CN106574287B - 用于核酸扩增的样品制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备用于随后核酸(例如DNA)扩增的样品的方法，该方法比现有的方法更简单进行。

Description

用于核酸扩增的样品制备
发明的技术领域
本发明涉及用于制备用于随后核酸(例如DNA)扩增的样品的方法，该方法比现有的方法更容易进行。特别是，本发明涉及其中不需要在扩增之前从样品纯化核酸(例如DNA)的方法。
发明背景
常规的DNA扩增方法通常需要在扩增步骤之前获得纯化的DNA。纯化过程通常需要酶消化或裂解细胞样品中的细胞，随后是一个或更多个分离步骤从细胞碎片分离出DNA，这可包括一个或更多个洗涤步骤和将纯化的DNA最终洗脱进管中准备用于在扩增过程(诸如PCR)中使用。该过程通常花费30分钟以上，通常40分钟或更多。
最近，Sigma开发了所谓的‘Extract-N-AmpTM血液PCR试剂盒’，其含有从全血提取宿主基因组DNA并通过PCR扩增感兴趣的靶必需的试剂。该提取系统降低了对于纯化、有机提取、离心、加热、过滤或乙醇沉淀的需要。试剂盒还包括PCR预混合物，尤其被配制用于直接从提取物扩增。该制品使用基于热启动(Hot Start)的抗体用于特异扩增。通过简单地添加提取溶液(其似乎是氢氧化钾)和在室温孵育持续5分钟，从10μl全血提取基因组DNA。在PCR之前，将中和溶液添加到提取物中抵消抑制物质。然后，将一部分的DNA提取物添加到专门配制的PCR混合物中。
本发明的目标是提供在扩增之前不需要纯化DNA的样品制备方法。优选地，那些方法仅需要简单的试剂，这降低了进行制备的人员的时间和成本负担。
发明概述
在本发明的一个实施方案中，提供了制备用于文库扩增和随后扩增的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)提供含有核酸的细胞样品；
(b)裂解样品的细胞以从细胞样品的细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和
(c)从裂解的样品扩增核酸；
其中在开始扩增步骤(c)之前，不从裂解的样品纯化核酸。
优选地，核酸是DNA。
优选地，样品是临床或非临床样品。
优选地，样品是血液样品。
优选地，血液样品是全血样品。
在一个实施方案中，样品取自培养物。在另一个实施方案中，样品取自微生物培养物(例如，血液培养物)。
优选地，样品是非血液样品，诸如组织样品(例如肿瘤、活体组织切片)、抽出物等等。
优选地，裂解试剂是水，优选地纯化水/蒸馏水。
优选地，裂解试剂不是水。实例可以包括去污剂、酸、碱、酶。
优选地，样品和裂解试剂被混合在一起以实现更均匀的分布。
任选地，还将酶添加到裂解物以便于破坏DNA结构。优选地，酶是蛋白酶K。
任选地，如果需要，在用裂解试剂裂解细胞之后存在中和步骤以使裂解试剂失活。优选地，该中和步骤在扩增步骤(c)之前。在一些方面，中和步骤可被看作孵育期的一部分。当标签化将作为扩增过程的一部分被进行时，还可以进行同一或另外的中和步骤，以便中和裂解物中可能干扰随后的扩增步骤的任何其他剂，诸如蛋白酶K。
任选地，在合并样品和裂解试剂之后，存在孵育期。孵育期应足以允许裂解样品中的细胞的部分，优选地大部分或基本全部或全部，包括其细胞膜(和优选地包括核膜)，以使得细胞的核酸(例如DNA)变得可用于合适的扩增。尽管孵育可以发生在高于室温的温度，孵育不必意味着使用升高的温度。孵育可以发生在室温或接近室温，或在低于室温。孵育时间可以范围从几秒钟例如约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒钟到几分钟例如约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6,5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10分钟。取决于样品和/或裂解试剂，可以需要更长的孵育期，诸如约20、30、40、50、60、70、80、90分钟。包括以上提到的任一时间的组合分别作为下限和上限的孵育时间的范围(例如约0.5-10分钟、约1-5分钟、约2-5分钟、约1-8分钟等等)也是允许的。
在本发明的一个方面，裂解样品和扩增包含在其中的核酸的步骤在单锅反应(single pot reaction)中进行。
从裂解细胞形成的裂解物可以包含当细胞被裂解时产生的所有内容物和细胞膜的碎片等等，诸如例如细胞质和其组分。在本发明的上下文中，裂解物还可以被看作是裂解的细胞的内容物，排除诸如以下的物质：细胞膜碎片和较大的细胞碎片(诸如细胞器等等(例如在裂解步骤期间免于被裂解的))。换句话说，裂解物可以包含细胞的胞质溶胶连同脂质、蛋白质和核酸。
术语“在开始扩增步骤(c)之前，不从裂解的样品纯化核酸”，意指在起始扩增过程之前，核酸(例如DNA)不被从裂解物分离或分开(扩增过程自身当然可以包括纯化核酸的步骤作为扩增过程的一部分)。然而，这不意指限制在裂解后和在扩增前进行的另外的步骤以改变或修饰核酸(例如DNA)或其三级结构，以便扩增过程可以成功地进行。
在本发明的一个方面，在扩增步骤之前，进行裂解物中DNA的量的定量。
在本发明的另外的实施方案中，扩增的DNA被测序以确定其序列。这可通过本领域已知的任何方法完成。优选地，其通过高通量测序，诸如合成测序方案被测序。
附图简述
图1阐明制备用于靶向DNA扩增的全血样品的方法的实例的流程图；
图2示出对于通过根据图1的方法制备的全血样品的靶向DNA扩增产生的扩增子，通过过滤的聚簇的绘图；
图3A和3B分别示出来自对通过用水稀释制备的全血样品进行的靶向DNA扩增测定的扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图；
图4示出图3A和3B的靶向DNA扩增测定的测序量度的数据表；
图5示出从通过靶向DNA扩增直接从全血样品产生的扩增子产生的聚簇的板图(panel)；
图6阐明制备用于构建标签化的DNA文库(Nextera)的全血样品的方法的实例的流程图；
图7A和7B分别示出根据图6的方法制备的标签化的DNA文库的每条染色体测序深度的柱形图和尺寸分布的绘图；
图8阐明制备用于靶向扩增和随后测序的FFPE样品的方法的实例的流程图；
图9A示出根据图8的方法，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图和测序量度的数据表；
图9B示出使用QiaAmp DNA纯化试剂盒，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图和测序量度的数据表；
图10A和10B示出图9A和9B的QuickExtract制备的DNA和QiaAmp制备的DNA的测序量度的数据表和扩增子聚簇的绘图；和
图11A和11B分别示出来自FFPE切片的直接靶向扩增(无孵育)的扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图；和
图12阐明从干燥的血斑测序的方法的实例；
图13A(测序量度的数据表)和13B(扩增子尺寸的绘图和GC含量百分比的绘图)示出图12的测序结果；和
图14阐明从血斑标签化和测序的方法的实例，其中上图包括在水中的洗涤步骤，且下图省略在水中的洗涤步骤；和
图15(测序量度的数据表、示出文库插入物尺寸和染色体覆盖度的图)示出图14的测序结果。
图16示出根据图6中阐明的工作流程进行的，制备用于构建标签化DNA文库(Nextera)的全血样品的样品制备方法的测序量度的数据表(上部)和示出每条染色体测序深度的图(下图)。
图17示出根据图6中阐明的工作流程进行的(但对于标签化步骤使用基于珠的标签化)制备用于构建标签化DNA文库(Nextera)的全血样品的样品制备方法的测序量度的数据表(上部)和每条染色体测序深度的图(下部)。
图18示出通过在水中冲洗干燥的血斑随后标签化(Nextera)进行的制备标签化的DNA文库(Nextera)的样品制备方法的测序量度的数据表(上部)和示出每条染色体测序深度的图(下部)。
图19示出三个BBN样品(BBN1、2、3)的测序量度相比于纯化的gDNA对照的测序量度的数据表。
图20是示出对于使用BBN、干燥的血斑和对照gDNA测序的血液样品，来自普通遗传紊乱和UK遗传测试网络(UKGTN)的感兴趣的基因小组的覆盖度的图。示出了中值(上部两个小图)和标准差(下部小图)。
图21是对于使用BBN、干燥的血斑和对照gDNA测序的血液样品，比较精确度和SNP一致性调用的图。
图22示出使用标准的TruSeq Nano方法或其改进从全血样品制备DNA文库的样品制备工作流程。
图23是示出根据图22中阐明的工作流程制备的文库的GC偏好性谱的图。
图24示出比较根据图22中阐明的工作流程制备的文库的文库多样性(左图)和测序效率(右图)的图。
图25示出使用图8中列出的工作流程的改进从FFPE样品制备DNA文库的样品制备工作流程。
图26是对于使用4种不同的工作流程从3个不同的FFPE样品获得的测序文库，比较获得的覆盖度均匀度的数据表。
图27示出对于通过根据图25的两种方法制备的FFPE样品的靶向DNA扩增产生的扩增子，通过过滤的聚簇的绘图。
发明详述
本发明提供制备用于核酸扩增的样品的方法。核酸可以是DNA或RNA。在一个实施方案中，本发明提供了制备用于核酸扩增的血液样品的方法，优选地其中血液样品是全血样品。
在另一个实施方案中，本发明提供了制备非血液样品诸如组织样品(例如，福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品)用于DNA扩增的方法。此类组织样品可以是肿瘤样品。其他样品可以是活体组织切片或抽出物等等。
DNA扩增可以根据WO2010/038042公布、WO2011/025477公布、2014年12月18日提交的PCT申请PCT/US2014/071263和/或2014年12月23日提交的PCT申请PCT/EP2014/079145中描述的方法进行，其的每一个通过引用以其整体被并入本文。靶向DNA扩增可用于富集靶序列用于随后的聚簇生成和测序。
本发明的方法优选地使用(全)血或非血液(例如FFPE)组织样品作为样品输入。本发明的方法消除了对扩增之前的核酸(例如DNA)纯化的需要。
本发明还提供了样品诸如全血样品中的核酸(例如DNA)的标签化(例如使用NexteraTM方法(Illumina,Inc.))的方法。
简言之，本发明提供了以下的步骤：
(a)提供含有核酸的细胞样品；
(b)裂解样品的细胞以从细胞样品的细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和
(c)从裂解的样品扩增核酸；
其中在开始扩增步骤(c)之前，不从裂解的样品纯化核酸。
图1阐明制备用于靶向DNA扩增的全血样品的方法100的实例的流程图。例如，靶向DNA扩增可以根据WO2010/038042公布、WO2011/025477公布、2014年12月18日提交的PCT申请PCT/US2014/071263和/或2014年12月23日提交的PCT申请PCT/EP2014/079145中描述的方法进行，其的每一个通过引用以其整体被并入本文。方法100包括但不限于以下的步骤。
在步骤110，获得或提供含有核酸的样品。这可以是血液样品，或非血液样品诸如组织样品、活体组织切片、抽出物等等。组织样品的实例可以是例如肿瘤样品。如果样品是血液样品，则其优选地是全血样品。
提供的样品的量将取决于样品和将对样品进行的随后的程序。通常，液体样品的样品量可以在近似1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20μL左右。此类量适合于将经历PCR扩增过程的血液样品。在一些方面，血液样品量将是近似10μL。在其他方面，血液样品量将是近似2μL。
在本发明的实施方案中，当提供固体样品时，应该使用将释放足够核酸的足量的样品。技术人员将知晓如何制备合适量的样品。
在步骤115，裂解样品(例如全血、组织)中的细胞。例如，使小份(例如10μL)的全血样品与一定量的裂解试剂混合。裂解试剂可以是任何适合于破坏和/或溶解细胞膜的试剂。
裂解溶液是能够裂解细胞的溶液(例如，通过溶解真核细胞膜)。优选地，裂解溶液是保持核酸完整的溶液(即不使核酸链变性到链被破坏成单独的核酸的程度)。在一个实施方案中，裂解溶液可以包含一种或更多种去污剂、一种或更多种酶、或一种或更多种去污剂和一种或更多种酶的组合，并且还可包括另外的剂。在一个实施方案中，去污剂可以是非变性裂解去污剂，诸如
Figure GDA0002730677680000081
X-100、
Figure GDA0002730677680000082
X-100-R、
Figure GDA0002730677680000083
X-114、NP-40、
Figure GDA0002730677680000084
C-100、
Figure GDA0002730677680000085
X-100、
Figure GDA0002730677680000086
CA630、ArlasolveTM200、
Figure GDA0002730677680000087
96/97、CHAPS、辛基β-D-吡喃葡萄糖苷、皂苷和单十二烷基九乙二醇醚(C12E9，聚乙二醇单十二醚)。任选地，还可以包括增溶剂，诸如
Figure GDA0002730677680000088
98、
Figure GDA0002730677680000089
58、
Figure GDA00027306776800000810
35、
Figure GDA00027306776800000811
80、
Figure GDA00027306776800000812
20、
Figure GDA00027306776800000813
L64、
Figure GDA00027306776800000814
P84、非去污剂磺酸甜菜碱(NDSB 201)、amphipols(PMAL-C8)和甲基-β-环糊精。通常，非变性去污剂和增溶剂以高于其临界胶束浓度(CMC)的浓度被使用，然而变性去污剂可以以低于其CMC的浓度被添加。例如，非变性裂解去污剂可以以约0.010％到约10％、例如，约0.015％到约1.0％、例如，约0.05％到约0.5％、例如，约0.10％到约0.30％的浓度被使用(与样品稀释后的终浓度)。在另一个实施方案中，聚氧乙烯去污剂可以是优选的。聚氧乙烯去污剂可以包含结构C12-18/E9-10，其中C12-18指示从12至18个碳原子的碳链长度，且E9-10指示从9至10个氧乙烯亲水头基团。例如，聚氧乙烯去污剂可以选自由以下组成的组：
Figure GDA00027306776800000815
97、
Figure GDA00027306776800000816
96V、
Figure GDA00027306776800000817
C-100、
Figure GDA00027306776800000818
X-100、单十二烷基九乙二醇醚(聚多卡醇)或其组合。
可以在裂解溶液中使用的酶，包括但不限于，被认为是膜污染材料的酶(例如，蛋白酶XXIII、神经氨酸酶、多糖、
Figure GDA00027306776800000819
和
Figure GDA00027306776800000820
)。可以使用的其他添加剂包括但不限于，还原剂诸如2-巯基乙醇(2-Me)或二硫苏糖醇(DTT)和稳定剂诸如丙酮酸镁和保湿剂。
裂解溶液可以被缓冲到适合裂解期望的细胞的任何pH,并且将取决于多个因素，包括但不限于样品的类型、要裂解的细胞和使用的去污剂。在一些实施方案中，pH可以在从约2到约13、例如，约6到约13、例如，约8到约13、例如，约10到约13的范围。合适的pH缓冲液包括任何能够保持pH在期望的范围的缓冲液，例如，约0.05M到约1.0M CAPS。
在一个实例中，裂解试剂是来自“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒(从Sigma可得)的裂解试剂。
取决于试剂，裂解试剂的合适的体积是例如10μL到200μL。体积可以选自近似10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μL，并且将取决于要裂解的样品的量。
在一个实施方案中，当使用10μL例如血液时，裂解试剂(例如来自“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒(从Sigma可得)的裂解试剂)，例如，氢氧化钾，可以以近似20μL被使用。
优选地，裂解试剂是水，优选地蒸馏水。在一个实施方案中，优选地以90μL的量使用水，其中提供10μL样品例如血液。技术人员根据其的常识和通常的实验室实践，将能够改变使用的水的量，取决于样品尺寸。例如，可以使12μL体积的水与2μL小份的全血混合。
当将裂解试剂(例如水)添加到细胞样品(例如血液样品)中后，任选地可以混合(例如，经由涡旋混合器、或用手摇动)混合物。混合允许裂解试剂与样品均匀分布，以使得样品尽可能均匀地裂解。混合可以发生持续数秒到若干秒(例如5s到60s)。
应该理解，裂解试剂可被添加到样品，或样品可被添加到裂解试剂。
当裂解试剂和样品已被合并并且任选地混合后，存在孵育期。这允许裂解试剂有足够的时间来裂解样品中的细胞。任选的混合步骤还可以形成孵育期的时间的部分。
在一个实施方案中，使样品与裂解溶液混合，然后孵育持续足够的时间用于发生细胞膜的裂解和溶解，例如，约1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50或60秒，或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20分钟或更长，例如，约1秒到约20分钟、约1秒到约5分钟、或约1秒到约2分钟。取决于样品和/或裂解试剂，更长的孵育时间也可以是必需的。例如，近似30、40、50、60、70、80、90分钟。孵育时间将取决于裂解溶液的强度，例如，去污剂和/或酶的浓度。裂解可以发生在约2℃到约45℃，例如，约15℃到约40℃，例如，约30℃到约40℃的温度、室温等等。在一个实施方案中，裂解溶液可被加载进注射器，然后样品可被抽进注射器，以使得混合和孵育发生在注射器内。在一个实施方案中，裂解溶液可被加载进注射器，然后样品可被抽进注射器，以使得混合和孵育发生在注射器内。
在本发明的一个实施方案中，特别是当裂解试剂不是水时，在室温的孵育时间是近似5分钟。
在本发明的特别优选的实施方案中，当裂解试剂是水时(即无任何其他裂解试剂(例如去污剂))，孵育时间(室温)是近似2分钟。这代表优于使用非水去污剂裂解试剂的显著的时间节省。
在步骤120，存在任选的中和步骤。如果裂解试剂需要在扩增步骤之前被中和，这可以是需要的，由于否则将发生裂解试剂对扩增过程的干扰。
在本发明的优选的实施方案中，选择裂解试剂，以使得不需要中和步骤。使用水作为裂解试剂在扩增之前不需要随后的中和步骤。
当需要中和步骤时，技术人员将很好地知晓中和裂解试剂需要的中和剂的量。例如，裂解反应可通过添加来自“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒的中和试剂被中和。此类试剂的合适的量可以是近似180μL。
在步骤125，小份的裂解的(且任选地中和的)血液样品通过靶向DNA扩增被扩增。可以使用任何合适的扩增方法，且通常将采用PCR。本发明不必被限于特定的扩增过程。取决于采用的扩增方法的类型，扩增过程需要的裂解的样品的量将相应地改变。例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μL的量可以适合于扩增过程。例如，2或4μL。
核酸扩增和聚簇
在一些实施方案中，固定的DNA片段利用簇扩增方法来扩增，如由美国专利号7,985,565和7,115,400的公开内容所例证的，其每个的内容通过引用以全文并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的并入的材料描述了固相核酸扩增的方法，其允许扩增产物被固定在固体支持物上，以形成包括固定的核酸分子的簇或“集群”的阵列。在此类阵列上的每个簇或集群从多个相同的固定的多核苷酸链和多个相同的固定的互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列本文中通常地被称作“成簇的阵列”。固相扩增反应的产物诸如在美国专利号7,985,565和7,115,400中描述的那些是通过成对的固定的多核苷酸链和固定的互补的链的退火形成的所谓的“桥接的”结构，两种链在5'末端被固定在固体支持物上，优选地经由共价附接。簇扩增方法是其中固定的核酸模板被用来产生固定的扩增子的方法的实例。其他合适的方法也可被用来从根据本文提供的方法产生的固定的DNA片段产生固定的扩增子。例如一个或更多个簇或集群可经由固相PCR来形成，每对扩增引物中的一个或两个引物是被固定的。
在其他的实施方案中，在溶液中扩增固定的DNA片段。例如，在一些实施方案中，固定的DNA片段被裂解或者以其他方式从固体支持物释放，并且然后扩增引物在溶液中与释放的分子杂交。在其他的实施方案中，对于一个或更多个初始扩增步骤，扩增引物被与固定的DNA片段杂交，然后是随后在溶液中的扩增步骤。因此，在一些实施方案中，固定的核酸模板可被用来产生溶液相扩增子。
将领会的是，本文描述的或本领域一般已知的任何扩增方法可与通用的或靶特异的引物一起使用以扩增固定的DNA片段。用于扩增的合适的方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如在美国专利号8,003,354中描述的，通过引用以其全文并入本文。以上扩增方法可被用来扩增一个或更多个感兴趣的核酸。例如，PCR包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等可被用来扩增固定的DNA片段。在一些实施方案中，将特异地针对感兴趣的核酸的引物包括在扩增反应中。
用于核酸扩增的其他合适方法可包括寡核苷酸延伸和连接技术、滚环扩增(RCA)技术(Lizardi等,Nat.Genet.19:225-232(1998)，通过引用将其并入本文)和寡核苷酸连接测定(OLA)计算(通常参见美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP 0320 308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696和WO 89/09835,通过引用将其所有并入本文)。将领会，这些扩增方法可被设计为扩增固定的DNA片段。例如，在一些实施方案中，扩增方法可包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其包括特异地针对感兴趣的核酸的引物。在一些实施方案中，扩增方法可包括引物延伸-连接反应，其包括特异地针对感兴趣的核酸的引物。作为引物延伸和连接的非限制性实例，引物可被特异地设计为扩增感兴趣的核酸，扩增可包括用于GoldenGate测定(Illumina,Inc.,San Diego,CA)的引物,如由美国专利号7,582,420和7,611,869所例证的，通过引用将其每个以其整体并入本文。
可在本公开内容的方法中使用的典型等温扩增方法包括但不限于多重置换扩增(MDA)，如由例如Dean等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)所例证的，或等温链置换核酸扩增，由例如美国专利号6,214,587所例证的，通过引用将其每个以其全文并入本文。可在本公开内容中使用的其他的非基于PCR的方法包括例如链置换扩增(SDA)，其在例如Walker等,Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166和5,130,238，以及Walker等Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中被描述；或超支化链置换扩增，其在例如Lage等,Genome Research 13:294-307(2003)中被描述，通过引用将其每个以其全文并入本文。等温扩增方法可与用于基因组DNA的随机引物扩增的链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'外切一起使用。这些聚合酶的使用运用其高的持续性和链置换活性。高的持续性允许聚合酶产生长10-20kb的片段。如以上描述的，可在等温条件下使用具有低的持性和链置换活性的聚合酶诸如Klenow聚合酶产生较小的片段。在美国专利号7,670,810的公开内容中详细描述了扩增反应、条件和组分的另外的描述，通过引用以其全文并入本文。
在本公开内容中有用的另一个核酸扩增方法是标签化PCR(Tagged PCR)，其使用具有恒定的5’区域接着是随机的3’区域的双域引物的群体，例如在Grothues等，NucleicAcids Res.21(5):1321-2(1993)中描述的，通过引用以其全文并入本文。进行第一轮扩增以允许在热变性的DNA上基于从随机合成的3'区域单独杂交的大量起始。由于3'区域的性质，所以起始位点预期是随机遍及基因组的。其后，未结合的引物可被移除并且另外的复制可使用与恒定的5’区域互补的引物发生。
如本发明中可以看到的，比起常规DNA纯化技术(例如超过20分钟，通常30-120分钟)，使用其中无DNA纯化的核酸制备的简化的方法(例如近似2-5分钟)的时间节省是显著的。
图2示出对于通过根据图1的方法100制备的全血样品的靶向DNA扩增产生的扩增子，通过过滤的聚簇的绘图200。具体地，10μL全血、20μL裂解试剂(“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒，Sigma)、在室温孵育5min、180μL中和试剂(“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒，Sigma),4μL裂解物到PCR。当分析聚簇时，从分析结果中移除最不可信数据(通常来自重叠聚簇)。因此，原始数据被过滤以移除任何不符合如通过简洁性过滤测量的整体质量的读段。碱基访问的简洁性被计算为最亮的强度除以最亮的强度和次亮的强度的和的比率。例如，如果在前25个循环不超过1个碱基访问，“通过过滤(PF)”的聚簇具有<0.6的简洁度。当将测序读段与参考基因组(例如人类基因组)比对时，读段的前32个碱基与人类基因组中的位置匹配，并且产生比对，只要在32碱基种子内存在不超过2个错配。可以比对基因组中多于一个位置的读段还被分类为比对(aligning)，但其比对具有低的比对得分。基于量度的组合对碱基质量打分，所述量度包括其简洁性得分、其是否遵循已知的困难序列和其在何处落入测序读段。例如，可以报告具有30或更多Q得分的碱基百分比，这意味着，存在千分之一的概率，该碱基访问是错误的。报告的覆盖度量度指示基因组的特定区域已被测序读段覆盖的次数。报告的多样性量度是原始测序文库中存在的独一片段的估计数目。AT和GC退出量度指读段中AT或GC含量相对于参考中的差异。
该实验中，将小份DNA扩增产物加载到具有捕获探针的流通池上，用于克隆扩增(聚簇产生)和测序(MiSeq)。绘图200上的每个点代表一个扩增子，且示出扩增子的GC含量百分比作为每扩增子聚簇的函数。在靶向扩增测定中，例如，可以引用均匀度值。该量度报告在0.2x平均覆盖度内被覆盖的扩增子的百分比，即，其将不包括以低于所有扩增子的平均覆盖度的20％的频率被测序的扩增子。测序量度在表1中示出。数据示出，所有扩增子被覆盖。在该测序实例中，聚簇密度是1626,000聚簇每mm2流通池表面，80.54％的聚簇通过过滤，99.4％的通过过滤的聚簇比对到人类基因组，和94.7％的通过过滤的聚簇具有大于或等于Q30的质量。
Figure GDA0002730677680000141
图3A和3B示出来自制备用于靶向DNA扩增的全血样品的简化的方法的结果，其中在扩增之前使小份(10μL)的全血样品与水(90μL)混合(使用2μL裂解物用于PCR扩增过程，与用于图2的过程相同)。例如，靶向DNA扩增可以根据WO2010/038042公布、WO2011/025477公布、2014年12月18日提交的PCT申请PCT/US2014/071263和/或2014年12月23日提交的PCT申请PCT/EP2014/079145中描述的方法进行，其的每一个通过引用以其整体被并入本文。此处，孵育时间仅是近似2分钟，有效的是用来使血液样品和水混合在一起，并且然后准备扩增步骤花费的时间。
图3A和3B分别示出来自对通过用水稀释制备的全血样品进行的靶向DNA扩增测定的扩增子尺寸的绘图300和GC含量百分比的绘图350。在该实例中，使10μL全血样品与90μL水混合。在该样品制备方案中，水充当裂解剂。通过靶向DNA扩增，扩增2μL小份的样品(裂解物)。将小份DNA扩增产物加载到具有捕获探针的流通池上，用于克隆扩增(聚簇产生)和测序(MiSeq)。绘图300和350上的每个点代表一个扩增子。
这些结果示出，仅用水作为裂解试剂的DNA制备给出可与使用非水裂解试剂(例如来自“Extract-N-Amp”血液PCR试剂盒的裂解试剂，Sigma)的DNA制备可比较的结果。
图4示出图3A和3B的靶向DNA扩增测定的测序量度的数据表400。图3A、3B和4的数据示出，在水中稀释全血样品足以制备用于靶向DNA扩增和随后聚簇产生和测序的血液样品。
在本发明的又另一个实施方案中，全血样品被直接用于靶向DNA扩增。例如，靶向DNA扩增可以根据WO2010/038042公布、WO2011/025477公布、2014年12月18日提交的美国PCT申请PCT/US2014/071263和/或2014年12月23日提交的PCT申请PCT/EP2014/079145中描述的方法进行，其的每一个通过引用以其整体被并入本文。
在该实施方案中，使用酶来直接地裂解细胞(例如血液细胞)，作为扩增过程的一部分。
特别优选的酶是Phusion DNA聚合酶(New England Biolabs,Thermo
Figure GDA0002730677680000151
)，一种高保真度DNA聚合酶。高保真度DNA聚合酶对于其中扩增后DNA序列需要是正确的应用是重要的。Phusion高保真度DNA聚合酶提供高保真度和稳健的性能二者，并且因此可被用于所有的PCR应用。其结构，新颖的火球菌属(Pyrococcus)样酶与持续合成能力增强的结构域融合，增加保真度和速度。Phusion DNA聚合酶正被用于克隆，并且可被用于长或困难的扩增子。以错误率按推测比Taq DNA聚合酶低>50倍，且比激烈火球菌(Pyrococcusfuriosus)DNA聚合酶低6倍，Phusion据称是可得的最准确的热稳定聚合酶之一。PhusionDNA聚合酶具有5′→3′聚合酶活性、3′→5′外切核酸酶活性，并且将产生平末端产物。
图5示出从通过靶向DNA扩增直接从全血样品产生的扩增子产生的聚簇的板图。在该实例中，2μL的全血直接与48μL的含有Phusion酶的PCR混合物混合(50μL反应体积)。使用10、1、0.1、0.01和0.001μL的扩增的PCR产物，进行聚簇产生。PhiX(5pM)和靶序列阳性对照被用作阳性对照。
图6阐明本发明的另一方面的流程图，在此情况中是制备样品(例如全血)用于构建标签化的DNA文库(例如经由NexteraTM、Illumina,Inc.)的方法600。方法600包括但不限于以下步骤。
在步骤610，获得或提供样品(例如全血)。
在步骤615，使小份(例如2μL)的全血与水(例如12μL)混合。
在步骤620，作为当扩增过程涉及标签化时的特殊步骤，将蛋白酶K添加到血液样品中以破坏染色质。如果不添加蛋白酶K，则DNA不完全解折叠(即保持与组蛋白关联)，且DNA的较大的序列最终变得标签化。在一个实例中，将1μL的蛋白酶K添加到14μL血液+水样品，并且在近似56℃孵育持续20分钟。随后通过在70℃加热样品持续10分钟，使蛋白酶K失活。
该反应有利地作为单锅反应进行，再次，在标签化步骤之前不需要DNA的任何纯化。
在步骤625，使用修改的Nextera反应来产生标签化的DNA文库，使样品被标签化。在一个实例中，标签化方案是基于快速裂解方案，Nextera试剂盒#1502811和有索引的试剂盒#15028216。简而言之，将25μL标签DNA缓冲液(TD)和10μL标签DNA酶(TDE1)添加到快速裂解样品中，并且在55℃孵育持续5分钟。然后，使样品在冰上冷却。使用Zymo纯化柱纯化样品，并且洗脱到25μL。使用5μL的两个索引引物(例如，索引N702和N507)、15μL Nextera PCRmastermix(NPM)、和5μL PCR引物混合物(PPC)，20μL小份的纯化的样品被PCR扩增。根据制造商的建议，进行热扩增。如果需要，使用重悬缓冲液(RSB)将样品体积调整到30μL，且使用SPRI珠纯化。用32.5μL RSB将纯化的文库从SPRI珠上洗脱下来。确定文库中的片段尺寸分布和DNA浓度。
图7A和7B分别示出根据图6的方法600制备的标签化的DNA文库的每条染色体测序深度的柱形图700和尺寸分布的绘图750。将小份的标签化的DNA文库加载到流通池上，用于克隆扩增(聚簇产生)和测序(MiSeq)。测序量度在表2中示出。在该测序实例中，聚簇密度是424,000聚簇每mm2流通池表面，96.65％的聚簇通过过滤，93.45％的通过过滤的聚簇比对到人类基因组，和98.2％的通过过滤的聚簇具有大于或等于Q30的质量。文库多样性是46.3亿，且人类基因组的覆盖度的深度是0.15x。GC和AT退出分别是0.35和16.31。
Figure GDA0002730677680000161
如本文使用的，术语“标签化(tagmentation)”指DNA被包含与含有转座子末端序列的适体复合的转座酶的转座体复合物的修饰。标签化导致同时的DNA片段化和适体与双链体片段的两条链的5’末端的连接。纯化步骤移除转座酶之后，例如通过PCR、连接或本领域技术人员已知的任何其他合适的方法，可将另外的序列添加到适配的片段的末端。
本发明的方法可以使用任何可以接受转座酶末端序列和破碎靶核酸的转座酶，附接转移的末端，而不是非转移的末端。“转座体”至少包括转座酶和转座酶识别位点。在一些此类系统中，被称为“转座体”，转座酶可以与转座子识别位点形成能够催化转座反应的功能复合物。在有时被称为“标签化”的过程中，转座酶或整合酶可以结合到转座酶识别位点并且将转座酶识别位点插入靶核酸。在一些此类插入事件中，转座酶识别位点的一条链可被转移到靶核酸中。
在标准样品制备方法中，每个模板在任一插入物末端含有适体并且通常需要很多步骤以修饰DNA或RNA并纯化期望的修饰反应产物。在将适合的片段添加至流通池之前，在溶液中进行这些步骤，其中适合的片段通过引物延伸反应被偶联至表面，所述引物延伸反应将杂交的片段拷贝至共价地附接至表面的引物的末端。然后这些‘接种’模板通过若干个循环的扩增产生拷贝的模板的单克隆簇。
在溶液中将DNA转化成适体修饰的模板，为形成簇和测序做准备所需要的步骤的数目可通过使用转座酶介导的片段化和标签化来最小化。
在一些实施方案中，基于转座子的技术可以用于使DNA片段化，例如如在NexteraTMDNA样品制备试剂盒(Illumina,Inc.)的工作流程中例证的，其中基因组DNA可被同时使输入DNA片段化并标签化的工程化的转座体片段化(“标签化”)，从而建立片段化的核酸分子的群体，所述片段化的核酸分子的群体包含在片段末端的独一的适体序列。
一些实施方案可以包括使用超活性Tn5转座酶和Tn5型转座酶识别位点(Goryshin和Reznikoff,J.Biol.Chem.,273:7367(1998))，或MuA转座酶和包含R1和R2末端序列的Mu转座酶识别位点(Mizuuchi,K.,Cell,35:785,1983；Savilahti,H,等,EMBO J.,14:4893,1995)。示例性转座酶识别位点是与超活性Tn5转座酶(例如，EZ-Tn5TM转座酶，EpicentreBiotechnologies,Madison,Wis.)形成复合物的转座酶识别位点。
可以与本文提供的某些实施方案一起使用的转座系统的更多的实例包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Tn552(Colegio等,J.Bacteriol.,183:2384-8,2001；Kirby C等,Mol.Microbiol.,43:173-86,2002)、Ty1(Devine&Boeke,Nucleic Acids Res.,22:3765-72,1994和国际公布WO 95/23875)、转座子Tn7(Craig,N L,Science.271:1512,1996；Craig,N L,Review in:Curr Top MicrobiolImmunol.,204:27-48,1996)、Tn/O和IS10(Kleckner N,等,Curr Top Microbiol Immunol.,204:49-82,1996)、Mariner转座酶(Lampe D J,等,EMBO J.,15:5470-9,1996)、Tc1(Plasterk RH,Curr.TopicsMicrobiol.Immunol.,204:125-43,1996)、P元件(Gloor,G B,Methods Mol.Biol.,260:97-114,2004)、Tn3(Ichikawa&Ohtsubo,J Biol.Chem.265:18829-32,1990)、细菌插入序列(Ohtsubo&Sekine,Curr.Top.Microbiol.Immunol.204:1-26,1996)、反转录病毒(Brown,等,Proc Natl Acad Sci USA,86:2525-9,1989)、和酵母的反转录转座子(Boeke&Corces,Annu Rev Microbiol.43:403-34,1989)。更多的实例包括IS5、Tn10、Tn903、IS911和转座酶家族酶的工程化的版本(Zhang等,(2009)PLoS Genet.5:e1000689.Epub 2009 Oct.16；Wilson C等(2007)J.Microbiol.Methods 71:332-5)。
直接从FFPE测序
本文还提出直接从FFPE样本制备测序文库的方法。在一些实施方案中，方法包括从FFPE样品扩增核酸，而不进行二甲苯去石蜡步骤。在一些实施方案中，方法包括从FFPE样品扩增核酸，而不进行单独的提取步骤。在一些实施方案中，扩增直接在包含FFPE样品的容器中进行。
图8阐明制备组织样品(例如FFPE样品)用于靶向DNA扩增和随后测序的方法800的实例的流程图。靶向DNA扩增可以例如，根据WO2010/038042公布、WO2011/025477公布、2014年12月18日提交的PCT申请PCT/US2014/071263和/或2014年12月23日提交的PCT申请PCT/EP2014/079145中描述的方法进行，其的每一个通过引用以其整体被并入本文。方法800包括但不限于以下步骤。
在步骤810，获得组织样品(例如FFPE样品的切片)。在一个实例中，FFPE样品是石蜡包埋的细胞培养物样品。在另一个实例中，FFPE样品是肿瘤样品或正常组织样品。
在步骤815，从样品提取DNA。在一个实例中，使用QuickExtract缓冲液(从EpiCentre可得)从FFPE样品提取DNA。在该实例中，将100μL的QuickExtract缓冲液添加到微量离心管中的FFPE样品中，使管涡旋，且在56℃孵育持续1小时，随后在98℃孵育持续2分钟。
在步骤820，样品中的DNA被定量。存在技术人员已知的若干方法来定量存在于混合物中的DNA的平均浓度，包括分光光度法定量和在染料存在下的UV荧光。
在步骤825，对提取的DNA样品进行靶向DNA扩增。在一个实例中，使用10ng提取的DNA进行靶向DNA扩增。
优选地，“提取的DNA”意指通过裂解细胞样品变得可接近的DNA。因此，10ng提取的DNA实际上可要求提供更大体积的裂解物。
在步骤830，扩增的DNA被稀释(例如，1/20)并且被加载到制备为带有捕获探针的流通池上，用于聚簇产生和测序(MiSeq)。
在一个实例中，图8的方法800被用于制备用于靶向扩增的结肠肿瘤FFPE样品。
图9A示出根据图8的方法800，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图900和测序量度的数据表920。图9B示出使用常规QiaAmp DNA纯化试剂盒，从自结肠肿瘤FFPE样品制备的DNA产生的扩增子的Q得分量度的柱形图940和测序量度的数据表960。
图10A和10B示出图9A和9B的QiaAmp制备的DNA和QuickExtract制备的DNA的测序量度的数据表1000和扩增子聚簇的绘图1050。在该快速提取方法的测序实例中，聚簇密度是305,000聚簇每mm2流通池表面，97％的聚簇通过过滤，97.9％的通过过滤的聚簇比对到人类基因组，和98.7％的通过过滤的聚簇具有大于或等于Q30的质量。
如在图9和10中可看到的，根据在扩增之前不采用DNA纯化的本发明的方法，结果是与在扩增之前纯化DNA的更经典的方法密切可比较的。因此，看来，本发明的方法以比常规的纯化方法更快的时间和更低的成本，在提供可比较的结果方面是有益的。
在另一个实例中，从FFPE样品提取DNA和靶向扩增可合并在单独的反应管中。例如，在上文与图8关联描述的的方法之后，首先使在QuickExtract缓冲液中的蛋白酶K热失活，并且然后以40:60的比率与靶向DNA扩增混合物合并。将水平FFPE切片添加到该缓冲液，并且在56℃孵育持续1小时，随后在98℃ 2分钟。然后，通过热循环扩增样品。数据在表3中示出。在该测序实例中，聚簇密度是941,000聚簇每mm2流通池表面，93.6％的聚簇通过过滤，99.5％的通过过滤的聚簇比对到人类基因组，和97.8％的通过过滤的聚簇具有大于或等于Q30的质量。
Figure GDA0002730677680000201
在另一个实例中，水平FFPE切片被添加到靶向DNA扩增PCR混合物中，随后直接热循环(任选地无孵育)。数据在表4中示出。在该测序实例中，聚簇密度是772,000聚簇每mm2流通池表面，94.4％的聚簇通过过滤，99.4％的通过过滤的聚簇比对到人类基因组，和98％的通过过滤的聚簇具有大于或等于Q30的质量。
Figure GDA0002730677680000202
图11A和11B分别示出来自FFPE切片的直接靶向扩增(无孵育)的扩增子尺寸的绘图1100和GC含量百分比的绘图1150。绘图1100和1150上的每个点代表一个扩增子。
这些结果再次是与包括DNA纯化的更常规的方法可比较的。
任选地，本发明还可包括扩增之后测序DNA序列的步骤。优选地，这经由高通量测序方法进行。
在一些实施方案中，如图25中阐明的，可以直接地从FFPE样品制备测序文库。图25示出使用图8中列出的工作流程的改进，从FFPE样品制备DNA文库的样品制备工作流程。使用QIAamp工具的通常的方法依赖于二甲苯去石蜡步骤，随后与蛋白酶K孵育且加热以除去交联。图26-27中，此类实施方案被称为“Qiagen纯化”。使用二甲苯去石蜡和蛋白酶K裂解的通常的方法可以要求接近3小时的处理，如图25-27中指示的(“2h 45m”)。
本文提出的方法提供了为测序准备的具有最少操作的文库，因此降低操作时间且去除用户错误和样品损失的机会。
在一些实施方案中，通过使FFPE样品与提取缓冲液诸如，例如QuickExtract缓冲液(Epicentre)或另一种合适的提取缓冲液孵育来制备测序文库。一种合适的缓冲液在下面的表5中列出。
表5
Tris HCL pH 7.5 50mM
EDTA 1mM
蛋白酶K 100mg/ml 0.5mg/ml
10％Triton X100 0.5％
在一些实施方案中，如图25中所示，将FFPE样品孵育在提取缓冲液中，诸如包含表5中组分的缓冲液。在一些实施方案中，提取步骤之后，总DNA被定量，并且一部分提取的DNA被用作输入用于靶向扩增反应，诸如如上文描述的PCR扩增。图26-27中，此类实施方案被称为“1h 20min工作流程”。
因此，在本文提出的实施方案中，使从FFPE获得的DNA经受靶向扩增，并且产生的扩增子通过例如，SBS方法测序。在一些此类实施方案中，因为从FFPE获得的DNA在被放置在测序仪器上之前未被纯化，测序设备(流通池等等)将包含来自FFPE样品的除了DNA之外的组分。FFPE组分的实例包括，例如，福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、细胞外基质组分、胶原、组织碎片等等。
因此，本文提出了在固体表面上进行聚簇反应的方法，其中聚簇反应在以下的一种或更多种的存在下进行：福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、细胞外基质组分、胶原和组织碎片。在一些实施方案中，聚簇反应在至少0.001pg石蜡的存在下进行。在一些实施方案中，聚簇反应在至少0.01pg、0.1pg、1pg、10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg或至少1mg石蜡的存在下进行。
本文提出了包含固定的扩增引物和以下的一种或更多种的流通池：福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、细胞外基质组分、胶原和组织碎片。在一些实施方案中，流通池包含至少0.001pg石蜡。在一些实施方案中，流通池包含至少0.01pg、0.1pg、1pg、10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg或至少1mg石蜡。
因此，本文提出了在固体表面上进行聚簇反应的方法，其中聚簇反应在蛋白酶K的存在下进行。在一些实施方案中，聚簇反应在至少0.001pg蛋白酶K的存在下进行。在一些实施方案中，聚簇反应在至少0.01pg、0.1pg、1pg、10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg或至少1mg蛋白酶K的存在下进行。
本文提出了包含固定的扩增引物和蛋白酶K的流通池。在一些实施方案中，流通池包含至少0.001pg蛋白酶K。在一些实施方案中，流通池包含至少0.01pg、0.1pg、1pg、10pg、100pg、1ng、10ng、100ng、1μg、10μg、100μg或至少1mg蛋白酶K。
在一些实施方案中，如图25所示，进行PCR扩增而不进行DNA定量。图26-27中，此类实施方案被称为“1h 2min工作流程”。
在图25描绘的所有实施方案中，将小份的扩增反应直接放置进MiSeq流通池，并且聚簇、随后SBS测序根据制造商说明进行。
在通常的实施方案中，FFPE切片约10μm厚。在一些实施方案中，FFPE切片的厚度可以薄到约1、2、3、4、5、6、7、8、9或超过9μm。因此，在10μm厚FFPE切片中，范围从0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的石蜡或超过20mg的石蜡可以存在。类似的，在10μm厚FFPE切片中，范围从0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20的组织或超过20mg的组织可以存在。在本文提出的实施方案中，将这些组分转移到测序流通池中。在一些实施方案中，使组织切片与10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或超过100μL的提取缓冲液接触，所述提取缓冲液包含蛋白酶，诸如蛋白酶K。一种通常的提取缓冲液在上文的表5中列出。
在一些实施方案中，如图25所示，将FFPE样品直接放置进扩增反应中，诸如PCR扩增缓冲液，而不首先进行单独的提取步骤。图26-27中，此类实施方案被称为“2min工作流程”。
图26是对于使用4种不同的工作流程从3个不同的FFPE样品获得的测序文库，比较获得的覆盖度均匀度的数据表。出人意外地，在以下的一种或更多种：蛋白酶K、福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、细胞外基质组分、胶原和组织碎片的存在下进行的聚簇和测序产生与使用纯化的DNA获得的那些测序覆盖度均匀度可比较的测序覆盖度均匀度。
图27示出对于通过根据图25的两种方法制备的FFPE样品的靶向DNA扩增产生的扩增子，通过过滤的聚簇的绘图。出人意外地，在以下的一种或更多种：蛋白酶K、福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、细胞外基质组分、胶原和组织碎片的存在下进行的聚簇和测序产生与使用纯化的DNA获得的那些测序覆盖度均匀度可比较的测序覆盖度均匀度。
直接从干燥的血斑测序
本发明人还示出，可直接地从干燥的血斑进行扩增子测序。在该实验中，图12示出，在Whatman 903滤纸上提供干燥的血斑，其中每斑～50-70ul血液。这等同于在Guthrie板上发现的用于新生儿脚后跟针刺测试的干燥的血斑。在该实验中，血液被干燥到纸上持续1-6天。
从血斑切出3mm2的部分并且放置进管中。用水冲洗这部分，这冲走血液中含有的蛋白抑制剂。DNA保持与滤纸结合。在该实例中，进行2x 5min 100ul洗涤。将冲洗的滤纸放置进带有PCR混合物的管中。可能地，这可作为一锅反应(one-pot reaction)被完成。然后，进行PCR、聚簇和测序。结果在图13A和13B中可见。
还进行实验以示出，基于标签化的全基因组测序可以对干燥的血斑进行。图14示出进行带有水洗涤步骤(上部)和不带水洗涤步骤(下部)二者的实验。再次，从血斑切出3mm2的部分并且放置进管中。在上部小图中，该部分被用水洗涤两次并且孵育持续5分钟。在下部小图中，不发生洗涤步骤。在两种情况中，然后发生标签化、PCR(有和无过滤)和测序，其结果示出在图15中。
基于珠的Nextera(BBN)
用于进行基于珠的标签化的方法(本文还被称为基于珠的NexteraTM(BBN))被描述于2015年5月28日提交的美国申请系列号62/167,463的材料中，其的内容通过引用以其整体被并入。简而言之，如在本文提出的一些实施方案中进行的，可如下进行BBN。使20μL血液样品与20μL磁珠(100nM TSM)和10ul标签缓冲液(TD)混合，并且在55℃孵育持续15min。将12.5μL NT缓冲液添加到样品，并且在室温孵育持续5min。将样品放置到磁体上，去除上清。对于每个洗涤步骤，用100μL HT2缓冲液将珠洗涤三次。使用5μL双索引引物(例如，索引N702和N507)、15μL Nextera PCR预混物(NPM)和5μL PCR引物混合物(PPC)，PCR扩增样品。根据制造商的推荐进行热扩增(例如，5个PCR循环)。将含有珠和样品的管放在磁体上，并且使用ZYMO柱(Zymo Research)和SPRI珠纯化上清。
进行基于珠的Nextera与其他全血文库制备方法的比较。图16、17和18示出根据三种不同的方法制备的标签化的DNA文库的测序量度和每条染色体测序深度。对于图16中示出的数据，通常根据图6的方法600从全血制备文库。特别是，使2μL全血与12μL水混合，并且然后在56C与蛋白酶K孵育持续10分钟。然后，将标签化试剂添加到裂解物中，并如以上描述的进行标签化。将小份的标签化的DNA文库加载到流通池上用于克隆扩增(聚簇产生)和测序(MiSeq)。对于图17中示出的数据，对以上的方案作出改进。具体地，用水裂解后，并且在与蛋白酶K孵育前，使细胞碎片成团。在蛋白酶K孵育后，使样品离心以去除固体碎片，并且然后如以上描述的进行基于珠的Nextera。对于图18中示出的数据，用水冲洗具有干燥的血斑的3mm2滤纸片持续15分钟，除去溶解的DNA，并且如以上描述的进行标签化。
分别对于图16、17和18中的三种方法，测序量度在表中示出。在该测序实例中，对于三个测序流程，聚簇密度分别是41.1亿、22.5亿和8.5亿聚簇每mm2流通池表面。表中还分别给出三种方法的GC和AT退出。
图19示出与纯化的gDNA对照和如以上描述的制备的干燥的血斑的测序量度比较，三个BBN样品(BBN1、2、3)的测序量度的比较。在该测序实例中，对于BBN样品、干燥的血斑和纯化的gDNA样品，聚簇密度、通过过滤的聚簇％、比对到人类基因组的通过过滤的聚簇％、具有大于或等于Q30质量的通过过滤的聚簇％是可比较的。图20和21示出感兴趣的基因小组的覆盖度的另外的比较(图20)和与SNP一致性相关的基因型准确度和调用(图21)，指示，三种方法的数据输出是可比较的。
非标签化的文库
在本文提出的一些实施方案中，用于从全血的文库制备方法可以包括适体连接，因此避免对标签化试剂的需要。如图22中示出的，命名为“TruSeq Nano”的标准的文库制备方法包括DNA提取、剪切(Covaris)、清除和尺寸选择(SPRI)，随后是末端修复、A加尾和适体连接。出人意外地发现，对该工作流程的修改可以极大地改进从全血样品的文库制备，如由若干量度表明的。
在一个实施方案中，描述了使用对Illumina TruSeq Nano试剂盒的修改直接从血液制备文库。简而言之，如图22中由WF-2阐明的，使16l血液与36L水和8L蛋白酶K混合，并且在56C孵育持续10min，随后在70C持续10min。以10,000g离心样品持续1min，随后使用Covaris超声剪切。然后，使用SPRI珠纯化样品，并且随后根据TruSeq Nano(Illumina,Inc)的制造商推荐，末端修复、A加尾、连接和PCR扩增。在另一个实施方案中，如图22中工作流程(WF-4)图解的，使16l血液与104LRSB(10mM Tris pH 7.0)混合，随后在COVARIS上剪切。将8L蛋白酶K添加到剪切的血液样品中，且在56C孵育持续10min，随后在70C持续10min。以10,000g离心样品持续1min。使用SPRI珠纯化样品，并且随后根据TruSeq Nano(Illumina,Inc)的制造商推荐，末端修复、A加尾、连接和PCR扩增。
图23示出从以上描述的用于全血的三个TrueSeq Nano工作流程制备的文库的GC偏好性谱。如图23中所示，WF2展现较好的GC偏好性谱，代表意外的发现和优于对照DNA样品制备的显著的改进。
图24示出，WF-2和WF-4的多样性高于对照样品的多样性。
总之，工作流程2和4(WF-2、WF-4)产生总体较好的覆盖度和可访问性(callability)。两种工作流程避免了DNA提取的需要，在成本和时间方面提供了显著的节约。
测序方法
原理上，新一代测序(NGS)与基于Sanger的测序或CE测序类似。当每个片段从DNA模板链被重新合成时，从发出的信号顺序地鉴定DNA的小片段的碱基。NGS以大量平行的方式跨几百万的反应扩展该过程，而不被限制于单一或少数DNA片段。该进步与能够在单一测序运行中产生几百千兆碱基的数据的最新的仪器一起，使DNA的大片段的快速测序能够实现。为了阐明该过程如何工作，考虑单一基因组DNA(gDNA)样品。gDNA首先被片段化成小片段的文库，然后测序。然后，使用已知的参考基因组作为支架(scaffold)重组装被称为读段的新鉴定的碱基串(重测序)，或如果没有可得的参考基因组，使用先进的计算技术将称为读段的新鉴定的碱基串组装在一起(从头测序)。完整的一组比对的读段揭示样品的整个基因组序列。当样品文库被制备后，所有的通过数据分析的测序步骤可以在单一的仪器上进行，促进快速周转和最小动手时间。
利用NGS，研究者可以直接地从gDNA或cDNA文库开始。然后，将DNA片段连接到特异的寡核苷酸适体，所述特异的寡核苷酸适体是进行测序生物化学反应需要的，以Illumina的
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技术需要少达90分钟。与此相比，基于CE的Sanger测序要求基因组DNA首先被片段化然后克隆到细菌人工染色体(BAC)或酵母人工染色体(YAC)。然后，每个BAC/YAC必须被进一步亚克隆到测序载体，并转化到合适的微生物宿主。然后，在测序之前，从单独的菌落或噬斑纯化模板DNA。该过程可花费几天或甚至几周来完成。
合成测序(SBS)技术
Illumina的测序仪器和试剂支持大量平行测序，使用专有的方法，其当单碱基被掺入生长中的DNA链时，检测单碱基。
SBS化学反应
当添加每个dNTP时，荧光标记的可逆的终止子成像，并且然后裂解以允许掺入下一个碱基。由于在每个测序循环期间四种可逆的终止子结合的dNTP均存在，自然竞争使掺入偏好最小化。最终结果是真的逐碱基测序，这使工业的最准确的数据用于广范围的应用能够实现。
本文描述的方法可以与多种核酸测序技术联合使用。特别可应用的技术是那些技术：其中核酸被附接在阵列中固定的位置以使得其的相对位置不改变，并且其中阵列被重复成像。其中在不同的颜色通道获得图像的实施方案，例如，符合不同的标记物用于区分一个核苷酸碱基类型与另一个，是特别可应用的。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的过程可以是自动化的过程。优选的实施方案包括合成测序(“SBS”)技术。
SBS技术通常包括通过针对模板链反复添加核苷酸，新生核酸链的酶促延伸。在常规的SBS方法中，每次递送时在聚合酶的存在下，可以向靶核苷酸提供单独的核苷酸单体。然而，在本文描述的方法中，递送时在聚合酶的存在下，可以向靶核酸提供多于一种类型的核苷酸单体。
SBS可以利用具有终止子部分的核苷酸单体或缺少任何终止子部分的那些核苷酸单体。利用缺少终止子的核苷酸单体的方法包括，例如，焦磷酸测序和使用γ-磷酸标记的核苷酸测序，如在下文进一步详细列出的。在使用缺少终止子的核苷酸单体的方法中，每个循环中添加的核苷酸的数目通常是变化的，并且取决于模板序列和核苷酸递送模式。对于利用具有终止子部分的核苷酸单体的SBS技术，在使用的测序条件下，终止子可以是有效的不可逆的，如在利用双脱氧核苷酸的常规的Sanger测序的情况中，或终止子可以是可逆的，如在Solexa(现为Illumina,Inc.)开发的测序方法的情况中。
SBS技术可以利用具有标记物部分的核苷酸单体或缺少标记物部分的那些核苷酸单体。因此，基于以下可以检测掺入事件：标记物的特征，诸如标记物的荧光；核苷酸单体的特征诸如分子质量或电荷；核苷酸掺入的副产物，诸如释放的焦磷酸或类似的。在测序试剂中存在两种或更多种不同的核苷酸的实施方案中，不同的核苷酸可以是彼此可区分的，或可选地，在使用的检测技术下，两种或更多种不同的标记物可以是不可区分的。例如，测序试剂中存在的不同的核苷酸可以具有不同的标记物，并且使用合适的光学器件，其可被区分，如通过Solexa(现为Illumina,Inc.)开发的测序方法例证的。
优选的实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测当特定的核苷酸被掺入新生的链时释放的无机焦磷酸(PPi)(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1996)"Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphaterelease."Analytical Biochemistry 242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)"Pyrosequencingsheds light on DNA sequencing."Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.和Nyren,P.(1998)"A sequencing method based on real-time pyrophosphate."Science281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过立即由ATP硫酸化酶转化成腺苷三磷酸(ATP)来检测，并且产生的ATP的水平经由荧光素酶产生的质子来检测。待测序的核酸可以附接到阵列中的特征上，并且阵列可被成像以捕获由于在阵列的器件上掺入核苷酸产生的化学发光信号。当用特定的核苷酸类型(例如A、T、C或G)处理阵列后，可以获得图像。就阵列中检测哪种特征而言，添加每种核苷酸类型后获得的图像将不同。图像中的这些差异反映阵列上的特征的不同序列含量。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。使用本文列出的方法，图像可被储存、加工和分析。例如，对于基于可逆的终止子的测序方法，对于从不同的检测通道获得的图像，用每个不同的核苷酸类型处理阵列后获得的图像可被以与本文例证的相同的方式处理。
在SBS的另一个示例类型中，通过逐步添加可逆的终止子核苷酸完成循环测序，所述可逆的终止子核苷酸含有例如，可裂解的或可光漂白的染料标记物，如被描述于例如WO04/018497和美国专利号7,057,026，通过引用将其公开内容并入本文。该方法正被Solexa(现为Illumina,Inc.)商业化，并且还被描述于WO 91/06678和WO 07/123,744，其的每一个通过引用被并入本文。终止可被逆转和荧光标记物可被裂解的荧光标记的终止子的可用性，促进有效的循环可逆的终止(CRT)测序。聚合酶还可被共工程化以有效地掺入这些修饰的核苷酸，并从这些修饰的核苷酸延伸。
优选地，在基于可逆的终止子的测序实施方案中，在SBS反应条件下，标记物基本不抑制延伸。然而，检测标记物可被移除，例如通过裂解或降解。在标记物掺入排列的核酸特征之后，可捕获图像。在特别的实施方案中，每个循环包括同时递送四种不同的核苷酸类型到阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱不同的标记物。然后，可以获得四种图像，每个使用对于四种不同标记物中的一个选择的检测通道。可选地，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且在每个添加步骤之间可以获得阵列的图像。在此类实施方案中，每个图像将示出已掺入特定类型的核苷酸的核酸特征。由于每个特征的不同序列含量，不同的图像中将存在或不存在不同的特征。然而，特征的相对位置在图像中将保持不变。从此类可逆的终止子-SBS方法获得的图像可被储存、加工和分析，如本文列出的。图像捕获步骤之后，标记物可被移除，并且可逆的终止子部分可被移除用于随后的核苷酸添加和检测循环。当其在特定循环中已被检测之后且在随后的循环之前移除标记物，可以提供降低背景信号和循环间的串扰的优势。有用的标记物和移除方法的实例在下面列出。
在特定的实施方案中，一些或所有的核苷酸单体可以包括可逆的终止子。在此类实施方案中，可逆的终止子/可裂解的荧光剂可以包括经由3’酯连接连接到核糖部分的荧光剂(Metzker,Genome Res.15:1767-1776(2005)，其通过引用并入本文)。其他方法已将终止子化学反应与荧光标记物的裂解分开(Ruparel等，Proc Natl Acad Sci USA 102:5932-7(2005)，其通过引用以其整体被并入本文)。Ruparel等描述了可逆终止子的开发，其使用小的3’烯丙基基团以封闭延伸，但通过用钯催化剂短期处理可容易地去封闭。荧光团经由可光裂解的接头附接到碱基，所述可光裂解的接头通过暴露于长波长UV光30秒可容易地裂解。因此，二硫键还原或光裂解可用作可裂解的接头。可逆的终止的另一种方法是使用天然的终止，其在dNTP上布置大量的染料后随之发生。dNTP上带电荷的大量染料的存在可通过立体和/或静电障碍充当有效的终止子。一个掺入事件的存在阻止进一步掺入，除非染料被移除。裂解染料去除荧光剂，并且有效地逆转终止。修饰的核苷酸的实例还被描述于美国专利号7,427,673和美国专利号7,057,026，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文。
可与本文描述的方法和系统一起利用的另外的示例性SBS系统和方法被描述于美国专利申请公布号2007/0166705、美国专利申请公布号2006/0188901、美国专利号7,057,026、美国专利申请公布号2006/0240439、美国专利申请公布号2006/0281109、PCT公布号WO05/065814、美国专利申请公布号2005/0100900、PCT公布号WO 06/064199、PCT公布号WO07/010,251、美国专利申请公布号2012/0270305和美国专利申请公布号2013/0260372，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文。
一些实施方案使用少于四种不同的标记物，可利用四种不同核苷酸的检测。例如，利用在美国专利申请公布号2013/0079232的并入的材料中描述的方法和系统可以进行SBS。作为第一个实例，一对核苷酸类型可以在同一波长检测，但基于该对中的一个成员相比于另一个的强度中的差异区分，或基于对该对的一个成员的改变(例如经由化学修饰、光化学修饰或物理修饰)导致表观信号相比于该对的另一个成员检测的信号出现或消失来区分。作为第二个实例，三种或四种不同的核苷酸类型可在特定的条件下被检测，而第四种核苷酸类型缺少在那些条件下可检测的标记物，或在那些条件下被最小检测(例如，由于背景荧光的最小检测)。基于其的各自的信号的存在可以确定前三种核苷酸类型掺入核酸，且第四种核苷酸类型掺入核酸可基于不存在任何信号或任何信号的最小检测确定。作为第三种实例，一种核苷酸类型可包括在两个不同通道中检测的一种或更多种标记物，而其他核苷酸类型在不超过一个通道中检测。前面提到的三种示例性构型不被认为是互相排斥的，并且可在多种组合中使用。合并全部三个实例的示例性实施方案是基于荧光的SBS方法，其使用在第一通道中检测的第一核苷酸类型(例如具有当被第一激发波长激发时，在第一通道中检测的标记物的dATP)，在第二通道中检测的第二核苷酸类型(例如具有当被第二激发波长激发时，在第二通道中检测的标记物的dCTP)，在第一和第二通道二者中检测的第三核苷酸类型(例如具有当被第一和/或第二激发波长激发时，在两个通道中检测的至少一种标记物的dTTP)和缺少标记物的第四核苷酸类型，其在任一通道不被检测到或被最小检测(例如不具有标记物的dGTP)。
此外，如在美国专利申请公布号2013/0079232的并入材料中描述的，可以使用单一通道获得测序数据。在此类所谓的一染料测序方法中，第一核苷酸类型被标记，但当产生第一图像后，标记物被移除，并且仅当产生第一图像后，第二核苷酸类型被标记。第三核苷酸类型在第一和第二图像二者中保持其的标记物，且第四核苷酸类型在两个图像中保持未被标记。
一些实施方案可利用通过连接测序的技术。此类技术利用DNA连接酶来掺入寡核苷酸，并且鉴定掺入的此类寡核苷酸。寡核苷酸通常具有不同的标记物，所述标记物与序列中与寡核苷酸杂交的特定核苷酸的身份关联。如同其他SBS方法，在用标记的测序试剂处理核酸特征的阵列之后，可以获得图像。每个图像将示出已掺入特定类型的标记物的核酸特征。由于每个特征的不同序列含量，不同的图像中将存在或不存在不同的特征，但特征的相对位置在图像中将保持不变。从基于连接的测序方法获得的图像可被储存、加工和分析，如本文列出的。可与本文描述的方法和系统一起利用的示例性SBS系统和方法被描述于美国专利号6,969,488、美国专利号6,172,218和美国专利号6,306,597，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文。
一些实施方案可利用纳米孔测序(Deamer,D.W.&Akeson,M."Nanopores andnucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing."Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer,D.和D.Branton,"Characterization of nucleic acids by nanoporeanalysis".Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li,J.,M.Gershow,D.Stein,E.Brandin,和J.A.Golovchenko,"DNA molecules and configurations in a solid-state nanoporemicroscope"Nat.Mater.2:611–615(2003)，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文)。在此类实施方案中，靶核酸穿过纳米孔。纳米孔可以是合成的孔或生物膜蛋白，诸如α-溶血素。随着靶核酸穿过纳米孔，每个碱基对可通过测量孔的电导率波动来鉴定。(美国专利号7,001,792；Soni,G.V.&Meller,"A.Progress toward ultrafast DNA sequencing usingsolid-state nanopores."Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,K."Nanopore-basedsingle-molecule DNA analysis."Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft,S.L.,Chu,J.,Amorin,M.&Ghadiri,M.R."A single-molecule nanopore device detects DNApolymerase activity with single-nucleotide resolution."J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)，其的公开内容通过引用以其整体被并入本文)。从纳米孔测序获得的数据可被储存、加工和分析，如本文列出的。特别是，根据本文列出的光学图像和其他图像的示例性处理，数据可作为图像被处理。
一些实施方案可利用包括DNA聚合酶活性的实时监测的方法。核苷酸掺入可通过载有荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测，如描述于例如美国专利号7,329,492和美国专利号7,211,414(其的每一个通过引用被并入本文)或核苷酸掺入可用零模波导来检测，如描述于例如美国专利号7,315,019(其通过引用被并入本文)和使用荧光核苷酸类似物和工程化的聚合酶，如描述于例如美国专利号7,405,281和美国专利申请公布号2008/0108082(其的每一个通过引用被并入本文)。照明可以限制于在表面拴系的聚合酶附近的仄升规模体积，以使得荧光标记的核苷酸的掺入可以低背景观察(Levene,M.J.等“Zero-mode waveguides for single-moleculeanalysis at high concentrations."Science 299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.等“Parallel confocal detection of single molecules in real time."Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach,J.等“Selective aluminum passivation for targetedimmobilization of single DNA polymerase molecules in zero-mode waveguide nanostructures."Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008),通过引用将其公开内容以其整体并入本文。)从此类方法获得的图像可被储存、加工和分析，如本文列出的。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸并入延伸产物后释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可使用电子检测器和从Ion Torrent(Guilford,CT,a LifeTechnologies subsidiary)商业可得的相关技术，或在US 2009/0026082 A1、US 2009/0127589 A1、US 2010/0137143 A1或US 2010/0282617 A1中描述的测序方法和系统，通过引用将其每个并入本文。本文列出的用于使用动力学排除扩增靶核酸的方法可容易地应用于被用来检测质子的基底。更具体地，本文列出的方法可被用来产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
以上的SBS方法可以有利地以多重格式进行，以使得同时操作多个不同的靶核酸。在特定的实施方案中，可以在普通的反应容器中或在特定基底的表面上处理不同的靶核酸。这允许以多重方式便捷递送测序试剂、移除未反应试剂和检测掺入事件。在使用表面结合的靶核酸的实施方案中，靶核酸可以是以阵列格式。在阵列格式中，靶核酸通常可以以空间可区分的方式结合到表面。靶核酸可以通过直接共价附接结合，附接到珠或其他颗粒或与附接到表面的聚合酶或其他分子结合。阵列可以包括在每个位点(还被称为特征)的单拷贝的靶核酸或在每个位点或特征可存在具有相同序列的多个拷贝。多个拷贝可通过扩增方法产生，诸如桥式扩增或乳液PCR，如下面进一步详述的。
本文列出的方法可以使用具有任何多种密度的特征的阵列，包括，例如，至少约10特征/cm2、100特征/cm2、500特征/cm2、1,000特征/cm2、5,000特征/cm2、10,000特征/cm2、50,000特征/cm2、100,000特征/cm2、1,000,000特征/cm2、5,000,000特征/cm2或更高。
本文列出的方法的优势是，其提供了多个靶核酸的快速且有效的平行检测。相应地本公开内容提供了能利用本领域已知的技术诸如以上例证的那些制备并检测核酸的整合系统。因此，本公开内容的整合系统可包括能够将扩增试剂和/或测序试剂递送至一个或更多个固定的DNA片段的流体组分；系统包括泵、阀门、储液箱、射流线路等。流通池可被构造和/或在用于检测靶核酸的整合系统中使用。示例性流通池被描述在，例如，US 2010/0111768 A1和美国系列号13/273,666，其每个通过引用被并入本文。作为流通池的例证，整合系统的一个或更多个流体组分可被用于扩增方法和用于检测方法。以核酸测序实施方案为例，整合系统中的一种或更多种流体组分可被用于本文描述的扩增方法并用于在诸如以上例证的那些的测序方法中递送测序试剂。可选地，整合系统可包括分隔流体系统以进行扩增方法和进行检测方法。能产生扩增的核酸且还能确定核酸的序列的整合测序系统的实例包括但不限于MiSeqTM平台(Illumina,Inc.,San Diego,CA)和在美国系列号13/273,666中描述的装置，其通过引用被并入本文。
遍及本申请引用了多个出版物、专利和专利申请。在此这些出版物的公开内容通过引用以其整体并入本申请，以更完整地描述本发明所属技术领域的状态。
前面详细描述的实施方案参考附图，其阐明本公开内容的特定的实施方案。具有不同结构和操作的其他实施方案不偏离本公开内容的范围。术语“发明”或类似的参考本说明书中列出的申请人的发明的多个可选的方面或实施方案的某些特定的实例使用，其的使用和其的不存在并不意图限制申请人的发明的范围或权利要求的范围。该说明书仅为了读者的便利分成多个部分。标题不应被解释为限制本发明的范围。定义意图作为本发明的描述的一部分。将理解，本发明的多个细节可以改变而不偏离本发明的范围。此外，前面的描述仅用于阐明的目的，并不用于限制的目的。

Claims (35)

1.一种制备用于文库扩增和随后扩增的样品的方法，所述方法包括以下的步骤：
(a)提供含有核酸的细胞样品，其中所述细胞样品是血液样品、组织样品、抽出物或福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样品；
(b)用裂解试剂裂解所述细胞样品的细胞以从所述细胞样品的所述细胞内释放核酸，从而形成裂解物；和
(c)从所裂解的样品扩增核酸以形成扩增的核酸；
(d)将所述扩增的核酸暴露于具有固定的扩增引物的固体表面，从而将所述扩增的核酸固定在所述固体表面上；
(e)克隆扩增所述固体表面上的所述固定的、扩增的核酸以生成聚簇；
其中在开始扩增步骤(c)之前，不从所述裂解物纯化核酸；并且
其中步骤(c)中扩增所述核酸包括标签化，其中标签化是核酸被包含与含有转座子末端序列的适体复合的转座酶的转座体复合物修饰。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述核酸是DNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品是全血样品。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述血液样品是干燥的血液样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织样品是肿瘤或活体组织切片。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解试剂是水。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述裂解试剂是纯化水。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述裂解试剂是蒸馏水。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解试剂是去污剂、碱、酸和/或酶。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述裂解试剂包含还原剂或稳定剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述还原剂是2-巯基乙醇或二硫苏糖醇。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品和裂解试剂在被合并后混合在一起。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括用破坏DNA结构的酶处理所述细胞样品的细胞或所述裂解物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中破坏DNA结构的所述酶是蛋白酶K。
15.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在扩增步骤(c)之前中和所述裂解试剂以使所述裂解试剂失活。
16.根据权利要求13所述的方法，所述方法还包括在在扩增步骤(c)之前中和破坏DNA结构的所述酶以使破坏DNA结构的所述酶失活。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述中和步骤经由中和剂或经由加热进行。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在合并所述细胞样品和所述裂解试剂之后且在扩增步骤之前，存在孵育期。
19.根据权利要求1所述的方法，其中裂解所述细胞样品的步骤和扩增包含在所述裂解物中的核酸的步骤在单锅反应中进行。
20.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于20分钟。
21.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于15分钟。
22.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于10分钟。
23.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于5分钟。
24.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于4分钟。
25.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于3分钟。
26.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间少于2分钟。
27.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间在1-5分钟之间。
28.根据权利要求1所述的方法，其中从合并所述细胞样品和裂解试剂到开始扩增过程所花费的时间在2-4分钟之间。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述固定的、扩增的核酸被测序以确定它们的序列。
30.根据权利要求29所述的方法，其中测序的方案是高通量测序。
31.根据权利要求30所述的方法，其中测序的方案是合成测序方案。
32.根据权利要求1所述的方法，其中克隆扩增所述固体表面上的所述固定的、扩增的核酸以生成聚簇在至少0.001pg石蜡的存在下进行。
33.根据权利要求1所述的方法，其中克隆扩增所述固体表面上的所述固定的、扩增的核酸以生成聚簇在以下的存在下进行：(a)蛋白酶K和/或(b)福尔马林、石蜡、细胞组分、蛋白质、胶原和组织碎片。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述细胞组分是细胞外基质组分。
35.根据权利要求1所述的方法，其中所述标签化使用基于珠的标签化进行。
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