DE19614852A1

DE19614852A1 - Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure

Info

Publication number: DE19614852A1
Application number: DE19614852A
Authority: DE
Inventors: Knut Dipl Chem Dr Bartl; Gerhard Dipl Chem Dr Bienhaus; Peter Dipl Biol Dr Wenzig
Original assignee: Boehringer Mannheim GmbH
Current assignee: Roche Diagnostics GmbH
Priority date: 1996-04-15
Filing date: 1996-04-15
Publication date: 1997-10-16

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analyt nukleinsäure mit Hilfe von Standards, welche eine definierte Menge an Standardnuklein säuren enthalten. Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zur Durchführung des Verfahrens.

Nukleinsäuren kommen in Probenmaterialien üblicherweise in sehr geringen Mengen vor. Andererseits ist die An- oder Abwesenheit bestimmter Nukleinsäuresequenzen oft ein An zeichen für krankhafte genetische Zustände oder die Anwesenheit unerwünschter Organis men. Wegen des geringen Vorkommens bestimmter Nukleotidsequenzen hat es sich als wünschenswert erwiesen, diese Nukleotidsequenzen zunächst spezifisch zu vermehren, so daß diese Sequenzen einerseits besser vor dem Hintergrund der in großer Menge vor handenen anderen Nukleotidsequenzen nachweisbar sind und darüber hinaus die Sensitivität des Testes deutlich gesteigert wird. Für eine Vervielfältigung von Nukleotidsequenzen gibt es mittlerweile eine Reihe von Verfahren. Eine der bekanntesten ist als Polymeraseketten reaktion (PCR) bekannt geworden. Eine solche Amplifikation ist beispielsweise beschrieben in EP-B-0 218 184 und US-A-4,683,295. Bei diesen Verfahren werden die nachzuweisen den Nukleotidsequenzen dadurch amplifiziert, daß sowohl die ursprüngliche Nukleinsäure als auch alle daraus gebildeten Kopien in Zyklen weiter amplifiziert werden. Hierdurch er gibt sich theoretisch eine exponentielle Vermehrung der Nukleinsäuren. Wie beispielsweise in PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1992, Seiten 1 bis 9) ausgeführt, ist die Gesamteffizienz jedoch weniger als 100%. Typische Amplifikatio nen haben zwischen dem 15. und 30. Zyklus eine Effizienz von ca. 70 bis 80%. Die Effi zienz der Amplifikation kann jedoch nicht von vornherein vorausgesagt werden und ist üb licherweise bei jeder individuellen Probe unterschiedlich. Dies hängt beispielsweise mit der unterschiedlichen Zusammensetzung jeder individuellen Probe zusammen. Die dem Stand der Technik entsprechenden Probenvorbereitungsmethoden können z. B. eine Ver schleppung potentieller Inhibitoren für die Enzyme der Amplifikationsreaktion nicht hundertprozentig ausschließen. Es hat sich daher als sehr schwierig erwiesen, mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion und anderer Amplifikationsreaktionen (NASBA, LCR) eine quantitative Bestimmung von Nukleinsäuren in einer Probe durchzuführen.

Um probenspezifische Einflüsse zu verringern wurde schon früh der Einsatz sogenannter interner Standards vorgeschlagen (siehe z. B. PCR, Clinical Diagnostics and Research, Springer Verlag, 1992, Seiten 201 bis 207) (Verfahren I). Hierzu wird das Probenmaterial in Aliquots aufgetrennt und jedem Teil eine bestimmte, unterschiedliche Menge einer Standardnukleinsäure zugegeben. Anschließend wird die Amplifikation durchgeführt und in jedem der Aliquots ein Meßwert für die zu bestimmende Nukleotidsequenz und ein Meß wert für die Standardnukleinsäure ermittelt. Aus den Meßwerten für die Standardnuklein säure wird eine Eichkurve abgeleitet, aus welcher für den Meßwert für die Analytnuklein säure die entsprechende Analytkonzentration abgelesen werden kann. Dabei werden die Signale der einzelnen Standards in verschiedenen Ansätzen bestimmt und tragen somit einen hohen Fehler, der durch die große Varianz der Amplifikationsreaktion erzeugt wird. Dieser Fehler ist durch das interne Standardverfahren korreliert mit dem Fehler bei jeder Proben- Aliquot-Messung und mittelt sich deshalb bis zu einem gewissen Grad heraus. Dieses Ver fahren erfordert relativ viel Probenmaterial und die Ermittlung einer Eichkurve für jede individuelle Probe; damit ist das Verfahren sehr aufwendig und teuer.

In PCR Methods and Applications (Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1993, Seiten 191 bis 196) ist ausgeführt, daß auch die Ermittlung einer externen Standard referenzkurve keine ausreichende Quantifizierung erlaubt. In einem solchen Verfahren (Verfahren II) wird eine Verdünnungsreihe einer Standardnukleinsäure zur Aufstellung einer Eichkurve benutzt. Hierbei enthalten die Verdünnungsreihen Konzentrationen von Standardnukleinsäuren, wie sie für die amplifizierte Analytnukleinsäure erwartet wird. Ob wohl hiermit auf Seiten der Standardnukleinsäure recht verläßliche Meßwerte erhalten wer den können, verhindert die schlechte Vorhersagbarkeit der Amplifikationseffizienz der Analytnukleinsäure eine genaue Quantifizierung. Im Gegensatz zu Verfahren I mittelt sich der Fehler bei Standardmessung und Probenmessung aufgrund der fehlenden internen Standardisierung nämlich nicht heraus.

In Journal of Clinieal Microbiology, 33/2 265 bis 269 (1995) wird ein Verfahren beschrie ben (Verfahren III), bei dem die Probe mit einer bestimmten und bekannten Menge einer Standardnukleinsäure versetzt wird. Aus Standards, welche dieselbe Menge an Standard nukleinsäuren, jedoch unterschiedliche Mengen an Analytnukleinsäure (kloniertem Analyt nukleinsäure-Fragment) enthalten, wird eine Eichkurve erstellt. Hierzu werden die Meß werte für die jeweiligen Analytkonzentrationen eines Standards mit dem für denselben Standard ermittelten Meßwert für die Standardnukleinsäure in Relation gesetzt. Aus den Verhältnissen der Meßwerte der einzelnen unterschiedlichen Analytkonzentrationen zu der Standardnukleinsäurekonzentration wird eine Eichkurve des Verhältnisses über die Konzen tration erstellt. Auch im Probenmaterial werden Meßwerte für die (unbekannte) Analytkon zentration und die (mit der in den Standards identischen) Standardnukleinsäurekonzentra tion ermittelt. Die zu diesem Verhältnis aus der Eichkurve zu entnehmende Konzentration soll die gesuchte Analytkonzentration sein. Für dieses Verfahren gilt wie bei Verfahren I, daß aufgrund der internen Standardisierung sich Fehler der Standard- und Probenmessung zumindest teilweise herausmitteln. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, daß für jede nachzuweisende Nukleinsäurespezies zwei verschiedene Standards hergestellt werden müssen, und die Standardreihe zweifach detektiert werden muß.

Es bestand daher ein Bedarf nach einem besonders einfachen Verfahren zur Quantifizierung von Analytnukleinsäuren, insbesondere einem, das mit möglichst hoher Genauigkeit, aber möglichst geringem Reagenz-und Meßaufwand arbeitet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Analyt nukleinsäuren A aus einem individuellen Probenmaterial PP durch

I. a) Zugabe einer bekannten Menge an mindestens einer Standardnukleinsäure S mit einer von A unterschiedlichen NS-Sequenz zu dem Probenmaterial PP,
b) Erforderlichenfalls Umwandlung der Standardnukleinsäure S in eine Target nukleinsäure ST und der Analytnukleinsäure A in eine Targetnukleinsäure AT,
c) Herstellung einer Vielzahl von Nukleinsäuren XS aus den Standardnukleinsäuren S bzw. den Targetnukleinsäuren ST und Nukleinsäuren XA aus den Analytnuklein säuren A bzw. den Targetnukleinsäuren AT
d) Ermittlung eines Meßwertes MPP (XA)_gem für die Menge an Nukleinsäuren XA und eines Meßwertes MPP (XS)_gem für die Menge von Nukleinsäuren XS,
II. a) Bereitstellung von n Standards PR (n), wobei diese Standards n definierte Mengen an mindestens einer der Standardnukleinsäuren S enthalten, nicht jedoch von dem individuellen Probenmaterial PP abgeleitet sind und n eine natürliche Zahl von 1 oder größer ist,
b) Behandlung der Standards PR (n) unter den Reaktionsbedingungen der Schritte I. b) bis d) wobei für jeden Standard mindestens 1 Meßwert MPR (XS)_gem erhalten wird, wobei für n < 1 die Standards in verschiedenen Ansätzen oder in einem einzi gen Ansatz behandelt werden können,
c) Erstellung einer Eichkurve E aufgrund der n Meßwerte MPR (XS)_gem aus II. b),
III. a) Vergleich des/r Meßwerte/s MPP (XS)_gem mit dem/n zu der selben Menge gehöri gen Wert/en der Eichkurve E unter Bildung eines oder mehrerer Korrekturfaktoren f und
b1) Korrektur des Meßwertes MPP (XA)_gem für die Analytnukleinsäure um den/die Korrekturfaktoren f unter Erhalt eines Meßwertes MPP (XA) und Ermittlung der Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des korrigierten Meßwertes MPP (XA)_korr mit der Eichkurve B oder
b2) Ermittlung einer korrigierten Eichkurve E′ unter Verwendung des/r Korrektur faktors/en und Ermittlung der Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des Meßwertes MPP (XA)_gem mit der korrigierten Eichkurve E′.

Unter einem Verfahren zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure wird erfin dungsgemaß ein Verfahren verstanden, bei dem die Menge oder Konzentration einer in einer Probe enthaltenen Analytnukleinsäure bestimmt wird. Die Analytnukleinsäure liegt normalerweise in einer von außen nicht direkt erkennbaren Konzentration vor. Unter einem quantitativen Nachweis werden aber auch Verfahren verstanden, bei denen beispielsweise die vorhandene Menge an Analytnukleinsäure bestätigt werden soll.

Die Analytnukleinsäure A ist die Nukleinsäure, deren Menge oder Konzentration nachge wiesen werden soll. Sie hat üblicherweise eine teilweise oder vollständig bekannte Nukleotidsequenz. Es handelt sich insbesondere um Nukleinsäuren genomischen (auch viralen und bakteriellen), plasmidischen, zellulären oder zytoplasmatischen Ursprungs. Es kann sich um Deoxyribonukleinsäure (DNS) und Ribonukleinsäure (PNS) handeln.

Zu Beginn des Verfahrens liegt die Analytnukleinsäure in einem Probenmaterial vor. Dies kann beispielsweise ein Gewebe oder eine Flüssigkeit sein. Bei Flüssigkeiten handelt es sich bevorzugt um Körperflüssigkeiten oder Proben aus der Molekularbiologie, z. B. Kulturen von Mikroorganismen. Unter einem individuellen Probenmaterial wird ein Probenmaterial verstanden, das wenig standardisiert ist, dessen Inhaltsstoffe in ihrer Menge größtenteils unbekannt sind, die von Probenmaterialien anderer Individuen unterscheidbar sind. Insbe sondere handelt es sich um Patientenproben ärztlichen oder klinischen Ursprungs. Die Indi vidualität der Probe bezieht sich insbesondere auf den Zustand eines definierten Körpers oder eine Kultur.

Eine Standardnukleinsäure im Sinne der Erfindung hat eine von der Analytnukleinsäure unterschiedliche Basensequenz, weist jedoch bevorzugt teilweise identische Sequenzen auf. In einem bevorzugten Fall enthält die Standardnukleinsäure zwei Nukleotidsequenzen einer Länge von mehr als 10 Basen, die weitgehend, bevorzugt zu 100%, homolog zu einem Teil der Analytnukleinsäure ist, und die eine Nukleotidsequenz flankieren, die sich in ihrer Sequenz von der Sequenz unterscheidet, die in der Analytnukleinsäure von den Sequenzen weitgehender Homologie flankiert wird. Die Unterschiede dieser Bereiche können sich so wohl auf die Sequenz als auch auf die Länge (Insertion zusätzlicher Basen oder/und Dele tion von Basen) oder/und der Basensequenz (Basenaustausch, Mutationen oder Restrik tionsstellen) betreffen. Die Länge der flankierten Sequenz ist bevorzugt größer als 20 Basen und liegt besonders bevorzugt zwischen 30 und 1000 Basen. Die Standardnukleinsäure kann einzel- oder auch doppelsträngig sein, je nach dem Vorliegen der Analytnukleinsäure in der Probe. Die Homologie zwischen der Sequenz der Standardnukleinsäure und der korrespondierenden Sequenz der Analytnukleinsäure beträgt vorzugsweise mehr als 50%, besonders bevorzugt mehr als 80%.

Die Standardnukleinsäure gehört vorzugsweise dem gleichen Typ von Nukleinsäuren an wie die Analytnukleinsäure. Handelt es sich bei der Analytnukleinsäure um DNS, so ist die Standardnukleinsäure ebenfalls bevorzugt DNS. Handelt es sich um RNS, so ist die Standardnukleinsäure ebenfalls bevorzugt RNS.

Die Standardnukleinsäure S wird dem Probenmaterial zugegeben und bevorzugt vermischt. Die Zugabe kann auf beliebige Art geschehen, beispielsweise in fester oder flüssiger Form, bevorzugt in Form eines bestimmten Volumens einer Lösung mit bekannter Konzentration an Standardnukleinsäure. Die Zugabe kann manuell oder auch automatisch, z. B. durch Pipettieren, vorgenommen werden.

Erfindungsgemäß ist es nicht nur möglich, eine Standardnukleinsäure zu dem Proben material zuzugeben, sondern auch mehr, z. B. 2 oder 3 Standardnukleinsäuren mit unterein ander unterschiedlicher Sequenz, die jedoch auch die oben genannten Bedingungen für eine Standardnukleinsäure erfüllen. Die Konzentrationen der unterschiedlichen Standardnuklein säuren können gleich oder verschieden sein. Obgleich die Menge an Analytnukleinsäure in der Probe weitgehend unbekannt sein wird, läßt sich in vielen Fällen jedoch schon eine grobe Einordnung des Konzentrationsbereiches im Vornherein festlegen. In diesen Fällen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, auch die Standardnukleinsäure(n) in einer ähnlichen Menge zu verwenden, wie sie für die Analytnukleinsäure erwartet wird.

Abhängig von der Art des eingesetzten Probenmaterials kann es erforderlich sein, die Analytnukleinsäure in einem oder mehreren Probenvorbereitungsschritten zugänglich zu machen. Dies wird beispielsweise der Fall sein, wenn sich die Nukleinsäuren in Komparti menten, z. B. in Zellen, befinden. Bevorzugt wird das Probenmaterial nach Zugabe der Standardnukleinsäure einer Probenvorbereitung unterzogen, die beispielsweise die Lyse mit zellwandzerstörenden Agenzien, z. B. chaotropen Salzen, gemäß Proc. Natl. Acad. Science USA 76, 615-619 (1979) oder Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987) einschließen.

Zur Probenvorbereitung können außerdem Aufreinigungsschritte der in der Probe vor handenen Nukleinsäuren gehören. Solche Aufreinigungsschritte können beispielsweise die Bindung aller im Probenmaterial vorhandenen Nukleinsäuren oder auch nur eines Teiles davon, jedoch die Analytnukleinsäure und die Standardnukleinsäure (n) einschließend und Abtrennung der sie umgebenden Flüssigkeit einschließen. Falls eine Aufreinigung durch eine Bindung an eine feste Phase (z. B. Glasoberflächen), durchgeführt wurde, hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Nukleinsäuren vor dem nächsten Nukleinsäurebearbeitungsschritt wieder von der festen Phase freizusetzen, z. B. durch Erniedrigung der Salzkonzentration der Flüssigkeit.

Nicht alle Analyttypen von Analyt- und Standardnukleinsäure sind direkt in Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Kopien dieser Nukleinsäuren einsetzbar. Es ist daher manchmal erforderlich, die Analytnukleinsäure A in eine Targetnukleinsäure AT und die Standardnukleinsäure S in eine Targetnukleinsäure ST umzuwandeln. So ist beispielsweise eine Umwandlung von RNS in DNS in solchen Verfahren bevorzugt, bei denen DNS-ab hängige DNS-Polymerasen bei der Amplifikation eingesetzt werden. Diese Umwandlung findet im Falle von RNS durch die Bildung einer cDNS mit Hilfe von reverser Transkriptase statt. Die Bedingungen für die Bildung von cDNS sind dem Fachmann geläufig.

Verfahren zur Herstellung einer Vielzahl von Nukleinsäuren aus in einer Probe vorhandenen Targetnukleinsäure sind dem Fachmann ebenfalls bekannt. Beispiele für solche Reaktionen sind die PCR (EP-B-0 201184), NASBA (EP-A-0 329 822) und die LCR (EP-A-0 320 308). Ein besonders bevorzugtes Verfahren ist die Amplifikation mit Hilfe der PCR. In diesem Fall wird dem Reaktionsgemisch ein Überschuß von Primern zugesetzt, mit denen die Analytnukleinsäure A bzw. die Targetnukleinsäure AT bzw. die Targetnuklein säure ST bzw. die Standardnukleinsäure S zyklisch amplifiziert werden können. Bevorzugt wird ein Primerpaar ausgewählt, mit welchem die Amplifikation von Analyt- und Standard nukleinsäuren möglich ist. Prinzipiell möglich ist jedoch auch die Amplifikation voneinander verschiedener Bereiche der Analytnukleinsäure bzw. Standardnukleinsäure unter Ver wendung eines weiteren Primerpaares.

In einer möglichen Variante des Amplifikationsverfahrens kann ein Primer des Primerpaares markiert sein, detektierbar oder bevorzugt immobilisierbar (z. B. mit Biotin). Bevorzugt sind die zwischen den Primerhybridisierungsstellen liegenden Bereiche auf der Analyt nukleinsäure bzw. der Standardnukleinsäure im wesentlichen gleich lang, unterscheiden sich jedoch in ihrer Sequenz. Ein Meßwert im Sinne der Erfindung ist ein Maß für das ge messene Signal, welches z. B. durch Lichtextinktion, Lichtabsorption, Lichterzeugung, Fluoreszenz oder Chemilumineszenz, durch die Reaktionsmischung erzeugt wird. In vielen Fällen wird der Meßwert in Form eines Stromflusses erzeugt werden. Der Meßwert wird ermittelt durch vorzugsweise apparative Durchführung einer Messung mit der ein Wert für die Menge an Nukleinsäuren XA und XS erzeugt wird. Die erzeugten Meßwerte können entweder aufgezeichnet oder/und elektronisch gespeichert werden.

Die Messung kann entweder auf unterschiedlichen Eigenschaften der Nukleinsäuren XS bzw. XA beruhen, z. B. auf unterschiedlichen Markierungen mit z. B. unterschiedlichen Absorptionseigenschaften, oder auf einer materiellen Trennung von XS und XA und ge trennter Messung aufgrund gleicher oder unterschiedlicher Eigenschaften von XA bzw. XS.

Für XA und jede unterschiedliche Nukleinsäure XS wird mindestens 1 Meßwert erzeugt. Es ist jedoch auch möglich, Mehrfachbestimmungen zu statistischen Zwecken (Mittelwertsbildung) durchzuführen.

Unter einem Standard PR wird im Sinne der Erfindung ein Gemisch verstanden, welches eine definierte Menge an mindestens einer Standardnukleinsäure S enthält, die jedoch nicht von dem individuellen Probenmaterial PP abgeleitet ist. Es handelt sich insbesondere nicht um eine durch Verdünnung des Probenmaterials hergestellte Lösung. Als Standard können jedoch durchaus Gemische dienen, die einer Probenflüssigkeit ähnlicher Herkunft in der Zusammensetzung nachempfunden sind. Insbesondere enthält sie solche Inhaltsstoffe, die größtenteils bekannt und definiert sind. Ein großer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß die erfindungsgemäßen Standards universell, d. h. für den quantitativen Nachweis der Analyt nukleinsäure auch aus anderen individuellen Proben verwendbar ist. Erfindungsgemäß ist die Verwendung von nur einem, jedoch auch von mehr als einem Standard möglich. Bevor zugt wird mehr als ein Standard eingesetzt, besonders bevorzugt zwischen 3 und 10 Standards. Mindestens zwei dieser Standards weisen eine unterschiedliche, bekannte Menge der Standardnukleinsäure S auf. Besonders bevorzugt unterscheiden sich alle Standards in ihrer Menge an Standardnukleinsäure voneinander. Die Menge an Standardnukleinsäure ist jedoch in jedem Fall definiert und bevorzugt bekannt. Die Menge an erforderlichen Standards kann auch davon abhängig sein, ob eine mit ihrer Hilfe ermittelte Eichkurve linear ist oder von der Linearität abweicht. Im zweiten Fall werden sicherlich mehr Standards er forderlich sein als im erstgenannten Fall.

Werden Standards unterschiedlicher Konzentrationen verwendet, können diese entweder in verschiedenen Ansätzen prozessiert werden oder aber in einem einzigen Ansatz vorbereitet und amplifiziert werden (und anschließend über unterschiedliche Fangsonden detektiert werden). Letzteres Vorgehen hat den Vorteil, daß alle Standards mit demselben Fehler der Probenvorbereitung und Amplifikation behaftet sind und somit eine genauere Bestimmung möglich ist. Eine Rekalibration der erhaltenen Eichkurve kann somit eventuell in größeren Abständen durchgeführt werden.

In besonders einfach gelagerten Fällen ist es jedoch auch möglich, nur einen einzigen Standard PR einzusetzen, der eine einzige, bekannte Menge der Standardnukleinsäure ent hält. In diesem Falle reduziert sich die mit ihm erzeugte Eichkurve E auf einen einzigen Wert, mit dem die bekannte Konzentration der Standardnukleinsäure zu dem Meßwert in Beziehung gesetzt wird. Dieser Fall ist jedoch auch dann bevorzugt, wenn bereits eine Eich kurve mit Hilfe mehrerer Standards erstellt wurde und diese durch eine Überprüfungs- und Korrektureichung (Rekalibration) nachgestellt werden soll. In einem solchen Fall kann die Eichkurve beispielsweise bereits beim Hersteller der Reagenzien aufgenommen werden, so daß im Labor bei der Durchführung des Verfahrens zum quantiativen Nachweis nur noch ein oder zwei Standards (n = 1 oder 2) und die Probe vermessen werden müssen. Im Folgenden soll jedoch die Situation für den Fall geschildert werden, daß mehrere Standards eingesetzt werden (n < 1). Die Standards werden unter denselben Bedingungen behandelt, wie das Probenmaterial, beginnend mit Schritt Ib, bevorzugt jedoch auch schon während der Freisetzung der Analytnukleinsäure aus dem Probenmaterial. In diesem Fall findet eine be vorzugte Einbeziehung von Einflüssen der Probenvorbereitung statt. Die Ermittlung der Meßwerte findet bei den Standards ebenso statt wie bei der Probe. Auch hier können Mehr fachmessungen mit Mittelwertsbildung durchgeführt werden.

Ergebnis der Bearbeitung n Standards sind n Meßwerte, die jeweils einer bekannten Kon zentration zugeordnet werden können. Dies geschieht bevorzugt in einer Eichkurve E. Bei dieser Eichkurve muß es sich jedoch nicht um eine graphische Eichkurve handeln, es kann sich jedoch auch um eine rechnerisch erzeugte Kurve handeln. Wesentlich für diese Eich kurve ist, daß jedem Meßwert innerhalb des zu erwartenden Meßbereiches eine bestimmte Konzentration an einer Nukleinsäure zugeordnet wird. Sofern mehrere unterschiedliche Standardnukleinsäuren dem Probenmaterial zugegeben wurden, kann auch für diese jeweils unter der Verwendung von Standards unterschiedlicher Konzentration dieser Standard nukleinsäuren eine Eichkurve ermittelt werden.

Die Bewertung der erhaltenen Meßwerte folgt dem Prinzip, daß einer bestimmten Menge an Standardnukleinsäuren, die dem Probenmaterial zugegeben wird, eine bestimmte Menge an Nukleinsäuren XS entspricht und daß dieses Verhältnis sich auch in der Relation zwischen der Analytnukleinsäure A und der Nukleinsäure XA wiederfindet. Erfindungsgemäß wird nun aus dem gemessenen Meßwert für XS im Probenmaterial und dem zu der dem Proben material zugegebenen Menge an Standardnukleinsäure identischen Menge an Standard nukleinsäure gehörigen Wert der Eichkurve ein Korrekturfaktor f gebildet. Bevorzugt wird der Korrekturfaktor f ermittelt aus dem tatsächlich gemessenen Wert MPP (XS) in der Probe und dem aus der Eichkurve für dieselbe Menge an S berechneten Wert. Bei dem Faktor f handelt es sich um einen mathematischen Algorithmus, bevorzugt um eine Ver hältnisbildung durch Division des Meßwertes durch den zu erwartenden Wert oder umge kehrt. Mit Hilfe dieses Korrekturfaktors ergeben sich 2 Berechnungsmöglichkeiten. In einer ersten Möglichkeit wird der Meßwert MPP (XA)_gem für die Analytnukleinsäure um den Korrekturfaktor unter Erhalt eines Wertes MPP (XA)_korr korrigiert und die Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des Meßwertes MPP (XA)_korr mit der Eichkurve E ermittelt. Hierbei wird der mathematische Algorithmus reziprok auf den Meßwert MPP (XA)_gem angewendet, d. h. bevorzugt Multiplikation bzw. Division des Meßwertes MPP (XA)_gem mit dem Faktor f. Da von einem weitgehenden Erhalt der Mengenproportionalität von S und A bzw. XS und XA in der Probe ausgegangen wird, kann aus MPP (XA)_korr aus der Eichkurve E ein Konzentrationswert entnommen werden, der die Analytmenge wider spiegelt.

In einer zweiten Möglichkeit wird mit Hilfe des Korrekturfaktors eine korrigierte Eichkurve E′ ermittelt und die Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des Meßwertes MPP (XA)_gem mit der korrigierten Eichkurve E′ ermittelt. Auch hier wird der mathematische Algorithmus des Faktors f reziprok auf die Punkte der Eichkurve angewandt. Damit ergibt sich rechnerisch eine korrigierte Eichkurve, durch die jedem Meßwert für XA ein Konzen trationswert für die Nukleinsäure (letztendlich A) zugeordnet ist.

Durch die genannten Maßnahmen wird sichergestellt, daß die von der individuellen Probe und die sich gegebenenfalls ändernden Bedingungen während der Probenvorbereitung und Amplifikation auf das Meßergebnis reduziert werden. Neben dieser Standardisierung sind jedoch auch die geräteseits üblichen Kalibrierungen möglich und empfehlenswert. Insbe sondere sind Rekalibrationen nach längerer Zeit, bei Verwendung unterschiedlicher Chargen von Reagenzien, unterschiedlicher Umgebungstemperaturen etc. empfehlenswert (siehe EP-A-0 520 304).

Die Reihenfolge der angegebenen Reaktionsschritte ist bevorzugt folgende. Die Reaktions schritte a) bis d) von I. sollten möglichst in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt wer den. Auch die Punkte a) bis c) von II. sollten in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden. Dasselbe gilt für die Schritte a) und b) von III. Die Reaktionsfolgen I. und II. können entweder nacheinander oder gleichzeitig durchgeführt werden. Als besonders be vorzugt hat es sich erwiesen, wenn die Schritte b), c) und d) von I. simultan mit den ent sprechenden Schritten von II. b) durchgeführt werden. Dies ist insbesondere deshalb sinn voll, da die Amplifikationsverfahren meist die Zugabe von Reagenzien und die Durchfüh rung von Temperaturzyklen erfordern, die für die Probe und die Standards identisch sind. Die Reaktionsfolgen von III. sind erst dann sinnvoll, wenn alle Schritte von I. und II. abge schlossen sind.

Bezüglich der Proben und der Standards ist festzustellen, daß angestrebt werden sollte, daß die Reaktionsvolumina jeweils gleich sind.

Die Mengen an Standardnukleinsäuren in den Standards sollte möglichst so gewählt wer den, daß die erwartete Menge an Analytnukleinsäure ungefähr in der Mitte der erstellten Eichkurve zu liegen kommt.

Besonders bevorzugt enthalten die Standards PR keine Analytnukleinsäure. Insbesondere für den Fall, daß die Primer für die Amplifikation der Standardnukleinsäure auch für die Amplifikation der Analytnukleinsäure verwendet werden, könnten sich Verfälschungen der Eichkurve ergeben.

In einer bevorzugten Variante des Verfahrens werden die Nukleinsäuren XA vor der Ermitt lung des Meßwertes MPP (XA)_gem über eine für die Analytnukleinsäure spezifische Fangsonde an eine feste Phase gebunden und ebenso die Standardnukleinsäuren XS vor der Ermittlung des Meßwertes über eine für die Standardnukleinsaure spezifische Fangsonde an eine feste Phase gebunden. Hierzu ist es bevorzugt, jeweils Aliquots sowohl von dem aus der Probe hervorgegangenen Reaktionsgemisch als auch den aus den Standards hervorge gangenen Reaktionsgemischen zu entnehmen und getrennt mit den spezifischen Fangsonden zu bearbeiten. Für diesen Fall ist es beispielsweise nicht erforderlich, unterschiedliche Mar kierungen für den Fall des Nachweises der Analytnukleinsäuren sowie für den Fall des Nachweises einer Standardnukleinsäure zu verwenden. Die Spezifität der Fangsonden kann beispielsweise dadurch erreicht werden, daß ihre Sequenz gerade zu den Teilen der Analyt nukleinsäure bzw. der Standardnukleinsäuren angepaßt ist, in denen diese sich unterschei den.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, daß verglichen mit mehreren internen Standards wie in Verfahren I weniger Messungen pro Probe erforderlich sind. Dieses Ver hältnis gestaltet sich umso günstiger, umsomehr individuelle Proben Gegenstand des Ver fahrens sein sollen. So ist es beispielsweise möglich, dieselbe Eichkurve für die Auswertung der Meßwerte einer Vielzahl von individuellen Proben zu verwenden. Andererseits erübrigt das erfindungsgemäße Verfahren die Anwesenheit von Analytkonzentrationen in den Standards wie in Verfahren III. Dies kann unter Umständen auch in Bezug auf die Infek tiosität der Standards von Vorteil sein.

In Fig. 1 und Fig. 2 sind die beiden Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens er läutert.

In Fig. 1 ist ein Verfahren illustriert, bei dem der Meßwert MPP (XA)_gem um einen Korrek turfaktor korrigiert wird. Wird beispielsweise für 10 Standardmoleküle aus der Eichkurve ein Meßsignal von 3,788 ermittelt und ein Meßsignal für 10 Standardmoleküle in der Probe von 3,400 gemessen, so ergibt sich ein Korrekturfaktor von f= 3,788/3,400 = 1,114. Wird ein Meßsignal MPP (XA)_gem von 5,8 für die Analytnukleinsäure gemessen, so ergibt sich ein korrigiertes Meßsignal für die Probe MPP (XA)_korr von 6,46. Für diesen Wert wird aus der Eichkurve als Menge an Analytnukleinsäure der Wert 54 Kopien/Ansatz abgelesen.

In Fig. 2 ist ein Verfahren gezeigt, bei dem die Eichkurve E zu einer Eichkurve E′ korri giert wird. Unter den selben Bedingungen wie für Fig. 1 ergibt sich wiederum ein Korrek turfaktor von 1,114. Die Eichkurve wird um den Faktor 1/f= 0,9 korrigiert, so daß die Eichkurve E′ erhalten wird. Bei einem Meßsignal MPP (XA)_gem von 5,8 ergibt sich durch Ablesen aus der korrigierten Eichkurve ein Wert von 54 Kopien/Ansatz.

In Fig. 3 ist ein Vergleich einer vollkalibrierten Eichkurve (b) mit einer rekalibrierten Eich kurve (a) gezeigt. Die rekalibrierte Eichkurve (a) ist gestrichelt gezeichnet.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenzkit zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäre A enthaltend in getrennten Gefäßen eine definierte Menge einer oder mehrerer Standardnukleinsäuren S zum Zusatz zu einer die Analytnukleinsäure A enthalten den Probe, n Standards enthaltend jeweils eine definierte Menge an Standardnukleinsäuren S, die sich in der Basensequenz von der Analytnukleinsäure unterscheidet, wobei die Standards keine Analytnukleinsäure enthalten, Reagenzien zum Nachweis der Analyt nukleinsäure und der Standardnukleinsäuren.

Von Vorteil ist, wenn das Reagenzkit ebenfalls in einem getrennten Behälter eine Negativ kontrolle enthält, welche weder Standardnukleinsäure noch Analytnukleinsäure enthält. Auch diese Negativkontrolle wird vorzugsweise den Reaktionsschritten unterzogen, denen die Probe und die Standards unterzogen werden. Der erhaltene Meßwert wird als 0-Wert bei der Ermittlung der Meßwerte für die Probe und die Standards herangezogen.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert.

Beispiel 1 1. Probenvorbereitung

Die Probenvorbereitung erfolgte mit dem QIAamp HCV-Kit der Fa. Qiagen entsprechend den Anweisungen des Herstellers.

2. Herstellung des PNA-Standards

Es wurde der in der Publikation "Besnard N.C. and Andre P.M., J. Clin.Microbiol., 32/8, 1994, p-1887-1893" beschriebene Standard mit der zugehörigen Fangsonde (5′-Biotin-TGT TGG GAA GGG CGA TCG GT-3′) verwendet. Die Sequenzen der verwendeten Primer sind 5′-GTC TAG CCA TGG CGT TAG TA-3′ (forward) und 5′-TCT CGC GGG GGC ACG CCC AA-3′(revers).

Die Reinigung des RNA-Standards erfolgte nach den dem Fachmann bekannten Methoden über in vitro Transkription des DNA-Plasmids, DNAse-Verdau des Plasmids und Ab trennung nicht-eingebauter Nukleotide über Gelfiltration. Die Konzentration der einge bauten RNA wurde über OD-Messung bei 260 und 280 nm bestimmt. Über die Konzentra tion und das bekannte Molekulargewicht wurde die Anzahl der Standardmoleküle berech net. Daraus wurden 6 Standardlösungen hergestellt, von 10E0 bis 10E5, und zwar durch Verdünnung einer Stammlösung in den Lysepuffer des QIAamp-HCV-Probenvorbe reitungskits; in Gegenwart der in diesem Puffer enthaltenen chaotropen Salze ist die RNA stabil.

3. Vorbereitung der externen Eichkurve

10E0 bis 10E5 Standardmoleküle in Lysepuffer wurden zu 140 µl HCV Negativplasma ge geben; die Differenz zu 700 µl wurde mit dem Lysepuffer aufgefüllt, so daß die vom Her steller angegebenen Pufferverhältnisse eingehalten wurden; anschließend erfolgte die Probenvorbereitung weiter nach Herstellerangabe.

4. Probenvorbereitung

140 µl jeder Probe wurde mit einer definierten Anzahl von Standardmolekülen in Lysepuffer versetzt (z. B. 10E3); die Differenz zu 700 µl wurde mit Lysepuffer aufgefüllt, so daß die Pufferverhältnisse eingehalten wurden; die weitere Probenvorbereitung erfolgte nach dem bekannten Protokoll. Als Negativkontrolle wurde das HCV Negativplasma verwendet, in das die Standards für die externe Eichkurve verdünnt wurden.

5. RT-PCR

Die RT-PCR wurde entsprechend den in der oben erwähnten Publikation von Besnard und Andre geschilderten Bedingungen durchgeführt. Es wurde eine Zwei-Topf-Zweischritt- Reaktion durchgeführt mit den Enzymen MoMuLV als reverser Transkriptase und der Taq DNA-Polymerase. Alle Reagentien stammten von der Fa. Boehringer Mannheim (BRD). Die RT wurde 50 min. bei 37°C durchgeführt mit 200 U MoMuLV, 40 U RNAse-Inhibitor, 1 µM des reversen Primers und 0,5 mM der dNTPs (Mischung aus dNTPs und Digoxigenin markiertem dUTP). Nach Denaturierung wurde die Amplifikation durchgeführt mit 1 µM der beiden Primer, 2 mM MgCl₂, 2,5 U Taq Die Zykluszeiten waren folgendermaßen:
Reaktionszeiten im PE Thermocycler 9600:

PCR: 35 Zyklen\|15′′93°
	75′′ 55°C
	75′′ 72°C
Elongation	10′72°C

6. Detektion

Nach der Amplifikation wurden die Amplifikate mit dem DNA-Detection-Kit der Fa. Boehringer Mannheim (BRD) (Best.-Nr. 1447 777) nachgewiesen, indem sie mit einer spe zifischen biotinylierten (z. B. über 5′-Biotin-Phosphoramidit) Fangsonde hybridisiert und an eine Streptavidin-Festphase (SA-Röhrchen der Fa. Boehringer Mannheim, Best.- Nr. 1144553) gebunden wurden. Das ins Amplikon eingebaute DIG wurde über (DIG)- POD und H₂O₂/ABTS detektiert. Die externe Eichkurve wurde mit der standardspezifischen Fangsonde vermessen, die Proben wurden geteilt und sowohl mit der standardspezifischen als auch mit der probenspezifischen Fangsonde (5′-Biotin-GAG AGC CAT AGT GGT CTG CG-3′) vermessen.

7. Auswertung

Aus den Signalen der Standards wurde eine Eichkurve erstellt, die entsprechend dem wiedergefundenen Standard in der Probe korrigiert wurde. Dazu wurde der Quotient be stimmt aus dem Meßwert für den Standard in der Probe und dem für dieselbe Konzentration des Standards aus der Eichkurve ermittelten Meßwert. Mit diesem Quotienten wurde die Steigung der Eichkurve korrigiert (was gleichbedeutend ist damit, daß jeder Meßwert der Eichkurve mit diesem Faktor korrigiert wird). An der korrigierten Eichkurve wurde die Konzentration der HCV RNA in der Probe abgelesen.

Beispiel 2 Vergleich einer Eichkurve, die durch Korrektur einer externen Eichkurve mit einem Korrekturfaktor erhalten wurde (Abb. 3, Kurve a) mit einer vollkalibrierten Kurve (Abb. 3, Kurve b) 1. Durchführung

10-10E4 Standardkopien (es wurde der Standard und die Primer/ Fangsonde aus Beispiel 1 eingesetzt) wurden revers transkribiert und amplifiziert nach folgendem Protokoll: 20 µl Standard, 2 mM MgCl₂, 600 nM Primer, 1 × DIG labeling Mix, 10 U/Ansatz RNAsin, 20 U/Ansatz MoMuLV, 2,5 U/Ansatz Taq-Polymerase (alle Reagentien der Fa. Boehringer Mannheim), Ansatzvolumen 100 µl. Folgendes Temperaturprofil wurde abgearbeitet:

RT
30 min/42°
Denat.	3 min/94°C
35x	45 sec/94°C
	45 sec/55°C
	60 sec/72°C
Elong.	10 min/72°C

Anschließend erfolgte die Detektion mit dem DNA Detection Kit (Fa. Boehringer Mannheim) und biotinylierten Fangsonde aus Beispiel 1 nach den Angaben des Herstellers. Aus den erhaltenen Signalen (Tabelle 1) wurde die Eichkurve aufgestellt (Abb. 3, Kurve b) In einem Parallelansatz wurde der Standard mit 10E3 Kopien im Ansatz revers transkribiert, amplifiziert und detektiert. Mit dem erhaltenen Meßwert (Tabelle 1) wurde die Eichkurve rekalibriert (Abb. 3, Kurve a).

2. Auswertung

Der Vergleich der beiden Eichkurven a und b zeigt, daß sich die rekalibrierte Eichkurve (a) nur wenig von einer gleichzeitig ermittelten vollkalibrierten Kurve b unterscheidet. Bei einem üblicherweise vorliegenden Variationskoeffizienten von 15% sind die Konzentratio nen einer von a bzw. b abgelesenen Probe vergleichbar. Der Aufwand zur Eichung für a ist jedoch um ein Vielfaches geringer.

Tabelle 1: Meßwerte für die Standards

Claims

1. Verfahren zum quantitativen Nachweis von Analytnukleinsäuren A aus einem indivi duellen Probenmaterial PP durch

I a) Zugabe einer bekannten Menge an mindestens einer Standardnukleinsäure S mit einer von A unterschiedlichen NS-Sequenz zu dem Probenmaterial PP,
b) Erforderlichenfalls Umwandlung der Standardnukleinsäure S in eine Target nukleinsäure ST und der Analytnukleinsäure A in eine Targetnukleinsäure AT,
c) Herstellung einer Vielzahl von Nukleinsäuren XS aus den Standardnuklein säuren S bzw. den Targetnukleinsäuren ST und Nukleinsäuren XA aus den Analytnukleinsäuren A bzw. den Targetnukleinsäuren AT
d) Ermittlung eines Meßwertes MPP (XA)_gem für die Menge an Nukleinsäuren XA und eines Meßwertes MPP (XS)_gem für die Menge von Nukleinsäuren XS,
II. a) Bereitstellung von n Standards PR (n), wobei diese Standards n definierte Mengen an mindestens einer der Standardnukleinsäuren S enthalten, nicht je doch von dem individuellen Probenmaterial PP abgeleitet sind und n eine natürliche Zahl von 1 oder größer ist,
b) Behandlung der Standards PR (n) unter den Reaktionsbedingungen der Schritte 1. b) bis d) wobei für jeden Standard mindestens 1 Meßwert MPR (XS)_gem erhalten wird, wobei für n < 1 die Standards in verschiedenen An sätzen oder in einem Ansatz bearbeitet werden können,
c) Erstellung einer Eichkurve E aufgrund der n Meßwerte MPR (XS)_gem aus II.b),
III. a) Vergleich des Meßwertes MPP (XS)_gem mit dem zu der selben Menge gehöri gen Wert der Eichkurve E unter Bildung eines Korrekturfaktors f und
b1) Korrektur des Meßwertes MPP (XA)_gem für die Analytnukleinsäure um den Korrekturfaktor f unter Erhalt eines Meßwertes MPP (XA) und Ermittlung der Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des Meßwertes MPP (XA) mit der Eichkurve E oder
b2) Ermittlung einer korrigierten Eichkurve E′ unter Verwendung des Korrektur faktors und Ermittlung der Menge an Analytnukleinsäure A durch Vergleich des Meßwertes MPP (XA)_gem mit der korrigierten Eichkurve E′.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Standards PR (n) keine Analytnukleinsäure enthalten.

3. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben und die Standards so behandelt werden, daß sowohl die Analytnukleinsäure als auch Standardnukleinsäuren vor dem Schritt der Herstellung einer Vielzahl von Nukleinsäuren an eine feste Phase gebunden werden und die sie umgebende Flüssigkeit abgetrennt wird.

4. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren XA vor der Ermittlung eines Meßwertes über eine für die Analyt nukleinsäure spezifische Fangsonde an eine feste Phase gebunden werden und die Standardnukleinsäuren XS über eine für die Standardnukleinsäure spezifische Fangsonde an eine feste Phase gebunden wird.

5. Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Vielzahl von Nukleinsäuren XA und XS unter Verwendung von Primern derselben Nukleotidsequenz hergestellt werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens einer der Primer eines Primerpaares eine immobilisierbare Gruppe enthält.

7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäuren XA eine andere Länge als die Nukleinsäuren XS aufweisen.

8. Reagenzkit zum quantitativen Nachweis einer Analytnukleinsäure A in getrennten Ge fäßen:

- eine definierte Menge einer Standardnukleinsäure S zum Zusatz zu einer die Analyt nukleinsäure A enthaltenden Probe
- n Standards enthaltend jeweils eine definierte Menge an Standardnukleinsäuren S, die sich in der Basensequenz von der Analytnukleinsäure unterscheidet, wobei die Standards keine Analytnukleinsäure enthalten.
- Reagenzien zum Nachweis der Analytnukleinsäure und der Standardnukleinsäuren.