highly sensitive DNA methylation analysis | |
WO2023225515A1 (en) | Compositions and methods for oncology assays |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191114 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20191120 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20201222 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210316 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210507 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210622 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20211130 |