DE102018222357A1

DE102018222357A1 - In-vitro-Verfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet und Vorrichtung und Kit hierzu

Info

Publication number: DE102018222357A1
Application number: DE102018222357.2A
Authority: DE
Inventors: Ralf Himmelreich; Perikles Simon
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV; Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Priority date: 2018-12-19
Filing date: 2018-12-19
Publication date: 2020-06-25
Also published as: WO2020127604A1; US20220081709A1; CN113728111A; EP3899026A1

Abstract

Es wird ein in-vitro-Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, bereitgestellt. Der Vorteil an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die Durchführung des Verfahrens weniger Zeitaufwand und apparativen Aufwand benötigt als bekannte Verfahren aus dem Stand der Technik und dass das Kontaminationsrisiko und Verlustrisiko an zu amplifizierender zellfreien Nukleinsäure (z.B. zellfreie DNA) minimiert ist. Das Verfahren ist daher ökonomischer und weist eine höhere Detektionsrichtigkeit als bekannte Nachweisverfahren für zellfreie Nukleinsäuren (wie- z.B. zellfreie DNA) auf. Ferner ist die Detektionssensitivität vor allem gegenüber Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik erhöht, die auf einer Verdünnung von Vollblut basieren. Es wird ferner eine Verwendung der bereitgestellten Vorrichtung und des bereitgestellten Kits vorgeschlagen.

Description

Es wird ein in-vitro-Verfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, bereitgestellt. Der Vorteil an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die Durchführung des Verfahrens weniger Zeitaufwand und apparativen Aufwand benötigt als bekannte Verfahren aus dem Stand der Technik und dass das Kontaminationsrisiko und Verlustrisiko an zu amplifizierender zellfreien Nukleinsäure (z.B. zellfreie DNA) minimiert ist. Das Verfahren ist daher ökonomischer und weist eine höhere Detektionsrichtigkeit als bekannte Nachweisverfahren für zellfreie Nukleinsäuren (wie- z.B. zellfreie DNA) auf. Ferner ist die Detektionssensitivität vor allem gegenüber Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik erhöht, die auf einer Verdünnung von Vollblut basieren. Es wird ferner eine Verwendung der bereitgestellten Vorrichtung und des bereitgestellten Kits vorgeschlagen.
In Vollblut von Lebewesen kann sich eine Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA) finden, die sich außerhalb der Blutzellen bzw. nicht in einer biologischen Doppelmembran eingeschlossen im Vollblut befindet und damit sozusagen „frei“ im Blut der Lebewesen zirkuliert. Diese sog. zellfreie Nukleinsäure (engl. „cell-free nucleic acid), bei der es sich beispielsweise um zellfreie DNA (engl. „cell-free DNA“, kurz: „cfDNA“) handeln kann, hat eine variable Konzentration im Blutplasma von ca. 1 - 1500 ng/ml. Sie entsteht durch absterbende Zellen, aber auch Tumorzellen und fötale Zellen geben beispielsweise cfDNA ab (z.B. über die Plazenta bei fötalen Zellen). cfDNA ist doppelsträngig und weist überwiegend eine Größe im Bereich von ca. 60 bis 300 Basenpaaren (Abkürzung für „Basenpaare“ im Folgenden: „bp“) auf. Häufig weist cfDNA eine Länge von 140 bp auf, weil das in etwa dem DNA-Anteil eines Nukleosoms entspricht.
Frei-zirkulierende DNA steht derzeit im Fokus vieler onkologischer Fragestellungen. Erhöhte Konzentrationen im Blut (Blutplasma bzw. Blutserum) korrelieren mit den klinischen Stadien in der akuten Phase der Krebsentwicklung. Die somatische cfDNA enthält dann noch einen Anteil an tumorgenerierter cfDNA, die auch als „ctDNA“ bezeichnet wird.
Die Bestimmung der ctDNA bei Krebspatienten im Rahmen einer sog. „Liquid Biopsy“ ermöglicht die Überwachung der Therapie („Monitoring“) und erlaubt in der Zukunft gezielte therapeutische Maßnahmen (sog. „Precision Medicine“).
Eine erhöhte Menge an frei zirkulierender DNA im Blutplasma tritt auch bei einer Vielzahl von Erkrankungen (z.B. bei Autoimmunerkrankungen, Herzinfarkt, Schlaganfall und Sepsis) auf und lässt sich auch bei einer übermäßigen Muskelbelastung beobachten. Da die unter körperlicher Belastung akut freigesetzte cfDNA hochgradig mit pro-inflammatorischen Immunmarkern korreliert und überwiegend aus Immunzellen selber stammt, ist die cfDNA ein wesentlicher pro-inflammatorischer Marker der sogenannten aseptischen Inflammation, welche unter körperlicher Belastung entsteht. Dabei ist die Menge an freigesetzter cfDNA sowohl bei körperlicher Belastung, als auch bei einer Entzündungsreaktion, welche unterschiedliche Erkrankungen begleitet, ein Marker für das Ausmaß der Inflammation.
Ein einfaches und schnelles Verfahren zur Quantifizierung von zellfreie Nukleinsäure, wie z.B. cfDNA, aus einer Blutprobe wäre bei diversen medizinischen Fragestellungen sehr interessant und hilfreich. So könnte ein solches Verfahren bei unklarem Befund einen Hinweis darüber geben, in welcher Richtung weitere diagnostische Testverfahren sinnvoll sind.
Der Nachweis von zellfreier Nukleinsäure, wie zellfreier DNA, aus Blut erfolgt bisher entweder über eine Gewinnung von Blutplasma aus einer Vollblutprobe, einer anschließenden Nukleinsäure-Reinigung und schließlich einer Nukleinsäure-Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion (engl. „polymerase chain reaction“, kurz: „PCR“). Alternativ wird zunächst Blutplasma aus einer Vollblutprobe gewonnen, das Blutplasma verdünnt und schließlich eine Direktamplifikation mittels PCR durchgeführt.
Diese im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren haben den Nachteil, dass sie aufwändige Präparationsschritte zur Aufbereitung des Vollbluts umfassen, bevor die eigentliche Amplifikationsreaktion, d.h. Nachweisreaktion der cfDNA, gestartet wird. Beispielsweise wird in den bekannten Verfahren zunächst auf zeitintensive Art und Weise aus Vollblut Blutplasma gewonnen, d.h. die im Vollblut befindlichen Blutzellen werden vom zellfreien Vollblut abgetrennt. Daran schließt sich entweder eine Nukleinsäure-Reinigung oder ein Verdünnungsschritt an.
Die Nukleinsäure-Reinigung ist sehr zeitintensiv. Die Alternative der Verdünnung des Blutplasmas ist zwar schneller, aber aufgrund der Verdünnung der Probe zwangsweise mit einer Verschlechterung der Nachweisgrenze (d.h. einer niedrigeren zu erwartenden Detektionssensitivität) behaftet. Verfahren aus dem Stand der Technik verwenden für die Amplifikation der cfDNA zudem die PCR, die sehr lange vom Start bis zum Ende benötigt (oft einige Stunden) und verhältnismäßig viel Wissen und Geduld bei der Probenvorbereitung benötigt.
Die bekannten Nachweisverfahren sind daher allesamt mit einem hohen Zeitaufwand verbunden und es ist eine Vielzahl von Geräten für den Nachweis erforderlich (z.B. eine Zentrifuge und ein PCR-Gerät). Einige der Geräte (z.B. das PCR-Gerät) können nur von geschulten Personen bedient werden. Ferner kann bei den Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik bei jedem der erforderlichen Verarbeitungsschritte ein Materialverlust auftreten und durch die Vielzahl und Dauer der Schritte steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die Probe mit Fremd-DNA kontaminiert wird und beim Nachweisverfahren falsch-positive Ergebnisse erhalten werden. Zudem kann sogar beim Schritt der Gewinnung von Blutplasma aus der Vollblutprobe eine Lyse von Blutzellen nicht ausgeschlossen werden. Die Folge ist, dass auch ein Risiko einer Kontamination der Probe mit Eigen-DNA, die vor der Probenentnahme (in vivo) innerhalb der Blutzellen und nicht außerhalb der Blutzellen im Blut vorhanden war, besteht und in diesem Fall die Eigen-DNA falsch-positive Ergebnisse beim Messverfahren verursacht.
Insgesamt zeichnen sich die im Stand der Technik bekannten Verfahren durch einen hohen Arbeits- und Geräteaufwand und eine niedrige Detektionsrichtigkeit (aufgrund der erhöhten Kontaminationsgefahr) aus. Bei Verfahren, die auf einer Verdünnung der Probe basieren, ist zwangsweise eine geringe Detektionssensitivität gegeben.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung und einen Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen, das/die/der die oben genannten Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte das Verfahren, die Vorrichtung und der Kit den Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, mit geringerem Arbeitsaufwand, geringerem Geräteaufwand, einer höheren Detektionsgenauigkeit (Detektionsrichtigkeit) und einer möglichst hohen Detektionssensitivität ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 1, der Vorrichtung und/oder dem Kit gemäß Anspruch 12 und der Verwendung gemäß Anspruch 24. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Ausgestaltungen auf.
Erfindungsgemäß wird ein in-vitro-Verfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte

a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsreaktion geeignet ist, wobei die Reaktionsmischung mindestens ein Primerpaar enthält, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA) geeignet ist oder mindestens ein solches Primerpaar der Reaktionsmischung zugegeben wird;
b) Zugabe von Vollblut eines Lebewesens zu der Reaktionsmischung;
c) Durchführen einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von ≤ 45 °C; und
d) Detektion von DNA mithilfe von mindestens einem Detektionsreagenz, wobei die Detektion während Schritt c) oder nach Schritt c) durchgeführt wird;

Erfindungsgemäß wird unter dem Begriff „Nukleinsäure“ bevorzugt DNA und/oder RNA verstanden, besonders bevorzugt DNA. Folglich kann es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. der zu amplifizierenden Nukleinsäure beispielsweise um DNA und/oder RNA handeln. Unter dem Begriff „Nukleinsäure“ werden bevorzugt auch RNA-DNA-Hybride umfasst. Solche RNA-DNA-Hybride sind beispielsweise einzelne, kurze DNA- und RNA-Stränge (insbesondere Stränge einer Länge von 20-22 Nukleotiden), die sich aneinander angelagert haben.
Enthält die nachzuweisende Nukleinsäure RNA oder besteht daraus, enthält die Reaktionsmischung bevorzugt ein Enzym oder ihr wird ein Enzym zugegeben wird, das RNA in DNA kopieren kann (z.B. das Enzym Reverse Transcriptase).
Die Reaktionsmischung kann Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure-Ligasen enthalten (z.B. eine T7-RNA-Polymerase) oder es können ihr Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure-Ligasen zugegeben werden.
Eine isothermale Amplifikation von freier RNA oder sich innerhalb eines RNA-DNA-Hybrids befindlichen RNA kann beispielsweise über ein NASBA-Verfahren erreicht werden. Hierbei wird die RNA über ein Zusammenwirken der Enzyme RNAse H, Reverse Transkriptase, SD Polymerase und T7 RNA Polymerase auch bei konstanter Temperatur (z.B. Raumtemperatur, 25 °C) in der Reaktionsmischung amplifiziert (mithilfe mindestens eines Primers, der eine T7-Promotorsequenz enthält). Folglich ist es bevorzugt, dass die Reaktionsmischung diese Enzyme und mindestens einen Primer mit T7-Promotorsequenz enthält oder ihr diese Enzyme und dieser Primer zugegeben werden.
Alternativ oder zusätzlich kann eine isothermale Amplifikation von freier RNA oder einer sich in einem RNA-DNA-Hybrid befindlichen RNA über eine Abwandlung des NASBA-Verfahrens erreicht werden, die als „Linker-Ligation“-NASBA-Verfahren bezeichnet wird. Hierbei wird die RNA über ein Zusammenwirken der Enzyme Poly(A)-Polymerase, RNAse H und T7 RNA Polymerase auch bei konstanter Temperatur (z.B. Raumtemperatur, 25 °C) in der Reaktionsmischung amplifiziert (mithilfe mindestens eines Primers, der eine T7-Promotorsequenz enthält). Bei dieser Abwandlung ist es bevorzugt, dass die Reaktionsmischung diese Enzyme und mindestens einen Primer mit T7-Promotorsequenz enthält oder ihr diese Enzyme und dieser Primer zugegeben werden.
Das oben genannte NASBA-Verfahren kann auch in Kombination mit einem RPA-Verfahren durchgeführt werden. Hierbei wird im Vollblut vorhandene DNA zunächst durch das RPA-Verfahren in RNA (NASBA-Amplikon) umgewandelt, wobei die RNA dann über das NASBA-Verfahren amplifiziert wird.
Es wurde gefunden, dass über das erfindungsgemäße Verfahren der Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet (bei DNA als Nukleinsäure sog. „cell-free DNA“ oder kurz „cfDNA“), auch dann gelingt, wenn nicht wie im Stand der Technik üblich eine aufgereinigte Blutprobe eingesetzt wird, sondern Vollblut direkt, d.h. ohne Vorbehandlung, eingesetzt wird. Voraussetzung hierfür ist, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern. Durch eine Verwendung einer solchen Reaktionsmischung kann verhindert werden, dass Nukleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA), die sich in zellkernhaltigen Blutzellen (z.B. Leukozyten) befindet, das Nachweisverfahren negativ beeinflussen, d.h. falsch-positive Ergebnisse liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Reaktionsmischung generell dazu geeignet, eine Lyse von Nukleinsäure-enthaltenden, Lipid-Doppelmembran-umschlossenen Kompartimenten, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern. Der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Kompartimente“ wird erfindungsgemäß weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkbaren Nukleinsäure-enthaltenden Kompartimente, die von einer biologischen Lipid-Doppelmembran umgeben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mitochondrien, extrazelluläre Vesikel (Exosomen und Mikropartikel), Peroxisomen, Viren, Einzeller und Bakterien.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren ist, dass eine Probenvorbereitung, d.h. eine Aufreinigung des Vollbluts entfällt. Das erfindungsgemäße Verfahren kommt daher mit weniger Verfahrensschritten aus und ist schneller durchführbar.
Ferner entfällt der bei bekannten Verfahren nötige apparative Aufwand für die Aufreinigung des Vollbluts, d.h. für die Vorbereitung der Probe. Es besteht somit ein deutlicher Kostenvorteil gegenüber bekannten Verfahren.
Zudem eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren damit hervorragend für eine Durchführung außerhalb eines Labors. Dies bedeutet, dass beispielsweise ein Patient ambulant (z.B. bei sich zu Hause mit einer hierzu geeigneten Vorrichtung bzw. einem hierzu geeigneten Kit zur Durchführung des Verfahrens) bestimmen kann, ob sich in seinem Blut grundsätzlich mindestens eine zellfreie Nukleinsäure (z.B. cfDNA) befindet (Verwendung unspezifischer Primer) oder ob sich in seinem Blut mindestens eine bestimmte zellfreie Nukleinsäure (z.B. eine bestimmte cfDNA) befindet (Verwendung spezifischer Primer). Bei der getesteten Person kann es sich um einen Sportler und/oder einen Patienten wie einen Unfall-, oder Notfallpatienten handeln, der unmittelbar nach dem Sport bzw. unmittelbar nach einem Unfall, oder medizinischen Notfall, direkt an Ort und Stelle dahingehend untersucht werden kann, ob sich mindestens eine (bestimmte) Nukleinsäure (z.B. cfDNA), oder eine erhöhte Menge von mindestens einer (bestimmten) Nukleinsäure (z.B. cfDNA) in seinem Blutkreislauf befindet. Die erhaltenden Informationen können einen entscheidenden Vorteil darstellen, um zügig eine adäquate Behandlung eines Patienten zu veranlassen.
Ferner besteht generell in jedem Verfahrensschritt, also auch in den im Stand der Technik üblichen Verfahrensschritten zur Aufreinigung der Vollblut-Probe, die Gefahr, dass zu detektierende Nukleinsäure (z.B. DNA) verloren geht (z.B. kann DNA und/oder RNA an bestimmte Oberflächen adsorbieren) und damit in dem eigentlichen Detektionsverfahren nicht mehr erfasst werden kann. Die Konsequenz sind eine niedrige Detektionssensitivität bzw. falsch-negative Ergebnisse. Das Risiko, zu detektierende Nukleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA) auf dem Weg zur Detektion zu verlieren, ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren reduziert, da direkt Vollblut eingesetzt wird. Folglich ist die Detektionssensitivität und Detektionsgenauigkeit höher als bei den bekannten Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich dafür, Gene mit einer niedrigen Kopienzahl (sog. „low copy number genes“) oder sogar mit einer Kopienzahl von lediglich eins (sog. „single copy number genes“) im Vollblut nachzuweisen.
Anders als durch die Schritte zur Aufreinigung der Vollblut-Probe bei den bekannten Verfahren aus dem Stand der Technik besteht beim erfindungsgemäßen Verfahren auch keine Gefahr, dass während einem dieser Schritte die Probe durch Fremd-Nukleinsäuren (z.B. DNA der Person, die das Verfahren durchführt oder bakterielle DNA) kontaminiert wird. Es wird daher durch das erfindungsgemäße Verfahren auch die Gefahr falsch-positiver Signale eingedämmt, wodurch die Detektionsgenauigkeit gegenüber den bekannten Verfahren weiter erhöht ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Reaktionsmischung mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist.
Ferner kann die Reaktionsmischung mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reaktionsmischung keine Tenside in Konzentrationen, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die Reaktionsmischung keine Tenside, bzw. keine Stoffe oder Stoffgemische, in einer Konzentration enthält, die dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Optional betrifft dieses Merkmal nicht nur Blutzellen, sondern auch generell Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Kompartimente, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind. Wie bereits oben erwähnt wird der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Kompartimente“ hier weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkbaren Nukleinsäuren, die von einer biologischen Doppelmembran umgeben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mitochondrien, Exosomen, Einzeller und Bakterien.
Die im Verfahren eingesetzte Reaktionsmischung kann mindestens einen der folgenden Stoffe enthalten oder der Reaktionsmischung mindestens einer der folgenden Stoffe zugegeben werden:

i) Nukleotidtriphosphate, bevorzugt dATP, dCTP, dGTP ,dTTP, ATP, GTP; und/oder
ii) Kreatinkinase und Phosphokreatin; und/oder
iii) ein Magnesiumsalz, bevorzugt Magnesiumacetat; und/oder
iv) Polyethylenglycol.

Ferner kann die Reaktionsmischung mindestens eines der folgenden Proteine enthalten oder mindestens eines der folgenden Proteine der Reaktionsmischung zugegeben werden:

i) eine strangversetzende Polymerase, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Sau-DNA-Polymerase, Bsu-DNA-Polymerase, Klenow-Fragment, phi29 und Kombinationen hiervon; und/oder
ii) eine Rekombinase, bevorzugt RecA-Rekombinase und/oder T₄ UvsX; und/oder
iii) ein Einzelstrang-bindendes Protein, bevorzugt SSB und/oder T₄ gp32; und/oder
iv) eine Exonuklease, bevorzugt Exonuklease III und/oder Exonuklease IV.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist das im Verfahren eingesetzte Detektionsreagenz nicht dazu geeignet, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren. Insbesondere kann dieses Merkmal nicht nur für Blutzellen, sondern generell für die Membran Nukleinsäure-enthaltender, Lipid-Doppelmembran umschlossener Kompartimente gelten. Vorteil an dieser Ausführungsform ist, dass die Detektion amplifizierter Nukleinsäure (z.B. DNA) auch ohne vorherige Abtrennung von DNA-aufweisenden Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente durchgeführt werden kann, da kein Risiko besteht, durch ein Binden des Detektionsreagenzes an DNA innerhalb der Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente falsch-positive Ergebnisse zu erhalten. Das Verfahren kann daher einfacher und schneller durchgeführt werden (z.B. ist kein Schritt nötig, um das Reaktionsgemisch von einem Reaktionsraum über eine Trennwand zu einem separaten Detektionsraum strömen zu lassen).
Das Detektionsreagenz kann zum Nachweis von einzelsträngiger und/oder doppelsträngiger DNA geeignet sein und hierfür eingesetzt werden.
Das Detektionsreagenz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon.
Die Sonde mit Fluorophor kann ein Oligonukleotid enthalten oder daraus bestehen, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz (durch eine interne Modifikation) dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist. Das DNA-bindende Farbstoffmolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon. Bevorzugt werden zur besonders sensitiven Detektion Farbstoffmoleküle, welche ein Absorptions- und ein Emissionsspektrum aufweisen, welches sich (bevorzugt deutlich) von den entsprechenden Spektren einer Vollblutprobe unterscheiden. Bezüglich des Absorptionsspektrums des eingesetzten Farbstoffmoleküls ist ein Absorptionsspektrum von unter 525 nm, eines zwischen 545 nm und 570 nm oder eines über 590 nm besonders vorteilhaft, da sich in diesen Bereichen relative lokale Absorptionsminima des Vollblutes befinden. Anders ausgedrückt sollte der Farbstoff nicht (stark) bei einer Wellenlänge von 525 nm bis 545 und/oder einer Wellenlänge von 570 bis 590 nm absorbieren. Für die Emission ist ein Emissionsspektrum zwischen 580 nm und 610 nm, insbesondere 590 nm bis 610 nm, besonders vorteilhaft. Das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat kann ein Magnesiumsalz sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Detektion von DNA über eine Detektionseinheit, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon (z.B. interne Kamera des Mobiltelefons, ggf. in Verbindung mit Auswertesoftware auf dem Mobiltelefon), und Kombinationen hiervon.
Ferner kann in dem Verfahren eine Quantifizierung der Menge an amplifizierter DNA über eine Auswerteeinheit erfolgen, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit (bevorzugt einer oben genannten Detektionseinheit) verbunden ist.
In dem Verfahren kann mindestens ein Primer, optional beide Primer des Primerpaars, eine Länge von 20 bis 45 bp, besonders bevorzugt 25 bis 40 bp, insbesondere 30 bis 35 bp, aufweisen.
Zudem kann mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
Der Vorteil an der Verwendung von Primern bzw. Primerpaaren, die an repetitive Sequenzen binden, ist, dass sie zur unspezifischen Amplifikation aller denkbaren unbekannten DNAs geeignet sind, die im Vollblut von Lebewesen vorkommen und repetitive DNA-Sequenzen enthalten. Da praktisch jede DNA bzw. jedes DNA-Fragment gewisser Länge repetitive DNA-Sequenzen aufweist, ist es über solche Primer bzw. Primerpaare möglich, jede denkbare DNA, die sich im Vollblut befindet, zu amplifizieren. Anders ausgedrückt muss die Sequenz der zu amplifizierenden DNA vor der Amplifikationsreaktion nicht bekannt sein. Das Verfahren kann also grundsätzlich den Nachweis liefern, ob überhaupt freie DNA im Blut des Lebewesens vorhanden ist.
Falls über das Verfahren tatsächlich freie DNA im Vollblut detektiert wird, kann diese natürlich über gängige Methoden sequenziert werden. Ist die spezifische Sequenz der freien DNA (bzw. der freien DNAs) im Blut eines bestimmten Lebewesens (z.B. eines bestimmten Patienten) bekannt, kann das erfindungsgemäße Verfahren natürlich auch mit Primerpaaren durchgeführt werden, die gezielt für den Nachweis der bekannten DNA(s) geeignet sind. Es kann somit mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch ein Monitoring spezifischer freier DNAs im Vollblut eines Patienten über einen bestimmten Zeitraum (z.B. Minuten, Stunden, Tage und/oder Monate) durchgeführt werden.
Ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, kann/können dazu geeignet sein, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Das Lebewesen kann ein Mensch oder ein Tier sein.
Die in dem Verfahren verwendete isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 °C bis 44 °C, bevorzugt 25 °C bis 42 °C, besonders bevorzugt 30 °C bis 41 °C, insbesondere 35 °C bis 40 °C, durchgeführt werden. Die hierfür erforderliche Temperatur kann über eine Temperiereinheit erzeugt bzw. eingestellt werden.
Falls in dem Verfahren keine Temperiereinheit eingesetzt wird kann die Reaktion entweder bei Raumtemperatur stattfinden oder die nötige Reaktionstemperatur über Körperwärme (eines Menschen oder eines Tieres) erzeugt werden. Letzteres ist beispielsweise möglich, indem die Reaktionsmischung der Vorrichtung so nah in die Nähe eines Körpers eines Menschen oder Tieres gebracht wird, dass eine Wärmeübertragung vom Körper auf die Reaktionsmischung möglich ist.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine semiquantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein oder eine quantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine Amplifikationsreaktion sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba HDA, NASBA und SDA-Amplifikationsreaktion, optional ist sie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba und SDA-Amplifikationsreaktion. Bevorzugt ist sie eine Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion. Optional enthält die Reaktionsmischung für die Amplifikationsreaktion eine Helicase. Eine bevorzugte Temperatur für die Amplifikation ist 37°C, d.h. die Reaktionsmischung wird bevorzugt auf eine Temperatur von 37°C temperiert.
Während oder nach Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann, im Falle von (detektierter) amplifizierter DNA, auf das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung geschlossen werden. Die Krankheit ist insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
Die eingesetzte Reaktionsmischung kann mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthalten, die jeweils zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (z.B. DNA) geeignet sind. Alternativ oder zusätzlich können mehrere solcher Primerpaare der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure (z.B. DNA) zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure (z.B. DNA), die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz, optional die Reaktionsmischung, das Primerpaar und das Detektionsreagenz, von einem Lateral-Flow-Strip enthalten.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung und/oder Kit bereitgestellt, die/der zum in-vitro-Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA) geeignet ist, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet. Die Vorrichtung und/oder der Kit enthält

a) eine Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von ≤ 45 °C geeignet ist,
b) mindestens ein Primerpaar, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA) geeignet ist, wobei das mindestens eine Primerpaar optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;
c) mindestens ein Detektionsreagenz zur Detektion von DNA, wobei das mindestens eine Detektionsreagenz optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;

Die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannten Vorteile gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung und den erfindungsgemäßen Kit entsprechend. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannten Merkmale aufweisen bzw. zu deren Durchführung konfiguriert sein.
Enthält die nachzuweisende Nukleinsäure RNA oder besteht daraus, enthält die Reaktionsmischung bevorzugt ein Enzym, das RNA in DNA kopieren kann (z.B. das Enzym Reverse Transcriptase).
Die Reaktionsmischung kann Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure-Ligasen enthalten (z.B. eine T7-RNA-Polymerase).
Bevorzugt enthält die Reaktionsmischung RNAse H, Reverse Transkriptase, SD Polymerase, T7 RNA Polymerase und mindestens einen Primer mit T7-Promotorsequenz.
Die Reaktionsmischung kann auch bevorzugt die Enzyme Poly(A)-Polymerase, RNAse H, T7 RNA Polymerase und mindestens einen Primer mit T7-Promotorsequenz enthalten.
Die in der Vorrichtung und/oder dem Kit enthaltene Reaktionsmischung kann dazu geeignet sein, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist.
Ferner kann die Reaktionsmischung dazu geeignet sein, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Vorrichtung und/oder des Kits enthält die Vorrichtung und/oder der Kit keine Tenside, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die Reaktionsmischung keine Tenside, bzw. keine Stoffe oder Stoffgemische, in einer Konzentration enthält, die dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Optional betrifft dieses Merkmal nicht nur Blutzellen, sondern auch generell Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran umschlossene Kompartimente, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind. Wie bereits oben erwähnt wird der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Kompartimente“ hier weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkbaren Nukleinsäuren, die von einer biologischen Doppelmembran umgeben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mitochondrien, Exosomen, Einzeller und Bakterien.
Die Reaktionsmischung kann mindestens einen der folgenden Stoffe enthalten:

Ferner kann die Reaktionsmischung mindestens einen der folgenden Proteine enthalten:

In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist das in der Vorrichtung und/oder dem Kit enthaltene Detektionsreagenz nicht dazu geeignet, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren. Insbesondere kann dieses Merkmal nicht nur für Blutzellen, sondern generell für die Lipid-Doppelmembran Nukleinsäure-enthaltender, Lipid-Doppelmembran umschlossener Kompartimente gelten. Vorteil an dieser Ausführungsform ist, dass die Detektion amplifizierter DNA auch ohne vorherige Abtrennung von DNA-aufweisenden Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente durchgeführt werden kann, da kein Risiko besteht, durch ein Binden des Detektionsreagenzes an DNA innerhalb der Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente falsch-positive Ergebnisse zu erhalten. Die Vorrichtung und/oder der Kit kann daher einfacher und in kleinerer Baugröße gehalten werden (z.B. ist kein Reaktionsraum und separater Detektionsraum mit einer dazwischen liegenden Trennwand nötig).
Das Detektionsreagenz kann zum Nachweis einzelsträngiger und/oder doppelsträngiger DNA geeignet sein.
Ferner kann das Detektionsreagenz der Vorrichtung und/oder des Kits ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon.
Die Sonde mit Fluorophor kann ein Oligonukleotid enthalten oder daraus bestehen, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist. Das DNA-bindende Farbstoffmolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon. Bevorzugt werden zur besonders sensitiven Detektion Farbstoffmoleküle eingesetzt, welche ein Absorptions- und ein Emissionsspektrum aufweisen, welches sich (bevorzugt deutlich) von den entsprechenden Spektren einer Vollblutprobe unterscheiden. Bezüglich des Absorptionsspektrums des eingesetzten Farbstoffmoleküls ist ein Absorptionsspektrum von unter 525 nm, eines zwischen 545 nm und 570 nm oder eines über 590 nm besonders vorteilhaft, da sich in diesen Bereichen relative lokale Absorptionsminima des Vollblutes befinden. Anders ausgedrückt sollte der Farbstoff nicht (stark) bei einer Wellenlänge von 525 nm bis 545 und/oder einer Wellenlänge von 570 bis 590 nm absorbieren. Für die Emission ist ein Emissionsspektrum zwischen 580 nm und 610 nm, insbesondere 590 nm bis 610 nm, besonders vorteilhaft. Das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat kann ein Magnesiumsalz sein.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält die Vorrichtung und/oder der Kit eine Detektionseinheit zur Detektion von DNA, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon (z.B. interne Kamera des Mobiltelefons, ggf. in Verbindung mit Auswertesoftware auf dem Mobiltelefon), und Kombinationen hiervon.
Ferner kann die Vorrichtung und/oder der Kit eine Auswerteeinheit zur Quantifizierung einer Menge an amplifizierter DNA enthalten, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
Mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, kann/können eine Länge von 20 bis 45 bp, besonders bevorzugt 25 bis 40 bp, insbesondere 30 bis 35 bp, aufweisen.
Ferner kann ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
Zudem kann mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Das Lebewesen kann ein Mensch oder ein Tier sein.
Die Vorrichtung und/oder der Kit kann eine Temperiereinheit enthalten, die dazu konfiguriert ist, die Reaktionsmischung auf eine Temperatur im Bereich von ≤ 45 °C zu temperieren, bevorzugt auf eine Temperatur im Bereich von 20 °C bis 44 °C, besonders bevorzugt 25 °C bis 42 °C, ganz besonders bevorzugt 30 °C bis 41 °C, insbesondere 35 °C bis 40 °C. Die Temperiereinheit wird bevorzugt von einer Spannungsquelle mit Energie versorgt wird, die eine Spannung im Bereich von 1 bis 12 V aufweist.
Es ist jedoch auch denkbar, dass die Vorrichtung und/oder der Kit keine Temperiereinheit enthalten. Die Reaktion kann dann entweder bei Raumtemperatur stattfinden oder über Körperwärme (eines Menschen oder eines Tieres) erzeugt werden. Letzteres ist beispielsweise möglich, indem die Reaktionsmischung der Vorrichtung so nah in die Nähe eines Körpers eines Menschen oder Tieres gebracht wird, dass eine Wärmeübertragung vom Körper auf die Reaktionsmischung möglich ist.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine semiquantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein oder eine quantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein.
Ferner kann die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion eine Amplifikationsreaktion sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba, HDA, NASBA und SDA-Amplifikationsreaktion, optional ist sie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba und SDA-Amplifikationsreaktion. Bevorzugt ist sie eine Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion. Optional enthält die Reaktionsmischung für die Amplifikationsreaktion eine Helicase. Eine bevorzugte Temperatur für die Amplifikation ist 37°C, d.h. die Reaktionsmischung wird bevorzugt auf eine Temperatur von 37°C temperiert.
Die Vorrichtung und/oder Kit kann dazu konfiguriert sein, im Falle einer Detektion von DNA durch das Detektionsreagenz das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung anzuzeigen, optional über eine für sichtbares Licht transparente Begrenzung der Vorrichtung. Insbesondere ist die Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält die Vorrichtung und/oder der Kit mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, wobei jedes Primerpaar zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (z.B. DNA) geeignet ist und wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure (z.B. DNA) zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure (z.B. DNA), die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
Die Vorrichtung ist bevorzugt ein Lateral-Flow-Strip.
Der Kit ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass er einen Lateral-Flow-Strip aufweist, der die Reaktionsmischung enthält; oder die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz enthält.
Es wird zudem die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum direkten, semiquantitativen oder quantitativen, Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA) in Vollblut vorgeschlagen, bevorzugt zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die bei einer Krankheit eines Lebewesens und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Vollblut des Lebewesens außerhalb der Blutzellen vorhanden ist.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.
1 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsreaktion einer bestimmten cfDNA über eine Sonde unter direktem Einsatz von Vollblut (siehe Beispiel 2). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass der Nachweis mit der Sonde auch beim direkten Einsatz von (nicht aufgereinigtem) Vollblut funktioniert. Ferner wird deutlich, dass sich bei der Versuchsperson, von der das Vollblut stammt, trainingsbedingt ein Anstieg der cfDNA nachweisen lässt.
2 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsreaktion einer bestimmten cfDNA über einen DNA-interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff unter direktem Einsatz von Vollblut (siehe Beispiel 4). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass der Nachweis mit dem Fluoreszenzfarbstoff auch beim direkten Einsatz von (nicht aufgereinigtem) Vollblut funktioniert. Ferner wird deutlich, dass sich bei der Versuchsperson, von der das Vollblut stammt, trainingsbedingt ein Anstieg der cfDNA nachweisen lässt.
3 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsreaktion einer bestimmten cfDNA über eine Sonde unter direktem Einsatz von humaner gDNA, die mit unterschiedlichen Mengen an Hämolysat kontaminiert wurde (siehe Beispiel 3). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass Hämolysat einen signifikant inhibierenden Einfluss auf die Amplifikationsreaktion ausübt, der erst ab einer starken Verdünnung von 1:10000 (v:v) mit Wasser verschwindet.
Beispiel 1 - Nachweis einer zellfreien DNA über Sonde unter direktem Einsatz von Vollblut
Mit einer Probe aus Vollblut, die zellfreie DNA (sog. cfDNA) enthält wurde eine isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur von 40°C zur Amplifikation mindestens einer bestimmten zellfreien DNA durchgeführt. Die amplifizierte DNA wurde über eine Sonde nachgewiesen.
Folgendes Protokoll wurde verwendet:

■ Ansetzen des Rehydrationgemisches (Gesamtvolumen: 63,08 µl) 6,72 µl Primer Gemisch aus Forward-Primer („301“-Primer) und Reverse-Primer („302“-Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt (je 10 µM); 0,96 µl Sonde (10 µM); 47,2 µl Rehydrationspuffer (aus „TwistAmp^® exo“-Kit, TwistDX Inc., Cambridge, USA); 8,2 µl H₂O.
■ Vermischen;
■ Resuspendieren und Lösen eines gefriergetrockneten Pellets eines „TwistAmp^® exo“-Kits (TwistDX Inc., Cambridge, USA) mit 63 µl Rehydrationsgemisch (durch auf- und abpipettieren);
■ Vermischen;
■ Jeweils 19,6 µl des gelösten Pellets in ein 0,5 ml Eppendorf-Cup überführen;
■ In eines der Eppendorf-Cups 1 µl Mausplasma als Kontrolle zugeben und in die anderen Eppendorf-Cups jeweils 1 µl EDTA-Vollblut als Probe zugeben;
■ Vermischen;
■ Jeweils 6,4 µl Magnesiumacetatlösung (Konzentration: 80 mM) dazugeben;
■ Vermischen;
■ Zugabe von jeweils 7 µl aus jedem Eppendorf-Cup auf eine PCR-Wellplate;
■ PCR-Wellplate vermischen;
■ PCR-Wellplate im CFX-Thermo-Cycler bei 40°C inkubieren (mit offenem Deckel, d.h. „LidOff“).

Das Ergebnis ist in 1 dargestellt. Es ist deutlich erkennbar, dass das erfindungsgemäße Nachweisverfahren mit einer Sonde als Nachweisreagenz und einem direkten Einsatz von (nicht aufgereinigten) Vollblut funktioniert. Die Konzentration von cfDNA im Vollblut der Versuchsperson vor dem Training (siehe Signal bei 2) ist geringer ist als nach dem Training (siehe Signal bei 1). Die Kontrollplasma-Probe von einer Maus (NTC-Plasma) zeigt keine Amplifikation der Ziel-cfDNA (siehe Signal bei 3), was eine Spezifizität der hier dargestellten Amplifikationsreaktion für humane cfDNA belegt.
Beispiel 2 - Nachweis einer zellfreien DNA über Fluoreszenzfarbstoff unter direktem Einsatz von Vollblut
Mit einer Probe aus Vollblut, die zellfreie DNA (sog. cfDNA) enthält wurde eine isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur von 40°C zur Amplifikation mindestens einer bestimmten zellfreien DNA durchgeführt. Die amplifizierte DNA wurde über einen Fluoreszenzfarbstoff („EvaGreen^® Dye“, Biotium Inc., Fremont, USA) nachgewiesen.
Folgendes Protokoll wurde verwendet:

■ Ansetzen des Rehydrationgemisches (Gesamtvolumen: 63,52 µl) 6,72 µl Primer Gemisch aus Forward-Primer („63“-Primer) und Reverse-Primer („66“-Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt (je 10 µM); 4 µl EvaGreen^®Dye (20x) (Biotium Inc., Fremont, USA); 47,2 µl Rehydrationspuffer (aus „TwistAmp^® exo“-Kit, TwistDX Inc., Cambridge, USA); 5,6 µl H₂O.
■ Vermischen;
■ Resuspendieren und Lösen eines gefriergetrockneten Pellets eines „TwistAmp^® exo“-Kits (TwistDX Inc., Cambridge, USA) mit 63 µl Rehydrationsgemisch (durch auf- und abpipettieren);
■ Vermischen;
■ Jeweils 19,6 µl des gelösten Pellets in ein 0,5 ml Eppendorf-Cup überführen;
■ In eines der Eppendorf-Cups 1 µl Mausplasma als Kontrolle zugeben und in die anderen Eppendorf-Cups jeweils 1 µl EDTA-Vollblut als Probe zugeben;
■ Vermischen;
■ Jeweils 6,4 µl Magnesiumacetatlösung (Konzentration: 80 mM) dazugeben;
■ Vermischen;
■ Zugabe von jeweils 7 µl aus jedem Eppendorf-Cup auf eine PCR-Wellplate;
■ PCR-Wellplate vermischen;
■ PCR-Wellplate im CFX-Thermo-Cycler bei 40°C inkubieren (mit offenem Deckel, d.h. „LidOff“).

Das Ergebnis ist in 2 dargestellt. Es ist deutlich erkennbar, dass das erfindungsgemäße Nachweisverfahren mit einem interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff als Nachweisreagenz und einem direkten Einsatz von (nicht aufgereinigten) Vollblut funktioniert. Die Konzentration von cfDNA im Vollblut der Versuchsperson vor dem Training (siehe Signal bei 2) ist geringer ist als nach dem Training (siehe Signal bei 1). Die Kontrollplasma Probe von einer Maus (NTC-Plasma) zeigt keine Amplifikation der Ziel-cfDNA (siehe Signal bei 3), was eine Spezifizität der hier dargestellten Amplifikationsreaktion für humane cfDNA belegt.
Beispiel 3 - Nachweis einer fehlenden Lyse von Vollblut während der isothermalen Amplifikationsreaktion
Es wird zunächst ein Hämolysats hergestellt, indem Mausblut durch mehrere Auftau- und Gefrierzyklen behandelt wird, wodurch es zur Lyse der Bluzellen kommt.

Ansatz:: RPA-Sonden für Vollblut
Primer:: Forward-Primer („301“-Primer) und Reverse-Primer („302“-Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt
Template:: 1 µl humane gDNA (50 ng/ml) mit 1 µl Wasser bzw. mit 1 µl unverdünntem Hämolysat oder einer Mischung aus einer unterschiedlichen Menge an lysiertem Vollblut (Hämolysat) mit Wasser. Für die Mischung von Hämolysat mit Wasser wurde Hämolysat jeweils 1:10 (v:v), 1:100 (v:v), 1:1000 (v:v) und 1:10000 (v:v) mit Wasser verdünnt.

Das Ergebnis ist in 3 dargestellt und in Tabelle 1 dargestellt. Die Probe mit 1 µl humaner gDNA (50 ng/ml) und 1 µl Wasser ist bei 1 zu sehen. Die Proben mit 1 µl humaner gDNA (50 ng/ml) und einer unterschiedlichen Menge an Hämolysat sind bei 2, 3, 4, 5 und 6 zu sehen. Hierbei ist das Signal für Hämolysat:Wasser = 1:10000 (v:v) bei 2 dargestellt, für Hämolysat:Wasser = 1:1000 (v:v) bei 3 dargestellt, für Hämolysat:Wasser = 1:100 (v:v) bei 4 dargestellt, für Hämolysat:Wasser = 1:10 (v:v) bei 5 dargestellt und für unverdünntes Hämolysat bei 6 dargestellt. Es ist in 3 deutlich erkennbar, dass eine zunehmende Menge an Hämolysat in dem Reaktionsgemisch während der isothermalen Amplifikationsreaktion die Amplifikationsreaktion von Ziel-cfDNA inhibiert. Bereits Hämolysat-Anteile in einer 1:10000-Verdünnung beeinträchtigen die Reaktionskinetik signifikant (vgl. Signale bei 1 und 2). Die Reaktionskinetik, die in Abwesenheit von Hämolysat erhalten wurde ist vergleichbar mit der Reaktionskinetik in den erfindungsgemäßen Verfahren mit Vollblut der Beispiele 1 und 2. Die jeweils erhaltenen Werte des Fluoreszenzschwellenzyklus sind in der Tabelle 1 zusammengefasst (siehe Tabelle 1).

Template	Fluoreszenzschwellenzykus (Cq)
unverdünntes Hämolysat	n.b.
Hämolysat:Wasser = 1:10 (v:v)	n.b.
Hämolysat:Wasser = 1:100 (v:v)	30,6
Hämolysat:Wasser = 1:1000 (v:v)	24,1
Hämolysat:Wasser = 1:10000 (v:v)	19,4
kein Hämolysat (nur Wasser)	19,4
Tabelle 1. n.b. = nicht bestimmbar

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass während der isothermalen Amplifikationsreaktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Blutzellen im Vollblut nicht zerstört werden und somit keine Substanzen während der Amplifikationsreaktion freigesetzt werden, welche diese inhibieren. Folglich kann durch das erfindungsgemäße Verfahren auch beim Einsatz von Vollblut eine hohe Detektionssensitivität und Detektionsgenauigkeit sichergestellt werden.

Claims

In-vitro-Verfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, umfassend die Schritte a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsreaktion geeignet ist, wobei die Reaktionsmischung mindestens ein Primerpaar enthält, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist oder mindestens ein solches Primerpaar der Reaktionsmischung zugegeben wird; b) Zugabe von Vollblut eines Lebewesens zu der Reaktionsmischung; c) Durchführen einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von ≤ 45 °C; und d) Detektion von DNA mithilfe von mindestens einem Detektionsreagenz, wobei die Detektion während Schritt c) oder nach Schritt c) durchgeführt wird; dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung i) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder ii) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu geeignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon, wobei bevorzugt i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion von DNA über eine Detektionseinheit erfolgt, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hiervon.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Quantifizierung der Menge an amplifizierter DNA über eine Auswerteeinheit erfolgt, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ll-NE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass während oder nach Schritt d) im Falle von amplifizierter DNA auf das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung geschlossen wird, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthält, die jeweils zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet sind, oder mehrere solcher Primerpaare der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz, optional die Reaktionsmischung, das Primerpaar und das Detektionsreagenz, von einem Lateral-Flow-Strip enthalten sind.
Vorrichtung und/oder Kit, geeignet zum in-vitro-Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, enthaltend a) eine Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von ≤ 45 °C geeignet ist, b) mindestens ein Primerpaar, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist, wobei das mindestens eine Primerpaar optional in der Reaktionsmischung enthalten ist; c) mindestens ein Detektionsreagenz zur Detektion von DNA, wobei das mindestens eine Detektionsreagenz optional in der Reaktionsmischung enthalten ist; dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei einem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung i) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder ii) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu geeignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon, wobei bevorzugt i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht,, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine Detektionseinheit zur Detektion von DNA enthält/enthalten, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hiervon.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine Auswerteeinheit zur Quantifizierung einer Menge an amplifizierter DNA enthält/enthalten, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit dazu konfiguriert ist, im Falle einer Detektion von DNA durch das Detektionsreagenz das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung anzuzeigen, optional über eine für sichtbares Licht transparente Begrenzung der Vorrichtung, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthält/enthalten, wobei jedes Primerpaar zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist und wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung ein Lateral-Flow-Strip ist.
Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit einen Lateral-Flow-Strip aufweist, der i) die Reaktionsmischung enthält; oder ii) die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz enthält.
Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, oder einem Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21 oder 23, zum direkten, semiquantitativen oder quantitativen, Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure in Vollblut, bevorzugt zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die bei einer Krankheit eines Lebewesens und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Vollblut des Lebewesens außerhalb der Blutzellen vorhanden ist.