DE112013002589T5

DE112013002589T5 - Extraktionskontrolle für DNA

Info

Publication number: DE112013002589T5
Application number: DE201311002589
Authority: DE
Inventors: Xi Ll
Original assignee: Vela Operations Pte Ltd
Current assignee: Vela Operations Pte Ltd
Priority date: 2012-05-21
Filing date: 2013-05-17
Publication date: 2015-03-12
Also published as: US20150132741A1; WO2013175364A1; EP2852683A1; GB201208926D0

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen zur Verwendung in der Kontrolle von Extraktionsverfahren, insbesondere hinsichtlich Nukleinsäurematerial zur Verwendung in der PCR und noch bevorzugter der Echtzeit-PCR (quantitative PCR). Die erfindungsgemäße Extraktionskontrolle beruht auf apathogenem bakteriellem Material, welches zu geringen Kosten in großem Umfang hergestellt werden kann und eine gute Stabilität hat.

Description

Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik, insbesondere Verbindungen, die als Extraktionskontrollen in Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Zielnukleinsäuren, z. B. DNA, in einer zu analysierenden Probe dienen sollen. Bestimmte Mengen der Extraktionskontrollen der Erfindung werden zu diesen Proben hinzugegeben und Nukleinsäuren, die aus solchen Proben stammen, werden anschließend in auf Echtzeit-PCR basierenden Tests zum Nachweis auf Ziel-DNA analysiert. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, Kits, Tests und Herstellungsartikel, die die erfindungsgemäße Extraktionskontrolle umfassen sowie Extraktionsverfahren für Nukleinsäuren und anschließende Echtzeit-PCR-Analyse, worin die Extraktionskontrollen verwendet werden.
Technischer Hintergrund
PCR wird als sensitivste und schnellste Methode zum Nachweis von Nukleinsäuren von Interesse, z. B. Nukleinsäuren, die von einem Pathogen in einer bestimmten Probe herrühren, angesehen. PCR ist im Fachgebiet gut bekannt und wurde in US-Patent Nr. 4,683,195 an Mullis et al., US-Patent-Nr. 4,683,202 an Mullis, US-Patent-Nr. 5,298,392 an Atlas et al. und US-Patent-Nr. 5,437,990 an Burg et al. beschrieben.
Für den PCR-Schritt werden Oligonukleotidprimerpaare bereitgestellt, die spezifisch für jede der Zielnukleinsäuren sind, wobei jedes Primerpaar eine erste Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einer Sequenz ist, die das 5'-Ende der Zielnukleinsäuresequenz flankiert und eine zweite Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Nukleotidsequenz ist, die das 3'-Ende der Zielnukleinsäuresequenz flankiert. Die Nukleotidsequenzen jedes Oligonukleotidprimerpaars sind für ein bestimmtes Nukleinsäureziel spezifisch und sollten mit anderen Nukleinsäuren nicht kreuzreagieren.
Die PCR ist gegenwärtig das Verfahren der Wahl zum Nachweis von Ziel-DNA, z. B. Nukleinsäuren, deren Vorhandensein oder Abwesenheit in diagnostischen Anwendungen detektiert werden kann, beispielsweise in der Diagnose einer bakteriellen Infektion, dem Vorhandsein biologischer Kontamination in Wasser, Nahrungsmitteln etc.
Die Echtzeit-PCR oder qPCR (quantitative qPCR, welche in zahlreichen Lehrbüchern, z. B. Logan J, Edwards K, Saunders N (Herausgeber), (2009), Real-Time PCR: Current Technology and Applications, Caister Academic Press) beschrieben wurden, kann zum Nachweis von DNA verwendet werden. Wenn PCR in diagnostischen Anwendungen verwendet wird, hängt die Genauigkeit einer Diagnose nicht nur von der Beschaffenheit/Unversehrtheit der verwendeten chemischen Verbindungen für die Amplifizierung der Ziel-DNA-Sequenzen ab, sondern auch von der Verfügbarkeit von erfolgreich aus einer Probe extrahierter DNA.
Die Analyse biologischer Materialien, z. B. Blutproben, Stuhlproben, kontaminiertes Wasser, Nahrungsmittel, etc., kann durch verschiedene chemische und physikalische Faktoren beeinflusst werden, die die Beschaffenheit/Unversehrtheit der Nukleinsäuren, die in solchen Proben vorhanden sind, betreffen. Beispiele für solche Faktoren sind solche, die eine Rolle bei der Lagerung und den Gewinnungsbedingungen der Proben spielen (Temperatur, pH-Wert, Zeit, die zwischen dem Gewinnen der Probe und dem Extrahieren der darin befindlichen Nukleinsäuren vergangen ist, etc.). Außerdem können Nukleinsäuren durch das Vorhandensein potentiell störender Faktoren in einer Probe betroffen sein, z. B. inhibitorische Proteine oder Nukleinsäure degradierende Enzyme (DNAsen, etc.). Das Fehlschlagen intakte oder ausreichende Mengen an DNA aus einer Probe zu extrahieren kann auch auf der schlechten Qualität der in dem Extraktionsverfahren verwendeten Reagenzien beruhen.
Einer oder mehrere Faktoren, die einen negativen Einfluss auf das Ergebnis der Extraktion von Zielnukleinsäuren ausüben, die ursprünglich in einer Probe vorhanden sind, können für das Fehlschlagen des Nachweises verantwortlich sein. Wenn PCR unter Verwendung von DNA durchgeführt wird, die aus einer Probe extrahiert wurde, kann das Fehlschlagen, eine Zielsequenz zu amplifizieren, fälschlicherweise als Abwesenheit des Ziels interpretiert werden. Für diagnostische Anwendungen, z. B. beim Nachweis von aus Pathogenen stammender DNA oder von Oncogenen, ist es daher von äußerster Wichtigkeit, Kontrollen für die Zuverlässigkeit des DNA-Extraktionsverfahrens einzuschließen. In Abwesenheit entsprechender Extraktionskontrollen kann das Fehlschlagen, eine Zielsequenz nachzuweisen, als falsch negatives Testergebnis interpretiert werden. Dies kann schwerwiegende Konsequenzen haben, da die Ergebnisse die Ursache für eine falsche Diagnose und anschließend für die falsche Behandlung des Ursprungsorganismus sein können, z. B. eines menschlichen Patienten.
Es ist wichtig, dass die Extraktionskontrollen auch eine gute Langzeitlagerstabilität (d. h. dass die Extraktionskontrolle für mindestens ein Jahr, vorzugsweise zwei Jahre oder länger nach der Verschiffung verwendet werden kann) bei relativ ungünstigen Bedingungen, z. B. erhöhten Temperaturen, beispielsweise Temperaturen über 4°C, vorzugsweise über 20°C besitzen, und dass die Extraktionskontrollen harschen Extraktionsbedingungen ausgesetzt werden können, ohne dass eine Degradierung befürchtet werden muss. Extraktionskontrollen sollten auch unter Laborbedingungen sicher sein und keine Bedrohung für die Umwelt oder die Gesundheit des hiermit arbeitenden Personals darstellen.
Die vorliegende Erfindung betrifft derartige verbesserte Extraktionskontrollen für Verfahren, die auf den Nachweis des Vorhandenseins oder der Abwesenheit von Ziel-DNA in zahlreichen Quellen ausgerichtet sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von DNA, die aus apathogenen Bakterien, wie beispielsweise solchen, die zum Genus Lactococcus gehören, vorzugsweise L. Lactis, noch bevorzugter L. lactis Subspezies cremoris als Quelle der Kontroll-DNA stammt, und als Extraktionskontrollreagenz für auf Echtzeit-PCR beruhenden Nachweismethoden.
L. lactis wird allgemein als apathogen für Tiere angesehen, insbesondere für Säuger wie Menschen, für Pflanzen oder Mikroorganismen, obwohl es gelegentlich Berichte über Infektionen mit diesen Bakterien gibt. L. lactis ist ein kugelförmiges, Gram-positives Bakterium, das intensiv in der Nahrungsmittelindustrie eingesetzt wird. Es bildet keine Sporen und ist nicht beweglich und wird als Bakterium mit Nahrungsmittelreinheit GRAS (allgemein als sicher angesehen) betrachtet. L. lactis erweist sich als eine nützliche Auswahlmöglichkeit aufgrund der genetischen Zugänglichkeit, der Einfachheit der Produktion im industriellen Maßstab sowie der Leichtigkeit der Handhabung.
In einigen erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die apathogenen Bakterien mit UV behandelt worden, um sie vor der Verwendung als Extraktionskontrollen abzutöten. Dies vermeidet jegliche Risiken für Personen, die an kommerziellen Anwendungen, der Herstellung, der Handhabung, der Verpackung und Laboranwendungen beteiligt sind. Gleichzeitig werden Umweltrisiken vollständig vermieden.
In anderen Ausführungsformen der Erfindung sind die apathogenen Bakterien, die oben genannt worden sind, nicht mit UV behandelt worden, da die Verwendung solcher Bakterien allgemein kein Risiko darstellt, aber die Sensitivität der Echtzeit-PCR-Verfahren besser ist als mit UV-behandelten Bakterien.
Die vorstelligen Erfinder haben überraschend herausgefunden, dass apathogene Bakterien, insbesondere des Genus Lactococcus, vorzugsweise L. lactis als ideale Extraktionskontrollen für DNA Extraktionsverfahren aus einer Probe dienen können. Die extrahierte DNA kann in Echtzeit-PCR(qPCR)-Reaktionen verwendet werden.
Lactobacillus, z. B. L. lactis besitzt auch den Vorteil, dass es in großen Mengen bei geringen Kosten hergestellt werden kann. Routinemaßnahmen in Laboratorien zur Behandlung von Abfallmaterial verhindern jegliche Risiken der Kontaminierung der Umwelt mit derartigen Extraktionskontrollmaterial. Einfache Hygienemaßnahmen, z. B. durch Pasteurisierung oder Autoklavierung, sind ausreichend, um jegliche Risiken zu vermeiden. Zusätzlich können die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Bakterien optional vor der Verwendung mit UV behandelt werden, was ihre Fähigkeit zum Proliferieren zunichtemacht.
Beschreibung der Erfindung
In einer ersten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren oder Methoden zum Nachweis und/oder der Quantifizierung mindestens einer Zielnukleinsäure in einer biologischen Probe, wobei das Verfahren einen Nukleinsäureextraktionsschritt in Gegenwart eines apathogenen Bakteriums umfasst, das zu dieser Probe zugegeben wird, bevor die Extraktion durchgeführt wird. Im Folgenden wird die Zugabe der Extraktionskontrolle der vorliegenden Erfindung zu einer biologischen Probe vor Extraktion der DNA auch als ”spiking” bezeichnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Quantifizierungs- und/oder Nachweisverfahren der Ziel-DNA die Echtzeit-PCR (auch als ”quantitative PCR”, qPCR bezeichnet).
Eine biologische Probe kann eine Probe einschließen, die aus der Wasserversorgung stammt; einer Kläranlage; einer Bodenprobe aus einem landwirtschaftlichen Bereich; von Weideland; aus einem Abfallbeseitigungsbereich; und/oder einer Probe, die aus nahezu jeder Wasserquelle stammt, die durch Tiere oder Menschen zum Verzehr, der Reinigung oder anderen häuslichen oder kommerziellen Verwendungen benutzt wird; oder Ähnliches. Zusätzlich kann eine biologische Probe menschliches oder tierisches Abfallmaterial (z. B. Stuhl), medizinische Abfälle (Bandagen und Wundverbände), Körperflüssigkeiten (Urin, Plasma, Blut, Schleim, etc.) und/oder Ähnliches umfassen. In einigen Ausführungsformen betreffen die Methoden das Screening und/oder Testen einer biologischen Probe wie Trinkwasser und/oder Gewässer (beispielsweise einem Bach, Fluss oder See), von dem Trinkwasser bezogen wird.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung kann die Extraktion der DNA unter Verwendung jegliches Verfahrens, das im Stand der Technik bekannt ist, durchgeführt werden (vgl. ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, dritte und vierte Ausgabe; Sambrook et al.) oder unter Verwendung von Kits, die auf dem Markt von verschiedenen kommerziellen Quellen wie beispielsweise Qiagen (Hilden, DE) oder Macherey-Nagel (DE) erhältlich sind.
In weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen gehört das apathogene Bakterium zum Genus Lactococcus, vorzugsweise L. lactis, noch bevorzugt L. lactis Subspezies cremoris.
In bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist die Ziel-DNA viralen, bakteriellen, pilzlichen oder parasitätren Ursprungs. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen wird die DNA im Genom eines Organismus gefunden, von dem die Probe gewonnen wurde, z. B. DNA, die eine Rolle bei bestimmten Erkrankungen, etc. spielt.
In noch weiteren erfindungsgemäßen Ausführungsformen sind die Verfahren und Methoden der Erfindung auf die Amplifizierung von Zielnukleinsäuren gerichtet, welche die Schritte umfassen:

a) Gewinnen einer Probe, von der vermutet wird, dass sie Ziel-DNA enthalten könnte;
b) Extrahieren der DNA aus dieser Probe in Gegenwart einer vorherbestimmten Menge einer Extraktionskontrolle der vorliegenden Erfindung, wobei die Extraktionskontrolle zu der Probe, von der vermutet wird, dass sie mindestens ein Nukleinsäuremolekül von Interesse/zu analysieren enthält vor der Extraktion der Nukleinsäuren zugegeben wird;
c) Amplifizierung von Zielsequenzen, unter Verwendung mindestens einer Reaktionsmischung, die Primer umfasst, die spezifisch mit einem Zielmolekül hybridisieren und/oder einem Primerpaar, das spezifisch mit DNA hybridisiert, welche aus der Extraktionskontrolle stammt und/oder Sonden, wobei diese Primer und/oder Sonden fluoreszierende Reste tragen, die ihren Nachweis ermöglichen;
d) Überwachen des Amplifizierungsprozesses und/oder Detektieren und Quantifizieren der Menge der Produkte;
e) ggf. Berechnen der Menge an Amplifikationsprodukte, die sowohl aus der Extraktionskontrollnukleinsäure und der Zielnukleinsäure stammen;
f) ggf. Entscheiden über die therapeutische Behandlung eines Patienten auf Grundlage der in den vorhergehenden Schritte gewonnenen Ergebnisse.

In den obigen Verfahren bzw. Prozessen der Erfindung wird eine vorbestimmte Menge des apathogenen Bakteriums, z. B. eines Bakteriums, das zum Genus Lactococcus, bevorzugt L. lactis, mehr bevorzugt L. lactis Subspezies cremoris gehört, hinzugegeben. Die Menge sollte ausreichend sein, um einen Ct-Wert von ~30 in einem Echtzeit-PCR-Test zu ergeben. Diese entspricht grob 10⁴ bis 10⁶ CFU von beispielsweise L. lactis, die pro Extraktionsreaktion verwendet werden. Die Menge an DNA-Material, die aus dieser Menge L. lactis extrahiert wird, ist niedrig genug, um die Detektionssensitivität der Zielnukleinsäure nicht zu beeinflussen, und ist dennoch eine signifikant ausreichende Menge, um deren wirkungsvollen Nachweis zu gewährleisten.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Zusammensetzungen zur Verwendung in der Extraktion von DNA, welche eine Extraktionskontrolle umfasst, wobei die Extraktionskontrolle ein apathogenes Bakterium umfasst. Dieses Bakterium ist vorzugsweise ausgewählt aus Bakterien des Genus Lactococcus, wie beispielsweise L. lactis, mehr bevorzugt ist es L. lactis cremoris.
In noch weiteren Ausführungsformen ist die Erfindung auf Kits ausgerichtet, die eine Extraktionskontrolle umfassen, die in den obigen Abschnitten beschrieben worden ist. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Kits diagnostische Kits, wobei die diagnostischen Kits Bestandteile zur Durchführung der Echtzeit-PCR umfassen. Die Kits der vorliegenden Erfindung umfassen eine Extraktionskontrolle mit einer Lagerstabilität von mindestens einem Jahr, vorzugsweise 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Jahren bei Umgebungstemperatur. In einigen Ausführungsformen der Erfindung können die Bestandteile des Kits gefriergetrocknet sein und können einen Puffer zur Rekonstitution enthalten.
In einigen Verfahren und/oder Methoden der Erfindung, in einigen Zusammensetzungen oder Kits oder anderen Produkten gemäß der Erfindung ist das apathogene Bakterium ggf. inaktiviert worden, d. h. es ist nicht länger in der Lage, sich zu teilen. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Inaktivierung durch UV-Behandlung der Bakterien erreicht. Die UV-Behandlung ist eine physikochemische Inaktivierungsmethode, die die Struktur der Proteine im Wesentlichen intakt lässt, aber die Nukleinsäuren vernetzt. Traditionell wird die UV-Behandlung in Verfahren zur Analyse von Nukleinsäuren nicht verwendet, sondern für auf Proteinen basierenden Assays wie beispielsweise ELISA, Western Blot und anderen auf Proteinen beruhenden Assays.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls einen Test zur Diagnose des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Ziel-DNA-Moleküls. Dieser Test umfasst eine Extraktionskontrolle, die in irgendeinem der vorhergehenden Abschnitte definiert worden ist.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung automatisierte Vorrichtungen zur Extraktion von Nukleinsäuren aus biologischen Proben, die eine Quelle umfassen, welche ein Teil der Vorrichtung ist, die die Extraktionskontrolle der Erfindung enthält.
Kommerzielle Anwendungen der vorliegenden Verfahren schließen die klinische Diagnose einer menschlichen Probe, veterinär-medizinische Diagnose einer Probe tierischer Herkunft, die Überprüfung der Wasserqualität aus Erholungs- oder Trinkwasserproben, Nahrungsmittelprobentests und Umwelt-Tests aus Boden- oder anderen Probentypen, die oben beschrieben wurden, ein.
Zusammensetzungen, Bestandteile von Kits oder andere Produkte der Erfindung können in lyophilisierter Form hergestellt und/oder in einem oder mehreren Master-Gemischen bereitgestellt werden, welche ggf. zusätzliche Bestandteile umfassen, z. B. zur Extraktion von Nukleinsäuren und/oder für die Durchführung einer PCR.
In einigen erfindungsgemäßen Aspekten können die Primer und/oder Sonden der Erfindung mit einem fluoreszierenden Rest markiert werden. Fluoreszierende Reste zur Verwendung in der Echtzeit-PCR-Detektion sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und sind aus zahlreichen kommerziellen Quellen erhältlich, z. B. von life technologies^TM oder anderen Lieferanten von Inhaltsstoffen für die Echtzeit-PCR.
Zusätzlich können die Verfahren und Produkte der vorliegenden Erfindung eine positive interne Kontrolle für die PCR einschließen, die im Fachgebiet bekannt ist oder in der britischen Anmeldung Nr. GB 1204776.7 beschrieben worden ist. Der Begriff ”interne Kontrolle” betrifft so wie er hier verwendet wird eine Nukleinsäuresequenz, die verwendet werden kann, um zu zeigen, dass eine PCR-Reaktion in der Lage ist, eine Zielsequenz nachzuweisen.
In einigen erfindungsgemäßen Aspekten werden Herstellungsartikel oder Kits bereitgestellt. Herstellungsartikel können fluorophore Reste zur Markierung der Primer oder Sonden enthalten bzw. die Primer und Proben sind bereits mit den entsprechenden Donor- und Akzeptor-Fluoreszenzresten markiert.
Die Amplifizierung beinhaltet im Allgemeinen die Verwendung eines Polymerase-Enzyms. Geeignete Enzyme sind im Fachgebiet bekannt, z. B. Taq-Polymerase, etc.
So wie es hier verwendet wird, kennzeichnet der Begriff ”Sonde” oder ”Detektionssonde” ein Oligonukleotid, das aufgrund der Komplementarität der mindestens einen Sequenz in der Sonde mit der Zielsequenz eine Hybridstruktur mit einer Zielsequenz bildet, die in einem Molekül (d. h. einem ”Zielmolekül”), in einer Probe, die einer Analyse unterzogen wird, enthalten ist. Die Nukleotide einer jeglichen Sonde können Deoxyribonukleotide, Ribonukleotide und/oder synthetische Nukleotidanaloga sein.
Der Begriff ”Primer” oder ”Amplifikationsprimer” bezeichnet ein Oligonukleotid, das in der Lage ist, als Ausgangspunkt für die 5'- nach 3'-Synthese eines Primerextensionsproduktes, das komplementär zu einem Nukleinsäurestrang ist, zu dienen. Das Primerextensionsprodukt wird in Gegenwart entsprechender Nukleotide und eines Polymerisierungsagens, wie einer DNA-Polymerase, in einem geeigneten Puffer und bei einer geeigneten Temperatur synthetisiert.
Das am umfassendsten verwendete Zielamplifikationsverfahren ist die PCR, welche zuerst für die Amplifizierung von DNA durch Mullis et al. in US-Patent Nr. 4,683,195 und Mullis in US-Patent Nr. 4,683,202 beschrieben wurde, und Durchschnittsfachleuten gut bekannt ist.
Der Begriff ”Echtzeit-PCR” bezieht sich auf den Nachweis von PCR-Produkten über Fluoreszenzsignale, die durch die Bindung eines Fluoreszenzfarbstoffmoleküls und eines ”Quencher”-Restes an das gleiche oder andere Oligonukleotidsubstrate erzeugt wird. Beispiele für gewöhnlich verwendeten Sonden sind TAQMAN^®-Sonden, Molecular Beacon Probes, SCORPION^®-Sonden und SYBR^® Green-Sonden. Kurz zusammengefasst haben TAQMAN^®-Sonden, Molecular Beacon- und SCORPION^®-Sonden jeweils einen fluoreszierenden sogenannten Reporter-Farbstoff (auch bezeichnet als ”Fluor”), welcher an das 5'-Ende der Sonden angehängt ist und einen Quencher-Rest, der an das 3'-Ende der Sonden gebunden ist. Im nicht-hybridisierten Zustand verhindert die Nähe des Fluors und des Quencher-Moleküls den Nachweis von Fluoreszenzsignalen von der Sonde; während der PCR, wenn die Polymerase eine Matrize, an die eine Sonde gebunden ist, repliziert, spaltet die 5'-Nuklease-Aktivität der Polymerase die Sonde ab, so dass mit jedem Replikationszyklus die Fluoreszenz ansteigt. SYBR Green^®-Sonden binden doppelsträngige DNA und nach Anregung emittieren sie Licht; das bedeutet, dass wenn das PCR-Produkt sich anhäuft, die Fluoreszenz zunimmt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von TAQMAN^®-Sonden bevorzugt. Wenn Echtzeit-PCR verwendet wird, ist es möglich, auch die Menge der Ziel-Nukleinsäure in der Probe zu messen oder zu bestimmen. Im letzteren Fall wird die Echtzeit-PCR häufig als qPCR bezeichnet.
Die Begriffe ”Fluorophor”, ”fluorogener Farbstoff”, ”Fluoreszenzfarbstoff” bezeichnen so wie sie hier verwendet werden, eine funktionale Gruppe, die an eine Nukleinsäure angehängt ist, die Energie einer spezifischen Wellenlänge absorbiert und bei einer anderen, aber ebenfalls spezifischen Wellenlänge reemittiert.
Die Begriffe ”komplementär” und ”im Wesentlichen komplementär” beziehen sich auf die Basenpaarung zwischen Nukleotiden oder Nukleinsäuren, wie beispielsweise zwischen zwei Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls oder zwischen einem Oligonukleotidprimer und einer Primerbindungsstelle auf einer einzelsträngigen zu sequenzierenden oder amplifizierenden Nukleinsäure. Komplementäre Nukleotide sind im Allgemeinen A und T (oder A und U), und G und C. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung soll davon ausgegangen werden, dass die aufgeführten spezifischen Sequenzlängen der Darstellung halber angegeben werden und nicht limitierend sind, und dass Sequenzen, die die gleichen Positionen abdecken, aber eine etwas geringere oder größere Anzahl an Basen haben, als Äquivalente der Sequenzen angesehen werden und in den Schutzbereich der Erfindung fallen, vorausgesetzt, dass sie an die gleichen Positionen des Ziels hybridisieren wie die aufgeführten Sequenzen. Da es klar ist, dass Nukleinsäuren nicht vollständige Komplementarität benötigen, um zu hybridisieren, können die hier offenbarten Sonden- und Primersequenzen im gewissen Ausmaß modifiziert sein ohne Verlust der Verwendbarkeit als spezifische Primer und Sonden. Im Allgemeinen fallen Sequenzen mit einer Homologie von ungefähr 90% oder mehr in den erfindungsgemäßen Schutzbereich. Wie im Fachgebiet bekannt ist, kann die Hybridisierung komplementäre und teilweise komplementäre Nukleinsäuresequenzen durch Einstellung der Hybridisierungsbedingungen erzielt werden, um die Stringenz zu erhöhen oder zu senken, d. h. durch Einstellung der Hybridisierungstemperatur oder des Salzgehalts des Puffers.
Der Begriff ”Hybridisierungsbedingungen” soll solche Bedingungen der Zeit, Temperatur und des pH-Werts und die notwendigen Mengen und Konzentration von Reaktionsteilnehmern und Reaktionsmitteln bezeichnen, die ausreichend sind, um mindestens einem Teil der komplementären Sequenzen zu ermöglichen, aneinander zu binden. Wie im Fachgebiet gut bekannt ist, hängen die Zeit, die Temperatur und die pH-Bedingungen, die benötigt werden, damit eine Hybridisierung eintritt, von der Größe der Oligonukleotidsonde oder des Primers, der hybridisiert werden soll sowie vom Grad der Komplementarität zwischen der Oligonukleotidsonde bzw. -primer und dem Ziel, und von dem Vorhandensein anderer Materialien in der Hybridisierungsreaktionsmischung ab. Die tatsächlichen Bedingungen, die für jeden Hybridiserungsschritt notwendig sind, sind im Fachgebiet gut bekannt oder können ohne unzumutbaren experimentellen Aufwand bestimmt werden.
Der Begriff ”Markierung” betrifft so wie er hier verwendet wird jedes Atom oder Molekül, das verwendet werden kann, um ein nachweisbares (vorzugsweise quantifizierbares) Signal zu erzeugen, und das an eine Nukleinsäure oder ein Protein über eine kovalente Bindung oder nicht-kovalente Interaktion gebunden werden kann (z. B. durch ionische oder Wasserstoff-Bindung, oder durch Immobilisierung, Adsorption oder Ähnliches). Markierungen stellen im Allgemeinen nachweisbare Signale durch Fluoreszenz, Chemilumineszenz, Radioaktivität, Kolorimetrie, Massenspektrometrie, Röntgenstrahlenablenkung oder -absorption, Magnetismus, Enzymaktivität oder Ähnliche bereit. Beispiele für Markierungen schließen Fluorophore, Chromophore, radioaktive Atome, elektronendichte Reagenzien, Enzyme und Liganden mit spezifischen Bindungspartnern ein.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung findet man die Extraktionskontrolle der vorliegenden Erfindung in einem Teil einer Vorrichtung, die für vollautomatisierte Laboratorien geeignet ist, die im Stande sind, Nukleinsäuren aus einer Probe zu extrahieren, Amplifikationsreaktionen anzusetzen und die Amplifikationsreaktionen durchzuführen (z. B. qPCR), indem die hier beschriebenen Bestandteile verwendet werden und bei dem quantitativ und/oder qualitativ Nukleinsäureziele, z. B. unter Verwendung von Echtzeit-PCR, nachgewiesen werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, die Primer und Sonden umfasst. Vorzugsweise umfasst die Zusammensetzung auch Inhaltsstoffe, z. B. Enzyme, Puffer und Nukleotide, die für die PCR notwendig sind, vorzugsweise für die qualitative und/oder quantitative PCR. Die Zusammensetzung kann im Kühlschrank im flüssigen Zustand oder tiefgefroren in einem geeigneten Medium gelagert werden, oder sie kann lyophilisiert und vor der Verwendung rekonstituiert werden und kann ferner nachweisbare Sonden und/oder interne (positive) Kontrollen umfassen.
Der Begriff ”Amplifikation” von DNA bedeutet so wie er hier verwendet wird die Verwendung von PCR, um die Konzentration einer bestimmten Nukleinsäuresequenz in einer Mischung aus Nukleinsäuresequenzen zu erhöhen. Der Begriff ”PCR” bedeutet so wie er hier verwendet wird die Polymerasekettenreaktion, die im Fachgebiet gut bekannt ist. Der Begriff schließt alle Formen der PCR ein, wie beispielsweise Echtzeit-PCR (quantitative PCR).
Die spezifische Nukleinsäuresequenz, die amplifiziert wird, wird hier als ”Ziel”-Sequenz bezeichnet. Der Begriff ”Ziel”-Sequenz bedeutet so wie er hier verwendet wird die Sequenz einer Nukleinsäure, die durch PCR amplifiziert wird. Der Begriff ”Ziel”-Nukleinsäuresequenz bedeutet so wie er hier verwendet wird, dass es die Sequenz einer Nukleinsäure ist, die durch PCR amplifiziert wird.
Die Begriffe ”biologische Probe” und ”Probe” kennzeichnen so wie sie hier verwendet werden jede Art oder Probenmaterial, das in der Lage ist, einen Organismus zu enthalten. Nicht beschränkende Beispiele schließen eine Wasserprobe, eine Bodenprobe, eine Luftprobe, eine Stuhlprobe, eine Urinprobe, usw. ein. In anderen erfindungsgemäßen Ausführungsformen ist die Probe eine Gewebeflüssigkeit eines Patienten, welche ausgewählt werden kann aus der Gruppe bestehend aus Blut, Plasma, Serum, Lymphflüssigkeit, Gelenkflüssigkeit, Cerebrospinalflüssigkeit, Fruchtwasser, Nabelschnurblut, Tränen, Speichel und Nasopharynxlavagen.
Der Begriff ”Patient” bedeutet so wie er hier verwendet wird, dass menschliche und tierische Patienten eingeschlossen sind.
Die Begriffe ”Pathogen”, ”Organismus” und ”Art” werden hier austauschbar verwendet und betreffen jede Art, oder engverwandte Gruppen von Arten, die durch eine Oligonukleotidsequenz als einzigartig identifiziert werden können. Die Art kann bekannt oder unbekannt sein und kann jeglichen Typ eines Virus, Bakteriums, Pilzes, etc. einschließen.
Der Begriff ”Primerpaar” so wie er verwendet wird bedeutet ein Paar aus Oligonukleotidprimern, das zu den Sequenzen, die eine Zielsequenz flankieren, komplementär ist. Das Primerpaar besteht aus einem Vorwärtsprimer und einem Rückwärtsprimer. Der Vorwärtsprimer hat eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zur Sequenz ist, die stromaufwärts, d. h. 5' der Zielsequenz liegt. Der Rückwärtsprimer hat eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär zu einer Sequenz stromabwärts, d. h. 3' der Zielsequenz, ist.
Die Begriffe ”Sonde” und ”Sondenpaar” betreffen eine oder zwei Oligonukleotidsequenzen, die komplementär zu einer spezifischen Zielsequenz sind und kovalent an einen Fluorophor gebunden sind. Ein Sondenpaar schließt zwei Oligonukleotide ein: eine ”Donorsonde” und eine ”Akzeptorsonde”. Wenn beide Sonden an die Zielsequenzen gebunden sind, kann das Fluorphor der Donorsonde Energie auf den Fluorophor der Akzeptorsonde durch Försters Resonanzenergietransfer (FREI) übertragen.
Es ist klar, dass die Erfindung nicht auf die bestimmte Methodik, die Protokolle und Reagenzien, die hier beschrieben sind, beschränkt ist, da diese variieren können, wie dem Fachmann klar ist. Es ist ebenfalls klar, dass die Terminologie, die hier verwendet wird, dem Zweck der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen dient und dass nicht beabsichtigt ist, den Erfindungsbereich zu beschränken.
Es sollte auch beachtet werden, dass die Einzelformen ”ein” und ”der, die, das” so wie sie hier und in den anhängigen Ansprüchen verwendet werden, den Pluralbezug einschließen, sofern der Kontext nicht ganz eindeutig etwas anderes vorgibt. Daher ist beispielsweise eine Bezugnahme auf ”eine Kapsel” eine Referenz zu einer oder mehreren Kapseln und Äquivalenten davon, die dem Fachmann bekannt sind.
Sofern es nicht anders angegeben worden ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen hier verwendeten Begriffe die gleichen Bedeutungen sie wie für gewöhnlich durch einen Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, zu dem die Erfindung gehört, verstanden werden. Die erfindungsgemäßen Ausführungsformen und die verschiedenen Merkmale und deren vorteilhafte Details werden vollständiger unter Bezugnahme auf die nicht beschränkenden Ausführungsformen erläutert und/oder in den hier angefügten Zeichnungen dargestellt sind und in der folgenden Beschreibung detailliert geschildert. Es sollte auch klar sein, dass die in den Zeichnungen dargestellten Merkmale nicht notwendigerweise maßstabsgetreu sind und dass Merkmale einer Ausführungsform in anderen Ausführungsformen verwendet werden können, wie ein Fachmann erkennen würde, selbst wenn dies nicht explizit hier angegeben ist.
Alle numerischen Werte, die hier angegeben werden, schließen alle Werte vom niedrigsten Wert bis zum obersten Wert in ansteigender Weise in Einzeleinheiten ein, vorausgesetzt, dass es einen Abstand von mindestens zwei Einheiten zwischen jeglichem niedrigen Wert und irgendeinem höheren Wert gibt. Wenn beispielweise angegeben ist, dass die Konzentration eines Bestandteils oder Wertes einer Verfahrensvariable, wie beispielsweise die Größe, die Temperatur, der Druck, die Zeit u. Ä. z. B. von 1 bis 90 reicht, genauer gesagt von 20 bis 80, noch genauer von 30 bis 70, wird beabsichtigt, dass Werte, wie beispielsweise 16 bis 85, 22 bis 68, 43 bis 51, 30 bis 32, etc., ausdrücklich in dieser Beschreibung aufgezählt sind. Für Werte, die weniger als 1 betragen, wird eine passende Einheit von 0,0001, 0,001, 0,01 oder 0,1 angenommen. Dies sind nur Beispiele dessen, was spezifisch beabsichtigt wird, und alle möglichen Kombinationen aus numerischen Werten zwischen dem niedrigsten Wert und dem höchsten Wert, die aufgezählt sind, werden als ausdrücklich in dieser Anmeldung in gleicher Weise ausgedrückt angesehen.
Bestimmte Verfahren, Geräte und Materialien sind beschrieben, obwohl andere Methoden oder Materialien, die ähnlich oder äquivalent denen sind, in der Durchführung oder beim Testen der Erfindung verwendet werden können. Alle hierin aufgeführten Referenzen werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen.
Sofern es nicht anders angegeben ist, haben alle technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung die für gewöhnlich von einem durchschnittlichen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird. Obwohl Verfahren und Materialien, die ähnlich oder äquivalent zu solchen sind, die hier beschrieben sind, in der Durchführung oder beim Testen der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden geeignete Verfahren und Materialien unten beschrieben. Zusätzlich sind alle Materialien, Methoden und Beispiele rein illustrativ, und es ist nicht beabsichtigt, dass sie beschränken sollen. Alle Publikationen, Patentanmeldungen, Patente und andere Referenzen, die hier erwähnt sind, werden durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit eingeschlossen. Im Falle eines Konflikts ist die vorliegende Beschreibung, einschließlich der Definition, entscheidend.
Die Details eines oder mehrerer Ausführungsformen der Erfindung werden in der Beschreibung unter ausgeführt. Andere Merkmale, Ziele und Vorteile der Erfindung werden aus der Beschreibung und aus den Ansprüchen deutlich.
Beispiele
Primer und Sondendesign (5' nach 3') – spezifisch for Lactococcus lactis
Experimentelle Daten
Amplifikation von genomischer DNA von Streptococcus pyogenes durch spezifische Primer und Sonden.

• L. lactus wurde einer Abtötung durch UV unterworfen. Wie durch Ausplattieren getestet wurde, wurde eine 100%ige Abtötung erzielt,. Von den gewonnenen Bakterien wurden 100 μl der folgenden Verdünnungen für die DNA-Extraktion unter Verwendung des Qiagen-DNA-Extraktionskits verwendet und mit 100 μl AE-Puffer eluiert.
• Ein Echtzeit-PCR-Test wurde mit den folgenden Primer-Sonden-Kombinationen durchgeführt, wobei genomische DNA von Streptococcus pyogenes als Matrize verwendet wurde.

Eine PCR-Reaktion wurde gemäß den unten stehenden Parameter angesetzt.

Komponente	Volumina/Endkonzentration für 1 Reaktion
Roche FastStart Mastermix (2x)	12,5 μl
S. pyogenes vorwärts	0,5 M Endkonzentration
S. pyogenes rückwärts	0,5 M Endkonzentration
S. pyogenes Sonde	0,5 M Endkonzentration
S. pyogenes gDNA	10 pg
L. lactis Vorwärtsprimer	0,5 M Endkonzentration
L. lactis Rückwärtsprimer	0,5 M Endkonzentration
L. lactis Sonde	0,5 M Endkonzentration
L. lactis gDNA	10²–10⁸ CFU
H2O	Auffüllen bis zum Endvolumen von 25 μl
Gesamtvolumen	25 μl

Ein Rotor-gene-Q-Apparat (Qiagen) wurde verwendet, und PCR-Reaktionen wurden mit den folgenden Zyklusbedingungen durchgeführt: 95°C für 10 min gefolgt von 45 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 60 Sekunden. S. pyogenes wurde im grünen Kanal detektiert und, während die EC L. lactis im roten Kanal detektiert wurde (vgl. 1). Die Graphen auf der Oberseite der 1 zeigen die Ergebnisse der Echtzeit-PCR, die S. pyogenes spezifisch sind und die zwei Graphen auf der Unterseite der 1 zeigen die Ergebnisse, die mit der Extraktionskontrolle gewonnen wurden. Jede Reaktion wurde doppelt durchgeführt und die Ergebnisse werden in der Tabelle unten aufgeführt.

	EC L. lactis (roter Kanal)		S. pyogenes (grüner Kanal)
EC L. lactis Konzentration (CFU)	Ct	Ct Durchschnitt	Ct	Ct Durchschnitt
10⁸	25,21	25,08	25,98	25,94
	24,94		25,91
10⁴	31,99	31,69	25,85	25,95
	31,38		26,05
10³	41,84	40,34	26,21	26,21
	38,84		26,21
10²	36,86	35,93	25,39	25,73
	35,00		26,06

Der Test wäre in der Lage, klinische Proben auf das Vorhandensein von S. pyogenes auf der Grundlage des S. pyogenes Exotoxin B(SpeB)-Gens zu diagnostizieren.
Dieser Test ist als Duplex-Test entworfen. Der Vorteil ist der, dass er erlaubt, L. lactis zu den klinischen Proben hinzuzugeben. L. lactis-DNA könnte als interne Extraktionskontrolle dienen, um zu zeigen, dass DNA erfolgreich extrahiert wurde. Wenn eine Echtzeit-PCR-Reaktion sowohl für S. pyogenes als auch für L. lactis negative Signale ergibt, könnte das bedeuten, dass DNA-Extraktion nicht erfolgreich war, und das schließt eine falsch-negative Interpretation aus.
Wie in den Daten gezeigt wird, beeinflusst das Vorhandensein von L. lactis-DNA und L. lactis-Primer/Sonden nicht die Sensitivität des Nachweises von 10 pg S. pyogenes-DNA.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von Ziel-DNA in einer Probe, wobei das Verfahren einen DNA-Extraktionsschritt in Gegenwart eines apathogenen Bakteriums umfasst, das vor dem Extraktionsschritt zu der Probe gegeben worden ist, eine Nukleinsäureamplifikationsschritt und einen Zielnukleinsäurenachweis und/oder Quantifizierungsschritt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei eine festgelegte Menge eines apathogenen Bakteriums zu der Probe gegeben wird.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 2, wobei das apathogene Bakterium zum Genus Lactococcus gehört.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das apathogene Bakterium L. lactis ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das apathogene Bakterium L. lactis Subspezies cremoris ist.
Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei der Amplifikationsschritt PCR umfasst.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Amplifikationsschritt Echtzeit-PCR ist.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Ziel-DNA eine von einem Pathogen stammende DNA ist oder DNA ist, die vom Donor der Probe stammt.
Verfahren gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die von einem Pathogen stammende DNA viralen, bakteriellen, pilzlichen oder parasitären Ursprungs ist.
Verfahren zur Amplifikation von Zielnukleinsäuren, umfassend die Schritte: a) Gewinnen einer Probe, die verdächtigt wird, eine Zielnukleinsäure zu enthalten, b) Extrahieren von Nukleinsäuren aus dieser Probe in Gegenwart eines apathogenen Bakteriums als Extraktionskontrolle, wobei diese Extraktionskontrolle zu einer Probe, die verdächtig wird, vor der Extraktion der Nukleinsäuren mindestens ein Nukleinsäuremolekül von Interesse/das zu analysieren ist hinzugegeben wird, c) Amplifizieren von Zielnukleinsäuren unter Verwendung einer Amplifikationsreaktionsmischung, die Primer umfasst, die spezifisch mit einem Zielnukleinsäuremolekül hybridisieren und ein Primerpaar, das spezifisch mit Nukleinsäuren hybridisiert, die von der Extraktionskontrolle stammen, d) Quantifizieren der Amplifikationsprodukte.
Verfahren gemäß Anspruch 10, umfassend Echtzeit-PCR.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, wobei das apathogene Bakterium in den Ansprüchen 3 bis 5 definiert ist.
Verfahren gemäß Ansprüchen 10 bis 12, wobei die Zielnukleinsäure wie in Ansprüchen 8 oder 9 definiert ist.
Zusammensetzung zur Verwendung in der Extraktion von Nukleinsäuren, umfassend eine Extraktionskontrolle, wobei die Extraktionskontrolle ein apathogenes Bakterium umfasst.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 14, wobei das apathogene Bakterium wie in irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5 definiert ist.
Kit umfassend eine Extraktionskontrolle wie in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche definiert.
Kit gemäß Anspruch 16, wobei das Kit ein diagnostisches Kit ist.
Kit gemäß den vorhergehenden Ansprüchen 16 und 17, wobei das diagnostische Kit für die PCR oder Echtzeit-PCR ist.
Kit gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche 16 bis 18, wobei das Kit weiter Reagenzien zur Extraktion von Nukleinsäuren umfasst.
Kit gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Extraktionskontrolle eine Lagerstabilität von mindestens einem Jahr bei Umgebungstemperatur hat.
Verfahren, Zusammensetzung oder Kit gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das apathogene Bakterium inaktiviert worden ist.
Kit gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bestandteile gefriergetrocknet sind und einen Puffer zur Rekonstituierung enthalten.
Verfahren, Zusammensetzung oder Kit gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das apathogene Bakterium ggf. mit UV behandelt worden ist.
Test zur Diagnose des Vorliegens, des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Zielnukleinsäuremoleküls, umfassend eine Extraktionskontrolle wie in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche definiert.
Vorrichtung zur Extraktion von DNA, umfassend eine DNA-Extraktionskontrolle.
Vorrichtung gemäß Anspruch 25, wobei die Extraktionskontrolle ein apathogenes Bakterium ist, das in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche definiert worden ist.
Nicht pathogenes Bakterium wie in irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche definiert, zur Verwendung als DNA-Extraktionskontrolle.
Das apathogene Bakterium zur Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei das nicht pathogene Bakterium nicht mit UV behandelt worden ist.
Das apathogene Bakterium zur Verwendung gemäß Anspruch 27, wobei das nicht pathogene Bakterium vor der Verwendung mit UV behandelt worden ist.