JP2023507876A - 哺乳類ｄｎａのメチル化の検出及び分析 - Google Patents

Abstract

本開示は、ゲノムフラグメントのメチル化解析の方法を提供する。

Description

本発明の実施の形態は、概して、少量のＤＮＡ、例えば、少数の細胞～１００個の細胞又は単一細胞（a single cell）に由来するＤＮＡをシーケンシングする方法及び組成物に関する。

腫瘍増殖、幹細胞リプログラミング、記憶形成、胚発生等、細胞間変動及び集団の不均一性が重要な役割を果たす研究では、単一細胞レベルＤＮＡにて高カバー率で高精度な哺乳類ＤＮＡメチル化研究を行う能力が不可欠である。これは、分析対象の細胞試料が貴重又は希少であるか、試料が単一細胞、又は単一細胞ＤＮＡ若しくは無細胞ＤＮＡのゲノムの全体若しくは一部である場合等、微量の場合にも重要である。

ＤＮＡメチル化を単一塩基分解能で分析するには、ＤＮＡが化学変換又は酵素変換を経て、メチル化シトシン及び非メチル化シトシンを効果的に区別する必要がある。一般的な変換方法としては、限定されるものではないが、亜硫酸水素ナトリウム、ＴＥＴアシストピリジンボランシーケンシング（ＴＡＰＳ）、非特許文献１、非特許文献２が挙げられる。

全ての化学変換又は酵素変換における主要な課題は、変換と同時に発生するＤＮＡの損失又は損傷である。長いインキュベーション時間、高温、高バイサルファイト濃度、及び高い酸化性又は還元性環境等、完全な変換に必要な条件は、インキュベートされたＤＮＡの最大９０％の分解、ＤＮＡ塩基損傷、及び断片化につながる可能性がある。変換中の工程間又は工程後にＤＮＡ精製を行うと、ＤＮＡが最大９０％失われる可能性もある。広範なＤＮＡの損失及び損傷は問題であり、限られた量若しくは少量の開始ＤＮＡ、又は、更には単一細胞レベルのＤＮＡを扱う場合等には更に問題がある。低カバー率の単一細胞バイサルファイトシーケンシングは、単一細胞に対してバイサルファイト変換を直接行い、続いてＤＮＡ増幅を行うことによって達成された（非特許文献３、非特許文献４）。

化学変換又は酵素変換中のＤＮＡ損傷、及び変換と同時に起こるＤＮＡ精製中のＤＮＡ損失は、１００ｂｐ～４ｋｂのサイズの超音波処理されたラムダＤＮＡ等のキャリアＤＮＡを追加することによって大幅に減少する可能性がある。しかしながら、キャリアＤＮＡと標的化ＤＮＡを混合すると、後で区別できない試料の混合物が生じ、その後のメチル化の検出及び分析が困難になるか、又は失敗することさえある。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位は、ＤＮＡ増幅の或る特定の用途で使用されている。かかる方法では、標的ＤＮＡが同時に断片化され、タグが付けられ、下流処理のために所望のＤＮＡ配列でタグ付けされた断片が生成される。ライブラリーの調製方法として、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位はIllumina, IncのＮｅｘｔｅｒａ技術で利用されており、ＤＮＡを同時に断片化し、各フラグメントに次世代シーケンシングのための適切な配列がタグ付けされている（特許文献１）。単一細胞のゲノム及びエピゲノムを研究するためのツールとして、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転位はBuenrostro et al.によってクロマチンのアクセシビリティをプロファイルするために使用され（非特許文献５）、三次元染色体コンフォメーションを研究するためにRamani et al.によって使用され（非特許文献６）、単一細胞ゲノムを直接シーケンスライブラリーに増幅するためにZahn et al.（非特許文献７）によって使用されている。しかしながら、これらの方法は全て、元の標的核酸のおよそ５０％の損失を受ける。これは、２つのトランスポゾン配列（以後、Ａ及びＢとして表す）がタグ付けに使用されるために起こる。トランスポゾンＡ及びＢを標的ＤＮＡにタグ付けした後、４つの異なるタイプのＤＮＡフラグメントを作製することができ、これらのフラグメントは、各フラグメントの２つの末端にＡ－Ａ、Ｂ－Ｂ、Ａ－Ｂ、又はＢ－Ａでタグ付けされたフラグメントである。全転位産物の５０％を占めるＡ－Ｂ又はＢ－Ａでタグ付けされたフラグメントのみが、ＰＣＲ増幅又はペアエンドシーケンシングに適している。Ａ－Ａ又はＢ－Ｂでタグ付けされたフラグメントの残り５０％は失われる。かかる損失率は、着床前の遺伝子スクリーニングに使用される単一細胞等、希少、固有の又は貴重な単一細胞試料を含む、ＤＮＡ量が限られている試料では確かに望ましくなく、潜在的に許容できない。追加の転位方法は特許文献２に記載されているが、かかる方法では転位バイアスに起因する５０％の損失は減少しない。

したがって、従来技術の方法に関連するＤＮＡの損失を招くことなく、少量の哺乳類ＤＮＡのメチル化状態を解析する更なる方法が必要である。

米国特許出願公開第２０１１０２８７４３５号明細書 国際公開第２０１６／０７３６９０号

Liu et al., Nature Biotechnology (2019). "Bisulfite-free direct detection of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at base resolution", Enzymatic-methyl seq conversion (EM-seq) Williams et al., New England Biolabs, Inc. (2019). "Enzymatic Methyl-seq: The Next Generation of Methylome Analysis" [world wide website international.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/enzymatic-methyl-seq-the-next-generation-of-methylome-analysis] Guo, H., eta. (2013). "Single-cell methylome landscapes of mouse embryonic stem cells and early embryos analyzed using reduced representation bisulfite sequencing." Genome Res 23(12): 2126-2135 Smallwood, S. A., et al. (2014). "Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity." Nat Methods 11(8): 817-820. Buenrostro, J. D., Wu, B., Litzenburger, U. M., Ruff, D., Gonzales, M. L., Snyder, M. P., ... & Greenleaf, W. J. (2015). Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature, 523(7561), 486-490 Ramani, V., Deng, X., Qiu, R., Gunderson, K. L., Steemers, F. J., Disteche, C. M., ... & Shendure, J. (2017). Massively multiplex single-cell Hi-C. Nature Methods, 14(3), 263-266 Zahn, H., Steif, A., Laks, E., Eirew, P., VanInsberghe, M., Shah, S. P., ... & Hansen, C. L. (2017). Scalable whole-genome single-cell library preparation without preamplification. Nature Methods, 2017

本開示は、複数のトランスポソームを用いたゲノムＤＮＡフラグメント化を含む、少量で存在する標的ＤＮＡ試料、例えば、複数の細胞から又は単一細胞からのＤＮＡのメチル化状態を分析する方法であって、複数のトランスポソームの各メンバーは、プライミング部位配列を有する２つのトランスポゾン核酸配列を含む、方法を提供する。トランスポゼースに結合するプライミング部位配列を有するトランスポゾン核酸配列は、変換化学がメチル化シトシン又は非メチル化シトシンを変換するかどうかに応じて、全てのシトシンについてメチル化されてもよく、又はメチル化されなくてもよい。トランスポソームによって産生されるＤＮＡフラグメントは、シトシン及び／又はメチルシトシンをその中に存在させることができる。

トランスポソームを用いた少量のＤＮＡの断片化、ギャップ充填、精製、増幅及びシーケンシングの方法は、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０３４１６２号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）で提供され、一般にマルチエンドタギング増幅（Multiple End Tagging Amplification）すなわち「ＭＥＴＡ」と称される。一態様によれば、トランスポソームの各トランスポゾン核酸配列のプライミング部位配列は同じである。一態様によれば、トランスポソームの各トランスポゾン核酸配列のプライミング部位配列は異なる。一態様によれば、複数のトランスポソームの各メンバーは、固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含み得る。一態様によれば、複数のトランスポソームの各メンバーは、トランスポソーム内の各トランスポゾンに対して１つずつ、２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含み得る。このようにして、トランスポソームと会合する固有のプライマー結合部位配列（又は２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列）を有し、トランスポソームを区別するために使用することができる一組のトランスポソームが提供される。言い換えれば、トランスポソーム内のトランスポゾンのプライマー結合部位配列は同じであってもよく、又は異なっていてもよく、すなわち同一でなくてもよい。標的核酸配列に付着し、フラグメントを作製するために使用される隣接する２つのトランスポソームにおけるトランスポソームのプライマー結合部位配列は、例えば高い確率で同一ではない。トランスポゾンを、トランスポソーム内の各トランスポゾンが異なるプライミング部位配列を有する限り、マルチプレックストランスポゾンと称することができる。トランスポソームのライブラリー内のプライミング部位を、各トランスポソームが、トランスポソームのセット内の他のトランスポソーム内の他のプライミング部位とは異なる、すなわち同一でない又は固有のプライミング部位を有する限り、マルチプレックスプライミング部位と称することができる。一態様によれば、上記方法は、隣接するトランスポソームが異なるプライマー結合部位配列を有するように、標的核酸配列に沿ってライブラリー又は複数のトランスポソームからのトランスポソームを結合する工程を提供する。このようにして、断片化部位の末端に異なるプライマー結合部位配列がタグ付けされる。これは、トランスポソームがその２つのトランスポゾンＤＮＡのそれぞれについて同じプライマー結合部位配列を持っているか、又はトランスポソームがその２つのトランスポゾンＤＮＡのそれぞれに対して異なるプライマー結合部位配列を持っているかどうかに関係なく達成できる。このようにして、本明細書に記載されるマルチプレックスエンドタギング増幅方法は、複数のプライミング配列を使用して、２つの末端が異なる配列でタグ付けされた標的ＤＮＡフラグメントを作り出す。マルチプレックスエンドタギング増幅方法は、２つの隣接するトランスポソーム（すなわちフラグメント配列を形成するように直接隣接している）が異なるトランスポゾンプライマー結合部位配列（フラグメントは、各末端に異なるプライマー結合部位配列を有する）を保有する限り、トランスポソーム内の２つのトランスポゾン配列が同じであるか異なっているかにかかわらず行うことができる。

一態様によれば、トランスポソームのセット内のマルチプレックスプライミング部位配列の使用は、単一細胞のゲノム核酸配列等のゲノム核酸配列を断片化及びタグ付けするために転位法が用いられる場合に、損失率を低下させた。本明細書の教示によれば、反応混合物中にＮ個の異なるトランスポゾン配列がある場合、すなわち固有のプライミング部位配列の数がＮである場合、同じトランスポゾン配列によってタグ付けされたＤＮＡフラグメントの確率、すなわち損失率は１／Ｎである。したがって、本開示は、損失率を制御するために、固有のプライミング部位配列の数、すなわち数Ｎを変更する方法を提供する。例えば、ヒトの単一細胞から得られたＤＮＡで使用する場合、２０の異なるトランスポゾン配列がある場合、損失率は１／２０すなわち５％である。

本明細書に記載される複数のフラグメントを作製する方法は、トランスポソームのセットの各メンバーが１つ又は２つの異なるプライマー結合部位配列を有し、トランスポソームのセットの各メンバーが、例えば高い確率で、トランスポソームのセットのそれぞれの他のメンバーと比較して、１つ又は２つの固有の又は異なったプライミング結合部位を有するトランスポソームのセットを使用する。このようにして、フラグメントの隣接する末端は、断片化プロセス中に異なった及び／又は固有の末端バーコード配列でバーコード化され、各末端に固有のバーコード配列（プライミング部位配列）を有するフラグメントを作り出す。このようにして、フラグメントの反対側の末端は、断片化プロセス中に高い確率で異なった及び／又は固有の末端バーコード配列でバーコード化され、各末端に異なるバーコード配列（プライミング部位配列）を有するフラグメントを作り出す。このようにして、フラグメントの対向する２つの末端は、断片化プロセス中に異なった及び／又は固有の末端バーコード配列でバーコード化され、各末端に固有のバーコード配列（プライミング部位配列）を有するフラグメントを作り出す。

一態様によれば、トランスポソームライブラリーは、水性媒体中でゲノムＤＮＡのフラグメントを作製するために使用され、トランスポソームのトランスポゼースによって切断された部位で、ゲノムＤＮＡの各末端に固有のバーコード配列が挿入又は付着される。各トランスポソームは、セット若しくは複数の、又はライブラリーの他のトランスポソームメンバーと比較して、１つ又は２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有するため、各フラグメントは、各末端に固有のプライミング部位配列（バーコード配列）を有する。一態様によれば、各フラグメントは、１つ以上のシトシン又は１つ以上のメチルシトシンを含む。本明細書に記載される方法は、シトシンをウラシルに変換する化学変換工程中にキャリアＤＮＡを利用して、化学変換工程中に試料ＤＮＡが喪失又は損傷されるのを防止する。シトシンをウラシルに変換するために使用される試薬又は酵素は、当業者には知られている。シトシンをウラシルに変換する酵素試薬、すなわちシトシンデアミナーゼとしては、ＡＰＯＢＥＣ－ｓｅｑ又はＡＰＯＢＥＣ３Ａ等のＡＢＯＰＥＣファミリーのものが挙げられる。ＡＰＯＢＥＣファミリーのメンバーは、５－ヒドロキシメチルシトシンを維持しながら、すなわち５－ヒドロキシメチルシトシンを変化させずに、シトシンをウラシルに変換するシチジンデアミナーゼである。５－メチルシトシンは、ＴＥＴ酵素との酸化反応により５－ヒドロキシメチルシトシンに変換され得る。かかる酵素は米国特許出願公開第２０１３／０２４４２３７号に記載されており、New England Biolabsから入手され得る。他の酵素試薬は、本開示に基づいて、当業者には明らかになるであろう。一態様によれば、試薬はバイサルファイトではない若しくはバイサルファイトを除外するか、又は試薬がバイサルファイトでないことを条件として、シトシンをウラシルに変換する。次いで、キャリアＤＮＡを除去するか、又はキャリアＤＮＡも増幅することなく変換されたフラグメントを増幅して、増幅された断片化ＤＮＡをもたらすことができる。より具体的には、トランスポソーム法を用いて断片化された標的ＤＮＡに挿入されたプライマー又はアダプターと、塩基分解能メチル化分析に必要とされるＤＮＡの化学変換又は酵素変換中のＤＮＡ損失及びＤＮＡ損傷を低減するためのキャリアＤＮＡの添加とを使用する方法が提供される。本明細書に記載される（及びキャリアＤＮＡの添加前に）各末端にプライマー又はアダプターを有するフラグメントを作り出すためのトランスポソームの使用は、標的化ＤＮＡがキャリアＤＮＡと十分に区別できるように、標的化ＤＮＡにバーコード及びＰＣＲアダプターを付加する。本明細書に記載される方法によれば、アダプター結合型ＤＮＡは増幅されるが、キャリアＤＮＡは増幅されない。キャリアＤＮＡは一本鎖ＤＮＡ、すなわちｓｓＤＮＡになり、混合物から除去され、純粋な増幅された標的化ＤＮＡが得られる。

本開示は、本明細書に記載されるトランスポソームライブラリーを使用して、ゲノムＤＮＡを複数のフラグメント、例えば、５以上のフラグメント、１０以上のフラグメント、１００以上のフラグメント、１０００以上のフラグメント、１００００以上のフラグメント、１０００００以上のフラグメント、１００００００以上のフラグメント、又は１０００００００以上のフラグメントに断片化することを企図する。固有の及び／又は異なったプライマー結合部位配列の数に依存する一態様によれば、トランスポソームライブラリーは、５～１０のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１０～１００のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１０００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１００００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１０００００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、１００００００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、又は１０００００００以上のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバー、又は５～５０のタイプ若しくは種類のトランスポソームメンバーを含む。

一態様によれば、各トランスポソームは、２つのトランスポゼースと２つのトランスポゾンＤＮＡとを含む。トランスポソームの２つのトランスポゾンＤＮＡのそれぞれは、トランスポゼース結合部位及びプライマー結合部位配列を含む。一態様によれば、トランスポゾンＤＮＡは、単一のトランスポゼース結合部位及び固有のプライマー結合部位配列を含む。各トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位でトランスポゼースに結合した別々の核酸である。トランスポソームは、それぞれが独自のトランスポゾンＤＮＡに結合した２つの別々のトランスポゼースのダイマーである。ダイマーは、各トランスポゾン上に同じプライマー結合部位配列を有してもよく、又は各トランスポゾン上に異なるプライマー結合部位配列を有してもよい。一態様によれば、トランスポソームは、それぞれがそれ自身の対応するトランスポゼースに結合している２つの別個のトランスポゾンＤＮＡを含む。一態様によれば、トランスポソームは、２つのトランスポゼース及び２つのトランスポゾンＤＮＡのみを含む。一態様によれば、トランスポソームの一部としての２つのトランスポゾンＤＮＡは、別個の、又は連結されていないトランスポゾンＤＮＡであり、それぞれがそれ自身の対応するトランスポゼースに結合している。

一態様によれば、ライブラリーの各トランスポソームメンバーは、固有の異なったプライミング部位配列を含む。同じ固有の異なったプライミング部位配列がトランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ上に存在してもよく、又はトランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ上に異なる固有の異なったプライミング部位配列が存在してもよい。このようにして、各トランスポソームは、トランスポソームライブラリー内の任意の他のトランスポソームのプライミング部位配列とは固有で異なった、固有で異なったプライミング部位配列を含む。一態様によれば、トランスポソームライブラリーは、他のトランスポソームメンバーと同じプライミング部位配列を有するトランスポソームメンバーを含み得るが、確率は比較的小さいか、又は重要ではない。このように、各フラグメント切断部位が異なるプライミング部位を有するゲノムＤＮＡを断片化することを目的としているため、トランスポソームライブラリーは、調製されたトランスポソームのコレクションのサブセットであると考えることができ、そのサブセットは、固有の異なったプライミング部位配列を有するトランスポソームのみを含む。各断片切断部位が異なるプライミング部位配列を有するゲノムＤＮＡを断片化する目的は、隣接するトランスポソームがそれぞれ固有の異なったプライミング部位配列を有する場合に達成され得るが、それはトランスポソームの２つのトランスポゾンによって共有されてもよいことを理解されたい。各断片切断部位が異なるプライミング部位配列を有するゲノムＤＮＡを断片化するという目的は、隣接するトランスポソームがそれぞれ２つの固有の異なったプライミング部位配列を有し、トランスポソームの各トランスポゾンが固有の異なったプライミング部位配列を有する場合に達成され得ることを理解されたい。

トランスポソームライブラリーの調製により、わずかな数の切断部位が同じプライミング部位配列を共有する可能性があることを理解されたい。例えば、所与のライブラリー調製方法では、同じプライミング部位配列を持つトランスポソームの分子が複数存在することは数学的に可能であるが、ライブラリーは、異なるプライミング部位配列の数が実際に標的ゲノムに挿入されるトランスポソーム分子の数を大幅に超えるように調製される。一態様によれば、トランスポソームライブラリーは、同じ２つのプライミング部位配列を有するトランスポソームメンバーを含み得る、すなわち、プライミング部位配列が同一又は同じであるが、このプライミング部位配列は、トランスポソームライブラリーのトランスポソームメンバーの任意の他のトランスポゾンＤＮＡと比較して固有である。かかるトランスポソームライブラリーを作るには、トランスポゼースと固有のプライミング部位配列を含むトランスポゾンＤＮＡとを混合して、各トランスポソームメンバーを別々に作製する。次いで、全てのトランスポソームメンバーが共に混合されてトランスポソームライブラリーが形成される。

一態様によれば、トランスポソームライブラリーは、全てのトランスポゾン配列をトランスポゼースと共に混合してトランスポソームを形成することによって調製される。この方法では、ほとんどのトランスポソームは異なるトランスポゾン配列を持っているが、トランスポソームが同じトランスポゾン配列を保有する可能性は１／Ｎである。トランスポソームライブラリーを作製する別の方法によれば、各タイプのトランスポゾン配列がトランスポゼースと別々に混合され、次いで全てのトランスポソームが混合されてトランスポソームライブラリーが形成される。この方法では、全てのトランスポソームが同じトランスポゾン配列を持つことになる。

一態様によれば、固有の及び／又は異なったプライミング部位配列の数は、５～５０、１０～５０、１５～４５、２０～４０、又は１～１０００、１～１００００、１～１０００００、１～１００００００、又は１～１０００００００である。一態様によれば、ゲノムＤＮＡ中の切断部位の数は、トランスポソームの濃度によって決定又は調整され、濃度が高いほど切断部位の数が多くなり、濃度が低いほど切断部位の数が少なくなる。一態様によれば、実質的に全ての切断部位が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有するように、トランスポソームの数、並びに関連する異なった及び／又は固有のプライミング部位配列が選択される。一態様によれば、切断部位の９０％超が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９５％超が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９６％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９７％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９８％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９９％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、切断部位の９９．５％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有し、又は切断部位の１００％が２つの異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有する。

次いで、トランスポソームライブラリーを使用してゲノムＤＮＡを切断し、各トランスポソームは、切断部位の末端で各トランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列を挿入又は付着させる。隣接するトランスポソームが互いに比べて固有の異なったプライミング部位配列を有する場合、切断部位は部位の各末端に固有の異なったプライミング部位配列を有することになり、すなわち、挿入されるプライミング部位配列が異なることになる。このようにして、トランスポソームライブラリーによって生成された複数の又はほとんどの又は実質的に全てのフラグメントは、隣接するトランスポソームが互いに比較して固有の異なったプライミング部位配列を有する限り、フラグメントの各末端、すなわち対向する末端に異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有する。次いで、トランスポゼースを各フラグメントから除去し、続いてギャップ埋め工程、例えばポリメラーゼ伸長工程を行うことができる。次いで、得られた二本鎖核酸フラグメント配列は、例えばマルチプレックスＰＣＲ増幅を用いて増幅することができる。次いで、フラグメントを配列決定し、ゲノムＤＮＡの配列を決定することができる。

一態様によれば、トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡは、当業者に知られている方法を使用するＰＣＲ又はＲＮＡ転写等により、シーケンシングの前にフラグメントを増幅できるように、フラグメントに付着することができる特異的プライマー配列又は転写プロモーター配列等の増幅方法を促進する配列を含むことができる。本開示は、フラグメントを増幅するための種々の増幅方法を企図し、アンプリコンをシーケンシングするための種々の配列決定方法は、任意の特定の増幅又はシーケンシング方法に限定されないことを理解されたい。

本開示の実施の形態は、核酸、例えばゲノムＤＮＡ、例えば微量若しくは少量のゲノムＤＮＡ、又は限られた量のＤＮＡ、例えば単一細胞若しくは同じ細胞型の複数の細胞から、又は個体若しくは基質から得られた組織、体液若しくは血液試料から得られた単数又は複数のゲノム配列のマルチプレックスエンドタギング増幅の方法に関する。本開示の或る特定の態様によれば、本明細書に記載される方法は、単一の反応混合物を用いて単一のチューブ内で実施することができる。本開示の或る特定の態様によれば、核酸試料は、単一細胞からの未精製又は未処理の溶解物内にあってもよい。本明細書に開示される方法に供される核酸は、種々の試薬と接触する前、及び本明細書に記載される様々な条件下で、カラム精製等によって精製される必要はない。本明細書に記載される方法は、ハイスループットシーケンシングのために増幅されたＤＮＡを産生する単一細胞の全ゲノムの実質的かつ均一なカバー率を提供するのを補助するように、損失率、すなわち元の標的核酸の損失を減少させる。

本発明の実施の形態は、一般に、ＤＮＡフラグメント、例えば、単一細胞の全ゲノムからのＤＮＡフラグメントを作製する方法及び組成物に関し、次いで、当業者に知られている及び本明細書に記載されるように、増幅及びシーケンシング方法に供することができる。或る特定の態様によれば、本明細書に記載される核酸フラグメントを作製する方法は、トランスポソームライブラリーを利用する。一態様によれば、トランスポソームの一部としてのトランスポゼースは、一組の二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントを作るために使用される。或る特定の態様によれば、トランスポゼースは、反応容器内又は反応容量にある場合等、互いに接触すると、トランスポゾンＤＮＡに結合して二量体化する能力を有し、トランスポソームと呼ばれるトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマーを形成する。トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖トランスポゼース結合部位と、プライミング部位配列及び任意に転写プロモーター部位等の機能配列を含む第１の核酸配列とを含む。第１の核酸配列は、一本鎖伸長の形態であってもよい。トランスポソームライブラリーの各トランスポソームは、トランスポソームライブラリーの残りの各メンバーのプライミング部位配列とは異なる固有の異なったプライミング部位配列を含む。一態様によれば、トランスポソームライブラリーの各トランスポソームは、トランスポソームライブラリーの残りの各メンバーのプライミング部位配列とは異なる２つの固有の異なったプライミング部位配列を含む。

トランスポソームは、二本鎖ゲノムＤＮＡ等の二本鎖核酸に沿った標的位置にランダムに結合する能力を有し、トランスポソーム及び二本鎖ゲノムＤＮＡを含む複合体を形成する。トランスポソーム内のトランスポゼースは二本鎖ゲノムＤＮＡを切断し、１つのトランスポゼースは上部鎖を切断し、１つのトランスポゼースは下部鎖を切断する。トランスポソーム中の各トランスポゾンＤＮＡは、切断部位の各末端の二本鎖ゲノムＤＮＡに付着しており、すなわち、トランスポソームの一方のトランスポゾンＤＮＡが左側の切断部位に付着し、トランスポソームのもう一方のトランスポゾンＤＮＡが右側の切断部位に付着している。トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡがそれぞれ異なるプライマー結合部位配列を持つ場合、左側の切断部位及び右側の切断部位は、異なった固有のバーコード、すなわちプライミング部位配列で「バーコード化」される。トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡがそれぞれ同じプライマー結合部位配列を持つ場合、左側の切断部位及び右側の切断部位は、同じバーコード、すなわちプライミング部位配列で「バーコード化」される。フラグメントを作製するために使用される隣接するトランスポソームがそれぞれ異なった固有のプライマー結合部位配列を持つ場合、得られるフラグメントは、フラグメントの各末端に異なった固有のプライマー結合部位を持つことになる。或る特定の態様によれば、複数のトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマー、すなわちトランスポソームは、例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡに沿って対応する複数の標的位置に結合し、次いで二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖フラグメントに切断し、各フラグメントは、二本鎖フラグメントの各末端に異なるバーコード配列が付着したトランスポゾンＤＮＡを有する。

一態様によれば、トランスポゾンＤＮＡは二本鎖ゲノムＤＮＡに付着し、ゲノムＤＮＡの１つの鎖とトランスポゾンＤＮＡの１つの鎖との間に一本鎖ギャップが存在する。一態様によれば、ギャップ伸長は、ギャップを埋め、二本鎖ゲノムＤＮＡと二本鎖トランスポゾンＤＮＡとの間に二本鎖接続を作り出すために行われる。一態様によれば、トランスポゼース結合部位及びプライミング部位配列を含む核酸配列が、二本鎖フラグメントの各末端に付着している。或る特定の態様によれば、トランスポゼースは、二本鎖フラグメントの各末端に付着しているトランスポゾンＤＮＡに付着している。一態様によれば、トランスポゼースは、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの各末端に付着しているトランスポゾンＤＮＡから除去される。

本開示の一態様によれば、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントの各末端に付着された異なるプライミング部位配列を有するトランスポゾンＤＮＡを有する二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントは、次いで、トランスポゾンＤＮＡをテンプレートとして用いてギャップ充填され伸長される。したがって、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントと、二本鎖ゲノムＤＮＡの各末端に異なるプライミング部位配列を含む二本鎖トランスポゾンＤＮＡとを含む二本鎖核酸伸長産物が生成される。

この段階で、ゲノムＤＮＡフラグメント、各末端の異なるプライミング部位配列を含む二本鎖核酸伸長産物は、当業者に知られている方法を使用して増幅され、各末端のゲノムＤＮＡフラグメント及び異なるプライマー結合部位のアンプリコンを生成することができる。ＰＣＲプライマー配列及び試薬を増幅に使用できる。本明細書に記載されるトランスポゾンは、ＲＮＡ転写産物を生成するためのＲＮＡポリメラーゼ結合部位も含むことができ、これを、次いで、線形増幅のためにｃＤＮＡに逆転写することができる。ゲノムＤＮＡフラグメントと各末端に異なるプライミング部位配列とを含む二本鎖核酸伸長産物は、増幅試薬と組み合わせることができ、次いで、二本鎖ゲノム核酸フラグメントを、当業者に知られている方法を用いて増幅して、二本鎖ゲノム核酸フラグメントのアンプリコンを生成することができる。

次いで、アンプリコンは、更なる分析の前に収集及び／又は精製することができる。アンプリコンは、当業者に知られている方法を使用して配列決定することができる。配列決定すると、配列をコンピューターで解析してゲノムＤＮＡを同定することができる。

本開示の実施の形態は、マルチプレックスエンドタギングを使用するＤＮＡ増幅の方法に関し、ＤＮＡは、微量若しくは少量のゲノムＤＮＡ、又は限られた量のＤＮＡ、例えば単一細胞若しくは同じ細胞型の複数の細胞から得られた、又は個体若しくは基質から得られた組織、体液若しくは血液の試料から得られた単数又は複数のゲノム配列である。本開示の或る特定の態様によれば、本明細書に記載される方法を単一のチューブ内で実施して、各末端に異なった固有の配列を有するフラグメントを作ることができ、次いで、このフラグメントは、当業者に知られているハイスループットシーケンシングプラットフォームを用いて増幅及び配列決定される。

本明細書に記載されるトランスポソームの断片化及びバーコード化の方法は、低量、少量、又は限られた量のＤＮＡを増幅し、次いでシーケンシングするのに有用である。本明細書に記載される方法は、腫瘍及び神経腫瘤等の非常に不均一な細胞集団を特徴とする生体系又は組織試料において特有の用途を有する。本明細書に記載される方法は、遺伝的に不均一な組織（例えば、癌）、希少で貴重な試料（例えば、胚性幹細胞）、及び非分裂細胞（例えばニューロン）等を含む、ＤＮＡ材料の様々な供給源、並びに当業者に知られているシーケンシングプラットフォーム及び遺伝子型決定方法を利用することができる。

本開示の或る特定の実施形態の更なる特徴及び利点は、その実施形態及び図面の以下の説明において、並びに特許請求の範囲から、より完全に明らかになるであろう。

本発明の前述及び他の特徴及び利点は、添付の図面と併せて、例示的な実施形態の以下の詳細な説明から、より完全に理解されるであろう。

５’の伸長が線状であるトランスポゾンＤＮＡの構造を概略図に示し、図中、Ｔは二本鎖トランスポゼース結合部位、Ｍは伸長の一端のマルチプレックスプライミング部位である。 トランスポゼース及びトランスポゾンＤＮＡがトランスポソームを自発的に形成する一般的な実施形態の概略図であり、これは液滴又は他の形成媒体内で起こり得る。トランスポソームの形成の前、各トランスポゾンは異なるパターンで表される異なった固有のプライミング部位配列を有する。トランスポソーム形成後、トランスポソームの各トランスポゾンは、異なるパターンで表される異なった固有のプライミング部位配列を有する。 トランスポソームがゲノムＤＮＡに結合し、フラグメントに切断し、トランスポゼース結合部位（黒色）と、各トランスポソームにおいて異なるパターンで表される各トランスポソームの各トランスポゾン上の固有の異なったプライミング部位配列とを含むトランスポゾンＤＮＡの付加又は挿入の概略図である。 トランスポソームがゲノムＤＮＡに結合し、フラグメントに切断し、トランスポゼース結合部位（黒色）と、トランスポソームを代表する固有の異なったプライミング部位配列とを含むトランスポゾンＤＮＡの付加又は挿入の概略図であり、すなわち、各トランスポソームにおいて同じパターンで表されるように、トランスポソームの各トランスポゾンには、同一の固有の異なったプライマー結合部位配列が存在する。各トランスポソーム間の異なるプライマー結合部位配列は、異なるパターンで表される。 トランスポゼース除去、ゲノムＤＮＡ、トランスポゼース結合部位、及び伸長産物の各末端における固有の異なったプライミング部位配列を含む核酸伸長産物を形成するためのギャップ充填の概略図である。 図４のフラグメントのマルチプレックスＰＣＲ増幅を示す概略図である。 低インプットメチル化検出法の一般的なワークフローを示す概略図である。 ｓｃＥＭ－ｓｅｑのワークフローを示す概略図である。 異なるアライメントアルゴリズム（ＰＥ又はＰＥ＋ＳＥ）を用いたｓｃ－ＣＯＯＬ ｓｅｑ及びｓｃＷＧＢＳと比較したｓｃＥＭ－ｓｅｑのゲノムカバー率である。ＰＥ：ペアエンド・アライメントを使用。ＰＥ＋ＳＥ：読み取りにシングルエンドアラインメントを使用すると参照ゲノムにアライメントされなかった。ｓｃＥＭ－ｓｅｑ及びｓｃ－ＣＯＯＬ ｓｅｑを４細胞段階のマウス胚に実施する。ｓｃＷＧＢＳはマウスＥＳＣに実施する。 ｓｃＥＭ－ｓｅｑ、ｓｃ－ＣＯＯＬ ｓｅｑ、及びｓｃＷＧＢＳ間のマッピング率の比較の図である。 ｓｃ－ＣＯＯＬ ｓｅｑ及びｓｃＥＭ－ｓｅｑのメチル化率分布の比較の図である。

一態様によれば、単一細胞からの二本鎖ゲノムＤＮＡを、それぞれがトランスポゾンＤＮＡに結合したＴｎ５トランスポゼース等のトランスポゼースと接触させることを含む、単一細胞全ゲノム増幅、シーケンシング及びアセンブリの方法が提供され、ここで、トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖１９ｂｐトランスポゼース（Ｔｎｐ）結合部位と、固有の異なったプライミング部位配列を含む第１の核酸配列とを含み、トランスポソームと呼ばれるトランスポゼース／トランスポゾンＤＮＡ複合体ダイマーを形成する。第１の核酸配列は、一本鎖伸長の形態であってもよい。一態様によれば、第１の核酸配列は、５’オーバーハング等のオーバーハングであってもよく、オーバーハングは、固有で異なったプライミング部位配列を含む。オーバーハングは、必要に応じて他の機能配列を含むことができる。オーバーハングは、プライミング部位配列、又は必要に応じて他の機能配列を含めるのに適した任意の長さであり得る。トランスポソームは、二本鎖ゲノムＤＮＡに沿った標的位置に結合し、二本鎖ゲノムＤＮＡを複数の二本鎖フラグメントに切断し、各二本鎖フラグメントは、Ｔｎｐ結合部位によって上部鎖に付着した第１の複合体と、Ｔｎｐ結合部位によって下部鎖に付着した第２の複合体とを有する。トランスポゾン結合部位、したがってトランスポゾンＤＮＡと共にプライマー結合部位は、二本鎖フラグメントの各５’末端に付着している。一態様によれば、Ｔｎ５トランスポゼースは複合体から除去される。

二本鎖フラグメントは、１つ以上のシトシン又は１つ以上のメチルシトシンを含み、トランスポゾンＤＮＡに沿って伸長して、二本鎖伸長産物の各末端に異種、又は異なった若しくは固有のプライミング部位配列を有する二本鎖伸長産物を作製する。一態様によれば、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントへのＴｎ５トランスポゼース結合部位の付着から生じ得るギャップを埋めることができる。

次いで、ギャップ充填された二本鎖伸長産物をキャリアＤＮＡの存在下で化学処理し、シトシンをウラシルに変換する。

ギャップ充填された二本鎖伸長産物を増幅試薬と混合し、二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントを増幅する。アンプリコンは、各末端に異種、又は異なった若しくは固有のプライミング部位配列（バーコード配列として機能し得る）を含み、例えば、当業者に知られているハイスループットシーケンシング法を用いて配列決定される。

特定の態様では、実施形態は、特定の部位の表現を失うことなく、実質的に全ゲノムを増幅、シーケンシング、及びアセンブリする方法（本明細書では「全ゲノム増幅」と定義される）に関する。特定の実施形態において、全ゲノム増幅は、ゲノムライブラリーの実質的に全てのフラグメント又は全てのフラグメントの増幅を含む。更なる特定の実施形態において、「実質的に全体」又は「実質的に全部」とは、ゲノム中の全配列の約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％を指す。

或る特定の実施形態の実施又は或る特定の実施形態の特徴は、特に明記されていない限り、当業者の技術の範囲内である分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ等の従来の手法を用いることができる。かかる技術は文献で完全に十分に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch, and Maniatis, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition (1989), OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait Ed., 1984), ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, Ed., 1987), the series METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. M. Miller and M. P. Calos eds. 1987), HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, (D. M. Weir and C. C. Blackwell, Eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J. G. Siedman, J. A. Smith, and K. Struhl, eds., 1987), CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY (J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach and W. Strober, eds., 1991); ANNUAL REVIEW OF IMMUNOLOGY；並びにADVANCES IN IMMUNOLOGY等の雑誌の研究論文を参照されたい。本明細書に言及される全ての特許、特許出願及び出版物は、上記及び下記の両方において、引用することにより本明細書の一部をなす。

本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、及び分子生物学の用語及び記号は、この分野の標準的な論文及びテキスト、例えば、Kornberg and Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, New York, 1992); Lehninger, Biochemistry, Second Edition (Worth Publishers, New York, 1975); Strachan and Read, Human Molecular Genetics, Second Edition (Wiley-Liss, New York, 1999); Eckstein, editor, Oligonucleotides and Analogs: A Practical Approach (Oxford University Press, New York, 1991); Gait, editor, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1984)等のものに従う。

定義
本明細書で使用される場合、「生物学的試料」という用語は、限定されるものではないが、被験体から単離された組織、細胞、生体液及びそれらの単離物、並びに被験体内に存在する組織、細胞及び体液を含む。

「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」という用語は、例えば、精製された試薬又は抽出物、例えば細胞抽出物を含む、その技術分野で認められた意味を有する。「ｉｎ ｖｉｖｏ」という用語は、例えば、生細胞、例えば不死化細胞、初代細胞、細胞株、及び／又は生物内の細胞を含む、その技術分野で認められた意味も有する。

本明細書で使用される場合、「相補的」及び「相補性」という用語は、塩基対合の規則によって関連するヌクレオチド配列を参照して使用される。例えば、配列５’－ＡＧＴ－３’は、配列５’－ＡＣＴ－３’に相補的である。相補性は部分的であってもよく、全体的であってもよい。部分相補性は、１つ以上の核酸塩基が塩基対合の規則に従って一致しない場合に起こる。核酸間の全体的又は完全な相補性は、どの核酸塩基も塩基対合の規則の下で別の塩基と一致する場合に起こる。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に大きな影響を及ぼす。

「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合を指す。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴ_ｍ、及び核酸内のＧ：Ｃ比等の要因によって影響される。その構造内に相補的な核酸対を含む単一の分子は、「自己ハイブリダイズ」していると言われる。

「Ｔ_ｍ」という用語は、核酸の融解温度を指す。融解温度は、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する温度である。核酸のＴ_ｍを計算する方程式は、当該技術分野でよく知られている。標準的な参考文献で示されるように、Ｔ_ｍ値の簡単な推定は次の式で計算することができる。核酸が１Ｍ ＮａＣｌの水溶液中にある場合、Ｔ_ｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization (1985)を参照されたい）。他の参考文献は、Ｔ_ｍの計算のために構造特性並びに配列特性を考慮したより高度な計算を含む。

「ストリンジェンシー」という用語は、温度、イオン強度、及び有機溶媒等の他の化合物の存在の条件を指し、その下で核酸ハイブリダイゼーションが行われる。

「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４（Ｈ_２Ｏ）及び１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５００ｍｌあたり５０×デンハルトは次を含む：５ｇ Ｆｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ ４００、Pharmacia）、５ｇ ＢＳＡ（画分Ｖ；Sigma））、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中４２℃での洗浄と同等の条件を含む。

「中ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４（Ｈ_２Ｏ）及び１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中４２℃での洗浄と同等の条件を含む。

「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して使用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ ＮａＨ_２ＰＯ_４（Ｈ_２Ｏ）及び１．８５ｇ／ｌ ＥＤＴＡ、ＮａＯＨでｐＨを７．４に調整）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルト試薬、及び１００ｍｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での４２℃での結合又はハイブリダイゼーション、続いて約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合、０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中４２℃での洗浄と同等の条件を含む。

本明細書で使用される場合、「ゲノム」という用語は、個体、細胞、又はオルガネラによって運ばれる集合的な遺伝子セットとして定義される。本明細書で使用される場合、「ゲノムＤＮＡ」という用語は、個体、細胞、又はオルガネラによって運ばれる部分的又は完全な集合遺伝子セットを含むＤＮＡ材料として定義される。

本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、リボース又はデオキシリボース糖に共有結合したプリン又はピリミジン塩基を有する分子を指す。例示的なヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン及びチミジンが挙げられる。追加の例示的なヌクレオシドとしては、イノシン、１－メチルイノシン、プソイドウリジン、５，６－ジヒドロウリジン、リボチミジン、２Ｎ－メチルグアノシン及び２，２－Ｎ，Ｎ－ジメチルグアノシン（「希少」ヌクレオシドとも称される）が挙げられる。「ヌクレオチド」という用語は、糖部分へのエステル結合で結合した１つ以上のリン酸基を有するヌクレオシドを指す。例示的なヌクレオチドとしては、ヌクレオシド一リン酸、二リン酸及び三リン酸が挙げられる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」及び「核酸分子」という用語は、本明細書では同じ意味で使用され、５’及び３’炭素原子間のホスホジエステル結合によって互いに結合された任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドのポリマーを指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を持つことができ、既知又は未知のあらゆる機能を果たすことができる。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴ又はＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、単離された任意のＤＮＡ配列、単離された任意のＲＮＡ配列、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類縁体等の修飾ヌクレオチドを含むことができる。この用語は、二本鎖分子と一本鎖分子との両方を指すこともある。別段の指定又は要求がない限り、ポリヌクレオチドを含む本発明の任意の実施形態は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが知られている、又は予測される２つの相補的な一本鎖形態のそれぞれの両方を包含する。ポリヌクレオチドは、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、及びポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、チミンの代わりにウラシル（Ｕ）の４つのヌクレオチド塩基の特定の配列で構成される。したがって、ポリヌクレオチド配列という用語は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表現である。このアルファベット表現は、中央処理ユニットを有するコンピューター内のデータベースに入力することができ、機能ゲノミクス及びホモロジー検索等のバイオインフォマティクスアプリケーションに使用することができる。

「ＤＮＡ」、「ＤＮＡ分子」、及び「デオキシリボ核酸分子」という用語は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡは自然に合成され得る（例えば、ＤＮＡ複製により）。ＲＮＡは転写後修飾が可能である。ＤＮＡは化学的に合成することもできる。ＤＮＡは一本鎖（すなわち、ｓｓＤＮＡ）又は多本鎖（例えば、二本鎖、すなわちｄｓＤＮＡ）であり得る。

「ヌクレオチド類縁体」、「変性ヌクレオチド」及び「修飾ヌクレオチド」という用語は、非天然に存在するリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む非標準ヌクレオチドを指す。或る特定の例示的な実施形態において、ヌクレオチド類縁体は、ヌクレオチドの或る特定の化学的性質を変化させるが、ヌクレオチド類縁体がその意図された機能を果たす能力を保持するように、任意の位置で修飾される。誘導体化され得るヌクレオチド位の例としては、５位、例えば、５－（２－アミノ）プロピルウリジン、５－ブロモウリジン、５－プロピンウリジン、５－プロペニルウリジン等；６位、例えば６－（２－アミノ）プロピルウリジン；アデノシン及び／又はグアノシンの場合の８位、例えば８－ブロモグアノシン、８－クロログアノシン、８－フルオログアノシン等が挙げられる。また、ヌクレオチド類縁体としては、デアザヌクレオチド、例えば、７－デアザ－アデノシン；Ｏ－及びＮ修飾された（例えば、アルキル化、例えば、Ｎ６－メチルアデノシン、又は当該技術分野で別途知られている）ヌクレオチド；並びにHerdewijn, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 2000 Aug. 10(4):297-310に記載されるような他の複素環式修飾ヌクレオチド類縁体も挙げられる。

ヌクレオチド類縁体はまた、ヌクレオチドの糖部分に対する修飾を含み得る。例えば、２’ＯＨ基は、Ｈ、ＯＲ、Ｒ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ_２、ＮＨＲ、ＮＲ_２、ＣＯＯＲ、又はＯＲから選択される基で置換されてもよく、Ｒは、置換又は未置換のＣ_１～Ｃ_６アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール等である。その他の可能な修飾としては、米国特許第５，８５８，９８８号及び同第６，２９１，４３８号に記載のものが挙げられる。

ヌクレオチドのリン酸基はまた、例えば、１つ以上のリン酸基の酸素を硫黄で置換することによって（例えば、ホスホロチオエート）、又はヌクレオチドがその意図された機能を果たすことを可能にする他の置換を行うことによって、例えばEckstein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr. 10(2):117-21, Rusckowski et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Oct. 10(5):333-45, Stein, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Oct. 11(5):317-25, Vorobjev et al. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2001 Apr. 11(2):77-85、及び米国特許第５，６８４，１４３号に記載されるように修飾され得る。上で参照される修飾の一部（例えば、リン酸基修飾）は、例えば、上記類縁体を含むポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏでの加水分解速度を低下させる。

ＤＮＡ試料の入手
本明細書に記載の方法により処理される核酸は、ＤＮＡであってもよく、それらは、例えば、ヒト試料等の任意の有用な供給源から得ることができる。特定の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ分子は、例えば、ヒト由来の試料から得られるゲノム等のゲノムを含むものとして更に定義される。試料は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、頬擦過物（cheek scrapings）、乳頭吸引液、生検試料、精液（射精液と呼ばれることもある）、尿、糞便、毛包、唾液、汗、免疫沈降又は物理的に分離されたクロマチン等、ヒト由来の任意の試料であってもよい。特定の実施形態において、試料は単一の細胞を含む。特定の実施形態において、試料は単一の細胞のみを含む。

一態様によれば、ＤＮＡ試料は、ゲノムＤＮＡ、マイクロ解剖染色体ＤＮＡ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、Ｐ１由来人工染色体（ＰＡＣ）ＤＮＡ、又は細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、法医学試料ＤＮＡ、又は試験する天然若しくは人工の供給源からの他のＤＮＡである。別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ試料は、哺乳類ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、酵母ＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、又は原核生物ＤＮＡである。更に別の好ましい実施形態において、ＤＮＡ試料は、ヒト、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、齧歯類、鳥類、魚、エビ、植物、酵母、ウイルス、又は細菌から得られる。ＤＮＡ試料はゲノムＤＮＡであることが好ましい。

或る特定の例示的な実施形態において、細胞が同定され、次いで単一の細胞又は複数の細胞が単離される。本開示の範囲内の細胞は、ＤＮＡ含有量の理解が当業者によって有用であると考えられるあらゆる種類の細胞を含む。本開示による細胞としては、任意の種類の癌細胞、肝細胞、卵母細胞、胚、幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、ニューロン、赤血球、メラニン形成細胞、星状膠細胞、生殖細胞、オリゴデンドロサイト、腎臓細胞等を含む。一態様によれば、本発明の方法は、単一細胞からの細胞ＤＮＡを用いて実施される。複数の細胞は、約２個～約１００００００個の細胞、約２個～約１０個の細胞、約２個～約１００個の細胞、約２個～約１０００個の細胞、約２個～約１００００個の細胞、約２個～約１０００００個の細胞、約２個～約１０個の細胞、又は約２個～約５個の細胞を含む。

本明細書で使用される場合、「単一細胞」は１つの細胞を指す。本明細書に記載される方法において有用な単一細胞は、目的の組織から、又は生検試料、血液試料若しくは細胞培養物から得ることができる。さらに、特定の臓器、組織、腫瘍、新生物等から細胞を得て、本明細書に記載する方法で使用することができる。さらに、一般に、細菌又は酵母を含む原核生物又は真核生物の単細胞生物の集団等、任意の集団からの細胞をこの方法で使用することができる。単一細胞懸濁液は、例えば、トリプシン又はパパインを酵素的に使用して、組織試料中で細胞をつないでいるタンパク質を消化すること、又は培養物中で付着細胞を放出すること、又は試料中の細胞を機械的に分離することを含む、当該技術分野で知られている標準的な方法を用いて得ることができる。単一細胞は、単一細胞を個別に処理できる任意の適切な反応容器に入れることができる。例えば、９６ウェルプレートで、各単一細胞を１つのウェルに入れる。

単一細胞を操作する方法は当該技術分野で知られており、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、フローサイトメトリー（Herzenberg., PNAS USA 76:1453-55 1979）、マイクロマニピュレーション、及び半自動セルピッカー（例えば、Stoelting Co.製のＱｕｉｘｅｌｌ（商標）細胞移送システム）の使用が挙げられる。個々の細胞は、例えば、位置、形態、又はレポーター遺伝子発現等の顕微鏡観察によって検出可能な特徴に基づいて個別に選択することができる。さらに、勾配遠心分離とフローサイトメトリーとの組合せを使用して、分離又は選別の効率を高めることもできる。

所望の細胞が同定されたら、その細胞を溶解して、当業者に知られている方法を用いて、ＤＮＡを含む細胞内容物を放出する。細胞内容物は、容器内又は収集量（collection volume)に収容される。本発明のいくつかの態様では、ゲノムＤＮＡ等の細胞内容物は、細胞を溶解することによって細胞から放出され得る。溶解は、例えば、細胞を加熱することによって、又は洗浄剤若しくは他の化学的方法を使用することによって、又はこれらの組み合わせによって達成することができる。しかしながら、当該技術分野で知られている任意の適切な溶解法を使用することができる。例えば、細胞を溶解するには、Ｔｗｅｅｎ－２０の存在下、７２℃で２分間細胞を加熱するだけで十分である。或いは、細胞を、水中で６５℃まで１０分間（Esumi et al., Neurosci Res 60(4):439-51 (2008)）、若しくは０．５％ＮＰ－４０を補充したＰＣＲバッファーＩＩ（Applied Biosystems）で７０℃まで９０秒間（Kurimoto et al., Nucleic Acids Res 34(5):e42 (2006)）加熱することもでき、又は溶解を、プロテアーゼＫ等のプロテアーゼ又はグアニジンイソチオシアネート等のカオトロピック塩の使用によって達成することができる（米国特許出願公開第２００７／０２８１３１３号）。本明細書に記載される方法によるゲノムＤＮＡの増幅を細胞溶解物に対して直接行うことができ、その結果、反応混合物を細胞溶解物に添加することができる。或いは、細胞溶解物を、各容量の容器、チューブ又は領域に含まれる細胞溶解物の一部を用いて、当業者に知られている方法を用いて、２つ以上の容器、チューブ、又は領域等、２つ以上の量に分離することができる。各容器、チューブ又は領域に含まれるゲノムＤＮＡは、次いで、本明細書に記載される方法、又は当業者に知られている方法によって増幅され得る。

本発明で使用される核酸は、天然又は非天然の塩基を含むこともできる。これに関して、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１種以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシン又はグアニンからなる群から選択される１種以上の塩基を有することができる。核酸に含めることができる例示的な非天然塩基は、天然の骨格又は類縁体構造を有するかにかかわらず、限定されないが、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、イソグアニン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロウラシル、１５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロアデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又はグアニン、８－チオールアデニン又はグアニン、８－チオアルキルアデニン又はグアニン、８－ヒドロキシルアデニン又はグアニン、５－ハロ置換ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニン等が挙げられる。特定の実施形態は、非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるため米国特許第５，６８１，７０２号に概ね記載されるように、核酸中のイソシトシン及びイソグアニンを利用することができる。

フラグメントを生成するためのトランスポソームの使用
本発明の一部は、トランスポゼース又はトランスポソームを使用して、ゲノムＤＮＡ等のオリジナルの又は初めの核酸配列を断片化し、切断部位又は断片化部位の各末端に異なるプライミング部位配列を付着させ、それによりセットの各メンバーが、２つの固有の異なったプライミング部位配列を有する一組のフラグメントを生成する、ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ等から核酸フラグメントテンプレートを作製する方法に一部基づく。核酸フラグメントテンプレートを増幅してアンプリコンを生成する。核酸フラグメントテンプレートのアンプリコンを収集し、配列決定することができる。収集されたアンプリコンは、ゲノムＤＮＡ等、オリジナルの核酸のフラグメントのアンプリコンのライブラリーを形成する。例示的な一態様によれば、Ｔｎ５等の酵素を用いて核酸フラグメントを作製する方法が記載される。かかる方法は当該技術分野で知られており、IlluminaのＮｅｘｔｅｒａキットを使用して実施される方法を含む。例示的な一態様によれば、本明細書に記載される方法は、トランスポソームライブラリー及び「タグメンテーション（tagmentation）」と称される方法を利用して、フラグメントがより大きなｄｓＤＮＡ配列から作られ、フラグメントがプライマーでタグ付けされ、単一のプライマーの伸長及び増幅に使用される。

一態様によれば、溶解された単一細胞から得られるゲノム核酸等のゲノムＤＮＡが得られる。複数のトランスポソーム又はトランスポソームのライブラリーを使用して、ゲノムＤＮＡを二本鎖フラグメントに切断する。複数の又はライブラリーの各トランスポソームは、トランスポゾンＤＮＡに結合したトランスポゼースのダイマーであり、すなわち、各トランスポソームは、２つの別個のトランスポゾンＤＮＡを含む。トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼース結合部位及びプライマー結合部位配列を含む。プライマー結合部位配列はトランスポソームに固有のものである。一態様によれば、トランスポソームの各トランスポゾンのプライミング部位配列は固有であってもよく、及び／又は異なってもよい。一態様によれば、トランスポソームの各トランスポゾンのプライミング部位配列は同じであり得る。一態様によれば、トランスポソームの大部分は、異なるプライミング部位配列を有する２つのトランスポゾンＤＮＡを有し、トランスポソームのごく一部のみが、同じプライミング部位配列を有する２つのトランスポゾンＤＮＡを有する。一態様によれば、各トランスポソームメンバーの２つのトランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列は同じであってもよいが、異なるトランスポソームメンバーからのトランスポゾンＤＮＡの単数又は複数のプライミング部位配列は固有であり異なる。トランスポゼースに結合するプライミング部位配列を有するトランスポゾン核酸配列は、全てのシトシンでメチル化されてもよいことから、メチル化検出に必要なシトシン変換後にプライミング部位配列は変化しない。

一態様によれば、トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡのプライミング部位配列は固有であり異なっている。一態様によれば、トランスポソームのトランスポゾンＤＮＡの単数又は複数のプライミング部位配列は、固有であり、複数のトランスポソーム又はトランスポソームライブラリーの残りのメンバーとは異なる。一態様によれば、複数又はライブラリーのトランスポソームの各トランスポソームは、複数のトランスポソーム又はトランスポソームライブラリーの残りのメンバーとは異なる独自の異なったプライミング部位配列を有し、複数のトランスポソーム又はトランスポソームライブラリーの残りのメンバーとは異なる２つの固有の異なったプライミング部位配列を有してもよい。トランスポゾンＤＮＡは、各切断部位又は断片化部位で、各二本鎖フラグメントの上下の鎖に付着するようになる。プライミング部位配列はトランスポゾンＤＮＡごとに異なる場合があるため、切断部位又は断片化部位には異なるプライミング部位配列がタグ付けされる。プライミング部位配列は各トランスポゾンＤＮＡで同じ場合があるため、切断部位又は断片化部位には同じプライミング部位配列がタグ付けされる。フラグメントを生成するために使用される隣接するトランスポソームはそれぞれ、それに関連する異なるプライマー結合部位配列を有し、フラグメントは、フラグメントの各末端に異なるプライマー結合部位配列を有する。したがって、フラグメントは２つの固有の異なったプライマー結合部位配列を有することになる。各トランスポソームは、それに関連する独自の及び／又は異なったプライミング部位配列を有し（及びそれに関連する２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を有していてもよい）、トランスポソームのライブラリーを使用して多数の切断部位又は断片化部位を作るため、各切断部位又は断片化部位は、切断部位のいずれかの末端に付着した異なった固有のプライミング部位配列を有し、各フラグメントは、そのフラグメントの各末端に異なった及び／又は固有のプライミング部位配列を有する。したがって、元の核酸配列からの多くのフラグメントは、トランスポソームのライブラリーによって作られ、各フラグメントは、フラグメントの各末端に異種プライミング部位配列を持つ。次いで、二本鎖のフラグメントを処理して、ギャップを埋める。フラグメントは、プライマー配列、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＲ増幅のためのヌクレオチド等の適切な増幅試薬を用いて増幅され、当業者に知られている方法を用いて配列決定される。

或る特定の態様によれば、例示的なトランスポゾンシステムとしては、Ｔｎ５トランスポゼース、Ｍｕトランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース又はＩＳ５トランスポゼース等が挙げられる。他の有用なトランスポゾンシステムは、当業者に知られており、Ｔｎ３トランスポゾンシステム（Maekawa, T., Yanagihara, K., and Ohtsubo, E. (1996), A cell-free system of Tn3 transposition and transposition immunity, Genes Cells 1, 1007-1016を参照されたい）、Ｔｎ７トランスポゾンシステム（Craig, N.L. (1991), Tn7: a target site-specific transposon, Mol. Microbiol. 5, 2569-2573を参照されたい）、Ｔｎ１０トランスポゾンシステム（Chalmers, R., Sewitz, S., Lipkow, K., and Crellin, P. (2000), Complete nucleotide sequence of Tn10, J. Bacteriol 182, 2970-2972を参照されたい）、Ｐｉｇｇｙｂａｃトランスポゾンシステム（Li, X., Burnight, E.R., Cooney, A.L., Malani, N., Brady, T., Sander, J.D., Staber, J., Wheelan, S.J., Joung, J.K., McCray, P.B., Jr., et al. (2013), PiggyBac transposase tools for genome engineering, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, E2279-2287を参照されたい）、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム（Ivics, Z., Hackett, P.B., Plasterk, R.H., and Izsvak, Z. (1997), Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells, Cell 91, 501-510を参照されたい）、Ｔｏｌ２トランスポゾンシステム（Kawakami, K. (2007), Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates, Genome Biol. 8 Suppl. 1, S7を参照されたい）が挙げられる。

特定のＴｎ５転位システムが説明され、当業者に利用可能である。Goryshin, I.Y. and W.S. Reznikoff, Tn5 in vitro transposition. The Journal of biological chemistry, 1998. 273(13): p. 7367-74; Davies, D.R., et al., Three-dimensional structure of the Tn5 synaptic complex transposition intermediate. Science, 2000. 289(5476): p. 77-85; Goryshin, I.Y., et al., Insertional transposon mutagenesis by electroporation of released Tn5 transposition complexes. Nature biotechnology, 2000. 18(1): p. 97-100、及びSteiniger-White, M., I. Rayment, and W.S.Reznikoff, Structure/function insights into Tn5 transposition. Current opinion in structural biology, 2004. 14(1): p. 50-7を参照されたい（これらの各々が、全ての目的で、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。ＤＮＡライブラリーの調製及び他の用途にＴｎ５転位システムを利用するキットが知られている。Adey, A., et al., Rapid, low-input, low-bias construction of shotgun fragment libraries by high-density in vitro transposition. Genome biology, 2010. 11(12): p. R119; Marine, R., et al., Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology, 2011. 77(22): p. 8071-9; Parkinson, N.J., et al., Preparation of high-quality next-generation sequencing libraries from picogram quantities of target DNA. Genome research, 2012. 22(1): p. 125-33; Adey, A. and J. Shendure, Ultra-low-input, tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing. Genome research, 2012. 22(6): p. 1139-43; Picelli, S., et al., Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nature protocols, 2014. 9(1): p. 171-81 and Buenrostro, J.D., et al., Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nature methods, 2013を参照されたい（これらの各々が、全ての目的で、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。国際公開第９８／１００７７号、欧州特許第２５２７４３８号、及び欧州特許第２３７６５１７号も参照されたい（これらの各々が、全ての目的で、引用することにより本明細書の一部をなす）。市販の転位キットはＮＥＸＴＥＲＡという名称で販売されており、Illuminaから入手可能である。

ギャップ充填
本明細書に記載のトランスポソーム法によって生成された二本鎖フラグメントは、次いで、ギャップを埋めるために処理される。一態様によれば、トランスポゾンは、本明細書に記載されるメチル化シトシンアダプター又はプライマー等の１つ以上のメチル化シトシンを含み得る。メチル化シトシンアダプターを使用してＴｎ５転位を行うシステムでは、ギャップ充填工程は、完全にメチル化された二本鎖アダプターを作るために、ｄＮＴＰミックスにおいてｄＣＴＰの代わりにメチル化ｄＣＴＰを使用することを含む。

キャリアＤＮＡ及び任意の精製
或る特定の態様によれば、ギャップが充填されたフラグメントを、次いで、キャリアＤＮＡと組み合わせる。キャリアＤＮＡは、１００塩基対（ｂｐ）から４キロ塩基対の長さの任意のｄｓＤＮＡフラグメントであり得る。一態様によれば、キャリアＤＮＡは、標的ＤＮＡとは異なるＤＮＡ型であってもよい。一態様によれば、キャリアＤＮＡは、標的ＤＮＡと同じＤＮＡ型であってもよい。一態様によれば、キャリアＤＮＡは超音波処理されたラムダＤＮＡである。一態様によれば、キャリアＤＮＡはIlluminaシーケンシングアダプターを含まない。

キャリアＤＮＡは、化学処理の厳しい条件から標的ＤＮＡを保護し、標的ＤＮＡへの損傷又は標的ＤＮＡの損失を減らす働きをする。ＤＮＡ損傷に関しては、例示的な非バイサルファイト変換は、ヒドロキシルラジカルを生成することによってＤＮＡ損傷を引き起こす強力な酸化試薬Ｆｅ（ＩＩ）を利用する。キャリアＤＮＡは、試料ＤＮＡよりも１００倍～１００００倍（例えば、１００倍～１０００倍）多い量で反応媒体に添加され、過剰なヒドロキシラジカルを占有し、標的ＤＮＡとの相互作用を防止又は制限する働きをする。例示的な一態様によれば、単一細胞由来の６ｐｇの試料ＤＮＡの場合、２０ｎｇの超音波処理されたラムダキャリアＤＮＡが提供される。

ＤＮＡ損失に関しては、異なる工程の前又は更には異なる工程の間に、変換反応は特殊なバッファー及び精製（ＤＮＡを保存しながらバッファーを交換する）を使用する。また、ＰＣＲ増幅の前に化学試薬を除去する精製工程が必要になる場合がある。シトシン変換プロセスの結果として、２つ又は３つの精製工程を行うことができる。各ＤＮＡ精製工程は、単一細胞からのＤＮＡのように、入力ＤＮＡ量が少ない場合、５０％～９０％のＤＮＡ損失をもたらす可能性がある。しかしながら、６ｐｇの試料ＤＮＡに２０ｎｇのラムダＤＮＡを添加する等、キャリアＤＮＡを試料ＤＮＡに添加する場合、ＤＮＡ精製では１０％の損失しか発生せず、キャリアＤＮＡと混合しても試料ＤＮＡの９０％が保存される。本開示によれば、入力ＤＮＡの量が増加するにつれて、ＤＮＡ精製の効率が向上する。

或る特定の態様によれば、ギャップ充填された二本鎖セグメント及びキャリアＤＮＡを含む反応媒体は、メチル化検出に必要とされるＤＮＡ変換の前に、ＤＮＡスピンカラム若しくはビーズベースのＤＮＡ精製、又は当業者に知られている他の精製方法によって精製することができる。或いは、反応媒体は直接化学変換に進むことができる。

化学処理
キャリアＤＮＡと組み合わされたギャップ充填フラグメントは、シトシンをウラシルに化学的に変更する化学試薬との混合へと進む。かかる化学試薬は米国特許出願公開第２０１３／０２４４２３７号に記載されており、New England Biolabsから入手され得る。他の酵素試薬は、本開示に基づいて、当業者には明らかになるであろう。一態様によれば、試薬はバイサルファイトではない若しくはバイサルファイトを除外する、又は試薬がバイサルファイトでないことを条件として、シトシンをウラシルに変換する。

任意の精製
或る特定の態様によれば、化学的に変換されたフラグメントを含む反応媒体は、増幅の前に、ＤＮＡスピンカラム又はビーズベースのＤＮＡ精製、又は当業者に知られている他の精製方法によって精製することができる。或いは、反応媒体は直接増幅に進むことができる。

増幅
一態様によれば、標的フラグメントのみの増幅を、トランスポソームによってフラグメントに組み込まれたアダプター配列を標的とするプライマーを用いて行う。キャリアＤＮＡは増幅されず、変性によりｓｓＤＮＡになる。

「増幅」又は「増幅する／増幅すること」という表現は、特定のポリヌクレオチドの追加のコピー又は複数のコピーが形成されるプロセスを指す。増幅するＤＮＡは、単一の細胞又は少数の細胞集団から取得され得る。本明細書に記載の方法は、単一の反応容器内で実施される単一の反応混合物等の反応混合物中の任意の種又は生物からＤＮＡを増幅することを可能にする。一態様では、本明細書に記載される方法は、ヒト、動物、植物、酵母、ウイルス、真核生物及び原核生物のＤＮＡを含むがこれらに限定されない任意の供給源からのＤＮＡの配列に依存しない増幅を含む。

本明細書に記載のトランスポゼース法を用いて作製されたＤＮＡフラグメントテンプレートを、当業者に知られている方法を用いて微小液滴内で増幅することができる。微小液滴は、油相及び水相のエマルジョンとして形成することができる。エマルジョンは、連続油相内の水滴又は単離された水の量（volume)を含み得る。エマルジョン全ゲノム増幅法は、単一細胞のゲノムの均一な増幅のため、各フラグメントを単離するために油中の少量の水滴を使用して記載される。各フラグメントを独自の液滴又は分離された水性反応ボリュームに分配することにより、各液滴はＤＮＡ増幅の飽和に達することができる。次に、各液滴内のアンプリコンは解乳化によって融合され、単一細胞の全ゲノムの全てのフラグメントが均一に増幅される。

或る特定の態様では、ＰＣＲを使用して増幅が達成される。ＰＣＲは、上流及び下流のプライマーからなる一対のプライマー又はプライマーのセットと、ＤＮＡポリメラーゼ等の重合触媒と、典型的には熱的に安定なポリメラーゼ酵素とを使用して、標的ポリヌクレオチドから複製コピーを作成する反応である。ＰＣＲの方法は当該技術分野でよく知られており、例えばMacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)に教示されている。Mullis（米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号及び同第４，９６５，１８８号）の「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）という用語は、クローニング又は精製を行わずに標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法を指す。標的配列を増幅するこのプロセスは、オリゴヌクレオチドプライマーに所望の標的配列及び増幅試薬を提供し、続いてポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の存在下での熱サイクリングの正確な順序を提供することを含む。プライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖（「プライマー結合配列」）と相補的である。増幅を行うために、二本鎖の標的配列を変性させた後、プライマーを標的分子内の相補配列にアニーリングする。アニーリングに続いて、プライマーはポリメラーゼで伸長され、新たな一対の相補鎖を形成する。変性、プライマーアニーリング、及びポリメラーゼ伸長の工程を何度も繰り返すことができ（すなわち、変性、アニーリング及び伸長は１つの「サイクル」を構成し、多数の「サイクル」が存在する可能性がある）、高濃度の所望の標的配列の増幅セグメントを得ることができる。所望の標的配列の増幅されたセグメントの長さは、プライマーの互いに対する相対的な位置によって決定され、したがって、この長さは制御可能なパラメータである。このプロセスの繰り返しの態様により、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応」（以下「ＰＣＲ」）と称され、標的配列は「ＰＣＲ増幅された」と言われる。

ＰＣＲを使用すると、ゲノムＤＮＡの特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法論で検出可能なレベルまで増幅することができる（例えば、標識されたプローブとのハイブリダイゼーション、ビオチン化プライマーの取り込みとそれに続くアビジン酵素コンジュゲートの検出、ｄＣＴＰ又はｄＡＴＰ等の３２Ｐ標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅セグメントへの取り込み）。ゲノムＤＮＡに加えて、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド配列は、適切なプライマー分子のセットを用いて増幅することができる。特に、各微小液滴内でＰＣＲプロセス自体によって作られた増幅セグメントは、それら自体が後続のＰＣＲ増幅のための効率的なテンプレートである。ＰＣＲを行う方法及びキットは、当該技術分野でよく知られている。ＰＣＲ又は遺伝子クローニング等のポリヌクレオチドの複製コピーを生成する全てのプロセスを、本明細書では総称して複製と称する。プライマーは、サザンブロット分析又はノーザンブロット分析等のハイブリダイゼーション反応のプローブとしても使用できる。

「増幅」又は「増幅する／増幅すること」という表現は、特定のポリヌクレオチドの追加のコピー又は複数のコピーが形成されるプロセスを指す。増幅としては、ＰＣＲ、ライゲーション増幅（又はリガーゼ連鎖反応、ＬＣＲ）等の方法及びその他の増幅方法が挙げられる。これらの方法は当該技術分野で知られており、広く実施されている。例えば、米国特許第４，６８３，１９５号及び同第４，６８３，２０２号、並びにInnis et al., ''PCR protocols: a guide to method and applications'' Academic Press, Incorporated (1990)（ＰＣＲの場合）、及びWu et al. (1989) Genomics 4:560-569（ＬＣＲの場合）を参照されたい。一般に、ＰＣＲ手順は、（ｉ）ＤＮＡ試料（又はライブラリー）内の特定の遺伝子へのプライマーの配列特異的ハイブリダイゼーション、（ｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼを使用した複数回のアニーリング、伸長、及び変性を含むその後の増幅、並びに（ｉｉｉ）正しいサイズのバンドについてのＰＣＲ産物のスクリーニングで構成される遺伝子増幅の方法を記載する。使用されるプライマーは、重合の開始を提供するのに十分な長さと適切な配列のオリゴヌクレオチドであり、すなわち、各プライマーは、増幅されるゲノム遺伝子座の各鎖に相補的であるように特別に設計されている。

増幅反応を行うための試薬及びハードウェアが市販されている。特定の遺伝子領域からの配列を増幅するのに有用なプライマーは、好ましくは、標的領域又はその近接領域の配列と相補的であり、特異的にハイブリダイズし、当業者に知られている方法を用いて調製することができる。増幅によって生成された核酸配列は、直接配列決定することができる。

２本の一本鎖ポリヌクレオチド間でハイブリダイゼーションが反平行配置で起こる場合、その反応は「アニーリング」と呼ばれ、これらのポリヌクレオチドは「相補的」と説明される。二本鎖ポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの鎖の一方と第２のポリヌクレオチドの鎖の一方との間でハイブリダイゼーションが起こり得る場合、もう一方のポリヌクレオチドと相補的又は相同性であり得る。相補性又は相同性（或るポリヌクレオチドが別のポリヌクレオチドと相補的である程度）は、一般に認められている塩基対合の規則に従って、互いに水素結合を形成すると予想される対向鎖の塩基の割合に関して定量化で可能である。

「ＰＣＲ産物」、「ＰＣＲフラグメント」、及び「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング、及び伸長のＰＣＲ工程の２サイクル以上が完了した後に得られる化合物の混合物を指す。これらの用語は、１つ以上の標的配列の１つ以上のセグメントの増幅があった場合を包含する。

「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸テンプレート、及び増幅酵素を除いて、増幅に必要な試薬（デオキシリボヌクレオチド三リン酸、バッファー等）を指す場合がある。典型的には、増幅試薬を他の反応成分と共に反応容器（試験管、マイクロウェル等）に入れ、収容する。増幅法としては、当業者に知られているＰＣＲ法が挙げられ、またローリングサークル増幅（Blanco et al., J. Biol.Chem., 264, 8935-8940, 1989）、超分岐ローリングサークル増幅（Lizard et al., Nat. Genetics, 19, 225-232, 1998）、及びループ介在等温増幅（Notomi et al., Nuc. Acids Res., 28, e63, 2000）が挙げられる（これらの各々が引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす）。

エマルジョンＰＣＲの場合、エマルジョンＰＣＲ反応は、「油中水」ミックスを激しく振盪又は撹拌することによって作られ、数百万ミクロンサイズの水性コンパートメントを生成する。マイクロ流体チップは、油相及び水相を振盪又は撹拌することによってエマルジョンを作る装置を備えてもよい。或いは、或る特定の油を水相と組み合わせるか、又は油相に水相を導入することによって、水滴を自発的に形成することもできる。増幅するＤＮＡライブラリーは、乳化の前に限定希釈液で混合される。コンパートメントサイズ、すなわち微小液滴サイズと、増幅されるＤＮＡフラグメントライブラリーの限界希釈を生じさせる微小液滴の量との組み合わせを使用して、平均して１つのＤＮＡ分子のみを含むコンパートメントを生成する。微小液滴形成又は乳化工程中に生成される水コンパートメントのサイズに応じて、１μｌあたり最大３×１０^９の個別のＰＣＲ反応を同じチューブで同時に行うことができる。本質的に、エマルジョン中の小さな水コンパートメント微小液滴はそれぞれ、マイクロＰＣＲ反応器を形成する。エマルジョン中のコンパートメントの平均サイズは、乳化条件に応じて、直径がサブミクロン～１００ミクロン以上、又は１ピコリットル～１０００ピコリットル、又は１ナノリットル～１０００ナノリットル、又は１ピコリットル～１ナノリットル、又は１ピコリットル～１０００ナノリットルの範囲である。

その他の増幅方法は、英国特許出願公開第２，２０２，３２８号及びＰＣＴ特許出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５号（各々が引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されるように、本開示に従って使用することができる。前者の出願では、「修飾された」プライマーがＰＣＲ様のテンプレート及び酵素依存性合成に使用される。プライマーは、捕捉部分（例えば、ビオチン）及び／又は検出器部分（例えば、酵素）で標識することによって修飾され得る。後者の出願では、過剰な標識されたプローブが試料に添加される。標的配列の存在下で、プローブは結合し、触媒的に切断される。切断後、標的配列はそのまま放出され、過剰なプローブに結合される。標識されたプローブの切断は、標的配列の存在を示す。

他の適切な増幅方法としては、「レース（race）」及び「片側（one-sided）ＰＣＲ」が挙げられる（Frohman, In:PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications, Academic Press, N.Y., 1990、それぞれ引用することにより本明細書の一部をなす）。得られる「ジオリゴヌクレオチド」の配列を有する核酸の存在下での２つ（又はそれ以上）のオリゴヌクレオチドのライゲーションに基づく方法であって、それによってジオリゴヌクレオチドを増幅する方法もまた、本開示に従ってＤＮＡを増幅するために使用され得る（Wu et al., Genomics 4:560-569, 1989、引用することにより本明細書の一部をなす）。

本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、一般に、天然又は合成のいずれかのオリゴヌクレオチドを含み、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドテンプレートとデュプレックスを形成する際に、シーケンシングプライマー等の核酸合成の開始点として作用することができ、伸長デュプレックスが形成されるように、テンプレートに沿ってその３’末端から伸長される。伸長プロセス中に添加されるヌクレオチドの配列は、テンプレートポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常、３ヌクレオチド～３６ヌクレオチド、また５ヌクレオチド～２４ヌクレオチド、また１４ヌクレオチド～３６ヌクレオチドの範囲の長さを有する。本発明の範囲内のプライマーとしては、オルソゴナルプライマー、増幅プライマー、構造プライマー（constructions primer）等が挙げられる。プライマー対は、目的の配列又は目的の配列のセットに近接することができる。プライマー及びプローブは、配列において縮重又は準縮重であり得る。本発明の範囲内のプライマーは、標的配列に隣接して結合する。「プライマー」は短いポリヌクレオチドと考えることができ、一般に、標的とハイブリダイズすることにより、目的の試料中に潜在的に存在する標的又はテンプレートに結合し、その後、標的と相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する遊離３’－ＯＨ基を有する。本発明のプライマーは、１７ヌクレオチド～３０ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドからなる。一態様では、プライマーは、少なくとも１７ヌクレオチド、或いは少なくとも１８ヌクレオチド、或いは少なくとも１９ヌクレオチド、或いは少なくとも２０ヌクレオチド、或いは少なくとも２１ヌクレオチド、或いは少なくとも２２ヌクレオチド、或いは少なくとも２３ヌクレオチド、或いは少なくとも２４ヌクレオチド、或いは少なくとも２５ヌクレオチド、或いは少なくとも２６ヌクレオチド、或いは少なくとも２７ヌクレオチド、或いは少なくとも２８ヌクレオチド、或いは少なくとも２９ヌクレオチド、或いは少なくとも３０ヌクレオチド、或いは少なくとも５０ヌクレオチド、或いは少なくとも７５ヌクレオチド、或いは少なくとも１００ヌクレオチドである。

精製
或る特定の態様によれば、増幅されたフラグメントを含む反応媒体は、シーケンシングの前に、ＤＮＡスピンカラム若しくはビーズベースのＤＮＡ精製、又は当業者に知られている他の精製方法によって精製することができる。ＰＣＲ反応等による増幅後に続くＤＮＡ精製は、ほとんどの一本鎖キャリアＤＮＡを除去し、シーケンシングの準備が整った純粋な増幅標的ＤＮＡライブラリーをもたらす。

シーケンシング
本明細書に記載される方法に従って増幅されたＤＮＡは、当業者に知られている方法を用いて配列決定及び分析され得る。目的の核酸配列の配列決定は、限定されるものではないが、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（ＳＢＨ）、ライゲーションによるシーケンシング（ＳＢＬ）（Shendure et al. (2005) Science 309:1728）、定量的増分蛍光ヌクレオチド付加シーケンシング（ＱＩＦＮＡＳ）、段階的ライゲーション及び切断、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、分子ビーコン、ＴａｑＭａｎレポータープローブ消化、パイロシーケンシング、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕシーケンシング（ＦＩＳＳＥＱ）、ＦＩＳＳＥＱビーズ（米国特許第７，４２５，４３１号）、ウォブルシーケンシング（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／２７６９５号）、マルチプレックスシーケンシング（米国特許出願第１２／０２７，０３９号、２００８年２月６日に出願；Porreca et al (2007) Nat. Methods 4:931）、重合コロニー（ＰＯＬＯＮＹ）シーケンシング（米国特許第６，４３２，３６０号、同第６，４８５，９４４号、同第６，５１１，８０３号、及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０５／０６４２５号）；ナノグリッドローリングサークルシーケンシング（ＲＯＬＯＮＹ）（米国特許出願第１２／１２０，５４１号、２００８年５月１４日に出願）、対立遺伝子特異的オリゴライゲーションアッセイ（例えば、オリゴライゲーションアッセイ（ＯＬＡ）、ライゲーテッドリニアプローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出しを用いた単一テンプレート分子ＯＬＡ、ライゲーテッドパドロックプローブ（ligated padlock probe）及び／又はライゲーションされた円形パドロックプローブ及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）読み出しを用いた単一テンプレート分子ＯＬＡ）等を含む当該技術分野で知られている様々な配列決定方法を用いて行うことができる。例えば、Ｒｏｃｈｅ ４５４、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｏｌｅｘａ、ＡＢ－ＳＯＬｉＤ、Ｈｅｌｉｃｏｓ、Ｐｏｌｏｎａｔｏｒプラットフォーム等のプラットフォームを使用するハイスループットシーケンシング法も利用することができる。当該技術分野では、様々な光ベースのシーケンシング技術が知られている（Landegren et al. (1998) Genome Res. 8:769-76；Kwok (2000) Pharmacogenomics 1:95-100；及びShi (2001) Clin. Chem. 47:164-172）。

増幅されたＤＮＡは、任意の適切な方法で配列決定され得る。特に、増幅されたＤＮＡは、Applied BiosystemsのＳＯＬｉＤシーケンシング技術、又はIlluminaのゲノムアナライザー等のハイスループットスクリーニング法を使用して配列決定することができる。本発明の一態様では、増幅されたＤＮＡをショットガン配列決定することができる。読み取り回数は、少なくとも１００００、少なくとも１００万、少なくとも１０００万、少なくとも１億、又は少なくとも１０億であり得る。別の態様では、読み取り回数は１００００～１０００００、或いは１０００００～１００万、或いは１００万～１０００万、或いは１０００万～１億、或いは１億～１０億であり得る。「読み取り」とは、シーケンシング反応によって得られる連続核酸配列の長さのことである。

「ショットガンシーケンシング」とは、非常に大量のＤＮＡ（ゲノム全体等）を配列決定するために使用される方法を指す。この方法では、配列決定されるＤＮＡは、最初に個別に配列決定できるより小さなフラグメントに細断される。これらのフラグメントの配列は、重複配列に基づいて元の順序に再構成され、完全な配列が生成される。ＤＮＡの「シュレッディング（shredding）」は、制限酵素消化又は機械的剪断を含む様々な技術を使用して行うことができる。重複配列は、通常、適切にプログラムされたコンピューターによって整列される。ｃＤＮＡライブラリーのショットガンシーケンシングの方法及びプログラムは、当該技術分野ではよく知られている。

増幅及び配列決定方法は、診断アッセイ、予後アッセイ、薬理ゲノミクス、及びモニタリング臨床試験が予後（予測）目的で用いられ、それによって個体を予防的に治療する予測医学の分野で有用である。したがって、本発明の一態様は、個体が障害及び／又は疾患を発症するリスクがあるかどうかを判断するために、ゲノムＤＮＡを決定するための診断アッセイに関する。かかるアッセイは、予後又は予測の目的で使用することができ、それによって障害及び／又は疾患の発症前に個人を予防的に治療することができる。したがって、或る特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の発現プロファイリング方法を使用して、１つ以上の疾患及び／又は障害を診断及び／又は予後判定する方法が提供される。

電子的実施形態
或る特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載される１つ以上のゲノムＤＮＡ配列を含む電子機器可読媒体が提供される。本明細書で使用される場合、「電子機器可読媒体」とは、電子機器によって直接読み取り及びアクセス可能なデータ又は情報を格納、保持、又は収容するのに適した任意の媒体を指す。かかる媒体としては、限定されるものではないが、フロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、及び磁気テープ等の磁気記憶媒体；コンパクトディスク等の光学記憶媒体；ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ等の電子記憶媒体；磁気／光学記憶媒体等の一般的なハードディスク及びこれらのカテゴリのハイブリッドを挙げることができる。媒体は、本明細書に記載された１つ以上の発現プロファイルをその上に記録するように適合又は構成される。

本明細書で使用される場合、「電子機器」という用語は、データ又は情報を格納するために構成又は適合された任意の適切なコンピューティング装置若しくは処理装置、又はその他のデバイスを含むことを意図する。本発明と共に使用するのに適した電子機器の例としては、スタンドアロンコンピューティング装置；ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）、ワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）、インターネット、イントラネット、及びエクストラネットを含むネットワーク；携帯情報端末（ＰＤＡ）、携帯電話、ポケットベル等の電子装置；並びにローカル処理システム及び分散処理システムが挙げられる。

本明細書で使用される場合、「記録された」とは、電子機器可読媒体に情報を格納又は符号化するプロセスを指す。当業者は、既知の媒体に情報を記録するための現在知られている方法のいずれかを容易に採用して、本明細書に記載される１つ以上の発現プロファイルを備える製品を作製することができる。

本発明のゲノムＤＮＡ情報を電子機器可読媒体に格納するために、種々のソフトウェアプログラム及びフォーマットを使用することができる。例えば、核酸配列は、ワープロテキストファイルで表すか、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄ等の市販のソフトウェアでフォーマットするか、又はＡＳＣＩＩファイルの形式で表すことができ、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅ等のデータベースアプリケーションと並んでその他の形態で格納され得る。本明細書に記載の１つ以上の発現プロファイルを記録した媒体を取得又は作るために、任意の数のデータプロセッサ構造化フォーマット（例えば、テキストファイル又はデータベース）を用いることができる。

記載されている本発明の実施形態は、本発明の原理の適用のいくつかの例示にすぎないことを理解されたい。本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本明細書に提示される教示に基づいて、当業者によって多数の修正が行われ得る。本出願を通して引用されている全ての参考文献、特許、及び公開された特許出願の内容は、全ての目的で引用することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす。

以下の実施例を、本発明を表すものとして記載する。これらの実施例は、これらの実施形態及び他の同等の実施形態が本開示、図及び添付の請求の範囲を考慮して明らかとなることから、本発明の範囲を限定するものと解釈されるものではない。

実施例Ｉ
特定の例示的な態様によれば、転位システムは、所望により、キャリアＤＮＡを含む化学的メチル化処理、増幅、及びシーケンシングのための核酸フラグメントを作製するために使用される。一態様によれば、転位システムを使用して、ゲノムＤＮＡを二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントに断片化し、その中に異なるプライミング部位配列を有するトランスポゾンＤＮＡを挿入する。図１に示すように、トランスポゾンＤＮＡは、二本鎖トランスポゼース結合部位と、固有の異なったプライミング部位配列Ｍとを含む。図１には示されていないが、トランスポゾンＤＮＡは１つ以上の５－メチルシトシンを含むことができる。二本鎖トランスポゼース結合部位は、オーバーハングの一端等で、プライミング部位配列を含む一本鎖オーバーハングに、共有結合等により連結又は接続された二本鎖１９ｂｐのＴｎ５トランスポゼース（Ｔｎｐ）結合部位であってもよい。トランスポゾンＤＮＡは、トランスポゼースを使用してフラグメントを作りながら、単一細胞のゲノムＤＮＡに挿入される。トランスポゼースの除去及びギャップ埋めの後、フラグメントの各末端に異種、又は異なった又は固有のプライミング部位配列を有するゲノムＤＮＡフラグメントは、プライマーをＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオチド及び増幅試薬と共に用いて増幅され、単一細胞の全ゲノムをＰＣＲ増幅する。

或る特定の態様によれば、いくつかの細胞、すなわち２個～５個、又は２個～１０個の細胞、又は２個～１００個、又は単一の細胞からのＤＮＡといった微量又は少量のＤＮＡを増幅する場合、増幅前に、単一細胞内から得ることができる少量（約６ｐｇ）のゲノムＤＮＡを最大化するようにＤＮＡカラム精製工程は行われない。ＤＮＡは、細胞溶解物又はその他の不純な状態から直接増幅することができる。したがって、ＤＮＡ試料は不純であるか、未精製であるか、又は単離されていなくてもよい。したがって、本発明の方法の態様は、増幅のためにゲノムＤＮＡを最大化し、他の方法、すなわち非マルチプレックス法と同様に、両末端に同じプライミング部位配列を有するフラグメントによる損失を低減することを可能にする。追加の態様によれば、本明細書に記載される方法は、ＰＣＲ以外の増幅方法を利用することができる。

一態様によれば、図２に概ね示されるように、異なるパターンのオーバーハング配列によって示される、それぞれが固有の異なったプライミング部位配列を有するトランスポゼース（Ｔｎｐ、灰色の円）及びトランスポゾンＤＮＡを組み合わせて、複数のトランスポソームを形成する。各トランスポソームは、２つの異なった固有のプライミング部位配列を有する。各トランスポソームは、その複数ある内の互いのトランスポソームと比較して、２つの異なった固有のプライミング部位配列を有する。２０個のトランスポゾン配列のトランスポゾン混合物のプールを作るため、等モルの各タイプのトランスポゾン配列を、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含むバッファーに混合する。トランスポソーム複合体をアセンブルするために、２０個のトランスポゾンプールをＴｎ５トランスポゼースと等モル比で混合し、室温で３０分間インキュベートする。

図３Ａに示すように、トランスポソームライブラリーのトランスポソームは、標的の単一細胞ゲノムＤＮＡをダイマーとして無作為に捕捉するか、そうでなければ結合する。代表的なトランスポソームには１、２、３の番号が付けられているが、所望の用途に応じてトランスポソームメンバーの数が多くなる場合がある。異なった及び／又は固有のプライマー結合部位配列を有するトランスポゾンの代表的な数は、５～５０である。各トランスポソームは、２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含む。例えば、トランスポソーム１は、２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含み、トランスポソーム２は、２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含み、トランスポソーム３は、２つの固有の及び／又は異なったプライミング部位配列を含む等である。固有の及び／又は異なったプライミング部位配列は、トランスポソームの各トランスポゾンＤＮＡ内にある。トランスポソーム内のトランスポゼースはゲノムＤＮＡを切断し、１つのトランスポゼースは上部鎖を切断し、１つのトランスポゼースは下鎖を切断してゲノムＤＮＡフラグメントを作り出す。図３Ａには示されていないが、フラグメントは１つ以上のシトシン又は１つ以上の５－メチルシトシンを含み得る。複数のトランスポソームは、１つ以上のシトシン又は１つ以上の５－メチルシトシンを含む、１つ以上のフラグメントを有する複数のゲノムＤＮＡフラグメントを作り出す。

したがって、トランスポゾンＤＮＡダイマーからの１つのトランスポゾンＤＮＡが切断部位又は断片化部位の各末端に付着し、すなわち、トランスポソーム１からの１つのトランスポゾンＤＮＡが左側の切断部位に付着し、トランスポソーム１からの他のトランスポゾンＤＮＡが右側の切断部位に付着する。トランスポソームライブラリーは核酸をフラグメントに切断するため、各フラグメントはフラグメントの各末端で異種プライミング部位配列を持つことになる。これは、２つの例示的なフラグメントによって表され、上部フラグメントは、一端に固有の異なったプライミング部位配列１と、他の一端に固有の異なったプライミング部位配列２とを有する。同様に、下部フラグメントは、一端に固有の異なったプライミング部位配列２と、他の一端に固有の異なったプライミング部位配列３とを有する。図に示すように、２つのフラグメント間の切断部位はトランスポソーム２によって生成され、左側の切断部位（すなわち、図３の上部フラグメントの右側を見る）は、固有の異なったプライミング部位配列２を持つ１つのトランスポゾンを含み、右側の切断部位（すなわち、図３の下部フラグメントの左側を見る）は、固有の異なったプライミング部位配列２（「２」はトランスポソーム２を指す）を含む。一態様によれば、１００ｎＭのトランスポソームを細胞溶解物に添加し、転位反応混合物を５５度で１０分間インキュベートし、マグネシウムの最終濃度を５ｍＭとする。トランスポゼースを除去した後、ゲノムＤＮＡは数百万の小さなＤＮＡフラグメントに切断され、それぞれが各末端に２０個のトランスポゾン配列の１つでタグ付けされる（図３Ａ）。このように、トランスポソームライブラリーは、本明細書に記載される２０の異なった及び／又は固有のプライマー結合部位配列を含むことができ、一方、トランスポソームライブラリーのメンバーは数百万のメンバーに達する可能性がある。

図３Ｂに示すように、トランスポソームライブラリーのトランスポソームは、標的の単一細胞ゲノムＤＮＡをダイマーとして無作為に捕捉するか、そうでなければ結合する。代表的なトランスポソームに１、２、３の番号が付けられているが、所望の用途に応じてトランスポソームメンバーの数が多くなる場合がある。異なった及び／又は固有のプライマー結合部位配列を有するトランスポゾンの代表的な数は、５～５０である。各トランスポソームは、トランスポソームの各トランスポゾンにおいて同じ固有の及び／又は異なったプライマー結合部位配列を含む。例えば、トランスポソーム１は各トランスポゾンに同じプライマー結合部位配列を含み、トランスポソーム２は各トランスポゾンに同じプライマー結合部位配列を含み、トランスポソーム３は各トランスポゾンに同じプライマー結合部位配列を含む等である。しかしながら、各トランスポソームは、それに関連する固有の異なったプライマー結合部位を有し、そのため、各トランスポソームは、トランスポソームライブラリーの他のメンバーと比較して、それに関連する異なるプライマー結合部位を有する。トランスポソーム内のトランスポゼースはゲノムＤＮＡを切断し、１つのトランスポゼースは上部鎖を切断し、１つのトランスポゼースは下鎖を切断してゲノムＤＮＡフラグメントを作り出す。複数のトランスポソームは、シトシンをウラシルに変えるための化学処理のために、１つ以上のシトシン又は１つ以上の５－メチルシトシンを含む１つ以上のフラグメントを有する複数のゲノムＤＮＡフラグメントを作り出す。したがって、トランスポゾンＤＮＡダイマーからの１つのトランスポゾンＤＮＡが切断部位又は断片化部位の各末端に付着し、すなわち、トランスポソーム１からの１つのトランスポゾンＤＮＡが左側の切断部位に付着し、トランスポソーム１からの他のトランスポゾンＤＮＡが右側の切断部位に付着する。トランスポソームライブラリーは核酸をフラグメントに切断することから、各フラグメントはフラグメントの各末端で異種プライミング部位配列を有することになり、これはフラグメントを作り出す核酸に結合された隣接するトランスポソームがそれぞれ異なるプライマー結合部位配列を持つためである。これは、２つの例示的なフラグメントによって表され、上部フラグメントは、一端に固有の異なったプライミング部位配列１と、他の一端に固有の異なったプライミング部位配列２とを有する。同様に、下部フラグメントは、一端に固有の異なったプライミング部位配列２（上部フラグメントの右端と同じプライマー結合部位配列）と、他の一端に固有の異なったプライミング部位配列３とを有する。図に示すように、２つのフラグメント間の切断部位はトランスポソーム２によって生成され、左側の切断部位（すなわち、図３の上部フラグメントの右側を見る）は、固有の異なったプライミング部位配列２を有する１つのトランスポゾンを含み、右側の切断部位（すなわち、図３の下部フラグメントの左側を見る）は、固有の異なったプライミング部位配列２（「２」はトランスポソーム２を指す）を含む。したがって、トランスポソームが各トランスポゾン上で同じプライマー結合部位配列を有する場合でも、この方法により、フラグメントの各末端に異なるプライマー結合部位配列を有するフラグメントがもたらされる。

図４に示すように、ゲノムＤＮＡの断片化及びメチルトランスポゾンの挿入は、転位／挿入部位の両端にギャップを残す。ギャップの長さは任意であるが、９塩基のギャップが典型的である。その結果、上部鎖の５’位にトランスポゾンＤＮＡ Ｔｎｐ結合部位が付着し、下部鎖の５’位にトランスポゾンＤＮＡ Ｔｎｐ結合部位が付着したゲノムＤＮＡフラグメントが得られる。トランスポゾンＤＮＡの付着又は挿入によって生じるギャップが示される。転位後、トランスポゼースを除去し、ギャップ伸長を行ってギャップを埋め、図４に示すようにトランスポゾンＤＮＡに元々設計された一本鎖オーバーハングを補完する。その後、ギャップを埋めたフラグメントを、キャリアＤＮＡの存在下でシトシンをウラシルに変換するための化学処理に供する。これらの化学的に処理されたフラグメントを、次いで、本明細書に記載されるように、増幅及び精製に供することができる。

一態様によれば、次いで、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１×ＮＥＢ Ｑ５反応バッファー、それぞれ１２５ｎＭの２０個のプライマー、及び０．０２Ｕ／μＬ Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼを含むＤＮＡポリメラーゼ反応混合物を添加し、転位によって残されたギャップを埋めるために、７２℃で３分間インキュベートする（図４）。更に図５に示すように、図４に示すフラグメントをマルチプレックスＰＣＲ増幅に供してアンプリコンを生成する。１５サイクルのＰＣＲ反応を次のように（９８℃で３０秒、６５℃で１分、７２℃で２分）実施することにより標的ゲノムＤＮＡを増幅する。次いで、増幅産物をＺｙｍｏ ＤＮＡ精製カラムによって精製する。

実施例ＩＩ
一般的なプロトコル
単一細胞を溶解バッファーに溶解する。Ｔｎ５転位は、本明細書に記載されるように、それぞれ異なった固有のプライマー結合部位配列を有する（又はそれぞれが２つの異なった固有のプライマー結合部位配列を有する）トランスポソームを含む及びメチルトランスポゾンを含むトランスポソームライブラリーを用いて行われ、転位バッファーを細胞溶解物に添加し、これをよく混合し、５５℃で１０分間インキュベートする。転位後に１ｍｇ／ｍｌのプロテアーゼを添加して、トランスポゼースが単一細胞ゲノムＤＮＡに結合しないようにする。Ｑ５ ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、ＰＣＲ反応バッファー、及びプライマーを反応混合物に添加し、７２℃に１０分間加熱して、トランスポゾン挿入から生じるギャップを埋める。１００ｂｐ～４０００ｂｐの超音波処理ラムダＤＮＡ等のキャリアＤＮＡ、及びシトシンをウラシルに変換するための化学試薬又は酵素試薬を添加し、シトシンからウラシルへの変換を行う。この工程は、事前の精製なしに行うことができる。次いで、化学的に処理されたフラグメントを５サイクル～２５サイクルのＰＣＲ反応に供し、単一細胞のゲノムＤＮＡを増幅する。この工程は精製せずに行うことができる。増幅産物を、ハイスループットディープシーケンシング等の更なる分析のために精製する。

実施例ＩＩＩ
細胞溶解
細胞を選択し、培養皿から切り取り、レーザー解剖顕微鏡（ＬＭＤ－６５００、Leica）を使用してチューブに次のように分注する。細胞を膜コーティングされた培養皿にプレーティングし、１０倍対物レンズ（Leica）の明視野顕微鏡検査を用いて観察する。次いで、ＵＶレーザーを使用して、個々に選択された細胞の周りの膜を切断して、ＰＣＲチューブのキャップに落ちるようにする。チューブを短時間遠心分離して、細胞をチューブの底に落とす。３μｌ～５μｌ溶解バッファー（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ ｐＨ７．８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、５００μｇ／ｍｌのＱｉａｇｅｎプロテアーゼ）をＰＣＲチューブの側面に添加し、遠沈した。次いで、捕捉した細胞をＰＣＲ機で次の温度スケジュールを使用して熱溶解する：５０℃で３時間、７５℃で３０分。或いは、ＥＤＴＡ及びＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ（QIAGEN）等のプロテアーゼを１０μｇ／ｍＬ～５０００μｇ／ｍＬの濃度で含む低塩溶解バッファーに単一細胞を口ピペットで移す。インキュベーション条件は、使用するプロテアーゼによって異なる。ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼの場合、インキュベーションは１時間～４時間、３７℃～５５℃である。次いで、プロテアーゼを８０℃まで熱不活性化し、更に、４－（２－アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）又はフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）（Sigma Aldrich）等の特異的プロテアーゼ阻害剤によって不活性化する。細胞溶解物を－８０℃で保存する。

単一細胞溶解の手順の例を以下に示す：
（１）溶解バッファーをａ）２０μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０（Invitrogen １５５６８０２５；最終：２０ｍＭ）；ｂ）４μＬの５Ｍ ＮａＣｌ（Invitrogen ＡＭ９７６０Ｇ；最終：２０ｍＭ）；ｃ）１５μＬの１０％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Sigma ９３４４３；最終：０．１５％）；ｄ）１５０μＬの１００ｍＭ ＤＴＴ（Sigma ４３８１６；最終：１５ｍＭ）；ｅ）２μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡ（Invitrogen ＡＭ９２６０Ｇ；最終：１ｍＭ）；ｆ）５μＬの１００μＭ キャリアｓｓＤＮＡ（最終：５００ｎＭ）；及びｇ）８０４μＬの水から調製する。組み合わせを混合し、－２０℃で保存する。
（２）２×転位バッファー（細胞あたり５μＬ；１ｍＬの場合は下記のレシピ）を次のように調製する。ａ）２０μＬの１Ｍ ＴＡＰＳ ｐＨ８．５（Boston Bio Products ＢＢ－２３７５）（最終：２０ｍＭ）；ｂ）１０μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ_２（最終：１０ｍＭ）；ｃ）３２０μＬの５０％ＰＥＧ ８０００（Hampton Research ＨＲ２－５３５）（最終：１６％）；ｄ）６５０μＬの水。組み合わせを混合し、－２０℃で保存する。
（３）溶解を次のように行う：７．５ｍｇ／ｍＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼを、ａ）１μＬの６０ｍｇ／ｍＬ Ｑｉａｇｅｎプロテアーゼ及びｂ）７μＬの水から調製する。２μｌ溶解バッファーをチューブごとに添加する。０．５μｌの７．５ｍｇ／ｍｌ ＱＰをチューブごとに添加する。細胞を密閉ＰＣＲ機において２．５μＬ量で、次のサイクル（ａ）５０℃で１時間、ｂ）６５℃で１時間、ｂ）７０℃で１５分、ｃ）４℃で一定に保つ）にて溶解する。

実施例ＩＶ
転位
単一細胞溶解及びトランスポソームライブラリーを、１ｍＭ～１００ｍＭのＭｇ^２＋及び任意に１ｍＭ～１００ｍＭのＭｎ^２＋又はＣｏ^２＋又はＣａ^２＋も含むバッファー系で混合し、３７℃～５５℃で５分～２４０分間インキュベートする。反応量は細胞溶解量によって異なる。反応に追加されるトランスポソームライブラリーの量は、所望の断片化サイズに応じて簡単に調整され得る。転位反応は、ＥＤＴＡ及び任意にＥＧＴＡ又は他のイオン用キレート剤を用いてＭｇ^２＋をキレート化することによって停止する。任意に、短い二本鎖ＤＮＡをスパイクインとして混合物に加えることができる。残留トランスポソームを、ＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ等のプロテアーゼの消化により、最終濃度１μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬで３７℃～５５℃にて１０分～６０分間不活性化する。次いで、プロテアーゼを、熱及び／又はＡＥＢＳＦ等のプロテアーゼ阻害剤によって不活性化する。

例示的な方法及びコンストラクトを以下に提供する：
Ｎｅｘｔｅｒａコンストラクト：
Ｎｅｘｔｅｒａトランスポゾンは１本の５’－／Ｐｈｏｓ／－ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’（配列番号１）鎖と、５’－ＴＭＧＴＭＧＧＭＡＧＭＧＴＭＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＭＡＧ－３’（「Ｐ５」）（配列番号２）又は５’－ＧＴＭＴＭＧＴＧＧＧＭＴＭＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＭＡＧ－３’（「Ｐ７」）（配列番号３）（ＩＤＴ、精製：ＰＡＧＥ）のいずれか１本の５ｍＣ修飾鎖とを有する。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ（Illumina）を使用することもできる。Ｍはメチル化シトシンを表す。

Ｎｅｘｔｅｒａインデックスプライマー（ＩＤＴ、精製：標準脱塩、次いで０．１×ＴＥに５μＭまで溶解し、－２０℃で保存）は、
５’－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ－［ｉ７］－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ－３’及び、
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣ－［ｉ５］－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ－３’、
のフォーマットである。

配列は次のとおりである：
７０１：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＧＣＣＴＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号４）
７０２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴＡＧＴＡＣＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号５）
７０３：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号６）
７０４：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＣＴＣＡＧＧＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号７）
７０５：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＧＧＡＧＴＣＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号８）
７０６：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＴＧＣＣＴＡＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号９）
７０７：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１０）
７０８：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１１）
７０９：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＡＧＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１２）
７１０：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＧＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１３）
７１１：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＧＣＣＴＣＴＴＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１４）
７１２：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴＴＣＣＴＣＴＡＣＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ（配列番号１５）
５０１：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＧＡＴＣＧＣＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号１６）
５０２：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＴＣＴＡＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号１７）
５０３：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＡＴＣＣＴＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号１８）
５０４：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＧＡＧＴＡＧＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号１９）
５０５：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＧＴＡＡＧＧＡＧＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号２０）
５０６：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＣＴＧＣＡＴＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号２１）
５０７：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＧＴＡＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号２２）
５０８：ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＣＴＡＡＧＣＣＴＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ（配列番号２３）

本明細書に記載されるデータを生成するために使用されるコンストラクトは、次の配列のｎ＝２０タグを持つ５ｍＣ修飾配列である。プライマー結合部位配列の多くの他のかかるセットは、当業者によって設計可能であり、以下の２０個のトランスポゾンプライマー結合部位配列は、いかなる方法でも制限することを意図していないことを理解されたい。

１．ＡＧＡＡＧＭＭＧＴＧＴＧＭＭＧＧＴＭＴＡ（配列番号２４）
２．ＡＴＭＧＴＧＭＧＧＡＭＧＡＧＡＭＡＧＭＡ（配列番号２５）
３．ＡＡＴＭＭＴＡＧＭＡＭＭＧＧＴＴＭＧＭＭ（配列番号２６）
４．ＡＭＧＴＧＴＴＧＭＡＧＧＴＧＭＡＭＴＭＧ（配列番号２７）
５．ＡＭＡＭＭＡＭＡＭＧＧＭＭＴＡＧＡＧＴＭ（配列番号２８）
６．ＴＧＧＡＭＡＡＴＭＡＭＧＭＧＡＭＭＡＧＭ（配列番号２９）
７．ＴＭＡＴＭＴＡＡＭＧＭＧＭＡＭＭＧＴＧＭ（配列番号３０）
８．ＴＴＭＧＴＭＧＧＭＴＭＴＭＴＭＧＡＡＭＭ（配列番号３１）
９．ＴＧＧＴＧＧＡＧＭＧＴＧＭＡＧＡＭＴＭＴ（配列番号３２）
１０．ＴＡＴＭＴＴＭＭＴＧＭＧＭＡＧＭＧＧＡＭ（配列番号３３）
１１．ＭＴＧＡＭＧＴＧＴＧＡＧＧＭＧＭＴＡＧＡ（配列番号３４）
１２．ＭＭＡＴＭＡＴＭＭＡＡＭＭＧＧＭＴＴＭＧ（配列番号３５）
１３．ＭＡＭＧＡＧＡＡＧＭＭＧＴＭＭＧＭＴＴＡ（配列番号３６）
１４．ＭＧＴＡＭＧＴＧＭＡＡＭＡＭＴＭＭＧＭＴ（配列番号３７）
１５．ＭＴＴＧＧＴＭＡＧＧＭＧＡＧＡＡＧＭＡＭ（配列番号３８）
１６．ＧＧＭＧＴＧＡＴＭＡＧＴＧＭＧＴＧＧＡＴ（配列番号３９）
１７．ＧＡＧＭＧＴＴＴＧＧＴＧＡＭＭＧＭＭＡＴ（配列番号４０）
１８．ＧＭＭＴＧＭＧＧＴＭＭＡＴＴＧＡＭＭＴＡ（配列番号４１）
１９．ＧＴＡＡＧＭＭＡＭＴＭＭＡＧＭＧＴＭＡＭ（配列番号４２）
２０．ＧＡＴＭＴＧＴＴＧＭＧＭＧＴＭＴＧＧＴＧ（配列番号４３）

Ｔｎ５トランスポゾンは５’－／Ｐｈｏｓ／ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’から構築され、もう一方の鎖は５’－［ｔａｇ］－ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＭＡＧ－３’の形態であった。各オリゴ（ＩＤＴ、精製：ＰＡＧＥ）を０．１×ＴＥに溶解し、最終濃度１００μＭにした。ｎ＝２０個のタグのそれぞれについて、２本の鎖がそれぞれ５μＭの最終濃度でアニーリングされた。次いで、アニールされた２０個のトランスポゾンを等量でプールした。第２に、ｐＴＸＢ１－Ｔｎ５プラスミド（Addgene）からの発現後にトランスポゼースを精製した。トランスポソームを、１．２５μＭダイマー（２．５μＭモノマー）、１：１０希釈（１２５ｎＭダイマー、又は２５０ｎＭモノマー）の最終濃度でアセンブリし、単回使用のため分注し、－８０℃で保存した。

２０プライマーミックス（ＰＣＲミックス１で使用）は、５’－［ｔａｇ］ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧ－３’の形態であった。各オリゴ（ＩＤＴ、精製：標準脱塩）を０．１×ＴＥに溶解して最終濃度を１００μＭにし、等量（合計１００μＭ、又はそれぞれ５μＭ）で合わせた。－２０℃で保存する。４０プライマーミックス（ＰＣＲミックス２で使用）は、Illuminaアダプターの片側では、
５’ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－［ＭＥＴＡｔａｇ］ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧ－３’、
の形態であり、もう片側では、
５’ＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ－［ＭＥＴＡｔａｇ］ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧ－３’、
であった。各オリゴ（ＩＤＴ、精製：ＰＡＧＥ）を０．１×ＴＥに溶解して最終濃度を５０μＭにし、等量（合計５０μＭ、又はそれぞれ１．２５μＭ）で合わせ、－２０℃で保存した。

１０μｌの反応でＮｅｘｔｅｒａ又は本明細書に記載されるトランスポソームのいずれかのトランスポソームを使用するアダプター挿入のため、各単一細胞について、以下の試薬のそれぞれを低結合ＰＣＲチューブに添加する：Ａ）２．５μｌの溶解試料、Ｂ）５μｌ ２×トランスバッファー、Ｃ）２．５μｌ希釈Ｔｎ５複合体であり、５５℃で１０分間維持し、その後４℃で一定に保つ。

トランスポソーム反応を、次のように停止バッファーを使用して停止する。０．２ｍｇ／ｍｌ ＱＰを調製する；停止バッファーを調製する；１μｌの２×停止バッファー；１μｌの２ｍｇ／ｍｌ ＱＰ（最終１００μｇ／ｍｌ）。転位は、ａ）５０℃で４０分間、ｂ）７０℃を２０分間、ｃ）その後４℃に保つ条件下で実行する（１２μＬ量）ことによって停止する又は止める。

実施例Ｖ
ギャップ充填及びキャリアＤＮＡ
転位及びトランスポゼース除去後、Ｍｇ^２＋、ｄＮＴＰミックス、プライマー、及びＤｅｅｐｖｅｎｔ ｅｘｏ－ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs）等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応混合物を適切な温度で適切な時間、溶液に添加して、転位反応によって残された９ｂｐのギャップを埋める。ギャップ充填インキュベーションの温度及び時間は、使用する特定のＤＮＡポリメラーゼに依存する。反応後、ＤＮＡポリメラーゼは、加熱及び／又はＱＩＡＧＥＮプロテアーゼ等のプロテアーゼ処理によって任意に不活性化される。次いで、プロテアーゼは、使用される場合、熱及び／又はプロテアーゼ阻害剤によって不活性化される。次いで、キャリアＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を反応媒体に添加する。存在するキャリアＤＮＡは、ラムダＤＮＡを超音波処理することによって作られるような、長さ１００ｂｐ～４０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含む。キャリアＤＮＡは、少なくとも２０ｎｇ、及び２０ｎｇ～５０ｎｇの量で反応媒体内に存在する。

ギャップ充填の手順の例は次のとおりである：
１．５－メチル－ｄＣＴＰ（各ｎｔ２．５ｍＭ）内でｄＮＴＰミックスを調製する。１００μＬの１０ｍＭ ｄＴＴＰ（NEB Ｎ０４４３Ｓ）、１００μＬの１０ｍＭ ｄＧＴＰ（NEB Ｎ０４４２Ｓ）、１００μＬの１０ｍＭ ｄＡＴＰ（NEB Ｎ０４４０Ｓ）を１００μＬの１０ｍＭ ５－メチル－ｄＣＴＰ（NEB Ｎ０３５６Ｓ）に加え、次いでボルテックスを行って完全に混合し、－２０℃で保存する。
２．ＰＣＲミックスを作製する（細胞あたり２３μＬ）；ａ）７μＬのＱ５反応バッファー（Ｑ５に含まれる）；ｂ）７μＬのＱ５高ＧＣエンハンサー（Ｑ５に含まれる）；ｃ）５－メチル－ｄＣＴＰ（各ｎｔ２．５ｍＭ）内の２．８μＬのｄＮＴＰミックス；ｄ）０．７μＬ １００ｍＭ ＭｇＣｌ_２（Invitrogen ＡＭ９５３０Ｇ）；ｅ）０．３５μＬのＱ５（NEB Ｍ０４９１Ｓ）；ｆ）１μｌの２０ｎｇ／μｌラムダキャリアＤＮＡ（超音波処理２００ｂｐ～３００ｂｐ）；ｇ）４．１５μｌのＨ_２Ｏをボルテックスして混合する。
３．液体に触れないようにチューブあたり２３μＬのＰＣＲミックスを加える。ボルテックスして遠沈する。
次の条件下：ａ）４℃で３分間（蓋を予熱するため）、ｂ）６５℃で３分間、ｃ）４℃で保存を実行する（３５μＬ量）ことによってギャップ充填を行う。
クリーンアップの場合：１．２００μｌ結合バッファーをｐｃｒチューブに直接加え、１０回混合し、カラム（ＺＹＭＯ ＤＣＣ）に移す；２．２００μｌで２回洗浄する；３．１７．８μｌの溶出バッファーで溶出する（ｅｄｔａなし、ＥＭ－ｓｅｑキットのＮＥＢの白色キャップのボトル）。

実施例ＶＩ
シトシンのウラシルへの化学変換又は酵素変換
次いで、キャリアＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を化学試薬と共に反応媒体に追加して、シトシンをウラシルに変換する。シトシンのウラシルへの化学変換又は酵素変換中に存在するキャリアＤＮＡは、ラムダＤＮＡを超音波処理することによって作り出されるような、長さ１００ｂｐ～４０００ｂｐのＤＮＡフラグメントを含む。キャリアＤＮＡは、少なくとも２０ｎｇ、及び２０ｎｇ～５０ｎｇの量で反応媒体内に存在する。

実施例ＶＩＩ
ＤＮＡフラグメント増幅
一態様によれば、当業者に知られている一般的な方法を用いて、ＤＮＡフラグメントを増幅する。上記の実施例からの化学変換されたフラグメントを、水性媒体中でＰＣＲ反応試薬と組み合わせる。次いで、水性媒体をＰＣＲ条件に供し、各ＤＮＡフラグメントをＰＣＲで増幅する。

実施例ＶＩＩＩ
ＤＮＡフラグメントアンプリコンのシーケンシング
一態様によれば、フラグメントは、当業者に知られている方法を用いて配列決定され、配列はコンピューター可読メモリに記憶される。次いで、この配列は、当業者に知られているソフトウェア方法を含む方法を使用して、ゲノム配列と比較し、アセンブルすることができる。

実施例ＩＸ
単一細胞のメチル化検出
本開示の一態様を図７に示す。
（１）標的ＤＮＡを、単一細胞、又は２細胞、又は４細胞、又は．．．１００細胞から抽出する。かかる抽出されたＤＮＡは少量であると考えられる。
（２）標的ＤＮＡを断片化し、Ｔｎ５トランスポソームを用いてメチルトランスポゾンを挿入又は結合させる。Ｔｎ５に結合するトランスポゾンプライマーは、全てのシトシンで完全にメチル化されている。その結果、完全にメチル化されたＰＣＲアダプターを含む標的ＤＮＡのフラグメントが生成される。
（３）フラグメントはギャップ充填される。ギャップ充填の後、キャリアＤＮＡを反応に追加する。キャリアＤＮＡを、超音波処理されたラムダＤＮＡから、１００ｂｐ～４００ｂｐを有するフラグメントにする。
（４）反応媒体をＤＮＡスピンカラムによって精製する。ＤＮＡ変換を、NEB製のＥＭ－ｓｅｑキットを使用して行った。ＥＭ－ＳｅｑキットのＡＢＯＰＥＣ工程を、量（volume）を４０μｌに減らすように変更する。
（５）変換後、Ｑ５Ｕポリメラーゼ及びバッファーを、ＤＮＡ精製を行わずに直接反応に追加する。全ゲノム増幅を、本明細書に記載されるように、Ｎｅｘｔｅｒａ ＰＣＲプライマー（Ｎｅｘｔｅｒａトランスポソームシステムを使用する場合）又はＰＣＲプライマーを使用して実施する。
（６）ＰＣＲ反応後、反応媒体を精製して一本鎖キャリアＤＮＡを除去し、ＤＮＡシーケンシングのため精製ライブラリーの準備を整える。

図８に示すように、キャリアＤＮＡを用いたトランスポソームアプローチを用いた本明細書に記載の方法は、既存の単一細胞全メチロームシーケンシング手法と比較して、より高いゲノムカバー率をもたらした。図９に示すように、キャリアＤＮＡを用いたトランスポソームアプローチを使用する本明細書に記載の方法は、既存の単一細胞全メチロームシーケンシング手法と比較して、より高いマッピング率をもたらした。図１０に示すように、キャリアＤＮＡを用いたトランスポソームアプローチを使用する本明細書に記載の方法は、既存の単一細胞全メチロームシーケンシング手法と比較して、より高い精度をもたらした。手法としては、ｓｃＷＧＢＳ（非特許文献４）、及びｓｃＣＯＯＬ－ｓｅｑ（"Guo, F., Li, L., Li, J., Wu, X., Hu, B., Zhu, P., ... & Tang, F. (2017). Single-cell multi-omics sequencing of mouse early embryos and embryonic stem cells. Cell research, 27(8), 967."）が挙げられる。

実施例Ｘ
酵素Ｍｅｔｈｙｌ－ｓｅｑキットの変換
５－メチルシトシン及び５－ヒドロキシメチルシトシンの酸化
１．ＴＥＴ２バッファーを調製する。
１００μｌのＴＥＴ２反応バッファー（ＴＥＴ２に含まれる）を１本のＴＥＴ２反応バッファーサプリメント（ＴＥＴ２に含まれる）のチューブに加え、よく混ぜてから－２０℃で保存する。
２．新たに希釈した鉄（ＩＩ）を調製する。
５００ｍＭ鉄（ＩＩ）溶液（ＴＥＴ２に含まれる）を水で０．４ｍＭに希釈する。
３．氷上で、９．６μＬの酸化プレミックス（６μＬの再構成されたＴＥＴ２反応バッファー（ＴＥＴ２に含まれる）、０．６μＬの酸化サプリメント（ＴＥＴ２に含まれる）、０．６μＬの酸化増強剤（ＴＥＴ２に含まれる）、２．４μＬのＴＥＴ２（Ｅ７１２０Ｓ））を１７．４μｌのタグ付けされた（tagmented）ＤＮＡに直接添加する。ボルテックスで完全に混合し、短時間遠心分離し、次いで３μＬの新たに希釈した０．４ｍＭ鉄（ＩＩ）を加えて合計量３０μＬにする。ボルテックスでよく混ぜてから、短時間遠心分離する。３７℃で１時間インキュベートし、次いで４℃にてサーモサイクラーでインキュベートする。ＴＥＴ反応の総量は３０μｌで、低インプットＤＮＡには十分である。総量は２０μｌ～４０μｌであり得る。この範囲の体積は、ＤＮＡの損失を減らすために、続く精製工程を同じ単一チューブで実施できるという利点がある。
４．０．６μｌの停止試薬（ＴＥＴ２に含まれる）を加える。ボルテックスでよく混ぜてから、短時間遠心分離する。３７℃で３０分間インキュベートし、次いで４℃にてサーモサイクラーでインキュベートする。

酸化ＤＮＡのクリーンアップ
１．２００μｌの結合バッファーをＰＣＲチューブに直接加え、１０回混合し、カラムに移す（ＺＹＭＯ ＤＣＣ）
２．２００μｌで２回洗う
３．１２．３μｌの溶出バッファーで溶出（ＥＤＴＡなし、ＥＭ－ｓｅｑキットのＮＥＢの白色キャップのボトル）
ＤＮＡのカラム精製は、精製によるＤＮＡの損失を最小限に抑えるために、ビーズ精製を行うことが好ましい。

水酸化ナトリウムによるＤＮＡの変性
１．９９μＬの水に１μＬの１０Ｍ ＮａＯＨを加えることで、新たに希釈した０．１Ｎ ＮａＯＨ（Sigma）を調製する。
２．１２μＬの酸化ＤＮＡに３μｌの０．１Ｎ ＮａＯＨを加える。ボルテックスして混合し、次いで短時間遠心分離する。予熱したサーモサイクラーで５０℃にて１０分間インキュベートする。次いで、氷上に置き、次のセクションに進む。

シトシンの脱アミノ化
１．１．４８μｌ～９９８．５２μｌの水を加えることで、３７％の塩酸（Sigma ３０７２１）を０．０１８Ｍに希釈する。
２．氷上で、１５μｌの変性ＤＮＡに７μＬの０．０１８Ｍ ＨＣｌを加える。
３．氷上で、１８μＬの脱アミノ化プレミックス（１３．２μＬの水、４μＬのＡＰＯＢＥＣ反応バッファー（ＡＰＯＢＥＣに含まれる）、０．４μＬのＢＳＡ（ＡＰＯＢＥＣに含まれる）、０．４μＬのＡＰＯＢＥＣ（Ｅ７１２０Ｓ））を加える。ボルテックスしてよく混合し、短時間遠心分離する。
４．３７℃で３時間インキュベートし、次いで４℃にてサーモサイクラーでインキュベートする。
変性工程及びＡＢＯＰＥＣ反応の反応量は４０μｌであり、３０μｌ～６０μｌであり得る。この量は、ＡＰＯＢＥＣによる処理後のＤＮＡ精製工程を回避できるという利点がある。ＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼ及びプライマーを含む４０μｌのＰＣＲバッファーミックスを４０μｌのＡＢＯＰＥＣ反応に添加することによって直接行うことができる。

実施例ＸＩ
ＰＣＲによるライブラリー調製
Ｎｅｘｔｅｒａコンストラクト
４０μｌの脱アミノ化システム、４０μｌのＱ５Ｕ ２×マスターミックス、及び０．４μｌの１００ｍＭ ｎｅｘｔｅｒａ ｉｎｄｅｘ（Ｐ５及びＰ７）を合わせる。次のことを実行して増幅する（８０．８μＬ量）：ａ）４℃で３分（蓋を予熱するため）、ｂ）９８℃で２０秒、ｃ）９８℃で１０秒、６２℃で３０秒、６５℃で１分を１２サイクル、ｅ）６５℃で５分間、及びｆ）４℃で一定にする。ＡＭｐｕｒｅビーズを使用した１．２×ビーズサイズの選択。

ＭＥＴＡ（マルチエンドタギング増幅）コンストラクト：
以下を合わせる：ＭＥＴＡ ２０プライマーミックス、２μＬ；４０μｌのＤＮＡ溶出；４０μｌのＱ５Ｕ ２×マスターミックス；９８℃で２０秒間インキュベーション、１０サイクルの［９８℃で１０秒、６２℃で３０秒、６５℃で１分］、及び６５℃で５分間。増幅産物を、この工程で１３．８μＬの溶出バッファーで精製し、シーケンスライブラリーを２つの追加のＰＣＲ工程で調製した。最初のＰＣＲ工程では、１６．５μＬのＰＣＲミックス２（１５μｌのＱ５Ｕ ２×マスターミックス及び１．５μＬの４０プライマーミックス）を添加し、９８℃で３０秒間、９８℃で１０秒間＋６２℃で３０秒間＋６５℃で１分間を２サイクル、及び６５℃で５分間インキュベーションすることにより、ＰＣＲを実施した。第２のＰＣＲ工程では、プライマーも同様に１μＬの２０Ｕ／μＬ ＥｘｏＩ（NEB Ｍ０２９３Ｓ）を添加し、３７℃で３０分間、７２℃で２０分間インキュベーションすることによって除去した。ＰＣＲを、同様に、２．５μＬのＮＥＢインデックスプライマー（NEB Ｅ７３３５Ｓ、Ｅ７５００Ｓ、Ｅ７７１０Ｓ、Ｅ７７３０Ｓ）及び６．５μＬのＰＣＲミックス３（５μＬ Ｑ５Ｕ ２×マスターミックス（NEB）、１．２５μＬの水、０．２５μＬのユニバーサルプライマー（ＩＤＴ、精製：ＰＡＧＥ））を添加し、９８℃で３０秒、９８℃で１０秒間＋６２℃で３０秒＋６５℃で１分間を２サイクル以上、及び６５℃で５分間インキュベーションを行うことによって実施した。ライブラリーを、この工程で、又はその後の任意の工程でプールすることができた。１．２×ＡＭｐｕｒｅビーズをサイズ選択に使用する。

実施例ＩＸ
キット
開示された増幅方法に必要な材料及び試薬を、キットに組み入れることができる。本開示のキットは、一般に、必要に応じてプライマーセットと共に特許請求の範囲に記載の方法を行うのに必要な、少なくともトランスポソーム（トランスポゼース酵素及びトランスポゾンＤＮＡからなる）、ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ、キャリアＤＮＡ、及びシトシンをウラシルに、又は５－メチルシトシンをウラシルに変換するための化学試薬を含む。好ましい実施形態において、キットは、ＤＮＡ試料からＤＮＡを増幅するための指示も含む。例示的なキットは、全ゲノムＤＮＡの増幅で使用するのに適したキットである。いずれの場合も、キットは、個々の試薬、酵素、又は反応物ごとに別々の容器を有することが好ましい。各作用物質は、一般に、それぞれの容器に適切に配分される。キットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル又は試験管を含む。フラスコ、ボトル、及び試薬を入れて分注する他の容器手段も可能である。キットの個々の容器は、商業販売のために密閉して保管することが好ましい。適切な大型容器は、所望のバイアルが保持される射出成形又はブロー成形されたプラスチック容器を含む場合がある。キットと共に説明書が提供されることが好ましい。

Claims (34)

1. 標的ゲノムＤＮＡのメチル化特性を分析する方法であって、
   ゲノムＤＮＡをトランスポソームのライブラリーに接触させることと、
   前記ライブラリーの各トランスポソームが２つのトランスポゼースと２つのトランスポゾンＤＮＡとを有し、各トランスポゾンＤＮＡがトランスポゼース結合部位及びプライマー結合部位配列を含み、前記プライマー結合部位配列が前記トランスポソームライブラリーの他のメンバーの前記プライマー結合部位とは異なり、各トランスポゾンＤＮＡが１つ以上の５－メチルシトシンを含み、
   前記トランスポソームのライブラリーが前記ゲノムＤＮＡに沿った標的位置に結合し、前記トランスポゼースがゲノムＤＮＡフラグメントライブラリーを表す複数の二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントへとゲノムＤＮＡを切断し、各二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントが１つ以上のシトシン及び／又は１つ以上の５－メチシトシンと、前記ゲノムＤＮＡフラグメントの各末端にある固有の及び／又は異なったプライマー結合部位配列とを含む；
   前記トランスポゾンＤＮＡと前記ゲノムＤＮＡフラグメントとの間のギャップを埋めて、各末端に固有の及び／又は異なったプライマー結合部位配列を有する二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物のライブラリーを形成することと、
   前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物のライブラリーを処理して、キャリアＤＮＡの存在下でシトシンをウラシルに変換することと、
   前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメント伸長産物を増幅してアンプリコンを生成することと、
   を含む、方法。
2. 前記アンプリコンを配列決定することを更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームが、２つの異なるプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記トランスポソームのライブラリー内の各トランスポソームが、前記トランスポソームの各トランスポゾン上に２つの同一のプライマー結合部位配列を含み、該プライマー結合部位配列が、前記トランスポソームのライブラリーの他のトランスポソームにおけるプライマー結合部位配列とは異なる、請求項１に記載の方法。
5. 前記ゲノムＤＮＡが単一細胞から得られた全ゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
6. 前記トランスポゼースがＴｎ５トランスポゼース、Ｍｕトランスポゼース、Ｔｎ７トランスポゼース、又はＩＳ５トランスポゼースである、請求項１に記載の方法。
7. 前記トランスポゾンＤＮＡが、１９ｂｐの二本鎖Ｔｎｐ結合部位及びオーバーハングを含み、前記オーバーハングが、該オーバーハングの５’末端に固有及び／又は異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
8. 前記二本鎖ゲノムＤＮＡフラグメントのギャップ充填及び伸長の前に、結合したトランスポゼースを前記二本鎖フラグメントから除去する、請求項１に記載の方法。
9. 前記ゲノムＤＮＡが出生前細胞、癌細胞、又は循環腫瘍細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
10. 前記ゲノムＤＮＡが、単一の出生前細胞、単一の癌細胞、又は単一の循環腫瘍細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
11. 前記固有の異なったプライマー結合部位配列が特異的ＰＣＲプライマー結合部位である、請求項１に記載の方法。
12. 前記トランスポソームのライブラリーが、１個～１００個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記トランスポソームのライブラリーが、１個～１０個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記トランスポソームのライブラリーが、５個～５０個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
15. 前記トランスポソームのライブラリーが、３０個～１００個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
16. 前記トランスポソームのライブラリーが、１５個～２５個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
17. 前記トランスポソームのライブラリーが、１００個～１０００個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
18. 前記トランスポソームのライブラリーが、１０００個～１００００個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
19. 前記トランスポソームのライブラリーが、１００００個～１０００００個の固有の異なったプライマー結合部位配列を含む、請求項１に記載の方法。
20. 前記異なったプライマー結合部位配列が直交している、請求項１に記載の方法。
21. 前記トランスポゾンＤＮＡが全てのシトシンでメチル化されている、請求項１に記載の方法。
22. 前記トランスポゾンＤＮＡがメチル化シトシンアダプターを含む、請求項１に記載の方法。
23. 前記ギャップ充填工程が、ｄＮＴＰ混合物においてｄＣＴＰの代わりにメチル化ｄＣＴＰを使用することを含む、請求項２２に記載の方法。
24. 前記キャリアＤＮＡが、１００塩基対（ｂｐ）～４キロ塩基対の長さを有するｄｓＤＮＡフラグメントからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
25. 前記キャリアＤＮＡが標的ＤＮＡと異なる又は同じＤＮＡ型である、請求項１に記載の方法。
26. 前記キャリアＤＮＡが超音波処理されたラムダＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
27. 前記キャリアＤＮＡがIlluminaシーケンシングアダプターを含まない、請求項１に記載の方法。
28. 前記キャリアＤＮＡが、試料ＤＮＡの量の１００倍～１００００倍の量で反応媒体に添加される、請求項１に記載の方法。
29. 前記ギャップ充填工程の後、かつ前記変換工程の前の工程、すなわち、前記ギャップ充填された二本鎖セグメント及びキャリアＤＮＡを含む反応媒体を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
30. 前記精製工程がＤＮＡスピンカラム又はビーズベースのＤＮＡ精製によって行われる、請求項２９に記載の方法。
31. 前記ギャップ充填された二本鎖セグメント及びキャリアＤＮＡを含む反応媒体を、精製せずに直接、前記変換工程に進める、請求項１に記載の方法。
32. シトシンをウラシルに変換する試薬がバイサルファイトではないか、又はバイサルファイトを除外する、請求項１に記載の方法。
33. 前記変換工程の後、かつ前記増幅工程の前の工程、すなわち、化学的に変換されたフラグメントを含む反応媒体を精製することを更に含む、請求項１に記載の方法。
34. 化学的に変換されたフラグメントを含む反応媒体を精製せずに直接、前記増幅工程に進める、請求項１に記載の方法。

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